Verfahren zur Herstellung neuer Polypeptide
Gegenstand der Erfindung ist ein VeRahren zur Herstellung eines neuen Heneikosapeptids der Formel
L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L- glutaminyl-L-histidy'1-L-phenylalanyl-L- arginyl'-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L- prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L- arginyT-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysin sowie der entsprechenden Verbindung, die statt des Glutaminylrestes den Rest der Glutaminsäure aufweist.
Die neuen Verbindungen haben eine hohe adreno corticotrope Wirksamkeit und können dementspre- chend als Heilmittel in der Human-und Veterinär- medizin verwendet werden. Ferner können sie als Zwischenprodukte zur Herstellung von Heilmitteln, die eine längere Kette von Aminosäure aufweisen, wie der adrenocorticotropen Hormone selbst, verwendet werden.
Die neuen Heneikosapeptide können nach den für die Peptidherstellung bekannten Methoden erhalten werden, wobei die Aminosäuren in der erwähnten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten verknüpft werden.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man die Aminosäuren L-Serin, L-Tyrosin, L-Serin-, L-Methionin, L-Glutamin oder LGlutaminsäure, L-Histidin, L-Phenylalanin, L Arginin. L-Trytophan, Glycin, L-Lysin, L-Prolin, L-Valin, Glycin, L-Lysin, L-Lysin, L-Arginin, L Arginin, L-Prolin, L-Valin und L-Lysin in der angegebenen Reihenfolge unter intermediärem Schutz von Aminio-bzw. Carboxylgruppen miteinander ver einigt. In den Fig. 1 und 2 sind Ausführungsformen des Verfahrens illustriert.
Für die Aminosäuren werden folgende Abkürzungen verwendet :
H-Arg-OH = L-Arginin H-Glu-OH = L-Glutaminsäure
H-Glu (NH2)-OH = L-Glutamin H-Gly-OH Glycin H-His-OH = L-Histidin
H-Lys-OH = L-Lysin H-Met-OH = L-Methionin
H-Phe-OH = L-Phenylialanin
H-Pro-OH = L-Prolin
H-Ser-OH = L-Serin
H-Try-OH = L-Tryptophan
H-Tyr-OH = L-Tyrosin
H-Val-OH = L-Valin.
BOC bedeutet eine tert.-Butyloxycarbonylgruppe.
Aille an der Reaktion nicht beteiligten, freien, funktionellen Gruppen werden zweckmässigerweise geschützt, insbesondere mittels durch Hydrolyse oder Reduktion leicht abspaltbarer Reste, die Carboxyl gruppe vorzugsweise durch Veresterung, zum Bei- spiel mit Methanol, tertiärem Butanol, Benzylalkohol (Bzy), p-Nitrobenzylalkohol (NB), die Aminogruppe beispielsweise durch Einführung des Tosyl- (= TOS), Tritylrestes (= TRI) oder der Carbobenz- oxygruppe (= Z) oder farbiger Schutzgruppen, wie der p-Phenylazo-benzyloxycarbonylgruppe (= PZ) und der p- (p'-Methoxy-phenylazo)-benzyloxycarbo- nylgruppe (= MZ)
oder insbesondere des tert. Butyloxycarbonylrestes. Zum Schutz der Aminogruppe in der Guanidogruppierung des Arginins ist die Nitrogruppe geeignet ; die genannte Aminogruppe des Arginins muss aber bei der Reakbiom nicht notwendig geschützt werden.
Die Umwandlung einer geschützten NH2-Gruppe in eine freie Gruppe sowie die Überführung einer funktionell abgewandelten Carboxylgruppe in eine freie Carboxylgruppe im Verlaufe des Verfahrens zur Herstellung der Nonadekapeptide und Zwischenprodukte kann nach an sich bekannten Methoden durch Behandlung mit hydrolysierenden bzw. reduzierenden Mitteln erfolgen.
Je nach der Arbeitsweise erhalt man die neuen Verbindungen in Form von Basen oder ihren Saiten.
Aus den Salzen können in an sich bekannter Weise die Basen gewonnen werden. Von letzteren wiederum lassen sich durch Umsetzung mit Säuren Salze ge winnen.
Die verfahrensgemäss erhaltenen Heneikosapep- tide können in Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden.
In den nachfolgenden Beispielen sind die Tem peraturen in Celsiusgraden angegeben.
EMI3.1
NHz <SEP> BO <SEP> C
<tb> H-I <SEP> Ser <SEP> Tyr <SEP> Ser <SEP> Met <SEP> Glu <SEP> His <SEP> Phe <SEP> Arg <SEP> Try <SEP> Gly <SEP> Lys <SEP> Pro <SEP> Val <SEP> Gly <SEP> Lys <SEP> Lys <SEP> Arg <SEP> Arg <SEP> Pro-OH <SEP> H-Val <SEP> Lys-OCHg
<tb> i
<tb> NHa <SEP> BOC <SEP> BOC <SEP> BOC
<tb> j
<tb> BOC-Ser <SEP> Tyr <SEP> Ser <SEP> Met <SEP> Glu <SEP> His <SEP> Phe <SEP> Arg <SEP> Try <SEP> Gly <SEP> Lys <SEP> Pro <SEP> Val <SEP> Gly <SEP> Lys <SEP> Lys <SEP> Arg <SEP> Arg <SEP> Pro-OH <SEP> <
<tb> NHa <SEP> BOC <SEP> BOC <SEP> BOC <SEP> BOC
<tb> :
<tb> BOC-Ser <SEP> Tyr <SEP> Ser <SEP> Met <SEP> Glu <SEP> His <SEP> Phe <SEP> Arg <SEP> Try <SEP> Gly <SEP> Lys <SEP> Pro <SEP> Val <SEP> Gly <SEP> Lys <SEP> Lys <SEP> Arg <SEP> Arg <SEP> Pro <SEP> Val <SEP> Lys-OCH3
<tb> t
<tb> NH2
<tb> H-Ser <SEP> Tyr <SEP> Ser <SEP> Met <SEP> Glu <SEP> His <SEP> Phe <SEP> Arg <SEP> Try <SEP> Gly <SEP> Lys <SEP> Pro <SEP> Val <SEP> Gly <SEP> Lys <SEP> Lys <SEP> Arg <SEP> Arg <SEP> Pro <SEP> Val <SEP> Lys-OCHs, <SEP> 8 <SEP> CF3COOH
<tb> i
<tb> OH
<tb> OH
<tb> i
<tb> H-Ser <SEP> Tyr <SEP> Ser <SEP> Met <SEP> Glu <SEP> His <SEP> Phe <SEP> Arg <SEP> Try <SEP> Gly <SEP> Lys <SEP> Pro <SEP> Val <SEP> Gly <SEP> Lys <SEP> Lys <SEP> Arg <SEP> Arg <SEP> Pro-OH, <SEP> 8HC1
<tb> Fig.
