DE69024400T2 - Dem menschlichen Calpastatin ähnliches Polypeptid - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft neue Peptide, welche die Aktivität von menschlichem Calpain, das eine Vielzahl von physiologischen Aktivitäten im Körper aufweist, inhibiert.
• Calpastatin ist ein intrazelluläres Protein, welches insbesondere Calpain, eine Calciumabhängige Cysteinprotease, inhibitiert. Calpastatin findet sich im Gewebe einer großen Vielzahl von höheren Tieren und wird aktiviert, um die Wirkung von Calpain durch von den Zellen empfangene Reize zu regulieren. Die Funktion von Calpain im Körper besteht in der Aktivierung von Kinase, wie Protein-Kinase C und Phosphorylase-Kinase B durch ihren begrenzten Abbau, und in der Zersetzung von Proteinen des Zellskeletts und von Rezeptoren von Wachstumsfaktoren und Hormonen.
• Calpastatin inhibiert insbesondere diese Wirkungen von Calpain und reguliert somit Calpain und verhindert dessen Überflunktion. Das Ungleichgewicht des Calpain-Calpastatin- Systems steht in engem Zusammenhang mit bestimmten Krankheitszuständen.
• Beispielsweise ist der Calpaingehalt bei Patienten mit Muskeldystrophie hoch und wird die Degeneration von Myofibrilen und Neurofilamenten durch Calpain beschleunigt, was mit dem Einsetzen der Krannheit zusammenhängen dürfte. Auch sind die Aktivitätsstärken von Calpain und von Rezeptoren für Interleukin 2 in mit adulten T-Zellen-Leukämie-Viren infizierten Zellen abnormal hoch. Diese Abnormalitäten lassen darauf schließen, daß eine Veränderung der Rezeptoraktivität für Calpain Proteine des Zellskeletts beeinflußt und bewirkt, daß die Zellen eine abnormale Reaktion auf Wachstumsfaktoren und dgl. zeigen, was möglicherweise die Ursache für das Auftreten der Krankheit ist (Y. Adachi et al., Seikagaku, 57 1202, 1985). Weiters spaltet Calpain das Protein von Kristallinsen; nimmt diese Reaktion ein übermäßiges Ausmaß an, kann es zu Katarakten flihren. Auch ist Calpastatin identisch mit dem Stabilisierungsfaktor von Steroidrezeptor-Komplexen, welcher für die Signal- Transduktion erforderlich ist (J. E. Bodwell et al., 1 Biol. Chem., 260 2601-2604, 1985). In hypertensiven Ratten ist der Calpastatingehalt abnormal niedrig (S. Pontremoli et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 145 1287-1294, 1987).
• Auf diese Weise ist Calpastatin ein endogener Inhibitor von Calpain, welches seine Funktion reguliert, und es kann ein nützliches Arzneimittel für die Behandlung von Krankheiten sein, die offenbar auf eine Überfunktion von Calpain zurückzuführen sind.
• Die DNA-Sequenz, die für menschliches Calpastatin kodiert, kann für die DNA- Diagnose einer Vielzahl von Krankheiten verwendet werden, die durch ein Ungleichgewicht in menschlichem Calpain und menschlichem Calpastatin verursacht werden können.
• Calpastatin findet sich in den Geweben höherer Tiere, und es wurde aus roten Blutzellen und dem Herzmuskel vom Schwein und auch aus Kaninchenleber gereinigt (M. Inomata et al., J. Biochem., 95 1661-1670, 1984); E. Takano et al., Biochem. 3., 235 97-102, 1986; E. Takano et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 122 912-917, 1984).
• Die cDNA von Calpastatin aus dem Schwein und Kaninchen wurde kloniert, und die Primärstruktur seiner Aminosäuren wurde identifiziert (E. Takano et al., Biochemistry, 27, 1964-1972, 1988; Y. Emori et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 4, 3590-3594, 1987). Die Basistruktur von Calpastin aus diesen zwei Arten gilt für beide gemeinsam, mit vier sich wiederholenden funktionellen Einheiten (Domänen 1-4), von denen jede etwa 140 Aminosäurereste und eine nicht-homologe Sequenz auf der N-terminalen Seite, genannt Domäne L, enthält (M. Maiki et al., FEBS Lett., 223 174-180, 1987).
• Es wurden nunmehr die Primärstruktur der Domänen 14 von menschlichem Calpastatin (Japanische Offengelegte Patentanmeldung 63-109111) und auch die Gesamtstruktur (Japanische Offengelegte Patentanmeldung 63-207283) identifiziert.
