DE69024071T2

DE69024071T2 - Chromogenische Merocyanin-Enzym-Substrate

Info

Publication number: DE69024071T2
Application number: DE69024071T
Authority: DE
Inventors: Paul F Corey; Teresa M Yip
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1989-02-13
Filing date: 1990-01-31
Publication date: 1996-05-15
Anticipated expiration: 2010-02-01
Also published as: AU640517B2; CA2000596A1; AU8367091A; CA2000596C; EP0383092B1; JP2926100B2; US5122602A; JPH02245200A; EP0383092A2; EP0383092A3; AU4868290A; AU617237B2; DE69024071D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft chromogene Verbindungen, die sich als optische Indikatorverbindungen in analytischen Testsystemen eignen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung neue chromogene Enzymsubstrat-Verbindungen sowie deren Verwendung in analytischen Testsystemen zum Nachweis von Enzymen in einer flüssigen Testprobe.
Die Bestimmung von Enzymen ist in einer Vielzahl von Gebieten wie der biochemischen Forschung, bei Testverfahren auf dem Gebiet der Umwelttechnik und Industrie sowie bei medizinischen Diagnoseverfahren wichtig. Die Quantifizierung von Enzymgehalten in Körperflüssigkeiten wie Serum und Plasma liefert dem Arzt sehr nützliche Informationen zur Diagnose von Krankheitszuständen und deren Behandlung. Außer als Analyte von Interesse in biologischen Flüssigkeiten können Enzyme auch als Nachweisreagentien in einer Vielzahl analytischer Systeme wie bei Immunoassy- und Nukleinsäurehybridisierungsverfahren dienen. In solchen Systemen sind Enzyme direkt oder indirekt als Markierungsmittel nützlich, um das Ausmaß der Antigen- Antikörper-Bindung oder einer stattfindenden Nukleinsäurehybridisierung zu verfolgen und aufzuzeigen.
Demzufolge hat der Wunsch zum Nachweis von Enzym-Analyten und zur Verwendung von Enzym-Markierungen als ein diagnostisches Werkzeug in verschiedenen analytischen Testsystemen zur Entwicklung optischer Indikatorverbindungen zur Verwendung bei Nachweis und Messung der Wirksamkeit solcher Enzyme Anlaß gegeben. Typischerweise enthalten solche bekannten optischen Indikatorverbindungen eine nachweisbare chemische Gruppe, wie ein Fluorogen oder ein Chromogen, welche mit einer durch ein Enzym abspaltbaren Substratgruppe derivatisiert worden sind, die bezüglich des Enzyms von Interesse spezifisch ist. Solche optischen Indikatorverbindungen ergeben ein optisches Signal, das sich von dem optischen Signal unterscheidet, das sich durch die abgespaltene native Form des Fluorgen oder Chromogen ergibt. Im Prinzip spaltet das Enzym die Indikatorverbindung, um das Fluorogen oder Chromogen in der Form eines eindeutig fluoreszierenden oder gefärbten Produkts freizusetzen, um eine Änderung bei der Fluoreszenz oder Farbe zu ergeben, welche proportional zur Menge an vorhandenem Enzym ist, das, seinerseits, mit der Menge an in einer flüssigen Testprobe vorhandenem Analyt korreliert werden kann.
Insbesondere sind Nachweis und/oder Bestimmung von Hydrolasen, d.h. von Enzymen, die Hydrolyse-Reaktionen von Estern, glycosidischen Bindungen, Peptidbindungen, weiteren Kohlenstoff-Stickstoff-Bindungen und von Säureanhydriden katalysieren [siehe Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., New York, NY, 1970) S. 148], von Interesse bei der Diagnose und aufzeichnenden Verfolgung verschiedener Krankheiten wie z.B. bei der Bestimmung von Amylase und Lipase in der Diagnose einer pankreatischen Disfunktion [siehe Kaplan und Pesce, Clinical Chemistry - Theory, Analysis and Correlation (C. V. Mosby Co., St. Louis, MO, 1984), Kapitel 56], bei der Bestimmung von N- Acetylglucosaminidase (NAG) als ein Indikator einer Nierenerkrankung [siehe Price, Curr. Probl. Clin. Biochem. 9, 150 (1979)] sowie beim Nachweis von Esterase als ein Indikator für Leukozyten [siehe Skjold, Clin. Chem. 31, 993 (1985)].
