DE69033668T2

DE69033668T2 - Dns kodierend für einen für epithelzellen spezifischen wachstumsfaktor

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Publication number: DE69033668T2
Application number: DE69033668T
Authority: DE
Inventors: Stuart A. Aaronson; Paul W. Finch; Jeffrey S. Rubin
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1989-01-31
Filing date: 1990-01-30
Publication date: 2001-04-12
Anticipated expiration: 2010-01-31
Also published as: HU218090B; DK0555205T3; JPH10243800A; JP3298874B2; CA2349875C; ATE197800T1; US6709842B1; US5654405A; JP2716416B2; EP0555205B1; JP2006149407A; US6833132B1; JP2001157594A; WO1990008771A1; CA2349875A1; US5731170A; US5741642A; AU647732B2; EP0555205A4; DE122006000021I1

Description

BEREICH DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft Wachstumsfaktoren und insbesondere die Isolierung eines Polypeptidwachstumsfaktors, der Ähnlichkeit mit einer Familie von Faktoren aufweist, dis die bekannten Fibroblastenwachstumsfaktoren (FGFs) einschließt. Diese Erfindung betrifft ebenfalls die Bereitstellung von Abschnitten komplementärer DNA (cDNA) aus Boten-RNA (mRNA), die den neuartigen Wachstumsfaktor kodieren. Ferner bezieht sich diese Erfindung auf die Synthese von Produkten derartiger DNA-Abschnitte durch rekombinante Zellen und auf die Herstellung und Verwendung bestimmter anderer neuartiger Produkte, die durch die Identifizierung und Klonierung der diesen Wachstumsfaktor kodierenden DNAs ermöglicht werden.

IN DIESER ANMELDUNG BENUTZTE ABKÜRZUNGEN

aFGF saurer Fibroblastenwachstumsfaktor
bFGF basischer Fibroblastenwachstumsfaktor
EGF epidermaler Wachstumsfaktor
HSAC Heparin-Sepharose-Affinitätschromatographie
kb Kilobasen
kDa Kilodalton
KGF Keratinocytenwachstumsfaktor
NaDodSO&sub4;/PAGE Natriumdodecylsulfat(SDS)IPolyacrylamid-Gelelektrophorese
RP-HPLC Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie
TGFα transformierender Wachstumsfaktor α

