DE69032591T2

DE69032591T2 - Physiologisch aktive peptide und den calcium-metabolismus regulierende arzneimittel, die genannte peptide als wirkungsvollen bestandteil enthalten

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Publication number: DE69032591T2
Application number: DE69032591T
Authority: DE
Inventors: Satoshi C/O Tsumura & Co. Inashiki-Gun Ibaraki Hanamura; Masahiko C/O Tsumura & Co. Inashiki-Gun Ibaraki Marumoto; Ronald C. Belmont Ca 94002 Orlowski; Kenji C/O Tsumura & Co. Inashiki-Gun Ibaraki Sakamoto; Yoshihiro C/O Tsumura & Co. Inashiki-Gun Ibaraki Waki
Original assignee: Tsumura and Co
Current assignee: Tsumura and Co
Priority date: 1989-04-21
Filing date: 1990-04-19
Publication date: 1999-01-07
Anticipated expiration: 2010-04-20
Also published as: US6127519A; AU640141B2; JP2778249B2; KR0141973B1; JPH03505589A; ATE170191T1; CA2030795A1; EP0423326A1; KR920700224A; DE69032591D1; CA2030795C; AU5548790A; WO1990012809A1; ES2119746T3; EP0423326B1; BR9006746A; DK0423326T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue, physiologisch aktive Gruppe von Peptiden, die bei der Behandlung von durch abnormen Calcium-Metabolismus im Körper verursachten Erkrankungen, wie Hypercalcämie, Paget-Knochenkrankheit und Osteoporose wirksam sind.
Östrogene, Vitamin D, Calciumsalze und Calcitonin wurden zur Behandlung von Hypercalcämie, Paget- Knochenkrankheit und Osteoporose eingesetzt; ihr Defizit bestand jedoch darin, daß die Indication begrenzt oder die Wirkung nicht eindeutig ist.
Calcitonin ist ein einkettiges, aus 32 Aminosäuren bestehendes Polypeptidhormon, das in der Natur vorkommt und aus der Schilddrüse von Säugetieren und der Ultimobranchialdrüse von Fischen und Vögeln abgesondert wird. Die Zusammensetzung oder Sequenz der Aminosäuren unterscheidet sich in hohem Maße bei den verschiedenen Spezies, die physiologische Wirksamkeit im Blut ist bei ihnen jedoch im wesentlichen die gleiche.
Folglich haben die hier angesprochenen Erfinder Forschung betrieben mit dem Ziel, ein den Calcium- Metabolismus regulierendes Arzneimittel zu entwickeln, das sich für die Behandlung von Hypercalcämie, Paget- Knochenkrankheit und Osteoporose eignet, und zu diesem Zweck neue Peptide synthetisiert und deren physiologische Wirksamkeit untersucht. Als Ergebnis hat sich herausgestellt, daß die neuen nachstehend beschriebenen Peptide eine hohe Wirksamkeit bezüglich der Senkung des Calciumspiegels im Blut aufweisen.
Genauer gesagt wird in Übereinstimmung mit einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ein neues physiologisch wirksames Peptid zur Verfügung gestellt, das in einer der folgenden Sequenzen 1-10 vorliegt.
Besonders bevorzugt sind Peptide der Sequenzen 2, 3 und 4.
Hinsichtlich weiterer Aspekte liefert die Erfindung ein Peptid wie oben definiert zur Verwendung bei der Regulierung des Calcium-Metabolismus; eine pharmazeutische Zusammensetzung bestehend aus einem Peptid wie oben definiert, zusammen mit einem pharmazeutischen Träger; Verwendung eines Peptids wie oben definiert bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur Verwendung bei der therapeutischen Regulierung des Calcium-Metabolismus; und ein Verfahren zur Darstellung eines Peptids wie oben definiert, das aus einer Flüssig- oder Festphasenmethode für die Peptidherstellung, bevorzugt einer Festphasenmethode besteht, bei der geeignete L-Aminosäuren der Reihe nach beim C-Terminal des gewünschten Peptids beginnend zu einem in organischen Lösungsmitteln unlöslichen Harz kondensiert werden mit daran anschließender Säurebehandlung, und man so das gewünschte Peptid erhält.
In Übereinstimmung mit einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein den Calcium-Metabolismus regulierendes Arzneimittel zur Verfügung gestellt, welches das oben erwähnte Peptid als Wirkstoff enthält.
Unter dem Begriff "Calciummetabolismusregulierendes Mittel", der in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen im Anhang verwendet wird, versteht man ein wirksames Mittel zur Heilung einer Krankheit, von der man annimmt, daß sie durch einen abnormen Calciummetabolismus im Körper, wie etwa Hypercalcämie oder Paget- Knochenkrankheit und Osteoporose verursacht wird.
In der vorliegenden Beschreibung und den beiliegenden Ansprüchen werden Aminosäuren gemäß der von der Commission on Biochemical Nomenclature (CBN), der Union of Pure and Applied Chemistry und der International Union of Biochemistry (IUPAC-IUB) übernommenen Methode abgekürzt. Zum Beispiel werden folgende Abkürzungen verwendet.
Das Peptid der vorliegenden Erfindung kann nach der bekannten, normalerweise für die Synthese von Peptiden verwendeten Flüssig- oder Festphasenmethode synthetisiert werden. Wenn zum Beispiel die Festphasenmethode angewandt wird, erfolgt die Synthese auf folgende Weise.
Insbesondere werden geschützte L-Aminosäuren entsprechend derjenigen, die durch die oben stehende Formel wiedergegeben werden, beginnend beim C-Terminal, der Reihe nach an ein in organischen Lösungsmitteln unlösliches Harz kondensiert, und dann wird eine Säurebehandlung vorgenommen, wobei das Peptid (als freies Peptid) der vorliegenden Erfindung erhalten wird.
Ein in organischen Lösungsmitteln unlösliches Harz, das gegenüber einem Lösungsmittel beständig ist, ist nahezu unzerbrechlich, hat ein gutes Quellungsvermögen und wird deshalb bevorzugt als in organischen Lösungsmitteln unlösliches Harz verwendet. Als spezifische Beispiele können ein Harz, das durch Einführung einer funktionellen Gruppe wie etwa eine Chlormethyl- oder Hydroxymethyl-Gruppe in ein Styrol/Divinylbenzol-Copolymerisat gebildet wurde, und ein Harz, das durch Umwandlung des erwähnten Copolymerisats in ein solches vom Benzhydrylamin-Typ gebildet wurde, angeführt werden.
Da das C-Terminal des Peptids der vorliegenden Erfindung ein Amid ist, sollte, wenn die oben erwähnten zwei Harztypen eingesetzt werden, die Amidierung unter Verwendung von Ammoniak oder etwas ähnlichem durchgeführt werden. Seitenketten anderer am Aufbau beteiligter Aminosäuren werden durch diese Amidierung beeinflußt, weshalb die Synthese nicht wirksam durchgeführt werden kann. Folglich wird ein Harz vom Benzhydrylamin-Typ (BHA-Harz) der letzteren Art, das am C-Terminal für die Säurebehandlung ein Peptidamid zur Verfügung stellen kann, vorgezogen. Anmerkung: Es kann irgendein Harz verwendet werden, das wie das oben erwähnte Harz vom Benzhydrylamin-Typ wirksam in der Lage ist, ein Peptid mit einem am C-Terminal vorhandenen Amid zur Verfügung zu stellen.
BHA-Harze mit unterschiedlichem Vernetzungsgrad und variierenden Mengen an eingebauten Aminogruppen werden hergestellt, passend ausgewählt und dem vorgesehenen Zweck entsprechend eingesetzt. Darüber hinaus können auch handelsübliche Harze verwendet werden.
Das oben erwähnte Harz muß vor der Synthese aktiviert werden, wobei diese Aktivierung zum Beispiel auf folgende Weise vorgenommen werden kann.
Ein BHA-Harz wird in ein Reaktionsgefäß für die Festphasensynthese von Peptiden chargiert, mit Methylenchlorid und Triethylamin(TEA)10%/Methylenchlorid versetzt, und die Mischung 1 bis 3mal für jeweils 5 bis 10 Minuten gerührt und danach filtriert. Genauso wird Methylenchlorid, Methanol oder Ethanol und erneut Methylenchlorid zugegeben, der Reihe nach gerührt (1 bis 3 mal bei jedem Lösungsmittel für jeweils 1 bis 3 Minuten Rühren) und danach filtriert und gewaschen.
Bei diesem Herstellungsverfahren werden Aminosäuren der Reihe nach kondensiert, bei denen eine α-Aminogruppe allein oder zusammen mit einer funktionellen Gruppe der Seitenkette durch eine Schutzgruppe geschützt wird. Eine tert.-Butyloxycarbonyl(Boc)-Gruppe, eine 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl(Fmoc)-Gruppe oder eine gleichwertige Gruppe werden als Schutzgruppe für die α-Aminogruppe eingesetzt.
Im Fall von Asparagin oder Glutamin wird im allgemeinen eine Boc- oder Fmoc-Aminosäure direkt oder in Form des jeweiligen Phenylesters, zum Beispiel des p-Nitrophenylesters, eingesetzt. Außerdem kann die Aminosäure mit der durch eine Xanthyl(Xan)-Gruppe, eine 4,4-Dimethoxybenzhydryl(Mbh)-Gruppe oder eine gleichwertige Gruppe geschützten ω-Carbamidgruppe eingesetzt werden.
Die ω-Carboxylgruppe der Asparagin- oder Glutaminsäure wird durch eine Benzylester(OBzl)-, Cyclohexylester- oder eine gleichwertige Gruppe geschützt.
Die Guanidingruppe von Arginin oder die Imidazolgruppe von Histidin werden im allgemeinen durch eine p-Toluolsulfonyl(Tos)- oder eine Dinitrophenyl(Dnp)- Gruppe geschützt.
Die &epsi;-Aminogruppe von Lysin wird durch eine Benzyloxycarbonyl(Z)-Gruppe, einem Derivat davon, d. h. eine o-Chlorbenzyloxycarbonyl(Cl-Z)-Gruppe, oder eine gleichwertige Gruppe geschützt.
Die alkoholische Hydroxylgruppe von Serin oder Threonin wird im allgemeinen durch eine Benzyl(Bzl)- oder eine gleichwertige Gruppe geschützt.
Die phenolische Hydroxylgruppe von Tyrosin wird im allgemeinen durch eine Bzl-Gruppe, ein Derivat davon wie etwa eine 2,6-Dichlorbenzyl(Cl&sub2;-Bzl)-Gruppe, eine o-Brombenzyloxycarbonyl(Br-Z)- oder eine gleichwertige Gruppe geschützt.
Außerdem werden Prolin, Alanin, Glyzin, Leucin, Isoleucin, Methionin, Valin und Tryptophan im allgemeinen in Form einer Boc- oder Fmoc-Aminosäure eingesetzt.
Es können auch handelsübliche Produkte dieser geschützten Aminosäuren verwendet werden.
Die Synthese des Peptids der vorliegenden Erfindung wird jetzt im einzelnen näher beschrieben.