• J. Enzyme Inhibition 1989, Bd. 3, S.49-56 offenbart die Primärstruktur von menschlichem Calpastatin, abgeleitet von der Nucleotid-Sequenz von isolierter cDNA und verglichen mit jener von Schweine- und Kaninchen-Calpastatinen.
• Die vorliegende Erfindung betrifft das menschliche Calpastatin-ähhliche Polypeptid, welches eine Calpain-Inhibitor-Aktivität aufweist und die Sequenz
• W-X oder W-X-Y
• besitzt, worin W die folgende Struktur aufweist:
• in welcher X die folgende Struktur besitzt:
• und worin Y die folgende Struktur besitzt:
• Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Basensequenz, welche für diese Polypeptide kodiert, und ein rekombinantes Plasmid, welches DNA enthält, die für die obengenannten Polypeptide kodiert.
• Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Transformanten, welcher die obengenannten Rekombinanten trägt.
• Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von menschlichem Calpastatin-ähnlichem Polypeptid, welches Verfahren die Kultivierung des obengenannten Transformanten und die Gewinnung des obengenannten Polypeptids aus der Kulturnährlösung umfaßt.
• Es wurde ein cDNA-Klon, welcher für menschliches Calpastatin kodiert, aus einer menschlichen cDNA-Bibliothek selektioniert und die gesamte Aminosäuresequenz von menschlichem Calpastatin durch die Analyse dieser Basissequenz identifiziert. Auch wurde die cDNA an einen Expressionsvektor gekoppelt und der Vektor in Escherichia coli eingeführt, wodurch die Exprimierung von menschlichem Calpastatin-ähnlichem Polypeptid induziert wurde.
• Es wurden die (im folgenden genannten) Peptidsynthese-Verfahren zur Synthetisierung eines Polypeptids aus 18 Aminosäuren in der Domäne von menschlichem Calpastatin
• (im folgenden Polypeptid aus 18 Aminosäuren genannt), eines Polypeptids aus 21 Aminosäuren
• (im folgenden Polypeptid aus 21 Aminosäuren genannt), und eines Polypeptids aus 26 Aminosäuren (im folgenden Polypeptid aus 26 Aminosäuren genannt), verwendet und gefimden, daß diese Polypeptide Calpain inhibieren können.
• Die vorliegende Erfindung beruht auf diesen Erkenntnissen.
• Durch Klonieren von cDNA für menschliches Calpastatin wurde die Primärstruktur der Aminosäuren identifiziert, und es wurde geflinden, daß sie aus vier sich wiederholenden funktionellen Einheiten (Domänen 1-4) aus jeweils etwa 140 Aminosäureresten plus einer nicht-homologen Sequenz, genannt Domäne L, auf der N-terminalen Seite besteht (Japanische offengelegte Patentanmeldung 63-207283). Jede der Domänen 14 hat selbst Calpastatin- Aktivität, aber die Aktivität der Domäne list am stärksten, und daher wurde diese Domäne näher untersucht. Es wurde gefünden, daß das Polypeptid aus 18 Aminosäuren in der Domäne 1 auch dann noch Aktivität besitzt, wenn es auf eine derartige Länge gekürzt worden ist.
• Die Polypeptide, die länger als das Polypeptid aus 26 Aminosäuren sind, wurden, wie nachstehend beschrieben, durch gentechnische Methoden hergestellt.
• Es können wohlbekannte Verfahren zum Klonieren von für menschliches Calpastatin kodierender cDNA verwendet werden. Beispielsweise ist es möglich, poly-A enthaltende RNA aus einer etablierten Zellinie menschlichen Ursprungs oder aus der Leber oder dem Herzmuskel, wo menschliches Calpastatin verteilt ist, zu extrahieren, und diese kann auf Sepharose als mit oligo-dT0 gekoppelter Träger gereinigt werden. Sie kann als Matrize bei der Synthese von cDNA unter Verwendung einer Reversen Transcriptase verwendet werden, und die synthetisierte cDNA kann mit einem Plasmid oder einem Phagenvektor durch ein Verfähren, wie jenes von Okayama-Berg oder jenes von Gubler-Hoffmann, gekoppelt werden. Der Vektor kann in einen Wirt eingebracht werden, und es kann eine cDNA-Bibliothek hergestellt werden. Diese Art von Bibliothek ist im Handel verfügbar und beispielsweise bei CLONTECH Laboratories, Inc. erhältlich. Hat man bereits einen Teil der cDNA, kann eine cDNA-Bibliothek durch das Primer-Extensionsverfahrens hergestellt werden. Dieses Verfahren eignet sich insbesondere für die Klonierung des 5'-Endes von cDNA.