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Wachstumsfaktoren sind wichtige Mediatoren der interzellulären Kommunikation. Diese hochwirksamen Moleküle werden in der Regel von einem Zelltyp freigesetzt und beeinflussen die Proliferation anderer Zelltypen (siehe Referenz I-1 im Versuchsteil I, nachstehend). Das Interesse an den Wachstumsfaktoren ist durch den Nachweis ihrer möglichen Beteiligung an der Neoplasie gewachsen (Referenz II-2 im Versuchsteil II, nachstehend). Das transformierende v-sis-Gen des Simian-Sarkomvirus kodiert ein Protein, das zu der B-Kette des Blutplättchen-entstammenden Wachstumsfaktors homolog ist (I-1, I-2). Ferner besitzen mehrere Oncogene Homologie zu den Genen, die Rezeptoren für Wachstumsfaktoren kodieren (I-1). Folglich wird wahrscheinlich ein zunehmendes Verständnis der Wachstumsfaktoren und deren Rezeptor-vermittelter Signaltransduktionswege Einblicke in die Wachstumsmechanismen von normalen und malignen Zellen bieten.
Zu einer bekannten Familie von Wachstumsfaktoren, die auf Bindegewebszellen wirken, gehören der saure Fibroblastenwachstumsfaktor (aFGF), der basische Fibroblastenwachstumsfaktor (bFBF) und die mit diesen verwandten Produkte der hst- und int-2-Oncogene.
Es ist ferner bekannt, dass einige Wachstumsfaktoren, darunter die Folgenden, Heparin-bindende Eigenschaften aufweisen: aFGF (I-20, I-21), bFGF (I-19, I-20), der Granulocyten/Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (I-1) und lnterleukin-3 (I-1). Alle diese Polypeptid-Faktoren werden von Stroma-Zellen produziert (I-1, I-2, I-25). Anscheinend werden derartige Faktoren in der extrazellulären Matrix oder auf Proteoglykanen abgesetzt, die die Oberfläche von Stroma- Zellen umhüllen (I-1, I-25). Es wurde angenommen, dass ihre Speicherung und Freigabe sowie der Kontakt mit den spezifischen Zielzellen durch diese Wechselwirkung gesteuert werden (I-25, I-28).
Es ist jedoch allgemein anerkannt, dass die große Mehrzahl der bösartigen humanen Tumoren aus dem Epithelgewebe stammen (I-5). Aus Mesenchym-Geweben stammende Effektoren der Proliferation von Epithelzellen wurden zwar beschrieben (I-1, I-2, I-3), ihre molekularen Identitäten und Strukturen sind bisher aber noch ungeklärt.
Angesichts des Mangels an Kenntnissen über derartige mesenchymale Wachstumsfaktoren, die auf Epithelzellen wirken, besteht offenbar ein Bedarf nach Verfahren, Zusammensetzungen und Biotests, die tiefere Kenntnisse und eine tiefergehende Analyse der regulatorischen Mechanismen der Proliferation von Epithelzellen liefern würden, und schließlich auch ein Bedarf nach neuartigen Diagnostika und Therapien, die auf den daran beteiligten Faktoren beruhen.
Um diesem Bedarf nachzukommen und Mittel zur Herstellung von Proteinfaktoren mesenchymaler Herkunft zu entwickeln, die anscheinend mit den Proliferationsvorgängen bei Epithelzellen in Verbindung stehen und auf eine andere Weise nicht hergestellt werden könnten, sieht diese Erfindung die Anwendung von Verfahren zur Proteinisolierung sowie DNA Rekombinationstechniken vor. Diese Erfindung sieht ebenfalls die Anwendung der molekularen Mechanismen dieser Faktoren vor, die mit Wachstumsvorgängen bei Epithelzellen in Verbindung stehen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft Entwicklungen bei der Proteinisolierung und der DNA-Rekombinationstechniken, unter anderem die Herstellung von neuartigen, auf Epithelzellen wirkenden Wachstumsfaktor-Proteinen und zwar frei von anderen Peptid-Faktoren. Neue DNA Abschnitte und Biotest-Verfahren gehören ebenfalls dazu.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein neuartiges Protein mit den Struktur- und/oder Funktionseigenschaften einer bekannten Familie von Wachstumsfaktoren, die den sauren Fibroblastenwachstumsfaktor (aFGF), den basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFBF) und die mit diesen verwandten Produkte der hst- und int-2-Oncogene einschließt. Dieses neue Mitglied der FGF-Polypeptidfamilie behält die Heparin-bindenden Eigenschaften der FGFs, hat jedoch eine einzigartige Zielzellen-Spezifität entwickelt. Dieser Wachstumsfaktor scheint spezifisch für Epithelzellen zu sein und ist besonders wirksam auf Keratinocyten. Aus diesem Grund wurde diesem neuartigen Faktor der Name "Keratinocytenwachstumsfaktor" (KGF) gegeben. Da es sich um das sechste bekannte Mitglied der FGF-Polypeptidfamilie handelt, kann KGF trotz fehlender Aktivität auf Fibroblasten auch als FGF-6 bezeichnet werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung steht der Begriff "KGF oder KGF ähnliche Proteine für ein isoliertes, glykosyliertes oder nicht-glykosyliertes Keratinocytenwachstumsfaktor(KGF)-Protein, umfassend: (a) die nachstehende Aminosäuresequenz, (b) einen Teil der nachstehenden Aminosäuresequenz ohne die N-terminalen 31 Aminosäuren oder (c) eine Aminosäuresequenz, die sich durch die Addition, Deletion oder Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren von der nachstehenden Aminosäuresequenz unterscheidet:
worin das Protein fähig ist, die DNA-Synthese in ruhenden BALB/MK epidermalen Keratinocyten mehr als 500fach zu stimulieren, wohingegen das Protein keine mitogene Aktivität auf Fibroblasten und Endothel-Zellen aufweist.
In einer bevorzugten Ausführungsform weisen 5 nM des Proteins weniger als einfache Stimulierung in NIH/3T3-Fibroblasten gegenüber dem Hintergrund auf.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist das KGF-Protein eine spezifische Aktivität von wenigstens ungefähr 3,4 · 10&sup4; Einheiten pro Milligramm Protein auf, wobei eine Aktivitätseinheit definiert ist als die Menge, die die Hälfte der maximal möglichen Stimulierung der DNA-Synthese in BALB/MK Keratinocytenzellen hervorruft.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das KGF-Protein glykosyliert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das KGF-Protein nicht-glykosyliert.
In eine weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das KGF-Protein die Aminosäuresequenz:
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das KGF Protein Aminosäuresequenz, die sich durch die Addition, Deletion oder Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren von der nachstehenden Aminosäurensequenz unterscheidet:
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das KGF-Protein eine Aminosäuresequenz, die sich durch die Addition, Deletion oder Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren von der nachstehenden Aminosäuresequenz unterscheidet:
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das KGF-Protein einen Aminosäureabschnitt von Fig. II-1B, der die Aminosäuren 32-78 von Fig. II-1B umfasst, um dem KGF-Protein bevorzugte mitogene Aktivität für eine Epithelzelle zu übertragen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, umfasst das KGF-Protein einen Abschnitt der nachstehenden Aminosäuresequenz:
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht das KGF Protein aus einem Abschnitt der nachstehenden Aminosäuresequenz:
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht das isolierte glykosylierte oder lichtglykosylierte Keratinocytenwachstumsfaktor(KGF)-Protein aus einem Abschnitt der nachstehenden Aminosäuresequenz:
worin der Abschnitt mitogene Aktivität für eine Keratinocytenzelle aufweist, und wobei der Abschnitt weiterhin Methionin am Amino-Terminus umfassen kann.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsfom, weist das KGF-Protein eine spezifische Aktivität von wenigstens ungefähr 3,4 · 10&sup4; Einheiten pro Milligramm Protein auf, worin eine Aktivitätseinheit definiert ist als die Menge, die die Hälfte der maximal möglichen Stimulierung der DNA-Synthese in BALB/M K-Keratinocytenzellen hervorruft.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das KGF-Protein Met am Amino-Terminus.
Demgemäß betrifft die Erfindung zum Teil gereinigten KGF oder gereinigte KGF-ähnliche Proteine sowie Verfahren zur Herstellung dieser Proteine. Diese gereinigten Faktoren können durch Kultivierung von menschlichen Zellen, die von Natur aus diese Proteine sezernieren, und Anwendung von Isolierungsverfahren gemäß der praktischen Umsetzung dieser Erfindung hergestellt werden. Diese Proteine können in biochemischen und biologischen Untersuchungen eingesetzt werden, die beispielsweise zur Isolierung von DNA-Abschnitten führen, die KGF oder KGF-ähnliche Polypeptide kodieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls DNA-Abschnitte, die derartige KGF- oder KGF-ähnliche Proteine kodieren. In einer Hauptausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung DNA-Abschnitte, die KGF-verwandte Produkte kodieren, bestehend aus den humanen cDNA-Klonen 32 oder 49, die aus polyadenylierter RNA stammen, welche aus der Fibroblastenzelllinie M426 aus der Lunge menschlicher Embryonen extrahiert wurde, sowie Rekombinanten und Mutanten dieser Klone und verwandte DNA-Abschnitte, die durch Hybridisierung mit einem der vorstehenden humanen DNA-Abschnitte nachgewiesen werden können, wobei die verwandten Abschnitte KGF-ähnliche Proteine oder Teile derselben kodieren.
In der praktischen Umsetzung einer Ausführungsform dieser Erfindung sind die erfindungsgemäßen DNA-Abschnitte in der Lage, in geeigneten Wirtszellen exprimiert zu werden, wodurch KGF oder KGF-ähnliche Proteine erzeugt werden. Die Erfindung betrifft ebenfalls mRNAs, die durch Transkription des kodierenden Strangs der DNA-Abschnitte gemäß dieser Erfindung hergestellt werden.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein rekombinantes DNA-Molekül, das einen Vektor und eine DNA gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst. Diese rekombinanten Moleküle sind beispielsweise Moleküle, die KGF-cDNA und eine der folgenden Vektor-DNAs umfassen: ein Bakteriophagen λ-Klonierungsvektor (zum Beispiel λpCEV9), ein DNA-Sequenzierungs-Plasmidvektor (z. B. eine pUC-Variante), ein Genexpressionsvektor in Bakterien (z. B. pKK233-2) oder ein Genexpressionsvektor in Säugern (wie etwa pMMT).
In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Erfindung eine Zelle, vorzugsweise eine Säugerzelle, die einen Vektor mit einer DNA gemäß der Erfindung umfasst. Ferner umfasst die Erfindung Zellen, einschließlich Insektenzellen, Hefezellen und Bakterienzellen, wie etwa solche von Escherichia coli und B. subtilis, die einen Vektor mit DNAs gemäß der Erfindung enthalten. Gemäß einer weiteren Ausführungsform dieses Aspektes der Erfindung ist die transformierende DNA in der Lage, in einer Zelle exprimiert zu werden, wodurch die Menge des von dieser DNA kodierten KGF oder KGF-ähnlichen Proteins in der Zelle erhöht wird.
Das anhand seiner cDNA-Sequenz vorhergesagte primäre KGF-Translationsprodukt enthält einen N-terminalen hydrophoben Bereich, der wahrscheinlich als Signalsequenz für die Sezernierung dient und in dem reifen KGF-Molekül nicht vorhanden ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des mit Genexpression befassten Aspektes der Erfindung sezerniert die mit der DNA gemäß der Erfindung transformierte Zelle das von dieser DNA kodierte Protein in der trunkierten Form, die von den Fibroblastenzellen aus der Lunge von menschlichen Embryonen sezerniert wird.
Ferner sieht diese Erfindung KGF oder KGF-ähnliche Proteine vor, der bzw. die durch Expression einer erfindungsgemäßen DNA oder durch Translation einer erfindungsgemäßen RNA erzeugt wird bzw. werden. Vorzugsweise werden diese Proteine in der sezernierten Form (d. h. ohne ersichtliche Signalsequenz) vorliegen. Diese Proteinfaktoren können in funktionellen Untersuchungen eingesetzt werden und für zusätzliche Struktur- und Funktionsanalysen, wie etwa qualitative und quantitative Rezeptorbindungstests aufgereinigt werden.
Die Möglichkeit, mittels rekombinanter Methoden große Mengen dieses neuartigen Wachstumsfaktors zu produzieren, wird die Erprobung seiner klinischen Anwendbarkeit bei Zuständen, bei denen eine spezifische Stimulierung des Epithelzellwachstums von besonderer Bedeutung ist, erlauben. Demgemäß schließt diese Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen ein, die KGF oder KGF-ähnliche Polypeptide beinhalten und zur Behandlung von derartigen Zuständen verwendbar sind, unter anderem beispielsweise Heilung von Brandwunden oder Stimulierung von transplantiertem Cornea-Gewebe.
Gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung sind die neuartigen KGF-ähnlichen Proteine Proteinprodukte von "nicht modifizierten" erfindungsgemäßen DNAs bzw. mRNAs oder modifizierte bzw. gentechnisch manipulierte Proteinprodukte. Wegen der gentechnisch eingeführten Mutationen in den DNA-Sequenzen werden sich die modifizierten KGF-ähnlichen Proteine an einer oder mehreren Stellen ihrer Aminosäuresequenz von den entsprechenden natürlichen "Wildtyp"-Proteinen unterscheiden. Gemäß einer Ausführungsform dieses Aspektes der Erfindung werden die modifizierten KGF-ähnlichen Proteine "chimäre" Moleküle einschließen, die einen KGF oder mindestens ein anderes Mitglied der FGF-Peptidfamilie umfassen.
Angesichts der Ergebnisse aus erfolgreichen vergleichbaren Ansätzen mit anderen Peptidfaktoren, die ähnliche Eigenschaften aufweisen, sollte die Entwicklung derartiger chimärer KGF-ähnlicher Polypeptide schließlich zu einer "zweiten Generation" von überlegenen KGF-ähnlichen Peptiden für klinische Zwecke führen. Diese modifizierten KGF-ähnlichen Produkte könnten zum Beispiel kleiner, stabiler, wirksamer und/oder einfacher bzw. kostengünstiger herzustellen sein.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren zur Stimulierung von Epithelzellen in vitro bereitgestellt, das den Schritt des Hinzufügens einer für die Stimulierung des Epithelzellwachstums ausreichenden Menge der Zusammensetzung mit KGF-Protein oder chimärem Protein umfasst.
Diese Erfindung umfasst ferner neuartige Biotest-Verfahren zum Nachweis der Expression der mRNAs und Proteine, die von den mit den erfindungsgemäßen DNA-Abschnitten verwandten Genen erzeugt werden, in menschlichen Zellen. Gemäß einer derartigen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen DNAs als Sonden zur Bestimmung von "steady state"-Mengen oder zur Ermittlung der Induktionskinetik von verwandten mRNAs eingesetzt werden. Die Verfügbarkeit der KGF-verwandten cDNA-Klone ermöglicht es herauszufinden, ob eine anomale Expression dieses Wachstumsfaktors an klinischen Zuständen beteiligt ist, die sich durch übermäßiges Epithelzellwachstum auszeichnen, einschließlich Dysplasie und Neoplasie (z. B. Psoriasis, bösartige oder gutartige epitheliale Tumoren).
Diese Erfindung sieht ebenfalls neuartige Antikörper vor, die gegen ein Peptid erzeugt werden, das von einem erfindungsgemäßen DNA-Abschnitt kodiert wird. In dieser Ausführungsform der Erfindung sind die Antikörper monoklonaler oder polyklonaler Herkunft und werden mit KGF-verwandten Polypeptiden erzeugt, die aus natürlichen Quellen stammen oder durch Rekombinations- oder Syntheseverfahren erhalten werden.
Die erfindungsgemäßen Antikörper binden spezifisch an KGF-Protein oder an ein KGF-ähnliches Protein, das die Sequenz eines derartigen Peptids beinhaltet, und zwar bevorzugt an das Protein in seiner nativen (biologisch aktiven) Konformation. Diese Antikörper können zum Nachweis oder zur Reinigung des KGF verwendet werden; Antikörper können zum Nachweis oder zur Reinigung von KGF oder KGF-ähnlichen Proteinfaktoren verwendet werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung werden die Antikörper die wachstumsfördernde Aktivität von KGF neutralisieren; sie ermöglichen dadurch Untersuchungen über den Mechanismus und schließlich auch die Therapie von klinischen Zuständen, an denen ein hoher KGF-Spiegel beteiligt ist.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. I-1 stellt die Ergebnisse einer Heparin-Sepharose-Affinitätschromatographie von konditioniertem Medium der M426-Fibroblasten aus menschlichen Embryonen dar; sie zeigt, dass über 90% der mitogenen Aktivität auf Maus-Keratinocyten (BALB/MK) bei 0,6 M NaCl eluiert wird. Etwa 150 ml des Ultrafiltrationsrückstands aus mehreren Litern konditionierten Mediums der M426-Fibroblasten wurden binnen 1 Stunde in eine Heparin-Sepharose-Säule (6 ml Säulenbettvolumen) aufgetragen. Nach Waschung der Säule mit 150 ml des Äquilibrierungspuffers (20 mM Tris-HCl, pH 7,5 und 0,3 M NaCl) wurde das zurückgehaltene Protein (< 5% des Gesamtproteins in dem Rückstand) mit einem modifizierten linearen Gradienten mit zunehmender NaCl-Konzentration eluiert. Die Größe der Fraktionen war 3,8 ml und die Durchflussgeschwindigkeit während der Gradientenelution war 108 ml/Std. Um den Einbau von ³H-Thymidin in BALB/MK-Zellen wie in den Methoden beschrieben zu testen, wurden 2 ul aus den angegebenen Fraktionen in die Vertiefungen von Mikrotiterplatten mit einem Endvolumen von 0,2 ml transferiert.
Fig. I-2 veranschaulicht die Ergebnisse einer weiteren Reinigung des Mitogens aus humanen Fibroblasten mit Hilfe von HPLC mit einer Adsorptionsmatrix. Abbildungsteil (A) zeigt das Profil der mitogenen Aktivität auf BALB/MK in Umkehrphasen-(C&sub4;)-HPLC. Abbildungsteil (B) stellt die Elektrophorese-Analyse (in NaDodSO&sub4;/PAGE) ausgewählter Fraktionen aus der in Abbildungsteil A gezeigten C&sub4;-Chromatographie dar; er zeigt, dass in einem mit Silber gefärbten Gel die Fraktionen in dem HPLC-Peak eine einzige Bande enthielten. Abbildungsteil (C) ist ein Balkendiagramm der DNA-Synthese in BALB/MK-Zellen, die durch die in Abbildungsteil B analysierten Fraktionen ausgelöst wurde; die Daten zeigen, dass über das gesamte Aktivitätsprofil hinweg die relative mitogene Aktivität mit der Intensität der Proteinbande genau korrelierte.
(A) Umkehrphasen-C&sub4;-HPLC der mitogenen Aktivität auf BALB/MK-Zellen. Die mit 0,6 M NaCl- Lösung aus Heparin-Sepharose eluierten aktiven Fraktionen wurden mit einem Centricon-10 konzentriert und in eine mit einer Lösung mit 0,1% Trifluoressigsäure und 20% Acetonitril (ACN) äquilibrierte C&sub4;-Vydac-Säule (4,6 · 250 mm) direkt aufgetragen. Nach Waschung der Säule mit 4 ml des Äquilibrierungspuffers wurde die Probe mit einem modifizierten linearen Gradienten von zunehmender ACN-% eluiert. Die Größe der Fraktionen war 0,2 ml und die Durchflussgeschwindigkeit 0,5 ml/min. Zur Testung des ³H-Thymidin-Einbaus in BALB/MK-Zellen wurden aliquote Teile sogleich mit einer Lösung mit 50 mg/ml Rinderserumalbumin und 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10fach verdünnt und bei einer 200fachen Endverdünnung getestet. (B) Analyse ausgewählter Fraktionen aus der in Abbildungsteil A gezeigten C&sub4;-Chromatographie in NaDodSO&sub4;PAGE. Die Hälfte jeder Fraktion wurde getrocknet, in einer NaDodSO&sub4;/ 2-Mercaptoethanol-Lösung wieder gelöst, mit Hitze denaturiert und einer Elektrophorese in einem 14%igen Polyacrylamidgel unterzogen, das anschließend mit Silber gefärbt wurde. Die Position jedes Eichmoleküls (Masse in kDa) wird mit einem Pfeil angezeigt. (C) Die DNA-Synthese in BALB/MK-Zellen wurde durch die in Abbildungsteil B analysierten Fraktionen ausgelöst. Die Aktivität wird als die x-fache Stimulation gegenüber dem Hintergrundpegel ausgedrückt, der 100 cpm betrug.
Fig. I-3 stellt einen Reinigungsschritt als Alternative zu der RP-HPLC dar, in dem eine Siebchromatographie (sieving chromatography) in einer (TSK-G3000SW-GIasPac)-Säule mit einer wässrigen Lösung mit nahezu physiologischem pH-Wert als Eluent durchgeführt wird; dies ergab einen großen Peak von mitogener Aktivität in dem BALB/MK-Biotest.
Molekularsieb-HPLC(TSK-3000SW)-Chromatographie der mitogenen Aktivität auf BALB/MK-Zellen. Etwa 50 ul eines mit einem Centricon konzentrierten HSAC-Pools mit 0,6 M NaCl wurden in eine LKB-GlasPac-TSK-G3000SW-Säule (8 · 300 mm) aufgetragen, die vorab mit einer Lösung mit 20 mM Tris-HCl, pH 6,8 und 0,5 M NaCl äqulibriert worden war, und bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 0,4 ml/min in Fraktionen von 0,2 ml eluiert. Zur Testung des ³H-Thymidin-Einbaus in BALB/MK-Zellen wurden aliquote Teile von 2 ul in die Vertiefungen von Mikrotiterplatten mit einem Endvolumen von 0,2 ml transferiert. Die Positionen, an denen die Eichmoleküle (Masse in kDa) eluiert werden, sind mit Pfeilen angedeutet.
Fig. I-4 veranschaulicht einen Vergleich der DNA-Synthese in BALB/MK-Zellen als Reaktion auf TSK-gereinigtes Mitogen und andere Wachstumsfaktoren.
Vergleich der DNA-Synthese in BALB/MK-Zellen als Reaktion auf TSK-gereinigtes Mitogen und andere Wachstumsfaktoren. Es wurde der Einbau von ³H-Thymidin in Trichloressigsäureunlösliche DNA, der als die x-fache Stimulierung über den Hintergrundpegel angegeben wird, bei verschiedenen Konzentrationen der angegebenen Wachstumsfaktoren ermittelt. Ohne Probe betrugen die Hintergrundpegel 150 cpm. Die Ergebnisse stellen Mittelwerte aus zwei unabhängigen Versuchen dar. Wiederholungen dieser Versuche ergaben Abweichungen von den Mittelwerten von weniger als 10% TSK-gereinigtes Mitogen, , EGF, , aFGF, , bFGF, .
Fig. I-5 zeigt einen Vergleich des Wachstums von BALB/MK-Zellen in einem chemisch definierten Medium als Reaktion auf verschiedene Kombinationen von Wachstumsfaktoren.
Vergleich des Wachstums von BALB/MK-Zellen in einem chemisch definierten Medium als Reaktion auf verschiedene Kombinationen von Wachstumsfaktoren. Die Kulturen wurden in einer Zelldichte von 2,5 · 10&sup4; Zellen pro Schale auf 35-mm-große Petrischalen ausplattiert, die zuvor mit Poly-D-Iysin/Fibronectin in einem 1 : 1-Gemisch von Eagle's Minimalmedium (Eagle's minimal essential medium) und Ham's F12-Medium, ergänzt mit Transferrin, Na&sub2;SeO&sub3;, Ethanotamin und den nachstehend angegebenen Wachstumsfaktoren, beschichtet wurden. Nach 10 Tagen wurden die Platten fixiert und mit Giemsa gefärbt. Schlüssel: a) kein Wachstumsfaktor; b) nur EGF; c) nur Insulin; d) nur KGF; e) EGF + Insulin. Die Endkonzentration der Wachstumsfaktoren war folgende: EGF, 20 ng/ml; Insulin 10 ug/ml, und KGF, 40 ng/ml.
Tabelle 1-I fasst die Ergebnisse aus verschiedenen Reinigungsschritten zusammen; diese belegen, dass die Molekularsieb-Chromatographie eine weit höhere Aktivitätsausbeute liefert als das Adsorptions-RP-HPLC-Verfahren.
Die Berechnung der Ausbeute erfolgte unter der Annahme, dass die gesamte mitogene Aktivität in dem Ausgangsmaterial auf den isolierten Faktor zurückzuführen war.
* Eine Aktivitätseinheit wird als die Hälfte der maximalen Stimulation des durch den TSK-gereinigten Faktor induzierten Thymidin-Einbaus in dem BALB/MK-Biotest definiert, bei dem etwa 3 ng des TSK-gereinigten Faktors 1 Aktivitätseinheit stimulierten.
a Das Protein wurde mit dem Bradford-Reagenz von BioRad (I-23) bestimmt.
b Das Protein wurde bei A = 140 bestimmt.
Tabelle I-2 fasst die Daten zur Zielzellen-Spezifität verschiedener Wachstumsfaktoren zusammen; sie zeigt, dass der jüngst isolierte Faktor eine starke mitogene Wirkung auf Keratinocyten (BALB/MK) aufweist, jedoch im auffälligen Gegensatz dazu keine nachweisbaren Wirkungen auf Fibroblasten oder auf humane Endothel-Zellen aus der Vena saphena.
Vergleich des maximalen, durch KGF oder andere Wachstumsfaktoren stimulierten Thymidin- Einbaus in einer Vielzahl von Zelllinien, angegeben als x-fache Stimulierung gegenüber dem Hintergrundpegel.
Diese Daten stellen eine Zusammenfassung aus vier verschiedenen Versuchen dar.
* Maximale Stimulierung durch aFGF erforderte die Anwesenheit von 20 g/ml Heparin (Sigma). n.e. = nicht ermittelt.
Fig. II-1 stellt die Nukleotidsequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz von KGF-cDNA sowie die Identifizierung von durch Transkription des KGF-Gens entstandenen RNAs dar. Abschnitt (A) skizziert eine schematische Darstellung der humanen KGF-cDNA-Klone. Abschnitt (B) stellt die Nukleotidsequenz der KGF-cDNA und die vorhergesagte Aminosäuresequenzen dar. (C) Identifizierung der RNA-Transkripte der KGF-Gene durch Northem-Blot-Analyse.
Nukleotidsequenz von KGF-cDNA und davon abgeleitete Aminosäuresequenz sowie Identifizierung der KGF-Gentranskripte. (A) Schematische Darstellung der humanen KGF-cDNA-Klone. Die überlappenden pCEV9-Klone 32 und 49, die zur Ermittlung der Sequenz benutzt wurden, werden über dem Diagramm der vollständigen Struktur gezeigt, in dem die nichttranslatierten Bereiche durch eine Linie und die kodierende Sequenz in einem Rahmen dargestellt werden. Der schraffierte Bereich kennzeichnet Sequenzen des Signalpeptids und den offenen Bereich des reifen Proteins. Ausgewählte Restriktionsschnittstellen sind angegeben. (B) Nukleotidsequenz der KGF-cDNA und vorhergesagte Aminosäuresequenz. Nukleotide sind rechts numeriert; Aminosäuren sind durchgängig numeriert. Die von gereinigtem KGF abgeleitete N-terminale Peptidsequenz ist unterstrichen. Die hydrophobe N-terminale Domäne ist kursiv angegeben. Die mögliche Stelle für asparragingebundene Glykosylierung ist mit einem Strich oben markiert. Die Varianten des Polyadenylierungssignals, AATTAA und AATACA, in der Nähe des 3'-Endes der RNA sind in einem Kästchen eingeschlossen. (C) Identifizierung von KGF-mRNAs durch Northem-Blot-Analyse. Spuren a und c, poly(A)-ausgewählte M426-RNA; Spur d, Gesamt-RNA aus M426-Zellen. Die Filter wurden mit einem 32P-markierten, 695 bp langen BamHI/Bc/I-Fragment aus dem Klon 32 (Sonde A, Fig. II-1A) - Spuren a und b - oder mit einem 541 bp langen ApaII/EcoRI-Fragment aus dem Klon 49 (Sonde B, Fig. II-1A) - Spuren c und d - hybridisiert.
Fig. II-2 veranschaulicht den topologischen Vergleich von verwandten Molekülen aus der FGF- Familie, einschließlich KGF, insbesondere bezüglich der zwei Proteindomänen mit ausgeprägter Homologie, der vermutlichen Signalpeptidsequenzen und der zwei konservierten Cystein-Reste.
Topologischer Vergleich von verwandten Molekülen aus der FGF-Familie. Die zwei Proteindomänen mit ausgeprägter Homologie sind als grau schattierte Kästchen dargestellt. Schraffierte Kästchen kennzeichnen vermutliche Signalpeptidsequenzen. Die Positionen von zwei konservierten Cystein-Resten (C) sind angegeben.
Fig. II-3 zeigt (Northem-Blot-)Analysen der Expression von KGF-verwandter mRNA in ausgewählten normalen humanen Zeillinien und Geweben; sie zeigt, dass in RNA aus Fibroblasten aus der Lunge menschlicher Embryonen sowie aus Hautfibroblasten von Erwachsenen ein einzelnes Transkript von 2,4 kb vorhanden war, während in der (B5/589)-Epithelzelllinie, in der (HA83)-Gliazelllinie oder in primären Kulturen von humanen Endothel-Zellen der Vena saphena kein Transkript nachgewiesen wurde.
Northern-Blot-Analyse von KGF-mRNA in normalen humanen Zelllinien und Geweben und Vergleich mit der mRNA-Expression anderer Wachstumsfaktoren, deren Wirkung auf Epithelzellen bekannt ist. Gesamt-RNA wurde durch Cesiumtrifluoracetat-Gradientenzentrifugation aus Zellen isoliert. 10 ug RNA wurden denaturiert und einer Elektrophorese in 1%igen Formaldehyd-Gelen unterzogen. Nach einer sanften alkalischen Denaturierung (50 mM NaOH 30 Min lang) wurde die RNA mit einer 1 M Ammoniumacetat-Lösung als Trägerlösung auf Nitrocellulosefilter transferiert. Die Filter wurden mit einer ³²P-markierten cDNA-Sande, die das 547-bp-lange EcoRI-Fragment von dem 5'-Ende der kodierenden Sequenz von KGF (A) enthielt, oder mit ähnlichen Proben aus DNAs der anderen Wachstumsfaktoren hybridisiert. Folgende menschliche Zelltypen wurden verwendet: Plattenepithelkarzinome (A253, A388 und A431), Brustepithelzellen (56 und R1), mit Ad12-SV40 immortalisierte Keratinocyten, primäre humane Keratinocyten, Vorhaut-Fibroblasten von Neugeborenen (AG1523), Hautfibroblasten von Erwachsenen (501T) und Fibroblasten aus der embryonalen Lunge (WI-38 und M426).
Tabelle II-I fasst einen Vergleich der Wirkung von Heparin auf die mitogene Aktivität von KGF mit der Wirkung auf andere Wachstumsfaktoren zusammen; sie zeigt, dass der Thymidin-Einbau in DNA von BALB/MK-Zellen als Reaktion auf KGF durch Heparin gehemmt wurde, während dagegen die Aktivität von aFGF und bFGF durch die gleiche Behandlung gesteigert wurde.
Die Zellen wurden in Mikrotiterplatten ausplattiert und in serumhaltigem Medium bis zur Konfluenz wachsen gelassen, um dann in den letzten 24-72 Std. vor Zugabe der Probe in ein serumfreies Medium gegeben zu werden. Die Mitogenese-Tests wurden wie beschrieben durchgeführt (siehe Versuchsteil I, vorstehend und II-3). Wo angegeben, enthielt das Kulturmedium Heparin in einer Endkonzentration von 20 ug/ml. Die Konzentration aller Wachstumsfaktoren war 50 ng/ml. Die Ergebnisse sind als x-fache Stimulierung des ³H-Thymidin-Einbaus in die angegebene Testzelle in Gegenwart (+) oder Abwesenheit (-) von Heparin angegeben. Jeder Wert stellt den Mittelwert von zwei unabhängigen Versuchen dar, bei denen wiederum jeder Punkt den Mittelwert von Doppelanalysen darstellt.

