DE69028658T2

DE69028658T2 - Proteine, Vakzine und Nucleinsäuren

Info

Publication number: DE69028658T2
Application number: DE69028658T
Authority: DE
Inventors: Gerhard Antoine; Walter Bodemer; Friedrich Dorner; Franz X Heinz; Christian Kunz; Christian W Mandl
Original assignee: Immuno AG
Current assignee: Oesterreichisches Institut fuer Haemoderivate
Priority date: 1989-06-06
Filing date: 1990-06-06
Publication date: 1997-03-06
Anticipated expiration: 2010-06-07
Also published as: NO902491L; DD297997A5; HUT54306A; HU903490D0; CS9002806A2; DE69028658D1; SK277781B6; EP0402116A1; ATE143373T1; YU109590A; NO902491D0; CA2018332A1; FI902814A0; JPH03151878A; EP0402116B1; CZ277921B6

Description

Die Erfindung betrifft Impfstoffe und Diagnostika für das TBE-Virus vom westlichen Subtyp und Nukleinsäuren und Proteine, die für solche Impfstoffe und Mittel nützlich sind.
Das durch Zecken übertragbare (tick-borne encephalitis) (TBE) -Virus vom westlichen subtyp ist ein Mitglied der Familie der Flaviviridae, die kugelförmige, Lipid-umhüllte RNA-Viren sind (Westaway et al, Intervirology 24, 183-192, 1985). Das Prototypvirus ist das Gelbfiebervirus. Definitionsgemäß sind alle Flaviviren serologisch verwandt, wie durch Hämagglutination-Inhibitionstests nachweisbar ist. Durch Kreuz- Neutralisation kann jedoch die Familie in mehrere Serokomplexe gruppiert werden (Demadrid and Porterfield, J. Gen. Virol. 23, 91-96, 1974), die enger verwandte Flaviviren im Gegensatz zu serologisch entfernt verwandten Viren verschiedener Serokomplexe oder nichtgruppierter Flaviviren umfaßt. Das TBE-Virus ist ein Mitglied des sogenannten zeckenübertragbaren Serokomplexes, der zusätzlich auch als "Louping ill", "Langat", "Omsk"- hämorrhagisches Fiber, "Kyasanur" Waldkrankheit und "Negishi" bezeichnete Viren umfaßt.
TBE-Virenstämme können einem westlichen (europäischen) Subtyp zugeordnet werden, der primär durch Ixodes ricinus übertragen wird, und einem fernöstlichen Subtyp mit Ixodes persulcatus als Hauptüberträger (Clarke, 1964; Bull. WHO 31, 45-56).
Diese Subtyp-Differentierung wurde durch Verdrängungs-RIA und Peptid- Kartierung unter Einsatz beschränkter Proteolyse der entsprechenden Struktur-Glycoproteine (Heinz und Kund, 1981; J. Gen. Virol. 57, 263-274) als auch durch antigene Analyse unter Einsatz monoklonaler Antikörper (Heinz et al, Virology 126, 525-537, 1983) bestätigt.
Reife Viruspartikel enthalten nur drei Strukturproteine, bezeichnet als E, C und M, mit ungefähren Molekulargewichten von 50 bis 60.000, 15.000 und 7.000 Dalton.
Das Geriom von Flaviviren besteht aus einzelsträngiger RNA mit ca. 11.000 Basen mit MRNA-Polarität, die ein Molekulargewicht von 4 x 10&sup6; Dalton haben. Zusammen mit dem C-Protein bildet diese RNA ein kugelförmiges Nukleokapsid, das von einer Lipidhülle, die sowohl mit den Proteinen E und M assoziiert ist, umgeben ist. Experimente unter Verwendung gereinigter Präparationen des E-Proteins, erhalten nach Solubilisierung des Virus durch Detergenzien, haben gezeigt, daß E das virale Hämagglutinin darstellt, d.h. es verursacht Agglutination bestimmter Erythrocyten unter geeigneten Bedingungen, das nach Immunisierung Hämagglutinations- inhibierende, neutralisierende und protektive Antikörper, als auch Immunität gegen Exposition mit virulentem Lebendvirus (Heinz et al, Infect. Immun. 33, 250- 257, 1981) induziert.
Zusätzlich zu diesen Strukturproteinen wurden mehrere Virusspezifische Nichtstrukturproteine in mit bestimmten Flaviviren infizierter Zellen gefunden.
Die Genomorganisation von Flaviviren wurde jüngst durch cDNA- Klonierung und Sequenzieren von Gelbfiber-, "West Nile"- und "Murray Valley"-Encephalitis-Virus aufgeklärt (Rice et al, Science 229, 726-73:3, 1985; Dalgarno et al, J. Mol. Biol. 167, 309-323, 1986; Castle et al, virology 147, 227-236, 1985; Castle et al, Virology 149, 10-26, 1986; Wengler et al, Virology 147, 264-274, 1985). Nach diesen Analysen enthält die genomische RNA von Flaviviren einen einzelnen, langenen offenen Leserahmen von ca. 11.000 Nukleotiden, der für alle strukturellen und nichtstrukturellen Proteine kodiert. Mandl et al (Virology 166, 197-205, 1988) beschreiben die Sequenzierung der 5'-terminalen Region des Genoms des TBE-Virus vom westlichen Subtyp.
Die für YF-Virus aufgeklärte und für mehrere andere Flaviviren bestätigte Genanordnung ist 5;C-prM(M)-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS48-NS5 3.C, prM(M) und E bedeutet die in unreifen (C, prM, E)- und reifen (C, M, E)-Viruspartikeln gefundenen Strukturproteine, wogegen der Rest des Genoms für Nichtstrukturproteine kodiert. Die Strukturproteine und die Nichtstrukturproteine wurden positiv durch Amino-terminale Sequenzanalyse identifiziert und daher mit den entsprechenden Genomsegmenten in Beziehung gesetzt.
Man vermutet, daß die Translation viraler Proteine mit dem ersten AUG am 5'-Ende der RNA beginnt und bis zu einem Stop-Kodon fortschreitet, das im 3'-Ende der RNA angetroffen wird. Man glaubt, daß die Bildung individueller Proteine durch eine Reihe spezifischer proteolytischer Spaltungsvorgänge geschieht, an denen zelluläre als auch Virus-spezifische Proteasen beteiligt sind.
Ca. 60 verschiedene Flaviviren wurden bislang identifiziert und ca. zwei Drittel davon werden durch Biß infizierter Arthropoden übertragen und bilden daher durch Arthropoden übertragbare (arthropod-borne) (ARBO)-Viren. Mehrere Flaviviren sind als humane Pathogene gut bekannt und umfassen das Gelbfiber-Virus, das Dengue-Virus, das japanische Encephalitis-Virus oder das Zecken-übertragbare Encephalitis-Virus (Shope, in: "The Togaviruses", Seiten 47-82, Academic Press, New York, 1980).
Das TBE-Virus ist in vielen europäischen Ländern, Rußland und China endemisch. Diese Krankheit ist in einigen zentraleuropäischen Ländern, wie Österreich, Tschechoslowakei und Ungarn gut dokumentiert, und es wird von meheren hundert Krankenhausfällen jedes Jahr berichtet. Dies bedeutet ein signifikantes öffentliches Gesundheitsproblem.
Die Krankheit kann wirksam durch Impfung mit einem hochgereinigten Formalin-inaktivierten Gesamtvirusimpfstoff verhinder werden (Kunz et al, J. Med. Virol 6, 103-109, 1980), der eine Immunantwort gegen die Strukturproteine des Virus induziert. Der Hauptnachteil dieses Impfstoffes ist, daß große Volumina an infektiösen und potentiell gefährlichen Virussuspensionen im Verlauf des Herstellungsverfahrens gehandhabt werden müssen. Daher sind umfangreiche und teure Sicherheitsmaßnahmen erforderlich.
Es wurde daher nach Mitteln gesucht, einen Impfstoff herzustellen, der die oben diskutierten Nachteile überwindet. EP-A-0284791 behandelte dieses Problem durch Bereitstellung eines DNA-Moleküls, welches eine vom TBE-Virus vom westlichen Subtyp abgeleitete DNA enthält, die für mindestens einen Teil von mindestens einem Strukturprotein kodiert, d.h. ausgewählt aus den Proteinen C, prM, M oder E des TBE-Virus vom westlichen Subtyp.
Ein solches DNA-Molekül entspricht der einzelsträngigen RNA des TBE- Virus vom westlichen Subtyp und erwies sich als geeignet zur Bereitstellung der genetischen Information zur Expression eines Polypeptids, welches das gesamte Protein C, prM, M oder E des TBE-Virus vom westlichen Subtyp, wie oben beschrieben, oder ein Teil von den oben erwähnten Proteinen sein kann Ein solches Polypeptid kann diagnostisch oder therapeutisch, z.B. bei der Herstellung eines Impfstoffes, verwendet werden.
Die Sequenzanalyse bestätigte auch den Unterschied gegenüber dem fernöstlichen Subtyp durch Aufdecken einer Verschiedenheit in der Aminosäuresequenz von bis zu 14 % (je nach Protein) im Vergleich zum fernöstlichen Subtyp (Yamshchikov und Pletnev, Nucleid Acid Res.16 7750 (1988)).
Obwohl ein Impfstoff auf Grundlage von einem oder mehreren rekombinanten Strukturproteinen, wie in EP-A-0284791, eine Verbesserung gegenüber einem inaktivierten Gesamtvirusimpfstoff hinsichtlich der Herstellung darstellt, teilt es mit dem inaktivierten Gesamtvirusimpfstoff den Nachteil, daß es keine Strukturproteine enthält, die zu einer protektiven Immunantwort beitragen können.
Die Nicht-Strukturproteine haben wichtige Funktionen für den Lebenszyklus von Flaviviren, wobei sie an der Virusreifung, der proteolytischen Aufarbeitung und der RNA-Replikation beteiligt sind. Obwohl für bestimmte andere Flaviviren als TBE gezeigt wurde, daß eines der Nicht- Strukturproteine (NS 1) zur Induktion einer protektiven Immunantwort in Labortieren (Schlessinger et al, J. Gen. Virol 68 853-857 (1987); Zhang et al, J. Virol. 62 3027-3031 (1988)) in der Lage ist, gibt es bislang keine solche Offenbarung für Nicht-Strukturproteine von TBE. Gibson et al (Vaccine, 6-, 7-9, 1988) geben einen Überblick über die Immunogenität des NS-1-Proteins von Flaviviren im allgemeinen.