Enzyme haben auch Bedeutung in der Diagnostik sowie auf Biotechnologie-Gebieten gewonnen. Beispielsweise haben alkalische Phosphatase und β-D-Galactosidase zunehmende Verwendung als Indikator-Enzyme für Enzym- Immunoassayverfahren gefunden [siehe Annals of Clinical Biochemistry 16, 221-40 (1979)]. Demgemäß hat die Verwendung von Enzymen wie von Glycosidasen, insbesondere von Galactosidase, als Indikator-Enzym-Markierungsmittel in analytischen Testsystemen Anlaß zur Entwicklung von Substrat- Glycosidasen wie Phenyl-β-D-galactosidase, o-Nitrophenyl-β-D- galactosidase und p-Nitrophenyl-β-D-galactosidase gegeben [siehe Biochem. Z., Bd. 33, S. 209 (1960)]; welche durch β-D- Galactosidase hydrolysiert werden, um Phenol, das photometrisch im ultravioletten Bereich bestimmt wird, oder die entsprechenden Nitrophenole freizusetzen, die im kurzwelligen sichtbaren Bereich bestimmt werden. Einige weitere Beispiele stellen die chromogenen Resorufin-Derivate aus EP 156 347 sowie die chromogenen Acridinon-Derivate aus EP 270 946 dar.
Die Verwendung von β-D-Galactosidasen ist auch im Zusammenhang mit histochemischen Untersuchungen beschrieben worden, wie der Naphthyl-β-D-galactosidasen, beschrieben in Histochemie, Bd. 35, S. 199 und Bd. 37, S. 89 (1973), sowie der entsprechenden 6-Brom-β-naphthyl-Derivate, beschrieben in J. Biol. Chem., Bd. 195, S. 239 (1952). Gemäß dieser Testsysteme werden die Naphthole, die durch die Wechselwirkung der Galactosidase mit dem Enzym freigesetzt werden, mit verschiedenen Diazoniumsalzen zur Reaktion gebracht, um die jeweiligen Azo-Farbstoffe zu ergeben, die dann sichtbar gemacht werden.
Es besteht allerdings weiterhin ein Bedarf nach neuen Verbindungen, die wünschbare Kombinationen chromogener Substrateigenschaften wie Extinktionskoeffizient, Absorptionsmaxima, Wasserlöslichkeit, Farbverschiebung und Umsatzgeschwindigkeit bzw. -prozentsatz aufweisen.
Merocyanin-Farbstoffe sind früher bereits als analytische Reagentien, allerdings nicht als chromogene Enzymsubstrate eingesetzt worden. In EP 47 470 ist die Verwendung von Cyanin- und Merocyanin-Farbstoffen als Markierungsmittel für Antikörper oder Antigene in einem immunochemischen Assayverfahren beschrieben. Die markierten Antigene oder Antikörper werden einer Immunreaktion unterzogen und mit einem Silberhalogenid in Kontakt gebracht, das dann belichtet und entwickelt wird. Die entstandene optische Dichte wird gemessen. In PCT 86-06374 ist ein Konjugat eines hochfluoreszierenden Merocyanin-Farbstoffs mit einem biologisch aktiven Rest beschrieben, der in diagnostischen Assayverfahren einsetzbar ist. Dabei werden mit Farbstoff markierte Antikörper verwendet, um Analyte in einer Testprobe zu messen. Kiciak [Roczniki Chemii 37, 225 (1963)] beschreibt die Herstellung eines Merocyaninacetatesters, er gibt aber keinen Hinweis darauf, daß dieser als ein chromogenes Enzymsubstrat fungieren könnte.