BESCHREIBUNG BESONDERER AUSFÜHRUNGSFORMEN

Diese Erfindung betrifft zu einem Teil gereinigten KGF oder gereinigte KGF-ähnliche Proteine wie vorstehend definiert sowie Verfahren zur Herstellung dieser Proteine. Eine Hauptausführungsform dieses Aspektes dieser Erfindung betrifft homogenen KGF, gekennzeichnet durch ein anhand der NaDodSO&sub4;/PAGE-Wanderung ermitteltes scheinbares Molekulargewicht von etwa 28 kDa, durch Wanderung als einzelner Peak in einer Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie und durch eine spezifische Aktivität von wenigstens ungefähr 3,4 · 10&sup4; Einheiten pro Milligramm, vorzugsweise wenigstens ungefähr 3,2 · 10&sup5; Einheiten pro Milligramm, wobei eine Einheit von Aktivität als die Menge definiert ist, die unter herkömmlichen Testbedingungen wie nachstehend angegeben die Hälfte der maximal möglichen Stimulierung der DNA-Synthese in bestimmten Epithelzellen (Keratinocyten) hervorruft.
Zur Identifizierung neuartiger Epithelzelltypen-spezifischer Wachstumsfaktoren wurde als Indikatorzelle zum Nachweis derartiger Faktoren eine als BALB/MK (I-6) bezeichnete klonale Keratinocytenzelllinie aus BALB/c-Mäusen benutzt. Selbst in serumhaltigem Medium benötigen diese Zellen zum Wachsen die exogene Zugabe eines Epithelzellenmitogens (I-6). Die Entwicklung eines chemisch definierten Mediums für diese Zellen ermöglichte den Nachweis, dass die BALB/MK-Zellen zu ihrer Proliferation zwei wichtige mitogene Mechanismen benötigen. An einem Mechanismus ist der Insulinähnliche Wachstumsfaktor I (oder Insulin in hohen Konzentrationen) beteiligt und der andere Mechanismus benötigt den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), den transformierenden Wachstumsfaktor α (TGFα), den sauren Fibroblastenwachstumsfaktor (aFGF) oder den basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFBF) (I-7).
Unter Verwendung von BALB/MK-Zellen als Epithelzelllinien-Prototyp und von NIH/3T3 als entsprechender Fibroblastenzelllinie wurden konditionierte Medien aus verschiedenen menschlichen Zelllinien auf neuartige Epithelzellen-spezifische Mitogene hin getestet. Diese Biotests in dieser Erfindung ermöglichten die Reinigung eines solchen neuartigen Wachstumsfaktors, der von einer Fibroblastenzelllinie aus der Lunge menschlicher Embryonen freigesetzt wird und hier als Keratinocytenwachstumsfaktor (KGF) bezeichnet wird, bis zur Homogenität.
Kurz gefasst: Der Biotest für KGF-ähnliche Aktivität unter herkömmlichen Bedingungen umfasst folgende Schritte:
(i) Maus-Keratinocyten (BALB/MK-Zellen) werden bis zur Konfluenz kultiviert und dann 24-72 Std. lang in serumfreiem Medium gehalten;
(ii) nach Zugabe der zu testenden Proben wird die Stimulierung der DNA-Synthese anhand des Einbaus von ³H-Thymidin in mit Säure ausfällbare DNA ermittelt.
Um die Zielzellen-Spezifität eines mitogenen Wachstumsfaktors zu ermitteln, kann die Stimulierung der DNA-Synthese, die als Verhältnis zwischen der stimulierten Synthese und dem Hintergrundpegel des Thymidin-Einbaus in Abwesenheit der zugesetzten Testprobe angegeben wird, mit der analogen Stimulierung verglichen werden, die in von Keratinocyten verschiedenen Zellen unter den gleichen Testbedingungen beobachtet wird. In derartigen Vergleichen zeigt die mitogene Aktivität von KGF eine ausgeprägte Spezifität für Keratinocyten (mindestens ungefähr 500mal höhere Stimulierung) im Vergleich zu Fibroblasten, und verhältnismäßig geringere, jedoch signifikant höhere (wenigstens ungefähr 50mal höhere) Aktivität auf Keratinocyten im Vergleich zu anderen beispielhaften Epithelzelltypen (weitere Daten stehen in Tabelle I-2, Einzelheiten über die herkömmlichen Bedingungen des Biotests bieten die Methoden im Versuchsteil I).
Eine zur detaillierten Charakterisierung der physikalischen und biologischen Eigenschaften von KGF hinreichende Menge wurde mit einem Verfahren zur Herstellung von KGF isoliert, das die Kultivierung von Zellen und die Isolierung von mitogener Aktivität beinhaltet, wobei das erfindungsgemäße Verfahren eine Ultrafiltration, eine Heparin-Sepharose-Affinitätschromatographie (HSAC) und eine Adsorptions-Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) oder eine Molekularsieb-HPLC (TSK-HPLC) umfasst.
Zusammenfassend: Das Verfahren zur Herstellung von KGF aus produzierenden Zellen, wie zum Beispiel M426-Fibroblasten aus menschlichen Embryonen (I-8), umfasst folgende Schritte:
(i) Herstellung von konditioniertem Medium (z. B. 10 Liter) mit einschichtigen Zellkulturen, die abwechselnd in serumhaltigem und serumfreiem Medium kultiviert werden, und Lagerung des gesammelten serumfreien Mediums bei -70ºC bis zur weiteren Verwendung;
(ii) Konzentrierung durch Ultrafiltration mit Membranen, die eine Ausschlussgrenze bei einem Molekulargewicht von 10 kDa aufweisen, in mehreren aufeinanderfolgenden Schritten, zwischen denen eine Verdünnung mit Puffer (zum Entfemen von niedermolekularen Substanzen) durchgeführt wird, und anschließende fakultative Lagerung bei -70ºC;
(iii) Affinitätschromatographie in an einen polymeren Träger (z. B. Sepharose) gekoppeltem Heparin und Eluierung mit einem Gradienten mit zunehmender NaCl-Konzentration;
(iv) mindestens zehn- bis zwanzigfache Konzentrierung mit Ultrafiltrationsapparaten für kleine Mengen, die eine Ausschlussgrenze bei einem Molekulargewicht von 10 kDa aufweisen (z. B. mit einem Centricon-10-Mikrokonzentrator von Amicon) und Lagerung bei -70ºC.
Der nächste Schritt des Aufreinigungsverfahrens umfasst entweder Schritt (v) oder alternativ Schritt (vi) wie folgt:
(v) Umkehrphasen-HPLC der aktiven Fraktionen (Pool bei 0,6 M NaCl) aus dem vorausgegangenen HSAC-Schritt in organischen Lösungsmittelsystemen, oder
(vi) Molekularsieb-HPLC (z. B. in einer TSK-G3000SW-Glas-Pac-Säule von LKB) in wässrigem Puffer mit nahezu physiologischem pH-Wert (z. B. Tris-HCl, pH 6,8 und 0,5 M NaCl) und anschließende Lagerung bei -70ºC.
Einer mit Silber gefärbten NaDodSO&sub4;/PAGE nach zu urteilen (Daten nicht gezeigt), war die durch den TSK-Schritt (vi) erhaltene Präparation fast so rein wie die mit RP-HPLC erhaltene Präpara tion; das TSK-Verfahren lieferte jedoch eine deutlich höhere Ausbeute an Aktivität (Tabelle I-1). Darüber hinaus hatte das TSK-gereinigte Material eine höhere spezifische Aktivität als das RP-HPLC-Material. Mit dem vorstehenden TSK Verfahren hergestellter KGF in subnanomolaren Konzentrationen stimulierte die DNA-Synthese in Epithelzellen, vermochte jedoch bei vergleichbaren oder sogar höheren Konzentrationen (bis zu 5 nM) den Thymidin-Einbau in die DNA von Fibroblasten oder Endothel-Zellen nicht zu induzieren. Die Aktivität war empfindlich gegen Säure, Wärme und die im RP-HPLC-Schritt verwendeten Lösungsmittel (siehe Versuchsteil I für Daten über Empfindlichkeit und weitere Einzelheiten des Herstellungsverfahrens).
Mit den herkömmlichen, im Stand der Technik bekannten Methoden wurde für die Positionen 2-13 ab dem Amino-Terminus des gereinigten KGF folgende eindeutige Sequenz ermittelt: Asn-Asp- Met-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Thr-Asn-Val (siehe Versuchsteil I).
Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls DNA-Abschnitte ein, die KGF bzw. KGF-ähnliche Polypeptide kodieren. Beispiele für die erfindungsgemäßen DNAs sind DNAs, die hier wie folgt bezeichnet werden: humane cDNA-Klone 32 und 49, die von polyadenylierter, aus der Fibroblastenzelllinie M426 aus der Lunge menschlicher Embryonen extrahierter RNA stammen, sowie Rekombinanten und Mutanten dieser Klone und verwandte DNA-Abschnitte, die durch Hybridisierung mit diesen DNA-Abschnitten nachgewiesen werden können.
Wie im Versuchsteil II beschrieben, wurden für die Suche nach cDNA-Klonen, die dem bekannten Teil der KGF-Aminosäuresequenz entsprechen, zwei Gruppen von Oligonukleotid-Sonden erzeugt, die auf sämtlichen möglichen Nukleotidsequenzen beruhen, die die aus neun Aminosäuren bestehende Sequenz Asn-Asp-Met-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala kodieren. Mit aus der Fibroblastenzelllinie M426 aus der Lunge menschlicher Embryonen, der ursprünglichen Quelle des Wachstumsfaktors, extrahierter polyadenylierter RNA wurde in einem cDNA-Klonierungsvektor λpCEV9 eine cDNA-Genbank erzeugt. Durch Screening der Genbank (9 · 10&sup5; Plaques) mit den ³²P-markierten Oligonukleotiden wurden 88 Plaques identifiziert, die mit beiden Proben hybridisierten.
Unter 10 aus den Plaques isolierten und analysierten Klonen enthielt ein Klon, als Klon 49 bezeichnet, ein cDNA-Insert von 3,5 kb, während die anderen Klone Inserts mit einer Länge zwischen 1,8 kb und 2,1 kb enthielten. Bei der Analyse der kleineren Klone fanden sich mehrere gemeinsame Restriktionsschnittstellen, und die Sequenzierung eines repräsentativen kleineren Klons, Klon 32, zusätzlich zu Klon 49, zeigt, dass die cDNAs sich überlappen (Fig. II-1A). Die Anordnung der zwei cDNAs ergab eine zusammenhängende Sequenz von 3,85 kb, die die vollständige kodierende Sequenz für KGF enthielt. Die Nukleotidsequenz des kodierenden Stranges der DNA sowie die vorhergesagte kodierte primäre Proteinsequenz werden in der ganzen Länge der zusammengesetzten KGFcDNA-Sequenz in Fig. II-1B gezeigt.
Diese DNAs, die cDNA-Klone 32 und 49, sowie rekombinante Formen dieser Abschnitte, die die vollständige kodierende Sequenz für KGF umfassen, sind die bevorzugtesten DNAs dieser Erfindung.
Aus der cDNA-Sequenz läßt sich entnehmen, dass die primären KGF- und hst-Translationsprodukte hydrophobe N-terminale Bereiche enthalten, die wegen der Ähnlichkeit mit derartigen Sequenzen in einer Vielzahl anderer Proteine wahrscheinlich als Signalsequenzen dienen.
Dementsprechend ist diese N-terminale Domäne in dem gereinigten reifen KGF-Molekül, das von humanen embryonalen Fibroblasten sezerniert wird, nicht vorhanden.
Femer teilt KGF mit allen anderen Mitgliedern der FGF-Familie zwei wichtige Homologiebereiche, die sich über die Aminosäuren 65-156 und 162-189 der vorhergesagten KGF-Sequenz erstrecken und durch kurze nicht-homologe Aminosäuresequenzen getrennt sind, die bei den verschiedenen Familienmitgliedern unterschiedliche Längen aufweisen. Die Sequenz der gereinigten Form von KGF enthält fünf Cystein-Reste, von denen zwei in der gesamten Familie der FGF-verwandten Proteine konserviert sind. In der gesamten KGF-Sequenz treten fünf Paare von basischen Resten auf. Dieses Muster wurde auch bei anderen Mitgliedern der FGF-Familie beobachtet.
Es sollte für Fachleute auf diesem Gebiet naheliegend sein, dass es durch Verwendung der erfindungsgemäßen DNAs und RNAs, und insbesondere der besonders bevorzugten, vorstehend angegebenen DNAs in Hybridisierungsverfahren (wie etwa Southern-Blot-Analysen von humanen genomischen DNAs) möglich ist, ohne aufwendiges Experimentieren genomische Genbanken oder cDNA-Genbanken zu durchmustern, um andere KGF-ähnliche DNAs zu finden, die unter den Schutzumfang dieser Erfindung fallen. Durch Verwendung der erfindungsgemäßen DNAs können ferner genetische Marker, die mit dem KGF-Gen in Verbindung stehen, wie etwa Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLPs) identifiziert und mit vererblichen klinischen Zuständen in Verbindung gebracht werden, an denen dieses Gen oder andere benachbarte Gene beteiligt sind.
Diese Erfindung schließt ebenfalls modifizierte Formen der KGF-DNAs ein. Gemäß der Hauptausführungsform dieses Aspekts der Erfindung kodieren derartige modifizierte DNAs KGF-ähnliche Proteine, die ein KGF-Protein und mindestens ein anderes Mitglied der FGF-Peptidfamilie umfassen. Da zwischen der sezernierten Form von KGF und analogen Positionen bei anderen FGF-verwandten Proteinen keine signifikante N-terminale Homologie besteht, können also beispielsweise Polypeptide mit neuartigen strukturellen und funktionellen Eigenschaften erzeugt werden, indem in den KGF- DNA-Abschnitt anstelle seiner eigenen NH&sub2;-terminalen Sequenz DNA-Abschnitte eingebaut werden, die N-terminale Abschnitte anderer Polypeptide der FGF-Peptidfamilie kodieren.
Mit Hilfe von Polypeptid-Chimären, die durch derartige modifizierte DNAs erzeugt werden, kann untersucht werden, ob allein die NH&sub2;-terminale Domäne von KGF für seine einzigartige Zielzellen- Spezifität verantwortlich ist. Untersuchungen über Chimären sollten ebenfalls Information darüber liefern, welche Domänen zu der unterschiedlichen Wirkung von Heparin auf ihre biologische Aktivität beitragen.
Tatsächlich hat sich die Nützlichkeit dieses Ansatzes bereits bestätigt, und zwar durch die erfolgreiche Bereitstellung und Expression eines chimären Moleküls, bei dem etwa 40 Aminosäuren vom NH&sub2;-Terminus der sezernierten Form von KGF (anfangend mit dem Amino-terminalen Cys-Rest der reifen Form von KGF mit der Nummer 32 in Fig. II-1 und endend an dem KGF-Rest 78, Arg) an etwa 140 Aminosäuren des C-terminalen Bereichs (core) von aFGF (beginnend bei Rest 39, Arg, und folgend bis zum C-terminalen Ende der kodierenden Sequenz von aFGF) gekoppelt sind. Dieses chimäre Produkt hat wie KGF eine Präferenz für Keratinocyten als Zielzellen, ihm fehlt jedoch die Heparinsensitivität, eine Eigenschaft, die eher aFGF als KGF entspricht. Dieser neuartige KGF-ähnliche Wachstumsfaktor kann sich bei der klinischen Anwendung dort als vorteilhaft erweisen, wo die Verabreichung eines Epithelzellen spezifischen Wachstumsfaktors in Gegenwart von Heparin, einem verbreitet eingesetzten Antikoagulans, gewünscht wird. Weitere Details zum Aufbau dieses chimären Moleküls und zu den Eigenschaften des Polypeptids werden in Versuchsteil II angegeben.
Andere erfindungsgemäße DNAs schließen die folgenden rekombinanten DNA-Moleküle ein, die eine KGF-cDNA und eine der folgenden, beispielhaft angegebenen Vektor DNAs umfassen: ein Bakteriophagen λ-Klonierungsvektor (λpCEV9), ein DNA-Sequenzierungs-Plasmidvektor (eine pUC-Variante), ein Expressionsvektor in Bakterien (pKK233-2) oder ein Expressionsvektor in Säugern (pMMT/neo). Als Beispiel für derartige rekombinante DNAs werden in den Versuchsteilen verschiedene Konstrukte detailliert beschrieben.
Besonders bevorzugte rekombinante Moleküle sind unter anderem: Moleküle, die die kodierende Sequenz der sezernierten Form von KGF und einen Expressionsvektor in Bakterien (z. B. pKK233-2) bzw. eine cDNA, die das vollständige primäre Translationsprodukt (einschließlich des NH&sub2;-terminalen Signalpeptids) und einen Expressionsvektor in Säugern (beispielsweise pMMT), der die eingebauten DNAs in Säugetierzellen (z. B. NIH/3T3) exprimieren kann, umfassen.
Der Aufbau der rekombinanten DNAs, die KGF-DNA und einen Expressionsvektor in Bakterien enthalten, wird im Versuchsteil II beschrieben. Kurz erläutert: Zur Herstellung des Polypeptids in E. coli wurde KGF-cDNA exprimiert, indem ihre kodierende Sequenz unter die Kontrolle des hybriden trk-Promotors in dem Expressionsvektor pKK233-2 (II-31) gestellt wurde.
Zur Bereitstellung von rekombinanten DNAs, die KGF-DNA und einen Vektor für Säuger umfassen und in der Lage sind, die eingebauten DNAs in einer Kultur von humanen oder tierischen Zellen zu exprimieren, können die üblichen Genexpressionstechniken angewandt werden, die sich im Stand der Technik bekannte Verfahren zur Expression eines derartigen, relativ einfachen Polypeptids zunutze machen. Eine spezielle Ausführungsform einer rekombinanten DNA gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung, die den Vektor pMMT für Säuger beinhaltet, wird nachstehend in diesem Teil bei den erfindungsgemäßen rekombinanten Zellen beschrieben.
Die erfindungsgemäßen DNAs und RNAs mit der Sequenz des kodierenden Strangs können zusammen mit den erfindungsgemäßen Verfahren zur Proteinherstellung benutzt werden, um große Mengen von im Wesentlichen reinem KGF oder im Wesentlichen reinen KGF-ähnlichen Proteinen herzustellen. Auf diese Weise hergestelltes, im Wesentlichen reines KGF-Protein kann in diagnostischen Tests unter Anwendung bekannter Methoden benutzt werden, um die Anwesenheit von Rezeptoren für dieses Protein in verschiedenen Körperflüssigkeiten und Gewebeproben zu ermitteln.
Demgemäß umfasst diese Erfindung darüber hinaus eine Zelle, vorzugsweise eine Bakterien- oder eine Säugerzelle, die einen Vektor mit einer erfindungsgemäßen DNA umfasst, wobei die DNA exprimierbar ist. In einer bevorzugten Ausführungsform gemäß diesem Aspekt der Erfindung erzeugt die mit der erfindungsgemäßen DNA transformierte Zelle ein KGF-Protein mit vollständiger mitogener Aktivität. Besonders bevorzugt wird die sezernierte Form dieser Proteine (d. h. ohne ersichtliche Signalsequenz). Diese Proteinfaktoren können in funktionellen Untersuchungen benutzt und für wei tere biochemische und funktionelle Analysen, wie etwa qualitative und quantitative Rezeptorbindungstests gereinigt werden.
Wie in Versuchsteil II detailliert beschrieben, wurden zur Herstellung von KGF rekombinante E. coli-Zellen mit einem bakteriellen Expressionsvektor, pKK233-2, bereitgestellt. Zusammengefasst: Mehrere rekombinante bakterielle Klone wurden mit den üblichen Verfahren für kleine Mengen auf Proteinproduktion hin getestet. Sämtliche getestete Rekombinanten synthetisierten ein Protein, das von Antikörpern gegen ein Amino-terminales KGF-Peptid (siehe unten) erkannt wurde. Eine in einem Liter Kultur angezüchtete Rekombinante erzeugte rekombinanten KGF, der zwar den Thymidin-Einbau in die DNA von BALB/MK-Keratinocytenzellen effizient stimulierte, in NIH/3T3-Fibroblasten jedoch nur geringfügig aktiv war. Die Hälfte der maximalen Stimulierung der BALB/MK Zellen wurden in dem üblichen Keratinocyten-Biotest bei einer Konzentration zwischen 2 und 5 ng/ml erreicht; vergleichsweise wurde bei aus M426-Zellen gereinigtem KGF eine Konzentration von 10 bis 15 ng/ml benötigt.
Ein Liter Bakterienzellen ergab etwa 50 ug des mit Mono-S aufgereinigten rekombinanten KGF. Es ist für Fachleute auf dem Gebiet der Genexpression ersichtlich, dass diese Anfangsausbeute ohne aufwendiges Experimentieren durch Anwendung verschiedener bekannter DNA-Rekombinationstechniken erheblich verbessert werden kann.
Es wurden ebenfalls rekombinante Säugerzellen (NIH/3T3-Mauszellen) bereitgestellt, und zwar mit der vollständigen kodierenden Sequenz der KGF-cDNA (einschließlich des NH&sub2;-terminalen Signalpeptids) und dem Vektor pMMT/neo, der den Metallothionin(MMT)-Promotor von Maus und das selektive Markergen für Neomycin-Resistenz enthält. Mit Hilfe der Biotests der vorliegenden Erfindung werden die Möglichkeiten zur Produktion von KGF in diesen Zellen, und insbesondere die Sezernierung der von humanen Fibroblasten erzeugten reifen Form (ohne Signalpeptid) untersucht. Diese Kombination aus Vektor und Wirtszelle wurde bereits erfolgreich eingesetzt, um verschiedene ähnliche rekombinante Polypeptide zu exprimieren, unter anderem hohe Mengen der A- und B-Ketten des Blutplättchen-entstammenden Wachstumsfaktors (PDGF). Folglich werden Fachleute auf diesem Gebiet erkennen, dass mit den vorstehend genannten rekombinanten DNAs und den transformierten Zellen dieser Erfindung auf diese Weise hohe Ausbeuten des rekombinanten KGF erzielt werden können.
Schließlich kann die Herstellung in großem Maßstab die klinische Erprobung bei Zuständen ermöglichen, die eine spezifische Stimulierung des Epithelzellwachstums erfordern. Materialien und Verfahren zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen zur topischen (beispielsweise auf die Haut oder auf die Augenhornhaut) oder systemischen Verabreichung sind im Stand der Technik bekannt und können leicht und ohne aufwendiges Experimentieren der Verabreichung von KGF und KGF-ähnlichen Peptiden angepasst werden.
Diese Erfindung umfasst ebenfalls neuartige Antikörper, die gegen ein Peptid erzeugt werden, das von einem erfindungsgemäßen DNA-Abschnitt kodiert wird. Als Beispiel für diese Ausführungsform der Erfindung dienen verschiedene Typen von KGF erkennenden Antikörpern. Diese wurden durch Anwendung üblicher, auf dem Gebiet der experimentellen Immunologie bekannter Methoden hergestellt, wie sie im Versuchsteil II dargestellt werden. Diese Antikörper sind unter anderem mono klonale Maus-Antikörper, die gegen intaktes gereinigtes Protein aus humanen Fibroblasten erzeugt werden, polyklonale Kaninchen-Antikörper, die gegen synthetische Peptide erzeugt werden, deren Sequenzen auf Aminosäuresequenzen beruhen, die anhand der cDNA-Sequenz für KGF vorhergesagt werden [beispielsweise gegen ein Peptid mit der Sequenz der Reste 32-45 von KGF, nämlich NDMTPEQMATNVR (mit dem üblichen Ein-Buchstaben-Code für Aminosäuresequenzen; siehe Fig. II-1)], polyklonale Kaninchen-Antikörper, die gegen natürlich sezernierten KGF aus humanen Fibroblasten oder in E. coli hergestellten rekombinanten KGF (siehe oben) erzeugt werden.
Sämtliche getestete Antikörper erkennen sowohl den rekombinanten als auch den natürlichen vorkommenden KGF in einem Festphasen(ELISA)-Test und/oder in einem Western-Blot. Einige beispielhafte Antikörper, die bevorzugte Antikörper dieser Erfindung sind, scheinen die mitogene Aktivität von KGF im BALB/MK-Biotest zu neutralisieren.
Fragmente der erfindungsgemäßen Antikörper, wie etwa Fab- oder F(ab)'-Fragmente, die die Antigenbindungsaktivität beibehalten und mit im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden können, fallen ebenfalls unter den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung. Die Erfindung umfasst ferner pharmazeutische Zusammensetzungen mit den erfindungsgemäßen Antikörpern oder aktiven Fragmenten davon; diese können mit Materialien und Verfahren, wie sie zur Produktion von Polypeptiden im Stand der Technik bekannt sind, hergestellt und für die Verabreichung von KGF und KGF-ähnliche Peptiden leicht und ohne aufwendiges Experimentieren angepasst werden können.
Beispielsweise können diese Antikörper und aktive Fragmente davon zum Nachweis von KGF in Biotests oder zur Reinigung der Proteinfaktoren verwendet werden. Sie können auch nach im Stand der Technik bekannten Ansätzen zur Isolierung des KGF-Rezeptors verwendet werden; wie im Versuchsteil II beschrieben wird, ist der KGF-Rezeptor anscheinend von den Rezeptoren für alle anderen bekannten Wachstumsfaktoren verschieden.
Die bevorzugten Antikörper sowie Fragmente und pharmazeutische Zusammensetzungen davon, welche, wie der BALB/MK-Test hindeutet, die mitogene Aktivität von KGF auf Epithelzellen neutralisieren, können beispielsweise zur Behandlung von klinischen Zuständen eingesetzt werden, die sich durch ein übermäßiges Wachstum der Epithelzellen auszeichnen, darunter Dysplasie und Neoplasie (z. B. Psoriasis und bösartige oder gutartige epitheliale Tumoren).
Diese Erfindung umfasst ferner neuartige Biotest-Verfahren zum Nachweis der Expression von Genen, die mit den erfindungsgemäßen DNAs verwandt sind. In einigen beispielhaften Ausführungsformen wurden die erfindungsgemäßen DNAs als Sonden zur Ermittlung von "steady-state"-Mengen von verwandten mRNAs benutzt. Die Verfahren für die erfindungsgemäßen Biotests unter Verwendung von KGF-DNAs sowie die üblichen Northern-Blot-Methoden werden im Versuchsteil II detailliert beschrieben.
Fachleute auf dem Gebiet werden erkennen, dass solche Verfahren leicht und ohne aufwendiges Experimentieren auf die Analyse der Genexpression von KGF-ähnlichen Proteinen angewandt werden können, und zwar entweder in isolierten Zellen oder in verschiedenen Geweben. Derartige Biotests können beispielsweise zur Identifizierung verschiedener Typen von Tumorzellen oder von genetischen Defekten bei den Wachstumsprozessen von Epithelzellen benutzt werden.
Ohne dies weiter auszuführen sind wir der Meinung, dass der Durchschnittsfachmann auf diesem Gebiet die vorliegende Erfindung anhand der vorstehenden Beschreibung und nach den Verfahren in den nachstehenden Versuchsteilen in vollem Umfang nutzen kann. Wenn nichts Anderes angegeben ist, dienen die in den Versuchsteilen offenbarten Angaben der Veranschaulichung und sollten nicht in irgendeiner Weise als einschränkend für die angefügten Ansprüche angesehen werden.

