CZ277921B6 - Peptides and polypeptides, vaccines and nucleic acids - Google Patents
Peptides and polypeptides, vaccines and nucleic acids Download PDFInfo
- Publication number
- CZ277921B6 CZ277921B6 CS902806A CS280690A CZ277921B6 CZ 277921 B6 CZ277921 B6 CZ 277921B6 CS 902806 A CS902806 A CS 902806A CS 280690 A CS280690 A CS 280690A CZ 277921 B6 CZ277921 B6 CZ 277921B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- protein
- virus
- dna
- nucleic acid
- vector
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 31
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 27
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 26
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 26
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 55
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 45
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 29
- 102100029241 Influenza virus NS1A-binding protein Human genes 0.000 claims abstract description 88
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 55
- 101000633984 Homo sapiens Influenza virus NS1A-binding protein Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 24
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 69
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 52
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 48
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 45
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 35
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 34
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 17
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims description 16
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 11
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 7
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 claims description 6
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 claims description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000017105 transposition Effects 0.000 claims description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 abstract description 28
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 abstract description 28
- 208000004006 Tick-borne encephalitis Diseases 0.000 abstract description 16
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 abstract description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000470 constituent Substances 0.000 abstract 1
- 101710128560 Initiator protein NS1 Proteins 0.000 description 56
- 101710144127 Non-structural protein 1 Proteins 0.000 description 56
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 48
- 241000710771 Tick-borne encephalitis virus Species 0.000 description 46
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 18
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 17
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 14
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 14
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 12
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 11
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 10
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 8
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 7
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 6
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 6
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 6
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 6
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 5
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 4
- 101710088839 Replication initiation protein Proteins 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 4
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 2
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 2
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 2
- 101150033828 NS1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101800000512 Non-structural protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 2
- 208000009714 Severe Dengue Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000710772 Yellow fever virus Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N glyoxal Chemical compound O=CC=O LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 2
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 2
- 229940051021 yellow-fever virus Drugs 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000238421 Arthropoda Species 0.000 description 1
- 241000713838 Avian myeloblastosis virus Species 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108700016947 Bos taurus structural-GP Proteins 0.000 description 1
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 description 1
- 101000611764 Gordonia sp. (strain TY-5) Propane 2-monooxygenase, effector component Proteins 0.000 description 1
- 101001090095 Gordonia sp. (strain TY-5) Propane 2-monooxygenase, hydroxylase component large subunit Proteins 0.000 description 1
- 101001090278 Gordonia sp. (strain TY-5) Propane 2-monooxygenase, hydroxylase component small subunit Proteins 0.000 description 1
- 101000701089 Gordonia sp. (strain TY-5) Propane 2-monooxygenase, reductase component Proteins 0.000 description 1
- OWXMKDGYPWMGEB-UHFFFAOYSA-N HEPPS Chemical compound OCCN1CCN(CCCS(O)(=O)=O)CC1 OWXMKDGYPWMGEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061192 Haemorrhagic fever Diseases 0.000 description 1
- 101000807236 Human cytomegalovirus (strain AD169) Membrane glycoprotein US3 Proteins 0.000 description 1
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 241001480847 Ixodes persulcatus Species 0.000 description 1
- 241001480843 Ixodes ricinus Species 0.000 description 1
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N L-norVal-OH Natural products CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010024887 Louping ill Diseases 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 101710145006 Lysis protein Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- UEQUQVLFIPOEMF-UHFFFAOYSA-N Mianserin Chemical compound C1C2=CC=CC=C2N2CCN(C)CC2C2=CC=CC=C21 UEQUQVLFIPOEMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000710908 Murray Valley encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101800001030 Non-structural protein 2A Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 101710141795 Ribonuclease inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122208 Ribonuclease inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102100037968 Ribonuclease inhibitor Human genes 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 102400000827 Saposin-D Human genes 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 108010093857 Viral Hemagglutinins Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 201000006449 West Nile encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 208000003152 Yellow Fever Diseases 0.000 description 1
- 241000120645 Yellow fever virus group Species 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000012505 colouration Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 239000007771 core particle Substances 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 201000009892 dengue shock syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 230000003544 deproteinization Effects 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229940015043 glyoxal Drugs 0.000 description 1
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000010211 hemagglutination inhibition (HI) assay Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 238000001799 protein solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007925 protein solubilization Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 229940043517 specific immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 229940124856 vaccine component Drugs 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000009447 viral pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
- G01N2333/18—Togaviridae; Flaviviridae
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Peptidy a polypeptidy, vakciny a nůkleové kyseliny
Oblast techniky
Vynález se týká peptidů, polypeptidů, vakcin a·diagnostických látek pro západní podtyp viru TBE a nukleových kyselin a bílkovin, vhodných pro použití v těchto vakcinách a diagnostických činidlech.
Dosavadní stav techniky
Západní podtyp viru klíšťové encefalitidy (TBE) náleží do čeledi flaviviridae. Jde o RNA viry, opatřené kulovitým lipidovým obalem, jak bylo popsáno v Westaway a další, Intervirology 24, 183-192, 1985. Prototypem tohoto viru je virus žluté horečky. Všechny viry z této čeledi jsou serologicky příbuzné, jak je možno prokázat testy na inhibici hemaglutinace. Při zkřížené neutralizaci je však možno tuto čeleď rozdělit na několik podskupin na základě serologických komplexů, jak bylo popsáno v DeMadrid and Portefield, J. Gen. Virol. 23, 91-96, 1974. Tyto skupiny obsahují blíže příbuzné flaviviry na rozdíl od serologicky méně příbuzných virů. Virus TBE náleží do skupiny serokomplexu virů, přenášených klíšťaty. Tato skupina zahrnuje rovněž viry nazývané Louping ill, Langat, Omsk (hemorhagická horečka), Kyasanur (lesní horečka) a Negishi.
Kmeny viru TBE je dále možno přiřadit k západnímu (evropskému) typu, který je přenášen primárně klíštětem Ixodes ricinus a k dálněvýchodnímu typu, jehož hlavním vektorem je Ixodes persulcatus (Clarke, 1964, Bull. WHO 31, 45-56).
Tato diferenciace na podtypy byla potvrzena kompetitivní RIA a mapováním peptidů při použití omezené proteolyzy odpovídajících strukturních glykoproteinů, jak bylo popsáno v Heinz a Kunz, 1981, J. Gen. Virol. 57, 263-274) a také analýzou antigenů při použití monoklonálních protilátek (Heinz a další, Virology 126, 525-537, 1983).
Zralé částice viru obsahují pouze 3 strukturní bílkoviny nazývané E, C a M s přibližnou molekulovou hmotností 50 až 60 000, 15 000 a 7 000.
Genom flavivirů je tvořen RNA s jednoduchým řetězcem s přibližně 11 000 mazemi s polaritou mRNA s molekulovou hmotností 4 x 106. Spolu s bílkovinou C tvoří tato RNA sférický nukleokapsid, který je obalen lipidovým obalem, spojeným s bílkovinou E i M. Pokusy s čištěnými přípravky bílkoviny E, získanými po solubilizaci viru pomocí smáčedel prokázaly, že bílkovina E představuje virový hemaglutinin, to znamená, že způsobuje hemaglutinaci určitých erythrocytů za příslušných podmínek, což po imunizaci vyvolá inhibici hemaglutinace, neutralizaci a vznik ochranných protilátek a tím i imunitu proti nákaze živým virulentním virem, jak bylo popsáno v Heinz a další, Infect. Immun. 33, 250-257, 1981.
Kromě těchto strukturních bílkovin bylo možno prokázat v buňkách, infikovaných flaviviry určité nestrukturní bílkoviny, .specifické pro virus.
Organizace genomu flavivirů byla v poslední době stanovena cDNA-klonováním a analýzou řetězce virů žluté horečky, West Nile a Murray Valley encefalitidy (Rice a další, Science 229, 726-733, 1985, Dalgarno a další, J. Mol. Biol. 187, 309-323, 1986, Castle a další, Virology 147, 227-2'36, 1985, Castle a další, Virology 149, 10-26, 1986, Wengler a další, Virology 147, 264-274, 1985). Podle těchto analýz obsahuje RNA genomu flavivirů jednoduchý dlouhý otevřený řetězec, obsahující přibližně 11 000 nukleotidů, který je kódem pro všechny strukturní a nestrukturní bílkoviny.
Pořadí genů, stanovené pro virus YF a potvrzené pro několik dalších flavivirů je 5; C-prM(M)-E-NSl-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4BNS5 3.C. E a prM(M) označují strukturní bílkoviny, které lze nalézt v nezralých (C, prM, E) a ve zralých (C, M a E) částicích viru, kdežto zbytek genomu je kódem pro nestrukturní bílkoviny. Strukturní a nestrukturní bílkoviny byly stanoveny v korelaci s odpovídajícími segmenty genomu na základě aminoterminální analyzy řetězce.
Je možno předpokládat, že translace virových bílkovin začíná na prvním kodonu AUG na 5'- zakončení RNA a pokračuje až do stop kodonu na 3' zakončení RNA. Tvorba jednotlivých bílkovin je tedy provázena řadou specifických štěpných pochodů, jichž se účastní jak buněčné proteázy, tak proteázy, specifické pro virus.
Až dosud bylo zjištěno přibližně 60 různých flavivirů a přibližně 2/3 z nich se přenáší kousnutím infekčními arthropody, takže jsou nazývány také viry ARBO (arthropod-borne). Několik z nich je pathogenních pro člověka včetně viru žluté horečky, viru dengue, viru japonské encefalitidy nebo viry jiných encefalitid (Shope v The Togaviruses, str. 47-82, Academie Press, New York, 1980).