1
EMI4.1
(OBzy) <SEP> (OBzy) <SEP> (OBzy) <SEP> R"R'
<tb> R-Ser-Y+ <SEP> R-Tyr-Y+ <SEP> R-Ser-Y+ <SEP> R-Met-Y+ <SEP> R-Glu-Y+ <SEP> R-His-Y+ <SEP> R-Phe-Y+ <SEP> R-Arg-Y+ <SEP> R-Try-Y+ <SEP> R-Gly-X
<tb> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10
<tb> Z <SEP> Z <SEP> Z <SEP> R'R'
<tb> A <SEP> A <SEP> A <SEP> I <SEP> I
<tb> R-Lys-Y+ <SEP> R-Pro-Y+ <SEP> R-Val-Y+ <SEP> R-Gly-Y+ <SEP> R-Lys-Y+ <SEP> R-Lys-Y+ <SEP> R-Arg-Y+ <SEP> R-Arg-Y+ <SEP> R-Pro-Y <SEP> +
<tb> 11 <SEP> 12 <SEP> 13 <SEP> 14 <SEP> 15 <SEP> 16 <SEP> 17 <SEP> 18 <SEP> 19
<tb> PZ <SEP> (MZ)
<tb> i
<tb> Yal <SEP> Lys-OIIB20 <SEP> 21 <SEP> 1
<tb> (OBzy) <SEP> (OBzy) <SEP> (OBzy) <SEP> Rlf <SEP> (NHO <SEP> R'z <SEP> Z <SEP> Z <SEP> R'R'PZ <SEP> (MZ)
<tb> R-Ser <SEP> Tyr <SEP> Ser <SEP> Met <SEP> Glu <SEP> His <SEP> Phe <SEP> Arg <SEP> Try <SEP> Gly <SEP> Lys <SEP> Pro <SEP> Val <SEP> Gly <SEP> Lys <SEP> Lys <SEP> Arg <SEP> Arg <SEP> Pro <SEP> Val <SEP> Lys-ONB
<tb> (OBzy) <SEP> g <SEP> Y <SEP> Y <SEP> Y <SEP> Y <SEP> Y <SEP> Y <SEP> g <SEP> g <SEP> Y <SEP> I
<tb> (OBzy) <SEP> (OBzy) <SEP> (OBzy) <SEP> R" <SEP> (NH <SEP> R'Z <SEP> Z <SEP> Z <SEP> R'R'PZ <SEP> (MZ)
<tb> i <SEP> i <SEP> i <SEP> i <SEP> i <SEP> i <SEP> i <SEP> i <SEP> i <SEP> i <SEP> i
<tb> H, <SEP> Ser <SEP> Tyr <SEP> Ser <SEP> Met <SEP> Glu <SEP> His <SEP> Phe <SEP> Arg <SEP> Try <SEP> Gly <SEP> Lys <SEP> Pro <SEP> Val <SEP> Gly <SEP> Lys <SEP> Lys <SEP> Arg <SEP> Arg <SEP> Pro <SEP> Val <SEP> Lys-ONB
<tb> 1 <SEP> H@
-Katalyse <SEP> Elektrolyse <SEP> (fiir <SEP> R'= <SEP> N02)
<tb> (NHS)
<tb> I
<tb> H-Ser <SEP> Tyr <SEP> Ser <SEP> Met <SEP> Glu <SEP> His <SEP> Phe <SEP> Arg <SEP> Try <SEP> Gly <SEP> Lys <SEP> Pro <SEP> Val <SEP> Gly <SEP> Lys <SEP> Lys <SEP> Arg <SEP> Arg <SEP> Pro <SEP> Val <SEP> Lys-OH
<tb> R' = -NO2 oder Di-carbobenzoxy, R" = OBzy oder ONB; R = TRI, BOC, p-Methoxy-carbobenzoxy oder Phthalyl (im letzten Fall Abspaltung durch Hydrazin); Y = -OH, gemischtes oder symmetrisches Anhydrid, aktivierter Ester, Azid, aktiviertes Amid.
Fig. 2
Beispiel 1
27, 06 mg (0, 01 mMol) L-Seryl-L-tyrosyl-L- seryl-L-methionylLL-gl'utaminyl-L-histidyl-
L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl- glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valylLglycyl-L- lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-
L-prol'lin-hexaacetat (französische Patentschrift Nr. 1310 534) werden in
1 ml Wasser gelöst und mit 1 ml Dioxan und 0, 4 ml 0, ln Natronlauge versetzt. Nun wird auf 0 gskühlt.
Nach Zugabe von 8, 58 mg t-Butyloxycarbonyl-azid (0, 06 mMol) werden im Laufe von 6 Stunden 0, 6 ml 0, 1n Natronlauge in ganz kleinen Portionen unter
Rühren zugegeben. Nach weiteren 15 Stunden wird die Lösung nach Zugabe von 0, 4 ml 0, ln Salzsäure im Vakuum zur Trockene verdampft, der Rückstand in Wasser gelöst und lyophilisiert. Der gut getrocknete, farblose Rückstand wird in 1 mlt Dimethylformamid gelöst und nach Zugabe von 35, 9 mg (0, 1 mMol,
10facher Überschuss) L-Valyl-N-t-butyloxycarbonyl L-lysin-methylester auf -5 gekühlt. Diese Lösung wird mit 20, 6 mg Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und 15 Stunden aufbewahrt.