VERSUCHSTEIL I

IDENTIFIZIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG EINES NEUARTIGEN, FÜR EPITHELZELLEN SPEZIFISCHEN WACHSTUMSFAKTORS

Dieser Teil beschreibt Experimente, die zur Identifizierung eines für Epithelzellen spezifischen Wachstumsfaktors in konditioniertem Medium einer Fibroblastenzelllinie aus der Lunge menschlicher Embryonen führten. Der Faktor, der wegen seiner Aktivität hauptsächlich auf diesen Zelltyp vorläufig den Namen Keratinocytenwachstumsfaktor (KGF) erhielt, wurde nach den Verfahren dieser Erfindung durch eine Kombination aus Ultrafiltration, Heparin-Sepharose-Affinitätschromatographie und hydrophober Chromatographie in einer C&sub4;-Umkehrphasen-HPLC-Säule bis zur Homogenität gereinigt. Es wurde festgestellt, dass KGF sowohl säure- als auch wärmelabil ist, und aus einer einzigen Polypeptidkette mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 28.000 Dalton besteht. Der gereinigte KGF war ein hochwirksames Mitogen für Epithelzellen, das in der Lage war, die DNA-Synthese in ruhenden epidermalen BALB/MK-Keratinocyten um mehr als das 500fache zu stimulieren, wobei die Aktivität ab 0,1 nM nachweisbar war und bei 1,0 nM ihr Maximum erreichte. Das Fehlen mitogener Aktivität auf andere Fibroblasten oder Endothel-Zellen deutete darauf hin, dass KGF eine andere Zielzellen-Spezifität als die bereits charakterisierten Wachstumsfaktoren besaß. Die Mikrosequenzierung ergab eine Amino-terminale Sequenz, die keine signifikante Homologie zu anderen bekannten Proteinen aufweist. Die Freisetzung dieses neuartigen Wachstumsfaktors durch humane embryonale Fibroblasten deutet darauf hin, dass KGF bei der mesenchymalen Stimulierung der Proliferation von normalen Epithelzellen eine Rolle spielt.