In der früher eingereichten PCT-Anmeldung WO 89/02473 sind bestimmte mit Merocyanin markierte Substrate beschrieben, diese Anmeldung schweigt sich aber bezüglich der hier vorliegenden Verbindungen aus.
Durch die vorliegende Erfindung werden neue chromogene Merocyanin-Enzymsubstrat-Verbindungen der allgemeinen Formel (A) bereitgestellt:
worin Y eine enzymatisch abspaltbare Gruppe darstellt, die ausgewählt ist, um Spezifität für das entsprechende Enzym von analytischem Interesse zu vermitteln. Ferner stellen A eine Gruppe von Atomen zur Ergänzung eines substituierten oder unsubstituierten Naphthalin-Gerüsts und B eine keine Metalle enthaltende Gruppe von Atomen oder einen entsprechenden Rest dar, welche einen 5- oder 6-gliedrigen N-haltigen heterocyclischen Ring oder ein kondensiertes Ringsystem aus 5- und/oder 6-gliedrigen heterocyclischen oder carbocyclischen Ringen vervollständigen; R¹ ist eine Alkyl- oder Aryl-Gruppe; R² und R³, die gleich oder verschieden sein können, sind ein Wasserstoffatom oder eine Niedrigalkyl- Gruppe; m, n und p, die gleich oder verschieden sein können, sind ganze Zahlen von 0 bis 3, mit der Maßgabe, daß m+n+p mindestens 2 beträgt; und X ist ein Gegenion (Anion). Die mit der Gruppe A in der Formel gebildeten Ringsysteme werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung als der saure Kern und die mit der Gruppe B gebildeten Ringsysteme als der basische Kern bezeichnet.
Fig. 1 ist eine Tabelle einiger repräsentativer basischer und saurer Kerne, die Merocyanine bilden können.
Fig. 2 bis 5 sind Fließdiagramme der prizipiellen Stufen in der bevorzugten einschlägigen Synthese von in den Beispielen beschriebenen Substrat-Verbindungen.
Fig. 6 bis 8 sind graphische Darstellungen der Dosis- Reaktion einiger Substrat-Verbindungen der vorliegenden Erfindung auf das Enzym β-Galactosidase.
Die Merocyanine sind eine Klasse von Sensibilisierungsfarbstoffen, die in den beginnenden Jahren von 1930 an, unabhängig voneinander, von Kendall (GB 426 718; 428 222; 428 359; 428 360; 432 628; 549 201-4; 555 549; 555 550; 624 027; 624 951 und 634 952) und Brooker (US 2 078 233; 2 089 729; 2 153 169; 2 161 331; 2 165 219; 2 165 338; 2 170 803-7; 2 177 401-3; 2 185 182; 2 185 343; 2 186 624; 2 211 762 und 2 332 433) aufgefunden wurden. Die Literatur über diese Verbindungen ist Gegenstand verschiedener Übersichtsartikel gewesen - Quarterly Reviews 4, 327 (1950); "The Chemistry of Synthetic Dyes", Vol. II, von K. Venkataraman, Academic Press, New York (1952), Kapitel 38; "The Cyanin Dyes und Related Compounds" von F. Hamer, Interscience Publishers, New York (1964), Kapitel 10, 11 und 14; "The Chemistry of Synthetic Dyes, Vol. IV, ed. K. Venkataraman, Academic Press, New York (1971), Kapitel 5; und "The Chemistry of Heterocyclic Compounds", Vol. 30, ed. E. Taylor und A. Weissberger, Wiley-Interscience, New York (1977).