• Beim Vorauswählen eines cDNA-Klons, der für das gewunschte menschliche Calpastatin kodiert, aus einer cDNA-Bibliothek ist es wirkungsvoll, als Sonde cDNA- Fragmente von Schweine- oder Kaninchen-Calpastatin zu verwenden, deren Sequenzen bereits bekannt sind. Die DNA-Sonde kann chemisch synthetisiert werden, und es ist auch möglich, sie aus einem cDNA enthaltenden Vektor unter Verwendung von Restriktionsenzymen zu schneiden.
• Beim Vorauswählschritt einer Bibliothek mit einer DNA-Sonde muß die Bibliothek zuerst auf einer Platte kultiviert werden, und die entstehenden Kolonien und Plaques werden auf ein Nitrocellulose- oder Nylonfilter übertragen, worauf die DNA durch eine deren Denaturierung bewirkende Behandlung am Filter fixiert wird. Dieses Filter wird in einem Lösungsmittel inkubiert, welches mit ³²P od. dgl. markierte DNA enthält, und die DNA am Filter und die Sonden-DNA werden hybridisiert (nachstehend, dieser Schritt wird Hybridisierung genannt). Die Inkubationstemperatur wird im allgemeinen auf die Schmelztemperatur Tm der verwendeten Sonde eingestellt. Nach der Hybridisierung werden nicht-spezifisch adsorbierte Substanzen durch Waschen entfernt, und die Klone, die Hybride mit der Sonde sind, werden unter Verwendung von Autoradiografie identifiziert. Dieser Schritt wird wiederholt, um einen Klon zu isolieren, der dann analysiert wird.
• Ist die Rekombinante E. coli, wird eine kleine Starterkultur in einem Teströhrchen od. dgl. kultiviert, und Plasmide werden durch übliche Verfahren extrahiert und mit Restriktionsenzymen gespalten. Dann werden die erhaltenen Fragmente durch Elektrophorese aufagaroseoder Polyacrylamid-Gelen behandelt, und es wird die Produktion der inserierten Fragmente, die geklont werden, geprüft. Das Elektrophorese-Muster wird auf ein Nitrocellulose- oder Nylonfilter übertragen, und mittels des oben beschriebenen Verfahrens wird die Bildung eines Hybrids der DNA-Sonde und der inserierten Fragmente untersucht. Schließlich wird die Basensequenz der inserierten Fragmente durch das übliche Verfahren identifiziert. Ist die Rekombinante ein Phage, werden im Prinzip die gleichen Analyseschritte der Klone angewendet. Der klonierte Phage wird zur Infizierung von Wirtszellen von E. coli in Kultivierung verwendet, und Phagen-DNA wird aus dem Phagenlysat gereinigt. Wenn der Phage λgt11 ist, werden zuerst lysogene Bakterien kultiviert, und dann kann das Phagenlysat durch die Anwendung einer Temperaturverschiebung erhalten werden. Es ist auch möglich, DNA aus einer infizierten Platte zu gewinnen. Details über die Reinigung von Phagen-DNA findet man beispielsweise auf den Seiten 76-85 von "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (T. Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1982)". Die Phagen-DNA kann mit Restriktionsenzymen gespalten und mittels Gel-Elektrophorese behandelt werden, um zu überprüfen, daß Fragmente inseriert worden sind, oder es ist durch die Anwendung einer Hybridisierung möglich, die Homologie mit der cDNA für Schweine-Calpastatin zu untersuchen. Schließlich wird durch die Identifikation der Basensequenz die Klonierung verifiziert.
• Die gefündene Basensequenz kann mit den für Kaninchen- und Schweine-cDNA veröffentlichten Sequenzen verglichen werden, und die Ergebnisse können zur Ermittlung der Struktur des Gens und der Aminosäuresequenz verwendet werden, oder es ist durch einen Vergleich mit den funktionellen Einheiten von Schweine- oder Kaninchen-Calpastatin möglich, die funktionellen Einheiten von menschlichem Calpastatin zu identifizieren.
• Auf diese Weise ist es möglich, die DNA-Sequenz zu identifizieren, die den Aminosäuresequenzen der funktionellen Einheiten, Domänen 1, 2, 3 und 4, von menschlichem Calpastatin entspricht. Bei Schweine-Calpastatin kann jede der funktionellen Einheiten selbst unabhängig Calpain inhibieren, aber die nicht-homologe Sequenz auf der N-terminalen Seite, die funktionelle Domäne L, hat selbst keine Aktivität. Zu den gleichen Ergebnissen kommt man wahrscheinlich bei menschlichem Calpastatin. Daher wird die gesamte Genstruktur der erhaltenen cDNA oder eine DNA-Sequenz, die mindestens eine der funktionellen Domänen 14 enthält, oder eine DNA-Sequenz, die die für die Aufrechterhaltung der Aktivität notwendige Region besitzt und von der die 5'-Seite oder die 3'-Seite zum Teil oder zur Gänze deletiert worden ist, durch Ankoppeln an einen Expressionsvektor in geeignete Wirtszellen eingebracht, so daß sie exprimiert wird, und diese Wirtszellen werden kultiviert, damit ein Polypeptid erzeugt wird, welches die Aktivität von menschlichem Calpastatin aufweist. Als Expressionsvektor kann jede bekannte Vektorart verwendet werden.