Virus TBE je endemický v mnoha evropských státech, Rusku a Číně. Onemocnění je dobře dokumentováno v některých státech střední Evropy jako jsou Rakousko, Československo a Maďarsko a každoročně je hospitalizováno několik set nemocných, což představuje vážný zdravotní problém.
Onemocnění je možno účinně zabránit vakcinací pomocí vakciny, kterou je vysoce čištěný, formladehydem inaktivovaný virus (Kunz a další, J. Med. Virol 6, 103-109, 1980), který vyvolává imunologickou odpověď proti strukturním bílkovinám viru. Zásadní nevýhodou této vakciny je skutečnost, že -je nutno zacházet s velkými objemy potenciálně nebezpečné suspenze viru v průběhu její výroby. Je proto nutné zachovávat rozsáhlá a nákladná bezpečnostní opatření.
Byly proto vyvíjeny snahy nalézt způsob výroby vakciny bez svrchu uvedených nevýhod. V EP 284 791 se tento problém řeší získáním molekuly DNA s obsahem DNA viru západního podtypu TBE, která je kódem pro alespoň část alespoň jednoho typu strukturní bílkoviny, například ze skupiny bílkovin C, prM, M nebo E nebo západního podtypu viru TBE.
Tato molekula DNA odpovídá RNA s>jednoduchým řetězcem západního podtypu viru TBE a bylo prokázáno, že je vhodná pro získání genetické informace při expresi polýpeptidu, a to úplné bílkoviny C, prM, M nebo E západního podtypu viru TBE nebo části některé ze shora uvedených bílkovin. Takový polypeptid je možno užít k diagnostickým nebo léčebným účelům například při výrobě vakciny.
Analýza řetězce rovněž potvrdila,.že existuje diferenciace proti dálněvýchodnímu podtypů. Aminokyseliny jednotlivých řetězců se od sebe liší až ve 14 % (v závislosti na bílkovině), jak bylo popsáno v publikaci Jamščikov a Pletnov, Necleic Acid Res. 16, 7750 (1988).
Přestože vakcina na bázi jedné nebo většího počtu rekombinantních strukturních bílkovin, tak jak byla popsána v EP 284 791 může znamenat zlepšení ve srovnání s inaktivovaným neporušeným virem jako vakcinou z hlediska výroby, má jinak s uvedenou vakcinou stejné nevýhody, že totiž neobsahuje nestruktumí bílkoviny, které mohou přispívat k ochranné imunologické odpovědi.
Nestrukturní bílkoviny mají důležité funkce pro životní cyklus flavivirů, a to pro dozrávání, proteolytické pochody a pro replikaci RNA. Přestože bylo prokázáno, že jedna z nestrukturních bílkovin (NS 1) je u virů, odlišných od virů TBE schopna vyvolat ochrannou imunologickou odpověď (Schlessinger a další, J. Gen. Virol. 68 853-857 (1987), Zhang a další, J.Virol. 62, 3027-3031 (1988) u pokusných zvířat, nebyly k disposici žádné důkazy tohoto typu pro nestrukturní bílkoviny TBE.
Je známo, že subneutralizačni koncentrace neutralizačních protilátek nebo jiných protilátek proti epitopům flavivirové bílkoviny E může zprostředkovat na protilátce závislé zlepšení infektivity u buněk, nesoucích Fc-receptory (Portefield, Cardosa: Concepts in viral Pathogenesis I, kapitola 17, str. 117), tento poznatek pomáhá objasnit pathogenetiku hemorrhagické horečky dengue a syndrom šoku, vyskytující se u této choroby (Ha.lstead, Science 239, 476-481 1988). V některých případech proto může být výhodné se vyvarovat použití bílkoviny E flavivirů ve vakcinách nebo je dokonce možno použít NS 1 jako jedinou složku vakciny a vůbec do vakciny nevčleňovat strukturní bílkoviny.
Jedna z bílkovin NS-1 západního podtypu viru TBE byla v poslední době identifikována svým řetě. _ un. Tato bílkovina je vhodnou složkou vakciny a je možno ji snadno získat použitím rekombinantní DNA.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je tedy peptid nebo polypeptid, který obsahuje alespoň část aminokyselinového řetězce bílkoviny NS-1 západního podtypu viru TBE.
V případě, že peptid nebo polypeptid obsahuje pouze část aminokyselinového řetězce bílkoviny je výhodné, aby šlo o imunogenní část. Avšak s výhodou má tento peptid nebo polypeptid řetězec aminokyselin, znázorněný na obr. 4.
Podstatu vynálezu také tvoří jakékoliv řetězce aminokyselin, které se liší od řetězce aminokyselin přírodního NS-1 mutací nebo transposicí, což spadá do běžných přirozených variací západního podtypu viru TBE. Tyto řetězce si však stále uchovávají podstatné vlastnosti (zvláště antigenní) nestrukturní bílkovina NS-1 západního podtypu viru TBE.
Přestože je výhodné získávat peptidy nebo polypeptidy podle vynálezu expresí příslušných nukleotidových řetězců, je také možno je izolovat nebo s výhodou synthetizovat chemickým způsobem. Peptidy nebo polypeptidy je tak možno získat v podstatě v čisté formě, prosté jiných látek, s nimiž jsou za přírodních podmínek obvykle smíseny.
Peptidy nebo polypeptidy podle vynálezu je možno užít jako takové nebo spolu s jednou nebo větším počtem pomocných látek jako diagnostická činidla a.jako složky vakcin. S výhodou se tyto látky zpracovávají na prostředky pro použití v lékařství.
Vynález se rovněž týká vakciny, která obsahuje peptid nebo polypeptid podle vynálezu a jednu nebo větší počet pomocných složek, přijatelných z farmaceutického hlediska. Z těchto složek může jít o nosič nebo pomocnou látku pro peptid nebo polypeptid. Další vhodnou složkou je například pufr.
Nosičem pro vakcinu může být jakýkoliv vhodný nosič a může v případě potřeby obsahovat jednu nebo větší počet pomocných látek. Podle běžné praxe je možno všechny vakciny podle vynálezu sterilizovat.
Výhodným použitím vakcin s obsahem antigenních peptidů nebo polypeptidů je příprava specifických imunoglobulinů, například monoklonálních nebo polyklonálních protilátek, tyto látky je možno získávat známým způsobem. Tyto protilátky proti peptidům a polypeptidům rovněž tvoří součást podstaty vynálezu.
Jak již bylo svrchu uvedeno, je možno použít prostředek s obsahem jednoho nebo většího počtu peptidů nebo polypeptidů podle vynálezu jako diagnostické činidlo.
Vynález se rovněž týká nukleových kyselin, které jsou kódem pro peptidy nebo polypeptidy podle vynálezu.
Podstatou vynálezu jsou tedy rovněž nukleové kyseliny, které jsou kódem pro alespoň část bílkoviny NS-1 západního podtypu viru TBE. Tyto nukleové kyseliny, často rekombinantní, zejména rekombinantní DNA mohou být kódem pro celou nebo v podstatě celou bílkovinu NS-1 nebo pro její příslušnou část.
Tyto molekuly DNA a RNA jsou použitelné pro získání peptidů a polypeptidů podle vynálezu a také pro výrobu živých vakcin. Tyto řetězce DNA se s výhodou spojují s DNA viru Vaccinia, který se často užívá jako žiyá vakcina.
Kromě svého použití jako živé vakciny mají řetězce DNA a RNA své použití také jako sondy.
V současné době nejsou k disposici žádné specifické látky pro léčbu nemocných s nákazou virem TBE. Existuje však několik potenciálních možností .specifické interference s životním cyklem viru včetně postupů, které zahrnují použití nestrukturních bílkovin jako je replikace RNA, posttranslační proteolytické pochody a sestavování úplného viru. Nukleové kyseliny, které jsou kódem pro bílkovinu NS-1 nebo její část by mohly být pro tento účel rovněž použitelné. Kromě interference s funkčními činnostmi virových bílkovin je také možno blokovat replikační pochody viru při použití protismyslné RNA.
Existuje řada cest pro přípravu molekul DNA podle vynálezu. Jednou z možností získání molekuly DNA je postup, při němž se nejprve extrahuje RNA viru západního podtypu TBE a molekula RNA se čistí, načež se provede transkripce tohoto templátu RNA na molekulu DNA při použití reversní transkriptázy. Další možností je chemicky synthetizovat molekulu DNA, jakmile byl zjištěn její řetězec.
Ve výhodném provedení zahrnuje vynález DNA, která hybridizuje s molekulami DNA podle prvního provedení a zejména s řetězci DNA z obr. 3 a/nebo molekulou DNA, která je kódem pro bílkovinu z obr. 4 za vymezených podmínek, např. při selekci na alespoň 90% homologii řetězce nukleotidů. Molekuly DNA tohoto výhodného typu mohou stále ještě být kódem pro peptidy, vyvolávající jako odpověď tvorbu protilátek, mimoto jsou tyto molekuly DNA vhodné jako sondy.
V jednom z provedení vynálezu jde o nukleovou kyselinu, obsahující úplný řetězec genomu divokého západního podtypu viru TBE, který je kódem pro nestrukturní bílkovinu NS-1 a o molekuly DNA, odvozené od RNA genomu, které jsou kódem pro alespoň část uvedené bílkoviny. Molekuly DNA podle vynálezu mohou odpovídat nebo mohou být komplementární k RNA s jednoduchým řetězcem západního podtypu viru TBE a jsou vhodné pro získání genetické informace, týkající se exprese úplné bílkoviny NS-1 nebo její části nebo většího počtu jejích částí a jejich použití jako složky vakciny pro léčebné a diagnostické účely.