Es ist bekannt, daß subneutralisierende Konzentrationen neutralisierender Antikörper oder anderer Antikörper gegen Epitope im Flavivirus-E-Protein Antikörper-abhängige Verstärkung der Infektiösität in Fc-Rezeptor-tragenden Zellen vermitteln können (Porterfield, Cardosa; "Concepts in Viral Pathogenesis 1", Chapter 17 Seite 117), was bei der Pathogenese von Dengue-hämorrhagischem Fiber und Dengue-Schocksyndrom eine Rolle spielen soll (Halstead, Science 239 476-481 (1988)). In bestimmten Fällen kann es daher vorteilhaft sein, die Verwendung von Flavivirus-E- Protein in Impfstoffen zu vermeiden oder auch nur NS 1 als einzige Impfstoffkomponente zu verwenden und keine viralen Strukturproteine aufzunehmen.
Es wurde nun ein NS-1-Protein von TBE-Virus vom westlichen Subtyp durch seine Sequenz identifiziert. Dieses Protein ist eine nützliche Impfstoffkomponente und kann bequemerweise durch rekombinante DNA- Technologie hergestellt werden.
Gemäß einem ersten erfindungsgemäßen Aspekt wird ein Peptid oder Polypeptid zur Verfügung gestellt, das die Aminosäuresequenz des NS-1- Proteins des TBE-Virus vom westlichen Subtyp, wie in Figur 4 gezeigt, besitzt.
Obwohl es bevorzugt ist, Peptide oder Polypeptide dieser Erfindung durch Expression der geeigneten Nukleotidsequenzen dieser Erfindung herzustellen, ist es auch möglich, die erfindungsgemäßen Peptide oder Polypeptide zu isolieren oder vorzugsweise chemisch zu synthetisieren. Die Peptide oder Polypeptide können daher in im wesentlichen reiner Form und/oder im wesentlichen frei von anderen Substanzen, mit denen sie natürlich vorliegen, bereitgestellt werden.
Peptide oder Polypeptide gemäß dem ersten erfindungsgemäßen Aspekt können an sich oder in Verbindung mit einem oder mehreren Exzipienten als Diagnostika oder als Bestandteile in der Herstellung von Impfstoffen nutzbar sein. Vorzugsweise sind die Peptide oder Polypeptide in einer Zusammensetzung enthalten, die im medizinischen Bereich verwendet werden kann.
Gemäß einem zweiten erfindungsgemäßen Aspekt wird eine Impfstoffzusammensetzung zur Verfügung gestellt, die ein Peptid oder Polypeptid gemäß dem ersten erfindungsgemäßen Aspekt enthält, und eine oder mehrere zusätzliche pharmazeutisch verträgliche Komponenten. Solche Komponenten können einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Adjuvans für das Peptid oder Polypeptid umfassen. Andere geeignete Komponenten können einen Puffer umfassen.
Der Impfstoffträger kann jeder geeignete Träger sein und kann ein oder mehrere Adjuvantien, falls notwendig, enthalten. In Übereinstimmung mit üblicher Praxis können alle Impfstoffzusammensetzungen gemäß dieser Erfindung steril vorliegen.
Ferner ist eine bevorzugte Verwendung von Impfstoffen, die antigene Peptide oder Polypeptide enthalten, die Herstellung spezifischer Immunglobuline, z.B. monoklonale oder polyklonale Antikörper, die nach dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt werden können. Antikörper gegen Peptide oder Polypeptide können ebenfalls als Teil der Erfindung angesehen werden.
Wie oben erwähnt, kann eine Zusammensetzung, die eines oder mehrere der erfindungsgemäßen Peptide oder Polypeptide enthält, auch als Diagnostikum eingesetzt werden. Diese Erfindung betrifft auch eine Nukleinsäure, die für die Peptide oder Polypeptide gemäß dem ersten Aspekt kodiert.
Gemäß einem dritten erfindungsgemäßen Aspekt wird eine Nukleinsäure zur Verfügung gestellt, die für das NS-1-Protein des TBE-Virus vom westlichen Subtyp kodiert. Die Nukleinsäure, die eine rekombinante Nukleinsäure sein kann und oft sein wird, insbesondere eine rekombinante DNA, kann für das gesamte oder im wesentlichen das gesamte NS-1-Protein kodieren.
Diese DNA- und RNA-Moleküle sind nicht nur nützlich zum Bereitstellen von Peptiden oder Polypeptiden gemäß dem ersten Aspekt, sie können auch zur Herstellung eines Lebendimpfstoffes verwendet werden. Vorzugsweise werden die TNA-Sequenzen mit der DNA von Vaccinia-Virus, das als Lebendimpfstoff gut etabliert ist, kombiniert werden.
Abgesehen von ihrer Verwendung als Lebendimpfstoffe sind die erfindungsgemäßen DNA- oder RNA-Sequenzen zusätzlich geeignet als Sonden für Screening-Zwecke.
Zur Zeit sind keine antiviralen Mittel für die spezifische Behandlung von TBE-Patienten erhältlich. Es gibt jedoch mehrere potentielle Möglichkeiten spezifisch in den viralen Lebenszyklus einzugreifen, einschließlich von Prozessen, die nichtstrukturelle Proteine betreffen, wia die RNA-Replikation, posttranslationale proteolytische Verarbeitung und Viruszusammenbau. Nukleinsäure, die für das NS-1- Protein oder ein Teil davon kodiert, könnte auch für diesen Zweck nützlich sein. Zusätzlich zum Eingriff in die funktionalen Aktivitäten von viralen Proteinen ist es ebenfalls machbar, den viralen Replikationsprozeß durch Verwendung von Anti-Sense-RNA zu blockieren.
Es gibt eine Anzahl von Wegen zur Herstellung von DNA-Molekülen innerhalb des Umfangs dieser Erfindung. Eine Möglichkeit, um das DNA- Molekül zu erhalten, ist zunächst die Extraktion viraler RNA aus TBE-Virus vom westlichen Subtyp und Reinigung des RNA-Moleküls, worauf Transkription dieser RNA-Matrize in ein DNA-Molekül unter Verwendung reverser Transkriptase erfolgt. Eine weitere Möglichkeit ist die chemische Synthese von DNA-Molekülen gemäß der Erfindung, nachdem einmal die DNA-Sequenz aufgeklärt wurde.
Als bevorzugte Ausführungsform umfaßt diese Erfindung DNA-Moleküle, die an die DNA-Moleküle gemäß dem ersten Aspekt hybridisieren, und insbesondere an eine DNA-Sequenz wie in Figur 3 und/oder an eine DNA- Sequenz, die für das Protein, wie in Figur 4 gezeigt, kodiert, unter stringenten Bedingungen hybridisiert, z.B. die nach mindestens 90 % Nukleotidsequenz-Homologie selektiert. DNA-Moleküle dieser bevorzugten Art können immer noch für Peptide kodieren, die eine Antikörper-Antwort auslösen können, und ferner sind solche DNA-Moleküle als DNA-Sonden geeignet.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird Nukleinsäure, einschließlich der kompletten Sequenz des TBE-Virusgenoms vom westlichen Wildtyp, die für das nichtstrukturelle Protein NS-1 kodiert, zur Verfügung gestellt, wie auch DNA-Moleküle, die aus der genomischen RNA, die für das Protein kodiert, abgeleitet sind. DNA-Moleküle innerhalb des Umfangs der Erfindung konnen mit der einzelsträngigen RNA des TBE-Virus vom westlicher Subtyp korrespondieren oder komplementär hierzu sein und sind geeignet zui Bereitstellung genetischer Information zur Expression des gesamten NS-1- Proteins oder eines Teiles davon, welches als Impfstoffkomponente oder für diagnostische oder therapeutische Zwecke verwendet werden kann.
Die Erfindung umfaßt explizit alle DNA-Sequenzen, die sich von den DNA-Molekülen, entsprechend oder komplementär zu einer natürlichen NS-1- RNA-Sequenz, unterscheiden, entweder durch Degeneration des genetischen Kodes und/oder Mutationen und/oder Transpositionen, die im normalen Bereich natürlicher Variation vom TBE-Virus vom westlichen Subtyp liegen. Diese Sequenzen kodieren daher immer noch für Proteine mit den wesentlichen Eigenschaften (insbesondere den wesentlichen antigenen Eigenschaften) des nichtstrukturellen NS-1-Proteins des TBE-Virus vom westlichen Subtyp.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung können die beanspruchten DNA-Moleküle mit zusätzlichen DNA-Sequenzen kombiniert sein.
Diese zustätzlichen Sequenzen können die Replikation und Expression des DNA-Moleküls in einer Zellkultur erlauben. Die wichtigsten DNA- Sequenzen für diesen Zweck sind solche, die als Promotoren, Enhancer, Polyadenylierungssignale und Splicing-Signale fungieren. Diese zusätzlichen DNA-Sequenzen können mit dem DNA-Molekül gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung nach Standardverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, kombiniert werden.
Die oben diskutierten Vorteile für die DNA-Moleküle innerhalb des Umfangs der Erfindung treffen ebenfalls für RNA-Moleküle auf die gleiche Weise zu. Erfindungsgemäße RNA-Moleküle können durch Isolierung und Reinigung von TBE-Virus-RNA vom westlichen Subtyp oder durch rekombinante RNA-DNA-Techniken erhalten werden. Ferner sind nicht nur die RNA-Moleküle, die durch Reinigung vom TBE-Virus des westlichen Subtyps erhalten werden, von dieser Erfindung eingeschlossen, sondern es werden auch RNA-Moleküle, die durch Transkribieren isolierter und gereinigter Virus-RNA in DNA durch reverse Transkriptase und anschließende Transkription der so erhaltenen DNA wiederum in RNA oder durch RNA-abhängige RNA-Transkription erhalten werden, umfaßt.
Erfindungsgemäß werden nicht nur die DNA- und die RNA-Moleküle, wie oben beschrieben, bereitgestellt, sondern auch Vektoren, die als Insert ein DNA- oder RNA-Molekül innerhalb des Umfangs der Erfindung enthalten. Gemäß einem vierten Aspekt der Erfindung wird ein Vektor zur Verfügung gestellt, der ein Klonierungsvektor oder ein Expressionsvektor sein kann, der eine Nukleinsäuresequenz gemäß dem dritten Aspekt umfaßt. Der Vektor kann z.B. ein Plasmid, ein Virus (z.B. ein Tier (z.B. Vaccinia)-Virus oder ein Phage) oder Cosmid sein. Wie im Stand der Technik bekannt ist, umfassen solche Vektoren im allgemeinen Sequenzen, die die Replikation und Expression der eingefügten RNA- oder DNA-Sequenzen kontrollieren; solche Kontrollsequenzen können ein Promotor und möglicherweise zusätzlich einen Enhancer oder andere Sequenzen enthalten.
