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CH550774A - Verfahren zur herstellung neuer hypocalcaemischer peptide. - Google Patents

Verfahren zur herstellung neuer hypocalcaemischer peptide.

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Publication number
CH550774A
CH550774A CH1540168A CH1540168A CH550774A CH 550774 A CH550774 A CH 550774A CH 1540168 A CH1540168 A CH 1540168A CH 1540168 A CH1540168 A CH 1540168A CH 550774 A CH550774 A CH 550774A
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CH1540168A
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Ciba Geigy Ag
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Publication date
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Description


  
 



   Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung neuer hypocalcämisch wirksamer Peptide der Formel I
EMI1.1     
 X-Leu-Gly-Thr-Tyr   Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr- Ala-Ile-Gly-val-Gly-Ala-pro-NH2    worin R für Wasserstoff, einen freien oder acylierten Aminorest und X für den Valin-, Norvalin-, Leucin-, Isoleucin-, Norleucin- oder a-Aminobuttersäurerest steht und entsprechender Verbindungen, in welchen einer oder mehrere der Asparagin- und Glutaminreste durch den Apsaraginsäurebzw. Glutaminsäurerest und/oder der Asparaginsäurerest durch den Apsaraginrest ersetzt sind, sowie der Säureadditionssalze und Komplexe der genannten Peptide.



   Als Säureadditionssalze sind besonders Salze von therapeutisch anwendbaren Säuren wie Salzsäure, Essigsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und Sulfonsäuren, wie Niederalkansulfonsäuren, Benzol- oder Toluolsulfonsäure zu nennen.



   Acylgruppen für die Acylierung der   Na-Aminogruppe    sind die Reste von Carbonsäuren, wie aliphatischen, aromatischen, araliphatischen, heterocyclischen und heterocyclylaliphatischen Carbonsäuren, insbesondere von niederen Alkansäuren wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Buttersäuren, von monocyclischen aromatischen Carbonsäuren wie unsubstituierter und substituierter Benzoesäure, von unsubstituierten und arylsubstituierten Aryl-niederalkylcarbonsäuren wie Phenylessigsäure, von 5- bis 6gliedrigen heterocyclischen Säuren mit Stickstoff, Schwefel und/ oder Sauerstoff als Heteroatomen, wie Pyridincarbonsäuren, Thiophencarbonsäuren, oder von Heterocyclyl-niederalkansäuren wie Pyridylessigsäure, Imidazolylessigsäure, worin die Substituenten der Ringe z. B. Halogenatome, Nitrogruppen, Niederalkyl- oder Niederalkoxygruppen oder Niedercarbalkoxygruppen sind.

  Weiter sind als Acylreste vor allem Acylreste von Aminosäuren, besonders a-Aminosäuren, wie z. B. der Pyroglutamylrest zu nennen, ferner Acylreste, die sich von Kohlensäure oder Thiokohlensäure bzw. ihren Estern oder Amiden ableiten, z. B. Niederalkyloxycarbonylgruppen wie Äthoxycarbonyl, tert.-Butyloxycarbonyl, ferner unsbustituiertes und wie oben angegeben substituiertes Benzyloxycarbonyl, Carbamoyl und Thiocarbamoyl sowie   N-substituiertes    Carbamoyl und Thiocarbamoyl, z. B.



  N-Niederalkylcarbamoyl, N-Phenylcarbamoyl, N-Phenylthiocarbamoyl.



   Unter Komplexen sind die in ihrer Struktur noch nicht abgeklärten Verbindungen zu verstehen, die beim Zusatz gewisser anorganischer oder organischer Stoffe zu langkettigen Peptiden entstehen und diesen eine verlängerte Wirkung verleihen. Solche Stoffe sind beispielsweise beschrieben für ACTH und andere adrenocorticotrop wirksame Peptide. Zu nennen sind z. B. anorganische Verbindungen, die sich von Metallen wie Calcium, Magnesium, Aluminium, Cobalt und insbesondere von Zink ableiten, vor allem schwerlösliche Salze wie Phosphate, Pyrophosphate und Polyphosphate sowie Hydroxyde dieser Metalle, ferner Alkalimetallpolyphosphate wie z. B.  Calgon N ,  Calgon 322 ,  Calgon 188  oder  Polyron B 12 . Organische Stoffe, die eine Verlängerung der Wirkung hervorrufen, sind beispielsweise nichtantigene Gelatine, z. B.

  Polyoxygelatine, Polyvinylpyrrolidon und Carhoxymethylcellulose, ferner Sulfonsäure- oder Phosphorsäureester von Alginsäure, Dextran, Polyphenolen und Polyalkoholen, vor allem Polyphloretinphosphat und Phytinsäure, sowie Polymerisate und Copolymerisate von Aminosäuren, z. B. Protamin oder Polyglutaminsäure.



   Die neuen Verbindungen weisen eine hypocalcämische Wirkung auf. Sie senken den Plasma-, Calcium- und Phosphatgehalt des Blutes von Säugetieren, wie durch Versuche an Wistar-Ratten nachgewiesen wurde.



   Die Verbindungen senken auch am Menschen den Plasma-Calciumspiegel des Blutes bei intravenöser Gabe von 0,01 bis 5 mg in 0,1m Acetatpuffer vom pH 4,6 und können dementsprechend bei Hypercalcämie verwendet werden.



   Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung der neuen Verbindungen der Formel I und entsprechender Verbindungen, in welchen einer oder mehrere der Asparaginund Glutaminreste durch den Asparaginsäure- bzw. Glutaminsäurerest und/oder der Asparaginsäurerest durch den Asparaginrest ersetzt sind, oder ihrer Säureadditionssalze, dadurch gekennzeichnet. dass man in beliebiger zeitlicher Reihenfolge die entsprechenden Säuren bzw. deren aktivierten Derivate unter intermediären Schutz von der Reaktion auszuschliessenden reaktiven funktionellen Gruppen und unter Bildung der Disulfidbrücke aus den beiden Mercaptogruppen durch Oxydation, kondensiert und die endständige Carboxylgruppe amidiert. Die erhaltenen Verbindungen können in ihre Säureadditionssalze oder Komplexe überführt werden.



   Bei der Synthese der Endprodukte wie auch aller Zwischenprodukte verwendet man als Schutzgruppen besonders die von der Synthese langkettiger Peptide her bekannten sowie einige neue Schutzgruppen, die leicht abgespalten werden können, z. B. durch Hydrolyse, Reduktion, Aminolyse oder Hydrazinolyse.



   So verwendet man z. B. als Schutzgruppen für Aminogruppen Acyl- oder Aralkylgruppen wie Formyl-, Trifluoracetyl-, Phthaloyl-, Benzolsulfonyl-, p-Tolueolsulfonyl-, o-Nitrophenylsulfenyl-,   2 ,4-Dinitrophenylsulfenylgruppen    (diese Sulfenylgruppen können auch durch Einwirkung nucleophiler Reagenzien, z. B. Sulfiten. Thiosulfaten, vgl.



  englisches Patent   1104    271, abgespalten werden) gegebenenfalls substituierte, wie z. B. durch Niederalkoxygruppen, besonders o- oder p-Methoxygruppen substituierte Benzyl-, oder Diphenyl- oder Triphenylmethylgruppen oder von der Kohlensäure sich ableitende Gruppen wie gegebenenfalls, z. B. durch Halogenatome wie Chlor oder Brom, Nitrogruppen oder Niederalkoxygruppen substituierte Benzyl- oder   B enzhydryloxycarbonylgruppen,    z. B.

  Carbobenzoxy, p-Brom- oder   p-Chlorcarbobenzoxy.    p-Nitrocarbobenzoxy oder p-Methoxycarbobenzoxy, farbige Benzyloxycarbonylgruppen wie p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl und p-(p'   Methoxy-phenylazo)-benzyloxycarbonyl    aliphatische Oxycarbonylgruppen wie Adamantyloxycarbonyl, Cyclopentyloxycarbonyl,   Trichloräthyloxycarbonyk    tert.-Amyloxycarbonyl oder vor allem tert.-Butyloxycarbonyl, aromatischaliphatische Oxycarbonylgruppen wie   2-Phenyl-isopropyl-    oxycarbonyl, 2-Tolyl-isopropyloxycarbonyl und insbesondere 2-p-Diphenyl-isopropyloxycarbonyl (vgl. Schweizer Patent Nr. 509 266). Die Aminogruppen können auch durch Bildung von Enaminen. erhalten durch Reaktion der Aminogruppe mit 1.3-Diketonen. z. B. Benzoylaceton, Acetylaceton oder Dimedon, geschützt werden.

 

   Carboxylgruppen werden beispielsweise durch Amidoder Hydrazidbildung oder durch Veresterung geschützt.



  Die Amid- und Hydrazidgruppen können gegebenenfalls substituiert sein, die Amidgruppe z. B. durch die 3,4-Dimethoxybenzyl- oder   bis-(p-Methoxyphenyl)-methylgruppe.   



  die Hydrazidgruppe z. B. durch die Carbobenzoxygruppe, die   Trichloräthyloxycarbonylgruppe,    die Trifluoracetylgruppe, die Tritylgruppe, die tert.-Butyloxycarbonylgruppe oder die 2-p-Diphenyl-isopropyloxycarbonylgruppe. Zur Veresterung geeignet sind z. B. niedere gegebenenfalls substituierte Alkanole wie Methanol, Äthanol, Cyanmethyl  alkohol, Benzoylmethylalkohol oder insbesondere tert. Butanol, ferner Aralkanole wie Arylniederalkanole, z. B.



  gegebenenfalls durch Niederalkyl- oder Niederalkoxygruppen oder Halogenatome substituierte Benzyl- oder Benzhydrylalkohole wie p-Nitrobenzylalkohol, p-Methoxybenzylalkohol oder   2,4,6-Trimethylbenzylalkohol,    gegebenenfalls durch elektronenanziehende Substituenten substituierte Phenole und Thiophenole wie Thiophenol, Thiokresol, p-Nitrothiophenol, 2,4,5- und 2,4,6-Trichlorphenol, Pentachlorphenol, p-Nitrophenol, 2,4-Dinitrophenol, p-Cyanophenol, oder p-Methansulfonylphenol, weiter z. B. N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxyphthalimid,   N-Hydroxypiperidin, 8 -Hydroxychinolin.   



   Die Hydroxygruppen der Serin-, Threonin- und Tyrosinreste können z. B. durch Veresterung oder Verätherung geschützt werden. Als Acylreste bei der Veresterung sind z. B.



  Niederalkanoylreste wie Acetyl, Aroylreste wie Benzoyl und vor allem von der Kohlensäure sich ableitende Reste wie Benzyloxycarbonyl oder Äthyloxycarbonyl geeignet. Zur Verätherung geeignete Gruppen sind z. B. Benzyl-, Tetrahydropyranyl- oder   tert.-Butylreste.    Ferner eignen sich zum Schutz der Hydroxylgruppen die in Ber. 100 (1967), 3838-3849 beschriebenen   2,2,2-Trifluor- 1-tert.-butyloxy-    carbonylamino-   oder -l-benzyloxycarbonylaminoäthylgrup-    pen (Weygand). Die Hydroxylgruppen brauchen aber nicht notwendig geschützt zu werden.



   Die Mercaptogruppen der Cysteinreste werden z. B.



  durch Acylierung oder Alkylierung geschützt. Zur Acylierung geeignet ist z. B. der Acetyl- oder Benzoylrest, der Äthylcarbamoylrest oder der gegebenenfalls substituierte Carbobenzoxyrest. Zur Alkylierung geeignet sind z. B. der tert. Butyl- oder Benzylthiomethylrest oder gegebenenfalls substituierte Arylmethylgruppen wie Benzyl, p-Nitrobenzyl, Diphenylmethyl, Dimethoxybenzhydryl oder Trityl, ferner Phenylcyclohexyl, Thienyl(2)-cyclohexyl u. a., vgl. Ber. 101 (1968), 681. Die Iminogruppe des Histidins braucht nicht unbedingt geschützt zu werden, jedoch kann es vorteilhaft sein, sie zu schützen, z. B. durch Benzyl, Trityl, Carbobenzoxy, Adamantyloxycarbonyl oder die oben genannten Weygandschen Gruppen.



   Vorzugsweise verwendet man zum Schutz der Carboxylgruppe der Seitenkette die tert.-Butylestergruppe, zum Schutz der Aminogruppe der Seitenkette die tert.-Butyloxycarbonylgruppe, für die Hydroxylgruppen der Serin-, Threonin- und Tyrosinreste, sofern diese überhaupt geschützt werden, die tert.-Butyläthergruppe und, wenn erwünscht, zum Schutz der Iminogruppe des Histidins die 2,2,2-Tri   fluor-1-tert.-butyloxycarbonylaminoäthylgruppe.    Alle diese Schutzgruppen können, wenn erwünscht, in einer Stufe durch saure Hydrolyse, z. B. mittels Trifluoressigsäure, abgespalten werden. Beim Aufbau des als Ausgangsmaterial verwendeten geschützten Dotriacontapeptidamids unter Verwendung von mit Trifluoressigsäure abspaltbaren Schutzgruppen werden die Mercaptogruppen vorzugsweise durch Benzyl oder Trityl geschützt.

  Die S-Tritylgruppen können aus dem geschützten Peptid in organischer Lösung selektiv (unter Beibehaltung der mit Trifluoressigsäure abspaltbaren Gruppen) mit Mercuriacetat und Schwefelwasserstoff abgespalten werden. Die S-Benzylgruppen können aus dem geschützten Peptid selektiv mit Natrium in flüssigem Ammoniak abgespalten werden. In beiden Fällen erhält man das geschützte Peptid mit freien Mercaptogruppen. Dieses kann zum geschützten Disulfid, z. B. mit Jod in Eisessig, mit Dijodäthan in organischen Lösungsmitteln, mit Luftsauerstoff in flüssigem Ammoniak oxydiert werden. Besonders vorteilhaft ist es, die Mercaptogruppen durch Tritylgruppen zu schützen und diese aus dem geschützten Peptid unter gleichzeitiger Bildung der Disulfidbrücke mit Jod in Methanol zu entfernen, vgl. Schweizer Patent Nr. 498 805.

  Diese Bildung des Disulfidringes kann auf der Stufe einer die beiden Cysteinreste enthaltenden Teilsequenz, z. B. des Decapeptids 1-10, oder auf der Stufe des Dotriacontapeptids ausgeführt werden.



   Bei der Herstellung der Na-Acylderivate kann die Acylgruppe als a-Aminoschutzgruppe verwendet werden.



   Die erhaltenen freien Peptide können in an sich bekannter Weise nachträglich in   jre    Säureadditionssalze, Derivate oder Komplexe oder   Na-Acylderivate    übergeführt werden.



   So kann man zwecks Herstellung von Na-Acylderivaten das Peptid mit freier a-Aminogruppe in üblicher Weise N-acylieren, z. B. durch Umsetzung mit einem den betreffenden Acylrest enthaltenden gemischten Anhydrid oder Säureazid oder vor allem einem aktivierten Ester wie Phenyl- oder substituierten Phenylester.



   Komplexe mit anorganischen Stoffen wie schwerlöslichen Metall-, z. B. Aluminium- oder Zinkverbindungen werden in analoger Weise wie für ACTH bekannt, z. B. durch Umsetzung mit einem löslichen Salz des betreffenden Metalls, z. B.



  Zinkchlorid oder Zinksulfat, und Ausfällung mit einem Alkalimetallphosphat und/oder -hydroxyd hergestellt. Komplexe mit organischen Verbindungen wie Polyoxygelatine, Carboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Polyphloretinphosphat, Polyglutaminsäure usw. werden durch Mischen dieser Substanzen mit dem Peptid in wässeriger Lösung erhalten. In gleicher Weise können auch unlösliche Verbindungen mit Alkalimetallpolyphosphaten hergestellt werden.



   Erfindungsgemäss werden die Aminosäuren, wenn erforderlich oder erwünscht unter Verwendung leicht abspaltbarer Schutzgruppen, in der erwähnten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten verknüpft, wobei auf einer geeigneten Stufe der Synthese die Disulfidbrücke gebildet wird. Man arbeitet zweckmässig nach den für die Herstellung langkettiger Peptide, unter Berücksichtigung der Disulfid-Brücke. geeigneten Verknüpfungsmethoden, wie sie aus der Literatur bekannt sind.



   Die Verknüpfung der Aminosäure- und/oder Peptideinheiten erfolgt daher z. B. in der Weise, dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit geschützter a-Aminogruppe und aktivierter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier a-Aminogruppe und freier oder geschützter, z. B. veresterter oder amidierter terminaler Carboxylgruppe umsetzt oder dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit aktivierter a-Aminogruppe und geschützter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier terminaler Carboxylgruppe und geschützter a-Aminogruppe umsetzt.



  Die Carboxylgruppe kann beispielsweise durch Überführung in ein Säureazid, -anhydrid, -imidazolid oder einen aktivierten Ester, wie Cyanmethylester, Thiophenylester, p-Nitrothiophenylester, Thiokresylester, p-Methansulfonylphenylester, p-Nitrophenylester, 2,4-Dinitrophenylester,2,4,5- oder 2,4,6-Trichlorphenylester, Pentachlorphenylester, N-Hydroxysuccinimidester,   N-Hydroxyphthalimidester, 8-Hydroxy-    chinolinester,   N-FIydroxypiperidinester,    oder durch Reaktion mittels eines Carbodiimids (gegebenenfalls unter Zusatz von N-Hydroxysuccinimid) oder N,N'-Carbonyldiimidazols, oder Isoxazoliumsalzes, z. B. Woodward Reagens, die Aminogruppe beispielsweise durch Reaktion mit einem Phosphit aktiviert werden. 

  Als gebräuchlichste Methoden sind zu nennen die Carbodiimidmethode, die Methode nach Weygand Wünsch (Carbodiimid in Gegenwart von N-Hydroxysuccinimid), die Azidmethode, die Methode der aktivierten Ester und die Anhydridmethode, ferner die Merrifield-Methode und die Methode der N-Carboxyanhydride oder N-Thiocarboxyanhydride.



   Auch die Herstellung der Ausgangsstoffe, vor allem des die Disulfidbrücke enthaltenden Peptidbruchstückes und  dessen Verknüpfung mit dem restlichen Teil des Peptids stellt einen besonderen Erfindungsgegenstand dar. Vorteilhaft ist es, von einer Sequenz auszugehen, welche die ersten 10 N-terminalen Aminosäuren umfasst, und mit diesem N-Terminus die gesamte restliche Sequenz zu kondensieren.



   Man kann aber auch die genannte N-terminale Sequenz mit dem Fragment bis zur 28. Aminosäure (Glycin) mit freier C-terminaler Carboxylgruppe verknüpfen und das Octacosapeptid mit dem Tetrapeptid der Aminosäuren   2W32    kondensieren. Diese Kondensation wird beispielsweise nach der Weygand-Wünsch-Methode durchgeführt.



  Falls die Kondensation der Sequenz 1-10 mit der C-terminalen Sequenz 11-32 ausgeführt wird, verwendet man vorzugsweise die Carbodiimidmethode oder die Methode nach Weygand-Wünsch. Im   folgenden    wird die Herstellung des N-terminalen   Decapeptids (1-10)    näher erläutert.



   Es kann z. B. aus den Sequenzen 1-4 und 5-10 oder 1-5 und   910    oder 16 und 7-10 oder 1-7 und 8-10 aufgebaut werden, wie aus den Fig. 1-8 ersichtlich; man kann jedoch auch andere Bruchstücke zum Aufbau der Sequenz 1-10 verwenden. Als Schutzgruppe für die a-Aminogruppe am Cystein wird vorzugsweise die tert.-Butyloxycarbonylgruppe oder eine äquivalente, durch saure Hydrolyse abspaltbare Gruppe verwendet, oder wenn ein Na-acyliertes Dotriacontapeptid hergestellt werden soll, die entsprechende Acyl- z. B. Acetylgruppe. Daneben verwendet man zweckmässig als Mercaptoschutzgruppen solche, die selektiv gegen über der durch saure Hydrolyse abspaltbaren   N"-Amino-    schutzgruppe (z. B. tert.-Butyloxycarbonylgruppe) abgespalten werden können, z. B. die Benzyl- oder Tritylgruppe.