Vynález se výslovně týká všech řetězců DNA, které se liší od molekul DNA, které odpovídají nebo jsou komplementární k přírodnímu řetězci RNA pro NS-1, ať již ke změně došlo degenerací genetického kódu a/nebo mutací a/nebo transposicí v rámci běžných přirozených variací západního podtypu viru TBE. Tyto řetězce jsou tedy stále ještě kódem pro bílkoviny, které mají základní vlastnosti (zejména základní antigenní vlastnosti) nestrukturní bílkoviny NS-1 západního podtypu viru TBE.
Ve výhodném provedení vynálezu je možno tyto řetězce DNA spojovat s dalšími řetězci DNA.
Tyto další řetězce mohou umožňovat replikaci a expresi molekuly DNA v buněčné struktuře. Nejdůležitější řetězce DNA k tomuto účelu jsou řetězce, které mají funkci promotoru nebo mohou být pomocnými řetězce, polyadenylačními signály, a signály pro štěpení. Tyto další řetězce je možno spojovat s molekulami FNA podle vynálezu standardními postupy.
Výhody, které jsou spojeny se shora uvedenými molekulami DNA platí rovněž stejným způsobem i pro molekuly RNA. Molekuly RNA podle vynálezu je možno získat izolací a čištěním RNA západního podtypu viru TBE nebo rekombinantním postupem při použití RNA/DNA. Podstatu vynálezu tvoří nejen molekuly RNA, které byly získány čištěním RNA západního podtypu viru TBE, nýbrž také molekuly RNA, které byly získány transkripcí izolované a čištěné RNA viru na DNA působením reversní transkriptázy s následnou transkripcí takto získané DNA zpět do RNA nebo transkripcí RNA, závislou na RNA.
Podstatu vynálezu netvoří pouze molekuly DNA a RNA, tak jak byly svrchu popsány, nýbrž také vektory, obsahující včleněnou molekulu DNA nebo RNA tohoto typu. Podstatu vynálezu tedy tvoří také vektory, a to vektory pro expiresi nebo pro klonování, . které obsahují řetězec nukleové kyseliny uvedeného typu. Vektorem může být například plasmid, virus (například živočišný, jako Vaccinia, nebo fág) nebo kosmid. Jak je v oboru známo, tyto vektory obvykle obsahují řetězce, řídící replikaci a expresi včleněné RNA nebo DNA. Tyto řídící řetězce mohou obsahovat promotor a mimo jiné různé pomocné řetězce, usnadňující replikaci a/nebo expresi.
Podstatu vynálezu rovněž tvoří hostitelské buňky s obsahem shora uvedeného vektoru. Buňky mohou tvořit kulturu.
Vektory se s výhodou uchovávají v buněčné kultuře, v níž dochází k expresi polypeptidů, pro které jsou kódem řetězce DNA a RNA podle vynálezu, s výhodou jde o buněčnou kulturu savčích buněk. Při použití buněčné kultury savčích buněk je možno dosáhnout nejvýhodnějších podmínek pro expresi polypeptidů, který má být užit jako vakcina pro ochranu savců proti infekcím západním podtypem viru TBE.
Vynález bude nyní popsán pro lepší pochopení v souvislosti s přiloženými výkresy.
Na obr. 1 je znázorněna fotografie agarozového gelu, na němž byla provedena elektroforéza nerozštěpeného plasmidu BS 17-6 (dráha b), který obsahuje celý kódový řetězec pro bílkovinu NS-1. V dráze c je znázorněn tentýž plasmid po rozštěpení enzymem BamHI a obě dráhy a obsahuj i značení o velikosti 0,6 kb, 2 kb a 100 kb.
Na obr. 2 je znázorněn úplný nukleotidový řetězec včleněné části 17-6 v plasmidu BS 17-6.
Na obr. 3 je znázorněn řetězec RNA a řetězec aminokyselin, pro něž je tento řetězec kódem (17-6). Polohy jsou číslovány podle číslování v úplném genomu viru TBE.
Na obr. 4 je znázorněn řetězec aminokyselin bílkoviny NS-1, odvozené od klonu 17-6. Polohy jsou číslovány od první aminokyseliny bílkoviny NS-1.
Na obr. 5, který se týká obsahu příkladu 10 je znázorněn způsob klonování NS-1 v prokaryotickém vektoru pro expresi pUC19S.
Na obr. 6A a 6B, které se rovněž týkají obsahu příkladu 10 jsou znázorněny nukleotidové řetězce klonu pNS1387 na 5'- a 3'zakončení. Včleněná část NS1 je zařazena ve správném sledu s bakteriálním genem lacZ. Exprese je pod řízením lac/Z operátoru/promotoru. Na obr. 6A je znázorněna obecná organisace uvedené konstrukce. Na obr. 6B jsou znázorněny řetězce DNA a bílkoviny. V této konstrukci má NS-1 40 přídatných nukleotidů, které odpovídají 14 aminokyselinám z genu lacZ s vazným řetězcem pUC19S na jeho 5'-zakončení. Na 3'-zakončení se nachází 27 přídatných nukleotidů, které nepatří k NS-1 (odpovídají 9 aminokyselinám). Polohy nukleotidů vzhledem ke genomu TBE (z obr. 3) jsou označeny pomocí hvězdiček.
Na obr. 7A, který se týká příkladu 11 je znázorněna strategie klonování (NS1 s autentickým 5'-signálním řetězcem v prokaryotickém vektoru pro expresi pUC19S.
Na obr. 7B, který se rovněž týká příkladu 11 jsou znázorněny nukleotidové řetězce klonu ptSNS1791 na 3'- a na 5'- zakončení. Včleněný řetězec NS1 je ve správném sledu s bakteriálním genem lacz pro expresi pod řízením jeho promotórového systému. V části I je znázorněna obecně strategie konstrukce. V části II jsou znázorněny řetězce DNA a bílkoviny. V této konstrukci má NS1 celkeM 39 přídatných nukleotidů, odpovídajících 13 aminokyselinám z genu lacZ a z vazného řetězce pUC19S na 5'- zakončení. Na 3'zakončení se nachází ještě 30 nukleotidů, jejichž původ není v NS1 a které odpovídají 10 aminokyselinám na 3'- zakončení. Polohy nukleotidů relativně ke genomu TBE jsou znázorněny hvězdičkou (TBE genom je na obr. 3).
Na obr. 8A, který se týká příkladu 12 je znázorněno klonování kódové oblasti NS1 ve vektoru pTKgptFIS pro rekombinaci s virem Vaccinia.
Na obr. 8B, který se týká rovněž příkladu 12 jsou znázorněny nukleotidové řetězce klonu pAPNS1338 na 5'- a na 3'- zakončení. NS1 obsahuje 19 přídatných nukleotidů, odpovídajících 7 aminokyselinám v očekávaném translačním produktu z polyvazné oblasti na 5'- zakončení. Hvězdičkou jsou označeny polohy nukleotidů vzhledem ke genomu viru TBE (obr. 3).
Na obr. 9A a 9B, které se vztahují k příkladu 13 jsou znázorněny podrobnosti klonování NS1 a jeho putativního signálu reakcí s polymerázou (PCR). Na obr. 8A je znázorněna obecná strategie PCR, na obr. 8B řetězce chemicky synthetizovaných oligonukleotidů, užitých jako primery pro amplifikaci DNA. Hvězdičkou jsou označeny polohy nukleotidů v genomu viru podle obr. 3.
Na obr. 10, který se. rovněž vztahuje k příkladu 13 je znázorněn agarozový gel s fragmentem NS1, syntetizovaným pomocí PCR. Agarozový gel je obarven ethidiumbromidem. Detekce DNA se provádí v ultrafialovém světle. Šipka ukazuje fragment s délkou přibližně 1130 bp.
Na obr. 11, který se rovněž týká příkladu 13 je znázorněno klonování -NS1 kódové oblasti s putativním signálním řetězcem po syntéze pomocí PCR do vektoru pSCll-OrthDELTAO pro rekombinaci s virem vaccinia.
Na obr. 12, který se rovněž týká příkladu 13 jsou znázorněny řetězce klonu pSCSNS1444 na 3'- a na 5'- zakončení. Autentická kódová oblast NS1 včetně signálního řetězce má na svém očekávaném produktu translace 12 přídatných nukleotidů, odpovídajících 4 aminokyselinám z oblasti vazného řetězce na 5'- zakončení. Dalších 47 nukleotidů (odpovídajících 16 aminokyselinám) se nachází na 3'- zakončení. Hvězdičkou jsou označeny polohy nukleotidů v genomu viru TBE (obr. 3).
Na obr. 13, který se týká příkladu 13 je znázorněna analýza plasmidu pSCtSNS1444 štěpením příslušnými restrikčními endonukleázami. Je znázorněna správná orientace včleněného řetězce NS1 do vektoru pSCll-Orth, rovněž je potvrzen rozměr fragmentů, odvozený od řetězce klonu 17-6.
Na obr. 14, který se týká příkladu 14 je znázorněno klonování NS1 včetně putativního signálního řetězce ve vektoru pTKgptF3s pro přenos a rekombinaci s virem vaccinia.
Na obr. 15, který se rovněž týká příkladu 14 je znázorněn nukleotidový řetězec plasmidu pTKtSNS1556 na 3'- a 5'- zakončení. V této konstrukci má NS1 navíc 24 nukleotidů, které odpovídají aminokyselinám v příslušném produktu translace z vazného řetězce na 5'- zakončení. Dalších 26 nukleotidů, které odpovídají aminokyselinám se nachází na 3'- zakončeni. Hvězdičkami je označena poloha nukleoidů v genomu viru TBE (obr. 3).