Gemäß dem vierten Aspekt der Erfindung wird eine Wirtszellen, enthaltend einen wie oben beschriebenen Vektor, zur Verfügung gestellt Viele solcher Zellen können in einer Zellkultur bereitgestellt werden.
Die Vektoren sind vorzugsweise in Zellkulturen enthalten, in denen die Expression der Polypeptide, kodiert für die RNA- und DNA-Sequenzen, gemäß dieser Erfindung erfolgt, wobei die Zellkultur vorzugsweise eine Säugerzellkultur ist. Durch die Verwendung einer Säugerzellkultur werden die am meisten bevorzugten Bedingungen für die Expression eines Polypeptids bereitgestellt, das als Impfstoff zur Prävention von TBE-Virus-Infektionen vom westlichen Subtyp von Säugern verwendet werden soll.
Zum besseren Verständnis der Erfindung und zur Darlegung, wie sie ausgeführt werden kann, werden nun bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung unter Bezugnahme auf die anliegenden Zeichnungen beschrieben, in denen bedeutet:
FIGUR 1 zeigt die Aufnahme einer Agarosegel-Elektrophorese des unverdauten Plasmids BS 17-6 (Bahn b), die die gesamte kodierende Sequenz für das NS-1-Protein enthält. Bahn c zeigt einen BamHI-Verdau des gleicher Plasmids und die beiden Bahnen a enthalten 0,6Kb-, 2Kb- und 10Kb- Größenmarker.
FIGUR 2 zeigt die komplette Nukleotidsequenz des Inserts 17-6 enthaltend in Plasmid BS 17-6.
FIGUR 3 zeigt die RNA-Sequenz und die kodierte Aminosäure-Sequenz des Inserts 17-6. Die Positionsnummern entsprechen dem Gesamtlängengenom des TBE-Virus.
FIGUR 4 zeigt die Aminosäure-Sequenz des Proteins NS-1, abgeleitet aus der Sequenzinformation von Klon 17-6. Die Positionsnummern werden von der ersten Aminosäure des Proteins NS-1 gezählt.
FIGUR 5, auf die im folgenden Beispiel 10 Bezug genommen wird, zeigt die Strategie zur Klonierung von NS-1 in den prokaryontischen Expressionsvektor pUC19S.
FIGUREN 6A und 6B, auf die ebenfalls in Beispiel 10 Bezug genommen wird, zeigen die Nukleotidsquenzen des Klons pNS1387 am 5'- und 3'-Terminus. Ein NS-1-Insert liegt im Leserahmen des bakteriellen lacZ- Gens. Die Expression steht unter der Kontrolle des lacZ-Operator/Promotor- Systems. In FIGUR 6A ist der allgemeine Aufbau des Konstrukts gezeigt. In FIGUR 68 sind die DNA- und Protein-Sequenzen angegeben. In diesem Konstrukt hat das NS-1 40 zusätzliche Nukleotide, entsprechend den 14 Aminosäuren des lacZ-Gens und der pUC19S-Polylinker an seinem 5'-Ende. Es gibt zusätzlich 27 nicht-NS-1-Nukleotide (entsprechend 9 Aminosäuren) am 3'-Ende. Nukleotid-Positionen relativ zum TBE-Genom, aus FIGUR 3, sind durch Sternchen angegeben.
FIGUR 7A, auf die in Beispiel 11 Bezug genommen wird, zeigt eine Klonierungsstrategie von NS-1 mit seiner authentischen 5'-Signalsequenz in dem prokaryontischen Expressionsvektor pUC19S.
FIGUR 7B, auf die ebenfalls in Beispiel 11 Bezug genommen wird, zeigt die Nukleotidsequenzen von Klon ptSNS1791 an den 5'- und 3'-Termini. Das NS-1-Insert befindet sich im Leserahmen mit der bakteriellen lacZ- Expression unter der Kontrolle des lacZ-Promotor-Systems. In Teil I ist der allgemeine Aufbau des Konstrukts gezeigt. In Teil II sind DNA- und Protein-Sequenzen angegeben. In diesem Konstrukt hat das NS-1 39 zusätzliche Nukleotide entsprechend 13 Aminosäuren vom lacZ-Gen und vom pUC19S-Polylinker an seinem 5'-Ende. Es gibt zusätzliche 30 Nicht-NS-1- Nukleotide entsprechend 10 Aminosäure am 3'-Ende. Die Nukleotidpositionen relativ zum TBE-Genom, entnommen aus FIGUR 3, sind ebenfalls durch Sternchen angegeben.
FIGUR 8A, auf die im Beispiel 12 Bezug genommen wird, zeigt die Klonierung der NS-1 kodierenden Region in dem Transfervektor pTKgptF1s zur Rekombination mit Vaccinia-Virus.
FIGUR 8B, auf die ebenfalls in FIGUR 12 Bezug genommen wird, zeigt die Nukleotid-Sequenzen des Klons pAPNS1338 an den 5'- und 3'-Termini. Das NS-1 hat 19 zusätzliche Nukleotide, entsprechend 7 Aminosäuren in seinem erwarteten Translationsprodukt aus der Polylinkerregion und an seinem 5'- Ende zusätzliche 30 Nukleotide entsprechend 10 Aminosäuren, die am 3'-Ende gefunden werden. Sterne bedeuten die Nukleotidpositionen im TBE-Virusgenom aus FIGUR 3.
FIGUREN 9A und 9B, auf die in Beispiel 13 Bezug genommen wird, zeigen die Klonierung von NS-1 und seiner vermuteten Signalfrequenz durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR). FIGUR 8A zeigt die allgemeine Strategie für die PCR. FIGUR 8B zeigt die Sequenz von chemisch synthetisierten Oligonukleotiden, die als Primer für die DNA-Amplifikation verwendet werden. Die Sternchen geben die Nukleotidpositionen im viralen Genom gemäß FIGUR 3 an.
FIGUR 10, auf die auch in Beispiel 13 Bezug genommen wird, zeigt ein Agarosegel mit dem NS-1-Fragment, synthetisiert durch PCR. Das Agarosegel ist mit Ethidiumbromid gefärbt. DNA wird unter UV-Licht nachgewiesen. Der Pfeil deutet auf das Fragment, das ca. 1130 bp lang ist.
FIGUR 11, auf die auch in Beispiel 13 Bezug genommen wird, zeigt die Klonierung der NS-1 codierenden Region mit ihrer vermutlichen Signalsequenz nach Synthese durch PCR in den Transfervektor pSC11- OrthDELTA0 zur Rekombination mit Vaccinia-Virus.
FIGUR 12, auf die auch in Beispiel 13 Bezug genommen wird, zeigt ein Agarosegel mit dem NS-1-Fragment, synthetisiert durch PCR. Das authentische NS-1 codierende Region, einschließlich ihrer Signal-Frequenz erwirbt in ihrem erwarteten Translationsprodukt 12 zusätzliche Nukleotide entsprechend 4 Aminosäuren von der Polylinker-Region an ihrem 5'-Ende. Zusätzliche 47 Nukleotide (d.h. 16 Aminosäuren) werden am 3'-Ende gefunden. Sternchen geben die Nukleotidpositionen im TBE-Virusgenom aus FIGUR 3 an.
FIGUR 13, auf die ebenfalls in Beispiel 13 Bezug genommen wird zeigt die Analyse des Plasmid pSCtSNS1444 durch verdau mit geeigneten Restriktions-Endonukleasen. Die DNA-Muster zeigen die korrekte Orientierung der eingefügten NS-1-Sequenz in den pSC11-Orth-Vektor an und bestätigen die Größe der Fragmente, wie aus der Nukleotidsequenz des Klons 17-6 abgeleitet.
FIGUR 14, auf die in Beispiel 14 Bezug genommen wird, zeigt die Klonierung von NS-1 mit seiner vermutlichen Signalsequenz in den Transfervektor pTKgptF3s zur Rekombination mit Vaccinia-Virus.
FIGUR 15, auf die auch in Beispiel 14 Bezug genommen wird, zeigt die Nukleotidsequenz des Plasmids pTKtSNS1556 an seinen 5'- und 3'-Termini. In diesem Konstrukt hat das NS-1 24 zusätzliche Nukleotide entsprechend 8 Aminosäuren in seinem erwarteten Translationsprodukt aus der Polylinker Region an seinem 5'-Ende. Zusätzliche 26 Nukleotide (d.h. 9 Aminosäuren) werden am 3'-Ende gefunden. Sternchen zeigen die Nukleotidpositionen im TBE-Virusgenom aus FIGUR 3 an.
FIGUR 16, auf die in Beispiel 15 Bezug genommen wird, zeigt eine Southern-Blot-Analyse für die NS-1 Vaccinia-Viren mit einer varecNS1556 CV-1-Zellen wurden mit rekombinanten Vaccinia-Viren mit einer Multiplizität von 5 pfu/Zelle infiziert. Zwei Tage nach Infektion wurde die Gesämt-Zell-DNA gereinigt, mit der Restriktions-Endonuklease HindIII verdaut und auf einem 1%igen Agarosegel aufgetrennt. Die DNA wurde auf einen Nitrocellulosefilter transferiert und mit dem radioaktiv markierten Plasmid pSCtSNS1444 als Sonde zum Nachweis des inserierten NS-1-Fragments und der benachbarten viralen tk-Sequenzen hybridisiert. Ein Vergleich der rekombinanten varecNS1556-112, -124, -122 und varecNS1444-121 mit Wildtyp Vaccinia DNA (Bahn 4) zeigt die erwartete Molekulargewichts-Erhöhung des HindIII-Fragments. Nur varecNS1556-222 zeigt eine kleinere Bande entsprechend dem w.t.-Fragment. Das weist daraufhin, daß das Plaque-Isolat nicht homogen ist. 1556-122 usw. sind verschiedene Plaque-Isolate aus dem gleichen Rekombinationsexperiment nach drei Plaque-Reinigungen. Als Kontrollen und Größemarker wurden verschiedene Verdaus des Plasmid pSCtSNS1444 verwendet (Bahnen 6 und 7).
FIGUR 17, auf die in Beispiel 16 Bezug genommen wird, zeigt eine Autoradiographie eines denaturierenden SDS-Gels, welches die rekombinanten Viren varecNS1444 und varecNS1556, die NS-1 Proteine exprimieren, zeigt.
Ein Protein mit einem erwarteten Molekulargewicht von ca. 48kD kann nachgewiesen werden, das nicht im Wildtyp oder varec1342 (die ein unterschiedliches Protein exprimieren) infizierten Zellen gefunden werden kann. Die sehr starke Proteinbande, die über der 97kD-Markerbande wandert, repräsentiert β-Galactosidase (116kd), die unter der Kontrolle des p11- Promotors in den pSC11-Orth abgeleiteten Rekombinanten varecNS1444 und varec1342 exprimiert wird.
Es können Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, und die Sequenz kann nach den folgenden Verfahren bestimmt werden:
Zunächst wird virale RNA aus TBE-Virus vom westlichen Subtyp oder mit TBE-Virus vom westlichen Subtyp infizierten Zellen extrahiert. Unter Verwendung dieser RNA als Matrize kann doppelsträngige cDNA z.B. durch reverse Transkriptase synthetisiert werden. Unter Verwendung der rekombinanten DNA-Techniken kann diese cDNA in eine Vektor-DNA, wie Escherichia coli Plasmid-DNA unter Erhalt eines rekombinanten Plasmids eingefügt werden. Rekombinante Plasmide können zur Transformation geeigneter Wirtszellen, wie E. coli-Stamm HB101 zur Amplifikation der Plasmide oder zur Expression der entsprechenden Proteine verwendet werden. Individuelle Kolonien mit inserthaltigen Plasmiden können durch das Mini- Plasmid-Präparationsverfahren nach Birnboim und Doly (Nucleid Acids Research, 7, 1195-1204, 1979) identifiziert werden. Die Basensequenz der spezifischen DNA vom Virus des westlichen Subtys, das im rekombinanten Plasmid vorliegt, kann durch rasche DNA-Sequenzierungsverfahren, wie dem Dideoxy-Kettenterminationsverfahren bestimmt werden.
Eine detailliertere Beschreibung eines bestimmten Verfahrens zur Herstellung von cDNA, rekombinanten Plasmiden, mit diesen Plasmiden transformierten Zellen und zur Bestimmung der Nukleotidsequenz ist wie folgt: Zunächst kann virale RNA vom TBE-Virus vom westlichen Subtyp aus gereinigtem Virus erhalten werden. Zu diesem Zweck kann TBE-Virus vom westlichen Subtyp in primären Hühnerembryozellen kultiviert werden, durch Ultrazentrifugation konzentriert und durch zwei Zyklen von Saccharose- Dichtegradienten-Zentrifugation gereinigt werden. Nach Solubilisierung der Proteine mit SDS in Gegenwart von Proteinase K und RNAse-Inhibitor, z.B. durch Inkubation für eine Stunde bei 37ºC, wird die RNA z.B. mit Phenol extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Unter Verwendung dieser RNA als Matrize wird dann eine DNA, die zur Virus-RNA komplementär ist, in vitro durch eine reverse Transkriptase, z.B. aus einem Affen-Myeloblastose-Virus, z.B. nach dem Verfahren von Gubler und Hofmann (Gene 25, 263-269, 1983) synthetisiert. Unter Verwendung von Primer, wie z.B. Hexanukleotid-Primer, erhalten aus Kalbsthymus-DNA, wird die virale RNA unter geeigneten Bedingungen, wie z.B. in Manual "cDNA synthesis system" von Amersham, England, beschrieben, mit reverser Transkriptase zusammen mit Deoxyadenosin-Triphosphat (dATP), Deoxythymidin-Triphosphat (dTTP), Deoxyguanisin-Triphosphat (dGTP) und Deoxycytidin-Triphosphat (dCTP) als Substrate inkubiert. Das so erhaltene cDNA.RNA-Hybrid wird mit RNAse H unter definierten Bedingungen behandelt, was Brüche in der RNA des Hybrid- Moleküls erzeugt. E. coli DNA-Polymerase 1 kann dann zur wirksamen Ersetzung des RNA-Strangs unter Verwendung der gebrochenen RNA als Primer verwendet werden. Die so erhaltene doppelsträngige RNA wird durch Phenol- Chloroform-Extraktion deprotoniert, mit Ethanol präzipitiert und die übrigen RNA-Fragmente werden dann durch Behandlung mit RNAse entfernt (z.B. in TE Puffer, 37ºC, 30 min).
Klonieren der dsDNA erfolgt z.B. unter Verwendung synthetischer Linker. Zu diesem Zweck wird die dsDNA mit dem Klenow-Fragment von E. coli DNA-Polymerase 1 unter geeigneten Bedingungen (Maniatis et al, Molecular Cloning, CSH 1982) zur Sicherstellung einer maximalen Menge an klonierbaren glatten Enden behandelt, worauf Phenolextraktion zur Entproteinisierung folgt. dsDNA wird unter geeigneten Bedingungen mit BamHI-Linkern in Gegenwart von DNA-Ligase inkubiert. Die Reaktionsmischung wird aufgegeben und auf einem 1%igen Agarosegel aufgetrennt und verschiedene Größenklassen von cDNA werden aus dem Gel ausgeschnitten und gereinigt, z.B. durch Elektroelution. Andererseits wird ein als Vektor-DNA zu verwendendes Plasmid DNA, z.B. E. coli Plasmid BLUESCRIPT SK-, mit Restriktions- Endonuklease BamHI gespalten und unter Verwendung bakterieller alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. Nach Verdau des cDNA mit BamHI wird sie mit der BamHI geschnittenen Vektor-DNA vermischt und unter geeigneten Bedingungen inkubiert, die eine Hybridisierung der komplementären überhängenden Sequenzen an den Enden beider DNA-Moleküle erlauben, und unter Verwendung von T4-DNA-Ligase legiert. Das rekombinante DNA-Molekül wird zur Transformation eines kompetenten E. coli-Stammes (z.B. E. coli XL 1-blue) verwendet. Virusspezifische Insert-haltige Rekombinanten werden durch Farbselektion identifiziert. Plasmide werden nach dem Mini-Plasmid- Präparationsverfahren (Birnboim und Doly, Nucleic Acids Research 7, 1195- 1204, 1979) isoliert und Insertgrößen werden durch Restriktions- Enzymanalysen unter Verwendung von BamHI und Auftrennung der erhaltenen Fragment auf 1%igem Agarosegel analysiert.
Die Basensequenz dieser Inserts wird durch das Dideoxy- Kettenterminationsverfahren nach Sanger et al (PNAS USA, 74, 5463-6467, 1977) bestimmt. Die erhaltene Sequenz wird nach Homologien mit bereits bekannter Sequenzen anderer Flaviviren (Rice et al, Science 229, 726-733, 1985; Dalgarno et al, J. Mol. Biol., 187, 309-323, 1986; Castle et al, Virology 147, 227-236, 1985; Castle et al, virology 149, 10-26, 1986; Wengler et al, Virology 147, 264-274, 1985; Yamshchikov und Pletnev Nucleic Acid Res. 16 7750, 1988) mit Hilfe von Computer-Programmen analysiert, um den Ort der zu untersuchenden Sequenz in der Gesamtsequenz der genomischen RNA festzulegen. Figur 2 zeigt die komplette Nukleotidsequenz und Figur 3 die entsprechende Aminosäuresequenz der NS-1-Region des TBE-Virusgenoms vom westlichen Subtyp.
Die vorliegende Erfindung stellt daher erstmals die Nukleotidsequenz des für das NS-1-Protein des TBE-Virus vom westlichen Subtyp kodierenden Gens zur Verfügung und stellt folglich die Aminosäuresequenz dieses Proteins zur Verfügung.
Die Basesequenz in Figur 2 ist ein bevorzugtes Beispiel für eine DNA, die für Polypeptide mit den Eigenschaften des NS-1-Proteins des TBR-Virus vom westlichen Subtyp kodiert. Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes kann die gleiche Aminosäuresequenz auch durch anderen Basen-Triplets als die in der Figur gezeigten kodiert werden.
Innerhalb des Umfangs der Erfindung sind ebenfalls Sequenzen umfaßt, die durch Mutation, Transposition und Abbau verändert sind, die nichtsdestoweniger für eine Aminosäuresequenz, die immer noch die wesentlichen antigenen Eigenschaften des NS-l-Proteins aufweist, kodiert.
Zusätzlich betrifft die Erfindung nicht nur genau die gleiche Aminosäuresequenz wie in Figur 3 gezeigt, die nur eine exemplarische Sequenz der NS-1-Sequenz vom TBE-Virus-Isolat vom natürlichen westlichen Subtyp darstellt. Es ist eine wohlbekannte Tatsache, daß die Genome von RNA-Viren einer höheren Mutationsfrequenz als solche, die bei DNA-Viren oder zellulären Genen gefunden werden, aufgrund der hohen Fehlerrate der RNA-Polymerase und des Fehlens von Sicherheits-Ablese-Mechanismen unterworfen sind (Holland et al, Science 215, 1577-1585, 1982; Reanney, Arin. Rev. Microbiol. 36, 47-73, 1982). Je nach den Eigenschaften des Virus können diese Mutationen zu einer raschen Entwicklung von neuen Virustypen aufgrund einer antigenen Verschiebung Anlaß geben, wie es bei Influenza Virus der Fall ist (Both et al in: "The Origin of Pandemic Influenza Viruses", W.G. Laver (ed.), Elsevier, 1983). Andererseits können RNA-Viren unter natürlichen ökologischen Bedingungen vermutlich aufgrund funktionaler Beschränkungen, die keine extensiven strukturellen Veränderungen in den antigenisch aktiven Proteinen erlauben, antigenisch stabilier sein. Trotzdem muß ein gewisses Ausmaß an Variationsbreite in Betracht gezogen werden und kann durch Sequenzvergleich der verschiedenen natürlichen Isolate demonstriert werden.
Das kann z.B. durch Sequenzieren der RNA verschiedener Isolate unter Verwendung des Dideoxy-Kettenterminationsverfahren mit synthetischen Oligonukleotiden als Primer erfolgen, die nach der Sequenz des in Figur 2 gezeigten Prototyp-Isolats hergestellt wurden.
Alle Sequenzen, die im Vergleich zu den Prototyp-Sequenzen leichte Variationen zeigen, wie solche, die in anderen natürlichen Isolaten vom TBE-Virus vom westlichen Subtyp gefunden werden, sind von der Erfindung mitumfaßt. Solche Variationen können ebenfalls durch in vitro - Modifikationen der Nukleinsäure erhalten werden. Diese Erfindung umfaßt daher alle Sequenzen, die unter stringenten Bedingungen, z.B. Selektion nach mindestens 90 % Nukleotid-Sequenzhomologie, mit den Sequenzen oder Teilen der offenbarten Sequenzen hybridisieren, und die vorzugsweise für Proteine oder Peptide mit im wesentlichen antigenen determinanten Eigenschafen von Strukturproteinen des TBE-Virus vom westlichen Subtyp kodieren.
Insertion der für ein Protein, wie NS-1, kodierenden Nukleotidsequenz in geeignete Vektore(n) und Wirtszellen zur Expression in einem hohen Maße ist eine wirksvolle Technologie zur Untersuchung der Struktur und der biologischen Funktion(en) des Proteins. Das zu verwendende Expressionssystem hängt immer von bestimmten molekularen Eigenschaften, z.B. post-transiationaler Modifikation des fraglichen Proteinmoleküls ab.