(1) Zugabe der einzelnen Aminosäuren

Ein BHA-Harz wird in ein Reaktionsgefäß chargiert, das mit einer Einfüllöffnung für ein Reagenz, ein Lösungsmittel und etwas vergleichbares, sowie mit einem Filter für die Rückgewinnung des Lösungsmittels durch Filtration ausgestattet ist, wobei das Harz so vorliegt, daß durch Schütteln des Gefäßes als Ganzes oder durch Rühren und Filtration unter erhöhtem oder vermindertem Druck eine Reaktion erfolgt. Dieses Reaktionsgefäß besteht vorzugsweise aus Glas, teflonbeschichtetem Glas oder aus Teflon.
Zu 1 g BHA-Harz werden etwa 2 bis etwa 20 ml eines das Harz zum Quellen bringenden Lösungsmittels wie etwa Methylenchlorid, Chloroform, Dimethylformamid (DMF) oder Benzol zugegeben. Das Harz wird im Lösungsmittel suspendiert, und dann eine dem C-Terminal entsprechende Aminosäure mit einer geschützten α-Aminogruppe in die Suspension gegeben in einer Menge von etwa 1 bis etwa 6 Äquivalenten pro Äquivalent der Aminogruppe des Harzes. Danach wird etwa 1 bis etwa 20 Minuten gerührt oder geschüttelt, ein Kupplungsmittel wie etwa Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in einer Menge von etwa 0,5 bis 2 Äquivalenten pro Äquivalent der geschützten Aminogruppe zugegeben und erneut gerührt oder geschüttelt.
Anstelle des Kupplungsmittels DCC können noch wasserlösliches Carbodiimid, Carbonyldiimidazol, Woodward-Reagenz "K", N-Ethyl-2'- hydroxybenzisoxazoltrifluorborat, 1-Ethoxycarbonyl-2- ethoxy-1,2-dihydroxychinolin, Bop-Reagenz und Diphenylphosphorylazid erwähnt werden.
Außerdem kann die Aminosäure mit einer geschützten α-Aminogruppe durch die Aktiver Ester - Methode oder die Symmetrisches Anhydrid - Methode an das Harz gebunden werden.
Der Grad des Fortschritts der Kupplungsreaktion kann durch den Ninhydrin-Test oder den Fluorescamin-Test verfolgt werden. Falls diese Reaktion unvollständig ist, wird die Kupplungsreaktion wiederholt.
Nach beendeter Reaktion wird das Aminosäureharz einmal bis mehrmals durch Verwendung von mindestens einem Lösungsmittel gewaschen, das unter Methylenchlorid, Chloroform, Methanol, Ethanol, DMF, Benzol und Essigsäure ausgewählt und in einer Menge von etwa 2 bis etwa 50 ml pro Gramm des zu Beginn eingesetzten BHA-Harzes eingesetzt wird. Das Prolin-Harz wird dann durch Filtration erhalten.
Die nicht umgesetzte Aminogruppe des gewaschenen BHA-Harzes wird durch folgende Reaktion mit einem Abbruchreagenz blockiert, und das Harz erneut gewaschen.
Als Abbruchreagenz kann Essigsäureanhydrid, Triethanolamin (TEA)/Methylenchlorid oder Chloroform, Acetylimidazol/DMF, Fluorescamin-diisopropylethylamin/ Methylenchlorid oder etwas ähnliches eingesetzt werden. Das Abbruchreagenz wird in einer Menge von etwa 0,5 bis etwa 5 Äquivalenten pro Äquivalent der Aminogruppe des Harzes eingesetzt, und die Reaktion in etwa 10 Minuten bis etwa 18 Stunden durchgeführt.
Für die Ankupplung der nächsten Aminosäure an das C-Terminalaminosäure-Harz wird die α-Aminoschutzgruppe des C-Terminalaminosäure-Harzes entfernt.
Als Reagenz für die Entfernung der Boc-Gruppe wird Trifluoressigsäure (TFA) bevorzugt und direkt (100%) oder auf 10% oder mehr mit Methylenchlorid, Chloroform oder einem entsprechenden Lösungsmittel verdünnt eingesetzt.
Die TFA-Lösung wird vorzugsweise in einer Menge von etwa 2 bis etwa 50 ml pro Gramm des zu Beginn eingesetzten BHA-Harzes zugegeben, und die Reaktion in etwa 5 bis etwa 60 Minuten durchgeführt. Nach der Reaktion wird filtriert und mit dem oben erwähnten Waschlösungsmittel gewaschen, eine Lösung aus etwa 5 bis etwa 30% TEA in Methylenchlorid, Chloroform oder einem entsprechenden Lösungsmittel in einer Menge von etwa 2 bis etwa 50 ml pro Gramm des zu Beginn eingesetzten BHA-Harzes zugegeben, um restliches TFA zu neutralisieren. Danach wird erneut mit dem oben erwähnten Waschlösungsmittel gewaschen.
Für die Entfernung der Fmoc-Gruppe wird Piperidin als Reagenz bevorzugt und mit Methylenchlorid, DMF, Chloroform oder einem entsprechenden Lösungsmittel verdünnt und in Form einer 5 bis 50%igen Lösung eingesetzt.
Die Piperidin-Lösung wird in einer Menge von etwa 2 bis etwa 100 ml pro Gramm des zu Beginn eingesetzten BHA-Harzes zugegeben, und die Reaktion vorzugsweise in etwa 5 bis etwa 60 Minuten durchgeführt. Nach der Reaktion wird filtriert und mit dem oben erwähnten Waschlösungsmittel gewaschen.
Dann wird eine weitere Aminosäure auf folgende Weise eingebaut.
Zu dem erhaltenen C-Terminalaminosäure-Harz wird ein Lösungsmittel zugegeben, um eine Suspension zu bilden, danach eine Aminosäure mit geschützter α-Aminogruppe in einer Menge von etwa 1 bis etwa 60 Äquivalenten pro Äquivalent der Aminogruppe des Harzes und schließlich ein Kupplungsmittel.
Der Grad des Fortschritts der Kupplungsreaktion kann durch den Ninhydrin- oder Fluorescamin-Test überprüft werden.