Na obr. 16, který se týká příkladu 15, je znázorněna analýza southern blot pro NS1- rekombinanty viru vaccinia, varecNS1444 a varecNS1556. Buňky CV-1 byly infikovány rekombinantním virem vaccinia při 5 pfu/buňka. Dva dny po infekci byla čištěna celková buněčná DNA, materiál byl rozštěpen restrikční endonukleázou HindlII a dělen na 1% agarozovém gelu. DNA byla přenesena na nitrocelulozový filtr a byla provedena hybridizace s radioaktivně značeným plasmidem pSCtNSl 444 jako sondou pro detekci včleněného fragmentu NS1 a pro sousedící řetězce viru tk. Srovnáním rekombinantních kmenů varecNS11556-112, -124, -122 a varecNS1444-121 s divokým typem viru vaccinia (vzorek 4,j byl prokázán očekávaný posun fragmentu, získaného štěpením HindlII směrem k vyšší molekulové hmotnosti. Pouze v případě varecNS1556-222 bylo možno prokázat malý pás, odpovídající w.t. fragmentu. To znamená, že izolát plaku není homogenní. 1556-122 atd., jsou různé izoláty plaků z téhož rekombinačního pokusu po trojím čištění plaků. Jako kontroly a k označení velikosti fragmentů byly užity různé štěpné produkty plasmidu pSCtSNS1444 . (vzorky 6 a 7).
Na obr. 17, který; se týká příkladu 17 je znázorněn autoradiograf denaturačního SDS-gelu s rekombinantními viry varecNS1444 a varec NS1556, u nichž dochází k expresi bílkoviny NS1. Bílkovinu s očekávanou molekulovou hmotností je možno prokázat u těchto virů (mol. hmotnost 48 000), avšak nikoliv u divokého typu varecl342 (u něhož dochází k expresi odlišné bílkoviny v infikovaných buňkách. Velmi silný pás pro bílkovinu, který přechází přes značku 97 000 je β-galaktosidáza (molekulová hmotnost 116 000), k jejíž expresi dochází pod řízením promotoru Pil v rekombinantních kmenech varecNS1444 a varecl342, odvozených od pSCll-Orth.
Je možno připravit nukleovou kyselinu podle vynálezu a stanovit její řetězec následujícími obecnými postupy:
Především je možno získat RNA viru extrakcí z buněk, infikovaných západním podtypem viru TBE. Při použití RNA jako templátu je možno získat cDNA s dvojitým řetězcem, na příklad při použití reversní transkriptázy. Při použití rekombinantní techniky je možno tuto cDNA uložit do DNA vektoru, například do plasmidové DNA Escherichia coli, čímž se získá rekombinantní plasmid. Rekombinantní plasmidy je možno užít k transformaci příslušných hostitelských buněk, například E. coli, kmen HB101 pro amplifikaci plasmidů nebo pro expresi odpovídajících bílkovin. Jednotlivé kolonie s plasmidy, obsahujícími vloženou DNA je možno identifikovat postupem, který byl uveden v publikaci Birnboim a Doly, Nucleic Acids Research 7, 1195-1204, 1979. Řetězec baží DNA, specifický pro západní subtyp viru, přítomný v rekombinantním plasmidů je možno prokázat postupy pro rychlé stanovení řetězce DNA, například při použití dideoxyřetězců.
Podrobněji je možno popsat způsob výroby cDNA, rekombinantních plasmidů, buněk, transformovaných těmito plasmidy a způsob stanovení nukleotidového řetězce takto: Nejprve se získá z čištěného západního subtypu viru TBE virová RNA. K tomuto účelu se virus pěstuje na primárních buňkách kuřecích embryí, koncentruje se pomocí ultraodstředivky a čistí ve dvou cyklech při odstředění pomocí sacharozového gradientu. Po solubilizaci bílkovin pomocí SDS za přítomnosti proteinázy K a inhibitoru RNázy, například tak, že se materiál inkubuje 1 hodinu při teplotě 37 ’C se RNA extrahuje například fenolem a sráží ethanolem. Při použití této RNA jako templátu se pak získá DNA, komplementární s virovou RNA in vitro působením reversní transkriptázy, například z viru myeloblastózy ptáků, například způsobem podle publikace Gubler a Hofmann, Gene 25, 263-269, 1983. Při použití primerů, například hexanukleotidového typu, získaných z telecího brzlíku a jeho DNA se virová RNA inkubuje za příslušných podmínek, například podle příručky cDNA synthesis systém, Amersham, Velká Británie při použití rcvrsní transkriptázy spolu s deoxyadenosintrifosfátem (dATP), deoxythymidintrifosfátem (dTTP), deoxyguanosintrifosfátem (dGTP) a deoxycytidintrifosfátem (dCTP) jako substrátem. Takto získaná hybridní cDNA. RNA se zpracovává působením RNázy H za přesně definovaných podmínek za vzniku vypuštěných úseků v RNA hybridní molekuly. Pak je možno účinně užít DNA-polymerázu I z E. coli k náhradě řetězce RNA při použití RNA s vypuštěnými úseky jako primeru. Takto získaná RNA s dvojitým řetězcem se deproteinizuje exprakcí směsí fenolu a chloroforu, vysráží ethanolem a zbývající fragmenty RNA se odstraní působením RNázy například v pufru TE 30 minut při teplotě 37 ’C.
Klonování dsDNA se provádí například při použití syntetických vazných řetězců. K tomuto účelu se dsDNA zpracuje při použití Klenovova fragmentu DNA polymerázy I z E. coli za příslušných podmínek podle publikace Maniatis a další, Molecular Coning, CSH 1982, aby bylo možno zajistit co největší množství klonovatelných zakončení, načež se provádí extrakce fenolem a deproteinizace. Pak se dsDNA inkubuje za vhodných podmínek s vaznými řetězci BamHI za přítomnosti DNA-ligázy. Reakční směs se nanese na 1% agarozový gel a z gelu se vyříznou cDNA s různou molekulovou hmotností a ty se pak dále čistí například elektroelucí. Na druhé straně se DNA plasmidu, který má být užit jako vektor, například plasmid Bluescript SK- z E. coli rozštěpí restrikční endonukleázou BamHI a defosforyluje při použití bakteriální alkalické fosfatázy. Po rozštěpení cDNA enzymem BamHI se materiál smis s vektorem, rovněž rozštěpeným enzymem BamHI a směs se inkubuje za příslušných podmínek pro umožnění hybridizace komplementárních přečnívajících řetězců na koncích obou molekul DNA a provádí se vazba působením T4-DNA-ligázy. Rekombinantní molekula DNA se užije k transformaci kompetentního kmene E. coli, například E. coli XL 1-blue. Rekombinanty, obsahující včleněnou část, specifickou pro virus se identifikují na základě barevné odlišnosti. Plasmidy se izolují podle publikace Birnboim a Doly, Nucleic Acids Research 7, 1195-1204, 1979 a rozměry včleněných částí s analyzují pomocí restrikčních enzymů při použití enzymu BamHI s následným dělením získaných fragmentů na 1% agarozovém gelu.
Řetězec bází v těchto včleněných úsecích se stanoví podle publikace Sanger a další, PNAS USA 74, 5463-5467, 1977. Získaný řetězec se analyzuje na homologii s již známými řetězci jiných flavivirů podle publikace Rice a další, Science 229, 726-733, 1985, Dalgarno a další, J. Mol. Biol. 187, 309-323, 1986, Castle a další, Virology 147, 227-236, 1985, Castle a další, Virology 149, 10-26, 1986, Wengler a další, Virology 147, 264-274, 1985, Jamščikov a Pletněv, Nucleic Acids Research 16 7750, 1988 při použití počítačových programů pro stnaovení uložení řetězce v celkovém řetězci genomu RNA. Na obr. 2 je znázorněn úplný nukleotidový řetězec a na obr. 3 odpovídající řetězec aminokyselin oblasti NS1 západního subtypu genomu viru TBE.
Vynález poprvé poskytuje možnost získat nukleotidový řetězec genu, který je kódem pro bílkovinu NS1 západního subtypu viru TBE a v důsledku toho také objasňuje řetězec aminokyselin této bílkoviny.
Řetězec bází na obr. 2 je výhodným příkladem DNA, která jekódem pro polypeptidy, charakteristické pro západní subtyp viru TBE, a to pro jeho bílkovinu NS1. Na základě degenerace genetického kódu může být kódovým řetězcem pro tentýž řetězec aminokyselin také triplet bází, odlišných od bází, uvedených na obr. 2.
Do oboru vynálezu spadají také řetězce, které jsou pozměněny mutací, transposicí nebo degradací, avšak přesto jsou kódem pro řetězec aminokyselin, který si uchovává základní antigenní vlastnosti bílkoviny NS1.
Mimoto se vynález netýká pouze přesného řetězce aminokyselin z obr. 3, který je pouze příkladem možného řetězce bílkoviny NS1 přírodního západního podtypu viru TBE. Je známou skutečností, že genomy virů RNA jsou podrobeny častějším mutacím než genomy DNA virů nebo buněčných genů, a to vzhledem k většímu výskytu chyb v činnosti RNA polymeráz a nedostatkům kontrolních a řídících mechanismů, jak bylo uvedeno v publikacích Holland a další, Science 215, 1577-1585, 1982, Reanney, Ann. Rev. Microbiol. 36, 47-73, 1982. V závislosti na vlastnostech viru mohou tyto mutace dát vznik novým typům virů vzhledem k posunu antigenních vlastností, tak jako tomu bylo v případě chřipkového viru podle publikace Both a další, Origin of Pandemic Influenza Viruses. W.G. Laver (ed.), Elsevier, 1983. Na druhé straně mohou být RNA viry antigenně stálejší za přírodních ekologických podmínek, pravděpodobně v důsledku přírodních funkčních omezení, která nedovolují rozsáhlejší strukturní změny v antigenně aktivních bílkovinách. Je však přesto zapotřebí brát v úvahu určitou míru variace, jak je možno prokázat srovnáním řetězců různých přírodních izolátů.