Die Expression kann in prokaryontischen oder eukaryontischen Zeilsystemen erfolgen. Für Glycoproteine, wie NS-1 erfolgt die Expression besser in einer eukaryontischen Wirtszelle, die zur richtigen Glycosylierung in der Lage ist. Ein bevorzugtes Expressionssystem besteht aus einem Vaccinia-Virus und einer primären Zellinie, die kontinuierlich in Kultur wächst. Dies stellt sicher, oder hilft sicherzustellen, daß die korrekten post-transiationalen Modifikationen und die Synthese mit hoher Ausbeute erzielt werden können.
Ferner gibt es ausreichend Belege dafür, daß Genregulationssequenzen des Vaccinia-Virus die Synthese von beinahe jedem Fremdprotein, entweder unter Verwendung eines "Spätphasen"-Promotors oder Verwendung eines "konstitutiven" Promotors, der während der frühen und späten Phase der viralen Replikation aktiv ist (Moss und Flexner, Ann. Rev. Immunol. 4 305- 324 (1987)) gesteuert werden kann. Es wurde jedoch berichtet, daß die Stabilität von Fremdproteinen, die in Vaccinia-Virus infizierten Zellen exprimiert werden, stark durch den Promotor, der die Expression des fraglichen Gens reguliert, beeinflußt wird (Coupar et al, Eur. J. Immunol. 16 1479 (1986); Townsend et al, J. Exp-Med. 168 1211-1224 (1988)).
Die Konstruktion geeigneter Expressionsplasmide, enthaltend NS-1 spezifische Inserts erfordern extensive DNA-Manipulation. Es muß in Betracht gezogen werden, daß NS-1 Teil eines Polyproteins ist, das Posttranslational in individuelle Proteine durch zelluläre und virale Proteasen abgebaut wird (Mandl et al, Virology 173 291-301 (1989)). Im Verlauf einer natürlichen Virusinfektion benötigt die Synthese von NS-l eine interne Signalsequenz am NH&sub2;-Terminus. Das Signal leitet die gebildete Polypeptidkette in das Lumen des endoplasmatischen Reticulums, was für richtige post-translationale Modifikationen, wie Glycosylierung, notwendig ist. Um ein korrekt prozessiertes Expressionsprodukt zu erhalten, muß dieses oder eine heterologe Signalsequenz in das rekombinante Molekül eingebaut sein.
Da ferner NS-1 Teil eines Polyproteins ist, enthält es kein Start- oder Stop-Codon für die Translation. Diese müssen durch spezifische rekombinante DNA-Manipulationen bereitgestellt werden.
Hydrophobe (5')-Signal- und (3')-Ankersequenzen sind in der Sequenz des Klon 17-6 (Figur 3) umfaßt. Das Fehlen von geeigneten Endonuklease- Restriktionsschnittstellen erlaubt keine direkte Klonierung des NS-1 mit seiner "natürlichen" Signalsequenz in Insertions-Vektoren. Daher kann ein Abschnitt von 1200 bp, umfassend die NS-1-Signalsequenz, und die Sequenz des reifen NS-1, z.B. in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR), synthetisiert werden. Diese Technik erlaubt auch die Einführung möglicher Restriktionsschnittstellen auf beiden Seiten der amplifizierten DNA, sowie auch von Start- und Signalsequenzen.
Ein spezifisch aufgebautes Primer-Paar für die Amplifikation führt zu einem NS-1-Sequenzprodukt, das durch Erkennungsstellen für die Restriktions-Endonuklease EcoRI flankiert wird. Unter Verwendung dieser Methode ist es möglich, die authentische NS-1-Signalsequenz durch irgendeine Signalsequenz, die natürlich vorkommt, oder durch eine synthetische Konsensus-Signalfrequenz nach den Vorschlägen von v.Heinje (NAR 14 4683-4690 (1986)) auszutauschen.
Alle Plasmide, die spezifisch für die Expression von NS-l-Molekülen entwickelt wurden, können in ein Ausgangs-Vaccinia-Virus (Stamm WR oder abgeschwächte Derivate des gleichen) durch homologe Rekombination in permissiven Wirtszellen, z.B. primäre CV-1-Zellen, transportiert werden. Das experimentelle Verfahren zur Erzeugung rekombinanter Vaccinia-Viren ist allgemeines Fachwissen und ist dem Fachmann bekannt und muß nicht beschrieben werden (Mackett et al, JRL Press; "DNA cloning II" Ed. DM Glover 191-211, 1985).
Die Erfindung betrifft auch die Synthese von NS-1-Molekülen in einem bakteriellen Wirt. Glycoproteine, die in bakteriellen Zellen exprimiert werden, werden im allgemeinen nicht auf die gleiche Weise wie in eukaryontischen Zellen glycosyliert. Nichtsdestoweniger kann die Synthese von NS-1 auch in nichtglycosylierter Form für verschiedene Zwecke nützlich sein. Als Beispiel haben Derivate des Hüllglycoproteins (gp) 160 von HIV-1, exprimiert in Bakterienzellen, signifikant zur HIV-Diagnose und experimentellen Impfung beigetragen.
Analog zur Konstruktion von Insertions-Plasmiden für die Rekombination mit Vaccinia-Virus wird eine NS-1-Sequenz einschließlich ihrer authentischen Signalsequenz mit PCR synthetisiert und in, z.B., pUC-19 kloniert. Die Substitution der TBE-Signalsequenz durch eine prokaryontische Signälsquenz, um eine wirksame Sekretion von NS-1-Molekülen aus den bakteriellen Zellen zu erreichen, ist möglich. Das letztere kann die Ansammlung von NS-1 und die Bildung von Inklusionskörperchen verhindern, die mit Lösungsmitteln oder anderen Solubilisierungsmitteln gelöst werden müssen.
Neben der Synthese des kompletten und reifen NS-1 kann diese Experimentiervorschrift auch auf verkürzte Formen des NS-1-Moleküls angewandt werden. Verkürzte Formen können verwendet werden, um eine gegen spezifische Stellen des Proteins gerichtete Immunantwort zu induzieren. Solche Formen können auch wertvolle Hilfsmittel zur Durchführung von "site directed serology" sein. Immunologisch relevante Epitope innerhalb des NS-1 können in Trägermoleküle als Adjuvantien (z.B. HB-Kernpartikel) oder in einen immunstimulierenden Komplex (ISCOM) (Morein et al, Immunology Today 8 (11) 333-338 (1987)) eingebaut werden.
Alle NS-1-Moleküle, die in prokaryontischen und eukaryontischen Expressionssystemen, wie in dieser Anmeldung beschrieben, synthetisiert werden, repräsentieren Moleküle, die als Kandidat für ein NS-1-Impfstoft geeignet sind, entweder allein oder gegebenenfalls in Kombination mit dem rekombinanten Glycoprotein-E des TBE-Virus (EP-A-0284791) oder bereits erhältlichen Impfstoffen aus inaktiviertem TBE-Virus.
Ferner kann die Analyse der Immunantwort gegen dieses nichtstrukturelle Protein oder Teile davon kritisch für das Verständnis der Pathogenität des TBE-Virus und anderer Mitglieder der Flavivirus-Familie sein.
Fremd-DNA- oder RNA-Sequenzen können auch in Genome von Lebendviren eingebaut werden, um so rekombinanten Viren zu erzeugen, die als Lebensimpfstoff verwendet werden können (zur Übersicht S. Mackett und Smith, J. Gen. Virol. 67, 2067-2082, 1986).
Es können ebenfalls Kombinationen von verschiedenen Genen, z.B. abgeleitet aus verschiedenen Viren, gleichzeitig durch rekombinante DNA- Technologien exprimiert und zur Impfung verwendet werden (Perkus et al, Science, 229, 981-984, 1985). Die Erfindung umfaßt daher alle Kombinationen von Sequenzen, die mit anderen Sequenzen offenbart sind, wie z.B. Gene, die für andere Proteine kodieren, oder Sequenzen, die zur Expression der Proteine beitragen, wie z.B. Promotoren, Enhancers, Polyadenylierung oder Splicing-Signale.
Es ist dem Fachmann bekannt, daß nicht notwendigerweise die gesamten, natürlich vorkommenden Proteine für die Immunisierung oder für diagnostische Zwecke verwendet werden müssen (Lerner, Nature 299, 592-596, 1982; Arnon, TIBS 11, 521-524, 1986).
Proteine oder Teile von Proteinen zur Verwendung als Impfstoffe oder Diagnostika können nicht nur durch rekombinante DNA-Technologien, wie oben beschrieben, hergestellt werden, sondern die Sequenz-Information, wie in der Erfindung offenbart, kann auch zur chemischen Synthese von Oligopeptiden verwendet werden. Es ist umfangreiche Literatur zu diesem Thema erhältlich: Es wurden Peptide, die gemäß DNA-Sequenzen, die für viele verschiedene Proteine kodieren, synthetisiert und für eine Vielzahl von Zwecken, wie molekularbiologische und immunologische Untersuchungen (Lerner et al, Cell, 23, 309-310, 1981; Lerner, Nature, 299, 592-596, 1982) oder zur Immunisierung verwendet (Shinnick et al, Axin. Rev. Microbiol. 37, 425-446, 1983; Dimarchi et al, Science, 232, 639-641, 1986). Die Herstellung und Verwendung von Peptiden oder Kombinationen von Peptiden entsprechend den erfindungsgemäß offenbarten Sequenzen bildet daher den Stand der Technik.
Es ist ferner dem Fachmann bekannt, Nukleinsäuren und -Sequenzen, die durch die Erfindung bereitgestellt werden, zur Herstellung von Hybridisierungssonden, z.B. zur Verwendung für die Bestimmung von Virus-RNA in Zecken oder Körperflüssigkeit, einzusetzen (Meinkoth und Wahl, Anal. Biochem. 138, 267-284, 1984; Kulski und Norval, Arch. Virol. 83, 3-15, 1985). Diese können entweder mit der rekombinanten DNA-Technologie oder durch chemische Synthese von Oligonukleotiden nach der offenbarten Sequenz hergestellt werden.
Die Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele erläutert. Wo nicht besonders angegeben, folgen die Maßnahmen solchen, die üblicherweise im Stand der Technik angewandt werden. Solche Verfahren können z.B. in einer Vielzahl von Standardwerken, einschließlich Sambrook, Fritsch und Maniatis "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (zweite Auflage) Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, gefunden werden.