Nach beendeter Reaktion wird das Harz mit dem oben erwähnten Waschlösungsmittel gewaschen. Falls die Reaktion unvollständig ist, wird die Kupplungsreaktion wiederholt, oder durch Einsatz des oben erwähnten Abbruchreagenzes bei der anschließenden Reaktion eine Blockierung vorgenommen.
Bei den nachfolgenden Arbeitsschritten werden Entfernen der Schutzgruppe, Waschen, Neutralisieren, Waschen, Kuppeln und erneutes Waschen auf die gleiche Weise wie oben beschrieben durchgeführt mit der Ausnahme, daß den jeweiligen Aminosäuren entsprechende Schutzaminogruppen eingesetzt werden. Da die Kupplung mit zunehmender Länge der Peptidkette schwierig wird, wird vorzugsweise 1-Hydroxybenztriazol (HOBt) dem DCC zugegeben und die Reaktion in DMF durchgeführt, oder die Reaktion erfolgt vorzugsweise durch Zugabe von Diisopropylethylamin (DIEA) zum Bop-Reagenz.
Beim Peptid mit einer durch eine Bindung anders als die Disulfid-Bindung gebildeten zyklischen Struktur kann diese beim Harz zum Beispiel durch Anwendung eines Verfahrens gebildet werden, bei dem nach vollzogener Kupplung der Aminosäure in 1-Stellung die Seitenkette der Aminosäure in 1-Stellung und die Seitenkette der entsprechenden Aminosäure durch das Kupplungsverfahren wie oben beschrieben miteinander verbunden werden, oder durch ein Verfahren, bei dem die entsprechende Aminosäure, an deren Seitenkette die Aminosäure in 1-Stellung gebunden ist, an die andere entsprechende Aminosäure gebunden wird, an deren α-Aminosäure nacheinander Aminosäuren gebunden werden.
Die Modifizierung der N-α-Aminogruppe durch einen Acyl-, Alkyl- oder entsprechenden Rest kann nach einer an sich bekannten Methode vorgenommen werden, und das Peptid ohne N-α-Aminogruppe durch Zugabe der entsprechenden Carboxylsäure oder etwas ähnliches zur Aminosäure in 1-Stellung erhalten werden.
Das durch den Einbau der einzelnen Aminosäuren in der oben beschriebenen Weise erhaltene Peptid-Harz wird aus dem Reaktionsgefäß herausgenommen und getrocknet.

(2) Isolierung des Peptids aus dem Harz und Entfernen der Schutzgruppe

Das Peptid-Harz wird mit Fluorwasserstoff (HF) behandelt, um die Amid-Bindung zwischen Peptid und Harz zu lösen und die Schutzgruppe zu entfernen, wobei das freie Peptid erhalten wird.
Für die HF-Behandlung ist ein besonderes Gefäß erforderlich; es kann ein handelsübliches Gefäß verwendet werden.
Das trockene Peptid-Harz wird in das Gefäß gefüllt, zur Kontrolle auftretender Nebenwirkungen wird Anisol in einer Menge von 0,5 bis 5 ml pro Gramm Peptid-Harz zugegeben und die Mischung gerührt. Danach gibt man flüssigen HF in einer Menge von 2 bis 50 ml pro Gramm Peptid-Harz zu, und die Behandlung wird 0,5 bis 2 Stunden bei -20 bis 0ºC durchgeführt.
Dem Anisol wird vorzugsweise noch Dimethylsulfid oder Ethandithiol zugegeben.
Nach beendeter Reaktion wird der HF unter Vakuum entfernt, und restlicher HF, die Schutzgruppe, Anisol und andere Additive werden unter Verwendung eines Lösungsmittels wie Ethylacetat, Diethylether oder Benzol entfernt. Das Peptid wird mit einer sauren wäßrigen Lösung wie etwa einer verdünnten Essigsäure extrahiert, und das Harz durch Filtration isoliert.
Im erhaltenen Peptid ist am C-Terminal ein Amid vorhanden.

(3) Reinigung des rohen Peptids

Das durch die oben beschriebenen Arbeitsschritte erhaltene Peptid der vorliegenden Erfindung enthält während der Synthese gebildete modifizierte Peptide, bei der Kristallisation gebildete Oligomere und andere Nebenprodukte. Folglich ist eine Reinigung notwendig.
Genauer gesagt wird die aus dem Harz extrahierte Lösung oder die durch die Kristallisation erhaltene Lösung durch Ultrafiltration konzentriert und dann einer Ionenaustauscher-Behandlung und einer Gefriertrocknung unterzogen. Das trockene Produkt wird durch Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatographie mit Umkehrphase und dann einer Ionenaustauscher-Behandlung und Gelfiltration unterzogen, wodurch ein gereinigtes Produkt erhalten wird.
Die folgenden 10 neuen Peptide wurden mit Hilfe der oben beschriebenen Synthese erhalten.
Die Strukturen und Aminosäure-Sequenzen dieser 10 Peptide und 5 ähnlicher Peptide (A-E) werden untenstehend beschrieben (jedes Peptid wird nachstehend durch die entsprechende Nummer gekennzeichnet). Peptid A Peptid B Peptid C Peptid D Peptid E Peptid Nr. 1 Peptid Nr. 2 Peptid Nr. 3 Peptid Nr. 4 Peptid Nr. 5 Peptid Nr. 6 Peptid Nr. 7 Peptid Nr. 8 Peptid Nr. 9 Peptid Nr. 10
Die Ergebnisse der Aminosäuren-Analyse des durch das oben erwähnte Herstellungsverfahren erhaltenen Peptids der vorliegenden Erfindung sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.
In Tabelle 1 ist jeder oben aufgeführte ein gefundener und jeder unten in Klammern aufgeführte ein theoretischer Wert. Tabelle 1
Das Peptid der vorliegenden Erfindung hat eine ausgezeichnete reduzierende Wirkung auf den Calcium- Spiegel im Serum, und es ist wirksam bei der Heilung von durch abnormen Calcium-Metabolismus im Körper verursachte Erkrankungen, wie etwa Hyperkalzämie und Osteoporose. Dies wird jetzt mit folgendem Test näher beschrieben.