• Aus Experimenten über die Exprimierung von Schweine- und Kaninchen-Calpastatin in E. coli ist es bekannt, daß ihre Moleküle keine S-S-Bindungen enthalten, und auch, daß ihre Moleküle keine Zuckerketten enthalten. Somit kann menschliches Calpastatin-ähnliches Peptid auf die gleiche Weise in E. coli exprimiert werden.
• Die Bestätigung der Exprimierung ist möglich durch eine Messung der Inhibition von Calpain wie bei der Messung mit Casein als Substrat unter Extraktion aus einem Kulturmedium von E. coli und Messung der Verringerung der säurelöslichen Fraktion durch Anwendung von Spektroskopie.
• Die Reinigung von menschlichem Calpastatin-ähnlichem Polypeptid aus E. coli kann durch gewöhnliche Chromatografie erfolgen. Das bedeutet, daß die Kulturzellen mit Lysozym behandelt und dann sonifiziert werden können, worauf der Überstand erhalten und die Stabilität von Calpastatin gegenüber einer Wärmebehandlung ausgenützt wird, um die säurelösliche Fraktion zu erhalten. Als nächstes wird Ionenaustausch-Chromatografie angewendet, gefolgt von Gelfiltration und chromatografischen Verfahren zur Erzielung des gewünschten Peptids.
• Die vorgenannte Präparation der Polypeptide mit einer Länge von 26 Aminosäuren oder kürzer kann durch die nachstehenden Peptidsyntheseverfahren erfolgen.
• So können die Polypeptide chemisch durch das synthetische Verfahren synthetisiert werden, bei welchem Fmoc (9-Fluorenylmethoxycarbonylpolyamid; L.k Carpino et al., J. Org. Chem., 37 3404-3409; 1972; E. Atherton et al., J. Chem. Soc., Chem. Comm., 1978. 537- 539, 1978; und 3. Meienhofer et al., Int. J. Peptide Protein Res., 13, 3542, 1979) zum Einsatz gelangt. Das Polypeptid, welches synthetisiert wurde, inhibierte Calpain, was zeigte, daß ein Polypeptid aus 18 Aminosäuren Calpastatin-ähnliche Aktivität haben kann. Auch ein Polypeptid aus 21 Aminosäuren und ein Polypeptid aus 26 Aminosäuren hatte Calpastatinähnliche Aktivität.
• Wie oben beschrieben ist es mit der vorliegenden Erfindung möglich, menschliche Calpastatin-ähnliche Polypeptide mit der Primärstruktur, funktionellen Einheiten und Regionen, die für die Aufrechthaltung der Aktivität zwischen für die Aktivität nötigen funktionellen Einheiten erforderlich sind, zu schaffen und Mittel vorzusehen, mit Hilfe derer diese Polypeptide mittels gentechnischer oder chemischer Verfahren hergestellt werden können.
Beispiele
• Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf Beispiele erläutert, aber ist nicht auf diese eingeschränkt zu betrachten.
• Die Beispiele beziehen sich teilweise auf die angeschlossenen Zeichnungen, worin Fig. 1 ein Diagramm für die Konstruktion von Expressionsplasmiden zeigt. Offene Boxen stellen Calpastatin-cDNA-Segmente dar. Fig. 2 zeigt Aminosäuresequenzen der 7-gestutzten Segmente von menschlichem Calpastatin. Die Aminosäurereste sind ausgehend vom Aminoterminalen Ende von menschlichem Calpastatin numiert (oben gezeigt die Sequenzen). Fig. 3 zeigt das Proffi der Inhibiton von Calpain durch in E. coli 545 πHR1 erzeugte Calpastatin- Segmente. Für jedes entsprechende Segment ist der Name des Expressionsplasmids gezeigt. Fig. 4 zeigt das Profil der Inhibition von Calpain durch synthetische Calpastatin-Segmente. Die Anzahl an Aminosäureresten für jedes Segmentist oberhalb der entsprechenden Kurve gezeigt.