  Die terminale Carboxylgruppe des Decapeptids braucht nicht notwendig geschützt zu werden, z. B. nicht, wenn Kondensationen nach der Azid- oder Anhydridmethode ausgeführt werden. Man kann diese Gruppe aber auch durch Veresterung, wie oben angegeben, schützen, z. B. durch Veresterung mit Methanol oder Äthanol (Abspaltung der Estergruppe mit verdünnter Natronlauge) oder mit Benzylalkohol oder Analogen (Abspaltung der Estergruppe z. B. mit Natrium in flüssigem Ammoniak). Der Schutz der Aminogruppen der Zwischenprodukte erfolgt mittels der üblichen Schutzgruppen, z. B. Carbobenzoxy, Trityl, tert.-Butyloxycarbonyl oder 2-para-Diphenyl-isopropyloxycarbonyl. Die Carboxylgruppen der Zwischenprodukte werden, wenn erforderlich, in der üblichen Weise verestert. Die Hydroxygruppen des Serinund Threoninrestes können durch Verätherung, z. B. mit tert.-Butanol oder Äquivalenten geschützt werden.



   In den folgenden Figuren und in den Beispielen bedeutet: 1) die Azidmethode 2) die Methode der gemischten Anhydride 3) die Methode der aktivierten Ester, besonders p-Nitro phenylester (ONP) oder Hydroxysuccinimidester (OSU) 4) die Carbodiimidmethode 5) die Methode nach Weygand-Wünsch BOC tert.-Butyloxycarbonyl DPC p-Diphenyl-isopropyloxycarbonyl Z Carbobenzoxy TRI Trityl Bzl Benzyl OtBu tert.-Butylester OBzl Benzylester ONB p-Nitrobenzylester ONP p-Nitrophenylester OMe Methylester OEt Äthylester tBu tert.-Butyläther Ac Acetyl TFA Trifluoressigsäure
Die p-Nitrobenzylester- und Benzylestergruppen werden in Methionin-haltigen Sequenzen mit Natrium in flüssigem Ammoniak, sonst durch Hydrogenolyse in Gegenwart von Palladiumkohle abgespalten, die Carbobenzoxygruppe ebenfalls durch Hydrogenolyse, die N-Tritylgruppe mit wässeriger Essigsäure,

   die tert.-Butyloxycarbonylgruppe mit Trifluoressigsäure, die Diphenylisopropyloxycarbonylgruppe mit wässeriger Essigsäure oder z. B. mit einem Gemisch von Eisessig, Ameisensäure (82,8%ig) und Wasser   (7:1:2)    wie im Schweizer Patent Nr. 509 266 beschrieben. Der p-Nitrobenzyl- oder Methylester kann mit Hydrazinhydrat in das Hydrazid übergeführt werden. Mit verdünnter Natronlauge wird die Methylestergruppe hydrolysiert. Der tert.-Butylester wird mit Trifluoressigsäure gespalten, ebenso der tert. Butyläther. Die S-Tritylgruppen werden mit Mercuriacetat und Schwefelwasserstoff entfernt, die S-Benzylgruppe mit Natrium in flüssigem Ammoniak, wobei gegebenenfalls vorhandene Benzyl- oder p-Nitrobenzylestergruppen gleichzeitig abgespalten werden. Der Ringschluss zum Disulfid erfolgt z.

  B. durch Oxydation mit 1,2-Dijodäthan, derjenige der S-Trityl-geschützten Verbindungen mit Jod in Methanol.



   Die mit der N-terminalen Sequenz zu verbindende C-terminale Sequenz umfassend die 11. bis 32. bzw. 11. bis 28. Aminosäure wird beispielsweise aus den Sequenzen 11-16, 17-20, 21-28 und 29-32 zusammengesetzt, wie Fig. 9 zeigt.



   In diesem Schema sind die Hydroxylgruppen der Threoninreste und des Tyrosinrestes geschützt, dies ist nichtunbedingt erforderlich. Es können auch andere Teilsequenzen miteinander vereinigt und andere Schutzgruppen verwendet werden.



   Fig. 10 zeigt den Aufbau des Hexapeptids (in Form des Hydrazids) der Aminosäuren 11-16. Es kann nach der Azidmethode mit der Sequenz 17-28 oder 17-32 verknüpft werden.



   Die Sequenz 17-28 kann nach der Azidmethode aus den Fragmenten 17-20 und 21-28 aufgebaut werden.



   Fig. 11 zeigt die Synthese des Tetrapeptidhydrazids der Aminosäuren 17-20, Fig. 12 den Aufbau des Octapeptids 21-28. Nach der Verknüpfung der beiden Sequenzen wird die a-Aminoschutzgruppe abgespalten (die Carbobenzoxygruppe durch Hydrogenolyse in Gegenwart von Palladiumkohle) und das so erhaltene Dodecapeptid mit geschützten Seitenketten nach der Azidmethode mit dem Hexapeptidhydrazid 11-16 (Fig. 10) kondensiert.



   Die so erhaltene Sequenz 11-28 kann mit dem Tetrapeptidamid der Aminosäuren 29-32, dessen Herstellung Fig. 13 zeigt, verbunden werden, z. B. nach der Methode von Weygand-Wünsch. Man erhält dann das geschützte Docosapeptidamid 11-32. Aus diesem kann man die a-Aminoschutzgruppe abspalten (Carbobenzoxy z. B. hydrogenolytisch, DPC mit   90%iger    Essigsäure oder Eisessig-Ameisensäure [82,8 %ige] - Wasser   [7: 1 :21)    und die so erhaltene Verbindung mit freier a-Aminogruppe nach Entfernung der Essigsäure mit dem N-terminalen Decapeptid (Fig. 1-8) verknüpfen, beispielsweise nach der Methode der gemischten Anhydride, der aktivierten Ester (OSU) oder nach Weygand-Wünsch.

 

   Man kann aber auch die Sequenz 11-28 mit freier C-terminaler Carboxylgruppe nach Abspaltung der a-Aminoschutzgruppe in der genannten Weise, mit dem N-terminalen Decapeptid nach der Methode der gemischten Anhydride verknüpfen und das so erhaltene Produkt mit dem Tetrapeptidamid 29-32 kondensieren, z. B. nach Weygand Wünsch.



   Eine weitere Möglichkeit, die C-terminale Sequenz   1132    aufzubauen, besteht z. B. darin, dass man sie aus den Teilsequenzen 11-19 und 20-32, die in Fig. 14 und 15 gezeigt  sind, zusammensetzt, vorzugsweise nach der Methode der gemischten Anhydride oder nach Weygand-Wünsch.



   Nach dem Schema von Fig. 15 kann auch die C-terminale Sequenz mit freier Carboxylgruppe hergestellt werden. In diesem Fall wird z. B. die an Aminosäure 32 vorhandene tert.-Butylestergruppe nicht abgespalten und in die Amidgruppe übergeführt, sondern bis zu Stufe J beibehalten. Die Kondensation der Sequenz 20-32 mit C-terminaler freier Carboxylgruppe mit der Sequenz 11-19 von Fig. 14 erfolgt z. B. nach der Methode der gemischten Anhydride, ebenso die Verknüpfung der so erhaltenen Sequenz 11-32 mit der N-terminalen Sequenz 1-10.



   Aus dem geschützten Dotriacontapeptidamid werden die Schutzgruppen abgespalten, beispielsweise mit Trifluoressigsäure, oder mit   korzentriener    Salzsäure.



   Das für das Verfahren gemäss Variante 2) oder 3) zu verwendende Dotriacontapeptid mit freien bzw. Tritylgeschützten SH-Gruppen kann in analoger Weise wie das oben beschriebene geschützte Dotriacontapeptid hergestellt werden, mit dem Unterschied, dass die geschützten SH Gruppen bis zum Schluss der Synthese beibehalten werden.



  Erst nachdem alle übrigen Schutzgruppen aus dem geschützten Dotriacontapeptid entfernt worden sind, spaltet man die SH-Schutzgruppen bzw. oxydiert die Trityl-geschützte Verbindung direkt wie oben erwähnt.



   Je nach der Arbeitsweise erhält man die neuen Verbindungen in Form von Basen oder ihren Salzen. Aus den Salzen können in an sich bekannter Weise die Basen gewonnen werden. Von letzteren wiederum lassen sich durch Umsetzung mit Säuren, die zur Bildung therapeutisch verwendbarer Salze geeignet sind, Salze gewinnen, wie z.

  B. solche mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, beispielsweise Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure, Salpetersäure oder Thiocyansäure, Schwefel- oder Phosphorsäuren, oder organischen Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Ascorbinsäure, Hydroxymaleinsäure, Dihydroxymaleinsäure, Benzoesäure,   Phenylessigsäure, 4-Aminoben-    zoesäure, 4-Hydroxybenzoesäure, Anthranilsäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Salicylsäure,   4-Aminosalicylsäure, 2-Phenoxy-    benzoesäure, 2-Acetoxybenzoesäure, Methansulfonsäure, Äthansulfonsäure, Hydroxyäthansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure oder Sulfanilsäure.



   Die verfahrensgemäss erhaltenen Peptide können in Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden. Diese enthalten die Peptide in Mischung mit einem für die enterale oder parenterale Applikation geeigneten pharmazeutischen, organischen oder anorganischen Trägermaterial.



   Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.



   In der Dünnschichtchromatographie werden die folgenden Systeme verwendet: System 45: sec.-Butanol-3 %iges wässeriges Ammoniak  (70:30) System 52: n-Butanol-Eisessig-Wasser   (75:7,5:21)    System 79: n-Butanol-Pyridin-Wasser   (34:33:33)    System 87: Isopropanol-Eisessig-Wasser   (77 :4:

  :19)     
EMI5.1     

  <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10
<tb>  <SEP> Cys <SEP> Gly <SEP> Asn <SEP> Leu <SEP> Ser <SEP> Thr <SEP> Cys <SEP> X <SEP> Leu <SEP> Gly
<tb>  <SEP> Bzl <SEP> Bzl
<tb> A <SEP> BOC---OH <SEP> BOC-OH <SEP> BOC-OH <SEP> H-N2E2-Z <SEP> BOC-OH <SEP> H-ONB <SEP> BOC-OH <SEP> BOC-OH <SEP> BOC-OH <SEP> H-OBzl
<tb>  <SEP> 3) <SEP> 1)-5) <SEP> 1)-5)
<tb> B <SEP> BOC------N2E2-Z <SEP> BOC---ONB <SEP> BOC---OBzl
<tb> C <SEP> H------N2E2-Z <SEP> H-ONB <SEP> H---OBzl
<tb>  <SEP> 1)-5) <SEP> 1)-5)
<tb> D <SEP> BOC-----N2E2-Z <SEP> BOC---------OBzl
<tb> E <SEP> BOC-----N2H3 <SEP> H---------OBzl
<tb>  <SEP> 1) <SEP> Bzl <SEP> 1)-5)
<tb> F <SEP> BOC-----------------------------ONB <SEP> BOC--------------------------OBzl
<tb>  <SEP> Bzl
<tb> G <SEP> H-----------------------------ONB <SEP> H--------------------------OBzl
<tb>  

   <SEP> Bzl <SEP> 1)-5)
<tb> H <SEP> BOC-------------------------------------ONB <SEP> -24  <SEP> Bzl
<tb> I <SEP> BOC-------------------------------------N2H3
<tb>  <SEP> Bzl <SEP> 1) <SEP> Bzl
<tb> J <SEP> BOC-----------------------------------------------------------------------OBzl
<tb>  <SEP> SH <SEP> SH
<tb> K <SEP> BOC-----------------------------------------------------------------------OH
<tb> L <SEP> BOC-----------------------------------------------------------------------OH
<tb>  <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10
<tb>    Fig.

   1     
EMI6.1     

  <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10
<tb>  <SEP> Cys <SEP> Gly <SEP> Asn <SEP> Leu <SEP> Ser <SEP> Thr <SEP> Cys <SEP> X <SEP> Leu <SEP> Gly
<tb>  <SEP> Bzl <SEP> Bzl
<tb> A <SEP> BOC----OH <SEP> z-OH <SEP> BOC-OH <SEP> BOC-OH <SEP> BOC-OH <SEP> H-OBzl <SEP> BOC---OH <SEP> BOC-OH <SEP> H-OBzl
<tb>  <SEP> 1)-5) <SEP> 1)-5)
<tb> B <SEP> BOC-------OBzl <SEP> BOC-----------------OBzl
<tb> C <SEP> H-------OBzl
<tb>  <SEP> 1)-5) <SEP> 1)-5)
<tb> D <SEP> BOC--------------OBzl <SEP> BOC--------OBzl
<tb> E <SEP> H--------------OBzl <SEP> H--------OBzl
<tb>  <SEP> 3) <SEP> Bzl <SEP> 1)-5)
<tb> F <SEP> BOC----------------------OBzl <SEP> BOC-----------------OBzl
<tb> G <SEP> H----------------------OBzl <SEP> H-----------------OBzl
<tb> H <SEP> Z-------------------------------OBzl
<tb> I <SEP> 

   H-------------------------------OH
<tb>  <SEP> Bzl <SEP> 3) <SEP> 5)
<tb> J <SEP> BOC------------------------------------------OH
<tb>  <SEP> Bzl <SEP> Bzl
<tb> K <SEP> BOC--------------------------------------------------------------------OBzl
<tb>  <SEP> SH <SEP> SH
<tb> L <SEP> BOC--------------------------------------------------------------------OH
<tb> M <SEP> BOC--------------------------------------------------------------------OH
<tb>  <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5FIG.2 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10
<tb>   
EMI7.1     

  <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10
<tb>  <SEP> Cys <SEP> Gly <SEP> Asn <SEP> Leu <SEP> Ser <SEP> Thr <SEP> Cys <SEP> X <SEP> Leu <SEP> Gly
<tb>  <SEP> TRI <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> TRI
<tb> A <SEP> BOC----OH <SEP> Z-OH <SEP> Z-ONP <SEP> H-OMe <SEP> DPC----OH <SEP> H---OMe <SEP> TRI---OH <SEP> 

   BOC--OH <SEP> z--OH <SEP> H-OMe
<tb>  <SEP> 3) <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> 1)-5)
<tb> B <SEP> Z---------OMe <SEP> DPC-----------OMe <SEP> Z---------OMe
<tb>  <SEP> tBu <SEP> tBu
<tb> C <SEP> H---------OMe <SEP> DPC-----------N2H3 <SEP> H---------OMe
<tb>  <SEP> 1)-5) <SEP> 1)-5)
<tb> D <SEP> Z-----------------OMe <SEP> BOC---------------OMe
<tb> E <SEP> H-----------------OMe <SEP> H---------------OMr
<tb>  <SEP> TRI <SEP> 4)
<tb> F <SEP> TRI-------------------------OMe
<tb>  <SEP> TRI
<tb> G <SEP> H-------------------------OH
<tb>  <SEP> TRI <SEP> 4) <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> 2) <SEP> TRI
<tb> H <SEP> BOC--------------------------OMe <SEP> DPC-------------------------------------------OH
<tb>  <SEP> TRI <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> TRI
<tb> I <SEP> BOC--------------------------N2H3 <SEP> H-------------------------------------------OH
<tb>  <SEP> TRI <SEP> 2) <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP>  

   TRI
<tb> J <SEP> BOC-----------------------------------------------------------------------------OH
<tb>  <SEP> SH <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> SH
<tb> K <SEP> BOC-----------------------------------------------------------------------------OH
<tb>  <SEP> tBu <SEP> tBu
<tb> L <SEP> BOC-----------------------------------------------------------------------------OH
<tb>  <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10
<tb>    Fig.

   3     
EMI8.1     

  <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10
<tb>  <SEP> Cys <SEP> Gly <SEP> Asn <SEP> Leu <SEP> Ser <SEP> Thr <SEP> Cys <SEP> X <SEP> Leu <SEP> Gly
<tb>  <SEP> TRI <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> TRI
<tb> A <SEP> BOC---OH <SEP> Z-OH <SEP> Z-ONP <SEP> H-OMe <SEP> DPC---OH <SEP> DPC---OH <SEP> TRI----OH <SEP> BOC-OH <SEP> Z-OH <SEP> H-OMe
<tb>  <SEP> 3) <SEP> 1)-5)
<tb> B <SEP> Z---------OMe <SEP> Z---------OMe
<tb> C <SEP> H---------OMe <SEP> H---------OMe
<tb>  <SEP> 1)-5) <SEP> 1)-5)
<tb> D <SEP> Z------------------OMe <SEP> BOC---------------OMe
<tb> E <SEP> H------------------OMe <SEP> H---------------OMe
<tb>  <SEP> TRI <SEP> 4) <SEP> TRI <SEP> 5)
<tb> F <SEP> BOC---------------------------OMe <SEP> TRI---------------------------OMe
<tb>  <SEP> TRI <SEP> TRI
<tb> G <SEP> BOC---------------------------N2H3 <SEP> 

   H---------------------------OMe
<tb>  <SEP> tBu <SEP> TRI <SEP> 1)-5)
<tb> H <SEP> DPC-----------------------------------OMe
<tb>  <SEP> tBu <SEP> TRI
<tb> I <SEP> H-----------------------------------OMe
<tb>  <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> TRI <SEP> 1)-5)
<tb> J <SEP> DPC--------------------------------------------OMe
<tb>  <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> TRI
<tb> K <SEP> H--------------------------------------------OMe
<tb>  <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> TRI
<tb> L <SEP> H--------------------------------------------OH
<tb>  <SEP> TRI <SEP> 1) <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> TRI
<tb> M <SEP> BOC------------------------------------------------------------------------------OH
<tb>  <SEP> tBu <SEP> tBu
<tb> N <SEP> BOC------------------------------------------------------------------------------OH
<tb>  <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10
<tb>   <RTI  

    ID=8.1> Fig. 4     
EMI9.1     

  <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10
<tb>  <SEP> Cys <SEP> Gly <SEP> Asn <SEP> Leu <SEP> Ser <SEP> Thr <SEP> Cys <SEP> X <SEP> Leu <SEP> Gly
<tb>  <SEP> TRI <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> TRI
<tb> A <SEP> TRI----OH <SEP> Z----OH <SEP> Z--ONP <SEP> H--OMe <SEP> DPC----OH <SEP> H----OME <SEP> TRI---OH <SEP> BOC--OH <SEP> Z--H <SEP> H----OMe
<tb>  <SEP> 3)
<tb> B <SEP> Z---------OMe
<tb> C <SEP> H---------OMe
<tb> D <SEP> Z------------------OMe
<tb> E <SEP> H------------------OMe
<tb>  <SEP> TRI <SEP> 4)
<tb> F <SEP> TRI---------------------------OMe
<tb>  <SEP> TRI
<tb> G <SEP> H---------------------------OMe
<tb>  <SEP> TRI
<tb> H <SEP> Ac---------------------------OMe
<tb>  <SEP> TRI <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> TRI <SEP> wie <SEP> Fig.

  <SEP> 3I <SEP> oder <SEP> 4L
<tb> I <SEP> Ac---------------------------N2H3 <SEP> H------------------------------------------------OH
<tb>  <SEP> TRI <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> TRI
<tb> J <SEP> Ac-----------------------------------------------------------------------------OH
<tb>  <SEP> tBu <SEP> tBu
<tb> K <SEP> Ac-----------------------------------------------------------------------------OH
<tb>  <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10
<tb>    Fig.

   5     
EMI10.1     

  <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10
<tb>  <SEP> Cys <SEP> Gly <SEP> Asn <SEP> Leu <SEP> Ser <SEP> Thr <SEP> Cys <SEP> X <SEP> Leu <SEP> Gly
<tb>  <SEP> TRI <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> TRI
<tb> A <SEP> BOC----OH <SEP> Z---OH <SEP> Z--ONP <SEP> H---OMeDPC---OH <SEP> H---OMe <SEP> TRI---OMe <SEP> BOC--OH <SEP> BOC--OH <SEP> H---OMe
<tb>  <SEP> tBu <SEP> 1)-5)tBu <SEP> TRI <SEP> 1)-5)
<tb> B <SEP> DPC----------OMe <SEP> H---OMe <SEP> BOC---------OMe
<tb>  <SEP> tBu <SEP> tBu
<tb> C <SEP> DPC----------N2H3 <SEP> H--------OMe
<tb>  <SEP> tButBu <SEP> 1) <SEP> TRI <SEP> BOC------------------OMe
<tb> D <SEP> DPC----------OMe <SEP> BOC------------------OH
<tb>  <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> TRI
<tb> E <SEP> DPC----------OH <SEP> H------------------OH
<tb>  <SEP> TRI <SEP> wie <SEP> Fig.