Toho je možno dosáhnout například tak, že se analyzuje řetězec RNA z různých izolátů při použití dideoxyřetězců na zakončeních a při použití synthetických oligonukleotidů jako primerů. Tyto řetězce se připraví podle prototypového řetězce ’ izolátů z obr. 2.
Všechny řetězce, které mají ve srovnání s řetězcem prototypu drobné variace, například takové, které byly nalezeny v dalších přírodních izolátech západního subtypu viru TBE jsou do vynálezu zahrnuty. Tyto variace je možno získat také modifikací nukleové kyseliny in vitro. Vynález proto zahrnuje všechny řetězce, které hybridizují za omezených podmínek, například při selekci na alespoň 90% homologii řetězce s řetězcem podle vynálezu nebo jeho částí a které jsou s výhodou kódem pro bílkoviny nebo peptidy s podstatnými antigenními determinujícími vlastnostmi západního subtypu viru TBE, tj. jeho strukturních bílkovin.
Uložení nukleotidového řetězce, který je kódem pro bílkovinu, například pro NS1 do příslušného vektoru nebo vektorů a do hostitelské buňky k expresi této bílkoviny ve velkém množství je účinnou technologií pro studium struktury a biologických funkcí bílkovin. Systém, užitý k expresi vždy závisí na určitých vlastnostech molekuly, např. na posttranslační modifikaci zkoumané molekuly bílkoviny.
Expresi je možno uskutečnit v prokaryotickém nebo eukáryotickém buněčném systému. V případě glykoproteinů, jako jsou bílkoviny typu NS1 je k expresi vhodnější eukaryotická hostitelská buňka, protože tato buňka je lépe schopna provést glykosylaci.
Výhodným systémem pro expresi je virus vaccinia a buňky primátů, které rostou v kontinuální kultuře. Tímto způsobem je možno zajistit nebo napomoci zajištění správné posttranslační modifikace a vysoké úrovně syntézy.
Mimoto je zřejmě možno prokázat, že řídící řetězce viru vaccinia jsou schopny řídit syntézu téměř kterékoliv cizorodé bílkoviny buď při použití promotoru pro pozdní fázi nebo při použití konstitutivního promotoru, který je činný v průběhu časné i pozdní fáze replikace viru, jak bylo popsáno v Moss a. Flexner, Ann. Rev. Immunol. 4, 305-324, 1987. Byly však podávány i zprávy o tom, že stálost cizorodých bílkovin, k. jejichž expresi došlo v buňkách, infikovaných virem vaccinia je silně ovlivněna promotorem, který řídí expresi příslušného genu, jak bylo popsáno v Coupar a další, Eur. J. Immunol. 16, 1479, 1986 a Townsend a další, J. Exp. Med. 168, 1211-1224, 1988.
Konstrukce příslušného plasmidu pro expresi s obsahem řetězce, specifického pro NS1 vyžaduje extensivní manipulaci s DNA. Je nutno brát v úvahu, že NS1 je částí polyproteinu, který je posttranslačně zpracováván na jednotlivé bílkoviny proteázami viru a buňky, jak bylo popsáno v Mandl a další, Virology 173, 291-301, 1989. V průběhu přírodní virové infekce zahrnuje syntéza NS1 vnitřní signální řetězec na aminoterminálním zakončení. Signální řetězec směruje vznikající polypeptidový řetězec do endoplasmatického retiula, což je nezbytné pro správnou posttranslační modifikaci, například pro glykosylaci. Aby bylo možno získat správně zpracovaný produkt exprese je nutné, abý tento signální řetězec nebo heterologní signální řetězec byl zahrnut v rekombinantní molekule.
Mimoto vzhledem k tomu, že NS1 je částí polyproteinu, neobsahuje kodony pro počátek ani stop kodon pro translaci. Tyto kodony je zapotřebí zajistit specifickou manipulací rekombinantní DNA.
Hydrofobní řetězec 5'- a řetězec 3'- jsou zařazeny v klonu 17-6 (obr. 3). Vzhledem k tomu, že nejsou k disposici místa štěpení restrikčními endonukleázami, není možno přímo klonovat NS1 s jejím přírodním signálním řetězcem ve vektoru pro včlenění. Z tohoto důvodu je možno syntetizovat například delší řetězec 1200 bp. obsahující signální řetězec NS1 a řetězec pro úplnou bílkovinu NS1, například při použití polymeráza (PCR). Tato technika také umožňuje zařazení případných míst štěpení restrikční endonukleázou na obou stranách amplifikované DNA a řetězců pro počátek a ukončení.
Specificky konstruovaný pár primerů pro amplifikaci dává vznik řetězci NS1, který má na každé straně místo působení restrikční endonukleázy EcoRI. Při použití tohoto postupu je možné zaměnit autentický signální řetězec jakýmkoliv signálním řetězcem, přírodně se vyskytujícím nebo syntetickým signálním řetězcem, jak bylo popsáno v Heinje, NAR 14, 4683-4690, 1986.
Všechny plasmidy, specificky vyvinuté pro expresi molekuly je možno transponovat do viru vaccinia (kmen WR nebo oslabený derivát tohoto kmene) homologní rekombinací v hostitelské buňce, '1 ·. ·.
například v buňkách primátů CV-1. Experimentální postup pro získání rekombinantníhp viru vaccinia je znám a není jej proto nutno blíže popisovat (Mackett a další, JRL Press: DNA cloning II, Ed. DM Glover, 191-211, 1985.
Vynález se rovněž týká syntézy molekul NS-1 v bakteriálním hostiteli. Glykoproteiny, k jejichž expresi došlo v bakteriální buňce obvykle nejsou glykosylovány stejným způsobem jako produkty, získané v eukaryotických buňkách. Přesto může být syntéza NS-1 i v neglykosylované formě užitečná pro různé účely. Jako příklad je možno uvést, že deriváty obalového glykoproteinu Cgp) 160 HIV-1, k jejichž expresi došlo v bakteriální buňce podstatně přispěly k diagnostice HIV a experimentální vakcinaci.
Analogicky jako zkonstruovaný plasmid pro rekombinaci s virem vaccinia byl syntetizován také řetězec pro NS-1 včetně autentického signálního řetězce pomocí PCR a byl klonován například v plasmidu pUC-19. Je možné nahradit TBE signální řetězec prokaryotickým signálním řetězcem za účelem dosažení účinné sekrece molekul NS-1 z bakteriální buňky. Bakteriální signální řetězec totiž může zabránit agregaci NS-1 a tvorbě inklusních tělísek, která je pak nutno rozpustit pomocí smáčedel nebo jinými solubilizačními prostředky.
Kromě syntézy úplné bílkoviny NS-1 je možno tento experimentální postup aplikovat také na zkrácené formy molekuly NS-1. Tyto zkrácené molekuly je možno použít k vyvolání imunologické odpovědi, namířené proti specifickým místům bílkoviny. Tyto formy jsou rovněž cenným nástrojem pro tak zvanou sérologii, namířenou proti specifickým místům. Imunologicky relevantní epitopy v bílkovině NS-1 je možno včlenit do nosných molekul jako pomocné úseky (například částice HB jádra) nebo do imunostimulačního komplexu (ISCOM) podle publikace Morein a další, immunology today 8 (11), 333-338, 1987.
Jakákoliv z molekul NS-1, syntetizovaných v prokaryotických a eukaryotických systémech pro expresi popsaných v průběhu přihlášky představuje molekulu, vhodnou jako složka NS-1 vakciny, molekulu je možno užít jako takovou nebo vázanou na rekombinantní glykoprotein E viru TBE (EP 284791) nebo je možno tyto molekuly přidávat do existující vakciny s obsahem inaktivovaného viru TBE.
Mimoto může být analýza imunologické odpovědi proti těmto nestrukturním bílkovinám nebo jejich částem kritická pro porozumění pathogenicity viru TBE a dalších členů skupiny flavivirů.
Do genomu živých virů je rovněž možno zařadit cizorodé řetězce DNA nebo RNA, čímž vzniknou rekombinantní viry, které je možno užít jako živou vakcinu. Shrnutí této možnosti bylo popsáno v publikaci Mackett a Smisth, J. Gen. Virol. 67, 2067-2082, 1986.
Také kombinace různých genů, například odvozených od různých virů je možno zpracovat genetickou technologií tak, že je možno dosáhnout jejich exprese a použít pro vakcinaci (Perkus a další, Science, 229, 981-984, 1985). Vynález proto zahrnuje jakékoliv kombinace řetězců, uvedených v průběhu přihlášky s dalšími řetězci, jako jsou geny, které jsou kódem pro odlišné bílkoviny nebo řetězce, které přispívají k expresi bílkovin jako jsou promotory, podpůrné řetězce, polyadenylační nebo štěpné signály.
Je známo, že k imunizačním nebo diagnostickým účelům není bezpodmínečné nutné použít úplnou přírodně se vyskytující bílkovinu (Lerner, Nátuře 299, 592-596, 1982, Arnon, TIBS 11, 521-524, 1986).
Bílkoviny nebo části bílkovin, jichž je možno užít jako vakcin nebo diagnostických činidel je možno získat rekombinantní shora popsanou technologií s použitím DNA, řetězce podle vynálezu je však rovněž možno užít k získání informací, které lze využít při syntéze oligopeptidů. 0 tomto předmětu je k disposici rozsáhlá literatura. Peptidy, syntetizované pomocí řetězců DNA byly připraveny a použity pro řadu účelů například, pro biologické a imunologické studie, jak bylo popsáno v Lerner a další, Cell, 23, 309 až 310, 1981, Lerner, Neture 299, 592-596, 1982. Použití pro vakcinaci bylo popsáno v Shinnick a další, Ann. Rev. Microbiol. 37, 425-446, 1983, DiMarchi a další, Science 232, 639-641, 1986. Obecná příprava peptidů nebo kombinace peptidů je tedy známa.