BEISPIELE

Beispiel 1 Vermehrung und Reinigung von TBE-Virus

Eine 10%ige Suspension aus dem Gehirn TBE-Virus-infizierter säugender Mäuse wurde zur Infektion von Monolayern aus primären Hühner- Embryonalzellen, die in Minimalmedium (MEM), gepuffert mit 15mM HEPES und 15mM EPPS bei pH 7,6 angezüchtet wurden, verwendet. Nach 40-stündiger Inkubation bei 37ºC wurde der Überstand bei 10.000G für 30 min bei 4ºC geklärt, und das Virus wurde durch Ultrazentrifugation bei 50.000G für 3 Stunden bei 4ºC pelletiert. Das Virus wurde dann in einem geeigneten Volumen von TAN-Puffer (0,05M Triethanolamin, 0,1M NaCl, pH 8,0) resuspendiert und einer Geschwindigkeitszonen-Zentrifugation in einem 5-20 % (Gew./Gew.) Saccharose-Dichtegradienten bei 170.000xg für 110 min bei 4ºC unterworfen. Der Viruspeak wurde durch Scannen des Gradienten bei 254nm lokalisiert und eine Equilibrium-Dichtegradienten-Zentrifugation in einem 20 bis 50% (Gew./Gew.) Saccharose-Gradienten für 18 Stunden bei 4ºC bei 150.000xg unterworfen. Der Viruspeak wurde gegen TAN pH 8,0 unter Entfernung von überschüssiger Saccharose dialysiert.

Beispiel 2 Herstellung viraler RNA

100 µg gereinigtes Virus wurden in 400 µl Proteinase K-Reaktionspuffer (10mM Tris pH 7,8, 5mM EDTA, 0,5 % Gew./V. SDS) verdünnt. Proteinase K wurde mit einer Endkonzentration von 200 µg/ml zugegeben und die Mischung wurde 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Anschließend wurde die Lösung durch zweimalige Extraktion mit gleichem Volumen (400 µl) Phenol und einmal mit Chloroform : Isoamylalkohol (24:1) deproteinisiert. Anschließend wurden 26 µl einer 3M Na-Acetatlösung zugegeben, und die RNA wurde mit 2,5 Volumeneinheiten an Ethanol präzipitiert. Vor der Weiterverarbeitung wurde ein Aliquot der RNA mit Glyoxal denaturiert und auf einem 1%igen Agarosegel aufgetrennt, um die Ausbeute und die Qualität der Präparation zu überprüfen.