• Beispiel 1. Herstellung von Calpastatin-ahnlichen Peptiden auf gentechnischem Weg:
1. Konstruktion von Expressionsplasmiden:
• Die Expressionsplasmide wurden konstruiert, wie in Fig. 1 gezeigt. Das BamHI-AccI- Fragment von λcs131 K. Asada et al., J. Enzyme Inhib., 3 49-56, 1989), welches für Teile der Domäne L- und Domäne 1-Regionen von Calpastatin kodierende cDNA enthält, wurde mit dem AccI-EcoRI-Fragment von λcs 19 (K. Asada et al., J. Enzyme Inhib., 3 49-56, 1989), welches für Teile der Domäne 1 und der Domänen 2-4 codierende cDNA enthält, an der AccI- Stelle ligiert und an der BamH1-EcoRI-Polylinker-Region von pUC119N (Takara Shuzo) inseriert.
• Das hierin konstruierte Plasmid, das mit pHCS13 bezeichnet wurde, wurde mit BamH1 verdaut, durch eine Auffüllkeaktion zu flachen Enden konvertiert und an NcoI-Linker
• (5'CAGCCATGGCTG3') gekoppelt. Die erhaltenen Moleküle wurden mit NcoI verdaut, und es folgte eine Selbstligation, die pHCS121 ergab. Das NcoI-EcoRI-Fragment von pHCS121, welches Calpastatin-cDNA enthielt, und das EcoRI-SalI-Fragment eines pINIII-ompAI- Vektors (K. Nakamura et al., Cell, 18 1109-1117, 1979), J. Ghrayeb et al., The EMBO J., 3, 2437-2442, 1984), welches die Transkriptionsabbruchregion des Lipoproteins der äußeren Membran enthielt, wurden an der EcoRI-Stelle ligiert und an der NcoI-SalI-Polylinker-Region von pUC118N inseriert, um pHCS131 zu ergeben.
• pHCS132 wurde mit NcoI verdaut, durch eine Auffüllreaktion zu flachen Enden konvertiert und mit XhoI verdaut. Das NcoI -XhoI-Fragment, das die Vektorregion enthielt, wurde isoliert und als Fragment 1 bezeichnet. Das EcoRI-Insert, welches die Kodiersequenz von menschlichem Calpastatin enthielt, wurde aus λcs143 isoliert und mit HinfI verdaut. Die erzeugten HinfI-Fragmente wurden durch eine Auffüllreaktion zu flachen Enden konvertiert und mit BcnI verdaut, und das Fragment, welches für die Domäne L kodierende cDNA enthielt, wurde isoliert und als Fragment 2 bezeichnet. Das NcoI-XhoI-Fragment, welches für Teile von Domäne L und Domäne 1 kodierende cDNA enthielt, wurde aus pHCS121 erhalten und mit Bcnl verdaut. Das BcnI-XhoI-Fragment, welches für die Domäne 1 kodierende cDNA enthielt, wurde isoliert und als Fragment 3 bezeichnet. Die Fragmente 1, 2 und 3 wurden vermischt und zur Erzeugung von pHCS181 ligiert.
• pHCS181 wurde mit SacI und XabI verdaut und mit SI-Nuclease behandelt; es erfolgte eine Selbstligation, was pHCS82 ergab, aus welchem die für den Großteil der Domäne 2 und die gesamte Domäne 3 und 4 kodierende cDNA entfernt worden war. AvaIII- und ClaI-Stellen wurden an der 5'-terminalen Seite der für die Domäne L kodierenden Region durch ortsgerichtete Mutagenese unter Verwendung eines Mutanten-K-Kits (Takara Shuzo) eingeführt, um pHCS83 zu ergeben; die Oligonudeotide
• 5'TATCTGATGCATGCTTGGGTA3' und 5'GTGAGCATCGATACTTCCTG3', die Basenpaare an den Positionen 131 bis 151, außer an der Position 141 (C-T), und an 152 bis 171, außer an der Position 161 (T-T) bilden können, wurden zur Einführung der AvaIII-bzw. ClaI-Stelle verwendet. pHCS83 wurde zur Einführung eines Stopcodons an der 3'-terminalen Stelle der für die Domäne 1 kodierenden Region verwendet, was pHCS84 ergab, ebenso wie die Einführung der AvaIII- oder ClaI-Stelle; das Oligonucleotid
• 5'CCTTTCTTTACTTCTCTTG3' kann Basenpaare an den Positionen 718 bis 736, mit Ausnahme der Position 727 (T-T), bilden. Das AvaIII-SalI-Fragment wurde aus pHCS84 isoliert und an der PstI-SalI-Polylinker-Region von pTV119N inseriert, um pHCS231 zu ergeben. Die Plasmid tragenden Escherichia coli JM109-Zellen wurden mit E. coli JM109/PHCS231 bezeichnet. Der Stamm wurde beim Fermentation Research Institute der Agency of Industrial Science and Technology, Japan, unter FERM BP-2819 hinterlegt.