Merocyanine sind aus einem sauren Kern und einem basischen Kern zusammengesetzt, wie dargestellt durch die allgemeine Formel (B):
Das Chromophor (der Farbträger) in diesem Molekül ist das dipolare amidische System, dargestellt in Formel (C):
Ein einfaches Merocyanin ist definiert als eines, worin die Kerne direkt verbunden sind, d.h. m=0 in Formel (B), und ein Dimethinmerocyanin ist als eines definiert, worin m=1 ("The Cyanine Dyes and Related Compounds", siehe oben). Dimethinmerocyanine sind auch Merocarbocyanine genannt worden ("Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology", Vol. 7, 3. Ausgabe, Wiley-Interscience, New York (1979), S. 335-358). Homologe, in denen m=2 und 3, sind ebenfalls bekannt. Synthetische Verfahren zur Herstellung dieser Klasse von Verbindungen sind in jüngerer Zeit als Übersicht zusammengestellt worden ("The Chemistry of Heterocyclic Compounds", siehe oben).
Unter den Merocyanin-Farbstoffen haben diejenigen des Stilbazolium-Betain-Typs [Formel (D)] dauerhaftes Interesse wegen ihrer solvatochromatischen Eigenschaften gefunden:
Bereits 1920 wurde von einer Verbindung dieses Typs berichtet, daß sie als ein pH-Indikator fungiert, wobei sie "Zitronengelb" in der Gegenwart von Säuren und "Blutrot" in der Gegenwart von Alkali ist [L. F. Werner, J. Am. Chem. Soc. 42, 2309 (1920)]. Im Laufe der folgenden Jahre wurden weitere pH-Indikatoren innerhalb dieser Klasse von Farbstoffen aufgefunden [Helv. 23, 247 (1940); Ukran. Khim. Zhur. 18, 347 (1952); Farmacia (Bukarest) 22, 345 (1974)]. Wird die Sauerstoff-Funktionalität des sauren Kerns derivatisiert, ist eine Verschiebung bei der Farbe vom underivatisierten Farbstoff festgestellt worden [J. Org. Chem. 14, 302 (1949); Roczniki Chemii 37, 225 (1963)].
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Merocyanin- Farbstoffe, in denen die Sauerstoff-Funktionalität des sauren Kerns mit einer durch ein Enzym abspaltbaren Gruppe derivatisiert worden ist, herzustellen und die Verwendbarkeit solcher Verbindungen als chromogene Enzymsubstrate aufzuzeigen und anzugeben. Als Ergebnis ist herausgefunden worden, daß Verbindungen der Formel (A) vorteilhafte chromogene Enzymsubstrate darstellen.
Wie hierin verwendet, soll der Begriff "Alkyl" lineare oder verzweigte Formen unsubstituierte Kohlenwasserstoff-Reste der allgemeinen Formel CnH2n+1, vorzugsweise vom aliphatischen "Niedrigalkyl"-Typ, worin n 6 oder weniger beträgt, wie einen Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, Isopropyl-, n-Butyl-, Isobutyl-, t-Butyl-, n-Hexyl-Rest und dgl., sowie substituierte Formen davon einschließen.
Ferner soll der Begriff "Aryl" organische Reste, die von einem aromatischen Kohlenwasserstoff-Ring oder Ringsystem durch Entfernung eines Wasserstoffatoms abgeleitet sind, und die unsubstituierten Kohlenwasserstoff-Ringreste, wie einen Phenyl- und Naphthyl-Rest, und substituierte Formen davon einschließen. Für die Zwecke und im Rahmen der vorliegenden Erfindung schließen Aryl-Reste diejenigen ein, welche eine oder mehrere gleiche oder verschiedene funktionelle Gruppen oder Substituenten aufweisen, welche vom Fachmann ausgewählt werden können, um die chromogenen Enzymsubstrat-Verbindungen der vorliegenden Erfindung bereitzustellen.