Alsdann wird die Lösung im Vakuum vorsichtig auf etwa die Hälfte eingeengt und mit 10 Liter trockenem Essigester versetzt. Dabei fällt das Henei kosapeptid-Derivat als unlösliches, farbloses Pulver aus, und die Überschüsse an Dicyclohexylcarbodi- imid und Dipeptidester gehen in Lösung. Das Pro dukt wird noch zweimal umgelöst.
Ungeachtet der kleinen Verunreinigung durch Dicyclohexylharnstoff wird die Verbindung in. 0, 5 ml Trifluoressigsäure gelöst und darin 1 Sssundebei Zimmertemperatur aufbewahrt. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird das Heneikosapeptid-Glu5 RI-amid-lys21-methylester-octa-trifluoracetat in elektro- phoretisch reiner Form gewonnen (Papierelektro- phorese bei 3000 V, pH 1, 9). Es zeigt eine be trächtliche Cofticotropin-Wirkung. Ausbeute 95 %.
Amid-und Esterfunktionen werden verseift durch Aufbewahrung in 0, ln Salzsäure-Lösung während 24 Stunden bei Zimmertemperatur, nachdem die Tri f ! uoracstatreste durch Passieren einer Säule von Ambert IR-4B (Acetat-Form) gegen Acetat Reste ausgetauscht worden waren. Durch Lyophilisieren erhält man das Heneikosapeptid in Form des s Octa-hydrochlorids, Ausbeute 84 %. Es zeigt eine grosse Corticotropin-Wirkung.
Das Dipeptidd'erivat, L-Valyl-Ns-t-butyloxycar- bonyl-L-lysin-methylester, wird'folgendermassen her- gestellt :
Carbobenzoxy-L-valin und Ne-t-Butyloxycarbo- nyl-L-lysin-methylester (vgl. französische Patentschrift Nr. 1297 720, Beispiel 3) werden im Verhältnis 2, 51 g zu 2, 60 g in 50 ml Acetonitril gelöst und bei -5 mit 2, 06 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt.
Nach 3 Stunden hat sich 90 % des erwarbeten Dicyclo hexylharnstoffs ausgeschieden. Dieser wird abfiltriert, das Filtrat wird zur Trockene verdampft, der Rückstand wird in Essigester gelöst und mit verdünnter, kalter Salzsäure, Kaliumcarbonatlösung und'Wasser gewaschen. Nach dlem Trocknen mit Natriumsulfat und Verdampfen des Lösungsmittels werden 4, 0 g (81 %) Carbobenzoxy-L-valyl-N-t-N-butyloxycarbonyl L-lysin-methylester als dickflüssiges Öl erhalten.
Die Carbobenzoxygruppe wird durch Hydrieren von 4, 0 g der obigen Verbindung in 100 mi Methanol und 8 ml ! ln Salzsäure in Gegenwart von 0, 5 g 10%- iger Pd-Kohle-Katalysator abgespalten. Nach 40 Minuten wird beim Durchperlen von Wasserstoff kein Kohlendioxyd mehr entwickelt. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat in Vakuum vorsichtig verdampft. Der Rückstand wird sofort mit 10 ml Essigester und 10 ml konz. Kaliuscarbonatllösung geschüttelt, wobei der freie Dipeptidester sich in der organischen Schicht Töst. Diese wird abgetrennt und mit festem Kaliumcarbonat getrocknet.
Nach Verdampfen des Essigesters verbleibt der L-Valyl-N-t butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester als dickflüssiges 01, welches sofort weiterverarbeitet werden muss.
Beispiel 2 1. H-Lys (PZ)-OBzy, HCl
3, 84 g N-PZ-Lysin werden in 38 ml abs. Tetrahydrofuran aufgeschlämmt und während einer Stunde mit Phosgen behandelt bei 40 . Die klare Lösung wird im Vakuum bei 40'verdampft, der kristallisierte Rückstand mit 20 ml abs. Benzylalkohol, enthaltend 0, 73 g Salzsäure-Gas, während 3 Minuten auf 60 erwärmt, wobei eine klare Lösung entsteht.
Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wird mit 60 ml abs. Ather versetzt, dabei kristallisiert das Hydrochlorid aus. Ausbeute : 4, 19 g = 82% der Theorie, P. 188-190 unter Zers. Zur Analyse wird aus Methanol-Ather umkristallisiert. F. 191 unter Zersetzung.
In analoger Weise werden das Nt-MZ-L-Lysin- benzylester-hydrochlorid sowie das entsprechende p Nitrobenzylesterderivat hergestellit. Deren weitere Verarbeitung ist ganz analog der des N-PZL-Lysin- benzylester-hydrochlorids.
2. BOC-Val-Lys (PZ)-OBzy
2, 64 g Ne-PZ-Lysin-benzylester-HCl werden in Chloroform und wenig Methanol gelöst und bei 0 mit Kaliumcarbonatlösung ausgeschüttelt. Nach Trocknen mit Natriumsulfat wird das Lösungsmittel im Vakuum bei 40 verdampft, der kristallisierte Rückstand zusammen mit 1, 12 g BOC-Valin in 14 ml Acetonitril gelöst und bei 0 mit 1, 17 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach Stehenlassen über Nacht bei 0 wird die dicke Fällung abgenutscht und mit eiskaltem Acetonitril gewaschen. Das Peptid wird mit dem Dicyclohexylharnstoff auskristallisiert.
Durch Extraktion mit Dimethylformamid wird das Peptid vom Harnstoff getrennt, aus dem Dimethyl- formamid kristallisiert es nach Zugabe von Wasser aus. Ausbeute : 2, 50 g = 72 % ; F. 154-156 .
Zur Analyse wird aus Äthanol-Wasser umkristalli- siert.