• Das erhaltene Plasmid, pHCS231, wurde mit SphI und ClaI verdaut, und verschiedene DNA-Größen wurden von der ClaI-Stelle in fünf progressiv veränderten Sets von Bedingungen unter Verwendung eines Kilo-Sequenzdeletions-Kits (Takara Shuzo) deletiert. Die erzeugten Moleküle wurden dann mit NcoI-Linker (einer Mischung aus 5'CAGCCATGGCTG3', 5'AGCCATGGCT3' und 5'GCCATGGC3') ligiert und vor der Selbstligation mit NcoI verdaut; pHCSd18, pHCSd42, pHCSd94, pHCSd65 und pHCSd81 waren unter den in diesem Schritt konstruierten Plasmiden (Fig. 2). Stopcodons wurden in pH,CSd42 an den Nucleotid-Positionen 616-618 mit dem Oligonucleotid 5'TTCACCTGAGGGTCGCC3' für die Konstruktion von pHCSd421 und an den Positionen 565-567 mit 5'TATTGGCTTAACCCATA3' für die Konstruktion von pHCSd422 auf die gleiche Weise eingeführt.
2. Herstellung von in E. coli produzierten Calpastatin-Segmenten:
• Mit rekombinanten Plasmiden transformierte E. coli 545πHR1-Zellen wurden in LB- Medium zur späten Logarithmusphase kultiviert und geerntet. Die Zellen wurden gewaschen und in einem Fünfündzwanzigstel des Kulturvolumens von 20 mM MES-Puffer (pH 5,5), enthaltend 1 mM EDTA, 5 mM 2-Mercaptoethanol und 4 µM p-Amidinophenylmethansulfonylfluorid (A-PMSF), suspendiert. Der Rohextrakt wurde durch Lysozyinbehandlung und Frost-Tauen, wie von M. Maki et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 143, 300-308, 1987) beschrieben, hergestellt. Für eine großangelegte Herstellung wurden die Zellen durch Sonifikation lysiert (zweimal jeweils 3 min). Nach der Behandlung bei 95ºC während 10 min wurde das Lysat mit 12.000 rpm (Nr. 5N, Tomy Seiko Co., Ltd., Tokyo, Japan) 30 min lang bei 4ºC zentrifugiert, und der Überstand wurde bei -80ºC bis zur weiteren Reinigung aufbewahrt. Die Proben wurden zum Teil mittels DEAE-Toyopearl-Chromatografie gereinigt. Die Säule wurde zuvor mit 20 mM MES-Puffer (pH 5,5), enthaltend 50 mM NaCl, 1 mM EDTA und 4 µM A-PMSF, equilibriert, und die Elution erfolgte mit einem linearen Gradienten von NaCl aus 50 bis 250 mM. Die Fraktionen, die eine Inhibitionsaktivität aufwiesen, wurden untersucht wie nachstehend beschrieben, gesammelt und dann mittels Gelfiltration auf einer mit Wasser equilibrierten Sephadex G-50 Säule zur Entfernung kontaminierender Salze und Nucleotide gereinigt. Die Calpastatin-Segmente enthaltenden Fraktionen wurden mittels SDS- Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese nachgewiesen und lyophilisiert. Die Segmente wurden hydrolysiert, und ihre Ausbeuten wurden gemessen und ihre Reinheit wurde überprüft (Aminosäure-Analysator L-8500, Hitachi, Tokyo, Japan).
• Vergleichsbeispiel 1: Synthese eines Polypeptids aus 18 Aminosäuren, eines Polypeptids aus 21 Aminosäuren und eines Polypeptids aus 26 Aminosäuren: Ausgangsmaterialien:
• Hierin ist But tert.Butyl, PFP Pentafluorphenyl, DHBT 1-Oxo-2-hydroxydihydrobenzotriazin, Mtr 4-Methoxy-2,3,6-trimethylphenylsulfonyl und Boc tert.Butoxycarbonyl.
Harz: PepSyn KA (MilliGen)
• 1. Harzbindung und Peptidverlängerung von Fmoc-Leu-OH, das modifiziert wird, um die C-terminale Aminosäure des Polypeptids mit 18 Aminosäuren, des Polypeptids mit 21 Aminosäuren und des Polypeptids mit 26 Aminosäuren zu werden.