Verfahren und Materialien

Bereitstellung von konditionierten Medien. Eine frühe Passage von humanen embryonalen M426-Fibroblasten (I-8) wurde in T-Flaschen mit einer Fläche von 175 cm² ausplattiert und 10-14 Tage lang in mit 10% Kalbsserum (GIBCO) ergänztem Dulbeccos-modifiziertem Eagle's Medium (Dulbeccos modified Eagle's medium, DMEM; GIBCO) bis zur Konfluenz angezüchtet. Nach Erreichen der Konfluenz wurde bei den einschichtigen Zelirasen wöchentlich das Medium gewechselt, und zwar wurde abwechselnd serumhaltiges und serumfreies Medium, das nur aus DMEM besteht, benutzt. Vor Zugabe von 20 ml DMEM wurden die Zellen zweimal mit 5 ml einer Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung gewaschen. Nach 27 Std. wurde die Kulturflüssigkeit gesammelt und durch 35 ml serumhaltiges Medium ersetzt. Das konditionierte Medium wurde bis zur weiteren Verwendung bei -70ºC gelagert.
Ultrafiltration. Etwa zehn Liter konditioniertes Medium wurden aufgetaut, durch ein Filter von 0,50 Mikron (Millipore HAWP 142 50) vorgefütert und mit dem Pellicon-Kassettensystem (Millipore XX42 OOK 60) und einer Kassette mit einer Ausschlussgrenze bei einem Molekulargewicht von 10 kDa (Millipore PTGC 000 05) auf 200 ml aufkonzentriert. Nach der Konzentrierung wurde die Probe zweimal hintereinander mit je einem Liter einer Lösung mit 20 mM Tris-HCl, pH 7,5 und 0,3 M NaCl verdünnt; nach jeder Verdünnung wurde ein weiterer Ultrafiltrationsschritt mit dem Pellicon-System durchgeführt. Die im Rückstand verbliebene Aktivität wurde sogleich auf eine Heparin-Sepharose- Matrix aufgetragen oder bei -70ºC gelagert.
Heparin-Sepharose-Affinitätschromatooraphie (HSAC). Der Rückstand aus der Ultrafiltration wurde auf eine Heparin-Sepharose-Matrix (Pharmacia) aufgetragen, die mit einer Lösung mit 20 mM Tris-HCl, pH 7,5 und 0,3 M NaCl äquilibriert worden war. Die Matrix wurde ausgiebig gewaschen, bis die Extinktion wieder den Grundwert erreichte, und wurde dann mit einem linearen schrittweisen Gradienten mit zunehmender NaCl-Konzentration eluiert. Nach Entnahme von aliquoten Teilen aus den Fraktionen für den Thymidin-Einbau-Biotest wurden die ausgewählten Fraktionen mit einem Centricon-10-Mikrokonzentrator (Amicon) zehn- bis zwanzigfach aufkonzentriert und bei -70ºC gelagert.
Umkehrphasen-HPLC (RP-HPLC). Die aktiven Fraktionen (Pool mit 0,6 M NaCl) aus der HSAC wurden aufgetaut, zusammengemischt und mit dem Centricon-10 bis zu einem Endvolumen von ≤ 200 ul weiter konzentriert. Die Probe wurde in eine Vydac-C&sub4;-HPLC-Säule (The Separations Group, Hesperia, CA), die mit einer Lösung mit 0,1% Trifluoressigsäure (TFA, Fluka) und 20% Acetonitril (Baker, HPLC-rein) äquilibriert worden war, aufgetragen und mit einem linearen Gradienten von zunehmender Acetonitril-Konzentration eluiert. Die aliquoten Teile für den Biotest wurden sogleich mit der 10fachen Menge einer Lösung mit 50 ug/ml BSA (Fraktion V, Sigma) und 20 mM Tris-HCl, pH 7,5 verdünnt. Zur Vorbereitung der Strukturanalyse wurde der Rest der Probe in einem Speed-Vac (Savant) getrocknet.
Molekularsieb-HPLC. Etwa 50 ul der zweimal konzentrierten Heparin-Sepharose-Fraktionen wurden in eine TSK-G3000SW-Glas-Pac-Säule (LKB) aufgetragen, die mit einer Lösung mit 20 mM Tris-HCl, pH 6,8 und 0,5 M NaCl äquilibriert worden war. Die Probe wurde mit diesem Puffer bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 0,4 ml/min eluiert. Nach Entnahme von aliquoten Teilen für den Biotest wurden die Fraktionen bei -70ºC gelagert.
NaDodSO&sub4;-Polyacrylamidgelelektrophorese (NaDodSO&sub4;/PAGE). Die Polyacrylamidgele wurden nach dem Verfahren von Laemmli (I-9) mit NaDodSO&sub4; hergestellt. Die Proben wurden 3 Minuten lang in Gegenwart von 2,5 Vol.-% 2-Mercaptoethanol gekocht. Die Gele wurden fixiert und mit den Reagenzien und nach dem Protokoll von BioRad mit Silber (I-10) gefärbt. Die Eichproteine waren von Pharmacia.
Stimulierung der DNA-Synthese. Mikrotiterplatten mit sechsundneunzig Vertiefungen (Falcon Nr. 3596) wurden vor der Inokulation mit BALB/MK-Zellen mit 1 ug/cm² humanem Fibronectin (Collaborative Research) beschichtet. Nach Erreichen der Konfluenz wurden die Zellen 24-72 Std. lang in serumfreiem Medium mit 5 ug/ml Transferrin (Collaborative Research) und 30 nM Na&sub2;SeO&sub3; (Baker) gehalten. Der Einbau von ³H-Thymidin (Endkonzentration 5 uCl/ml, NEN) in die DNA wurde während eines 6stündigen Zeitraums gemessen, der 16 Std. nach Zugabe der Proben begann. Um den Test zu beenden, wurden die Zellen einmal mit eiskalter Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung und zweimal mit einer 5%igen Trichloressigsäure-Lösung gewaschen. Das Präzipitat wurde in einer 0,25 M NaOH-Lösung wieder aufgelöst, in Szintillationsflüssigkeit (Biofluor, NEN) transferiert und gezählt.
Die Überwachung der Stimulierung der DNA-Synthese wurde wie vorstehend für BALB/MK-Zellen beschrieben bei verschiedenen anderen Zelilinien durchgeführt. Die NIH/3T3-Fibroblasten (I-11) wurden von den National Institutes of Health zur Verfügung gestellt, und die bronchialen Epithelzellen CCL208 aus Rhesus-Affen (I-12) wurden von der American Type Culture Collection bezogen. Die wie in (I-13) beschrieben bereitgestellte humane Brustepithelzelllinie B5/589 wurde von Martha Stampfer (Universität von Kalifornien, Berkeley) bezogen. Die Brustzellen wurden in RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 10% fötalem Kalbsserum und 4 ng/ml EGF, kultiviert. Wurden diese Zellen unter serumfreien Bedingungen gehalten, so bestand das basale Medium aus DMEM. Primäre Kulturen von humanen Endothel-Zellen der Vena saphena wurden wie an einer anderen Stelle beschrieben (I-14) bereitgestellt und gehalten. Der epidermale Wachstumsfaktor und das Insulin waren von Collaborative Research. Saurer FGF und bFGF wurden von California Biotechnology, Inc. bezogen. Rekombinanter TGFα wurde von Genentech, Inc. erhalten. Medien und Serum wurden entweder von GIBCO, Biofluids, Inc. oder von der Medien-Abteilung des NIH erhalten.
Proliferationstest. Kulturplatten von fünfunddreißig mm wurden nacheinander mit Poly-D-lysin (20 ug/cm²) (Sigma) und humanem Fibronectin beschichtet und dann mit etwa 2,5 · 10&sup4; BALB/MK-Zellen inokuliert. Das Grundmedium bestand aus einem 1 : 1-Gemisch von Eagle's minimalem Medium mit geringem Ca²&spplus;-Gehalt und Ham's F-12-Medium ergänzt mit 5 ug/ml Transferrin, 30 nM Na&sub2;SeO&sub3; und 0,2 mM Ethanolamin (Sigma). Das Medium wurde alle 2 bis 3 Tage ausgetauscht. Nach 10 Tagen wurden die Zellen mit Formalin (Fisher Scientific Co.) fixiert und mit Giemsa (Fisher Scientific Co.) gefärbt.
Protein-Mikrosequenzierung. Etwa 4 ug (150 umol) Protein von den aktiven Fraktionen aus der C&sub4;-Säule wurden in einer 50%igen TFA-Lösung erneut gelöst und in ein Gasphasen-Proteinsequenzierungsgerät von Applied Biosystems aufgetragen. Nach zwanzig Zyklen von Edman-Abbau wurden die Aminosäurederivate mit Hilfe eines automatisierten HPLC (Modell 120A, Applied Biosystems) in Echtzeit (online) identifiziert.

ERGEBNISSE

Nachweis und Isolierung des Wachstumsfaktors.

Die Ergebnisse eines vorbereitenden Screenings von konditionierten Medien aus verschiedenen Zelllinien deuteten darauf hin, dass Medien aus einigen Fibroblastenzelllinien mitogene Aktivitäten enthielten, die sowohl in BALB/MK- als auch in NIH/3T3-Zellen nachweisbar waren. Durch Kochen wurde zwar die Aktivität auf BALB/MK-Zellen zerstört, die mitogene Aktivität auf NIH/3T3-Zellen blieb jedoch intakt. Aufgrund der bekannten Hitzestabilität von EGF (I-15) und TGFα (I-16) folgerte man, dass die mitogene Aktivität auf BALB/MK-Zellen auf ein Agens zurückzuführen sein könnte, das von diesen bekannten epithelialen Wachstumsfaktoren verschieden ist.
Um den (die) mutmaßlichen Wachstumsfaktor(en) aufzureinigen, wählte man die M426-Zelllinie, eine Fibroblastenzelllinie aus der Lunge menschlicher Embryonen als die ergiebigste Quelle dieser Aktivität. Die Ultrafiltration mit dem Pellicon-System erlaubte die Reduzierung des Probevolumens auf ein für die nachfolgende Chromatographie geeignetes Volumen. Bei der Entwicklung einer Aufreinigungsstrategie wurde mit verschiedenen Kombinationen von Siebohromatographie, Ionenaustauschchromatographie und isoelektrischer Fokussierungschromatographie experimentiert, die jedoch geringe, nicht zufriedenstellende Ausbeuten ergaben. Andererseits erwies sich die Heparin- Sepharose-Affinitätschromatographie (HSAC), die bereits zur Reinigung anderer Wachstumsfaktoren benutzt worden war (I-17 bis I-22), bei der vorliegenden Erfindung als ein nützlicher früher Reinigungsschritt. Obwohl in diesem Stadium die Schätzungen der Ausbeute an spezifischer Aktivität wegen der wahrscheinlichen Anwesenheit anderer Faktoren ungenau waren, lag die scheinbare Aktivitätsausbeute bei 50-70% und die entsprechende Anreicherung war etwa 1000fach.
Wie in Fig. I-1 gezeigt, wurde über 90% der mitogenen Aktivität auf BALB/MK-Zellen bei 0,6 M NaCl aus der HSAC-Säule eluiert. Dieser Aktivitätspeak ging nicht mit irgendeiner Aktivität auf NIH/3T3-Zellen einher (Daten nicht gezeigt). Ein weit kleinerer Peak mit mitogener Aktivität auf BALB/MK-Zellen erschien jedes Mal bei 0,8-1,2 M NaCl.
Wegen der Reproduzierbarkeit des HSAC-Elutionsmusters konnten anhand des Gradientenprofils und des Profils der optischen Dichte aussichtsreiche aktive Fraktionen identifiziert werden. Es wurde festgestellt, dass eine rasche 10-20fache Konzentrierung mit dem Centricon-10 wesentlich für die Stabilität war; diese konnte dann mehrere Monate lang bei -70ºC stabil gehalten werden.
Der letzte Reinigungsschritt erfolgte durch RP-HPLC mit einer C&sub4;-Vydao-Säule, einem für die Analyse der Aminosäuresequenz geeigneten präparativen Verfahren. Die Aktivitätsausbeute bei dem C&sub4;-Schritt betrug zwar in der Regel nur wenige Prozente, dieser Verlust konnte jedoch auf die eingesetzten Lösungsmittel zurückgeführt werden. In anderen Versuchen wurde die mitogene Aktivität der Präparation bei einer einstündigen Behandlung mit einer Lösung mit 0,1% TFA und 50% Acetonitril bei Raumtemperatur um 98% verringert. Wie in Fig. I-2 gezeigt, wurde dennoch ein einzelner Peak mit stimulierender Aktivität auf BALB/MK-Zellen erhalten, der mit einem klaren Peak in dem Extinktionsprofil zusammenfiel. Nach NaDodSO&sub4;/PAGE und Färbung des Gels mit Silber (Fig. I-2B) ergaben die Fraktionen des Peaks eine einzige Bande; über das gesamte Aktivitätsprofil hinweg bestand eine genaue Korrelation zwischen der relativen mitogenen Aktivität jeder getesteten Fraktion (Fig. I-2C) und der Intensität der Banden.
Eine Alternative zu der vorstehend beschriebenen HPLC-Methode bietet ein Reinigungsschritt, bei dem eine Molekularsieb-Chromatographie in einer TSK-G3000SW-GlasPac-Säule durchgeführt wird, die mit einer wässrigen Lösung mit nahezu physiologischem pH-Wert eluiert wird; dies ergab einen großen Aktivitätspeak in dem BALB/MK-Biotest (Fig. I-3). Dem mit Silber gefärbten NaDodSO&sub4;/PAGE-Gel nach zu urteilen war diese Präparation nahezu so rein wie die durch RP-HPLC erhaltene Präparation (Daten nicht gezeigt), ihre Aktivitätsausbeute war jedoch weit höher (Ta belle I-1). Da das TSK-gereinigte Material eine höhere spezifische Aktivität aufwies, wurde dieses routinemäßig für biologische Untersuchungen verwendet.
Bei beiden Typen von gereinigten Präparationen (d. h. die durch HPLC gereinigte oder die durch Molekularsieb-Chromatographie gereinigte Präparation) ging das Profil der mitogenen Aktivität mit einer klaren Bande in NaDodSO&sub4;/PAGE einher, wobei zwischen den zwei Präparationen kein Unterschied zu beobachten war.
Physikalische und biologische Charakterisierung des Wachstumsfaktors. Auf der Grundlage von NaDodSO&sub4;/PAGE unter reduzierenden (Fig. I-2) und nichtreduzierenden Bedingungen (Daten nicht gezeigt) wies der gereinigte Faktor ein geschätztes Molekulargewicht von etwa 28 kDa auf. Dieser Wert stand gut im Einklang mit der Position, an der der Faktor aus zwei verschiedenen Säulen zur Bestimmung der Größe (TSK-G3000-SW, Fig. I-3, und Superose-12, Daten nicht gezeigt) mit Lösungsmitteln eluiert wurde, mit denen eine Beibehaltung der nativen Konformation zu erwarten war. Anhand dieser Daten scheint das Mitogen aus einer einzigen Polypeptidkette mit einem Molekulargewicht von 25-30 kDa zu bestehen.
Die Hitze- und Säurelabilität der mitogenen Aktivität wurde in einem BALB/MK-Mitogenese- Biotest gezeigt. Die Aktivität blieb zwar nach einer 10minütigen Inkubation bei 50ºC unverändert, sie warjedoch nach 10 Min bei 60ºC um 68% reduziert und war nach 3 Min bei 100ºC nicht mehr nachweisbar. Eine 60minütige Behandlung mit Essigsäure in einer Konzentration von 0,5 M bei Raumtemperatur führte zu einer Senkung der Aktivität auf 14% der Aktivität der Kontrolle. Im Vergleich dazu wurde die mitogene Aktivität des bekannten Wachstumsfaktors EGF mit keiner dieser Behandlungen gesenkt.
Die in Fig. I-4 dargestellte Dosis-Wirkungs-Kurve für den aufgereinigten Wachstumsfaktor zeigt, dass eine Konzentration von nur 0,1 nM zu einer nachweisbaren Stimulierung der DNA-Synthese führte. Der Aktivitätsbereich war also dem Bereich der anderen bisher analysierten Wachstumsfaktoren vergleichbar. In dem Konzentrationsbereich 0,1-1,0 nM wurde ein lineares Verhältnis beobachtet, wobei das 600fache Maximum der Stimulierung bei 1,0 nM beobachtet wurde. Der von dem neuartigen Faktor induzierte maximale Thymidin-Einbau in BALB/MK-Keratinocyten war stets höher als bei EGF, aFGF oder bFGF (Fig. I-4).
Der Nachweis der charakteristischen Zielzellen-Spezifität dieses Faktors erfolgte durch Vergleich zwischen der Wirkung dieses Faktors auf eine Vielzahl von Zelltypen und der Wirkung anderer Wachstumsfaktoren, die bekanntermaßen mitogene Aktivität auf Epithelzellen aufweisen. Wie in Tabelle I-2 gezeigt, zeigte der neu isolierte Faktor eine starke mitogene Wirkung auf BALB/MK-Zellen, induzierte jedoch auch einen nachweisbaren Einbau von Thymidin in die DNA anderer getesteten Epithelzellen. Im auffälligen Gegensatz dazu wies der Faktor keine nachweisbare mitogene Wirkung auf Maus-Fibroblasten (oder humane Fibroblasten, Daten nicht gezeigt) oder auf humane Endothel- Zellen der Vena saphena auf.
Vergleichsweise schien keiner der anderen bekannten Wachstumsfaktoren bevorzugt Keratinocyten zu stimulieren. TGFα und EGF zeigten eine starke Aktivität auf Fibroblasten und die FGFs induzierten die Mitogenese von Endothel-Zellen und Fibroblasten (Tabelle I-2). Wegen seiner Spezifität für Epithelzellen und insbesondere wegen der Empfindlichkeit von Keratinocyten wurde dem neuartigen Mitogen vorläufig der Name "Keratinocytenwachstumsfaktor (KGF)" gegeben.
Um nachzuweisen, dass KGF nicht nur die DNA-Synthese stimulieren, sondern auch stetiges Zellwachstum unterstützen würde, wurde die Wachstumsfähigkeit von BALB/MK-Zellen in einem definierten, serumfreien Medium untersucht, das mit diesem Wachstumsfaktor ergänzt worden war. Wie in Fig. I-5 gezeigt, stellte KGF in diesem chemisch definierten Medium einen ausgezeichneten Ersatz für EGF dar, jedoch nicht für Insulin (oder den Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor I). Folglich scheint die Wirkung von KGF auf die Proliferation von BALB/MK-Zellen über den Hauptsignaliserungsmechanismus zu erfolgen, der EGF, aFGF und bFGF gemeinsam ist.
Die Mikroseguenzierung deckt eine einzigartige N-terminale Aminosäuresequenz des KGF auf. Zur weiteren Charakterisierung des Wachstumsfaktors wurde mit etwa 150 umol C&sub4;-gereinigtem Material eine Analyse der Aminosäuresequenz durchgeführt. Bei eindeutigen Zuweisungen in den Zyklen 2-13 wurde folgende Sequenz nachgewiesen: X-Asn-Asp-Met-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Thr-Asn-Val. Eine Zuweisung der ersten Position wurde durch den hohen Hintergrundpegel verhindert; sie wird daher als X angegeben.
Eine computerunterstützte Recherche mit dem FASTP-Programm (I-24) zeigte, dass die N-terminale Aminosäuresequenz von KGF keine signifikante Homologie zu irgendeinem Protein in der Datenbank der National Biomedical Research Foundation aufweist, was die Neuheit dieses epithelialen Wachstumsfaktors belegte.