3. H-Val-Lys (PZ)-OBzy, HCl
2, 02 g BOC-Valyl-Ns-PZ-lysin-benzylester werden in 26 ml abs. Essigester gelöst, mit 40 ml 3, 3n Salzsäure in Essigester versetzt und 1 Stunde bei Raumtemperatur aufbewahrt. Beim Verdampfen des Lösungsmittels am Vakuum bei 40 fällt das Hydrochlorid fest aus. Ausbeute : 1, 78 g = 97% ; F. 200 bis 201 unter Zersetzung.
Der Dipsptidestsr kann in der in Fig. 2 gezeigten Weise mit den weiteren Aminosäuren zum Henei kosapeptid kondensiert werden.
4 BOC-Pro-Val-Lys (PZ)-OBzy
2, 8 g BOC-Pro-OH werden in 17 ml abs. Tetra- hydrofuran und 1, 8 ml Triäthylamin gelöst und bei -15 mit 1, 6 ml Pivaloylchlorid versetzt. 15 Minuten wird bei - 15 rührengelassen. In der Zwischenzeit wird aus 7, 93 g H-Val-Lys (PZ)-OBzy, HCI in Dimethylformamid und Triäthylamin das H-Val-Lys- (PZ)-OB hergestellt und diese Losung zum obigen gemischten Anhydrid gegeben. Man bewahrt die Mi- schung über Nacht bei 0 auf, verdünnt dann mit Essigester und schüttelt bei 0 mit verdünnter Salzsäure und Natriumbicarbonatlösung aus.
Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand aus Athanol-Wasser umkristallisiert. Ausbeute 8, 8 g gleich 88 % der Theorie ; F. 123-125 .
5. H-Pro-Lys (PZ)-OBzy, HC1
Das Tripeptidderivat wird durch Decarbobenzoxylierung wie unter 3. beschrieben erhalten. Nach Umkristallisieren aus Methanol-Ather schmilzt die Substanz bei 218-219 .
6. BOC-Arg (Zs)-Pro-Val-Lys (PZ)-OBzy
1, 15 g N-BOC-Ne--Di-carbobenzoxy-L-arginin werden in 11 ml abs. Tetrahydrofuran und 0, 29 ml Triäthylamin gelöst. Bei-15 werden 0, 28 ml Chlor- kohlensäureisobutylester zugegeben und 15 Minuten bei-15 gerührt. Dazu gibt man eine Lösung von 1, 00 g H-Pro-Val-Lys (PZ)-OBzy, lIC1 in 4 ml abs.
Dimethylformamid und 0, 2 ml Triäthylamin. Nach einstündigem Rihren bei 0 wird über Nacht bei 0 aufbewahrt, dann mit Essigester verdUnnt, bei 0 mit Salzsäure und Natriumhydrogencarbonat gewaschen, getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum verdampft. Der Na-BOC-NE-Dicarbobenzoxy- Arg-Pro-Val-Lys (PZ)-benzylester besteht aus einem festen, nichlt kristalqisierbaren Schaum. Ausbeute : 1, 69 g = 100% der Theorie.
Das Produkt ist dünnschichtchromatographisch einheitlich im System Chloroform-Aceton (7 : 3) Rf 0, 53 und Benzol-Aceton (1 : 1) Rf 0, 67.
7. H-Arg (Z2)-Pro-Val-Lys (PZ)-OBzy
1, 2 g BOC-Tetrapeptid werden mit 7, 5 ml Trifluoressigsäure 10 Minuten stehengelassen ; nach Verdampfen der Trifliuoressigsäure wird das O1 in Chlo roform gelöst, bei 0 mit Wasser und d'ann mit Kaliumcarbonatlösung gewaschen, getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum verdampft. Man erhält 990 ml = 90% der Theorie eines festen orangen Schaums. Die Substanz ist diinnschichtchromato- graphisch einheitlich ; im System Benzol-Aceton (1 : 1) Rf 0, 09 und Dioxan-Wass, er (9 : 1) Rf 0, 71.
8. BOC-Arg (Zz)-Arg (Z2)-Pro-Val-Lys (PZ)-OBzy
Das obige Pentapeptidderivat wird aus 1, 72 g BOC-Arg (Zs) und 2, 175 g H-Arg (Z2)-Pro-Val-Lys (PZ)-OBzy in analoger Weise wie unter 6. beschrie- ben hergestellt. Ausbeute : 3, 12 g = 97 % der Theorie.
Dünnschichtchromatogramm : in Benzol-Acetat (1 : 1) Rf 0, 71 ; in Chloroform-Aceton (7 : 3) Rf 0, 57.
9. H-Arg (Z2)-Arg (Z2)-Pro-Val-Lys (PZ)-OBzy
Aus obigem 3, 12 g BOC-Pentapeptidderivat wird die BOC-Gruppe in gleicher Weise wie unter 7. beschrieben abgespalten. Ausbeute : 2, 90 g = 99% der Theorie.
Dünnschichtchromatogramm : Einheitldch. Rf 0, 48 in Benzo1LAceton (1 : 1) und 0, 18 in Chloroform Aceton (7 : 3).
10. BOC-Lys (Z)-Arg (Z2)-Arg (Z2)-Pro-Val-
Lys (PZ)-OBzy
587 mg des unter 9. beschriebenen Produkts werden mit 235 mg BOC-Lys (Z)-OH, in analoger Weise wie unter 6. beschrieben, umgesetzt. Das Rohprodukt wird aus Tetrahydrofuran-Äther umgefällt. Ausbeute : 725 mg = 100% der Theorie.
Dünnschichtchromatogramm : In Benzol-Aceton (1 : 1) Rf 0, 68, in Chloroform-Aceton (7 : 3) Rf 0, 36.
11. H-Lys (Z)-Arg (Z2)-Arg (Z2)-Pro-Val
Lys (PZ)-OBzy
Aus 614 mg BOC-Hexapeptid wird in analoger Weise wie unter 7. beschrieben die BOC-Gruppe abgespalten. Ausbeute : 574 mg = 99 %.
Dünnschichtchromatogramm : Benzol-Aceton (1 : 1) Rf 0, 38 ; Chloroform-Aceton (7 : 3) Rf 0, 11.