(1) Synthese eines [Fmoc-Arg(Mtr)]&sub2;O-Anhydrids und eines (Fmoc-Leu)&sub2;O-Anhydrids
• Zuerst wurden 730 mg Fmoc-Arg(Mtr)-OH in 5 ml Methylenchlorid gelöst, und zu der Lösung wurden 110 mg Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Die Mischung wurde in einem Eisbad 40 min lang gerührt, und dann wurde der Dicyclo-Harnstoff durch Filtration entfernt und unter reduziertem Druck zur Trockene konzentriert. Der gleiche Vorgang wurde unter Verwendung von 420 mg Fmoc-Leu-OH getätigt.
(2) Bindung von [Fmoc-Arg(Mtr)]&sub2;O und (Fmoc-Leu)&sub2;O an Harz PepSyn KA)
• Zuerst wurden 720 mg [Fmoc-Arg(Mtr)]&sub2;O-Anhydrid in ausreichend Dimethylformamid (DMF) gelöst, um das Harz anzufeuchten, und in Gegenwart von 11 mg 4- Dimethylaminopyridin wurde 1 g Harz etwa 2 h lang reagieren gelassen. Nach Ende der Reaktion wurde die Reaktionsmischung zuerst mit 10 ml DMF und dann mit 10 ml Methylenchlorid gewaschen, worauf die Mischung getrocknet wurde. Die Bindungsrate wurde mittels Aminosäurenanalyse überprüft. Separat wurde ein Anhydrid von 410 mg (Fmoc- Leu)&sub2;O auf die gleiche Weise behandelt.
(3) Verlängerung der Peptidkette
• Als nächstes wurde das synthetisierte Fmoc-Arg(Mtr)- PepSyn KA-Harz zum Befüllen einer Säule zur Verwendung in einem Peptid-Synthetisierer (MilliGen) verwendet, und es wurde ein Peptid-Synthetisierer (MilliGen) zur Anfügung von Fmoc-Tyr(But)-PFP, Fmoc-Lys(Boc)-PFP usw., der Reihe nach bis zur 18. Verbindung Fmoc-Thr(But)-DHBT, an das C-terminale Polypeptidende eingesetzt, um das Polypeptid aus 18 Aminosäuren zu synthetisieren. Auch das Fmoc-Leu-PepSyn KA-Harz wurde mit Fmoc-Leu-PFP, Fmoc- Glu(Obut)-PFP usw., der Reihe nach bis zum 21. Fmoc-Thr(But)-DHBT, gebunden, um das Polypeptid mit 21 Aminosäuren zu bilden, und bis zur 26. Verbindung, Fmoc-Asp(Obut)-PFP, um das Polypeptid mit 26 Aminosäuren zu bilden. Nach der Synthese wurde das an das Peptid gebundene Harz mit 10 ml Methylenchlorid (4mal), mit 10 mi tert-Amylalkohol (2mal), 10 ml Essigsäure (2mal) und 10 ml Diethylether (4mal) gewaschen.
2. Entfernung des Harzes und der Schutzgruppen:
• Am Ende der Synthese wurde 20 %iges Piperidin-DMF zum Harz zugegeben, und die Mischung wurde 1 h stehen gelassen, worauf 10 ml DMF zum Waschen des Harzes verwendet wurden und danach 10 mi Methylenchlorid. Dann wurde das Harz getrocknet. Zum Rückstand wurden 10 ml einer 90:5:5-Mischung aus Trifluoracetat (TFA), Ethandithiol und Thioanisol zugegeben. Die Mischung wurde 3 h stehen gelassen. Als nächstes wurde Wasser für eine 5%ige Konzentration von TFA zugegeben, und die Mischung wurde zuerst mit 10 ml Hexan und dann mit 10 ml Ether gewaschen. Nach dem Waschen wurde das Wasser mit einem Verdampfer entfernt, der Rückstand wurde in 1 ml 1 N Essigsäure gelöst, und eine Portion wurde mittels Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (Säule, YMC-ODS&sub5;C&sub1;&sub8;, mobile Phase, 0,05 % TFA in Wasser -0,05 % TFA in Acetonitril) behandelt. Die an den Peaks eluierten Fraktionen wurden auf ihre Aminosäuren untersucht. Die Fraktionen mit der richtigen Aminosäurenzusammensetzung wurden gesammelt, und ihr Molekulargewicht wurde unter Anwendung von Schnellatombeschuß-Massenspektroskopie ermittelt, um zu überprüfen, ob die Schutzgruppen entfernt worden waren. Auf diese Weise wurden 32 mg Polypeptid mit 18 Aminosäuren, 40 mg Polypeptid mit 21 Aminosäuren und 50 mg Polypeptid mit 26 Aminosäuren erhalten.