Dále je známo použití nukleových kyselin a řetězců, získaných pomocí těchto kyselin pro přípravu hybridizačnich sond, například pro použití při průkazu virové RNA u klíšťat nebo v krevním séru (Meinkoth a Wahl, Anal. biochem 138, 267-284, 1984, Kulski a Norval, Arch. Virol. 83, 3-15, 1985*. Tyto sondy je možno připravit bud’ technologií při použití rekombinantní DNA nebo chemickou syntézou oligonukleotidů na základě požadovaného řetězce.
Vynález bude osvětlen následujícími příklady. Není-li výslovně uvedeno jinak, provádí se jednotlivé postupy způsobem, který je sám o sobě znám. Tyto postupy je možno nalézt v řadě standardních publikací včetně publikace Sambrook, Fritsch a Maniatis Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. vydání), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Propagace a čištění viru TBE
10% suspenze viru ZBE ve formě infikovaných mozků infantilních myší byla užita k infekci primárních buněk kuřecích embryí v jedné vrstvě, udržovaných na minimálním základním prostředí MEM) s přísadou pufru 15 mM Hepěs a 15 mM EPPS ίο pH 7,6. Po 40 hodinách inkubace při teplotě 37 ’C byl supernatant vyčeřen odstředěním při 10 000 g po 30 minut při teplotě 4 ’C a virus byl usazen ultraodstředěním při 50 000 g po dobu 3 hodiny při teplotě 4 “C. Pak byl virus znovu uveden do suspenze v příslušném objemu pufru TNA (0,05 M triethanolaminu, 0,1 M chloridu sodného o ph 8,0) a pak byl materiál podroben zonálnímu odstředění v sacharozovém gradientu 5 až 20 % hmotnostních při 17 777 g celkem 110 minut při teplotě 4 °C.
Největší koncentrace viru byla pak stanovena sledováním garientu při 254 niti, načež byl materiál znovu odstředěn ve 20 až 50% sacharozovém gradientu k dosažení rovnovážného stavu 18 hodin při teplotě 4 “Ca při 15 000 g. Pak byl virus dialyzován proti pufru TAN při pH 8,0 k odstranění přebytku sacharózy.
Příklad 2
Příprava RNA viru
100 μg čištěného viru se zředí na 400 μΐ přidáním pufru pro reakci s proteinázou K (10 mM tris o pH 7,8m 5 mM EDTA, 0,5 % SDS). Proteináza K se přidá do konečné koncentrace 200 μg/ml a směs se hodinu inkubuje při teplotě 37 ’C. Pak se roztok deproteinizuje tak, že se dvakrát extrahuje stejným objemem (400 μΐ) fenolu a pak ještě jednou chloroformem a isoamylalkoholem v poměru 24 : 1, pak se přidá 26 μΐ 2M roztoku octanu sodného a RNA se vysráží přidáním 2,5 objemů ethanolu. Před dalším použitím se podíl RNA denaturuje glyoxalem a pak se podrobí elektroforéze na agarozovém gelu ke kontrole výtěžku a kvality získaného materiálu.
Příklad 3
Syntéza cDNA s dvojitým řetězcem μg RNA, vysrážené ethanolem se znovu uvede do suspenze ve 40 μΐ pufru pro syntézu prvního řetězce (Amersham, UK) s obsahem 5 μg náhodně volených oligonukleotidových primerů, směs se zahřeje na 70 °C na 1 minutu a pak se nechá pomalu zchladnout na teplotu místnosti. Pak se přidají všechny čtyři deoxynukleotidtrifosfáty do konečné koncentrace 1 mM. Mimoto se ke směsi přidá 5 jednotek inhibitoru ribonukleázy z lidské placenty a 10 μΟΐ α-32Ρ dCTP. Syntéze prvního řetězce se zahájí přidáním 100 jednotek reversní transkriptázy (Amersham) a reakce se nechá probíhat 2 hodiny při teplotě 42 °C. Pak se reakční směs uloží do ledu a reakční složky pro tvorbu druhého řetězce se přidají v tomto pořadí: 93,5 μΐ pufru pro syntézu druhého řetězce (Amersham, UK), 4 jednotky ribonukleázy H, 23 jednotek DNA-polymerázy z E. coli a voda do konečného objemu 250 μΐ. Syntéze druhého řetězce se provádí následnou inkubací při 12 °c a při 22 ’C (dvě hodiny pokaždé) a pak se zastaví zahřátím roztoku nA 20 minut na teplotu 70 ’C. Pak se cDNA s dvojitým řetězcem rozštěpí působením 10 jednotek T4 DNA-polymerázy 30 minut při teplotě 37 ’C pro vznik vhodných zakončení. Pak se cDNA čistí extrakcí fenolem a chloroformem a vysráží dvěma objemy ethanolu.
Příklad 4
Vazba pomocí vazných řetězců
Syntetické 5'-fosforylované vazné řetězce BamHI (New England Biolabs) se přidají k cDNA a reakce se nechá probíhat přes noc při teplotě 12 ’C. Reakční směs obsahovala v konečném objemu 200 μΐ pufru pro uskutečnění vazby (50 mM tris o pH 7,5, 5 mM MgCl2, mM DTT, 1 mM ATP) přibližně 1 μg cDNA, 1 μg vazné DNA a 1 μΐ T4 DNA-ligázy (New England Biolabs).
Příklad 5
Francionace cDNA podle velikosti cDNA byla frakcionována na 1% agarozovém gelu. France s různou velikostí byly z gelu vyříznuty a DNA byla extrahována z agarozy elektroelucí v analytickém zařízení pro tento účel (IBI) podle pokynů výrobce. Přesto, že množství DNA bylo velmi malé, takže je bylo jen s obtížemi možno prokázat barvením ethidiumbromidem, bylo možno extrakci snadno sledovat vzhledem k radioaktivnímu značení DNA. Frakcionační stupeň je tedy prostředkem pro získání velkých fragmentů cDNA vhodných pro selektivní klonování a také umožňuje cDNA úplně oddělit od nenavázaných vazných řetězců.
Příklad 6
Klonování v bakteriálním plasmidu cDNA byla rozštěpena působením 10 jednotek restrikční endonukleázy BamHI, reakce trvala 1 hodinu při teplotě 37 °C. Po extrakci fenolem a chloroformem byla DNA vysrážena 2 objemy ethanolu a znovu uvedena do suspenze v malém objemu vody. Pak bylo 20 až 30 ng cDNA smíseno s 50 ng fagemidu Bluescript SK(Stratagene), který byl linearizován rozštěpením enzymem BamHI (výraz Bluescript je obchodní značka). Tyto dvě složky byly na sebe navázány působením T4 DNA-ligázy v 10 μΐ svrchu uvedeného pufru pro vazbu přes noc při 16 “C. Následujícího rána byla směs zahřáta na 5 minut na 65 °C, zředěna 100 x vodou a užita k transformaci buněk E. coli XL1 (Blue). Kompetentní bakterie byly získány od firmy Stratagene a transformovány ve 3 μΐ zředěné směsi pro vazbu přesně podle návodu výrobce. Bakterie byly naneseny na LB agarové plotny s obsahem ampicilinu, tetracyklinu, IPTG a X-Gal.
Příklad 7
Identifikace fagemidů s obsahem včleněného řetězce
V systému Bluescript nabývají fagemidy se včleněným řetězcem bílého zbarvení bakteriálních kolonií, kdežto navzájem vázané fagemidy poskytují modře zbarvené kolonie. Tyto bílé kolonie byly izolovány a použity k naočkování 2 ml prostředí LB s obsahem ampicilinu a byly pěstovány přes noc při 37 ‘C na třepačce při 220 otáčkách za minutu. Následujícího dne byl rychle připraven plasrid standardním způsobem při použití varu podle publikace Birnboim a Doly, Nucleic Acids Research 7, 1195-1204, 1979. Plasmidy byly rozštěpeny restrikčním enzymem BamHI a analyzovány na 1% agarozovém gelu. Jeden z klonů, který byl tímto způsobem identifikován byl fagemid BS 17-6, který nese včleněnou část, specifickou pro virus, v délce přibližně 2 000 bp. Na obr. 1 je znázorněn na 1% agarozovém gelu takto připravený plasmid BD 17-6 jak v cirkulární formě, tak ve formě po rozštěpení enzymem BamHI.
Příklad 8
Analýza řetězce včleněné části v klonu BS 17-6
DNA s jednoduchým řetězcem klonu BS 17-6 byla připravena přidáním pomocného fágu VCS (Stratagene) v poměru 20 : 1 k exponenciálně rostoucí kultuře Bakterií E. coli XL1 (Blue) s obsahem BS 17-6. Směs se energicky míchá 16 hodin při teplotě 37 °C a pak se ze supematantu čistí ssDNA známým způsobem. DNA s jednoduchým řetězcem se analyzuje v celé oblasti včleněné části . postupem podle publikace Sanger a další, PNAS USA 74, 5463-5467, 1977 při použití enzymu Sequanázy (United States Biochemicals) a reakčních činidel, dodaných výrobcem. (Výraz Sequenáza je obchodní název). Oligonukleotidy, specifické pro virus a pro vektor byly užity jako primery pro analýzu řetězce. Úplný řetězec včleněné části 17-6 je znázorněn na obr. 2.