  <SEP> 4G <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> TRI
<tb> F <SEP> BOC----------------------------N2H3 <SEP> H----------OH
<tb>  <SEP> TRI <SEP> 2) <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> TRI
<tb> G <SEP> BOC--------------------------------------------OH
<tb>  <SEP> tBu <SEP> tBu
<tb> H <SEP> BOC--------------------------------------------OH
<tb>  <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> 3)
<tb> I <SEP> BOC-------------------------------------------------------------------------------OH
<tb>    Fig.

   6     
EMI11.1     

  <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10
<tb>  <SEP> Cys <SEP> Gly <SEP> Asn <SEP> Leu <SEP> Ser <SEP> Thr <SEP> Cys <SEP> X <SEP> Leu <SEP> Gly
<tb>  <SEP> Bzl <SEP> Bzl
<tb> A <SEP> BOC---OSU <SEP> BOC--ONF <SEP> BOC--OH <SEP> BOC--ONP <SEP> BOC---OH <SEP> H---OBzl <SEP> H--OBzl <SEP> BOC--N2H3 <SEP> Z--------OEt
<tb>  <SEP> 2) <SEP> 4) <SEP> 5)
<tb> B <SEP> BOC----------OBzl <SEP> H--------OEt
<tb>  <SEP> 1)
<tb> C <SEP> H----------OBzl <SEP> BOC----------------OEt
<tb>  <SEP> 3)
<tb> D <SEP> BOC-------------------OBzl <SEP> BOC----------------OE
<tb> E <SEP> H-------------------OBzl <SEP> H----------------OE
<tb>  <SEP> 2) <SEP> 4) <SEP> 5)
<tb> F <SEP> BOC-------------------OBzl
<tb> G <SEP> H-------------------OBzl
<tb>  <SEP> 3)
<tb> H <SEP> BOC------------------------------------OBzl
<tb> I <SEP> 

   BOC------------------------------------OH
<tb>  <SEP> 2)5) <SEP> Bzl
<tb> J <SEP> BOC-------------------------------------------OBzl
<tb>  <SEP> Bzl
<tb> K <SEP> E--------------------------------------------OBzl
<tb>  <SEP> Bzl <SEP> 3) <SEP> Bzl
<tb> L <SEP> BOC-----------------------------------------------------OBzl
<tb> K <SEP> BOC-----------------------------------------------------OH
<tb> N <SEP> BOC-----------------------------------------------------OH
<tb>  <SEP> 2)
<tb> O <SEP> BOC---------------------------------------------------------------------------OH
<tb>    Fig.

   7     
EMI12.1     

  <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10
<tb>  <SEP> Cys <SEP> Gly <SEP> Asn <SEP> Leu <SEP> Ser <SEP> Thr <SEP> Cys <SEP> X <SEP> Leu <SEP> Gly
<tb>  <SEP> Bzl <SEP> Bzl
<tb> A <SEP> BOC----CSU <SEP> BOC---OXP <SEP> BOC--OH <SEP> BOC-ONP <SEP> BOC-OH <SEP> H---OBzl <SEP> H--N2H2Z <SEP> BOC--N2H3 <SEP> Z----------OEt
<tb>  <SEP> 2)4)5)
<tb> B <SEP> BOC--------OBzl <SEP> H----------OEt
<tb> C <SEP> H--------OBzl <SEP> BOC------------------OEt
<tb>  <SEP> 3)
<tb> D <SEP> BOC----------------OBzl <SEP> H-------------------OH
<tb> E <SEP> H-----------------OBzl
<tb>  <SEP> 2)4)5)
<tb> F <SEP> BOC------------------------OBzl
<tb> G <SEP> H-------------------------OBzl
<tb>  <SEP> 3)
<tb> H <SEP> BOC----------------------------------OBzl
<tb> I <SEP> BOC----------------------------------OH
<tb>  <SEP> 2) <SEP> 5) <SEP>  

   Bzl
<tb> J <SEP> BOC------------------------------------------N2H2-Z
<tb>  <SEP> Bzl
<tb> K <SEP> H-------------------------------------------N2H2-Z
<tb>  <SEP> Bzl <SEP> Bzl
<tb> L <SEP> BOC-----------------------------------------------------N2H2-Z
<tb> M <SEP> BOC-----------------------------------------------------N2H3
<tb> X <SEP> BOC-----------------------------------------------------N2H3
<tb>  <SEP> 1)
<tb> O <SEP> BOC------------------------------------------------------------------------------OH
<tb>    Fig.

   8     
EMI13.1     

 10 <SEP> 11 <SEP> 12 <SEP> 13 <SEP> 14 <SEP> 15 <SEP> 16 <SEP> 17 <SEP> 18 <SEP> 19 <SEP> 20 <SEP> 21 <SEP> 22 <SEP> 23 <SEP> 24 <SEP> 25 <SEP> 26 <SEP> 27 <SEP> 28 <SEP> 29 <SEP> 30 <SEP> 31 <SEP> 32
<tb>  <SEP> Thr <SEP> Tyr <SEP> Thr <SEP> Gln <SEP> Asp <SEP> Phe <SEP> Asn <SEP> Lys <SEP> Phe <SEP> His <SEP> Thr <SEP> Phe <SEP> Pro <SEP> Gln <SEP> Thr <SEP> Ala <SEP> Ile <SEP> Gly <SEP> Val <SEP> Gly <SEP> Ala <SEP> Pro
<tb>  <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> OH
<tb>  <SEP> Z-----------OH <SEP> H-------------------OMe
<tb>  <SEP> tBu <SEP> tBu
<tb>  <SEP> Z-----------------------------------OH
<tb>  <SEP> BOC <SEP> tBu <SEP> 2) <SEP> tBu
<tb>  <SEP> Z--------------N2H3 <SEP> H-----------------------------------OH
<tb>  <SEP> BOC <SEP> 1) <SEP> tBu <SEP> tBu
<tb>  <SEP> Z-------------------------------------------------------OH
<tb>  <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> tBu 

   <SEP> tBu <SEP> BOC <SEP> tBu <SEP> tBu
<tb>  <SEP> Z{----------------------N2H3 <SEP> H-------------------------------------------------------OH
<tb>  <SEP> DPC
<tb>  <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> 1) <SEP> BOC <SEP> tBu <SEP> tBu
<tb>  <SEP> Z{------------------------------------------------------------------------------------OH <SEP> H---------NH2
<tb>  <SEP> DPC
<tb>  <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> BOC <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> 4)5)
<tb>  <SEP> Z{-------------------------------------------------------------------------------------------------NH2
<tb>  <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> BOC <SEP> tBu <SEP> tBu
<tb>  <SEP> H--------------------------------------------------------------------------------------------------NH2
<tb>    Fig.

   9     
EMI14.1     

  <SEP> 11 <SEP> 12 <SEP> 13 <SEP> 14 <SEP> 15 <SEP> 16
<tb>  <SEP> Thr <SEP> Tyr <SEP> Thr <SEP> Gln <SEP> Asp <SEP> Phe
<tb>  <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> OtBu
<tb> A <SEP> Z{----OH <SEP> Z----OH <SEP> Z---OH <SEP> Z---ONP <SEP> Z------ONP <SEP> H-----OMe
<tb>  <SEP> DPC
<tb>  <SEP> OtBu <SEP> 3)
<tb> B <SEP> Z----------------OMe
<tb>  <SEP> OtBu
<tb> C <SEP> H----------------OMe
<tb>  <SEP> 3) <SEP> OtBu
<tb> D <SEP> Z------------------------OMe
<tb>  <SEP> OtBu
<tb> E <SEP> H------------------------OMe
<tb>  <SEP> tBu <SEP> 3) <SEP> OtBu
<tb> F <SEP> Z--------------------------------OMe
<tb>  <SEP> tBu <SEP> OtBu
<tb> G <SEP> H--------------------------------OMe
<tb>  <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> OtBu
<tb> H <SEP> Z-----------------------------------------OMe
<tb>  <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> OtBu
<tb> I <SEP> 

   H-----------------------------------------OMe
<tb>  <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> OtBu
<tb> J <SEP> Z{--------------------------------------------------OMe
<tb>  <SEP> DPC
<tb>  <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> OtBu
<tb> K <SEP> Z{--------------------------------------------------K2H3
<tb>  <SEP> DPC
<tb>    Fig. 10     
EMI15.1     


<tb>  <SEP> 17 <SEP> 18 <SEP> 19 <SEP> 20
<tb>  <SEP> Asn <SEP> Lys <SEP> Phe <SEP> His
<tb>  <SEP> BOO
<tb> A <SEP> Z <SEP> --ONP <SEP> Z1--ONP <SEP> H- <SEP> OMe <SEP> H-OMe
<tb>  <SEP> BOC
<tb> B <SEP> 1 <SEP> 3) <SEP> OMe
<tb>  <SEP> BOC
<tb> C <SEP> Z <SEP> NR
<tb>  <SEP> BOO
<tb> D <SEP> z <SEP> l <SEP> 1) <SEP> OMe
<tb>  <SEP> BOC
<tb> E <SEP> H1 <SEP> - <SEP> OMe
<tb>  <SEP> BOC
<tb> F
<tb>  <SEP> BOC
<tb> G <SEP> Z <SEP> { <SEP> NR
<tb>  Fig.

   11  
EMI16.1     

  <SEP> 21 <SEP> 22 <SEP> 23 <SEP> 24 <SEP> 25 <SEP> 26 <SEP> 27 <SEP> 28
<tb>  <SEP> Thr <SEP> Phe <SEP> Pro <SEP> Gln <SEP> Thr <SEP> Ala <SEP> The <SEP> Gly
<tb>  <SEP> tBu <SEP> tBu
<tb> A <SEP> Z----OH <SEP> Z-----------OH <SEP> Z-----ONP <SEP> Z------OH <SEP> Z------ONP <SEP> Z---OH <SEP> H---OMe
<tb>  <SEP> 1)-5)
<tb> B <SEP> H-----------OH <SEP> Z------------OMe
<tb>  <SEP> tBu <SEP> 2)
<tb> C <SEP> Z--------------------OH <SEP> H------------OMe
<tb>  <SEP> 3)
<tb> D <SEP> Z------------------------OMe
<tb> E <SEP> H------------------------OMe
<tb>  <SEP> tBu <SEP> 2)
<tb> F <SEP> Z---------------------------------OMe
<tb>  <SEP> tBu
<tb> G <SEP> H---------------------------------OMe
<tb>  <SEP> tBu
<tb> H <SEP> H---------------------------------OH
<tb>  <SEP> tBu <SEP> 3)
<tb> I <SEP> Z--------------------------------------------OH
<tb>  <SEP> tBu
<tb> J 

   <SEP> H--------------------------------------------OH
<tb>  <SEP> tBu <SEP> 2) <SEP> tBu
<tb> K <SEP> Z-----------------------------------------------------------------------OH
<tb>  <SEP> tBu <SEP> tBu
<tb> L <SEP> Z-----------------------------------------------------------------------OH
<tb>    Fig. 12     
EMI17.1     


<tb>  <SEP> 29 <SEP> 30 <SEP> 31 <SEP> 32
<tb>  <SEP> Val <SEP> Gly <SEP> Ala <SEP> Pro
<tb> A <SEP> ZONP <SEP> z <SEP> OH <SEP> Z <SEP> ONP <SEP> H <SEP> NH2
<tb> B <SEP> z <SEP> 3) <SEP> NR2
<tb> C <SEP> H- <SEP> iN <SEP> 2
<tb> D <SEP> Z <SEP> 1)-5) <SEP> NH2
<tb> 3 <SEP> g <SEP> 'H2
<tb> F <SEP> n <SEP> 3) <SEP> NR2
<tb> G <SEP> H--------------------------- <SEP> H <SEP> NH2
<tb>  Fig.

   13  
EMI18.1     

  <SEP> 11 <SEP> 12 <SEP> 13 <SEP> 14 <SEP> 15 <SEP> 16 <SEP> 17 <SEP> 18 <SEP> 19
<tb>  <SEP> Thr <SEP> Tyr <SEP> Thr <SEP> Gln <SEP> Asp <SEP> Phe <SEP> Asn <SEP> Lys <SEP> Phe
<tb>  <SEP> OtBu <SEP> BOC
<tb> A <SEP> Z-----OH <SEP> BOC--OH <SEP> H---ONB <SEP> H---N2H20BOC <SEP> Z----OH <SEP> H----OMe <SEP> Z---ONP <SEP> Z---OH <SEP> H---OBzl
<tb>  <SEP> 4) <SEP> OtBu <SEP> 4) <SEP> BOC <SEP> 4)
<tb> B <SEP> BOC---------ONB <SEP> Z------------OMe <SEP> Z----------OBzl
<tb>  <SEP> OtBu <SEP> BOC
<tb> C <SEP> H----------ONB <SEP> Z------------N2H3 <SEP> H----------OH
<tb>  <SEP> 4) <SEP> BOC <SEP> 3)
<tb> D <SEP> Z--------------------ONB <SEP> Z------------------OH
<tb>  <SEP> BOC
<tb> E <SEP> Z--------------------N2H3 <SEP> H------------------OH
<tb>  <SEP> 1) <SEP> OtBu <SEP> 1) <SEP> BOC
<tb> F <SEP> Z--------------------------------N2H2-BOC <SEP> 

   Z--------------------------------OH
<tb>  <SEP> OtBu <SEP> BOC
<tb> G <SEP> Z--------------------------------N2H3 <SEP> H--------------------------------OH
<tb>  <SEP> OtBu <SEP> BOC
<tb> H <SEP> Z--------------------------------------------------------------------------OH
<tb>    Fig.

   14     
EMI19.1     

  <SEP> 20 <SEP> 21 <SEP> 22 <SEP> 23 <SEP> 24 <SEP> 25 <SEP> 26 <SEP> 27 <SEP> 28 <SEP> 29 <SEP> 30 <SEP> 31 <SEP> 32
<tb>  <SEP> Eis <SEP> Thr <SEP> Phe <SEP> Pro <SEP> Gln <SEP> Thr <SEP> Ala <SEP> Ile <SEP> Gly <SEP> Val <SEP> Gly <SEP> Ala <SEP> Pro
<tb> A <SEP> Z--N2H3 <SEP> Z--N2H3 <SEP> Z--ONP <SEP> Z--OH <SEP> H--N2H2-BOC <SEP> BOC-N2H3 <SEP> Z-OH <SEP> Z-ONP <SEP> H--OMe <SEP> Z--ONP <SEP> Z-ONP <SEP> Z--OH <SEP> H--OtBu
<tb>  <SEP> 2) <SEP> 3) <SEP> 2)
<tb> B <SEP> Z---------N2H2-BOC <SEP> Z----------OMe <SEP> Z---------------OtBu
<tb> C <SEP> H---------N2H2-BOC <SEP> H----------OMe <SEP> H---------------OtBu
<tb>  <SEP> 3) <SEP> 2) <SEP> 3)
<tb> D <SEP> Z----------------N2B2-BOC <SEP> Z-----------------OMe <SEP> Z---------------------------OtBu
<tb> E <SEP> H----------------N2H2-BOC <SEP> H-----------------OMe <SEP> 

   Z---------------------------OtBu
<tb>  <SEP> 1) <SEP> 1) <SEP> 3)
<tb> F <SEP> Z------------------------N2H2-BOC <SEP> BOC------------------------OMe <SEP> Z-------------------------------------OtBu
<tb> G <SEP> H------------------------N2H2-BOC <SEP> BOC------------------------OH <SEP> Z-------------------------------------OH
<tb>  <SEP> 1) <SEP> 2)+NH3
<tb> H <SEP> Z--------------------------------N2H2-BOC <SEP> Z-------------------------------------NH2
<tb> I <SEP> Z--------------------------------N2H3 <SEP> H-------------------------------------NH2
<tb>  <SEP> 204)5)
<tb> J <SEP> BOC-------------------------------------------------------------------NH2
<tb> K <SEP> H--------------------------------------------------------------------NH2
<tb>  <SEP> 1)
<tb> L <SEP>  

   Z---------------------------------------------------------------------------------------------------------------NH2
<tb> M <SEP> H---------------------------------------------------------------------------------------------------------------NH2
<tb>    Fig. 15      Beispiel 1
EMI20.1     
 Nle-Leu-Gly-Thr-Tyr Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr    Ala-Ile-Glv-Val-Giv-Ala-Pro-NH,    (Nle8-Calcitonin M).
EMI20.2     




     Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-      Val-Gly-Ala-Pro;NH,    werden unter intensivem Rühren in 10 ml eiskalte, konzentrierte Salzsäure eingetragen. Nach 10 Minuten bei   0     werden 50 ml Wasser und 5 ml Eisessig zugegeben und die Lösung wird zur Entfernung von Chlor Ionen über eine Säule von Merck-Ionenaustauscher Nr. II, schwach basisch, Acetatform,   filtnert.    Hierauf wird unter n-Octanol-Zusatz am   Rotationlverdampfer    zur Trockne verdampft, der Rückstand zur Entfernung von Octanol mit Petroläther mehrmals unter Dekantieren gewaschen, getrocknet, in 0,1n Ameisensäure gelöst und zur Reinigung an einer Säule (3,8 cm; 120 cm) von Bio-Gel P6 chromatographiert. Es werden Fraktionen von je 10 ml aufgefangen.



  Diese werden mittels Dünnschichtchromatographie auf Aluminiumoxyd (Systeme 52, 79 und 45) auf ihre Reinheit geprüft; die einheitlichen Fraktionen werden vereinigt und lyophilisiert. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf6 = 0,44; an Aluminiumoxyd ist   Rfs2    = 0,55; Rf79 = 0,64;   Rf45    = 0,45.



   Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden: 1. Z-Ala-Pro-OtBu
68,85 g Z-Ala-OH werden in 550 ml Dimethylformamid gelöst und dann werden 43,3 ml Triäthylamin zugefügt. Bei   -15"    gibt man 30,8 ml Chlorameisensäureäthylester zu und steigert die Temperatur innert 10 Minuten auf   -10".    Dann wird eine   auf -10"    gekühlte Lösung von 52,65 g H-Pro-OtBu in 105 ml Dimethylformamid zugefügt.

  Man rührt 30 Minuten bei   -10"    und 2,5 Stunden bei   20 ,    lässt über Nacht im Kühlschrank stehen und verdampft dann das Lösungsmittel im Vakuum bei   40".    Der Rückstand wird in wässrigem Essigester aufgenommen, die Lösung mit 0,1n Salzesäure, 10 %iger Kochsalzlösung, 5 %igem Natriumbicarbonat und wieder mit Kochsalzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Bei Dünnschichtchromatographie auf Silicagel ist Rf2 = 0,6.



  2. H-Ala-Pro-OtBu, Acetat
Man löst 109 g Z-Ala-Pro-OtBu in 649 ml Methanol und hydriert in Gegenwart von 4,1 ml Eisessig und 3,1 g Palladiumkohle (10%). Nach Filtration und Eindampfen der Lösung zur Trockne zeigt das Produkt Rf7 = 0,5.



  3. Z-Gly-Ala-Pro-OtBu
Man löst 56,75 g Z-Gly-OH in 675 ml Tetrahydrofuran.



  Mit 47,5 ml Triäthylamin und 27 nil Chlorameisensäure äthylester wird das gemischte Anhydrid gebildet und dieses mit 74 g H-Ala-Pro-OtBu, Acetat wie unter 1 umgesetzt. Das erhaltene Öl wird mit Äther verrieben. Das Produkt schmilzt bei   87-89 ;      [a]D20    = -62,9 (c = 1 in Dimethylformamid).



  Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf2 =   0,50.   



  4. H-Gly-Ala-Pro-OtBu
80 g Z-Gly-Ala-Pro-OtBu werden in 800 ml Methanol gelöst und wie unter 2 beschrieben, jedoch ohne Eisessig, hydriert. Das Produkt zeigt im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel   Rf5    =   0,30.   



   5. Z-Val-Gly-Ala-Pro-OtBu
Man suspendiert 54,7 g H-Gly-Ala-Pro-OtBu in 722 ml
Essigester, kühlt auf   -10"    und fügt 71,6 g Z-Val-ONP hinzu.



  Die Mischung wird 1 Stunde bei   -10 ,    1 Stunde bei   10     und 20 Stunden bei   20     gerührt. Man wäscht die Reaktionsmischung mit 0,1n Salzsäure, Salzwasser, 20%igem Kaliumcarbonat und wieder mit Salzwasser. Die organische Schicht wird getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft. Der Rückstand (Öl) wird mit Essigester-Hexan gewaschen. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf2 = 0,4.



  6. Z-Val-Gly-Ala-Pro-OH
Man löst 102 g Z-Val-Gly-Ala-Pro-OtBu in 690 ml trocknem Essigester und lässt 1,5 Stunden Salzsäuregas durch die Lösung strömen. Das Lösungsmittel wird verdampft, der Rückstand wieder in Essigester gelöst, Hexan zugefügt und 1 Stunde   bei 100    gerührt. Dann filtriert man.



  Das Produkt schmilzt bei   111"    (Zers.). [a]D20 =   -38,3"    (c = 2 in Dimethylformamid). Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf = 0,50.



  7. Z-Val-Gly-Ala-Pro-NH2
Man löst 64,4 g Z-Val-Gly-Ala-Pro-OH in 644 ml trokkenem Tetrahydrofuran, bildet das gemischte Anhydrid mit 18,9 ml Triäthylamin und 13,5 ml Chlorameisensäureäthylester wie unter 1 beschrieben, gibt dann 25 ml flüssiges Ammoniak zu und arbeitet die Reaktionsmischung wie unter 1 auf. Das Produkt schmilzt die   208-211".      [a]D20    =   -32,7     (c = 2 in Dimethylformamid). Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf7 = 0,7.



  8. H-Val-Gly-Ala-Pro-NH2, Sulfat
Man suspendiert 27,5 g Z-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 in 550 ml Methanol und hydriert nach Zugabe von 3 ml   96 %iger    Schwefelsäure wie unter 2 beschrieben. Das Produkt zeigt im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel   Rf5    = 0,2.



  9. Z-Ile-Gly-OMe
Man suspendiert 84,2 g H-Gly-OMe und 247 g Z-Ile ONP in 2,4 Liter Dimethylformamid, kühlt auf   -10"    ab und gibt 99 ml Triäthylamin zu. Die Reaktionsmischung wird wie unter 5 beschrieben aufgearbeitet. Das Produkt kristallisiert aus Essigester-Hexan. F.   126-128".      [a]D20      = 270    (c = 3 in Methanol). Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf = 0,50.



  10. H-Ile-Gly-OMe, Sulfat
Man löst 193 g Z-Ile-Gly-OMe in 4860 ml Methanol und 30 ml 96%iger Schwefelsäure. Die Hydrierung wird wie unter 2 beschrieben ausgeführt. Das Produkt zeigt im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel   Rf5    = 0,56.



  11. Z-Ala-Ile-Gly-OMe
Man löst 125,3 g Z-Ala-OH in 1250 ml Dimethylformamid, bildet das gemischte Anhydrid mit 79,3 ml Triäthylamin und 55,7 ml Chlorameisensäureäthylester und setzt mit einer Lösung von 168 g H-Ile-Gly-OMe, Sulfat in 835 ml Dimethylformamid und 158,3 ml Triäthylamin wie unter 1 beschrieben um. Das Dimethylformamid wird im Vakuum entfernt bis auf 100 ml und die Lösung in 500 ml Wasser gegossen. Das Produkt schmilzt bis   191,5-192,5 .      [a]D20    = -9,2 (c = 1 in Dimethylformamid). Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist   Rfz    = 0,65.

 

  12. H-Ala-Ile-Gly-OMe,   t/2    H2SO4
Man suspendiert 100 g Z-Ala-Ile-Gly-OMe in 824 ml Dimethylformamid und 6,66 ml   96 %iger    Schwefelsäure und hydriert wie unter 2 beschrieben. Das Produkt zeigt im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel   Rf5    = 0,5.  



  13.   BOC-Thr-Ala-lle-Gly-OMe   
Man löst 57,8 g BOC-Thr-NH-NH2 in 340 ml Dimethylformamid und kühlt auf   -20".    Zu der Lösung gibt man 250 ml 1,989n Salzsäure und dann 33,5 ml iso-Amylnitrit.



  Die Lösung wird 10 Minuten stark gerührt. Inzwischen gibt man zu einer auf   -10"    gekühlten Lösung von 79,1 g H-Ala Ile-Gly-OMe in 1500 ml Dimethylformamid 105 ml Triäthylamin, kühlt diese Lösung auf   -20"    ab und fügt die obige Lösung von BOC-Thr-N3 hinzu. Man lässt die Mischung 70 Stunden bei   0     reagieren, dampft dann das Lösungsmittel im Vakuum bei   40     ab, nimmt den Rückstand in Essigester auf, wäscht die Lösung mit 0,1n Salzsäure,   Wasser, 5%igem    Natriumbicarbonat und Wasser und trocknet sie. Dann wird der Essigester im Vakuum entfernt und der Rückstand aus Essigester-Hexan kristallisiert. Das Produkt schmilzt bei   187-189".      [a]D20    =   -13,20    (c = 2 in Dimethylformamid).



  Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf, = 0,68.



  14. BOC-Thr-Ala-Ile-Gly-NH-NH2
Man löst 87 g BOC-Tetrapeptidester in 870 ml Methanol, kühlt die Lösung auf   0     ab und gibt 37,6 ml Hydrazinhydrat hinzu. Man rührt 18 Stunden bei Raumtemperatur und 1 Stunde bei   0     und filtriert dann. Der Niederschlag wird   zweimal aus Methanol umkristallisiert. F. 231-232,5".   



     [a]D20    =   -5,90    (c = 2 in Dimethylformamid). Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf, = 0,7.



  15.   BOC-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2   
Man suspendiert 27,1 g BOC-Thr-Ala-Ile-Gly-NH-NH2 in 250 ml Dimethylformamid. Das Azid wird wie unter 13 beschrieben mit 59,9 ml 2,23n Salzsäure und 9,1 ml iso Amylnitrit hergestellt. Die Lösung wird 15 Minuten gerührt.



  24,2 g H-Val-Gly-Ala-Pro-NH2, Sulfat werden in 120 ml Dimethylformamid gelöst, auf   0     gekühlt und dann 28 ml Tritäyhalmin zugegeben. Nach Mischen mit der Azidlösung bringt man das pH auf 7. Man lässt die Mischung 70 Stunden reagieren. Das Peptid wird aus Essigester-Hexan kristallisiert. F.   226-227,5 .    [a]D20 =   -25,6"    (c = 2 in Dimethylformamid). Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf, = 0,7.



  16. H-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2, Trifluoracetat
Man löst 51 g BOC-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala Pro-NH2 in 153 ml   10%iger    wässeriger Trifluoressigsäure, lässt die Lösung 1 Stunde stehen und fügt dann 1530 ml trockenen Äther hinzu. Der Niederschlag wird abfiltriert und 3mal mit Äther gewaschen. F.   221-223 . Im    Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf, = 0,5.



  17. Z-Pro-Gln-NH-NH-BOC
Man löst 67,23 g Z-Pro-OH in 670 ml Dimethylformamid und bildet mittels 38,9 ml Triäthylamin und 26 ml Chlorameisensäureäthylester das gemischte Anhydrid. Mit diesem lässt man 70,2 g H-Gln-NH-NH-BOC wie unter 1 beschrieben reagieren. Der Rückstand wird aus heissem Essigester kristallisiert. F.   169-171".    [a]D20 =   -41,30    (c = 1 in Dimethylformamid). Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist   Rfl    = 0,45.



  18. H-Pro-Gln-NH-NH-BOC
Man löst 94 g des unter 17 beschriebenen Derivates in 564 ml Dimethylformamid und hydriert wie unter 2 beschrieben, jedoch ohne Säure. Das Produkt zeigt im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel   Rf5    = 0,3.



  19. Z-Phe-Pro-Gln-NH-NH-BOC
Man löst 80,4 g Z-Phe-ONP, 68 g H-Pro-Gln-NH-NH BOC und 9,4 ml Eisessig in 560 ml Dimethylformamid wie unter 5 beschrieben. Das Produkt schmilzt bei   107".   



     [a]D20    =   -35,9"    (c = 1 in Dimethylformamid). Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf, = 0,7.



  20. H-Phe-Pro-Gln-NH-NH-BOC
Man löst 103 g Z-Phe-Pro-Gln-NH-NH-BOC in 618 ml Dimethylformamid und hydriert wie unter 2 beschrieben, jedoch ohne Säure. Das Produkt zeigt im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel Rf6 = 0,5.



   21. Z-Thr-Phe-Pro-Gln-NH-NH-BOC
Man suspendiert 46,1 g Z-Thr-NH-NH2 in 550 ml Di methylformamid und bildet das Azid wie unter 13 beschrie ben mit 177 ml 1,958n Salzsäure in Tetrahydrofuran und 24 ml iso-Amylnitrit. Das Azid wird mit 81,4 g H-Phe Pro-Gln-NH-NH-BOC, gelöst in 1200 ml Dimethylformamid und 48,5 ml Triäthylamin, gekuppelt. Nach Kristallisation aus Essigester-Hexan schmilzt das Produkt bei   129-134".   



   [a]D20 =   -34,8    (c = 1 in Dimethylformamid). Im Dünn schichtchromatogramm an Silicagel ist Rf7 = 0,85.



  22.   H-Thr-Phe-Pro-Gln-NH-NH-BOC   
Man löst 23,6 g des unter 21 beschriebenen Produktes in
188 ml Dimethylformamid und hydriert wie unter 2 beschrieben, jedoch ohne Säure. Das Produkt zeigt im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel Rf7 = 0,7.



  23.   Z-His-Thr-Phe-Pro-Gln-NH-NH-BOC   
Man löst 9,68 g Z-His-NH-NH2 in 100 ml Dimethylformamid. Das Azid wird mit 36,3 ml 2,67n Salzsäure in Tetrahydrofuran und 4,32 ml iso-Amylnitrit gebildet und mit
19,32 g H-Thr-Phe-Pro-Gln-NH-NH-BOC, gelöst in 300 ml Dimethylformamid und 13,8 ml Triäthylamin, wie unter 13 beschrieben, gekuppelt. Das Reaktionsgemisch wird filtriert, das Filtrat im Vakuum auf 100 ml eingeengt und in 1100 ml Essigester gegossen. Das Produkt schmilzt bei   95-133".   



  Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf6 = 0,7.



  24. Z-His-Thr-Phe-Pro-Gln-NH-NH2, HCI
Man löst 114 g Z-His-Thr-Phe-Pro-Gln-NH-NH-BOC in 57 ml   90%igerTrifluoressigsäure,    lässt die Lösung 1 Stunde stehen und gibt dann 9,8 ml 4n Salzsäure hinzu. Die Lösung wird in 570 ml trockenem Äther gegossen und der Rückstand im Vakuum über Kaliumhydroxyd getrocknet. Das Produkt zeigt im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel Rf5 = 0;25.



  25.   Z-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-       Pro-NR2   
Man löst 11 g des unter 24 beschriebenen Hydrazids in 47 ml Dimethylformamid und bildet das Azid mit 15,6 ml 2,267n Salzsäure in Tetrahydrofuran und 1,57 ml Amylnitrit wie unter 13 beschrieben. Man lässt das Azid mit 6 g des unter 16 beschriebenen Octapeptidamids, gelöst in 70 ml Dimethylformamid und 5,5 ml Tritäthylamin reagieren. Das pH ist 6,5. Nach 7 Tagen wird die Reaktionsmischung filtriert, das Filtrat in 710 ml Essigester gegossen und der Rückstand zweimal mit Essigester verrührt. Das Produkt schmilzt bei   186     unter Zersetzung. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf7 = 0,6.

 

  26. Z-Lys(BOC)-Phe-OBzl
Man suspendiert 261,6 g Z-Lys(BOC)-OH, Dicyclohexylammoniumsalz in 6,4 1 Acetonitril, gibt 137,6 g H-Phe-OBzl, HCI hinzu und rührt die Suspension 30 Minuten. Nach Abkühlen   auf 5    werden 96 g Dicyclohexylcarbodiimid zugefügt. Man rührt die Suspension 20 Stunden bei Zimmertemperatur, filtriert und wäscht den Rückstand mit Acetonitril.



  Das Filtrat wird im Vakuum eingedampft, der Rückstand in   Essigester aufgenommen, die Lösung mit 0,1n Salzsäure, Wasser, 5 %igem Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand kristallisiert aus   Essigester-Hexan. F. 101-103 . [a]D20 =-12,5 (c = 2 in    Dimethylformamid). Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf2 =   0,55.   



  27. h-Lys(BOC)-Phe-OH, HCl
Man löst 105,4 g des obigen Dipeptidesters in 630 ml Dimethylformamid und hydriert wie unter 2 beschrieben, jedoch wird kein Eisessig zugefügt, sondern nach   21/2    Stunden 150 ml 1,115n Salzsäure in Tetrahydrofuran. Die Hydrierung dauert 20 Stunden. Das Produkt zeigt im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel Rf4 = 0,7.



  28. Z-Asn-Lys(BOC)-Phe-OH
Man löst 76,2 g Z-Asn-ONP und 73,6 g H-Lys(BOC) Phe-OH, HCI in 850 ml Dimethylformamid und 150 ml Tetrahydrofuran, kühlt   auf 100    ab und gibt 47,8 ml Tri äthylamin zu wie unter 5 beschrieben. Nach 20 Stunden bei   20     engt man auf 320 ml ein und giesst das Konzentrat in 1435 ml Essigester und 359 ml 0,1n Salzsäure. Der Niederschlag wird mit Wasser und Äther gewaschen. F.   167-168       [a]D20    =   -11,7     (c = 2 in Dimethylformamid). Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf7 = 0,7.



  29. H-Asn-Lys(BOC)-Phe-OH, HCI
Man löst 34 g des obigen Produktes in 240 ml Methanol und hydriert wie unter 27 beschrieben, jedoch unter Zufügen von 13,3 ml 2n Salzsäure in Tetrahydrofuran nach 21/2 Stunden und von weiteren 13,3 ml 2n Salzsäure in Tetrahydrofuran nach 20 Stunden. Die Lösung wird direkt weiterverarbeitet. Das Produkt zeigt im Dünnschichtchromatogramm an   Silicagel Rf7 =    0,6.



  30. Z-Asp(OtBu)-Phe-OMe
Man löst 100,84 g Z-Asp(OtBu)-OH, Dicyclohexylammoniumsalz in 880 ml Methylenchlorid, gibt 43,16 g H-Phe-OMe, HCI hinzu und rührt noch 10 Minuten weiter.



  Dann kühlt man die Suspension auf-5  ab, fügt 41,2 g Dicyclohexylcarbodiimid in 120 ml Methylenchlorid zu und arbeitet auf wie unter 26 beschrieben. Der Rückstand wird mit Methylenchlorid gewaschen. Das Produkt zeigt im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel   Rfi    = 0,9.



  31.   Z-Asp(OtBu)-Phe-NH-NH2   
Man löst 79,2 g des obigen Dipeptidesters in 1320 ml Methanol, kühlt die Lösung auf   0"    ab und gibt 21,1 ml Hydrazinhydrat wie unter 14 beschrieben zu, lässt jedoch 3 Tage reagieren. Der Rückstand wird zweimal mit Wasser gewaschen. F.   143-145 < .    [a]D20 =   -22,2"    (c = 2 in Dimethylformamid). Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf, = 0,65.



  32.   Z-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-OH   
Man löst 54,4 g Z-Asp(OtBu)-Phe-NH-NH2 in 325 ml Dimethylformamid und stellt das Azid wie unter 13 beschrieben mit 111 ml 1,98n Salzsäure in Tetrahydrofuran und 14 ml iso-Amylnitrit her. Man löst 53,4 g H-Asn-Lys(BOC) Phe-OH, HCI in 280 ml Dimethylformamid und 50 ml Tri äthylamin, kühlt auf   -10"    ab und fügt die Azidlösung hinzu.



  Das Pentapeptidderivat wird durch Vermischen des Rückstandes mit Essigester ausgefällt und der Niederschlag mit   Wasser-Äthanol (15:1)    gewaschen. F.   189-190 < .      [a]D20    =   -21,8 <     (c = 1 in Dimethylformamid). Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf6 = 0,77.



     33. H-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-OH   
Man löst 9,6 g des unter 32 erhaltenen geschützten Pentapeptids in 192 ml Dimethylformamid und hydriert wie unter 27 beschrieben, jedoch mit 4,43 ml 2,3n Salzsäure in Tetrahydrofuran. Das Produkt zeigt im Dünnschichtchromatrogramm an Silicagel   Rf5    =   0,8.   



  34. BOC-Tyr-Thr-ONB
Man suspendiert 69,68 g H-Thr-ONB, HCI in 480 ml Acetonitril, fügt 32,84 ml Triäthylamin hinzu, kühlt auf   -5"    ab und gibt 67,52 g BOC-Tyr-OH und 960 ml kaltes Acetonitril und dann 49,44 g Dicyclohexylcarbodiimid hinzu.



  Die Suspension wird 1 Stunde bei 3  gerührt und wie unter 26 beschrieben aufgearbeitet. Das Dipeptidderivat wird als Öl isoliert. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf1 = 0,60.



  35. H-Tyr-Thr-ONB, HCI
Man löst 121 g BOC-Tyr-Thr-ONB in 1537 ml Methylenchlorid und 384 ml Nitromethan und verfährt weiter wie unter 6 beschrieben. Nach 45 Minuten Durchleiten von HCl-Gas wird die Suspension 1 Stunde gerührt und dann filtriert. Das Produkt schmilzt bei   226-227 < .    Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf, = 0,35.



  36. Z-Thr-Tyr-Thr-ONB
Man suspendiert 57,4 g Z-Thr-NH-NH2 in 320 ml Dimethylformamid und bildet das Azid mit 220 ml 1,953n Salzsäure in Tetrahydrofuran und 29 ml iso-Amylnitrit wie unter 13 beschrieben. Die Azidlösung wird zu einer Lösung von 98 g H-Tyr-Thr-ONB, HCI in 760 ml Dimethylformamid und 91 ml Triäthylamin gegeben. Das Tripeptidderivat kristallisiert aus Essigester-Hexan. F.   111-118".      [a]D20    = -4,4  (c = 2 in Dimethylformamid). Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf1 = 0,6.



  37.   Z-Thr-Tyr-Thr-NH-NH2   
Man löst 114,2 g des obigen Tripeptidesters in 480 ml Methanol und fügt wie unter 14 beschrieben 48 ml Hydrazinhydrat hinzu. Nach 4 Stunden gibt man 1440 ml Essigester zu und nach weiteren 11/2 Stunden filtriert man die Suspension. Der Rückstand wird 20 Stunden mit 1 Liter Essigester gerührt. Das Produkt schmilzt bei   219-221".      [a]D20    =   -6,6     (c = 2 in Dimethylformamid). Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf6 = 0,85.



  38. Z-Thr-Tyr-Thr-Gln-NH-NH-BOC
Man suspendiert 89 g Z-Thr-Tyr-Thr-Gln-NH-NH2 in 890 ml Dimethylformamid und bildet das Azid wie unter 13 beschrieben mit 197 ml 2,02n Salzsäure in Tetrahydrofuran und 26,8 ml iso-Amylnitrit. Die Azidlösung wird zu einer auf   -10"    gekühlten Lösung von 39,3 g H-Gln-NH-NH-BOC und 56,2 ml Triäthylamin in 750 ml Dimethylformamid gegeben und die Suspension 2 Stunden gerührt. Dann filtriert man die Kristalle ab und rührt sie mit 400 ml 0,05n Salzsäure (2x). Das Produkt schmilzt bei   216-218 .      [a]D20    =   -8,3     (c = 2 in Dimethylformamid). Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist   Rfjo    = 0,8.