Test 1

Sechs Wochen alte weibliche Ratten der Wistar-Rasse (jede Gruppe bestand aus 4 Ratten) wurden als Versuchstiere verwendet, und die in den nachstehend wiedergegebenen Beispielen erhaltenen Peptide der vorliegenden Erfindung wurden in mit einer 1%igen wäßrigen Lösung von Natriumacetat (pH 4,0) eingestellten Konzentrationen getestet, denen man 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) zugesetzt hatte.
Die Lösung wurde auf eine Konzentration von 166 ug/ml, 830 ng/ml oder 83 ng/ml eingestellt und in einer Menge von 1 ml/kg über die Schwanzvene verabreicht.
Die Ratte wurde auf dem Rücken fixiert, und ihr unmittelbar vor der Verabreichung und in vorher bestimmten Intervallen nach der Verabreichung aus der Halsvene Blut entnommen. Die jedesmal gesammelte Blutmenge betrug 0,3 ml. Die Blutproben wurden 20 Minuten lang bei 3500 UpM zentrifugiert, im abgetrennten Serum wurde der Calciumgehalt mit dem TBA-380 (Lieferant: Toshiba) unter Verwendung eines Wako-Calcium-Meßkits (Methode o-cpc) gemessen, und das Reduktionsverhältnis der Calciumkonzentration im Serum bestimmt.
Die Ergebnisse sind in den Tabellen 2 bis 5 zusammengefaßt. Tabelle 2 Tabelle 3 Tabelle 4 Tabelle 5
Mit den vorstehenden Ergebnissen wurde bestätigt, daß das Peptid der vorliegenden Erfindung eine den Calcium-Spiegel im Serum reduzierende Wirkung hat.
Die akute Toxizität (LD&sub5;&sub0;) des Peptids der vorliegenden Erfindung beträgt 10.000 IE/kg oder mehr bei Mäusen bei oraler Verabreichung oder intravenöser Injektion, oder 5.000 IE/kg oder mehr bei Ratten bei oraler Verabreichung oder intravenöser Injektion. Das Peptid der vorliegenden Erfindung hat nämlich einen hohen Sicherheitsfaktor.
Folglich ist das Peptid der vorliegenden Erfindung ein sicheres Medikament ohne wesentliche nachteilige Wirkung und wirksam bei der Heilung von Hyperkalzämie, Paget-Knochenkrankheit und Osteoporose.
Die verabreichte Menge Peptid der vorliegenden Erfindung und das Verfahren zur Herstellung eines Medikaments der vorliegenden Erfindung werden jetzt näher beschrieben.
Das Peptid der vorliegenden Erfindung kann direkt an Mensch und Tier oder zusammen mit einem der üblichen pharmazeutischen Träger verabreicht werden. Die Darreichungsform wird entsprechend gewählt, das heißt es können nichtorale Arzneimittel wie etwa eine Injektion, ein Suppositorium und ein über eine Schleimhaut verabreichtes Medikament in Betracht gezogen werden.
Damit das nichtorale Medikament eine beabsichtigte Wirkung ausübt, wird das Peptid der vorliegenden Erfindung durch intravenöse Injektion, intravenöse Einträufelung, subkutane Injektion oder intramuskuläre Injektion oder in Form eines Suppositoriums oder eines über eine Schleimhaut verabreichten Medikamentes vorzugsweise mit einem Titer von 10 bis 200 IE pro Tag an Erwachsene verabreicht, obwohl die verabreichte Menge des Peptids vom Alter und Körpergewicht eines Patienten und der Schwere der Erkrankung abhängt.
Diese nichtoralen Arzneimittel werden nach üblichen Verfahren hergestellt. Im allgemeinen kann als Diluens für Injektionszwecke geeignetes destilliertes Wasser, physiologische Kochsalzlösung, eine wäßrige Glukose- Lösung, ein für Injektionszwecke geeignetes Pflanzenöl, Sesamöl, Erdnußöl, Sojaöl, Maiskeimöl, Propylenglykol und Polyethylenglykol verwendet werden. Es kann auch ein Fungizid, ein Antiseptikum und ein Stabilisator zugesetzt werden. Vom Sicherheitsstandpunkt kann ein Verfahren angewandt werden, bei dem das nichtorale Medikament in eine Ampulle oder etwas vergleichbares abgefüllt und dann eingefroren, das Wasser durch konventionelle Gefriertrocknung entfernt, und das trockene Produkt unmittelbar vor der Verabreichung wieder in eine Flüssigkeit umgewandelt wird. Außerdem kann bei Bedarf ein isotonisches Mittel, ein Konservierungsmittel, ein Antiseptikum, ein Analgetikum, ein Dispergiermittel, ein Antioxydans und etwas ähnliches zugegeben werden.
Als weitere nichtorale Arzneimittel können für die Verabreichung in den Darm ein Suppositorium, ein Medikament für die Verabreichung über die Schleimhaut, eine Salbe oder etwas ähnliches in Betracht gezogen werden, die nach herkömmlichen Verfahren hergestellt werden können.
Die vorliegende Erfindung wird nun im einzelnen beschrieben unter Einbeziehung der folgenden Beispiele, die in keinem Fall den Umfang der Erfindung eingrenzen.

Erläuterndes Beispiel A

(1) Aktivierung des Harzes

Ein Reaktionsgefäß (Lieferer: Peninsula Laboratory) für die Festphasen-Synthese von Peptiden wird mit 150 g BHA-Harz chargiert (Lieferant: Peninsula Laboratory, Gehalt an Divinylbenzol = 1%, 100 bis 120 mesh, Gehalt an Aminogruppen: 0,86 mN/g), das Harz mit den folgenden Lösungsmitteln der Reihe nach 2mal mit jedem Lösungsmittel jeweils 5 Minuten gerührt mit anschließender Filtration.
(i) 1 Liter Methylenchlorid
(1i) 420 ml TEA 10%/Methylenchlorid
Danach wird der Reihe nach mit jeweils 1,5 Liter Methylenchlorid, Methanol und erneut Methylenchlorid gewaschen. Mit jedem Lösungsmittel wird 2mal gewaschen, bei jedem Waschgang 2 Minuten gerührt und nach jedem Rühren filtriert (dieses Waschen wird nachstehend als "Waschoperation I" bezeichnet).

(2) Stufe 1

Das gesamte beim obigen Verfahren (1) erhaltene Harz wurde der Reihe nach mit folgenden Lösungsmitteln gerührt, und danach wurde filtriert.

Kupplung:

1,5 Liter Methylenchlorid + 25,8 g (0,12 Mol) Boc-Pro + 120 ml 1 M DCC/Methylenchlorid (2,5 Stunden).
Danach wird die Waschoperation I durchgeführt.

Acetylierung:

1,5 Liter Methylenchlorid + 10 ml Essigsäureanhydrid + 100 ml TEA 10%/Methylenchlorid (30 Minuten). Danach wird die Waschoperation I durchgeführt.
Wenn das behandelte Harz dem Ninhydrin-Test unterzogen wurde, war das Ergebnis negativ.