Příklad 9
Odvození řetězce aminokyselin bílkoviny NS1
Translace nukleotidového řetězce klonu BS 17-6 ve všech směrech objevila pouze jedinou možnost správné translace delšího řetězce. Řetězec aminokyselin, odvozený tímto způsobem, byl srovnáván s řetězci pro další flaviviry které byly uvedeny v publikacích Rice a další, Science 229, 726-733, 1985, Coia a další, J. Gen. Virol. 69, 1-21, 1988, Chambers a další, Virology 169, 100 až 109, 1989. Pro tyto analýzy byl užit software Beckman MICROGENIE (verse 4.0) na IBM osobním počítači. Výraz MICROGENIE je obchodní název. Analýza prokázala, že klon 17-6 obsahuje úplný kódový řetězec pro bílkovinu NS-1 a části kódového řetězce pro bílkovinu E a NS2A, které ohraničují gen NS1 proti genomu flaviviru.
Na obr. 3 je znázorněn řetězec RNA a řetězec aminokyselin, pro které je tento řetězec kódem, odvozený od klonu 17-6. Aminoterminální zakončení NS1 je patrně uvolněno buněčnou signalázou, karboxyterminální zakončení enzymem, podobným signaláze. Delší forma bílkoviny NS1, která obsahuje také aminoterminální zakončení bílkoviny NS2a byla pozorována Masonem a dalšími (Virology 158, 361-372, 1987). Karboxyterminální formu této bílkoviny NS1 je možno uvolnit pro virus specifickou proteázou nebo buněčnou signalázou podle publikace Rice a další, Science 229, 726-733, 1985. Aminoterminální zakončení a tři možná karboxyterminální zakončení jsou znázorněna na obr. 3. Karboxyterminální zakončení, uvolněná enzymem, podobným signaláze (Chambers a další, Virology 169, 100-109, 1988) je popsáno jako COOH-Terminus 1, karboxyterminální zakončení, které je pravděpodobně tvořeno provirus specifickou proteázou je pravděpodobné tvořeno pro virus specifickou proteázou je označeno COOH-Terminus 2 a potenciální karboxyterminální zakončení, uvolněné buněčnou signalázou je znázorněno jako COOH-Terminus 3. Čísla poloh, uvedená na obr. 3 odpovídají plné délce genomu viru TBE.
Na obr. 4 je znázorněn řetězec aminokyselin bílkoviny NS1, odvozený od řetězce klonu 17-6. Možná COOH-terminální zakončení jsou označena stejně jako na obr. 3. Číselné označení polohy je počítáno od první aminokyseliny bílkoviny NS1. Na obr. 4 je rovněž znázorněno umístění tří potenciálních míst pro N-glykosylaci, která jsou přítomna v bílkovině NS1 viru.
Příklad 10
Klonování oblasti, která je kódem pro NS1 v prokaryotickém vektoru pro expresi
Nukleotidový řetězec, který je kódem pro bílkovinu NS1 se podrobí subklonování z klonu 17-6 do plasmidu pUC19S. Vektor pUC19s je derivát plasmidu pUC19, který obsahuje stop-vazný řetězec s obsahem stop kodonu TAG ve všech třech řetězcích, klonovaných v místě štěpení BamHI. Řetězec pro NS1, který obsahuje malou část řetězce pro bílkovinu NS2a na svém 3’-terminálním zakončení se vyjme působením restrikční endonukleázy Cfol a zakončení se upraví působením Sl-nukleázy. Vektor pUC19S pro klonování se linearizuje v polyvazné oblasti působením Sáli a zakončení se vyplní T4-DNA-polymerázou (obr. 5). Vazba vektoru a včleněného řetězce dává vznik místu působení enzymu SA1I a tím se váže řetězec pro bílkovinu NS1 na gen lacZ ve správném pořadí (Obr. 6A a 6B). Na 3'-terminálním zakončení je řetězec pro bílkovinu NS1 ohraničen prokaryotickými stopsignály pro transkripci a translaci, které jsou obsaženy ve vektoru, plasmid je označen pNS1387.
Příklad 11
Klonování kódové oblasti pro NS1 včetně 5'-proximálního zakončení hydrofobního signálního řetězce při použití PCR
Aby bylo možno konstruovat indukovatelný prokaryotický plasmid pro expresi s obsahem kódové oblasti pro NS1 včetně autentického signálního řetězce byl přenesen fragment plasmidu pSCtSNS1444 po štěpení enzymem Sáli (Příklad 13) do plasmidu pUC19S, čímž byl získán klon ptSNS1682. Aby bylo možno uložit gen pro NS1 do správné polohy vzhledem ke genu lacZ byl klon ptSNS1682 rozštěpen enzymem HindlII, zakončení byla upravena pomocí Sl-nukleázy a znovu navázána za vzniku klonu ptSNS1791 s vypuštěnými 4 nukleotidy, jak je znázorněno na obr. 7a a 7b.
Příklad 12
Konstrukce plasmidu pro rekombinaci vé viru vaccinia: řetězec pro bílkovinu NS1 pod řízením promotoru W-pll(L)
Kódová oblast pro bílkovinu NS1, například z příkladu 10 se podrobí subklonování v místě štěpení enzymem Sáli plasmidu pTKgptFls (Falkner G.F. a Moss B., J. Virol 62, 1849-1854, 1988. Řetězec pro NS1 se uloží ve správnémismyslu vzhledem ke kodonu ATG pro počátek translace ve vektoru. Translační stop signál je rovněž obsažen ve vektoru. Polyvazná oblast vektoru je příčinou přidání 7 aminokyselin na 5'- zakončení a 10 aminokyselin na 3'zakončení. Strategie 5'- zakončení a 10 aminokyselin na 3'zakončení. Strategie klonování a hraniční oblasti bílkoviny jsou znázorněny na obr. 8a a 8b. Plasmid byl označen pAPNS 1338.
Příklad 13
Konstrukce plasmidu pro rekombinaci ve viru vaccinia: řetězec pro bílkovinu NS1 s přírodním signálním řetězcem pod řízením promotoru W-p7.5(E/L)
Řetězec nukleotidů s obsahem kódové oblasti pro bílkovinu NS1 s jejím signálním řetězcem se syntetrizuje pomocí PCR při použití klonu 17-6 jako templátu. Chemicky se syntetizují dva oligonukleotidy se štěpnými místy pro restrikční endonukleázy EcoRi a Sáli na 5'- zakončení a Sáli a Hpal na 3'- zakončení, tyto oligonukleotidy se užijí jako primery při PCR (obr. 9 A a 9B). Amplifikovaný fragment NS1 se čistí na garozovém gelu (obr. 10) po štěpení Sáli a pak se klonuje v místě štěpení Sáli vektoru pSCll-Orth po malých modifikacích. Plasmid pSCll-Orth byl uložen ve veřejné sbírce D.S.M., Braunschweig^ SRN pod číslem DSM 5734 dne 15. ledna 1990. Strategie klonování a řetězce na 3'a 5'- zakončení nové konstrukce jsou uvedeny na obr. 11 a 12. Analýza restrikčních fragmentů klonu na agarozovém gelu potvrzuje správnou orientaci včleněné části, jak je zřejmé z obr. 13. Plasmid byl označen pSCtSNS1444.
Příklad 14
Konstrukce plasmidu pro rekombinaci ve viru vaccinia: Řetězec pro bílkovinu NS1 s původním signálním řetězcem pod řízením promotoru Vv-pll(L)
Plasmid pTKtSNS1556 je výsledkem subklonování řetězce pro NS1 z klonu pSCtSNS1444 ve vektoru pTKgptF3s (Falkner a Moss, J. Virol. 62, 1849-1854, 1988). Řetězec pro NS1 se vyjme při použití enzymu Sáli a včlení se do místa štěpení enzymem Sáli v plasmidu pTKgptF3s. Strategie klonování a řetězec nukleotidů pro plasmid pTKtSNS1556 je znázorněn na obr. 14 a 15.
Všechny plasmidy se pěstují při použití selekce ampicilinem v množství 100 μρ/ml v E. coli, kmenech DK1, BH101 nebo JM jako v hostiteli (JM105, JM83).
Příklad 15
Vytvoření rekombinantů viru vaccinia pro expresi bílkoviny NS1
Rekombinantní viry se získají standardním způsobem (Mackett M., Smith G. a Moss B.: DNA Cloning: A Practical Approach, str. 191121, ed. D.M. Glover, Oxford: IRL Press). DNA plasmidu pSCtSNS1444 a plasmidu pTKtSNS1556 se podrobí transfekci v buňkách CV-1, infikovaných virem vaccinia, divokým typem. Rekombinant varecNS1444, odvozený od plasmidu pSCll-Orth se podrobí selekci na BuDR v buňkách 143tk. Rekombinant varecNS1556, odvozený od pTKgptFs se izoluje selekcí gpt v buňkách CV-1. Všechny rekombinanty byly čištěny třikrát ve formě plaků. Správná organizace rekombinantů byla zjištěna analýzou Southern blot (Obr. 16).
Příklad 16
Exprese bílkoviny NS1 v buňkách CV-1, infikovaných rekombinanty viru vaccinia
Buňky CV-1 se infikují rekombinanty varecNS1444 a varec NS1556 viru vaccinia. Dva dny po infekci se buňky označí methioninem, značeným 35S po dobu 4 hodin. Bílkoviny se oddělí na. 12% SDS-polyakrylamidovém gelu s denaturačním účinkem a identifikují autoradiograficky. Pás bílkoviny, odpovídající očekávané molekulové hmotnosti přibližně 48 888 je možno oddělit. Tento pás není obsažen v buňkách divokého typu viru nebo v rekombinantech viru typu varec 1342, jak je znázorněno na obr. 17.
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (20)
- I. Peptid nebo polypeptid, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň část řetězce aminokyselin bílkoviny NS-1 západního subtypu viru TBE.