Insbesondere soll, wenn "Aryl" und "Alkyl" substituiert sind, eine solche Substitution solche Gruppen oder Substituenten, bei Vorliegen von Mono- oder Polysubstitution mit funktionellen Gruppen, einschließen, welche die nützlichen Merkmale der vorliegenden Verbindungen im wesentlichen nicht aufheben. Solche funktionellen Gruppen schließen chemische Gruppen ein, die synthetisch eingeführt werden können und die stabilen und geeigneten chromogenen Enzymsubstrat- Indikatorverbindungen der vorliegenden Erfindung ergeben. Beispiele solcher funktionellen Gruppen schließen, ohne darauf eingeschränkt zu sein, Halo-Gruppen (z.B. Fluor, Chlor, Brom), substituierte Amino- wie Dialkylamino-Gruppen, Nitro-, Alkoxy-, Aryloxy-, Alkyl-, Aryl-, Cyano-, Sulfo-, Carboxy- und Alkoxycarbonyl-Gruppen ein.

Enzymatisch abspaltbare Gruppen

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die enzymatisch abspaltbare Gruppe Y ein Rest einer Verbindung Y-OH, die einen Enzym-spezifischen Rest aufweist, um neue chromogene Enzymsubstrat-Verbindungen zu ergeben, durch welche Spezifität auf eine große Vielzahl von in der klinischen Chemie vorzufindenden Enzymen, insbesondere gegenüber Hydrolasen, übertragen bzw. vermittelt wird. Die Verbindung Y-OH soll, ohne unbedingt darauf eingeschränkt zu sein, Zucker und Derivate davon, Acyl-Gruppen, einschließlich aliphatischer und aromatischer Carboxylsäuren, Aminosäuren und Peptide sowie anorganische Säuren wie Phosphor- und Schwefelsäure-Gruppen einschließen.
Es sollte klar sein, daß es für einen Durchschnittsfachmann unmittelbar und ohne weiteres ersichtlich ist, daß die Auswahl der enzymatisch-spaltbaren Gruppe Y natürlich von dem besonderen Enzym abhängt, das den Gegenstand von Interesse darstellt. Ist beispielsweise das Enzym von Interesse eine Glycosidase, kann ein Glycosid hergestellt werden, worin die enzymatisch-spaltbare Gruppe Y der glycosidische Rest ist, der dem natürlichen Substrat für die besondere Glycosidase entspricht. Geeignete glycosidische Reste schließen, ohne allerdings darauf eingeschränkt zu sein, Mono- und Oligosaccharid-Reste, die dazu befähigt sind, in ein Glycosid-Substrat, das für ein besonderes Glycosidase-Enzym spezifisch ist, eingebracht und durch das genannte Enzym gespalten zu werden, wie Reste von β-D-Galactopyranose, α-D- Galactopyranose, β-D-Glucopyranose, α-D-Glucopyranose und α- D-Mannopyranose, sowie Aminozucker wie N-Acetylglucosamin und N-Acetylneuraminsäure, und ähnliche Reste ein. Weitere geeignete glycosidische Reste schließen Oligosaccharid-Ketten mit einer Länge von ca. 2 bis 20, vorzugsweise von 2 bis 7, Monosaccharid-Einheiten ein, die durch α-1,4-Glucosid- Bindungen gebunden sind, welche durch Enzyme, die eine Saccharid-Kette spalten, zu einem Mono- oder Oligosaccharid gebrochen werden können, das, seinerseits, durch eine entsprechende Glycosidase, wie z.B. Reste von Maltopentose, Maltohexose und Maltoheptose, gespalten werden kann.