(3) Stufe 2

Das gesamte beim obigen Verfahren (2) erhaltene Harz wurde der Reihe nach mit folgenden Lösungsmitteln gerührt und das Ganze dann filtriert.

Entfernung der Schutzgruppe:

TFA 50%/Methylenchlorid (5 Minuten und 25 Minuten, jeweils 1,8 Liter).
Danach wurde das Harz unter jeweils 2 Minuten langem Rühren 2mal mit jeweils 1,5 Liter Methylenchlorid, Methanol und Chloroform gewaschen mit anschließender Filtration (dieses Waschen wird nachstehend als "Waschoperation II" bezeichnet).

Neutralisation:

1,5 Liter Chloroform + 400 ml TEA 10%/Methylenchlorid (5 Minuten und 15 Minuten). Danach wird die Waschoperation I durchgeführt.

Kupplung

1,5 Liter Methylenchlorid + 56,7 g (0,30 Mol) Boc-Ala + 300 ml 1 M DCC/Methylenchlorid (2 Stunden)
Danach wird die Waschoperation I durchgeführt. Wenn das behandelte Harz dem Ninhydrin-Test unterzogen wurde, war das Ergebnis negativ.

(4) Stufen 3-11

Das gesamte durch das obige Verfahren (3) erhaltene Harz wurde zur Entfernung der Schutzgruppe auf die gleiche Weise wie im obigen Verfahren (3) einer Neutralisation unterzogen und gewaschen mit der Ausnahme, daß die in Tabelle 6 aufgeführten geschützten Aminogruppen der Reihe nach gekuppelt wurden.
In Tabelle 6 steht CH&sub2;Cl&sub2; für Methylenchlorid, DMF für Dimethylformamid und HOBt für 1-Hydroxybenztriazol. Tabelle 6
Nach der Kupplung von Tyrosin in Stufe 11 und dem Waschen wurde das Peptid-Harz aus dem Reaktionsgefäß herausgenommen und getrocknet.

(5) Stufen 12-13

Unter Einsatz von 100 g des nach dem obigen Verfahren (4) erhaltenen Peptid-Harzes wurden Entfernung der Schutzgruppe, Neutralisierung und Waschen in gleicher Weise wie im obigen Verfahren (3) durchgeführt mit der Ausnahme, daß die in der Tabelle 7 aufgeführten geschützten Aminosäuren der Reihe nach gekuppelt wurden, und die Menge Lösungsmittel auf 2/3 der im Verfahren (3) eingesetzten Menge eingestellt wurde. Tabelle 7
Nach der Kupplung von Glutamin in Stufe 13 und dem Waschen wurde das Peptid-Harz aus dem Reaktionsgefäß herausgenommen und getrocknet.

(6) Stufen 14-17

Unter Einsatz von 30 g des nach dem obigen Verfahren (5) erhaltenen Peptid-Harzes wurden Entfernung der Schutzgruppe, Neutralisierung und Waschen in gleicher Weise wie im obigen Verfahren (3) durchgeführt mit der Ausnahme, daß die in der Tabelle 8 aufgeführten geschützten Aminosäuren der Reihe nach gekuppelt wurden, und die Menge Lösungsmittel auf 1/6 der im Verfahren (3) eingesetzten Menge eingestellt wurde. Tabelle 8
Nach der Kupplung von Leucin in Stufe 17 und dem Waschen wurde das Peptid-Harz aus dem Reaktionsgefäß herausgenommen und getrocknet.

(7) Stufen 18-25

Unter Einsatz von 18 g des nach dem obigen Verfahren (6) erhaltenen Peptid-Harzes wurden Entfernung der Schutzgruppe, Neutralisierung und Waschen in gleicher Weise wie im obigen Verfahren (3) durchgeführt mit der Ausnahme, daß die in der Tabelle 9 aufgeführten geschützten Aminosäuren der Reihe nach gekuppelt wurden, und die Menge Lösungsmittel auf 1/6 der im Verfahren (3) eingesetzten Menge eingestellt wurde. Tabelle 9
Nach der Kupplung von Methionin in Stufe 25 und dem Waschen wurde das Peptid-Harz aus dem Reaktionsgefäß herausgenommen und getrocknet.

(8) Stufen 26-32

Unter Einsatz von 11 g des nach dem obigen Verfahren (7) erhaltenen Peptid-Harzes wurden Entfernung der Schutzgruppe, Neutralisierung und Waschen in gleicher Weise wie im obigen Verfahren (3) durchgeführt mit der Ausnahme, daß die in der Tabelle 10 aufgeführten geschützten Aminosäuren der Reihe nach gekuppelt wurden, und die Menge Lösungsmittel auf 1/6 der im Verfahren (3) eingesetzten Menge eingestellt wurde. Tabelle 10
Nach der Kupplung von Cystein in Stufe 32 und dem Waschen wurde das Peptid-Harz aus dem Reaktionsgefäß herausgenommen und getrocknet.

(9) Isolierung des Peptids aus dem Harz und Entfernung der Schutzgruppen

4 g des nach dem obigen Verfahren (8) erhaltenen Peptid-Harzes wurden in ein HF-Reaktionsgefäß gegeben, mit 4 ml Anisol und 1 ml Methylsulfid versetzt, und die Mischung wurde dann gerührt. Das Reaktionsgefäß wurde in einen HF-Reaktionsapparat (Lieferer: Peptide Laboratory) gesetzt und in einem Trockeneis/Aceton-Bad gekühlt; dann wurden etwa 35 ml HF zugegeben.
Danach wurde die Reaktionsmischung zur Durchführung der Reaktion in einem Eiswasserbad 45 Minuten gerührt, und der HF unter Einsatz einer Vakuumpumpe in 15 Minuten durch Destillation entfernt. Die Evakuierung wurde anschließend noch in einem Wasserbad für weitere 15 Minuten fortgesetzt.
Dann wurde Äther zugegeben, die Mischung gründlich gerührt und über ein Glasfilter filtriert. Der Rückstand auf dem Filter wurde mit Äther nachgewaschen (insgesamt wurden etwa 300 ml Äther verbraucht). Das Peptid wurde mit einer 0,1 N Essigsäure (4 · 100 ml) extrahiert.

(10) Cyclisierung

Zu der nach dem Verfahren (9) erhaltenen wäßrigen Essigsäure-Lösung wurden 150 mg Glutathion vom Reduktionstyp und 300 mg Glutathion vom Oxidationstyp gegeben, und zur Mischung soviel 0,1 N Essigsäure hinzugefügt, daß das Gesamtvolumen etwa 800 ml betrug. Danach wurde der pH-Wert mit wäßrigem Ammoniak auf 9,0 eingestellt. Die Mischung wurde 30 Minuten gerührt, und der pH-Wert dann mit Essigsäureanhydrid auf 8,0 eingestellt. Die Mischung wurde über Nacht bei durchperlendem Stickstoff gerührt.