 

  39. Z-Thr-Tyr-Thr-Gln-NH-NH2
Man löst 53,5 g des unter 38 beschriebenen Derivates in 110 ml   90%iger    Trifluoressigsäure, rührt   11/2    Stunden und gibt dann 880 ml Äther zu wie unter 16 beschrieben. Der Niederschlag wird mit 200 ml Methanol-Äther (1:4) gerührt (2x). Das Produkt schmilzt bei   200-203 .      [a]D20    =   -4,6     (c = 2 in Dimethylformamid). Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rfs =   0,75.     



  40. Z-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)
Phe-OH
Man suspendiert   sir,5    g Z-Thr-Tyr-Thr-Gln-NH-NH2 in 95 ml Dimethylformamid und bildet das Azid wie unter 13 beschrieben mit 11,94 ml 2,122n Salzsäure in Tetrahydrofuran und 2,28 ml iso-Amylnitrit. 8,6 g H-Asp(OtBu) Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-OH werden in 210 ml Dimethylformamid und 7,5 ml Triäthylamin gelöst. Diese Lösung wird   auf -10"    gekühlt und zu der Azidlösung gegeben. Man lässt 3 Tage bei   0"    reagieren. Dann filtriert man, dampft das Filtrat ein und verrührt den Rückstand mit 300 ml   0,ln    Salzsäure. Das Produkt kristallisiert aus Dimethylformamid 0,1n Salzsäure (1 :3,5). Es schmilzt bei   206".      [a]D20    =   -19,3     (c = 1 in Dimethylformamid).

  Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist   Rf5    = 0,87.



  41. H-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly
Ala-Pro-NH2
Man löst 32 g des unter 25 beschriebenen BOC-Tridecapeptidamids in 1200 ml Dimethylformamid und 12 ml 4n Salzsäure und hydriert wie unter 2 beschrieben während 20 Stunden. Das Filtrat wird auf 250 ml eingeengt und mit 1500 ml trockenem Äther verrührt. Das Rohprodukt wird durch Gegenstromverteilung nach Craig im System n-Butanol-Eisessig-Wasser   (4:1:5)    gereinigt. K = 0,11. Das Produkt weist   [a]D20    =   -39,4     (c = 1 in Dimethylformamid) auf. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf6 = 0,2.



  42.   Z-Thr-'Fyr-Thr-Glu-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-   
Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly
Ala-Pro-NH2
Man löst 7,3 g des unter 40 beschriebenen geschützten Nonapeptids in 75 ml Dimethylformamid, gibt 1,33 g N Hydroxysuccinimid zu und kühlt die Lösung auf   -22".    Eine ebenso abgekühlte Lösung von 1,195 g Dicyclohexylcarbodiimid in 15 ml Dimethylformamid wird hinzugefügt (Lösung A). Nachdem man eine Stunde bei   -22"    und 5 Stunden bei   +4"    gerührt hat, kühlt man die Suspension wieder auf   -22"    ab. Man gibt nun zur Lösung A eine mit Triäthylamin auf pH 6,7 bis 7 gebrachte und gekühlte Lösung von 6,9 g des unter 41 beschriebenen   Tridecapeptidamids    in 80   ml    Dimethylformamid.

  Nach einer Reaktionszeit von 14 Tagen wird die Suspension zu einer neuen Lösung A, hergestellt aus 0,73 g des unter 40 beschriebenen Nonapeptids gegeben.



  Man lässt weitere 7 Tage bei   0"    reagieren, filtriert dann die Suspension und dampft das Filtrat im Vakuum zur Trockne ein. Der Rückstand wird durch Säulenchromatographie an Silicagel im System n-Butanol-Eisessig-Wasser (4   :1:5)    gereinigt. Das Produkt weist im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel   Rf5    = 0,32 auf.



  43. H-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys-(BOC)
Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly
Ala-Pro-NH2
Man löst 2 g des unter 42 beschriebenen Produkts in 150 ml Dimethylformamid und hydriert. Nach 21/2 Stunden werden 0,3 ml 4,844n Salzsäure zugefügt. Nach 21 Stunden filtriert man und dampft das Filtrat ein. Den Rückstand löst man in 25 ml Dimethylformamid, gibt 0,73 ml 0,1n Salzsäure zu, vermischt mit 40 ml Essigester und kühlt auf   0"    Nach Abfiltrieren des Niederschlags nimmt man ihn in tert. Butanol-Wasser auf und lyophilisiert. Das Produkt zeigt   [a]D20    =   -25,2 <     (c = 2 in Dimethylformamid). Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf6 = 0,32.



  44. BOC-Ser-Thr-OBzl
Man gibt zu einer Lösung von 73,8 g BOC-Ser-OH, Dicyclohexylammoniumsalz in 500 ml Methylenchlorid 47,0 g H-Thr-OBzl, HCI in 300 ml Methylenchlorid, rührt 10 Minuten bei Raumtemperatur und kühlt dann   auf -5".   



  Bei dieser Temperatur tropft man eine Lösung von 40,1 g Dicyclohexylcarbodiimid in 90 ml Methylenchlorid zu. Man rührt 3 Stunden bei   -5"    und die ganze Nacht bei Raumtemperatur. Nach Abfiltrieren des Dicyclohexylharnstoffs und Dicyclohexylamin-Hydrochlorids wird die Lösung ausgeschüttelt, und zwar dreimal mit   0,ln    Salzsäure, zweimal mit 20%iger Kochsalzlösung, einmal mit   10%iger    Natriumbicarbonatlösung und zweimal mit   20 %iger    Kochsalzlösung und über Natriumsulfat getrocknet. Die Lösung wird auf etwa 600 ml eingeengt, auf   5"    gekühlt und von weiterem Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Nach Eindampfen zur Trockne wird der Rückstand zur Reinigung aus Essigester-Hexan kristallisiert.

  F.   110111 < ;      [aj =      -8,5"    (c = 2 in Dimethylformamid); Rf2 = 0,33 (an Silicagel).



  45. H-Ser-Thr-OBzl, TFA
65,7 g BOC-Ser-Thr-OBzl werden gelöst in 100 ml   90 %iger    Trifluoressigsäure und die Lösung eine Stunde bei   20"    belassen. Hierauf wird sie unter Rühren in 1000 ml trockenen Äther eingetropft, eine Stunde gerührt und über Nacht bei   -10"    stehengelassen. Die entstandene Fällung wird abfiltriert und dreimal mit trockenem Äther gewaschen und im Vakuum über Ätznatron getrocknet; F.   128-129 ;    Rf, = 0,65; Rf4 = 0,50 (an Silicagel).



  46. BOC-Leu-Ser-Thr-OBzl
52,5 g H-Ser-Thr-OBzl, TFA werden in 145 ml Dimethylformamid gelöst und bei   0"    mit einer Lösung von 48,0 g BOC-Leu-ONP versetzt. Man gibt alsdann 21 ml Triäthylamin und 0,75 ml Eisessig zu. Das Reaktionsgemisch wird 3 Stunden bei   0"    und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von 2,1 Liter Essigester wird die Lösung ausgeschüttelt, und zwar zweimal mit Wasser, zweimal mit 0,1n Salzsäure, zweimal mit   10%iger    Kochsalzlösung, achtmal mit 20%iger Kaliumcarbonatlösung, zweimal mit   10%iger    und einmal mit   30%iger    Kochsalzlösung.

  Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird die Lösung auf etwa 1,4 Liter eingeengt. Über Nacht im Eisschrank kristallisiert das geschützte Tripeptid vom F.   114-116";    [a]D =   -14"    (c = 2 in Dimethylformamid); Rf2 = 0,25 (an Silicagel).



  47. H-Leu-Ser-Thr-OBzl, TFA
46,1 g BOC-Leu-Ser-Thr-OBzl werden in 92,5 ml   90 %iger    Trifluoressigsäure gelöst und 1 Stunde bei   20"    belassen. Darauf wird unter Rühren trockener Äther (925 ml) zugegeben, eine Stunde bei   0"    gerührt und über Nacht bei   -10"    stehengelassen. Die entstandene Fällung wird abfiltriert, dreimal mit trockenem Äther gewaschen und im Vakuum über Ätznatron getrocknet. F.   168-171 ;    Rf, = 0,80 (an Silicagel).



  48. BOC-Asn-Leu-Ser-Thr-OBzl
20,8 g BOC-Asn-OH werden in 208 ml Acetonitril aufgeschlämmt, mit 22,7 g Woodward's Reagenz K versetzt und 30 Minuten bei   20"    gerührt. Dann lässt man unter Rühren 12,6 ml Triäthylamin so zutropfen, dass die Innentemperatur   + 32 <     nicht übersteigt, kühlt auf   20",    und rührt bei dieser Temperatur noch 50 Minuten. Die fast klare Lösung wird auf   0"    gekühlt und mit einer ebenfalls auf   0"    gekühlten Lösung von 39,1 g H-Leu-Ser-Thr-OBzl,TFA und 10,5 ml Triäthylamin in 257 ml Dimethylformamid versetzt. 

  Man rührt das bald erstarrende Reaktionsgemisch über Nacht bei Zimmertemperatur, kühlt auf   -10"    ab und rührt noch 2 Stunden bei   -10 .    Hierauf nutscht man die kristalline Fällung ab und wäscht das Tetrapeptidderivat einmal mit kaltem Acetonitril, einmal mit Essigester und dreimal mit Wasser, bis es   Chlorid-frei ist. Das erhaltene Produkt wird kristallisiert aus 370 ml Dimethylformamid, 3,7 ml Eisessig und 370 ml Acetonitril. F.   225-226 ;    [a]D   = -36"    (c = 2 in Dimethylformamid); Rf6 = 0,85 (an Silicagel).



  49. H-Asn-Leu-Ser-Thr-OBzl,TFA
32 g BOC-Asn-Leu-Ser-Thr-OBzl werden in 192 ml   90%iger    Trifluoressigsäure gelöst und 45 Minuten bei   200    belassen. Darauf wird die Lösung auf etwa 40 ml eingeengt, unter Rühren mit 400 ml Äther versetzt und 20 Minuten bei   35     unter Rückfluss gerührt. Alsdann kühlt man die Kristallsuspension auf   -10"    ab und lässt über Nacht bei   -10"    stehen.



  Die Fällung wird abfiltriert, dreimal mit Äther gewaschen und in Vakuum über Ätznatron getrocknet. F.   125-127";    Rf4 = 0,33 (an Silicagel).



   50. B OC-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-OBzl
26,3 g H-Asn-Leu-Ser-Thr-OBzl,TFA werden in 100 ml
Dimethylformamid gelöst, gekühlt auf 00, nacheinander mit
7,5 ml Triäthylamin, 0,54 ml Eisessig und einer Lösung von
14,4 g BOC-Gly-ONP in 100 ml Dimethylformamid versetzt, bei Raumtemperatur gerührt, bis die Mischung erstarrt, und zwei Tage stehengelassen. Alsdann gibt man unter Rühren 300 ml Essigester zu und lässt über Nacht bei   -10"    stehen. Die Fällung wird abfiltriert, zweimal mit Essigester und zweimal mit Äther gewaschen, eine halbe Stunde mit 200 ml Wasser verrührt, abfiltriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. F.   227-228";      [a]D =      -23"    (c = 2 in Dimethylformamid);   Rf9    = 0,50 (an Silicagel).



  51. BOC-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-OH
17,0 g BOC-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-OBzl werden in 340 ml Dimethylformamid unter Erwärmen gelöst. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur gibt man 3,4 g 10 %ige Palladium Kohle zu und hydriert. Die Reduktion ist nach 4 Stunden vollendet. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird die Lösung am Hochvakuum eingeengt. Dreimaliges Verreiben mit Äther liefert ein laut Dünnschichtchromatogramm einheitliches Pentapeptid. F.   181-183";      [aln      = -16,5"    (c = 2 in Dimethylformamid); Rf, = 0,65 (an Silicagel).



   52.   B OC-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Bzl)-N2H2-Z   
9,2 g H-Cys(Bzl)-N2H2-Z,HCl werden in 300 ml frisch destilliertem Dimethylformamid gelöst, mit 12,2 g BOC
Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-OH versetzt und bei Raumtemperatur bis zur Lösung gerührt. Sodann kühlt man die Lösung auf    0     ab, gibt 3,28 ml Triäthylamin und 4,88 g N-Hydroxysuccinimid in 100 ml Dimethylformamid zu, kühlt weiter auf   -22"    ab und gibt 4,36 g Dicyclohexylcarbodiimid in 30 ml Dimethylformamid zu. Man rührt eine Stunde   bei -22",    lässt alsdann die Innentemperatur allmählich steigen, und rührt noch 3 Tage bei Zimmertemperatur, filtriert von ausgefallenem Dicyclohexylharnstoff ab und dampft am Hochvakuum zur Trockne ein.

  Der Rückstand wird verrührt mit einer Mischung von Essigester und 5 %iger Zitronensäurelösung, die Fällung abfiltriert, mit Wasser gewaschen, im Vakuum getrocknet, mit trockenem Äther verrührt, filtriert und im Hochvakuum getrocknet. F.   173-178       [ajn      = -25,5"    (c = 2 in Dimethylformamid);   Rft    = 0,21 (an Silicagel).



  53.   H-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Bzl) -N2H2-Z,TFA   
13 g   Boc-Gly-Asn-Leu-ser-Thr-cys(Bzl)-N2H2-z    werden gelöst in 130 ml   90%iger    Trifluoressigsäure und die Lösung wird 2 Stunden bei   22     stehengelassen. Darauf wird die Lösung eingeengt und der Rückstand dreimal mit Äther verrührt und im Vakuum über Ätznatron getrocknet.



  F.   159-161".    Rf6 = 0,63 (an Silicagel).



  54. BOC-Cys(Bzl)-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Bzl)
N2H2-Z
6,69 g BOC-Cys(Bzl)-OSU und 12,2 g H-Gly-Asn-Leu Ser-Thr-Cys(Bzl)-N2H2-Z, 1,22 TFA werden in 100 ml Dimethylformamid gelöst. Aus einer Lösung von 150 mMol Triäthylamin in 100 ml Dimethylformamid wird unter Rühren so viel Triäthylamin zugetropft, bis das Reaktionsgemisch auf feuchtem Indikatorpapier einen pH-Wert von 6,4 zeigt.



  Die Lösung wird 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt, darauf    am am Hochvakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand    wird zweimal mit 300 ml Essigester verrührt, anschliessend dreimal mit einer Mischung von 150 ml Essigester und 30 ml 5 %iger Zitronensäurelösung, abfiltriert, im Vakuum getrocknet und aus Dimethylformamid-Essigester kristallisiert.



  F.   191-193";    [a]D   = -31,5"    (c = 2 Dimethylformamid); Rf8 = 0,35 (an Silicagel).



  55.   BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-N2H3   
6 g   B OC-Cys(Bzl)-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Bzl)-    N2H2-Z werden bei   40"    in 700 ml trockenem flüssigem Ammoniak gelöst. Unter Rühren werden beim Siedepunkt des Ammoniaks 973 mg Natrium in solcher Weise zugegeben, dass die Farbe des Reaktionsgemisches nur hellblau wird.



  Nach 25 Minuten ist die Reduktion vollendet. Man rührt noch 10 Minuten unter Beibehalten der Blaufärbung, gibt alsdann 2,4 ml Eisessig zu und dampft am Hochvakuum (etwa 1 mm) zur Trockne ein. Der Rückstand wird mit 12 ml Wasser, 3,2 ml Eisessig und 20 ml Essigester während einer Stunde bei   0     verrührt, die Fällung abfiltriert, zweimal mit 10 ml   1 %iger    Essigsäurelösung und einmal mit 10 ml Essigester gewaschen und im Hochvakuum getrocknet.



     Rf5    = 0,65 (an Silicagel).



  56. BOC
EMI24.1     
 N2H3
1,0 g   BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-N2H3    wird gelöst in 100 ml Dimethylformamid und 500 ml Wasser, das 1,23 mÄq. Chlorwasserstoff enthält. Mit 3,7 ml einer 0,43n Kaliumhydroxydlösung wird der pH-Wert der Lösung auf 6,8 eingestellt. Unter Beibehalten dieses pH-Wertes werden innerhalb 90 Minuten unter Rühren gleichzeitig zugetropft 247 ml einer 0,01m Kaliumferricyanidlösung und 4,9 ml einer 0,43n Kaliumhydroxylösung. Man rührt noch 90 Minuten bei Raumtemperatur, bringt alsdann mit 0,7 ml Eisessig den pH-Wert der Lösung auf 4,0. Darauf wird die Lösung mit 50 ml Dowex-2-X8, Acetatform, anschliessend mit 13 ml Dowex-SOW-X8, H+-Form, gerührt, filtriert und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 50%igem t-Butanol gelöst, lyophilisiert und im Hochvakuum getrocknet. Das Produkt enthält etwa 15% Kaliumacetat. 

  Es ist einheitlich in Dünnschichtchromatogramm an Silicagel;   Rf5    = 0,63; Rf6 = 0,70; Rf7 = 0,75.



  57.   H-Leu-Gly-OEt,HC1   
Man löst 14 g Z-Leu-Gly-OEt [dargestellt nach J. R.



  Vaughan  & R. L. Osato, J. Am. Chem. Soc. 73, 5553 (1951)] in 150 ml absolutem Äthanol, versetzt mit 11,5 ml einer 6,9n Chlorwasserstofflösung in Äthanol und hydriert in Gegenwart von 2,8 g Palladium-Kohle (10% Pd). Nach 1 Stunde wird vom Katalysator abgenutscht und im Vakuum bei   40     Badtemperatur eingedampft. Der Rückstand ist ein Öl und wird direkt weiter verarbeitet. Rf1 = 0,50 (an Silicagel).



  58. BOC-Nle-Leu-Gly-OEt
Aus 4,63 g BOC-Nle-OH, 2,82 ml Triäthylamin und 1,9 ml Chlorameisensäureäthylester in 50 ml Tetrahydrofuran stellt man das gemischte Anhydrid her wie unter 1 beschrieben und kuppelt es mit 5,05 g H-Leu-Gly-OEt, HCI in  50 ml Tetrahydrofuran. Der Rückstand wird aus Essigester Petroläther (40:60) kristallisiert. F.   126-127 .      [a]D70    =   -28,3     (c = 1 in Dimethylformamid). Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf7 = 0,7.



  59.   BOC-Nle-Leu-Gly-OH   
Man löst 3,25 g des unter 55 beschriebenen Esters in 100 ml Methanol und gibt 21 ml 0,53n Natriumhydroxyd zu.



     Nach 1 l/2stündigem Rühren säuert man die Lösung an und    dampft sie im Vakuum ein. Der Rückstand wird in Wasser gelöst und mit Essigester extrahiert. Die organische Schicht wird getrocknet und eingedampft. Das Produkt schmilzt bei   71-72 .      [a]D70    =   -28,4     (c = 1 in Dimethylformamid). Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf7 = 0,75.



  60. H-Nle-Leu-Gly-OH
Man löst 2,42 g   BOC-Nle-Leu-Gly-OH    in 24 ml   90%iger      Trifluoressigsäure    wie unter 16 beschrieben. Nach einer Stunde wird die Lösung eingedampft. Das Produkt schmilzt bei   94-96 .    Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf,   =    0,56.



  61. BOC
EMI25.1     
   NIe-Gly-OH   
Man löst 1 g des unter 56 beschriebenen Hydrazids in 35 ml Dimethylformamid und bildet das Azid wie unter 13 beschrieben mit 0,85 ml 3,64n Salzsäure in Tetrahydrofuran und 0,155 ml iso-Amylnitrit. Die Azidlösung gibt man zu einer Lösung von 0,955 g H-Nle-Leu-Gly-OH und 0,324 g Triäthylamin in 25 ml Dimethylformamid. Die Reaktionsmischung wird eingedampft und zweimal mit Essigester-Zitronensäurelösung verrührt. Das Produkt weist im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel   Rfs    = 0,71 auf.