Es sollte klar sein, daß in einigen Fällen, in denen der glycosidische Rest eine zuvor beschriebene Oligosaccharid- Kette ist, eine solche Kette zuerst zu einem kürzeren Oligosaccharid oder einem Monosaccharid durch das zu bestimmende Enzym modifiziert oder gebrochen wird, um eine sekundäre Substratverbindung zu erzeugen, in welcher die enzymatisch-spaltbare Gruppe durch ein sekundäres Enzym von der Merocyanin-Indikatorgruppe abgespalten wird, in welchem Fall die sekundäre Verbindung dann mit dem sekundären Enzym in Kontakt gebracht wird, um eine meßbare Absorptionsänderung zu erzeugen, wie vorher beschrieben. Ist beispielsweise das zu bestimmende Enzym α-Amylase, wird die Oligosaccharid-Kette gespalten, um eine sekundäre Glycosid-Substratverbindung, z.B. ein α-Glucosid oder ein β-Glucosid, zu erzeugen, worin die sich ergebende entsprechende Glycosid-Gruppe jeweils von der Merocyanin-Indikatorgruppe durch ein sekundäres Glycosidase-Enzym, z.B. α-Glucosidase oder β-Glucosidase, abspaltbar ist.
Im Falle von nicht-spezifischen Esterase-Enzymen ist die enzymatisch-spaltbare Gruppe Y eine Acyl-Rest-Gruppe der Formel:
- V
worin V ein Niedrigalkyl- oder Aryl-Rest ist, solche Verbindungen können zum Nachweis nicht-spezifischer Esterase- Enzyme wie von Cholinesterase, Acylase, Lipase und dgl. herangezogen werden.
Die chromogenen Enzymsubstrat-Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch zum Nachweis proteolytischer Enzyme eingesetzt werden, die gewöhnlich in Leukozyten aufgefunden werden. Solche Verbindungen sind Ester der allgemeinen Formel, worin Y ein Rest der Verbindung Y-OH ist, und worin Y-OH eine N-geschützte Aminosäure oder ein kurzes Peptid aus z.B. ca. 2 bis 5 Aminosäure-Einheiten ist. Beispielsweise kann Y als ein N-geschützter Aminosäure-Rest der N-Tosyl-L- alanin-Rest sein. Es ist zu würdigen, daß im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch weitere Carboxylsäure-Reste, Aminosäure-Reste und N-schützende Gruppen als Äquivalente in Betracht gezogen sind, wie nachfolgend in größerem Detail beschrieben wird.
In ganz ähnlicher Weise ist, für den Nachweis alkalischer Phosphatase aus einer flüssigen Testprobe, die enzymatisch- spaltbare Gruppe Y ein Rest der Verbindung Y-OH, worin Y-OH eine Phosphorsäure-Gruppe ist.

Basische und saure Kerne

Eine äußerst große Vielfalt verschiedener substituierter und unsubstituierter basischer und saurer Kerne kann verwendet werden, um die Merocyanin-Farbstoff-Komponente der vorliegenden Verbindungen zu bilden. In der Literatur angegebene Merocyanine sind als Beispiele durch diejenigen Kombinationen der basischen und sauren Kerne aufgeführt, die in Fig. 1 dargestellt sind, wobei die dazugehörigen Literaturstellen in Tabelle A aufgelistet sind. Diese können zur Bildung der vorliegenden Verbindungen verwendet werden, worin -OY für -OH am sauren Kern substituiert ist. Weitere Beispiele von Merocyanin-Farbstoffen sind in verschiedenen Übersichtsartikeln, Patenten und weiteren hierin zitierten Literaturstellen zu finden. Tabelle A Merocyanin-Farbstoff (basischer Kernsaurer Kern) Literaturstelle J. Chem. Soc. J. Org. Chem. J. Am. Chem. Soc. J. Gen. Chem. USSR Farmacia (Bukarest) J. Chem. Ed. Ann. Ukran. Khim. Zhur. Helv. Tabelle A (Fortsetzung) Merocyanin-Farbstoff (basischer Kernsaurer Kern) Literaturstelle J. Chem. Soc. Chem. Ber. Ann. Farmacia (Bukarest) J. Gen. Chem. USSR J. Am. Chem. Soc. Roczniki Chemii Ukran. Khim. Zhur. Helv. Tabelle A (Fortsetzung) Merocyanin-Farbstoff (basischer Kernsaurer Kern) Literaturstelle J. Am. Chem. Soc. Helv. Ann. J. Chem. Soc. Ukran. Khim. Zhur. Tabelle A (Fortsetzung) Merocyanin-Farbstoff (basischer Kernsaurer Kern) Literaturstelle Helv. J. Chem. Soc. J. Gen. Chem. (USSR) Farmacia (Bukarest) Ukran. Khim. Zhur. J. Am. Chem. Soc. Roczniki Chemii Tabelle A (Fortsetzung) Merocyanin-Farbstoff (basischer Kernsaurer Kern) Literaturstelle J. Gen. Chem. (USSR) Ukran. Khim. Zhur. Helv. J. Chem. Soc. J. Am. Chem. Soc.