(11) Reinigung

Der pH-Wert der mit dem Verfahren (10) erhaltenen Lösung wurde mit Essigsäureanhydrid auf 5,0 eingestellt, und die Lösung unter Einsatz einer Ultrafiltrationsapparatur aufkonzentriert, die mit einer Ultrafiltrationsmembran mit einem Molekulargewicht von 1000 ausgestattet ist, und dann unter Verwendung einer Ammoniumacetat-Pufferlösung einer Dialyse unterzogen. Die erhaltene Flüssigkeit wurde in einer mit einem Kationenaustauscher-Harz (CM52 von Wattman) gefüllten Säule unter Verwendung einer Ammoniumacetat-Pufferlösung als mobile Phase eluiert, und das Eluat gefriergetrocknet.
Das trockene Produkt wurde durch trennende Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatographie mit Umkehrphase gereinigt. Die verwendete Säule war eine ODP- 90 (Lieferant: Asahi Kasei), die Gradientelution wurde mit einem Phosphatpuffer/Acetonitril-System durchgeführt. Die Fraktion des Hauptpeaks wurde mit der oben erwähnten Ultrafiltrationsapparatur aufkonzentriert. Das Konzentrat wurde in einer mit einem Kationenaustauscher-Harz (SP-Sephadex, Lieferant: Pharmacia) gefüllten Säule unter Verwendung einer wäßrigen Natriumchlorid-Lösung als mobile Phase eluiert, und das Eluat in einer weiteren, mit Sephadex G-25 (Lieferant: Pharmacia) gefüllten Säule unter Verwendung einer wäßrigen Essigsäure-Lösung als mobile Phase noch einmal eluiert. Das Eluat wurde dann gefriergetrocknet.
Die Ergebnisse der Aminosäuren-Analyse des erhaltenen gereinigten Produktes sind nachstehend aufgeführt. Jeder Wert in Klammern ist ein theoretischer Wert.
Die obigen Ergebnisse der Aminosäuren-Analyse erhärten die Schlußfolgerung, daß das nach dem obigen Verfahren erhaltene gereinigte Produkt das Peptid A ist, wie es weiter oben gezeigt wird.

Erläuterndes Beispiel B

(1) Unter Einsatz von 75 g des nach dem Verfahren (4) von Beispiel A erhaltenen Peptid-Harzes wurden Entfernung der Schutzgruppe, Neutralisierung und Waschen in gleicher Weise wie im Verfahren (3) von Beispiel A durchgeführt mit der Ausnahme, daß die in der Tabelle 11 aufgeführten geschützten Aminosäuren der Reihe nach gekuppelt wurden. Die Menge Lösungsmittel wurde auf 2/3 der im Verfahren (3) von Beispiel A eingesetzten Menge eingestellt, und bei den Waschgängen I und II Ethanol anstelle von Methanol verwendet. Tabelle 11
Nach der Kupplung von Leucin in Stufe 24 und dem Waschen wurde das Peptid-Harz aus dem Reaktionsgefäß herausgenommen und getrocknet.
(2) Unter Einsatz von 15 g des nach dem Verfahren (1) erhaltenen Peptid-Harzes wurden die in Tabelle 12 aufgeführten Aminosäuren der Reihe nach gekuppelt. Tabelle 12
Nach der Kupplung von Cystein in Stufe 32 und dem Waschen wurde das Peptid-Harz aus dem Reaktionsgefäß herausgenommen und getrocknet. Danach wurde das Peptid- Harz den Arbeitsgängen des Verfahrens (9) und den daran anschließenden Schritten auf die gleiche Weise unterzogen wie in Beispiel A beschrieben.
Die Ergebnisse der Aminosäuren-Analyse des erhaltenen gereinigten Produktes sind nachstehend aufgeführt. Jeder Wert in Klammern ist ein theoretischer Wert.
Die obigen Ergebnisse der Aminosäuren-Analyse lassen die Schlußfolgerung zu, daß das gereinigte, durch das oben erwähnte Verfahren erhaltene Produkt das oben beschriebene Peptid B ist.

Erläuterndes Beispiel C

Die in Tabelle 13 aufgeführten geschützten Aminosäuren wurden der Reihe nach an 11 g des nach Verfahren (7) von Beispiel A erhaltenen Peptid-Harzes gekuppelt. Danach erfolgten Entfernen der Schutzgruppen, Neutralisierung, Waschen, Trocknen und Isolierung des Peptids in gleicher Weise wie in den Verfahren (8) und (9) von Beispiel A. Der pH-Wert der erhaltenen Lösung wurde auf 9 eingestellt, und die Lösung 30 Minuten gerührt. Anschließend erfolgte die Reinigung in gleicher Weise wie in Verfahren 11 von Beispiel A. Tabelle 13
Die Ergebnisse der Aminosäuren-Analyse des erhaltenen gereinigten Produktes sind nachstehend aufgeführt. Jeder Wert in Klammern ist ein theoretischer Wert.
Die obigen Ergebnisse der Aminosäuren-Analyse lassen die Feststellung zu, daß das gereinigte, nach dem oben erwähnten Verfahren erhaltene Produkt das Peptid C ist mit der oben gezeigten Aminosäuren-Zusammensetzung.

Erläuterndes Beispiel D

(1) Unter Einsatz von 75 g des nach dem Verfahren (4) von Beispiel A erhaltenen Peptid-Harzes wurden die in Tabelle 14 aufgeführten geschützten Aminosäuren der Reihe nach gekuppelt. Tabelle 14
Nach der Kupplung von Leucin in Stufe 21 und dem Waschen wurde das Peptid-Harz aus dem Reaktionsgefäß herausgenommen und getrocknet.
(2) Unter Einsatz von 15 g des nach dem Verfahren (1) erhaltenen Peptid-Harzes wurden die in Tabelle 15 aufgeführten geschützten Aminosäuren der Reihe nach gekuppelt. Tabelle 15
Nach der Kupplung von Alanin in Stufe 32 und dem Waschen wurde das Peptid-Harz aus dem Reaktionsgefäß herausgenommen und getrocknet. Danach wurde das Peptid- Harz in gleicher Weise wie in Beispiel C behandelt.
Die Ergebnisse der Aminosäuren-Analyse des erhaltenen gereinigten Produktes sind nachstehend aufgeführt. Jeder Wert in Klammern ist ein theoretischer Wert.
Die obigen Ergebnisse der Aminosäuren-Analyse lassen die Schlußfolgerung zu, daß das gereinigte, nach dem oben beschriebenen Verfahren erhaltene Produkt das Peptid D ist mit der in Tabelle 1 gezeigten Zusammensetzung der Aminosäuren.

Erläuterndes Beispiel E

Unter Einsatz von 5 g des nach Verfahren (1) im Beispiel B erhaltenen Peptid-Harzes wurden die in Tabelle 16 aufgeführten geschützten Aminosäuren der Reihe nach gekuppelt.
In Tabelle 16 steht Asu(OBut) für L-α-Aminosuberinsäure-ω-tert.-butylester und Opfp für Pentafluorphenylester. Tabelle 16
Nach der Kupplung von Glyzin in Stufe 31 und dem Waschen wurde das Peptid-Harz der Reihe nach in folgenden Lösungsmitteln gerührt und filtriert.
100 ml TEA 75%/Methylenchlorid + 0,5 g Phenol (30 Minuten)
Methylenchlorid, Ethanol und Chloroform (2mal je 75 ml)
10 ml TEA + 65 ml Chloroform
75 ml DMF (2mal)
100 ml Piperidin 20%/DMF (20 Minuten)
Methylenchlorid, Ethanol und Chloroform (2mal je 75 ml)
75 ml von 2 g Bop/DMF (16 Stunden, 3mal)
Nach dem Waschen wurde das Peptid-Harz aus dem Reaktionsgefäß herausgenommen, getrocknet und in gleicher Weise wie in Beispiel C behandelt, um ein gereinigtes Produkt zu erhalten.
Die Ergebnisse der Aminosäuren-Analyse des erhaltenen gereinigten Produktes werden nachstehen aufgeführt. Jeder Wert in Klammern ist ein theoretischer Wert.
Die obigen Ergebnisse der Aminosäuren-Analyse lassen die Schlußfolgerung zu, daß das gereinigte, durch das oben erwähnte Verfahren erhaltene Produkt das Peptid E ist mit der in der Tabelle 1 gezeigten Zusammensetzung der Aminosäuren.