12. BOC-Lys (Z)-Lys (Z)-Arg (Z2)-Arg (Z2)
Pro-Val-Lys (PZ)-OBzy
3, 26 g H-Lys (Z)-Arg (Z2)-Arg (Z2)-Pro-Val-Lys- (PZ)-OBzy und 1, 19 g BOC-Lys (Z)-Nitrophenyl- ester werden in 7 ml abs. Tetrahydrofuran über Nacht bei 40 gerührt. Die dicke Mischung wird in wenig Dimethylformamid gelöst und in 300 ml Ather-Petroläther (2 : 1) eingetropft. Man saugt die Fällung ab und wäscht gut mit Ather. Ausbeute : 3, 45 g = 88%.
Dünnschichtchromatogramm : Benzol-Aceton (1 : 1) Rf 0, 57 einheitlich ; Chloroform-Aceton (7:3) Rf 0, 22 einheitlich.
13. H-Lys (Z)-Lys (Z)-Arg (Z2)-Arg (Z2)-Pro-
Val-Lys (PZ)-OBzy
Aus d ! em obigen 3, 45 g Peptidderivat spaltet man die BOC-Gruppe wie unter 7. beschrieben ab. Ausbeute : 3, 20 g = 97 % der Theorie.
Dünnschichtchromatogramm : Benzol-Aceton (1 : 1) Rf 0, 32 ; Chloroform-Aceton (7 : 3) Rf 0, 09.
14. BOC-Val-Gly-Lys (Z)-Lys (Z)-Arg (Z2-Arg (Z2)-
Pro-Val-Lys (PZ)-OBzy
Aus obigen 3, 20 g Heptapeptidderivat und 686 mg BOC-Val-Gly-OH wird nach dem unter 6. beschriebenen Verfahren der geschützte Nonapeptidester hergestellt. Er wird durch Umfällen aus Di methylformamid/Atber gemeinigt. Ausbeute : 2, 92 g gloich 81 % der Theorie.
Dünnschichtchromatogramm : Benzol-Aceton (1 : 1) Rf 0, 34 ; Dioxan Rf 0, 72.
Das BOC-Val-Gly-OH wird folgendermassen hergestellt :
Aus 5 g BOC-Valin und 3, 54 g Gycinäthyl- esterhydrochlorid wird nach der unter 4. beschrie- benen Methode BOC-Val-Gly-OEt hergestellt. Ausbeute : 4, 45 g = 64% der Theorie ; F. 95-96 nach Kristallisation aus Ligroin.
4, 3 g des Athylesters werden in 80 ml Dioxan mit 32 ml 0, 5n Natronlauge während 30 Minuten verseift. Nach Einengen des Lösungsmittels über- schichtet man mit Essigester, säuert bei 0 mit konz.
Salzsäure an und extrahiert mit Essigester. Nach Neutralwaschen und Verdampfen hinterbleiben 3, 90 g eines Harzes gleich 100 der Theorie.
Das Dicyclohexylaminsalz davon kristallisiert bei F. 167-169 .
15. H-Val-Gly-Lys (Z)-Lys (Z)-Arg (Z2)-Arg (Z2)
Pro-Val-Lys (PZ)-OBzy
Aus 2, 92 g des BOC-Nonapeptidesters wird wie unter 7. beschrieben die BOC-Gruppe abgespalten.
Ausbeute : 2, 54 g = 91 % der Theorie.
Dünnschichtchromatogramm : Chloroform-Metha- nol (9 : 1) Rf 0, 4.
16. BOC-Pro-Val-Gly-Lys (Z)-Lys (Z)-Arg (Z2)-
Arg (Z2)-Pro-Val-Lys (PZ)-OBzy
2, 985 g Nonapeptidester werden mit 466 mg BOC-Prdlin nach der unter 6. beschriebenen Methode umgesetzt. Das erhaltene Rohprodukt wird aus Di methylformamid-Ather-Petroläther umgefällt. Aus- beute : 2, 70 g = 83 % der Theorie.
Dünnschichtchromatogramm : Chloroform-Metha- nol (9 : 1) Rf 0, 9.
17. H-Pro-ValLGly-Lys (Z)-Lys (Z)-Arg (Z2)-
Arg (Z2)-Pro-Val-Lys (PZ)-OBzy
2, 30 g BOC-Dekapeptidester werden wie unter 5. beschrieben mit Trifluoressigsäure behandelt. Ausbeute : 2, 108 g = 96 % der Theorie.
Da die Dünnschichtchromatographie infolge der abnehmenden Loslichkeit nur noch schwierig durchzuführen ist, wird folgende Methode zur Reinheits- prüfung verwendet :
Einige mg der obigen Substanz werden in Di methylformamid gelöst, mit 1 Tropfen Triäthylamin und einigen mg 2, 4-Dinitrofluorbenzol versetzt. Nach Stehen über Nacht bei Zimmertemperatur wird das s Dinitrophenylpeptid mit Ather ausgefällt, abzentm- fugiert und mit Salzsäure total hydrolysiert. Die Dinitrophenylaminosäuren werden chromatographisch untersucht. Es wurde nur ätherlösliches Dinitrophe- nyl-prolin gefunden.
18. BOC-Lys (Z)-Pro-Val-Gly-Lys (Z)-Lys (Z)
Arg (Z2)-Arg (Z2)-Pro-Val-Lys (PZ)-OBzy
2, 10 g Dekapepttdester und 700 mg BOC-Lys (Z) Nitrophenylester werden in 5 ml Dimethylformamid 2 Tage bei Zimmertemperatur und 12 Stunden bei 45 aufbewahrt. Durch Eintropfen in 250 ml Ather wird das Undekapeptidesterderivat gefällt. Ausbeute : 2, 255 g = 93 %.
19. H-Lys (Z)-Pro-Val-Gly-Lys (Z)-Lys (Z)
Arg(Z2)-Arg(Z2)-Pro-Val-Lys (PZ)-OBzy
Das obige Produkt wird entsprechend der unter 7. beschriebenen Methode behandelt. Ausbeute : 2, 08 g gleich 96 % der Theorie.