Beispiel 3 Synthese doppelsträngiger cDNA

5 µg der Ethanol-präzipitierten RNA wurden in 40 µl eines ersten Strangsynthesepuffers (Amersham, UK), der 5 µg von Oligonukleotid- Zufallsprimern enthielt, resuspendiert auf 70ºC für eine Minute erhitzt, und dann langsam auf Raumtemperatur gekühlt. Alle vier Deoxynukleotid- Triphosphate wurden bis zu einer Endkonzentrationen von 1mM zugegeben. Ferner wurden 5 Einheiten von humanem Placenta-Ribonuklease-Inhibitor und 10 µCi α-³²P dCTP zur Mischung zugegeben. Die Synthese des ersten Stranges wurde durch Zugabe von 100 Einheiten reverser Transkriptase (Amersham) gestartet und für 2 Stunden bei 42ºC inkubiert. Dann wurde die Reaktionsmischung auf Eis gestellt, und die Reagenzien für die Synthese des zweiten Stranges wurden in dieser Reihenfolge zugegeben: 93,5 µl eines Synthesepuffers für den zweiten Strang (Amersham, UK), 4 Einheiten Ribonuklease H, 23 Einheiten E. coli DNA-Polymerase und Wasser auf ein Endvolumen von 250 µl. Die Synthese des zweiten Stranges erfolgte durch anschließende Inkubation bei 12ºC und 22ºC (jeweils 2 Stunden) und wurde durch Erhitzen der Lösung für 20 min auf 70ºC abgebrochen. Die doppelsträngige cDNA wurde 10 min mit T4-DNA-Polymerase für 30 min bei 37ºC verdaut, um glatte Enden zu erzeugen. Anschließend wurde die cDNA durch Phenol- und Chloroform-Extraktionen gereinigt und mit 2 Volumeneinheiten an Ethanol präzipitiert.

Beispiel 4 Linker-Ligation

Synthetische 5'-phosphorylierte BamHI-Linker (New England Biolabs) wurden zur cDNA in einer Über-Nacht-Reaktion bei 12ºC zugegeben. Die Reaktionsmischung enthielt in einem Endvolumen 20 µl Ligationspuffer (50mM Tris pH 7,5, 5mM MgCl&sub2;, 5mM DTT, 1mM ATP) ca. 1 µg cDNA, 1 µg Linker-DNA und 1 µl T4-DNA-Ligase (New England Biolabs)

Beispiel 5 Größenfraktionierung der cDNA

Die cDNA wurde auf einem 1 % Agarosegel fraktioniert. Verschiedene Größenfraktionen wurden aus dem Gel ausgeschnitten und die DNA wurde aus der Agarose in einem analytischen Elektroelutor (IBI) nach den Herstellerangaben extrahiert. Trotz der kleinen Menge an handhabarer DNA, die kaum durch Ethidium-Bromidfärbung nachgewiesen werden konnte, konnte das Extraktionsverfahren leicht aufgrund der radioaktiven Markierung, die in die cDNA eingebaut war, überwacht werden. Ein Größenfraktionierungsschritt lieferte ein Mittel zur selektiven Klonierung großer Fragmente der cDNA und diente auch zur kompletten Abtrennung der cDNA von nichtligierten Linker-Molekülen.

Beispiel 6 Klonieren in ein bakterielles Phagemid

Die cDNA wurde mit 10 Einheiten BamHI-Restriktionsendonuklease 1 Stunde bei 37ºC verdaut. Nach Phenol- und Chloroformextraktionen wurde die DNA in 2 Volumeneinheiten Ethanol präzipitiert und in einem kleinen Volumen Wasser resuspendiert. 20 bis 30 ng der cDNA wurden mit 50 ng des Phagemids BLUESCRIPT SK ("BLUESCRIPT" ist eine Marke) (Stratagene) , der durch BamHI- Verdau linearisiert worden war, vermischt. Diese beiden Komponenten wurden mit T4-DNA-Ligase in 10 µl Ligationspuffer (s. oben) in einer Über-Nacht- Reaktion bei 16ºC ligiert. Am nächsten Morgen wurde die Ligationsmischung auf 65ºC für 5 min erhitzt, 100-fach mit Wasser verdünnt und zur Transformation von E. coli XL1 Blue -Zellen verwendet. Kompetente Bakterien wurden von Stratagene erworben und mit 3 µl verdünnter Ligationsmischung transformiert, wobei man exakt der Vorschrift des Herstellers folgte. Die Bakterien wurden auf LB-Agarplatten, enthaltend Ampicillin, Tetracyclin, IPTG und X-Gal, ausplattiert.
Beispiel 7 Identifikation der Insert-haltigen Phagemiden Im BLUESCRIPT-Vektorsystem liefern Insert-haltige Phagemide weiße bakterielle Kolonien, wogegen self-ligiertes Phagemid eine blaue Farbreaktion ergibt. Daher wurden weiße Kolonien isoliert und zur Impfung von 2 ml LB-Medium, enthaltend Ampicillin, verwendet und über Nacht bei 37ºC in einem Schüttler mit 220 Umdrehungen pro Minute verwendet. Am nächsten Tag erfolgte eine raschen Plasmid-Präparation nach einem Standard- Verfahren (Birnboim und Doly, Nucleic Acids Research 7, 1195-1204, 1979). Die Plasmide wurden mit dem Restriktionsenzym BamHI verdaut und auf 1%igem Agarosegel analysiert. Ein auf diese Weise identifizierter Klon war das Phagemid BS 17-6, das ein ca. 2000 bp langes Virus-spezifisches Insert trägt. Figur 1 zeigt ein 1%iges Agarosegel einer raschen Plasmidpräparation von BS 17-6, sowohl in der supercoiled zirkulären als auch in der BamHI verdauten linearen Form..

Beispiel 8 Sequenzanalyse des Inserts vom Klon BS 17-6

Einzelsträngige DNA des Klons BS 17-6 wurde durch Zugabe von VCS- Helferphagen (Stratagene) mit einer M.O.I- von 20:1 zu exponentiell wachsenden Kulturen von BS 17-6, enthaltend E. coli XL1 Blue-Bakterien, hergestellt. Nach heftigem Schütteln der Kultur bei 37ºC für 16 Stunden wurde ssDNA aus dem Überstand nach Standardvorschriften gereinigt. Diese einzelsträngige DNA wurde in der gesamten Region des Inserts nach dem Dideoxy-Verfahren von Sanger et al (PNAS USA 74, 5463-6467; 1977) , unter Verwendung des SEQUENASE -Enzyms (United States Biochemicals) und der vom Enzymhersteller bereitgestellten Reagenzien sequenziert. Eine Vektorspezifische und ein Set von Virus-Sequenz-spezifischen Oligonukleotiden wurden als Primer für die Sequenzierungsreaktionen verwendet. Die komplette Sequenz des Inserts 17-6 ist in Figur 2 gezeigt.

Beispiel 9 Ableiten der Aminosäure-Sequenz des Proteing NS-1

Die Translation der Nukleotid-Sequenz von 17-6 in allen möglichen Leserahmen zeigte nur einen langen offenen Leserahmen. Die in diesem Rahmer abgeleitete Aminosäure-Sequenz wurde den Sequenzen anderer Flaviviren zugeordnet (Rice et al, Science 229; 726-733 (1985); Coia et al, J. Gen. Virol. 69, 1-21 (1988); Chambers et al, Virology 169, 100-109 (1989)). Für diese Analysen wurde die Beckman MICROGENIE Software (Version 4.0) auf einem IBM-Personal-Computer eingesetzt. Die Analyse zeigte, daß Klon 17-6 die gesamte codierende Sequenz für das Protein NS-1 und Teile der kodierenden Sequenz der Proteine E und NS2A, die das NS-1-Gen flankieren, innerhalb des flaviviralen Genoms enthielt.
Figur 3 gibt die RNA-Sequenz und die kodierte Aminosäure-Sequenz, abgeleitet aus Klon 17-6, wieder. Man vermutet, daß der Amino-Terminus vor NS-1 von einer zellulären Signalase freigesetzt wird, der Carboxy-Terminus durch ein Signalase-ähnliches Enzym. Eine größere Form des NS-1-Proteins, das auch den Amino-terminalen Part des Proteins NS2A enthält, wurde von Mason et al beobachtet (Virology 158, 361-371 (1987)). Der Carboxy-Terminus dieser Form das NS-1-Proteins kann auch von einer Virus-spezifischen Protease oder der zellulären Signalase (Rice et al, Science 229, 726-733 (1985)) freigesetzt werden. Der Amino-Terminus und die drei möglichen Carboxy-Termini sind in Figur 3 angegeben. Der von einem Signalaseähnlichen Enzym freigesetzte Carboxy-Termininus (Chambers et al, Virology 169 100-109 (1988)) ist als "COOH-Terminus 1" angegeben; der Carboxy- Terminus, der möglicherweise durch eine mögliche Virus-spezifische Protease gebildet wird, wird als "COOH-Terminus 2" bezeichnet; und der von der zellulären Signalase freigesetzte potentielle Carboxy-Terminus ist als "COOH-Terminus 3" gezeigt. Die Positionsangaben, die in Figur 3 verwendet werden, beziehen sich auf das Genom des TBE-Virus mit gesamter Länge.
Figur 4 zeigt die Aminosäure-Sequenz des Proteins NS1, abgeleitet von der Sequenz-Information des Klons 17-6. Die möglichen COOH-Termini sind wie in Figur 3 angegeben. Die Positionsangaben werden von der ersten Aminosäure des Proteins NS-1 gezählt. Figur 4 gibt auch die Orte der drei möglichen N-Glycosylierungsstellen, die im TBE-Virusprotein NS-1 vorliegen, an.