  62. BOC
EMI25.2     
   NIe-Leu-Gly-Thr-   
Tyr-Thr-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe
His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Al    Pro-NH2   
Man löst 440 mg des unter 61 beschriebenen BOC-Decapeptids und 109 mg N-Hydroxysuccinimid in 35 ml Dimethylformamid, kühlt die Lösung auf   -22 ,    fügt 98 mg Dicyclohexylcarbodiimid hinzu und rührt noch   1l/2    Stunden bei   -22     und   3'/2    Stunden bei   0 .    Dann kühlt man wieder auf   -22     und gibt 850 mg des unter 43 beschriebenen Docosapeptidamids hinzu und stellt das   pH    mit   Triäthylamin    auf 6,6.

  Nach 7 Tagen bei   0     und 5 Tagen bei   22     wird die Lösung im Vakuum zur Trockne eingedampft und der Rückstand über Silicagel im System n-Butanol-Eisessig-Wasser   (4: 1: 5)    chromatographiert. Das Produkt zeigt im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel   Rfs    =   0,29-   
EMI25.3     
 Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe    Ala-Ile-Glv-Val-Glv-Ala-Pro-NH, (Val8-Calcitonin M).   
EMI25.4     




  Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC) Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Al   Pro-NH2    werden in 3 ml eiskalter, 95%iger Trifluoressigsäure gelöst und die Lösung wird auf   25     erwärmt. Nach 1 Stunde bei   25     wird in 70 ml eiskalten Äther eingegossen und die erhaltene Fällung abgenutscht. Sie wird mehrmals mit Äther gewaschen, getrocknet und dann in 5   %iger    Essigsäure gelöst.



  Dann wird zur Entfernung von   Trifluoracetat-Ionen    über eine Säule von Merck-Ionenaustauscher Nr. II (schwach basisch, Acetatform) filtriert. Das Eluat wird lyophilisiert. Das so erhaltene Dotriacontapeptid ist   dünnschichtchromatogra-    phisch   (Aluminiumoxydplatten,    Systeme 52 und 45) nicht ganz einheitlich. Es kann durch Gegenstromverteilung im System n-Butanol-Essigsäure-Wasser (4:1:5) gereinigt werden. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf6 = 0,45; an Aluminiumoxyd ist Rf52 = 0,53; Rf45 = 0,42.



   Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden: 1.   BOC-Val-Leu-Gly-OEt   
Man löst 4,35 g BOC-Val-OH in 50 ml Tetrahydrofuran und bildet das gemischte Anhydrid wie in Beispiel 1 unter 58 beschrieben und kuppelt es mit 5,06   g Hleu-Gly-OEt    (Beispiel   1,      57).    Das Produkt schmilzt bei   112-113   .      [a]D20    =   -27,3      (c = 1 in Dimethylformamid). Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf,   =      0,7.   



  2.   BOC-Val-Leu-Gly-OH   
Man verseift   BOC-Val-Leu-Gly-OEt    in gleicher Weise wie in Beispiel 1 unter 59 beschrieben. Das Produkt schmilzt bei   78 .      [a]D20    =   ¯24,7     (c = 1 in Dimethylformamid). Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf7 = 0,71.



  3. H-Val-Leu-Gly-OH
Man löst 2,9 g   BOC-Val-Leu-Gly-OH    in 24 ml   90%iger    Trifluoressigsäure wie in Beispiel 1 unter 60 beschrieben.



  Das Produkt schmilzt bei   75 .    Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf,   =    0,5.
EMI25.5     




   1 g des in Beispiel 1 unter 56 beschriebenen Hydrazids wird wie in Beispiel 1 unter 61 beschrieben in das Azid   über-    geführt und dieses mit 0.933 g H-Val-Leu-Gly-OH kondensiert. Das Produkt zeigt im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel   Rfs    = 0,71.
EMI25.6     




   Tyr-Thr-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe
His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala
Pro-NH2
440 mg des in Beispiel 1 unter 43 beschriebenen Docosa   nentidamids    werden in gleicher Weise wie in   Beispiel      1    unter   62 beschrieben    mit
EMI25.7     
 Leu-Gly-OH kondensiert. Das Produkt weist im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel   Rfs    = 0,29 auf.



   Beispiel 3
EMI25.8     
   Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-   
Ala-Ile-Glv-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 (Leu8-Calcitonin M).
EMI25.9     




  Thr(tBu) -Gln-Asp(OtBu) -Phe-Asn-Lys(BOC) -Phe-His Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly   Ala-Pro-NH2 mit 3,5 ml eiskalter, 95 %iger Trifluoressigsäure    erwärmt die Mischung nach vollständiger Lösung des Peptid-   derivats auf 30  und lässt die Lösung 1 Stunde stehen. Dann wird sie in 200 ml eiskalten Äther gegossen. Die feine Fäl-    lung wird abgenutscht. nach Trocknen im Vakuum über Natriumhydroxyd in verdünnter   Essigsäure    gelöst und zur Entfernung von Trifluoracetat-Ionen über eine Säule von Merck Ionenaustauscher Nr. II. schwach basisch, filtriert. Das Eluat    wird lyophilisiert. Man erhält das essigsaure Salz des Leu8-    Calcitonin M.

 

   Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden:
EMI25.10     
 Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Cys(BOC) Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-V Pro-NII2 100 mg N-Hydroxysuccinimid,120 mg Dicyclo  hexylcarbodiimid und 6 ml Dimethylformamid werden 3 Stunden bei   45"    gerührt. Dann giesst man die Mischung in 300 ml Äther und filtriert den Niederschlag ab. Man reinigt das Rohprodukt durch Gegenstromverteilung im System Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff   11: 3: 6: 7; (Puffer wie in Beispiel 1); K = 0,7.   



   Das als Ausgangsmaterial verwendete Dekapeptid wird wie im britischen Patent Nr. 1 287 601 für das entsprechende Met8-Dekapeptid beschrieben hergestellt. Man geht von H-Leu-Gly-OMe aus, setzt mit Z-Leucin-N-Hydroxysuccinimidester um, hydriert das erhaltene Z-Leu-Leu-Gly-OMe, kondensiert das H-Leu-Leu-Gly-OMe, HCI mit TRI-Cys (TRI)-OH wie unter 9) in Beispiel 1 des genannten britischen Patentes beschrieben und verfährt mit dem erhaltenen Tetrapeptidderivat analog wie in dem genannten Patent unter 10 bis 18 beschrieben.



   Beispiel 4
EMI26.1     
   Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-   
Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 (Nva8-Calci tonin M).
EMI26.2     




  Nva-Leu-Gly-Thr(tBu) -Tyr(tBu)   -Thr(tBu)-(iln -Asp    (OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC) -Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 werden mit 0,2 ml 95 %iger Trifluoressigsäure versetzt und 1 Stunde bei   30     stehengelassen. Hierauf gibt man 5 ml Äther zu, zentrifugiert die Fällung ab, wäscht sie mit wenig Äther und trocknet sie. Das als trifluoressigsaures Salz erhaltene Dotriacontapeptidamid kann durch Ionenaustauscher in das Acetat übergeführt werden.



   Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden: 1. Z-Nva-Leu-Gly-OMe:
Man versetzt 4,3 g   Z-L-Nva-2,4,5-trichlorphenylester    (J. chem. Soc. (c) 1968, 715) und 2,2 g H-Leu-Gly-OMe mit 15 ml Dimethylformamid und rührt das Reaktionsgemisch 48 Stunden bei   35"    Dann verdünnt man mit viel Chloroform, kühlt in Eis und schüttelt dreimal mit 5 %iger eiskalter Kaliumcarbonatlösung und dreimal mit Eis-Wasser.



  Die Chloroformlösung wird mit Natriumsulfat getrocknet und dann zur Trockne eingedampft, zuletzt bei 0,1 mm Hg zur Entfernung des restlichen Dimethylformamids. Dann löst man den Rückstand in Chloroform und chromatographiert an einer in Chloroform bereiteten Säule von Silicagel, wobei man zur Elution einer linearen gradierten Chloroform Chloroform + Methanol   (1:1)    (je 1 Liter) verwendet. Man sammelt Fraktionen zu 100 ml, dampft zur Trockne ein und prüft die Reinheit des Rückstandes durch Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatten und vereinigt die reinen Fraktionen. Das Produkt weist in Toluol-Aceton   (1:1)    Rf = 0,4 auf.



  2. H-Nva-Leu-Gly-OMe
1,7 g des obigen Tripeptids werden in Methanol gelöst und unter intensivem Rühren in Gegenwart von 400 mg Palladiumkohle (10% Pd) hydriert. Nach Beendigung der Wasserstoffaufnahme filtriert man vom Katalysator ab und dampft das Eluat zur Trockne ein. Man erhält ein farbloses Harz, das direkt zur weiteren Umsetzung verwendet wird.



  3. TRI-Cys(TRI)-Nva-Leu-Gly-OMe
Man versetzt 2,5 g TRI-Cys(TRI)-OH und 1,1 g des obigen H-Nva-Leu-Gly-OMe mit 40 ml Acetonitril und gibt dann unter Rühren 1,3 g Dicyclohexylcarbodiimid zu. Nach 20 Stunden Rühren bei   27     nutscht man von dem ausgeschiedenen Produkt ab und extrahiert dieses mit 1 Liter Chloroform. Dann dampft man das Eluat zur Trockne ein und zerreibt den Rückstand mit Petroläther. Nach Abgiessen der Petroläther-Lösung wird unlösliches Produkt getrocknet und zur Reinigung 3 ml aus Petroläther umgefällt. Man erhält das Tetrapeptidderivat als amorphes, festes Pulver. Es zeigt bei Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatten Rf = 0,62 in Chloroform-Methanol (98 :2).



  4. H-Cys(TRI)-Nva-Leu-Gly-OMe
980 mg TRI-Cys(TRI)-Nva-Leu-Gly-OMe werden bei   30     in 25 ml   75 %iger    Essigsäure gelöst und 1 Stunde stehengelassen. Dann wird zur Trockne eingedampft und der Rückstand mehrmals mit Äther zerrieben. Das in Äther unlösliche Acetat von H-Cys(TRI)-Nva-Leu-Gly-OMe wird im Vakuum bei   35     getrocknet und direkt weiterverarbeitet.



  5.   DPC-Ser(tBu) -Thr(tBu)-Cys(TRI)-Nva-Leu-Gly-OMe   
Man löst 750 mg DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-NHNH2 in 6 ml Dimethylformamid, kühlt   auf 200    und fügt 3,5 ml   1n    Chlorwasserstoff in Essigester zu. Dann gibt man 0,16 ml t-Butylnitrit zu und lässt das Reaktionsgemisch 15 Minuten   bei 100    stehen. Hierauf wird die   auf 100    gekühlte Lösung von 500 mg H-Cys(TRI)-Nva-Leu-Gly-OMe in 4 ml Dimethylformamid und 0,7 ml Triäthylamin zugegeben und 30 Minuten   bei 100    und 18 Stunden bei   0     stehengelassen.



  Dann dampft man im Hochvakuum bei   40     Badtemperatur auf ein Volumen von etwa 5 ml ein und fällt das Produkt durch Zugabe von Eiswasser aus. Nach gründlichem Zerreiben nutscht man ab, wäscht mit Eiswasser nach und trocknet das rohe Hexapeptidderivat im Exsikkator über Calciumchlorid. Zur Reinigung fällt man dreimal aus Essigester Cyclohexan um. Das Produkt zeigt bei Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatten Rf = 0,47 in Toluol-Aceton   (7:3).   



  6. H-S er(tBu) -Thr(tBu)-Cys(TRI) -Nva-Leu-Gly-OH
Man löst 430 mg DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI) Nva-Leu-Gly-OMe in 10 ml 80%ige Essigsäure, lässt 7 Stunden bei   28"    stehen, dampft am Rotationsverdampfer bei   35"    Badtemperatur zur Trockne ein, trocknet 3 Stunden bei    35     und 0,01 Torr, löst dann in 30 ml Methanol gibt 3 ml
1,0n Natronlauge zu, rührt 1 Stunde bei   28 ,    gibt dann 2 ml Eisessig zu und dampft am Rotationsverdampfer bei   35     Badtemperatur zur Trockne ein. Man zerreibt den Rückstand mit Eiswasser, wobei man den pH-Wert auf 6-7 einstellt, nutscht ab und wäscht mit Eiswasser nach und trocknet im Exsikkator über Calciumchlorid.



   7. BOC-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-S er(tBu) -Thr(tBu) -Cys  (TRI) -Nva-Leu-Gly-OH
Man versetzt 270 mg   BOC-Cys(TRI) -Gly-Asn-Leu-   
NH-NH2 mit 4 ml Dimethylformamid, kühlt auf   -20"    ab und fügt 1,2 ml   1n    Chlorwasserstoff in Essigester zu. Dann gibt man 0,044 ml t-Butylnitrit zu und lässt 15 Minuten bei   -10"    stehen. Hernach gibt man eine auf   -10"    gekühlte Lösung von 230 mg H-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI) -Nva-Leu
Gly-OH in 4 ml Dimethylformamid, 1 ml Wasser und
0,25 ml Triäthylamin zu. Man lässt 18 Stunden bei   0     stehen, dampft dann bei 0,01 Torr. und 35  Badtemperatur auf ein kleines Volumen ein und fällt das Decapeptid durch Zugabe von Wasser aus. Man zerreibt die Fällung, nutscht ab und trocknet über Calciumchlorid im Exsikkator. 

  Das Pulver suspendiert man in 7 ml Methanol bei   0 ,    zerreibt gründlich und nutscht dann ab.  
EMI27.1     




   Leu-Gly-OH
Man löst 105 mg des unter 7 erhaltenen Decapeptids in 20 ml Dimethylformamid und tropft diese Lösung im Verlauf von 1 Stunde in die heftig gerührte Lösung von 150 mg Jod in 100 ml Methanol. Man rührt 1 Stunde weiter, entfärbt dann bei   0     durch Zugabe von   1n    Natriumthiosulfatlösung, dampft hierauf am Rotationsverdampfer auf ein Volumen von etwa 20 ml ein und fällt durch Zugabe von 300 ml Äther aus.



  Man nutscht ab, trocknet im Vakuum bei   30    und zerreibt dann das Pulver mit Wasser. Man nutscht ab und trocknet im Exsikkator über Calciumchlorid.



  9. Z-Asp(OtBu)-Phe-OCH3
30,3 g Z-Asp(OtBu)-ONP und 18,3 g H-Phe-OCH3, HCI werden zusammen in 150 ml Dimethylformamid gelöst, und zu der klaren Lösung 11,8 ml Triäthylamin zugetropft.



  Die entstandene Suspension wird 20 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt, wobei sie sich tiefgelb färbt. Anschliessend wird im Vakuum auf etwa 100 ml eingeengt und in 1 Liter Essigester/Chloroform (4 :1) dreimal mit   5%iger    Zitronensäure, 19 ml mit etwa 2n Natriumcarbonat und mit gesättigter Kochsalzlösung bis zur neutralen Reaktion ausgeschüttelt. Das Rohprodukt, ein gelbes Öl, wird in Äther mit Aktivkohle behandelt und nach Animpfen aus 650 ml Äther/Hexan (1:1) im Kühlschrank kristallisiert. Es bilden sich farblose Nadeln vom F.   74,5-76,5 . Im    Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist der Rf-Wert im System Chloroform-Methanol   (95 :5)    = 0,74 in Chloroform-Aceton (75:27) = 0,65.



  10. H-Asp(tBu)-Phe-OCH3
48,6 g Z-Asp(OtBu)-Phe-OCH3 werden in 700 ml Methanol nach Zusatz von 33,5 ml 3n Chlorwasserstoff in Dioxan und 5 g   10%igem    Palladiumkatalysator auf Kohle   in    der Schüttelente bei Raumtemperatur decarbobenzoxyliert.



  Nach Beendigung der Wasserstoffaufnahme wird filtriert und eingedampft. Man erhält 38,7 g eines weissen Schaums. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel in Chloroform Methanol   (9:1) ist    Rf = 0,60; in Chloroform-Aceton   (1:1)    ist Rf = 0,58;   Rfl02E    = 0,42. Das Produkt wird ohne weitere Reinigung zur nachfolgenden Kondensation eingesetzt.



  11.   Z-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OCH3   
38,6 g des erhaltenen H-Asp(OtBu)-Phe-OCH3, HCI werden mit 42,0 g Z-Gln-ONP in 170 ml Dimethylformamid zu einer klaren, leicht gelben Lösung gelöst und unter Rühren mit 13,9 ml Triäthylamin langsam versetzt. Es entsteht eine orange Suspension, die 24 Stunden bei   30-35     Badtemperatur gerührt wird. Während dieser Zeit gibt man weitere 40 ml Dimethylformamid und ausserdem noch 1,39 ml Tri äthylamin zu.



   Zur Aufarbeitung wird der Ansatz in 4 Litern Chloroform gelöst und in einer 20stufigen Gegenstromverteilapparatur (Phasenvolumen: untere Phase 400 ml, obere Phase 200   rr.l    pro Gefäss) nacheinander mit 1 Liter 5 %iger Zitronensäurelösung, 400 ml gesättigter Kochsalzlösung, 6 Liter etwa 2n Soda und 2,8 Liter gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Nach dem Trocknen und Eindampfen kristallisiert das Tripeptidderivat aus 1,8 1 Äthanol im Kühlschrank langsam aus. Man erhält Z-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OCH3 vom F.   1861880.   



   Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel werden folgende Rf-Werte erhalten: in Chloroform-Methanol   (9:1):    Rf=0,39; in Chloroform-Aceton (1:1): Rf=0,24 ; Rf102E  = 0,69, Rf89 = 0,46, Rf43A = 0,65 [a]D20 =-28    #    1  (c =   1,3%    in Dimethylformamid).



   12. H-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OCH3
7,55 g Z-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OCH3 werden in 400 ml Methanol gelöst, mit 4,1 ml 3n Chlorwasserstoff in Dioxan versetzt und in Gegenwart von 2 g Palladiumkohle (10% Pd) hydriert. Nach Abnutschen des Katalysators und Eindampfen erhält man H-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OCH3, HCI in Form eines farblosen Schaums. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel werden folgende Rf-Werte erhalten: in Chloro   form-Methanol (9: 1);    Rf = 0,13; in Chloroform-Aceton   (25:75):    Rf = 0,14; Rf102E = 0,22.



   13.   Z-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OCH3   
Die gesamte Menge des Hydrochlorids von 12 wird zusammen mit 7,4 g Z-Thr(tBu)-OSU in 14 ml Dimethylformamid bei Zimmertemperatur gelöst, und zu dieser Lösung werden unter Kühlung im Eisbad 1,72 ml Triäthylamin getropft. Anschliessend wird die bräunliche Suspension 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach üblicher Aufarbeitung in viel Essigester (je dreimaliges Waschen mit   5 %iger    Zitronensäure und etwa 2n Natriumcarbonat, Neutralwaschen mit gesättigter Koch salzlösung, Trocknen über Natriumsulfat und Eindampfen im Vakuum bei   30-40 )    wird das Rohprodukt in Äthanol mit Aktivkohle behandelt und aus 90 ml Äthanol im Kühlschrank kristallisiert. F.   155-161".   



   Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel werden folgende Rf-Werte gefunden: in Chloroform-Methanol   (9:1):    Rf = 0,52; in Cyclohexan-Aceton   (3:7):    Rf = 0,48; Rf89 = 0,48,   Rf12lA    = 0,76;   [aj¯20    =-4    +0,5    (c = 2,3% in Dimethyllormamid).



   14. H-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OCH3
478 mg Z-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OCH3 werden in 150 ml Methanol mit 100 mg Palladiumkohle (10%ig) bei Raumtemperatur neutral hydriert. Man erhält 395 mg eines farblosen Schaums von H-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe OCH3, der ohne weitere Reinigung für die folgende Kondensation verwendet wird.



   Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel werden folgende Rf-Werte erhalten: in Chloroform-Methanol   (1:1):    Rf = 0,75; in Chloroform-Methanol   (9:1):    Rf = 0,17; in Aceton Rf = 0,18; Rf102E = 0,23; Rf89 = 0,12.