Dinitrophenylierung : Ausgeführt wie unter 17. beschrieben. Bei diesem Versuch werden keine äther- löhslichen Dinitrophenylaminosäuren erhalten, es wird einzig das wasserlösliche a-Dinitrophenyl-lysin gefunden.
20. BOC-Gly-Lys (Z)-Pro-Val-Gl ! y-Lys (Z)-Lys (Z)
Arg (Z2)-Arg (Z2)-Pro-Val-Lys (PZ)-OBzy
1, 68 g des unter 19. erhaltenen Produkts werden mit 230 mg BOC-Glycin nach der unter 6. beschriebenen Methode umgesetzt. Ausbeute : 1, 725 g gleich 97 % der Theorie.
21. H-Gly-Lys (Z)-Pro-Val-Gly-Lys (Z)-Lys (Z)-@
Arg (Z2)-Arg (Z2)-Pro-Val-Lys (PZ)-OBzy
1, 725 g BOC-Dodekapeptidester werden nach der unter 7. beschriebenen Methode behandelt. Ausbeube : 1, 592 g = 96% der Theorie.
Dinitrophenylierung : Es wird nur ätherlösliches Dinitrophenyl-glycin gefunden, keine wasserlöslichen Dinitrophenylaminosäuren.
22. BOC-Try-Gly-Lys (Z)-Pro-Val-Gly-Lys (Z)
Lys (Z)-Arg (Z2)-Arg (Z2)-Pro-Val-Lys (PZ)-OBzy
3, 85 g Dodekapeptidesterderivat und 1, 12 g BOC Tryptophan werden nach der unter 6. beschriebenen Methode umgesetzt. Man reinigt das Produkt durch Umfällen aus Dimcthylformamid-Ather. Ausbeute : 4, 11 g geschützter Tridekapeptidester = 96% der Theorie.
23. H-Try-Gly-Lys (Z)-Pro-Val-Gly-Lys (Z)-Lys (Z)
Arg (Z2)-Arg (Z2)-Pro-Val-Lys (PZ)-OBzy
4, 0 g des obigen Produkts werden nach der unter 7. beschriebenen Methode behandelt. Ausbeute : 3, 86 g = 100% der Theorie.
24. BOC-Arg (Z2)-Try-Gly-Lys (Z)-Pro-Val-Gly
Lys (Z)-Lys (Z)-Arg (Z2)-Arg (Z2)-
Pro-Val-Lys (PZ)-OBzy
Die obigen 3, 86 g Peptidfester werden mit 2, 37 g BOC-Arg (Z2)-OH nach der unter 6. beschriebenen Methode umgesetzt. Man fällt aus Dimethylformamid- Ather um. Ausbeute : 4, 40 g geschützter Tetrade kapeptidester = 96 % der Theorie.
25. H-Arg (Z2)-Try-Gly-Lys(Z)-Pro-Val-Gly
Lys (Z)-Lys (Z)-Arg (Z2)-Arg (Z2)-Pro-Val-
Lys (PZ)-OBzy
4, 30 g der obigen BOC-Verbindung werden wie unter 7. beschrieben behandelt. Ausbeute : 4, 15 g gleich 99 % der Theorie.
Dinitrophenylierung : Chromatographisch wird nur wasserlösliches Dnnitrophenyl-arginin gefunden.
26. BOC-Phe-Arg (Z2)-Try-Gly-Lys (Z)-Pro-Val-
Gly-Lys (Z)-Lys (Z)-Arg (Z2)-Arg (Z2)-Pro-
Val-Lys (PZ)-OBzy
Aus 4, 15 g des obigen Produkts und 2, 14 g BOC Phenylalanin-p-nitrophenylester wird nach der unter 18. beschriebenen Methode 4, 25 g geschützter Pentadekapeptidester = 95 % der Theorie erhalten.
27. H-Phe-Arg (Z2)-Try-Gly-Lys (Z)-Pro-Val-
Gly-Lys (Z)-Lys (Z)-Arg (Z2)-Arg (Z2)-Pro-
Val-Lys (PZ)-OBzy
Aus 4, 18 g obiger BOC-Verbindung werden nach der unter 7. beschriebenen Methode 4, 14 g Penta dekapeptidtesterderivat = 102 % der Theorie erhalten.
Dinitrophenylierung : Es wird nur das ätherlösliche Dinitrophenyl-phenylalanin erhalten.
28. BOC-His-Phe-Arg (Z)-Try-Gly-Lys (Z)-Pro
Val-Gly-Lys (Z)-Lys (Z)-Arg (Z2)-Arg (Z2)-
Pro-Val-Lys (PZ)-OBzy
Aus 4, 14 g des obigen Produkts und 1, 30 g BOC Histidin werden nach der unter 6. beschriebenen Methode 4, 31 g (= 97% der Theorie) geschützter Hexadekapeptidester erhalten.
29. H-His-Phe Arg (Z2)-Try-Gly-Lys (Z)-Pro-Val
Gly-Lys (Z)-Lys (Z)-Arg (Z2)-Arg (Z2)-Pro-
Val-Lys (PZ)-OBzy
Aus 4, 20 g der obigen BOC-Verbindung wird nach der unter 7. beschriebenen Methode 3, 90 g BOC-freier Hexadekapeptidester = 95 % der Theorie erhalten.
30. BOC-Glu (OBzy)-His-Phe-Arg (Z2)-Try-Gly
Lys (Z)-Pro-Val-Gly-Lys (Z)-Lys (Z)-Arg (Z2)-
Arg (Z2)-Pro-Val-Lys (PZ)-OBzy
Aus obigen 3, 90 g und 1, 5 g BOC-Glutamin- säure-y-benzylester werden nach der unter 6. beschriebenen Methode 3, 93 g des geschützten Hepta dekapeptidesters erhalten. Ausbeute 92 % der Theorie.