- 2.. Peptid nebo polypeptid podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje řetězec aminokyselin, znázorněný na obr. 4.
- 3. Bílkovina NS-1 západního subtypu viru TBE.
- 4.. Bílkovina nebo polypeptid, vyznačující se tím, že obsahuje řetězec aminokyselin, který se liší od řetězce přírodní bílkoviny NS-1 na základě mutace a/nebo transposice v rámci běžných variací západního subtypu viru TBE.
- 5. Bílkovina, peptid nebo polypeptid podle nároku 1 až 4 pro použití v lékařství.
- 6. Vakcina, vyznačující se tím, že obsahuje peptid, polypeptid nebo bílkovinu podle nároků 1 až 4 a jednu nebo větší počet dalších složek, přijatelných z farmaceutického hlediska.
- 7. Diagnostické činidlo, vyznačující se tím, že obsahuje peptid, polypeptid nebo bílkovinu podle nároků 1 až 4.
- 8. Nukleová kyselina, vyznačující se tím, že je kódem propeptid, polypeptid nebo bílkovinu podle nároků 1 až 4.
- 9. Živá vakcina, vyznačující se tím, že obsahuje nukleovou kyselinu podle bodu 8.
- 10.Sonda, vyznačující se tím, že obsahuje nukleovou kyselinu podle nároku 8.II. Nukleová kyselina, vyznačující se tím, že hybridizuje s řetězcem DNA, znázorněným na obr. 3.I ;CZ/277921 B6
- 12. Nukleová kyselina, vyznačující se tím, že obsahuje řetězec z nároku 8.
- 13. Nukleová kyselina, vyznačující se tím, že její řetězec se liší od řetězce molekuly DNA, které odpovídají nebo jsou komplementární s přírodním řetězcem RNA pro bílkovinu NS-1 v důsledku degenerace genetického kódu a/nebo mutace a/nebo transposice v rámci běžných variací západního subtypu viru TBE.
- 14. Nukleová kyselina podle nároků 8 až 13, vyznačující se tím, že je vázána na další řetězce nukleových kyselin.
- 15. Nukleová kyselina podle nároku 14, vyznačující se tím, že jde o DNA, přičemž přídatné řetězce umožňují replikaci a expresi molekuly DNA v buněčné kultuře a s výhodou obsahují řetězce, které mají funkci promotoru, podpůrného řetězce, polyadenylačního signálu a/nebo signálu pro štěpení.
- 16. Vektor, například plasmid, virus nebo fág, vyznačující se tím, že obsahuje nukleovou kyselinu podle nároků 8 až 15.
- 17. Vektor podle nároku 16, vyznačující se tím, že je odvozen od viru vaccinia.
- 18. Vektor podle nároku 16, vyznačující se tím, že je odvozen od bakteriálního plasmidu.
- 19. Hostitelská buňka, vyznačující se tím, že obsahuje vektor podle nároku 16, 17 nebo 18.
- 20. Kultura buněk, vyznačující se tím, že obsahuje hostitelské buňky podle nároku 19.
- 21. Kultura buněk podle nároku 20, vyznačující se tím, že jde o buněčnou kulturu savčích buněk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP89305708 | 1989-06-06 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS9002806A2 CS9002806A2 (en) | 1991-11-12 |
| CZ277921B6 true CZ277921B6 (en) | 1993-06-16 |
Family
ID=8202711
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS902806A CZ277921B6 (en) | 1989-06-06 | 1990-06-06 | Peptides and polypeptides, vaccines and nucleic acids |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0402116B1 (cs) |
| JP (1) | JPH03151878A (cs) |
| AT (1) | ATE143373T1 (cs) |
| CA (1) | CA2018332A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ277921B6 (cs) |
| DD (1) | DD297997A5 (cs) |
| DE (1) | DE69028658T2 (cs) |
| FI (1) | FI902814A0 (cs) |
| HU (1) | HUT54306A (cs) |
| NO (1) | NO902491L (cs) |
| SK (1) | SK277781B6 (cs) |
| YU (1) | YU109590A (cs) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4224402A1 (de) * | 1992-07-21 | 1994-01-27 | Schering Ag | Neue Pyridin-Derivate mit Leukotrien-B¶4¶-antagonistischer Wirkung |
| FR2794865B1 (fr) | 1999-06-09 | 2003-04-18 | Pasteur Institut | Methode de detection precoce des flavivirus et ses applications |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE122055T1 (de) * | 1987-03-20 | 1995-05-15 | Immuno Ag | Dna- und rna-moleküle des westlichen subtyps des fsme-virus, polypeptide, die von diesen molekülen codiert werden, und deren verwendung. |
| IL91304A0 (en) * | 1988-08-20 | 1990-03-19 | Us Health | Recombinant vaccinia virus for prevention of disease caused by flavivirus |
-
1990
- 1990-06-05 FI FI902814A patent/FI902814A0/fi not_active Application Discontinuation
- 1990-06-05 DD DD90341327A patent/DD297997A5/de not_active IP Right Cessation
- 1990-06-05 CA CA002018332A patent/CA2018332A1/en not_active Abandoned
- 1990-06-05 HU HU903490A patent/HUT54306A/hu unknown
- 1990-06-05 NO NO90902491A patent/NO902491L/no unknown
- 1990-06-05 YU YU109590A patent/YU109590A/sh unknown
- 1990-06-06 EP EP90306154A patent/EP0402116B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-06-06 SK SK2806-90A patent/SK277781B6/sk unknown
- 1990-06-06 AT AT90306154T patent/ATE143373T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-06-06 CZ CS902806A patent/CZ277921B6/cs unknown
- 1990-06-06 JP JP2146403A patent/JPH03151878A/ja active Pending
- 1990-06-06 DE DE69028658T patent/DE69028658T2/de not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO902491L (no) | 1990-12-07 |
| DD297997A5 (de) | 1992-01-30 |
| HUT54306A (en) | 1991-02-28 |
| HU903490D0 (en) | 1990-10-28 |
| CS9002806A2 (en) | 1991-11-12 |
| DE69028658D1 (de) | 1996-10-31 |
| SK277781B6 (en) | 1995-01-12 |
| EP0402116A1 (en) | 1990-12-12 |
| DE69028658T2 (de) | 1997-03-06 |
| ATE143373T1 (de) | 1996-10-15 |
| YU109590A (sh) | 1992-07-20 |
| NO902491D0 (no) | 1990-06-05 |
| CA2018332A1 (en) | 1990-12-06 |
| FI902814A0 (fi) | 1990-06-05 |
| JPH03151878A (ja) | 1991-06-28 |
| EP0402116B1 (en) | 1996-09-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5744141A (en) | Flavivirus recombinant poxvirus immunological composition | |
| US5514375A (en) | Flavivirus recombinant poxvirus vaccine | |
| JP3826055B2 (ja) | 組換えアビポックスウイルスによる免疫方法 | |
| US5741492A (en) | Preparation and use of viral vectors for mixed envelope protein vaccines against human immunodeficiency viruses | |
| JP3531934B2 (ja) | キメラおよび／または増殖制限されたフラビウイルス | |
| JP2001514518A (ja) | 発現の向上したベクター並びにその製造および使用方法 | |
| JP2007105040A (ja) | 組換体ポックスウイルス−ネコ感染性腹膜炎ウイルス、その組成物およびそれらの製造および使用方法 | |
| WO1996040933A1 (en) | Infectious dengue 2 virus pdk-53 as quadravalent vaccine | |
| MXPA05005140A (es) | Vacuna contra el virus del nilo occidental. | |
| JP2007254489A (ja) | Ｈｔｌｖ抗原を発現する組換え弱毒化ポックスウイルスを含有する免疫原性組成物 | |
| KR20230008707A (ko) | 코로나바이러스 치료용 백신 조성물 | |
| KR100909846B1 (ko) | Ｂｖｄｖ 바이러스-유사 입자 | |
| JPH0365191A (ja) | スフェロイジン単離ｄｎａおよび組み換え昆虫ポックスウィルス発現ベクター | |
| WO1990012101A1 (en) | Vaccinia vectors, vaccinia genes and expression products thereof | |
| EP1087014B1 (en) | Hog cholera virus vaccine and diagnostic | |
| US6673601B1 (en) | Chimeric lyssavirus nucleic acids and polypeptides | |
| Gong et al. | A single point mutation of Ala-25 to Asp in the 14,000-Mr envelope protein of vaccinia virus induces a size change that leads to the small plaque size phenotype of the virus | |
| CA2591532A1 (en) | Nucleic acid sequences encoding proteins capable of associating into a virus-like particle | |
| JP4664072B2 (ja) | Ｃ及び／又はｅ１タンパク質を発現しないペスチウイルスのレプリコン及びワクチンに使用できる前記レプリコンを含む感染性ウイルス粒子 | |
| Van der Ryst et al. | Study of the immunogenicity of different recombinant Mengo viruses expressing HIV1 and SIV epitopes | |
| CZ277921B6 (en) | Peptides and polypeptides, vaccines and nucleic acids | |
| EP2240509A1 (en) | Flaviviridae mutants comprising a deletion in the capsid protein for use as vaccines | |
| Venugopal et al. | Recombinant vaccinia virus expressing PrM and E glycoproteins of louping ill virus: induction of partial homologous and heterologous protection in mice | |
| DK175515B1 (da) | DNA- og RNA-molekyler stammende fra den vestlige undertype af FSME-virus, vektorer svarende dertil, vaccinia-ekspressionsvektor, bærerbakterie, cellekultur, peptid eller polypeptid, præparat omfattende peptider eller polypeptider, l.... | |
| AU769221B2 (en) | Recombinant poxvirus-feline infectious peritonitis virus, compositions thereof and methods for making and using them |