   15. Z-Tyr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OCH3
687 mg Z-Tyr(tBu)-OH-Dicyclohexylammoniumsalz werden in Chloroform mit wässeriger Zitronensäure ausgeschüttelt, und die erhaltene freie Säure, ein klares Öl, wird in 6,5 ml Tetrahydrofuran mit 0,139 ml N-Methylmorpholin versetzt. Bei   -22     gibt man 0,170 ml Chlorameisensäureisobutylester zu und rührt eine halbe Stunde bei -22 bis   -10".    Dann lässt man das oben beschriebene H-Thr(tBu) Gln-Asp(OtBu)-Phe-OCH3 in 15 ml Tetrahydrofuran gelöst und vorgekühlt zutropfen und spült mit 5 ml desselben Lösungsmittels. Nach 1/2 Stunde   bei 100    rührt man noch 15 Stunden bei Raumtemperatur. Nachher wird am Vakuum eingeengt und in Essigester wie üblich aufgearbeitet (vgl.

 

  13). Das Rohprodukt wird in 15 ml Essigester gelöst, mit 40 ml Äther gefällt und anschliessend aus Methanol im Kühlschrank kristallisiert. Kurze, dicke Nadeln, die beim Trocknen am Hochvakuum bei   50     verwittern. F.   169-173 .   



   Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel werden folgende Rf-Werte erhalten: in Chloroform-Methanol   (9 :1)    Rf = 0,46; in Chloroform-Methanol (1:1) Rf = 0,95; in Chloroform-Aceton (1:1) Rf = 0,44: Rf89 =   0,61; RfAcetOn    = 0,68, Rf102E = 0,73: [a]D21 = -54    #   0,5  (c=2,0% in Dimethylfomamid).



  16. H-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OCH3
2,36 g Z-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe OCH3 werden in 450 ml Methanol mit 500 mg   10 %iger    Pal  ladiumkohle wie üblich bei Zimmertemperatur hydriert. Man erhält einen farblosen Schaum, der dünnschichtchromatographisch einheitlich ist und als solcher weiterverwendet wird.



  Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel werden folgende
Rf-Werte erhalten: in Chloroforom-Methanol (95:5)
Rf = 0,22;   Rf89    = 0,42.



   17.   Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-       Phe-OCH3   
Das Produkt von 16 wird zusammen mit 1,48 g Z-Thr  (tBu)-OSU in 3 ml Dimethylformamid gelöst und 21 Stun den bei Zimmertemperatur gerührt. Nach Verdünnen der
Reaktionslösung mit viel Essigester wird wie üblich aufgear beitet (vgl. 13). Das Rohprodukt wird in 30 ml Essigester
Methanol (9:1) warm gelöst und nach Kühlen im Eisbad mit
80 ml Äther gefällt. Man erhält das Produkt als farbloses, amorphes Pulver vom F.   146-148".    Im Dünnschichtchroma togramm an Silicagel werden folgende Rf-Werte erhalten: in Chloroform-Methanol   (9:1):    Rf = 0,55; in Chloroform    Aceton(1:1):Rf=0,60;Rf89      = 0,43; [a]D21    =   +6+0,5      (c = 2,0 in Dimethylformamid).



   18.   Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-   
Phe-NH-NH2    1,91 g Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu) -Thr(tBu)-Gln-Asp     (OtBu)-Phe-OCH3 werden in 80 ml Methanol gelöst und mit
8 ml Hydrazinhydrat vermischt. Nach 22 Stunden Stehenlas sen bei Zimmertemperatur wird das ausgefallene Produkt iso liert und am Hochvakuum bei   60     getrocknet. Man erhält das mikrokristalline Hydrazid vom F.   226-229"    (Zerset zung).



   Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel werden fol gende Rf-Werte gefunden: In Chloroform-Methanol (9:1)
Rf = 0,32; in Cyclohexan-Aceton (3:7) Rf = 0,23; Rf89 =
0,34.   [a]D20    =   +4  + 1     (c = 1,0 in Dimethylformamid).



   19. Z-Lys(BOC)-Phe-OMe
25,0 g Z-Lys(BOC)-ONP und 10,7 g H-Phe-OMe, HCI in 70 ml Dimethylformamid werden unter Rühren bei Raum temperatur mit 6,9 ml Triäthylamin versetzt und noch
18 Stunden gerührt. Nach Verdünnen mit Essigester wird mit Kaliumcarbonatlösung Nitrophenol-frei gewaschen, mit
0,1m Zitronensäure und Wasser ausgeschüttelt, über Na triumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trokcne einge dampft. Aus Essigester-Hexan kristallisiert das geschützte Dipeptidvom   F. 78800. Rf    = 0,45 im Dünnschichtchromato gramm auf Silicagel im System Chloroform-Aceton   (8 : 2).   



   20.   Z-Lys(BOC)-Phe-NH-NH2   
27 g des obigen Dipeptidmethylesters werden in 135 ml warmem Methanol gelöst, bei Raumtemperatur mit 25 ml Hydrazinhydrat versetzt und 16 Stunden stehengelassen.



   Das Kristallisat wird mit 135 ml Wasser versetzt, abgenutscht und gut mit Wasser gewaschen. F.   173-174"    nach Umkri stallisieren aus Methanol-Wasser. Rf = 0,3 im Dünnschicht chromatogramm auf Silicagel im System Chloroform-Methanol   5).   



  21. Z-Lys(BOC)-Phe-His-OMe
5,4 g   Z-Lys(BOC)-Phe-NH-NH2    in 40 ml Dimethylformamid werden bei   -16"    mit 6,8 ml 3,66n HCI in Dioxan und dann mit 1,5 ml t-Butylnitrit versetzt. Nach 10 Minuten bei   -10"    bis   -15"    werden 3,5 ml Triäthylamin zugegeben.



  3,64 g H-His-OMe, 2   HC1    werden fest zugesetzt, anschliessend 4,2 ml Triäthylamin zugetropft. Man lässt innert 1 Stunde auf   0     erwärmen, wobei durch Zugabe von insgesamt 0,8 ml Triäthylamin ein pH von etwa 7 eingestellt wird.



  Nach Rühren über Nacht bei   0     wird in 250 ml Wasser gegossen und das schmierige Produkt durch Zerreiben mit Wasser pulvrig gewonnen. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel in Chloroform-Methanol (9:1) ist Rf = 0,4.



   22. H-Lys(BOC)-Phe-His-OMe
6,8 g Z-Lys(BOC)-Phe-His-OMe in 140 ml Methanol werden in Gegenwart von 1 g   10%iger    Pd-Kohle hydriert.



  Nach beendigter Hydrierung wird der Katalysator abfiltriert, das Filtrat zur Trockne eingedampft und der Rückstand sofort weiterverarbeitet.



   23. Z-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-OMe
5,4 g H-Lys(BOC)-Phe-His-OMe und 4,5 g Z-Asn
ONP werden in 20 ml Dimethylformamid 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Durch Zugabe von Essigester wird das Peptidderivat ausgefällt, abfiltriert und mit Äther gew schen. Nach Umkristallisieren aus Methanol schmilzt das
Produkt bei 182-183 . Im Dünnschichtchromatogramm ist
Rf100 = 0,57 (an Silicagel).   [&alpha;]D20   = -28  (c = 1 in Dimethylformamid).



   24. Z-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-NH-NH2
3,97 g Z-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-OMe werden in 8 ml warmem Dimethylformamid und 12 ml Methanol gelöst. Zu der noch etwa   30     warmen Lösung werden 2,5 ml Hydrazin hydrat zugesetzt und es wird während 20 Stunden bei Raum temperatur stehengelassen. Durch Zugabe von Wasser wird das Peptidhydrazid ausgefällt, abfiltriert und mit Wasser
Hydrazin-frei gewaschen. Das Produkt wird aus Äthanol umkristallisiert, F. =   200-201".    Im Dünnschichtchromato gramm an Silicagel ist   Rf43C    = 0,5.



   25. H-Phe-Pro-OH
Z-Phe-Pro-OH wird durch katalytische Reduktion  (Pd-Kohle) in Methanol-Wasser (4:1) in das freie Dipeptid  übergeführt. Dieses wird nach Einengen der vom Katalysator befreiten Hydrierlösung auf ein kleines Volumen durch Zu gabe von Aceton kristallisiert erhalten, und zwar als Dipeptid
Monohydrat vom F. 125-128.



   26. Z-Thr(tBu)-Phe-Pro-OH
20,2 g Z-Thr(tBu)-OSU, 13,3 g H-Phe-Pro-OH (Mono hydrat) und 6,54 ml Triäthylamin werden in 80 ml Dimethyl formamid gelöst, über Nacht bei etwa   20     stehengelassen und dann im Hochvakuum bis zur Bildung einer klebrigen Masse konzentriert. Diese wird in 500 ml Essigester gelöst und fünf mal mit je 100 ml 5 %iger Weinsäurelösung und anschliessend bis zur Neutralität mit Wasser gewaschen. Die organische
Phase wird zur Trockne eingeengt und der zurückbleibende feste Schaum pulverisiert und im Hochvakuum bei   40     ge trocknet.

  Durch zweimaliges Umfällen aus Essigester-Petrol  äther erhält man 13,3 g amorphes, chromatographisch reines
Tripeptidderivat mit unscharfem Schmelzbereich bei etwa    75-85".    Im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel ist    Rf115    = 0,68;   Rfl2lA    = 0,57.

 

   27. Z-Ile-Gly-OMe
2,23 g Z-Ile-OH-dicyclohexylammoniumsalz werden in
Essigester suspendiert und mit 0,2m Zitronensäure angesäuerst. Die erhaltene Essigester-Lösung wird neutral gewaschen, getrocknet und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in 15 ml Acetonitril gelöst, zu der Lösung werden
750 mg H-Gly-OMc, HCl zugegcben und bei 0  unter Rüh ren 0,84 ml Triäthylamin. Nach 10 Minuten gibt man 1,24 g
Dicyclohexylcarbodiimid zu und rührt über Nacht bei   0".    Die
Fällung wird abfiltriert und das Filtrat wird zur Trockene ein gedampft, der Rückstand in 30 ml Essigester aufgenommen und filtriert. Die Essigesterlösung wird mit 0,2m Zitronen  säure und gesättigter Natriumbicarbonatlösung gewaschen, getrocknet und im Vakuum auf etwa 10 ml eingeengt.

  Nach Zugabe von 25 ml Hexan kristallisiert das geschützte Dipeptid aus, F.   120-122".    Rf = 0,53 im System Chloroform Methanol   (95 :5)    im Dünnschichtchromatogramm auf Slicagel.



  28. H-Ile-Gly-OMe
3,36 g Z-Ile-Gly-OMe werden in 100 ml Methanol und 10 ml   1n    Salzsäure gelöst und in Gegenwart von 0,5 g Pd-Kohle (10%) hydriert. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Lösungsmittel vollständig verdampft. Der erhaltene Schaum ist im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel einheitlich; Rf = 0,26 in Chloroform-Methanol (95:5).



  29. Z-Ala-Ile-Gly-OMe
2,39 g des obigen Dipeptidester-hydrochlorids und 3,78 g Z-Ala-ONP in 40 ml Dimethylformamid werden unter Rühren mit 1,4 ml Triäthylamin versetzt und die entstandene Suspension wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt.



  Nach Verdünnen mit Essigester wird mit verdünnter Kaliumcarbonatlösung Nitrophenol-frei gewaschen, anschliessend noch mit 0,1m Zitronensäure und Wasser gewaschen. Ein Teil des Tripeptidderivats bleibt während des Ausschüttelns ungelöst, es wird abfiltriert. Die Essigesterlösung wird nach dem Trocknen vollständig eingedampft. Der Rückstand besteht ebenfalls aus reinem Produkt. F.   1901910,    Rf = 0,5 im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel im System Chloroform-Methanol   (95:5).   



  30. H-Ala-Ile-Gly-OMe
2,0 g Z-Ala-Ile-Gly-OMe werden in 40 ml Methanol unter schwachem Erwärmen gelöst, dann in Gegenwart von 300 mg Pd-Kohle (10%) hydriert. Nach beendigter Hydrierung wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat vollständig zur Trockene eingedampft. Der im Dünnschichtchromatogramm einheitliche Rückstand wird sofort weiterverarbeitet.



  31. Z-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OMe
1,36 g H-Ala-Ile-Gly-OMe und 2,5 g Z-Thr(tBu)-OSU werden in 3 ml Dimethylformamid während 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Tetrapeptidderivat wird durch Äther ausgefällt, abfiltriert und mit Äther gewaschen. Nach Umkristallisieren aus Äthanol ist F. =   229-2300.    [a]D20 =   -43"    (c = 1 in Methanol). Rf = 0,55 im System Chloroform Methanol   (95 :5)    an Silicagel.



  32. H-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OMe
5,66 g der obigen Carbobenzoxyverbindung werden in 400 ml warmem Methanol gelöst und in Gegenwart von 1 g Pd-Kohle (10%) hydriert. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Methanol im Vakuum bei   40     verdampft. Der feste Rückstand wird sofort weiterverarbeitet. Rf = 0,2 im System Chloroform-Methanol (95:5) an Silicagel.



  33. Z-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OMe
4,6 g des unter 32 beschriebenen H-Thr(tBu)-Ala Ile-Gly-OMe in 30 ml Dimethylformamid werden mit 3,5 g Z-Gln-ONP versetzt und bei Raumtemperatur gerührt, bis das Gemisch fest wird. Nach Stehenlassen über Nacht wird mit Äther verdünnt, die Fällung abfiltriert und mit Äther Nitrophenol-frei gewaschen. Das geschützte Pentapeptid zeigt im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel Rf = 0,14 im System Chloroform-Methanol (95:5). F.:    > 250 .   



  34.   H-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OMe,    HCI
14,4 g des unter 33 beschriebenen Pentapeptidderivats werden in 800 ml 80%igem Methanol suspendiert und einige Zeit auf   50    erwärmt. Die Suspension wird auf Raumtemperatur gekühlt, mit 20,8 ml Salzsäure und 3 g Pd-Kohle   (10%mg)    versetzt und hydriert, bis die Wasserstoffaufnahme beendet und das Ausgangsmaterial in Lösung gegangen ist.



  Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Filtrat im Vakuum bei   40     eingedampft und der Rückstand durch zweimaliges Eindampfen mit Dimethylformamid im Hochvakuum entwässert. Der Rückstand wird ohne weitere Reinigung verwendet.   Rfloo    = 0,33 im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel.



  35.   Z-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OMe   
12,0 g des unter 34 beschriebenen Pentapeptidmethylester-hydrochlorids werden in 80 ml Dimethylformamid gelöst. Nacheinander werden unter Rühren bei Raumtemperatur 13,3 g Z-Thr(tBu)-Phe-Pro-OH und 5,75 g N-Hydroxysuccinimid zugegeben, dann bei   0     2,76 ml Triäthylamin und 6,2 g Dicyclohexylcarbodiimid. Man rührt bei   00, bis    die Mischung dick wird, dann wird über Nacht bei   0     stehengelassen. Nach Einengen im Hochvakuum auf etwa 50 ml wird das Produkt mit 300 ml Äther gefällt. Das isolierte Material wird mit 0,05m Zitronensäure und Wasser gewaschen und im Hochvakuum bei   40     getrocknet. Gereinigt wird durch Umkristallisieren aus etwa   11    Isopropanol.

  Man erhält 18,2 g des geschützten Octapeptidderivats.   Rfôg    = 0,27 im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel.



  36. Z-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OH
10,9 g-des unter 35 beschriebenen Octapeptidmethylesters werden in 190 ml 90%igem Methanol unter Erwärmen auf   70"    gelöst. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur werden 30 ml   1n    Natronlauge und 10 Minuten später 160 ml Wasser in kleinen Portionen zugefügt. Dann wird klar filtriert und aus dem Filtrat das Produkt durch Eingiessen in 600 ml 0,05n eiskalte Salzsäure gefällt. Der Niederschlag wird abfiltriert und mit Wasser neutral gewaschen. Das im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel einheitliche Produkt   (Rfloo    = 0,45) kann aus Methanol-Wasser umkristallisiert werden.



  37.   H-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OH   
3,6 g des unter 36 erhaltenen Z-Thr(tBu)-Phe-Pro Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OH werden in 100 ml 80%iger Essigsäure gelöst und die Lösung wird in Gegenwart von 0,5 g Palladiumkohle (10% Pd) hydriert. Nach beendeter Wasserstoffaufnahme nutscht man vom Katalysator ab und dampft die Lösung zur Trockne ein. Das als farbloser Firn erhaltene essigsaure Salz des Octapeptidderivats wird im Hochvakuum getrocknet. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist   Rfloo    = 0,21.



  38.   Z-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu) -Phe-Pro-Gln-   
Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OH
11,25 g Z-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-hydrazid, gelöst in 65 ml Dimethylformamid, werden bei -20   bis 250    in 2 Minuten mit 8,4 ml 4,2n Chlorwasserstoff in Dioxan versetzt. Anschliessend fügt man bei -15 bis   -20"    2,1 ml tert. Butylnitrit zu und lässt 15 Minuten bei   -15"    stehen. Nach Abkühlen auf   -20"    werden 4,8 ml Triäthylamin zugegeben, dann eine Lösung von 9,0 g des unter 37 beschriebenen Produktes in 210 ml 90%igem Dimethylformamid. Durch kräftige Kühlung hält man die Innentemperatur auf   150.   

 

  Im Laufe einer Stunde wird auf   0     erwärmt, wobei durch gelegentliche Zugabe von Triäthylamin das pH auf 7-8 gehalten wird. Insgesamt werden noch 3,5 ml Triäthylamin zugegeben. Nach Rühren über Nacht bei   0     wird in 3 1 Äther eingegossen, die flockige Fällung abfiltriert und zweimal mit Äther und einmal mit Wasser gewaschen. Das Rohprodukt  wird in 500 ml warmem Methanol gelöst und durch Eingiessen in 1,5 1   1 %ige    Essigsäure wieder ausgefällt. Das abfiltrierte und zweimal mit Wasser gewaschene Produkt wird nochmals auf gleiche Weise umgefällt.   Rftoo    = 0,33 (auf Silicagelplatten).



  39. H-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln
Thr(tBu) -Ala-Ile-Gly-OH
1,7 g des obigen geschützten Dodekapeptids werden in 100 ml 80%iger Essigsäure gelöst und in Gegenwart von 0,5 g Palladiumkohle   (10%    Pd) wie üblich hydriert. Nach Abfiltrieren vom Katalysator wird im Hochvakuum bei   30     stark eingeengt und der Rückstand mit tert.-Butanol lyophilisiert. Das in quantitativer Ausbeute erhaltene, im Dünnschichtchromatogramm   (Rfloo    = 0,1 auf Silicagel) einheitliche Produkt wird sofort wieterverarbeitet.



  40.   Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu) -Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu) -   
Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln
Thr(tBu) -Ala-Ile-Gly-OH
1,73 g des unter 18 beschriebenen Peptidderivats werden bei   50     in 10 ml Dimethylformamid gelöst. Nach Abkühlen auf   -20"    werden 0,9 ml 4,2n Chlorwasserstoff in Dioxan zugetropft. Dann gibt man   bei 150    0,22 ml tert.-Butylnitrit zu und lässt 15 Minuten   bei-15"    reagieren. Nun kühlt man wieder auf   -20"    ab und lässt 0,53 ml Triäthylamin und dann eine Lösung von 1,6 g des unter 39 beschriebenen   Peptid-    derivats in 40 ml   90%igem    Dimethylformamid zutropfen.



  Man   erhöht die    Temperatur innerhalb 1 Stunde auf   0 ,    wobei durch portionenweise Zugabe von Triäthylamin das pH auf 7-8 gehalten wird. Insgesamt werden 0,25 ml Triäthylamin zugegeben. Nach weiteren 15 Stunden Rühren bei   0     wird das Produkt durch Eingiessen in Äther gefällt, die Fällung abfiltriert und mit Äther und Wasser gewaschen. Zur Reinigung wird einmal aus Dimethylformamid-Essigester und einmal aus Dimethylformamid 0,02n Salzsäure umgefällt. Das reine Material zeigt im Dünnschichtchromatogramm auf Sili   cagel Rfloo    = 0,40.