31. H-Glu (OBzy)-His-Phe-Arg (Z2)-Try-Gly-Lys (Z)
Pro-Val-Gly-Lys (Z)-Lys (Z)-Arg (Z2)-Arg (Z2)-
Pro-Val-Lys (PZ)-OBzy
Aus 1, 954 g der obigen BOC-Verbindung werden nach der unter 7. beschriebenen Methode 1, 957 g BOC-freier Heptadekapeptidester (100% der Theorie) erhalten.
Dinitrophenylierung : Es wird einzig Dinitro- phenylglutaminsäure gefunden.
32. BOC-Met-Glu (OBzy)-His-Phe-Arg (Z2)-Try
Gly-Lys (Z)-Pro-Val-Gly-Lys (Z)-Lys (Z)
Arg (Z2)-Arg (Z2)-Pro-Val-Lys (PZ)-OBzy
Aus 2, 00 g des obigen Peptidesters und 752 mg BOC-Methiomin wird nach der unter 6. beschriebenen Methode der geschützte Octadekapeptidester hergestellt. Ausbeute : 1, 91 g = 90 % der Theorie.
33. H-Met-Glu (OBzy)-His-Phe-Arg (Z2)-Try-Gly-
Lys (Z)-Pro-Val-Gly-Lys (Z)-Lys (Z)-Arg (Z2)-
Arg (Z2)-Pro-Val-Lys (PZ)-OBzy
1, 87 g des obigen Produkts werden nach der unter 7. beschriebenen Methode behandelt. Ausbeute :
1, 88 g BOC-freier Octadekapeptidester = 100% der Theorie.
34. BOC-Ser (Bzy)-Met-Glu (OBzy)-His-Phe
Arg (Z2)-Try-Gly-Lys (Z)-Pro-Val-Gly-Lys (Z)
Lys (Z)-Arg (Z2)-Arg (Z2)-Pro-Val-Lys (PZ)
OBzy
1, 88 g des obigen Produkts und 797 mg BOC Serin (Bzy) werden nach der unter 6. beschrie- benen Methode umgesetzt. Ausbeute : 1, 847 g ge schützter Nonadekapeptidester =92% der Theorie.
35. H-Ser (Bzy)-Met-Glu (OBzy)-His-Phe-Arg (Z2)
Try-Gly-Lys (Z)-Pro-Val ; Gly-Lys (Z)-Lys (Z)
Arg (Z2)-Arg (Z2)-Pro-Val-Lys (PZ)-OBzy
Die Behandlung von 1, 826 g des obigen Produkts nach der unter 7. beschriebenen Methode liefert 1, 82 g BOC-freien Nonadekapeptidester = 100 % der Theorie.
36. BOC-Tyr (Bzy)-Ser (Bzy)-Met-Glu (OBzy)-His
Phe-Arg (Z2)-Try-Gly-Lys (Z)-Pro-Val-Gly-Lys (Z)
Lys (Z)-Arg (Z2)-Arg (Z2)-Pro-Val-Lys (PZ)-OBzy
1, 82 g des obigen Produkts werden mit 1075 mg BOC-Tyrosin (Bzy) nach der unter 6. beschriebe- nen Methode umgesetzt. Ausbeute : 1, 90 g geschützter Eikosapeptidester = 96 % der Theorile.
37. H-Tyr (Bzy)-Ser (Bzy)-Met-Glu (OBzy)-His- Phe-Arg (Z2)-Try-Gly-Lys (Z)-Pro-Val-Gly
Lys (Z)-Lys (Z)-Arg (Z2)-Arg (Z2)-Pro-Val-
Lys (PZ)-OBzy
1, 885 g der obigen BOC-Verbindung werden nach der unter 7. beschriebenen Methode behandelt. Ausbeute : 1, 91 g BOC-freier Eikosapeptidester gleich 100% der Theorie.
38. BOC-Ser (Bzy)-Tyr (Bzy)-Ser (Bzy)-Met-
Glu (OBzy)-His-Phe-Arg (Z2)-Try-Gly-Lys (Z)
Pro-Val-Gly-Lys (Z)-Lys (Z)-Arg (Z2)-Arg (Z2)-
Pro-Val-Lys (PZ)-OBzy
1, 91 g von obigem Peptidester und 825 mg BOC-Berin (Bzy) werden nach der unter 6. be schriebenen Methode umgesetzt. Ausbeute : 1, 903 g geschützter Heneikosapeptidester = 94 % der Theorie.
39. H-Ser (Bzy)-Tyr (Bzy)-Ser (Bzy)-Met-Glu (OBzy) His-Phe-Arg (Z2)-Try-Gly-Lys (Z)-Pro-Val-
Gly-Lys (Z)-Lys (Z)-Arg (Z2)-Arg (Z2)-Pro
Val-Lys (PZ)-OBzy
Aus 1, 875 g der obigen BOC-Verbindung wird durch Behandlung mit Trifluoressigsäure, entsprechend der unter 7. beschriebenen Methode, die BOC Gruppe abgespalten. Das Rohprodukt wird durch Losen in siedendem Alkohot und Abkühlen pulvrig erhalten. Ausbeute : 1, 73 g = 94% der Theorie.
40. H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-
Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg
Pro-Val-Lys-OH
259 mg des unter 39. beschriebenen Produkts werden in 1 Liter flüssigem Ammoniak gerührt bis zur Lösung. Nun werden beim Siedepunkt des Ammoniaks kleine Natriumstückchen zugegeben bis zur bleibenden Blaufärbung. Das überschüssige Natrium wird mit Ammoniumacetat zersetzt und das Ammoniak verdampfen l'assen. Man löst den Rückstand in Wasser, wobei 55 mg gelbe, unlösliche Substanz zurückbleibt. Die wässrige Lösung wird lyophilisiert und der Rückstand in U, ln Essigsäure durch präpa- rative Hochspannungselektrophorese (700 V) ge reinigt. Die Sakaguchi-positiven Fraktionen werden vereinigt und lyophilisiert.
Ausbeute : 75, 9 mg Hexaacetat. Sie zeigen corticotrope Wirkung.