Beispiel 1

Unter Einsatz von 12 g des im Verfahren (1) im Beispiel D erhaltenen Peptid-Harzes werden die in Tabelle 17 aufgeführten geschützten Aminosäuren der Reihe nach angekuppelt. Tabelle 17
Nach der Kupplung von Asparagin in Stufe 31 und dem Wäschen wurde das Peptid-Harz auf die gleiche Weise wie in Beispiel E behandelt, um ein gereinigtes Produkt zu erhalten, mit der Ausnahme, daß 4,3 g Bop in 100 ml 1-Methyl-2-pyrrolidon gelöst und 3 ml DIEA der Lösung zugegeben wurden, und man die Mischung 24 Stunden reagieren ließ.
Die Ergebnisse der Aminosäuren-Analyse des erhaltenen gereinigten Produktes sind nachstehend aufgeführt. Jeder Wert in Klammern ist ein theoretischer Wert.
Die obigen Ergebnisse der Aminosäuren-Analyse lassen die Schlußfolgerung zu, daß das gereinigte, nach dem oben erwähnten Verfahren erhaltene Produkt das Peptid Nr. 1 ist mit der in der Tabelle 1 gezeigten Zusammensetzung der Aminosäuren.

Beispiel 2

Ein gereinigtes Produkt wurde erhalten, wenn man 12 g des im Verfahren (1) im Beispiel D erhaltenen Peptid- Harzes den im Beispiel 1 durchgeführten Arbeitsgängen unterzieht mit der Ausnahme, daß anstelle der Methionin- Kupplung in Stufe 25 im Beispiel 1 die Kupplung von Leucin durchgeführt wurde, wie in Tabelle 18 gezeigt. Tabelle 18
Die Ergebnisse der Aminosäuren-Analyse des erhaltenen gereinigten Produktes sind nachstehend aufgeführt. Jeder Wert in Klammern ist ein theoretischer Wert.
Die obigen Ergebnisse der Aminosäuren-Analyse lassen die Schlußfolgerung zu, daß das gereinigte, nach dem oben erwähnten Verfahren erhaltene Produkt das Peptid Nr. 2 ist mit der in Tabelle 1 gezeigten Zusammensetzung der Aminosäuren.

Beispiel 3

Unter Einsatz von 12 g des im Verfahren (1) im Beispiel 1 erhaltenen Peptid-Harzes werden die in Tabelle 19 aufgeführten geschützten Aminosäuren der Reihe nach angekuppelt. Tabelle 19
Nach der Kupplung der Asparaginsäure in Stufe 31 und dem Waschen wurde das Peptid-Harz der Reihe nach in folgenden Lösungsmitteln gerührt und dann filtriert.
100 ml DMF (2 Minuten, 2mal)
125 ml Piperidin 20%/DMF (20 Minuten)
Methylenchlorid, Ethanol und erneut Methylenchlorid (jeweils 100 ml, 2 Minuten, 2mal)
125 ml von 7,8 g Bop/1-Methyl-2-pyrrolidon + 5 ml DIEA + 2,4 g HOBt (15 Stunden)
Methylenchlorid, Ethanol und erneut Methylenchlorid (jeweils 100 ml, 2 Minuten, 2mal)
100 ml von 3,5 g Bop/1-Methyl-2-pyrrolidon + 3 ml DIEA + 1,2 g HOBt (43 Stunden)
Methylenchlorid, Ethanol und Chloroform (jeweils 100 ml, 2 Minuten, 2mal)
25 ml TEA 10%/100 ml Chloroform (5 Minuten) + 1,7 ml Essigsäureanhydrid (60 Minuten)
Methylenchlorid, Ethanol und erneut Methylenchlorid (jeweils 100 ml, 2 Minuten, 2mal)
125 ml TFA 50%/Methylenchlorid (5 Minuten und 30 Minuten)
Methylenchlorid, Ethanol und Chloroform (jeweils 100 ml, 2 Minuten, 2mal)
25 ml TEA 10%/100 ml Chloroform (5 Minuten und 15 Minuten)
Methylenchlorid, Ethanol und Chloroform (jeweils 100 ml, 2 Minuten, 2mal)
25 ml TEA 10%/100 ml Chloroform (5 Minuten) + 1,7 ml Essigsäureanhydrid (60 Minuten)
Methylenchlorid, Ethanol und erneut Methylenchlorid (jeweils 100 ml, 2 Minuten, 2mal)
Nach dem Waschen wurde das Peptid-Harz aus dem Reaktionsgefäß herausgenommen, getrocknet und in gleicher Weise wie im Beispiel C behandelt, um ein gereinigtes Produkt zu erhalten.
Die Ergebnisse der Aminosäuren-Analyse des erhaltenen gereinigten Produktes sind nachstehend aufgeführt. Jeder Wert in Klammern ist ein theoretischer Wert.
Die obigen Ergebnisse der Aminosäuren-Analyse lassen die Schlußfolgerung zu, daß das gereinigte, nach dem oben erwähnten Verfahren erhaltene Produkt das Peptid Nr. 3 ist mit der in der Tabelle 1 gezeigten Zusammensetzung der Aminosäuren.

Beispiel 4

Unter Einsatz von 12 g des im Verfahren (1) von Beispiel D erhaltenen Peptid-Harzes wurden die in Tabelle 20 aufgeführten geschützten Aminosäuren der Reihe nach angekuppelt. Tabelle 20
Nach der Kupplung von Bernsteinsäureanhydrid in Stufe 31 und dem Waschen wurde das Peptid-Harz der Reihe nach in folgenden Lösungsmitteln gerührt und dann filtriert.
100 ml DMF (2 Minuten, 2mal)
125 ml Piperidin 20%/DMF (20 Minuten)
Methylenchlorid, Ethanol und erneut Methylenchlorid (jeweils 100 ml, 2 Minuten, 2mal)
125 ml von 7,8 g Bop/1-Methyl-2-pyrrolidon + 5 ml DIEA + 2,4 g HOBt (15 Stunden)
Methylenchlorid, Ethanol und erneut Methylenchlorid (jeweils 100 ml, 2 Minuten 2mal)
125 ml von 2,6 g Bop/1-Methyl-2-pyrrolidon + 1,7 ml DIEA + 0,8 mg HOBt (15 Stunden, 2mal)
Nach dem Waschen wurde das Peptid-Harz aus dem Reaktionsgefäß herausgenommen, getrocknet und in gleicher Weise wie in Beispiel C behandelt, um ein gereinigtes Produkt zu erhalten.
Die Ergebnisse der Aminosäuren-Analyse des erhaltenen gereinigten Produktes sind nachstehend aufgeführt. Jeder Wert in Klammern ist ein theoretischer Wert.
Die obigen Ergebnisse der Aminosäuren-Analyse lassen die Schlußfolgerung zu, daß das gereinigte, nach dem oben erwähnten Verfahren erhaltene Produkt das Peptid Nr. 4 ist mit der in der Tabelle 1 gezeigten Zusammensetzung der Aminosäuren.