  41. Z-Ala-Pro-NH2
2,28 g H-Pro-NH2 und 7,57 g Z-Ala-ONP werden in 20 ml Dimethylformamid gelöst und die gelbe Lösung wird
18 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Dann wird im Hochvakuum zur Trockne eingedampft, der Rückstand mit Äther versetzt und das entstehende Pulver gründlich zerrieben. Nach Abnutschen und Trocknen werden 5,5 g Z-Ala Pro-NH2 von F.   167,5-168,5"    erhalten.   [a]D20    = 740 (c = 1 in Methanol).



  42. Z-Gly-Ala-Pro-NH2
27,1 g des obigen Dipeptidderivats werden in 425 ml Äthanol gelöst und nach Zugabe von 85 ml 1,0n wässeriger Salzsäure in Gegenwart von 4,25 g Palladium-Kohle (10% Pd) hydriert. Nach beendeter Hydrierung wird die Lösung bei   40-50"    Badtemperatur im Vakuum eingedampft.



  Der Rückstand wird bei   40"    in 40 ml Dimethylformamid gelöst und die Lösung auf   20     abgekühlt. Sodann werden 29,1 g Z-Gly-ONP zugegeben und nach Lösen innerhalb 45 Minuten 11,2 ml absolutes Triäthylamin unter Rühren zugetropft. Danach wird während 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Suspension wird bei   40     und 0,01 Torr eingedampft und der Rückstand zwischen 600 ml Wasser und 300 ml Äther verteilt. Die wässerige Schicht wird zweimal mit je 300 ml Äther und die Äther-Schicht zweimal mit je 300 ml Wasser extrahiert. Die wässerigen Fraktionen werden gemeinsam im Vakuum bei   40-50     eingedampft und mehrmals durch Zugabe von Chloroform und Eindampfen von Wasser befreit.

  Der gut getrocknete Rückstand wird bei   40-50"    in 500 ml Essigester aufgenommen, unlösliches Tri äthylamin-hydrochlorid abfiltriert und das Filtrat bei 30 bis   40     mit 10 ml Äther versetzt, worauf Kristallisation eintritt.



  Nach etwa 20stündigem Stehen bei + 5 bis   + 10     werden die Kristalle isoliert, gewaschen und getrocknet. F.:   105-106 .   



  Das Produkt enthält   3 %    Triäthylamin-hydrochlorid. Es kann in dieser Form weiter umgesetzt werden. Zur Reinigung werden 5,0 g des obigen Rohkristallisats in 10 ml Wasser gelöst und nach Zugabe von 20 ml Methylenchlorid mit 15 ml gesättigter Kaliumcarbonatlösung versetzt. Die organische Schicht wird abgetrennt, mit 10 ml gesättigter Kaliumcarbonatlösung extrahiert, die wässerige Schicht wird mit 15 ml Methylenchlorid extrahiert. Die vereinigten Methylenchloridlösungen werden mittels wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird aus 50 ml Essigester kristallisiert.

  Man erhält 4,4 g Tripeptidderivat, F.   109-112".    Nach Kristallisation aus Aceton-Methanol Äther   (10:4:6)    werden Kristalle vom F.   144,5-145,5"    erhalten (Kristallpolymorphie).   [a]D20    =   -93"    (c = 1,0 in Methanol). Bei der Dünnschichtchromatographie auf Silicagel in Chloroform + Methanol (8:2) ist Rf = 0,38.



  43. H-Gly-Ala-Pro-NH2
18,8 g des unter 42 erhaltenen rohen Tripeptidamidderivates werden in 400 ml Dimethylformamid gelöst und in Gegenwart von 1,0 g Palladium-Kohle   (10So    Pd) hydriert.



  Nach beendeter Hydrierung wird filtriert und die Lösung nach kurzem Entgasen in der nächsten Stufe eingesetzt.



  44. Z-Val-Gly-Ala-Pro-NH2
Zu der unter 43 erhaltenen Lösung des Tripeptidamids (550 ml) gibt man 20,1 g Z-Val-p-Nitrophenylester und lässt das Gemisch während 18 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Danach wird bei 50   -60"    und 0,01 Torr zur Trockne eingedampft, der Rückstand mit 300 ml Äther verrieben und filtriert. Der Filterrückstand wird getrocknet und in 210 ml absolutem Äthanol während 15 Minuten bei   70-80"    gerührt, auf   0     gekühlt und filtriert. Der Rückstand wird aus einem Gemisch von 170 ml absolutem Tetrahydrofuran, 25 ml Wasser und 110 ml Äther kristallisiert. F. =   209-211".   



  Rf-Wert auf Silicagelplatten = 0,42 in Chloroform-Methanol (8:2).



  45.   H-Val-Gly-Ala-Pro-NH2   
1,1 g Z-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 werden in 50 ml 80%igem Methanol gelöst und die Lösung wird in Gegenwart von 0,3 g Palladium-Kohle   (10So    Pd) hydriert. Nach Beendigung der Wasserstoffaufnahme wird vom Katalysator abgenutscht, die Lösung eingedampft und der Rückstand im Hochvakuum bei   35     Badtemperatur getrocknet. Dabei wird das Tetrapeptid H-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 als farblose Substanz erhalten, Rf-Wert = 0,20 (Silicagelplatten, System Chloroform Methanol= 1:1).

 

  46.   Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-       Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-
Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2   
800 mg des unter 40 beschriebenen Peptidderivats, 500 mg H-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 und 170 mg N-Hydroxysuccinimid werden in 10 ml Dimethylformamid gelöst, im Hochvakuum auf etwa die Hälfte eingeengt und mit 250 mg Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wird mit Äther ausgefällt und das Material isoliert. Gereinigt wird durch Craig-Verteilung im Gemisch Methanol-Puffer (wie in Beispiel 1) -Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (10:3:5:6), K = 0,29. Das aus der Verteilung isolierte reine Produkt zeigt im Dünnschichtchromatogramm   Rf1o7    = 0,62 (auf Silicagelplatten).  



  47.   H-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-   
Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln
Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2
300 mg des obigen Peptidderivats werden in 30 ml   80%iger    Essigsäure gelöst und in Gegenwart von 100   mg    Palladiumkohle (10% Pd) hydriert. Nach vollständiger Decarbobenzoxylierung wird der Katalysator abfiltriert, das Filtrat im Hochvakuum bei   30     stark eingeengt und der Rückstand aus tert.-Butanol lyophilisiert. Der Rückstand wird in 10 ml Methanol gelöst, durch Zugabe von in Natriumbicarbonat schwach alkalisch gemacht und durch Eintropfen in 0,1n Natriumcarbonat ausgefällt. Das isolierte Produkt wird nochmals gleich umgefällt.

  Im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel ist   Rfloo    = 0,34.
EMI31.1     
 Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp (OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2
EMI31.2     
   Nva-Leu-Gly-OH, 35    mg H-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)
Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-His-Phe-Thr (tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala   Pro-NH2, 7    mg N-Hydroxysuccinimid, 8 mg Dicyclohexylcarbodiimid und 0,5 ml Dimethylformamid werden 4 Stunden bei   45"    gerührt. Dann gibt man 15 ml Äther zu und nutscht die feine Fällung ab.

  Zur Reinigung verteilt man das Rohprodukt   multipflkativ    über 35 Stufen im Lösungsmittelsystem Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff   (11:3:      6 :7;    Puffer wie in Beispiel 1.



      Reieniel S   
EMI31.3     
   Thr-Gln-Asp-Phe-Asn -Lys-Phe-His-Thr -Phe-Pro-Gln-Thr-   
EMI31.4     
   Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)    -Phe-Asn-Lys(BOC) Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly Val-Gly-Ala-Pro-NH2 in 50 ml eiskalte, konzentrierte Salzsäure ein, rührt 10 Minuten bei   0 ,    fügt dann 300 ml eiskalte,   10%ige    Essigsäure zu und filtriert über eine Säule von Merck Ionenaustauscher Nr. II, Acetatform. Dann dampft man die Lösung am Rotationsverdampfer bei   40     Badtemperatur unter Zusatz von n-Octanol ein, wäscht den Eindampfrückstand zur Entfernung von n-Octanol mit Petroläther, trocknet bei   40 ,    löst in Wasser und lyophilisiert.

  Man erhält das Dotriacontapeptidamid als fast farbloses, leichtes Pulver.



   Das   AusPansmateriai    stellt man   w1e      folgt    dar   20      v   
EMI31.5     
   Gly-OH, 3,2    g   H-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp-      (OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro      Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2    und 500 mg N-Hydroxysuccinimid werden mit 35 ml Dimethylformamid versetzt. Dann fügt man unter Rühren eine Lösung von 600 mg Dicyclohexylcarbodiimid in 5 ml Dimethylformamid zu und rührt weitere 4 Stunden bei   45".    Hierauf kühlt man auf   0     ab und trägt die Reaktionsmasse in 600 ml Äther ein.

  Man lässt 3 Stunden bei   0     stehen, nutscht dann ab und trocknet das Rohprodukt im Vakuum bei   35".    Zur Reinigung versetzt man es mit Methanol, filtriert in etwas Dicyclohexylharnstoff ab und chromatographiert an einer in Methanol bereiteten Säule von Sephadex LH-20 (4,8 cm; 120 cm).



  Man fängt Fraktionen zu 20 ml auf, dampft zur Trockne ein und evaluiert die Reinheit der Fraktionen durch Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatten im System 52A und 100. Die reinen Fraktionen werden vereinigt.



   Das als Ausgangsmaterial verwendete Dekapeptidderivat wird z. B. wie folgt dargestellt:
Man kondensiert Z-Abu-OH nach der gemischten An   hydridmethode    (gemischtes Anhydrid mit Pivaloylchlorid) mit H-Leu-Gly-OMe, hydriert das nach Chromatographie an Silicagel gereinigte Tripeptidderivat Z-Abu-Leu-Gly-OMe zu H-Abu-Leu-Gly-OMe und verfährt dann analog wie für   H-Met-Leu-GIy-OMe    im britischen Patent Nr. 1 287 601 in Beispiel 1 unter 9 bis 18 beschrieben.



   Beispiel 6
EMI31.6     

Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr
Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 (Val8-Calcitonin M).



   Man löst 12 mg H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 in 10 ml Wasser, stellt die erhaltene Lösung durch Zugabe etwa 2n wässerigem Ammoniak auf pH = 6,5 ein und leitet solange Luft durch die Lösung, bis mit Natriumnitroprussidreagens keine freien SH-Gruppen mehr nachweisbar sind. Dann säuert man mit verdünnter Essigsäure auf pH = 4 an und lyophilisiert die Lösung. Man befreit den Rückstand vom Ammoniumacetat durch Trocknen bei   40     und 0,01 mm Hg und erhält so nahezu reines Val8-Calcitonin M.



   Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist   Rf6 =    0,45; an Aluminiumoxid ist   Ruf52    = 0,53;   Rf45    = 0,42.



   Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden: 1.   BOC-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys     (TRI)-Val-Leu-Gly-Thr(tBU)-Tyr(tBu) -Thr(tBu)
Gln-Asp(OtBu) -Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr  (tBu) -Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly
Ala-Pro-NH2
30 mg BOC-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr (tBu)-Cys(TRI)-Val-Leu-Gly-OH, 10 mg N-Hydroxysucciniimid, 50 mg H-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu) -Gln Asp(OtBu)   -Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)    -Phe   Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2    und 1 ml Dimethylformamid werden bei   50     1 Stunde gerührt.



  Dann gibt man eine Lösung von 15 mg Dicyclohexylcarbodiimid in 0,2 ml Dimethylformamid zu und rührt 6 Stunden bei   4045 .    Dann trägt man in 15 ml Äther ein, lässt 5 Stunden bei   0     stehen und filtriert den Niederschlag ab. Zur Reinigung suspendiert man das getrocknete, fein pulverisierte Rohprodukt in 3 ml eiskaltem Methanol, rührt 2 Stunden und zentrifugiert das schwerlösliche, geschützte Dotriacontapeptidamid ab. Man wiederholt den Vorgang, und trocknet das gereinigte Dotriacontapeptid im Vakuumexsikkator über Calciumchlorid.



   Im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel ist   Rfzoo    = 0,54; Rf52A = 0,61.

 

  2. H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Thr-Tyr
Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln
Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2
19 mg BOC-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr   (tBu)-Cys(TRI)-Val-Leu-Gly-ThrtBu)-Tyr(tBu)-Thr    (tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr   (tBu)-Phe-Prn-Gln-Thr(tBu)-Ala-fle-Gly-Val-Gly-Ala-    Pro-NH2 werden in 0,3 ml   95%iger    Trifluoressigsäure gelöst und 60 Minuten bei   25     stehengelassen. Dann kühlt man auf   0     und giesst in ein eiskaltes Gemisch von 10 ml Wasser und 3 ml Pyridin. Man filtriert unter Stickstoff, wäscht die wässerige Phase mit 10 ml Essigester, versetzt sie hierauf mit 0,5 ml Essigsäure und filtriert unter Stickstoff über eine Säule von Merck-Ionenaustauscher Nr. II (schwach basisch,   Acetatform).

  Das Eluat dampft man am Rotationsverdampfer bei 40  Badtemperatur zur Trockne ein und befreit den Rückstand vom Pyridinacetat durch Trocknen bei   40     und 0,01 mm Hg.



   PATENTANSPRUCH 1
Verfahren zur Herstellung neuer Peptide der Formel I
EMI32.1     
 Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr   Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2    worin R für Wasserstoff, einen freien oder acylierten Aminorest und X für den Valin-, Norvalin-, Leucin-, Isoleucin-, Norleucin- oder a-Aminobuttersäurerest steht, und entsprechender Verbindungen, in welchen einer oder mehrere der Asparagin- und Glutaminreste durch den Asparaginsäurebzw. Glutaminsäurerest und/oder der Asparaginsäurerest durch den Asparaginrest ersetzt sind, und ihrer Säureadditionssalze, dadurch gekennzeichnet, dass man in beliebiger zeitlicher Reihenfolge die entsprechenden Säuren bzw.



  deren aktivierten Derivate unter intermediärem Schutz von von der Reaktion auszuschliessenden reaktiven funktionellen Gruppen und unter Bildung der Disulfidbrücke aus den beiden Mercaptogruppen durch Oxydation kondensiert und die endständige Carboxylgruppe amidiert.



   UNTERANSPRÜCHE
1. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man von der Reaktion auszuschliessende Carboxylgruppen durch die tert.-Butylgruppe schützt.



   2. Verfahren nach Patentanspruch I und Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man von der Reaktion auszuschliessende Aminogruppen durch die tert.-Butyloxycarbonylgruppe schützt.



   3. Verfahren nach Patentanspruch I und Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man von der Reaktion auszuschliessende Hydroxylgruppen in den Seitenketten durch die tert.-Butylgruppe schützt.



   4. Verfahren nach Patentanspruch I oder Unteransprüchen 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der Formel I herstellt, worin   R    für Wasserstoff steht und X die angegebene Bedeutung hat.



   5. Verfahren nach Patentanspruch I oder Unteransprüchen 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass man das Dotriacontapeptidamid der Formel
EMI32.2     
   Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala- Ile,Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2    worin X für den Valin-, Norvalin-, Leucin-, Isoleucin-, Norleucin- oder a-Aminobuttersäurerest steht, oder seine Säureadditionssalze herstellt.



   6. Verfahren nach Patentanspruch I oder Unteransprüchen 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass man das   Dotriacontanentidamid    der   Format   
EMI32.3     
   Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr- Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro -NH2    oder seine Säureadditionssalze herstellt.



   7. Verfahren nach Patentanspruch I oder Unteransprüchen 1. 2 oder dadurch # diese
EMI32.4     
   Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln- Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH,    worin X für den Valin-, Norvalin-, Leucin-, Isoleucin-, Norleucin- oder a-Aminobuttersäurerest steht, oder seine Säureadditionssalze herstellt.

 

   8. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man erhaltene Verbindungen der Formel I, worin R für eine freie Aminogruppe steht und X die angegebene Bedeutung hat,   N -acyliert.   



   PATENTANSPRUCH II
Verwendung von nach Patentanspruch I erhaltenen Peptiden zur Herstellung von schwerlöslichen Zinkkomplexen dieser Peptide, dadurch gekennzeichnet, dass man die erhaltenen Peptide in wässeriger Lösung mit einem wasserlöslichen Zinksalz und einem   Alkalimetallphosphat,    -pyrophosphat, -polyphosphat und/oder -hydroxyd umsetzt.

**WARNUNG** Ende DESC Feld konnte Anfang CLMS uberlappen**.

Claims (1)

  1. **WARNUNG** Anfang CLMS Feld konnte Ende DESC uberlappen **. Acetatform). Das Eluat dampft man am Rotationsverdampfer bei 40 Badtemperatur zur Trockne ein und befreit den Rückstand vom Pyridinacetat durch Trocknen bei 40 und 0,01 mm Hg.
    PATENTANSPRUCH 1 Verfahren zur Herstellung neuer Peptide der Formel I EMI32.1 Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 worin R für Wasserstoff, einen freien oder acylierten Aminorest und X für den Valin-, Norvalin-, Leucin-, Isoleucin-, Norleucin- oder a-Aminobuttersäurerest steht, und entsprechender Verbindungen, in welchen einer oder mehrere der Asparagin- und Glutaminreste durch den Asparaginsäurebzw. Glutaminsäurerest und/oder der Asparaginsäurerest durch den Asparaginrest ersetzt sind, und ihrer Säureadditionssalze, dadurch gekennzeichnet, dass man in beliebiger zeitlicher Reihenfolge die entsprechenden Säuren bzw.
    deren aktivierten Derivate unter intermediärem Schutz von von der Reaktion auszuschliessenden reaktiven funktionellen Gruppen und unter Bildung der Disulfidbrücke aus den beiden Mercaptogruppen durch Oxydation kondensiert und die endständige Carboxylgruppe amidiert.
    UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man von der Reaktion auszuschliessende Carboxylgruppen durch die tert.-Butylgruppe schützt.
    2. Verfahren nach Patentanspruch I und Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man von der Reaktion auszuschliessende Aminogruppen durch die tert.-Butyloxycarbonylgruppe schützt.
    3. Verfahren nach Patentanspruch I und Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man von der Reaktion auszuschliessende Hydroxylgruppen in den Seitenketten durch die tert.-Butylgruppe schützt.
    4. Verfahren nach Patentanspruch I oder Unteransprüchen 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der Formel I herstellt, worin R für Wasserstoff steht und X die angegebene Bedeutung hat.
    5. Verfahren nach Patentanspruch I oder Unteransprüchen 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass man das Dotriacontapeptidamid der Formel EMI32.2 Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala- Ile,Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 worin X für den Valin-, Norvalin-, Leucin-, Isoleucin-, Norleucin- oder a-Aminobuttersäurerest steht, oder seine Säureadditionssalze herstellt.
    6. Verfahren nach Patentanspruch I oder Unteransprüchen 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass man das Dotriacontanentidamid der Format EMI32.3 Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr- Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro -NH2 oder seine Säureadditionssalze herstellt.
    7. Verfahren nach Patentanspruch I oder Unteransprüchen 1. 2 oder dadurch # diese EMI32.4 Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln- Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH, worin X für den Valin-, Norvalin-, Leucin-, Isoleucin-, Norleucin- oder a-Aminobuttersäurerest steht, oder seine Säureadditionssalze herstellt.
    8. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man erhaltene Verbindungen der Formel I, worin R für eine freie Aminogruppe steht und X die angegebene Bedeutung hat, N -acyliert.
    PATENTANSPRUCH II Verwendung von nach Patentanspruch I erhaltenen Peptiden zur Herstellung von schwerlöslichen Zinkkomplexen dieser Peptide, dadurch gekennzeichnet, dass man die erhaltenen Peptide in wässeriger Lösung mit einem wasserlöslichen Zinksalz und einem Alkalimetallphosphat, -pyrophosphat, -polyphosphat und/oder -hydroxyd umsetzt.
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