Die in den einzelnen Stufen verwendeten Aminosäurederivate werden wie folgt hergestellt : a) Nα-BOC-N#, N#-Dicarbobenzoxy-L-arginin
2, 82 g N#,N#-dicarbobenzoxy-L-arginin werden in 60 ml Dioxan und 60 ml Wasser mit 2, 8 g Magnesiumoxyd und 1, 77 ml BOC-Azid über Nacht bei 45 gerührt. Man dampft das Dioxan im Vakuum ab, versetzt die wässrige Lösung mit Essigester und säuert bei 0 mit 2n Salzsäure an. Der Essigester- extrakt wird nach dem Waschen mit Wasser ein- gedampft. Rückstand : 2, 70 g BOC-Arg (Z2) gleich 78 % der Theorie.
Zur Reinigung wird das Produkt durch eine Säule von Silicagel (54 g) filtriert. Die mit Chloro- form-Essigester (1 : 1) eluierbare Substanz wird aus Methanol-Wasser umkrdstallisiert. Ausbeute'2, 21 g gleich 64% der Theorie ; F. 141-143 . b) N-BOC-Ne-Carbobenzoxy-L-lysin-p- nitrophenylester
12, 7 g BOC-Lys (Z) und 5, 5 g p-Ndtrophenol werden in 65 ml Essigester gelöst und bei 0 mit 7, 6 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach 5 Stunden saugt man den Dicyclohexylharnstoff ab und verdampft den Essigester.
Der Rückstand wird dn Me thylenchlorid gelöst und bei 0 mit 0, 5n Kaliumcarbonatlösung extrahiert. Nach Waschen mit Salzsäure und Wasser und Trocknen mit Natriumsulfat wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand aus Athanol-Wasser umkristallisiert. Ausbeute : 16, 3 g BOC-Lys (Z)-ONP = 93 % der Theorie ; F. 91, 5-92 . c) BOC-L-Histidin
Zu einer Lösung von 19, 2 g L-Histildin-HCl in 100 mI 2n Natronlauge und 200 ml Dioxan werden bei 45 langsam 14, 6 ml BOC-Azid und 110 ml ln Natronlauge zugetropft.
Nach Rühren über Nacht wird das Dioxan im Vakuum eingedampft, die wäss- rige Lösung mit Essigester extrahiert und dann im Vakuum auf wenige ml eingeengt. Man überschichtet die Lösung mit Butanol, säuert bei 0 mit Schwefel- säure an und extrahiert mehrmals mit Butanol. Die Butanol-Auszüge hinterlassen nach dem Verdampfen des Lösungsmittels 15, 1 g = 59 % der Theorie eines Harzes des BOC-His, das papierchromatographisch einheitlich ist.
Es wird noch durch Umfällen aus Äthanol-Äther gereinigt, wobei ein sehr hygrosko- pisches, amorphes Pulver erhalten wird. d) BOC-L-Glutaminsäure-y-benzylester
Eine Suspension von 6, 9 g L-Glutaminsäure-y- benzylester n 50 ml Dioxan wird mit 4, 45 ml BOC Azid versetzt. Bei 45 wird unter Rühren eine Lösung von 6, 1 g Kaliumhydrogencarbonat in 50 ml Wasser zugetropft. Die Aminosäure geht dabei langsam in Lösung. Nach Rühren über Nacht verdampft man das Dioxan im Vakuum, extrahiert dib wässrige Lösung mit Essigester, säuert dann bei 0 mit Sali- säure an und extrahiert mit Essigester.
Nach Waschen mit Wasser werden die Essigesterauszüge mit Na triumbicarbonatlösung (5 %) und Wasser gewaschen, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand besteht aus einem nicht kristallisierenden Öl. Ausbeute 7, 9 g BOC-Glu (OBzy) = 81 % der Theorie.
Das Dicyclohexylaminsalz kristallisiert praktisch quantitativ aus Ather oder Essigester und wenig Petroläther. F. 145-146 . e) BOC-L-Phenylalanin-p-nitrophenylester
6, 2 g BOC-L-Phenylalanin, 3, 9 g p-Nitrophenol und 25 ml abs. Essigester werden bei 0 mit 5, 3 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Man lässt über Nacht bei 0 stehen. Durch, schwaches Erwärmen wird der auskristallisierte Nitrophenylester in Lösung gebracht, dann der Dicyclohexylharnstoff abgenutscht und d'as Filtrat im Vakuum zur Trockene verdampft.
Nach Umkristallisieren aus Äthanol werden 6, 1 g gleich 69 % der Theorie an Nitrophenylester vom F.
130-132 erhalten. Das analysenreine Produkt schmilzt bei 135 . f) BOC-O-Benzyl-L-serin
10, 8 g O-Benzyl-L-serin-methylester-D-hydrogentartrat werden mit 23 ml 4n Natronlauge versetzt.
Nach 15 Minuten wird die erhaltene Lösung mit Eisessig auf pH 6 gestellt. Man saugt das auskristal lisierte O-Benzyl-L-serin ab und wäscht es mit Was ser. Ausbeute : 4, 95 g = 84% der Theorie. Dieses Produkt wird in 25, 4 ml In Natronlauge und 25 ml Dioxan gelöst, bei 45 mit 3, 88 ml BOC-Azid und langsam mit 28 ml In Natronlauge versetzt. Nach Rühren über Nacht verdampft man das Dioxan im Vakuum, extrahiert die wässrige Lösung mit Essig- ester, säuert dann bei 0 mit Salzsäure an und extrahiert wieder mit Essigester.
Die Essigesterauszüge werden im Vakuum eingeengt, mit 4, 2 ml Dicyclohexylamin versetzt, mit Petroläther zur Kristalilisation gebracht und das Salz abgenutscht. Ausbeute : 8, 2 g Dicyclohexylaminsalz = 68 % der Theorie ; F. 134-135 .
Das Dicyclohexylaminsalz wird warm in Wasser gelöst, mit Essigester überschichtet, auf 0 gekühlt und mit 2n Salzsäure angesäuert. Die Essigesterlösung wird nochmals mit Salzsäure, dann mit Wasser gewaschen, getrocknet und verdampft. BOC-O-Benzyl-L-serin bildet ein Öl. Die Ausbeute ist quantitativ.