Beispiel 5

Ein gereinigtes Produkt wurde erhalten, wenn man 12 g des Peptid-Harzes im Verfahren (1) im Beispiel D den Arbeitsgängen wie in Beispiel 1 unterzieht mit der Ausnahme, daß anstelle der Methionin-Kupplung die Kupplung von Leucin, anstelle der Lysin-Kupplung in Stufe 26 die Kupplung von Asparaginsäure, und anstelle der Asparaginsäure-Kupplung in Stufe 31 die Kupplung von Lysin durchgeführt wurde wie in Tabelle 21 dargestellt. Die Kupplung von Threonin und die zweite Kupplung von Asparagin wurden nicht durchgeführt. Tabelle 21
Die Ergebnisse der Aminosäuren-Analyse des erhaltenen gereinigten Produktes sind nachstehend aufgeführt. Jeder Wert in Klammern ist ein theoretischer Wert.
Die obigen Ergebnisse der Aminosäuren-Analyse lassen die Schlußfolgerung zu, daß das gereinigte, nach dem oben erwähnten Verfahren erhaltene Produkt das Peptid Nr. 5 ist mit der in der Tabelle 1 gezeigten Zusammensetzung der Aminosäuren.

Beispiel 6

Unter Einsatz von 13 g des im Verfahren (1) im Beispiel B erhaltenen Peptid-Harzes wurden die in Tabelle 22 aufgeführten geschützten Aminosäuren der Reihe nach angekuppelt.
In der Tabelle 22 steht Orn für Ornithin. Tabelle 22
Nach der Kupplung von Glutaminsäure in Stufe 31 und dem Waschen wurde das Peptid-Harz wie in Beispiel 4 behandelt.
Die Ergebnisse der Aminosäuren-Analyse des erhaltenen gereinigten Produktes sind nachstehend aufgeführt. Jeder Wert in Klammern ist ein theoretischer Wert.
Die obigen Ergebnisse der Aminosäuren-Analyse lassen die Schlußfolgerung zu, daß das gereinigte, nach dem oben erwähnten Verfahren erhaltene Produkt das Peptid Nr. 6 ist mit der in der Tabelle 1 gezeigten Zusammensetzung der Aminosäuren.

Beispiel 7

Ein gereinigtes Produkt wurde erhalten, wenn 13 g des nach Verfahren 1 im Beispiel B erhaltenen Peptid- Harzes den Arbeitsgängen im Beispiel 6 unterzogen wurden mit der Ausnahme, daß anstelle der Ornithin-Kupplung in Stufe 26 die Kupplung von Glutaminsäure, und anstelle der Glutaminsäure-Kupplung in Stufe 31 die Kupplung von Ornithin durchgeführt wurde, wie in Tabelle 23 dargestellt. Tabelle 23
Die Ergebnisse der Aminosäuren-Analyse des erhaltenen gereinigten Produktes sind nachstehend aufgeführt. Jeder Wert in Klammern ist ein theoretischer Wert.
Die obigen Ergebnisse der Aminosäuren-Analyse lassen die Schlußfolgerung zu, daß das gereinigte, nach dem oben erwähnten Verfahren erhaltene Produkt das Peptid Nr. 7 ist mit der in der Tabelle 1 gezeigten Zusammensetzung der Aminosäuren.

Beispiel 8

(1) Unter Einsatz von 20 g des im Verfahren (4) im Beispiel A erhaltenen Peptid-Harzes werden die in Tabelle 24 aufgeführten geschützten Aminosäuren der Reihe nach angekuppelt. Tabelle 24
Nach der Kupplung von Leucin in Stufe 24 und dem Waschen wurde das Peptid-Harz aus dem Reaktionsgefäß herausgenommen und getrocknet.
(2) Unter Einsatz von 15 g des nach Verfahren (1) erhaltenen Peptid-Harzes wurden die in Tabelle 25 aufgeführten geschützten Aminosäuren der Reihe nach angekuppelt; und das Peptid-Harz wurde auf die gleiche Weise wie im Beispiel 4 behandelt, um eine gereinigtes Produkt zu erhalten. Tabelle 25
Die Ergebnisse der Aminosäuren-Analyse des erhaltenen gereinigten Produktes sind nachstehend aufgeführt. Jeder Wert in Klammern ist ein theoretischer Wert.
Die obigen Ergebnisse der Aminosäuren-Analyse lassen die Schlußfolgerung zu, daß das gereinigte, durch das oben erwähnte Verfahren erhaltene Produkt das Peptid Nr. 8 ist mit der in der Tabelle 1 gezeigten Zusammensetzung der Aminosäuren.

Beispiel 9

Unter Einsatz von 15 g des im Verfahren (1) im Beispiel 8 erhaltenen Peptid-Harzes wurden die in Tabelle 26 aufgeführten geschützten Aminosäuren der Reihe nach angekuppelt; und das Peptid-Harz wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 4 behandelt, um ein gereinigtes Produkt zu erhalten. Tabelle 26
Die Ergebnisse der Aminosäuren-Analyse des erhaltenen gereinigten Produktes sind nachstehend aufgeführt. Jeder Wert in Klammern ist ein theoretischer Wert.
Die obigen Ergebnisse der Aminosäuren-Analyse lassen die Schlußfolgerung zu, daß das gereinigte, nach dem oben erwähnten Verfahren erhaltene Produkt das Peptid Nr. 9 ist mit der in der Tabelle 1 gezeigten Zusammensetzung der Aminosäuren.

Beispiel 10

Unter Einsatz von 16 g des im Verfahren (4) im Beispiel A erhaltenen Peptid-Harzes wurden die in Tabelle 27 aufgeführten geschützten Aminosäuren der Reihe nach angekuppelt. Tabelle 27
Nach der Kupplung von Bernsteinsäureanhydrid in Stufe 31 und dem Waschen wurde das Peptid-Harz in gleicher Weise wie in Beispiel 4 behandelt.
Die Ergebnisse der Aminosäuren-Analyse des erhaltenen gereinigten Produktes sind nachstehend aufgeführt. Jeder Wert in Klammern ist ein theoretischer Wert.
Die obigen Ergebnisse der Aminosäuren-Analyse lassen die Schlußfolgerung zu, daß das gereinigte, nach dem oben erwähnten Verfahren erhaltene Produkt das Peptid Nr. 10 ist mit der in der Tabelle 1 gezeigten Zusammensetzung der Aminosäuren.

Erläuterndes Beispiel F

Im Rahmen eines üblichen Injektionsvorbereitungs- Prozesses wurde mit dem im Beispiel A erhaltenen Peptid, destilliertem Wasser für Injektionszwecke, Natriumchlorid und Gelatine eine Injektion vorbereitet.

Claims

1. Neues physiologisch aktives Peptid mit einer der folgenden Sequenzen 1-10:

2. Peptid nach Anspruch 1, welches Peptid Nr. 2 ist.

3. Peptid nach Anspruch 1, welches Peptid Nr. 3 ist.

4. Peptid nach Anspruch 1, welches Peptid Nr. 4 ist.

5. Peptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Verwendung in der Regulierung des Calciumstoffwechsels.

6. Pharmazeutisches Mittel, das ein Peptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche zusammen mit einem pharmazeutischen Träger enthält.

7. Mittel zur Regulierung des Calciumstoffwechsels, das als Wirkstoff ein neues physiologisch aktives Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält.

8. Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 bei der Herstellung eines Mittels zur Verwendung in der therapeutischen Regulierung des Calciumstoffwechsels.

9. Verfahren zur Herstellung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Peptid an einer festen oder in einer flüssigen Phase hergestellt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin ein Festphasenverfahren verwendet wird, bei dem geeignete L-Aminosäuren sequenzweise vom C-terminalen Ende des gewünschten Peptids an einen Harz gebunden wird, das in organischen Lösungsmitteln unlöslich ist, eine Säurebehandlung durchgeführt und das gewünschte Peptid gewonnen wird.