DISKUSSION

Bei den in diesem Versuchsteil beschriebenen Versuchen wurde ein humaner Wachstumsfaktor mit einer einzigartigen Spezifität für Epithelzellen identifiziert. Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde durch Ultrafiltration, HSAC und RP-HPLC bzw. TSK-Siebchromatographie eine zur detaillierten Charakterisierung der physikalischen und biologischen Eigenschaften dieses Moleküls hinreichende Menge isoliert.
In den aktiven Fraktionen aus der RP-HPLC wurde mit Silberfärbung eine einzelne Bande nachgewiesen, die einem Molekulargewicht von etwa 28.000 Dalton entsprach und deren Intensität proportional zur Stärke der mitogenen Aktivität in diesen Fraktionen war. In den aktiven Fraktionen aus der TSK-Chromatographie wurde eine Bande beobachtet, die von der durch RP-HPLC erhaltenen Bande nicht unterscheidbar war. Das gereinigte Protein stimulierte die DNA-Synthese bei Epithelzellen in subnanomolaren Konzentrationen, es war jedoch in vergleichbaren oder höheren Konzentrationen (bis zu 5 nM) nicht in der Lage, den Thymidin-Einbau bei Fibroblasten oder Endothel-Zellen zu induzieren. Anhand dieser charakteristischen Zielzellen-Spezifität sowie der für das gereinigte Molekül ermittelten einmalige neuartigen N-terminalen Aminosäuresequenz folgerte man, dass es sich bei KGF um einen neuen Wachstumsfaktor handelt.
Da der gereinigte Faktor in der Lage war, in einem chemisch definierten Medium den für das Wachstum von BALB/MK-Zellen erforderlichen Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor I bzw. Insulin zu ersetzen, muss seine Wirkung auf einem Signaltransduktionsmechanismus beruhen, der EGF, TGFc und den FGFs gemeinsam ist. Ferner war der neue Faktor bei der Stimulierung des Thymidin-Einbaus in BALB/MK-Zellen wirksamer als irgendeines der bekannten Mitogene für Epithelzellen. Vorläufige Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieser Faktor auch in der Lage ist, die Proliferation von sekundären Kulturen humaner Keratinocyten zu unterstützen (Daten nicht gezeigt).
Die Handhabung und Lagerung von KGF während seiner Aufreinigung stellte sich als problematisch dar. Über seine inhärente Säure- und Wärmelabilität hinaus zeigt er sich unstabil bei Lyophilisierung oder Dialyse. Nach HSAC trat trotz Einsatz von Trägerproteinen, Heparin, Proteaseinhibitoren und silikonisierten Röhrchen und trotz Lagerung bei 4ºC oder -20ºC ein vollständiger Verlust der Aktivität innerhalb von 24 Std. ein. Nur die Konzentrierung der Probe in diesem Stadium konnte seine Aktivität erhalten.
Um den getrockneten, gereinigten Faktor in Lösung zu bringen, benötigte man entweder eine starke Säure oder ein Detergens; dies steht mit seiner adsorptiven Tendenz oder seiner Unlöslichkeit in Einklang. Zur Erhaltung seiner Aktivität wurde also der gereinigte Faktor als hochkonzentrierte Lösung bei -70ºC gehalten, und blieb auf diese Weise mehrere Monate stabil.
Die Fähigkeit von KGF zur Bindung an Heparin könnte eine wesentliche Eigenschaft dieses Faktors darstellen, die für seine Funktion in vivo von Bedeutung ist. Wachstumsfaktoren mit Heparinbindenden Eigenschaften sind unter anderem aFGF (I-20 bis I-22), bFGF (I-19, I-22), Granulocyten/Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor und Interleukin 3 (I-25). Alle diese Faktoren werden von Stromazellen produziert (I-25 bis I-27). Derartige Faktoren scheinen in der extrazellulären Matrix oder in den Proteoglykanen, die die Oberfläche der Stromazellen umhüllen, abgelagert zu werden (I-1, I-28). Es wurde angenommen, dass ihre Lagerung und Freigabe sowie der Kontakt mit den spezifischen Zielzellen durch diese Wechselwirkung gesteuert wird (I-25, I-28). Zwar sind auch Effektoren der Epithelzellen-Proliferation mit Herkunft aus Mesenchym-Geweben beschrieben worden (I-29 bis I-31), doch ist ihre Identität bislang ungeklärt. Mit seinen Heparin-bindenden Eigenschaften, seiner Freisetzung durch humane embryonale Fibroblasten-Stromazellen und seinem Tropismus für Epithelzellen besitzt KGF alle Eigenschaften, die von einem derartigen parakrinen Mediator des normalen Epithelzellwachstums erwartet werden.
Wie im nachstehenden Versuchsteil II beschrieben, ermöglichte die für diesen neuen Wachstumsfaktor ermittelte Aminosäure-Teilsequenz die Klonierung seiner kodierenden Sequenz und die Bestimmung seiner strukturellen Verwandtschaft mit bekannten Familien von Wachstumsfaktoren.

LITERATURANGABEN ZU DEM VERSUCHSTEIL I

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VERSUCHSTEIL II

DIE cDNA-SEQUENZ EINES NEUARTIGEN, FÜR EPITHELZELLEN SPEZIFISCHEN WACHSTUMSFAKTORS DEFINIERT EIN NEUES MITGLIED DER FGF-FAMILIE

Durch die Arbeiten in dem vorangegangenen Versuchsteil I wurde ein neuartiger Heparin-bindender Wachstumsfaktor, der sogenannte Keratinocytenwachstumsfaktor (KGF), identifiziert und gereinigt, der insbesondere auf Keratinocyten wirkt und anscheinend spezifisch für Epithelzellen ist. Dieser zweite Versuchsteil beschreibt die Isolierung und Charakterisierung von KGF kodierenden cDNA-Klonen, wobei synthetische Oligonukleotide auf der Grundlage der experimentell ermittelten NH&sub2;-terminalen Aminosäuresequenz als Hybridisierungssonden verwendet wurden. Bei der Analyse der Nukleotidsequenz wurde ein 582-bp-langes offenes Leseraster identifiziert, das ein 194-Aminosäuren-Polypeptid mit einer 41%iger bis 33%iger Identität mit den Heparin-bindenden sauren und basischen Fibroblastenwachstumsfaktoren (FGFs) und mit den verwandten Produkten der hst und int-2-Oncogene kodieren würde. Das RNA-Transkript des KGF-Gens wird in normalen Fibroblasten sowohl von embryonaler Herkunft als auch aus Erwachsenen, jedoch nicht in Epithel-, Endothel- oder Glyazellen exprimiert. Folglich scheint KGF üblicherweise von dem Mesenchym exprimiert zu werden, was auf eine Rolle bei der Regulation der Proliferation von Epithelzellen hindeutet.

MATERIALIEN UND METHODEN

Isolierung von cDNA-Klonen. Die Reinigung von KGF und die Sequenzierung seines N-Terminus wurde bereits beschrieben (siehe Versuchsteil I, oben und II-3). Die in den Ergebnissen beschriebenen Gemische aus Deoxyoligonukleotiden (50 umol) wurden mit 83 umol γ-³²P-ATP (3000 Ci/mmol, Amersham) und 10 Einheiten T4-Polynukleotidkinase am 5'-Ende markiert. Die die cDNA-Klone enthaltenden rekombinanten Phagen wurden durch Abdruck auf Nitrocellulose-Filter übertragen und über Nacht in einer Lösung mit 20% Formamid, 10% Dextransulfat, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 8 · SSC, 5 · Denhardts und 50 ug/ml denaturierter DNA aus Lachsspermien bei 42ºC mit ³²P-markierten Deoxyoligonukleotiden hybridisiert. Die Filter wurden in einer Lösung mit 0,5 · SSC und 0,1% SDS bei 50ºC gewaschen und zum Belichten wurde ein Kodak X-omat AR-Film benutzt.
DNA-Sequenzierung. Die Nukleotidsequenz der KGF-cDNA wurde anhand von überlappenden, in pUC-Vektoren (II-27) subklonierten Restriktionsfragmenten mit Hilfe der Dideoxykettenterminationstechnik (II-26) ermittelt.
Bereitstellung eines bakteriellen Expressionsvektors für KGF-cDNA. KGF-cDNA, die die reife sezernierte Form des Polypeptids kodiert, wurde wie folgt unter die Kontrolle des hybriden trk-Promotors in dem Expressionsplasmid pKK233-2 (II-31) gestellt. Dafür wurde ein bestimmter Abschnitt der KGF-cDNA, der die Information zur Kodierung des reifen KGF-Moleküls (d. h. ohne sein Signalpeptid) enthielt, mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion(PCR)-Methode (II-32) amplifiziert. Das Fragment wurde mit den üblichen DNA-Rekombinationsmethoden in einer bestimmten Richtung zwischen zwei Restriktionsschnittstellen des Vektors eingebaut, nämlich zwischen der NcoI-Schnittstelle, deren Enden durch Verdau mit S1-Nuklease geglättet wurden, und der HindIII-Schnittstelle. Die Enden der mit dem PCR-Verfahren erzeugten KGF-cDNA waren wie folgt: Das 5'-Ende war glatt und begann mit einem ATG-Codon, gefolgt von dem TGC-Codon für den Cys-Rest Nummer 33, welcher den Aminoterminalen Rest der reifen Form von KGF (siehe Fig. II-1) darstellt, und der vollständigen kodierenden Sequenz für KGF. Das Stop-Codon, TAA, und die vier unmittelbar darauffolgenden Basen, TTGC, wurden am 3'-Ende der cDNA miteinbezogen. Der Primer, der im PCR-Verfahren zum Hinlenken der DNA-Synthese zur gewünschten Position am 3'-Ende der cDNA eingesetzt wurde, beinhaltete eine HindIII-Schnittstelle für den Einbau der amplifizierten cDNA in die Vektor-DNA.
Erzeugung von Antikörpern gegen KGF- und KGF-verwandte Peptide. Mit 5 oder mehr subkutanen Injektionen in Mäusen wurden monoklonale Antikörper gegen intaktes gereinigtes Protein aus humanen Fibroblasten erzeugt. Die Blutproben wurden in einem Festphasen(ELISA)-Immuntest mit stark gereinigtem KGF aus humanen Epithelzellen als Antigen getestet. Zur Bereitstellung der Hybridome wurden herkömmliche Verfahren angewandt und zum Nachweis von mit KGF-reagierenden Antikörpern wurden die Überstände mit dem ELISA-Test durchmustert. Die positiven Klone wurden mit den üblichen Verfahren nacheinander subkloniert und die ausgewählten Subklone wurden zur Erzeugung großer Antikörpermengen als Aszites-Tumoren in Mäusen vermehrt. Die Antikörper wurden mit den üblichen Methoden (z. B. Hydroxyapatit- oder Immunoaffinitätsmatrix) aus Aszitenflüssigkeit gereinigt.
Polyklonale Kaninchen-Antikörper gegen ein synthetisches Peptid wurden mit herkömmlichen Verfahren wie folgt erzeugt. Die Peptide wurden mit der Festphasentechnik hergestellt und durch Reaktion mit Glutaraldehyd an Thyroglobulin gekoppelt. Nach einer Reihe subkutaner Injektionen wurden Blutproben mit ELISA sowie mit anderen Methoden, unter anderem Western-Blot-Analyse und Mitogenese-Biotest getestet. IgG-Immunglobuline wurden durch Affinitätschromatographie mit immobilisiertem Protein G isoliert.
Zur Erzeugung polyklonaler Antikörper gegen den natürlich sezemierten KGF aus humanen Fibroblasten sowie den in E. coli hergestellten rekombinanten KGF (siehe nächsten Teil) in Kaninchen wurde folgendes Verfahren angewandt:
i) die erste Injektion und die erste Auffrischung (boost) wurden in die inguinalen Lymphknoten gegeben;
ii) nachträgliche Auffrischungen erfolgten intramuskulär.
Das Screening der Blutproben wurde unter anderem durch ELISA sowie durch Western-Blot- Analyse und Mitogenese-Biotest durchgeführt und lgG wurde wie oben bei den Antikörpern gegen synthetische Peptide gereinigt.