Beispiel 2: Nachweis der Inhibition von Calpain durch Calpastatin-ähnliche Polypeptide
• Die Untersuchung der Calpain-Inhibition erfolgte, wie nachstehend beschrieben (A. Kitahara et al., J. Biochem., 95 1759-1766, 1984). Zuerst wurden 10 µl der Probe, 2,5 µl Calpain in einer Konzentration von 1 mg/ml, 40 µl 2% Casein in Imidazol und 20 µl Crystein in einer Konzentration von 6 mg/ml zusammengemischt, was ein Gesamtvolumen von 180 µl ergab. Danach wurde die Mischung 5 min lang bei 30ºC behandelt, worauf 20 µl 50 mM Calciumchlorid zugegeben wurden, und die Mischung wurde 15 min lang bei 30ºC inkubiert. Dann wurden 200 µl 5%ige Trichloressigsäure zugegeben, um die Reaktion zu stoppen, und die Mischung wurde 10 min lang bei 12.000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde erhalten, und es wurde seine Extinktion bei 280 nm gemessen, aus welcher die Inhibitionsaktivität gegenüber Calpain errechnet wurde.
• Die Ergebnisse sind in den Fig. 3 und 4 gezeigt. Die in Beispiel 1 erzeugten und im Vergleichsbeispiel synthetisierten Calpastatin-ähnlichen Polypeptide inhibierten Calpain.
• Vergleichsbeispiel 2: Nachweis der Inhibition von Calpain durch ein Polypeptid mit einer Aminosäure oder einem Peptid vom N-Terminus des Polypeptids mit 18 Aminosäuren
(1) Synthese von Polypeptiden mit Deletion am N-Terminus:
• Mit dem im Vergleichsbeispiel 1 gezeigten Verfahren wurden Fmoc-Tyr(But)-PFP, Fmoc-Lys(Boc)-PFP und insgesamt 11 Verbindungen an das Fmoc-Arg(Mtr)-PepSyn KA- Harz gebunden, was ein synthetisches Polypeptid ergab, welches mit Fmoc-Lys(Boc)-PFP endete. Auch wurde ein ähnliches Polypeptid mit 12 Verbindungen, endend mit Fmoc-Gly- PFP, hergestellt. Ein ähnliches Polypeptid wurde mit 13 Verbindungen, endend mit Fmoc-Leu- PFP, gemacht. Ein ähnliches Polypeptid wurde mit 14 Verbindungen, endend mit Fmoc- Glu(OBut)-PFP, gemacht. Ein ähnliches Polypeptid wurde mit 15 Verbindungen, endend mit Fmoc-Glu(OBut)-PFP, hergestellt. Ein ähnliches Polypeptid wurde mit 16 Verbindungen, endend mit Fmoc-Ile-PFP erzeugt. Ein ähnliches Polypeptid wurde mit 17 Verbindungen, endend mit Fmoc-Tyr(But)-PFP, gemacht.
(2) Nachweis der Inhibition von Calpain:
• Diese synthetischen Polypeptide wurden in einem Versuch über Calpain-Inhibition durch die Vorgangsweisen aus Beispiel 2 verwendet. Die Ergebnisse zeigten, daß diese Polypeptide mit diesen Deletionen am N-Terminus eine sehr geringe oder keine Inhibitionsaktivität gegenüber Calpain hatten. Die Inhibitionsaktivität des Polypeptids mit 17 Aminosäuren ist in Fig. 4 veranschaulicht - diese Aktivität war fast nicht nachweisbar.
• Die oben dargelegten Ergebnisse zeigen, daß die vorliegende Erfindung neue Polypeptide mit menschlicher Calpastatin-ähnlicher Aktivität liefert. Diese neuen Polypeptide können bei verschiedenen Störungen wirken, die auf eine Überaktivität von Calpain zurückzugehen scheinen.

Claims (5)

1. Menschliches Calpastatin-ähnliches Polypeptid, welches eine Calpain-Inhibitor-Aktivität aufweist, und die Sequenz

W-X oder W-X-Y

besitzt, worin W die folgende Struktur aufweist:

in welcher X die folgende Struktur besitzt:

und worin Y die folgende Struktur besitzt:

2. Basensequenz, welche das menschliche Calpastatin-ännliche Polypeptid nach Anspruch 1 kodiert.

3. Rekombinantes Plasmid, welches DNA enthält, die das menschliche Calpastatin-ähnliche Polypeptid nach Anspruch 1 kodiert.

4. Transformant, welcher das rekombinante Plasmid nach Anspruch 3 trägt.

5. Verfahren zur Herstellung von menschlichem Calpastatin-ähnlichem Polypeptid, welches Verfahren die Kultivierung des Transformanten nach Anspruch 4 und die Gewinnung von menschlichem Calpastatin-ännlichem Polypeptid nach Anspruch 1 aus der Kulturnährlösung des Tränformanten umfaßt.