Beispiel 10 Klonieren der NS-1 codierenden Region in einen prokaryontischen Expressionsvektor

Die für NS-1 kodierende Nukleotid-Sequenz wird aus Klon 17-6 in pUC19S subkioniert. Der Vektor pUC19S ist ein Derivat von pUC19, das einen Stop- Linker mit einem TAG-Stop-Kodon in allen drei Leserahmen, der in die BamHI- Schnittstelle kloniert wird, enthält. Die NS-1-Sequenz, die einen kleinen Teil von NS-2a an ihrem 3'-Ende enthält, wird mit der Restriktions- Endonuklease CfoI ausgeschnitten, und glatte Enden werden mit S1-Nuklease erzeugt. Der Klonierungsvektor pUC19S wird in seinem Polylinker mit SalI linearisiert und die Termini werden mit T4-DNA-Polymerase (Figur 5) aufgefüllt. Die Ligation von Vektor und Insert regeneriert die SalI- Schnittstelle und fusioniert NS-1 in den Rahmen mit dem lacZ-Gen (Figuren 6A und 6B). Am 3'-Terminus wird die NS-1-Nukleotid-Sequenz durch prokaryontische transkriptionale und translationale Stop-Signale, die im Vektör enthalten sind, flankiert. Das Plasmid wird als pNS1387 bezeichnet.

Beispiel 11 Klonieren der NS-1 codierenden Region, einschließlich ihrer 5'-proximalen, hydrophoben Signalsequenz unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion

Zur Konstruktion eines induzierbaren prokaryontischen Expresssionsplasmids, enthaltend die NS-1 codierende Region einschließlich (Beispiel 13) in pUC19S transferiert, was zum Klon ptSNS1682 führt. Um das NS-1-Gen in den gleichen Leserahmen wie lacZ zu plazieren, wird der Klon ptSNS1682 mit HindIII verdaut, glatte Enden werden mit S-1 Nuklease erzeugt und religiert, was so zum Klon ptSNS1791 mit einer Deletion von 4 Nukleotiden (Figuren 7a und 7b) führt.

Beispiel 12 Konstruktion eines Plasmids für die Rekombination in Vaccinia-Virus: Das NS-1-Protein unter der Kontrolle des VV-p11 (L)-Promotors

Die NS-1 codierende Region (z.B. in Beispiel 10) wird in die SalI- Schnittstelle des Plasmids pTKgptF1s (Falkner, G.F. und B. Moss, (J. Virol 62, 1849-1854 (1988)) subkloniert. Die NS-1-Sequenz wird im Rahmen mit dem ATG-translationalen Startcodon des Vektors positioniert. Translationale Stop-Signale werden ebenfalls durch den Vektor zur Verfügung gestellt. Die Polylinkerregion des Vektors fügt zusätzlich 7 Aminosäuren am 5'-Ende und 10 Aminosäuren am 3'-Ende ein. Die Klonierungsstrategie und die flankierenden Sequenzen des Proteins sind in Figur 8a und 8b gezeigt. Das Plasmid wird als pAPNS133* bezeichnet.

Beispiel 13 Konstruktion eines Plasmids für die Rekombination in Vacciniavirus, das NS-1 Protein mit seiner natürlichen Signalfrequenz unter der Kontrolle des VV-p7,5 (E/L)- Promotors

Eine Nukleotid-Sequenz, umfassend die NS-1 codierende Region und ihre Signalsequenz wird mit der Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung von Klon 17-6 als Matrize synthetisiert. Zwei Oligonukleotide mit den Restriktions-Endonuklease-Schnittstellen EcoRI und SalI am 5'-Ende und SalI und HpaI am 3'-Ende werden chemisch synthetisiert und als Primer in der PCR verwendet (Figuren 9A und 9B). Das amplifizierte NS1-Fragment wird aus einem Agarosegel gereinigt (Fig. 10), mit SalI gespalten und in die SalI- Schnittstelle des Vektors pSC11-Orth nach kleineren Modifikationen kloniert. Das Plasmid pSC11-Orth wurde bei der D.S.M., Braunschweig, Westdeutschland, unter DSM 5734 am 15. Januar 1990 hinterlegt. Die Klonierungsstrategie und die Sequenzen der 5'- und 3'-Termini des neuen Konstrukts sind in Figuren 11 und 12 gezeigt. Ein Agarosegel eines Restriktionsverdaus des Klons, welches die korrekte Orientierung des Inserts zeigte, ist in Figur 13 gezeigt. Das Plasmid wird als pSCtSNS1444 bezeichnet.

Beispiel 14 Konstruktion eines Plasmids für die Rekombination in Vaccinia-Virus: Das NS-1-Protein mit seiner ursprünglichen Signal-Frequenz unter der Kontrolle des VV-p11 (L) -Promotors

Plasmid pTKtSNS1556 stammt aus der Sub-Klonierung von NS-1 aus Klon 1854 (1988)). Die NS-1-Sequenz wird mit SalI ausgeschnitten und in die SalI-Schnittstelle des pTKgptF3s eingefügt. Die Klonierungsstrategie und die Nukleotidsequenzen von pTKtSNS1556 sind in Figuren 14 und 15 gezeigt.
Alle Plasmide werden unter Ampicillin-Selektion von 100 µg/ml in E. coli-Wirten, wie DK1, BH101 oder JM-Stämmen (JM105, JM83) kultiviert.

Beispiel 15 Erzeugung von Vaccinia-Rekombinanten für die Expression von NS-1-Protein

Rekombinante Viren werden nach Standardverfahren erzeugt (Mackett, M., Smith, G. und Moss, B. in: DNA Cloining: A Practical Approach, Seiten 191- 121. Herausgegeben von D.M. Glover; Oxford: IRL Press). Die Plasmid-DNA von Vaccinia-Virus Wildtypus infiziert wurden. Die von pSC11-Orth-abgeleitete Rekombinante varecNS1444 wird auf BiDR in 143tk-Zellen selektiert. Die pTKgptFs abgeleitete Rekombinante varecNS1556 wird durch gpt-Selektion auf CV-1-Zellen isoliert. Alle Rekombinanten wurden dreimal plaque-gereinigt. Der korrekte Aufbau der Rekombinanten wird mit Southern Blot-Analyse analysiert (Fig. 16).

Beispiel 16 Expression von NS-1 in CV-1-Zellen, die mit Vaccinia-Virus-Rekombinanten infiziert wurden

CV-1-Zellen werden mit den Vaccinia-Virus-Rekombinanten varecNS1444 und varecNS1556 infiziert. Zwei Tage nach Infektion werden die Zellen mit ³&sup5;S Methionin 4 Stunden markiert. Proteine werden auf 12% denaturierendem SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und mit Autoradiographie identifiziert. Eine Proteinbande entsprechend einem erwarteten Molekulargewicht von ca. 48 kD kann in rekombinanten Viren nachgewiesen werden, wogegen diese Bande in Zellen mit Wildtyp-Virus oder Nicht-NS-1-Kombinanten wie varec1342 (Fig. 17) fehlt.

Claims

1. Rekombinantes Protein, umfassend die Aminosäure-Squenz des NS-1-Proteins eines TBE-Virus vom westlichen Subtyp, wie in Figur 4 gezeigt

2. Protein nach Anspruch 1 zur Verwendung in der Medizin.

3. Impfstoffzusammensetzung, umfassend ein Protein nach Anspruch 1 und ein oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Komponenten.

4. Diagnostikum, umfassend ein Protein nach Anspruch 1.

5. Nukleinsäure, kodierend für ein Protein nach Anspruch 1.

6. Nukleinsäure nach Anspruch 5, die eine DNA ist, und die zusätzliche DNA-Sequenzen umfaßt, worin die zusätzlichen Sequenzen die Replikation und Expression des DNA-Moleküls in einer Zellkultur erlauben, und vorzugsweise Sequenzen enthält, die als Promotor, Enhancer, Polyadenylierungssignal und/oder Splicingsignal fungieren.

7. Nukleinsäure nach Anspruch 6, worin der Promotor den VV-p7,5- oder VV-p11-Promotor umfaßt.

8. Vektor, wie ein Plasmid, ein anderes Virus als das natürliche TBE-Virus vom westlichen Subtyp oder ein Phage, umfassend die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 5 bis 7.

9. Vektor nach Anspruch 8, der von Vaccinia-Virus abgeleitet ist.

10. Vektor nach Anspruch 8, der von einem bakteriellen Plasmid abgeleitet ist.

11. Wirtszelle, enthaltend einen Vektor nach einem der Ansprüche 8 bis 10.

12. Kultur von Wirtszellen nach Anspruch 11.

13. Kultur nach Anspruch 12, welche eine Säugerzellkultur ist.

14. Kultur nach Anspruch 13, die eine CV-1-Zellkultur ist.

15. Verfahren zur Herstellung von NS-1-Protein des TBE-Virus vom westlichen Subtyp, dadurch gekennzeichnet, daß das NS- 1-Protein aus einer Kultur nach einem der Ansprüche 12 bis 14 isoliert wird.