ERGEBNISSE

Isolierung von cDNA-Klonen, die den neuartigen Wachstumsfaktor kodieren. Um cDNA-Klone für die kodierende Sequenz von KGF zu suchen, wurden zwei Gemische aus Oligonukleotiden mit einer Länge von 26 Basen erzeugt, und zwar auf der Grundlage einer Sequenz mit neun Aminosäuren, Asn-Asp-Met-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala, die durch Mikrosequenzierung von gereinigtem KGF ermittelt wurde (siehe Versuchsteil I, oben und Referenz II-3). Ein Oligonukleotidgemisch bestand aus einem Gemisch aus allen 256 möglichen Sequenzen, die die neun Aminosäuren kodieren, während das andere Gemisch an der degenerierten dritten Position der Codons für Thr und Pro Inosin-Reste enthielt.
Durch die letztere Strategie wurde die Anzahl der möglichen kodierenden Sequenzen in dem Gemisch auf 16 reduziert. Das Inosin in einem tRNA-Anticodon kann Wasserstoffbrücken mit A, C oder U bilden (II-4); nachweislich findet eine effiziente Hybridisierung zwischen Deoxyinosin enthaltenden Oligonukleotiden und der entsprechenden cDNA statt (II-5).
Mit polyadenylierter RNA, die aus der Fibroblastenzelllinie M426 (II-7) aus der Lunge menschlicher Embryonen, der ursprünglichen Quelle des Wachstumsfaktors, extrahiert worden war, wurde in einem cDNA-Klonierungsvektor, pCEV9 (II-6), eine cDNA-Genbank bereitgestellt. Durch Screening der Genbank (9 · 10&sup5; Plaques) mit den ³²P-markierten, aus 26 Nukleotiden bestehenden Oligonukleotiden wurden 88 Plaques identifiziert, die mit beiden Gemischen aus Oligonukleotidsonden hybridisierten.
Charakterisierung und Sequenzierung von ausgewählten cDNA-Klonen. Unter den 10 aus Plaques gereinigten und analysierten Klonen enthielt einer, als Klon 49 bezeichnet, ein cDNA-Insert von 3,5 kb, während die übrigen Klone Inserts von zwischen 1,8 kb und 2,1 kb enthielten.
Die Analyse der kleineren Klone zeigte mehrere gemeinsame Restriktionsschnittstellen. Bei Sequenzierung eines repräsentativen kleineren Klons, als Klon 32 bezeichnet, zusätzlich zu Klon 49 zeigte sich, dass die cDNAs sich überlappen (Fig. II-1A). Klon 49 wurde bei Andocken der Sonde an den Poly(A)-Schwanz der mRNA erzeugt; dagegen entstand Klon 32 bei der Bereitstellung der Genbank durch Hybridisierung des Oligo(dT)-Primers mit einer A-reichen Sequenz in dem nichtkodierenden 3'-Bereich der KGF-mRNA.
Beschreibung der Sequenz, die das KGF-Polypeptid kodiert. Durch Anordnung der zwei cDNAs (Klone 32 und 49) wurde eine kontinuierliche Sequenz mit 3,85 kb erhalten, die die vollständige kodierende Sequenz für KGF enthielt (Fig. II-1 B). Mit einem ATG-Codon, das an der Position 446 lokalisiert ist und wahrscheinlich ein Initiationscodon darstellt, beginnt ein 582-Basenpaare-langes offenes Leseraster, das an dem TAA-Terminationscodon an Position 1030 endet. Dieses offene Leseraster würde ein Polypeptid aus 194 Aminosäuren mit einem errechneten Molekulargewicht von 22.512 Dalton kodieren.
Die Sequenz zu beiden Seiten des ATG-Codons entsprach nicht der für eine optimale Initiation durch eukaryontische Ribosomen vorgeschlagenen Konsensussequenz GCC(G/A)CCATGG (II-8); drei Nukleotide stromaufwärts vom ATG-Codon befand sich jedoch ein A. Ein A an dieser Position ist das am stärksten konservierte Nukleotid in der Konsensussequenz. Vor diesem ATG-Codon befand sich 85 Nukleotide stromaufwärts in demselben Leseraster ein TGA-Stopcodon.
Eine 19 Aminosäuren lange Sequenz, die zu dem experimentell ermittelten NH&sub2;-Terminus des gereinigten KGF homolog war, begann 32 Aminosäuren stromabwärts des vorgeschlagenen Initiationscodons. An den Stellen, wo eindeutige Zuweisungen möglich waren, bestand zwischen der vorhergesagten und der experimentell ermittelten Aminosäuresequenz vollständige Übereinstimmung.
Zur Ermittlung einer möglichen Homologie zwischen KGF und einem bekannten Protein wurde mit dem FASTP-Programm von Lipman und Pearson eine computerunterstützte Recherche in der Datenbank der National Biomedical Research Foundation durchgeführt (II-9). Auf diesem Wege wurde ein aufälliger Verwandtschaftgrad zwischen der vorhergesagten primären Struktur von KGF und der Primärstruktur des sauren bzw. basischen FGF sowie der verwandten, von den hst und int-2-Genen kodierten Proteine aufgedeckt.
Expression der mRNA-Transkripte des KGF-Gens in menschlichen Zellen. Bei den Vorversuchen zur Untersuchung der Expression von KGF-mRNA in menschlichen Zellen wurde durch Northem-Blot-Analyse der Gesamt-RNA aus M426-Zellen mit einer Sonde, die sich über den Großteil der kodierenden Sequenz von KGF erstreckte (Sonde A, Fig. II-IA), ein einzelnes Transkript von 2,4 kb nachgewiesen (Fig. II-1C). Dies war erheblich kürzer als die Länge der zusammengesetzten cDNA-Sequenz (3,85 kb).
Beim Durchmustern von M426-RNA, die auf Poly(A) hin ausgewählt worden war, wurde jedoch ein zusätzliches Transkript von etwa 5 kb nachgewiesen. Eine Sonde, die von dem nichttranslatierten, 3' von dem Ende des Klons 32 gelegenen Bereich des Klons 49 abgeleitet wurde (Sonde B, Fig. II-1A), hybridisierte nur mit der längeren mRNA (Fig. II-1C). Das KGF-Gen scheint also in zwei verschiedene RNAs transkribiert zu werden. Zwei weitere Mitglieder der FGF-Genfamilie, bFGF (II-29) und int-2 (II-30), erzeugen ebenfalls mehrere RNAs, eine Tatsache deren Bedeutung noch zu klären ist.
Um die normale Funktion von KGF zu untersuchen, wurde die Expression seines Transkripts in einer Vielzahl von humanen Zelllinien und Geweben untersucht. Wie in Fig. II-3 gezeigt, wurde das vorherrschende KGF-Transkript von 2,4 kb in jeder der verschiedenen Stroma-Fibroblastenzelllinien nachgewiesen, die von Epithelgeweben embryonaler oder neonataler Herkunft oder aus Erwachsenen stammen, jedoch nicht in solchen, die von Epithelzelllinien normaler Herkunft stammen. Das Transkript wurde ebenfalls bei RNA nachgewiesen, die aus Nieren und Organen des gastrointestinalen Traktes von normalen Erwachsenen extrahiert wurde, jedoch nicht in RNA aus der Lunge oder dem Gehirn. Die auffallende Spezifität der Expression der KGF-RNA in Stromazellen aus Epithelgeweben deutete darauf hin, dass dieser Faktor eine normale Rolle bei der mesenchymalen Stimulierung des Wachstums von Epithelzellen spielt.
Zum Vergleich wurden in den vorstehend angegebenen Geweben auch die mRNAs anderer Wachstumsfaktoren mit bekannter Aktivität auf Epithelzellen analysiert. Bei den analysierten Epithel- und Stromazelllinien gab es kein einheitliches Muster für die Expression der aFGF- oder bFGF-Transkripte (Fig. II-3). Das EGF-Transkript wurde in keiner der vorgenannten Zelllinien exprimiert und unter den verschiedenen Geweben nur in der Niere beobachtet. Schließlich wurde die TGFc-mRNA in keiner der Stroma-Fibroblastenzelllinien nachgewiesen, sie wurde jedoch in unterschiedlichen Mengen in jeder der Epithelzelllinien exprimiert. Unter den untersuchten Geweben wurde sie in kleinen Mengen auch in der Niere nachgewiesen (Fig. II-3).
Hemmung der mitogenen Aktivität von KGF durch Heparin. Es wurde gezeigt, dass Heparin die mitogene Aktivität von aFGF auf verschiedene Zielzellen in Kultur erheblich erhöht und sie gegen Inaktivierung durch Hitze stabiler macht (II-21, II-22). Obwohl seine Bindung an bFGF eng ist, hat Heparin nur minimale Wirkungen auf die mitogene Aktivität desselben (II-22). Im Hinblick auf die Verwandt schaft zwischen KGF und den FGFs wurde die Wirkung von Heparin auf die mitogene Aktivität von KGF untersucht. Wie in Tabelle II-1 gezeigt, wurde der Thymidin-Einbau in BALB/MK-Zellen als Reaktion auf KGF in Gegenwart von Heparin im Medium um das 16-fache gehemmt. Demgegenüber wurde die Aktivität sowohl von aFGF als auch von bFGF durch dieselbe Behandlung erhöht.
Bereitstellung von Anti-KGF-Antikörpem. Mit auf dem Gebiet der experimentellen Immunologie bekannten Standardmethoden, die vorstehend in dem Methodenteil zusammengefasst sind, wurden verschiedene Typen von Antikörpern hergestellt, die KGF oder KGF-ähnliche Polypeptide erkennen. Darunter sind monoklonale Maus-Antikörper, die gegen intaktes, aufgereinigtes Protein aus humanen Fibroblasten erzeugt werden, polyklonale Kaninchen-Antikörper, die gegen synthetische Peptide erzeugt werden, deren Sequenzen auf Aminosäuresequenzen beruhen, die anhand der cDNA-Sequenz für KGF vorhergesagt werden, polyklonale Kaninchen-Antikörper, die gegen natürlich sezernierten KGF aus humanen Fibroblasten und in E. coli hergestellten rekombinanten KGF erzeugt werden (siehe nächsten Teil).
Es wurden monoklonale Antikörper aus drei verschiedenen Hybridomen aufgereinigt. Alle drei Antikörper erkennen in einem Festphasen(ELISA)-Immuntest sowohl den rekombinanten als auch den natürlich vorkommenden KGF. Keiner von ihnen geht unter denaturierenden Bedingungen (in einem Western-Blot) eine Kreuzreaktion mit KGF ein oder neutralisiert die mitogene Aktivität von KGF in dem BALB/MK-Biotest.
Polyklonale Antikörper wurden mit einem synthetischen Peptid mit der Aminosäuresequenz NDMTPEQMATNVR erzeugt, die den Resten Nummer 32 bis 44 von KGF (siehe Fig. II-1) entspricht und einen zusätzlichen R(Arg)-Rest anstelle des von der cDNA an Position 45 kodierten Asp-Rest aufweist. Der Asp-Rest ist in dem natürlichen KGF-Polypeptid wahrscheinlich glykosyliert und erscheint daher als Arg bei den Daten aus der direkten Sequenzierung der Aminosäuresequenz dieses Polypeptids (siehe Diskussion unten). Polyklonale Antikörper, die mit diesem synthetischen Peptid erzeugt wurden, erkennen sowohl den natürlich vorkommenden als auch den rekombinanten KGF bei ELISA- und Western-Blot-Analysen mit einem Empfindlichkeitsgrad von bis zu 10 ng Protein. Diese Antikörper neutralisieren jedoch nicht die mitogene Aktivität von KGF in dem BALB/MK-Biotest.
Polyklonale Antiseren gegen intaktes natürliches KGF-Protein erkennen KGF sowohl bei ELISA- als auch bei Western-Blot-Tests. Solche Antikörper scheinen auch die mitogene Aktivität von KGF in dem BALB/MK-Biotest zu hemmen.
Expression von KGF-cDNA in E. coli. Die Herstellung von Polypeptid in E. coli erfolgte durch Expression der KGF-cDNA, deren kodierende Sequenz unter die Kontrolle des hybriden trk-Promotors (der Elemente der trp- und lac-Promotoren umfasst) in dem Plasmid pKK233-2 (II-31) gestellt wurde. Dafür wurde ein bestimmter Abschnitt der KGF-cDNA, der die Information zur Kodierung des reifen KGF-Moleküls (d. h. ohne sein Signalpeptid) enthält, mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion-Methode (II-32) amplifiziert. Das Fragment wurde mit den herkömmlichen DNA-Rekombinationsmethoden in einer bestimmten Richtung zwischen zwei Schnittstellen des Vektors eingebaut, nämlich zwischen der Ncol-Schnittstelle, deren Enden durch Verdau mit S1 Nuklease geglättet wurden, und der HindIII- Schnittstelle. Um den richtigen Anschluß des ATG-Initiationscodons an die regulatorischen Elemente des trk-Promotors sicherzustellen, wurde das 5'-Ende der cDNA einzelner Rekombinanten sequenziert.
Mit den üblichen Verfahren für kleine Mengen wurden mehrere Rekombinanten auf die Produktion des Proteins getestet. Kurz gefasst: Die Klone wurden bis zur Mitte der exponentialen Phase (OD&sub5;&sub9;&sub5; 0,5) kultiviert und 90 Minuten lang mit einer 1 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid(IPTG)- Lösung behandelt; für die Westem-Blot-Analyse wurden die Zellextrakte einer Elektrophorese in SDS/Polyacrylamid-Gelen unterzogen. Sämtliche getestete Rekombinanten synthetisierten ein Protein, das von Antikörpern gegen ein Peptid am Amino-Terminus von KGF erkannt wurde. Für weitere Proteinanalysen wurde eine Rekombinante ausgewählt, die die höchste Induktion durch IPTG zeigte.
Ein Liter Bakterien, die in NZY-Nährmedium mit 50 ug/ml Ampicillin und 12,5 ug/ml Tetracyclin bis zur OD&sub5;&sub9;&sub5; 0,5 angezüchtet worden war, wurde 90 Min lang mit IPTG behandelt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt, in einer Lösung mit 50 mM Natriumphosphat (pH 7,3) und 0,2 M NaCl resuspendiert und durch Ultraschall lysiert. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation entfernt und das Lysat wurde sogleich in eine Heparin-Sepharose-Affinitätssäule aufgetragen.
Anhand der Westem-Blot-Analyse und der mitogenen Aktivität auf Keratinocyten wurde ermittelt, dass der rekombinante KGF bei 0,5-0,6 M NaCl eluiert wurde. Die anschließende Reinigung des HSAC-Materials mit einer Mono-S-(FPLC)-Säule (Pharmacia) ergab eine KGF-Präparation, die, der elektrophoretischen Analyse in SDS/Polyacrylamid-Gelen und der Färbung mit Silber nach zu urteilen, zu 90% rein war.
Rekombinanter KGF stimulierte wirksam den Thymidin-Einbau in BALB/MK-Keratinocytenzellen, besaß jedoch nur geringfügige Aktivität auf NIH/3T3-Fibroblasten. Die Hälfte der maximalen Stimulierung der BALB/MK-Zellen in dem Standard-Keratinocyten-Biotest wurde mit einer Konzentration zwischen 2 und 5 ng/ml erzielt; vergleichsweise war bei aus M426-Zellen gereinigtem KGF eine Konzentration von 10 bis 15 ng/ml erforderlich. Ein Liter Bakterienzellen ergab nach der Mono-S-Reinigung etwa 50 ug rekombinanten KGF.
Bereitstellung einer Chimäre mit KGF- und aFGF-Sequenzen. Die vorstehenden Untersuchungen deuteten darauf hin, dass KGF zwei verschiedene Eigenschaften aufweist, die von verschiedenen Abschnitten oder Domänen der Polypeptidsequenz kodiert sein könnten, wie es bei den kodierenden Sequenzen anderer multifunktionaler Polypeptide bekannt ist. Um diese Möglichkeit zu prüfen, wurde einen chimären DNA-Abschnitt, der die NH&sub2;-terminale Sequenz von KGF gekoppelt an den C-terminalen Bereich (core) von aFGF kodiert, wie folgt bereitgestellt. Eine Sau3AI-Restriktionsschnittstelle (GATC) am 5'-Ende der KGF-cDNA zwischen den Codons für die Reste 78 und 79 (Arg bzw. Ile, siehe Fig. II-1) wurde geschnitten und an eine homologe Schnittstelle zwischen den Codons für die Aminosäuren 39 (Arg) und 40 der aFGF-cDNA gekoppelt. Die 3'- und 5'-Enden dieser DNA-Chimäre wurden an Vektor-DNA des Plasmids pKK233-2 gekoppelt, und zwar mit dem gleichen Verfahren, das für den Einbau der KGF-cDNA angewandt wurde, die die sezernierte Form des Polypeptids kodiert (siehe Methoden, oben).
Nach Bereitstellung von rekombinanten E. coli-Zellen mit dem Vektor, der die Chimäre trägt, und Durchführung von Expressionsversuchen, wie sie vorstehend für reifen KGF beschrieben worden sind, wurde ein neuartiges Produkt mit den Eigenschaften von sowohl KGF als auch aFGF produziert. Das Peptid wurde durch Heparin-Sepharose-Chromatographie angereichert und es stellte sich heraus, dass es wie KGF eine Präferenz für Keratinocyten als Zielzellen und eine minimale Aktivität auf Fibroblasten (NIH/3T3) besitzt. Die mitogene Aktivität dieses chimären Polypeptids wird jedoch von Heparin nicht gehemmt; diese Eigenschaft macht es aFGF eher als KGF ähnlich. Tatsächlich wird die mitogene Aktivität auf Keratinocyten wie bei aFGF durch Heparin verstärkt. Die für die Zielzellen- Spezifität und die Heparinsensitivität verantwortlichen Peptid-Domänen sind also bei KGF eindeutig verschieden und leicht trennbar, wie die praktische Umsetzung der vorliegenden Erfindung zeigt.

DISKUSSION

Die in diesem Teil beschriebenen Versuche veranschaulichen die Ausführung mehrerer Hauptausführungsformen der vorliegenden Erfindung. Dabei handelt es sich unter anderem um die Isolierung von KGF kodierenden cDNAs, die Expression solcher cDNAs in rekombinanten Zellen, die Erzeugung verschiedener Antikörper, die mit KGF reagieren, und die Bereitstellung und Expression einer chimären cDNA, die einen neuartigen Wachstumsfaktor mit den Aminosäuresequenzen und den entsprechenden Funktionen von sowohl KGF als auch aFGF kodiert. Folgende Angaben in Zusammenhang mit diesen Ausführungsformen können zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung gemacht werden.
Die anhand der KGF-cDNA vorhergesagte Aminosäuresequenz stimmte mit der Aminosäuresequenz überein, die für die gereinigte, von humanen Fibroblasten sezernierte KGF-Form ermittelt wurde. Ferner bot die Sequenz mögliche Erklärungen für Positionen, an denen durch direkte Aminosäuresequenzierung keine eindeutige Zuweisung einer bestimmten Aminosäure möglich war.
Anhand der cDNA-Sequenz sollten zwar die Reste 32 und 46 Cysteine sein, jedoch sind hydrolysierte Derivate von nichtmodifizierten Cysteinresten nach Edman-Abbau nicht nachweisbar. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz für KGF enthielt darüber hinaus eine mögliche Stelle für asparragingebundene Glykosylierung (Asn-X-Ser/Thr) bei den Resten 45 bis 47. Wäre Asn 45 glykosyliert, so wäre sie mit den hier angewandten Aminosäuresequenzierungsverfahren nicht nachweisbar. Tatsächlich wandert KGF in NaDodSO&sub4;/PAGE als breite Bande bei einem Molekulargewicht, das größer als das vorhergesagte Molekulargewicht des gereinigten Proteins ist. Dies kann auf Glykosylierung zurückzuführen sein.
Die FGFs sind Heparin-bindende Mitogene mit einer breiten Zielzellen-Spezifität (II-10). Mit herkömmlichen NIH/3T3-Transfektionsversuchen wurde das hst Gen in einem humanen Magentumor (II-11), im benachbarten normalen Magengewebe (II-12) und im Kaposi-Sarkom (II-13) als transformierendes Gen identifiziert. Das Produkt des int-2-Gens wurde während der Embryogenese in Maus normal exprimiert (II-14) und nach Integration des Provirus des Maus-Brusttumor-Virus (mouse mammary tumor virus) (II-15) aberrant exprimiert.
KGF ist das sechste identifizierte Mitglied der Familie der Fibroblastenwachstumsfaktoren (II-28). Obwohl der Name FGF-6 aufgrund seiner fehlenden Aktivität auf Fibroblasten nicht geeignet erscheint, kann auch diese Bezeichnung für diesen Wachstumsfaktor benutzt werden, um seine strukturelle Verwandtschaft mit der FGF-Familie hervorzuheben. Da die bisher charakterisierten Wachstumsfaktoren Epithelzellen entweder gar nicht oder als eine von mehreren Zielzellen haben, ist KGF aufgrund der hohen Spezifität seiner mitogenen Aktivität für Epithelzellen, und insbesondere aufgrund der Sensitivität von Keratinocyten, einzigartig.
Bei den bisherigen Untersuchungen scheint die Expression des KGF-Transkriptes spezifisch für von Epithelgeweben stammende Stromazellen zu sein, was eine Funktion bei der normalen Proliferation von Epithelzellen nahe legt. Durch die Verfügbarkeit des KGF-cDNA-Klons wird man herausfinden können, ob eine anomale Expression dieses Wachstumsfaktors an klinischen Zuständen beteiligt ist, die sich durch Dysplasie und/oder Neoplasie der Epithelzellen auszeichnen. Ferner sollte die Fähigkeit, mit rekombinanten Methoden große Mengen dieses neuartigen Wachstumsfaktors herzustellen, die Erprobung seiner klinischen Anwendbarkeit bei Zuständen ermöglichen, bei denen das spezielle Wachstum von Epithelzellen von besonderer Bedeutung ist.
Die Zuordnung der KGF-Sequenz zu den Sequenzen der anderen fünf Proteine der FGF-Familie zeigte zwei Haupthomologiebereiche, die im Bereich der Aminosäuren 65-156 und 162-189 der vorhergesagten KGF-Sequenz liegen und bei den verschiedenen Mitgliedern der Familie durch kurze nicht-homologe Aminosäuresequenzen von unterschiedlichen Längen getrennt sind (Fig. II-2). Bei int-2 betrug die Länge dieser Sequenz 17 Reste, dagegen lagen die zwei homologen Bereiche bei hst nebeneinander. Bei KGF besteht die dazwischenliegende Sequenz aus fünf Aminosäuren.
In den zugeordneten Bereichen war die Aminosäuresequenz von KGF zu etwa 44% identisch mit int-2 (Maus), zu 39% identisch mit bFGF (Mensch), zu 37% identisch mit aFGF (Mensch) und zu 33% mit hst (Mensch). In demselben Bereich waren alle sechs Proteine bei 19% der Reste identisch und, bei Berücksichtigung von konservativen Substitutionen, zeigten sie eine 28%ige Homologie.
Wie in Fig. II-2 gezeigt, sind die Amino-Termini dieser verwandten Proteine nicht homolog und von unterschiedlicher Länge. Die primären KGF- und hst-Translationsprodukte enthalten hydrophobe N-terminale Bereiche, die wahrscheinlich als Signalsequenzen dienen (II-16). Ein weiterer Beleg für diese Annahme ist die Tatsache, dass diese N-terminale Domäne in dem reifen KGF-Molekül nicht vorhanden ist (Fig. II-1B). Dagegen scheinen die FGFs ohne Signalpeptid synthetisiert zu werden (II-10). Das int-2-Protein enthält einen atypisch kurzen Bereich von hydrophoben Resten am N-Terminus (II-17), es ist jedoch nicht bekannt, ob das Protein sezemiert wird. Femer enthält das int-2-Protein im Vergleich zu den anderen Mitgliedern der Familie eine lange C-terminale Verlängerung.
Der gereinigte KGF enthält fünf Cystein-Reste, von denen zwei über die gesamte Familie der FGF-verwandten Proteine konserviert sind (Fig. II-2). Bemerkenswert sind ebenfalls die fünf über die gesamte KGF-Sequenz verteilte Paare von basischen Resten. Dieses Muster wurde bei anderen Mitgliedern der FGF-Familie beobachtet und kann bei der Wechselwirkung mit Heparin eine Rolle spielen (II-18). Basische Paare sind ebenfalls übliche Ziele für die proteolytische Prozessierung; die in einigen KGF-Präparationen beobachtete Mikroheterogenität könnte auf eine solche Prozessierung zurückzuführen sein (unveröffentlichte Daten).
Die cDNA-Sequenz von KGF war über ihre gesamte Länge AT-reich, insbesondere aber in dem nichttranslatierten 3'-Bereich (mit 70% AT-Gehalt), im Vergleich zu 60% in der mutmaßlichen kodierenden Sequenz und 63% in dem nichttranslatierten 5'-Bereich. Der nichttranslatierte 3'-Bereich enthielt eine hohe Anzahl an ATTA-Sequenzen; es ist vorgeschlagen worden, dass diese Sequenzen an dem selektiven Abbau von transient exprimierten, instabilen RNAs beteiligt sein könnten (II-19). Ein klassisches AATAAA-Polyadenylierungssignal war zwar nicht vorhanden, jedoch wurden 24 bzw. 19 Nukleotide stromaufwärts von der Poly(A)-Sequenz am 3'-Ende der cDNA zwei Sequenzvarianten, AATTAA und AATACA (II-20) nachgewiesen.
Es ist vorgeschlagen worden, dass die Wirkung von Heparin auf sauren FGF entweder auf der Stabilisierung der aktiven Konformation dieses Wachstumsfaktors oder auf der Bildung eines terziären Komplexes mit saurem FGF und dessen Rezeptor beruhen könnte (II-21, II-22). In diesem Fall könnte Heparin eine Konformation von KGF stabilisieren, die weniger aktiv als das freie Molekül ist, oder einen engen Komplex bilden, der nicht in der Lage ist, eine effektive Wechselwirkung mit seinem Rezeptor einzugehen.
Die Fähigkeit, an Heparin zu binden, spiegelt zwar die strukturellen Ähnlichkeiten von KGF mit den FGFs wieder, die Unterschiede zwischen diesen verwandten Mitogenen bezüglich der Zielzellen- Spezifität sind jedoch bemerkenswert. Die FGFs induzieren die Teilung der meisten noch nicht endgültig differenzierten Zellen sowohl aus dem Mesodemi als auch aus dem Neuroektoderm von Embryonen. Unter den aus dem Mesoderm stammenden Zielzellen in Kultur sind neben Fibroblasten und vaskulären Endothelgeweben auch Myoblasten, Chondrocyten und Osteoblasten (II-23). Die FGFs wirken auch als Mitogene für gliäre Astrocyten und Neuroblasten (II-24). Das Produkt des aus dem Kaposi-Sarkom isolierten Onkogens, das mit hst identisch ist, stimuliert ebenfalls die Proliferation von NIH/3T3-Zellen und Endothel-Zellen der Kapillaren (II-25). Bisher wurde die KGF-induzierte Mitogenese nur bei Epithelzellen beobachtet; der Mangel an nachweisbarer Aktivität bei Fibroblasten oder Endothel-Zellen wurde ebenfalls gezeigt (siehe Versuchsteil I, vorstehend und II-3). Daher erscheint es wahrscheinlich, dass KGF über einen anderen Zelloberflächenrezeptor als die FGFs wirkt.
Es besteht keine signifikante Homologie zwischen dem N-Terminus des KGF-Proteins und dem anderer FGF-verwandten Proteine. Um herauszufinden, ob allein die N-terminale Domäne von KGF für seine einzigartige Zielzellen-Spezifität verantwortlich ist, wurde der Versuch unternommen, chimäre Moleküle zwischen KGF und einem Prototyp-FGF herzustellen. Die Ergebnisse für die erste solcher rekombinanten Polypeptidsequenzen deuten darauf hin, dass die N-terminale Domäne von KGF im Wesentlichen die Zellpräferenz für Keratinocyten kodiert, während die Sensitivität von KGF auf Heparin irgendwo in dem C-terminalen Bereich (core) kodiert wird, der durch Sequenzen von aFGF ersetzt wurde. Dieser neuartige KGF-ähnliche Wachstumsfaktor kann Vorteile bei klinischen Anwendungen haben, wo die Verabreichung eines für Epithelzellen spezifischen Wachstumsfaktors in Gegenwart von Heparin, einem verbreitet eingesetzten Antikoagulans, gewünscht wird. Zusätzliche Untersuchungen über Chimären sollten ebenfalls Information darüber liefern, welche spezielle Domänen in dem C-terminalen Bereich (core) zu den verschiedenen Wirkungen von Heparin auf ihre jeweilige biologische Aktivität beitragen.

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Zur Vervollständigung der Beschreibung des Standes der Technik sowie der Offenbarung werden alle veröffentlichten Artikel, Patente und Patentanmeldungen, die bisher in dieser Beschreibung angegeben wurden, durch Bezugnahme in die Beschreibung miteinbezogen.
Die vorangegangene Erfindung wurde zur Erläuterung und zum besseren Verständnis recht detailliert beschrieben. Es ist jedoch naheliegend, dass verschiedene Kombinationen in der Form und im Detail möglich sind, ohne den Schutzbereich der Erfindung zu verfassen.

Claims

1. Isoliertes, glykosyliertes oder nicht-glykosyliertes Keratinocytenwachstumsfaktor (KGF)-Protein, umfassend:

(a) die nachstehende Aminosäuresequenz,

(b) einen Teil der nachstehenden Aminosäuresequenz ohne die N-terminalen 31 Aminosäuren oder

(c) eine Aminosäuresequenz, die sich durch die Addition, Deletion oder Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren von der nachstehenden Aminosäuresequenz unterscheidet:

worin das Protein fähig ist, die DNA-Synthese in ruhenden BALB/MK epidermalen Keratinocyten mehr als 500-fach zu stimulieren, wohingegen das Protein keine mitogene Aktivität auf Fibroblasten und Endothel-Zellen aufweist.

2. KGF-Protein gemäß Anspruch 1, wobei 5 nM Protein weniger als einfache Stimulierung in NIH/3T3 Fibroblasten gegenüber dem Hintergrund autxeist.

3. KGF-Protein gemäß einem der Ansprüche 1-2, wobei das KGF-Protein eine spezifische Aktivität von wenigstens ungefähr 3,4 · 10&sup4; Einheiten pro Milligramm Protein aufweist, wobei eine Aktivitätseinheit definiert ist afs die Menge, die die Hälfte der maximal möglichen Stimulierung der DNA-Synthese in BALB/MK Keratinocytenzellen hervorruft.

4. KGF-Protein gemäß einem der Ansprüche 1-3, wobei das KGF-Protein glykosyliert ist.

5. KGF-Protein gemäß einem der Ansprüche 1-3, wobei das KGF-Protein nicht glykosyliert ist.

6. KGF-Protein gemäß einem der Ansprüche 1-5, das die Aminosäuresequenz umfasst:

7. KGF-Protein gemäß einem der Ansprüche 1-5, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die sich durch die Addition, Deletion oder Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren von der nachstehenden Aminosäuresequenz unterscheidet:

8. KGF-Protein gemäß einem der Ansprüche 1-5, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die sich durch die Addition, Deletion oder Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren von der nachstehenden Aminosäuresequenz unterscheidet:

9. KGF-Prorein gemäß einem der Ansprüche 1-5, das einen Aminosäurenabschnitt von Fig. II-18 umfasst, der die Aminosäuren 32-78 von Fig. II-18 umfasst, um dem KCF-Protein bevorzugte mitogene Aktivität für eine Epithelzelle zu überragen.

10. KGF-Protein gemäß einem der Ansorüche 1-5, das einen Abschnitt der nachstehenden Aminosäuresequenz umfasst:

M H K W I L T W I L P T L L Y R S C F H I I C L V G T I S L A C N D M T P E Q M A T N V N C S S P E R H T R S Y D Y M E G G D I R V R R L F C R T Q W Y L R I D K R G K V K G T Q E M K N N Y N I M E I R T V A V G I V A I K G V E S E F Y L A M N K E G K L Y A K K E C N E D C N F K E L I L E N H Y N T Y A S A K W T H N G G E M F V A L N Q K G I P V R G K K T K K E Q K T A H F L P M A I T

11. KGF-Protein gemäß Anspruch 10 das aus einem Abschnitt der nachstehenden Aminosäuresequenz besteht:

12. Isoliertes, glykosyliertes oder nicht-glykosyliertes Keratinocytenwachstumsfaktor (KGF)-Protein gemäß einem der Ansprüche 1-5, das aus einem Abschnitt der nachstehenden Aminosäuresequenz besteht:

worin der Abschnitt mitogene Aktivität für eine Keratinocytenzelle aufweist, und wobei der Abschnitt weiterhin Methionin am Amino-Terminus umfassen kann.

13. KGF-Protein gemäß Anspruch 12, wobei das KGF-Protein eine spezifische Aktivität von wenigstens ungefähr 3,4 · 10&sup4; Einheiten pro Milligramm Protein aufweist, worin eine Aktivitätseinheit definiert ist als die Menge, die die Hälfte der maximal möglichen Stimulierung der ONA-Synthese in BALB/MK Keratinocytenzellen hervorruft.

14. KGF-Protein gemäß einem der Ansprüche 1-13, worin das KGF-Protein Met am Amino-Terminus umfasst.

15. Pharmazeutische Zusammensetzung, die wenigstens ein KGF-Protein gemäß einem der Ansprüche 1-14 umfasst.

16. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Stimulierung von Epithelzellen, die wenigstens ein KGF-Protein gemäß einem der Ansprüche 1-14 umfasst.

17. Verwendung des KGF-Proteins gemäß einem der Ansprüche 1-14 zum Herstellen eines Medikamentes zur Stimulierung von Epithelzellen.

18. Verwendung des KGF-Proteins gemäß einem der Ansprüche 1-14 zum Herstellen eines Medikamentes, worin das Medikament topisch auf die Haut oder das Auge aufgebracht wird.

19. Verwendung des KGF-Proteins gemäß Anspruch 18, worin das Medikament topisch auf die Haut aufgebracht wird.

20. Chimäres Protein, wobei das chimäre Protein innerhalb eines einzelnen Polypeptidmoleküls ein KGF-Protein gemäß einem der Ansprüche 1-14 und wenigstens einen weiteren Teil eines Polypeptides der Fibroblastenwachstumsfaktor-Familie umfasst.

21. Chimäres Protein gemäß Anspruch 20, das die Aminosäuren 32 bis 78 von Fig. II-1B umfasst, um dem Polypeptidmolekül bevorzugte mitogene Aktivität von KGF für eine Epithelzelle zu übertragen.

22. Chimäres Protein gemäß Anspruch 21, worin der Fibroblastenwachstumsfaktor der saure Fibroblastenwachstumsfaktor (aFGF) ist.

23. Chimäres Protein gemäß Anspruch 22, worin der Teil eines Polypeptides von aFGF durch die Aminosäurereste in dem Teil von aFGF bestimmt ist, der homolog zu der für die Heparinsensitivität von KGF verantwortlichen KGF-Sequenz ist.

24. Chimäres Protein gemäß Anspruch 23, worin das KGF-Protein durch die Aminosäurereste 32-78 in Fig. II-1B bestimmt ist und der Teil eines Polypeptides von aFGF durch den Carboxy-Terminus von aFGF bestimmt ist, der mit dem Aminosäurerest 39 beginnt.

25. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein chimäres Protein gemäß einem der Ansprüche 20-24 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.

26. Verwendung eines chimären Proteins gemäß einem der Ansprüche 20-24 zum Herstellen eines Medikamentes zum Behandeln von Zuständen, die die spezifische Stimulierung von Epithelzellen in Gegenwart von Heparin erfordern.

27. Verwendung eines chimären Proteins gemäß einem der Ansprüche 20-24 zum Herstellen eines Medikamentes, das topisch auf die Haut oder das Auge aufgebracht wird.

28. Antikörper, der spezifisch gegen das KGF-Protein gemäß einem der Ansprüche 1-14 gerichtet ist.

29. Antikörper gemäß Anspruch 28, der die mitogene Aktivität von humanem KGF neutralisiert.

30. Antikörper gemäß Anspruch 28, der ein polyklonaler Antikörper ist.

31. Antikörper gemäß Anspruch 28, der ein monoklonaler Antikörper ist.

32. Antikörper gemäß Anspruch 28, der mit dem Peptid NDMTPEQMATNVR reagiert.

33. Pharmazeutische Zusammensetzung, die wenigstens einen Antikörper gemäß Anspruch 28 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.

34. Verwendung des Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 28-32 zum Herstellen eines Medikamentes zum Behandeln von Zuständen, die die spezifische Hemmung der Stimulierung von Epithelzellen durch KGF erfordern.

35. Rekombinantes DNA-Molekül, das einen Keratinocytenwachstumsfaktor (KGF) gemäß einem der Ansprüche 1-14 kodiert.

36. Rekombinantes DNA-Molekül, das ein chimäres Protein gemäß einem der Ansprüche 20-24 kodiert.

37. Rekombinantes DNA-Molekül, das das DNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 35 und 36 und einen Vektor umfasst.

38. Rekombinantes DNA-Molekül gemäß Anspruch 37, worin der Vektor ein Plasmid, ein Bakteriophagen-Klonierungsvektor, ein DNA-Sequenzierungs- Plasmidvektor, ein Genexpressionsvektor in Bakterien oder ein Genexpressionsvektor in Säugern ist.

39. Wirtszelle, die ein rekombinantes DNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 37 oder 38 umfasst.

40. Zelle gemäß Anspruch 39, worin die Zelle eine Säugerzelle, eine Insektenzelle, eine Hefezelle, oder eine Bakterienzelle ist.

41. Verfahren zum Herstellen des KGF-Proteins gemäß Anspruch 1, wobei das Verfahren den Schritt des Kultivierens der Zelle gemäß einem der Ansprüche 39 -40 in einem Kulturmedium unter Bedingungen umfasst, so dass das Protein hergestellt wird.

42. Verfahren gemäß Anspruch 41, das weiterhin den Schritt des Isolierens des KGF-Proteins umfasst.

43. Verfahren gemäß Anspruch 41, worin das rekombinante DNA-Molekül eine von der natürlichen KGF-Promotor-DNA unterschiedliche Promotor-DNA umfasst, die in operativer Weise mit der das KGF-Protein kodierenden DNA verbunden ist.

44. Verfahren gemäß Anspruch 43, worin das rekombinante DNA-Molekül KGF- Protein kodierende natürliche DNA umfasst.

45. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 41-44, worin die Zelle eine E. coli Zelle ist.

46. Verfahren zum Herstellen des KGF-Proteins oder des chimären Proteins gemäß einem der Ansprüche 1-14 oder 20-24, das die nachstehenden Schritte umfasst:

i) Inkontaktbringen einer ersten das Protein umfassenden Lösung mit Heparin unter Bedingungen, so dass das Protein an das Heparin bindet, wodurch ein Heparin-Proteinkomplex gebildet wird;

ii) Abtrennen des Heparin-Proteinkomplexes aus der ersten Lösung; und

iii) Abtrennen des Proteins aus dem Heparin-Proteinkomplex.

47. Verfahren zum Bestimmen des Spiegels an KGF-RNA-Transkript, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

i) Isolieren der mRNA aus Geweben oder Zellen;

ii) Anlagern (annealing) der mRNA an eine DNA-Sonde, die ein KGF-Protein gemäß einem der Ansprüche 1-14 kodiert, zur Bildung eines DNA : RNA- Hybrids; und

iii) Bestimmen der Menge von DNA : RNA-Hybrid.

48. Verfahren zum Nachweisen eines KGF-Proteins in einer Probe, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

i) Umsetzen von Polypeptiden aus Körperflüssigkeiten oder Gewebeproben mit einem Antikörper gemäß Anspruch 29 zur Bildung eines Antikörper- Polypeptidkomplexes; und

ii) Nachweisen des Komplexes.

49. Zusammensetzung, die das KGF-Protein oder chimäres Protein gemäß einem der Ansprüche 1-14 oder 20-24 umfasst.

50. Verfahren zur Stimulierung des Epithelzellwachstums in vitro, wobei das Verfahren den Schritt des Hinzufügens einer für die Stimulierung des Epithelzellwachstums ausreichenden Menge der Zusammensetzung gemäß Anspruch 49 umfasst.

51. Verfahren gemäß Anspruch 50, worin die Zellen Keratinocyten sind.