Basische Kerne

Ein Fachmann auf dem Gebiet der Farbstoff-Synthese wird erkennen, daß eigentlich jeder bekannte basische Kern in die vorliegenden Verbindungen eingeführt werden kann. Der basische Kern wird grundsätzlich ein 5- oder 6-gliedriger N- haltiger heterocyclischer Ring oder ein kondensiertes Ringsystem aus 5- und/oder 6-gliedrigen heterocyclischen oder carbocyclischen Ringen sein. Demzufolge stellt B in Formel (A) einen geeigneten Rest dar, um einen solchen basischen Kern zu vervollständigen. Repräsentativ für geeignete nicht- metallische Gruppen von Atomen sind C, S, O, N und Se. Die 5- oder 6-gliedrigen heterocyclischen Ringe sind Ringe aus Kohlenstoffatomen und einem oder mehreren Heteroatomen, ausgewählt aus N, O, S oder Se, die durch Einfach- oder Doppelbindungen verbunden sind, welche durch die in Tabelle B gezeigten Kerne dargestellt sind. Die in Tabelle B gezeigten Kerne sind lediglich einige wenige Beispiele geeigneter Ringe und Ringsysteme für die basischen Kerne. Es ist offensichtlich, daß weitere Ringsysteme für diesen Zweck sowie verschiedene derivatisierte und substituierte Formen der dargestellten Kerne verwendet werden können.
Ein besonders bevorzugter basischer Kern weist Formel (E) auf:
worin Z eine disubstituierte Methylen-Gruppe, z.B. eine Di(niedrigalkyl)methylen-Gruppe, eine Vinylen-Gruppe, Alkyl- oder Aryl-substituiertes N, z.B. ein N-Atom, das mit einem Niedrigalkyl- oder Phenyl-Rest substituiert ist, O, S oder Se ist und R¹ die hierin bereits beschriebene Bedeutung hat, und worin die in der Formel dargestellte Phenyl-Gruppe substituiert oder unsubstituiert ist. Der basische Kern kann unsubstituiert sein oder Substituenten eines solchen Typs und in einer solchen Anzahl am gegebenen Kern aufweisen, daß sie die endgültigen angestrebten chromogenen Substrat- Eigenschaften im wesentlichen nicht stören. Als derartige Substituenten können Substituenten angesehen werden, die Alkyl-, insbesondere Niedrigalkyl-, Aryl-, insbesondere Phenyl- und substituierte Phenyl-, Alkoxy-, Aryloxy-, Halo-, Nitro- und Amino- oder substituierte Amino-, z.B. Dialkylamino-, Cyano-, Sulfo-, Carboxyl-, Carboxyalky-, Carboxamid- und Carboxamidoalkyl-Reste einschließen. Tabelle B (1) 5-gliedrige heterocyclische Ringe Alkyl Aryl (2) 6-gliedrige heterocyclische Ringe Tabelle B (Fortsetzung) (3) kondensiertes heterocyclisches 2-Ringsystem Alkyl Aryl Alkoxy Halo Cyano Aryloxy Carboxyalkyl Sulfoalkyl (4) kondensiertes heterocyclisches 3-Ringsystem Tabelle B (Fortsetzung) Aminoalkyl Alkyl Aryl Carboxyalkyl Sulfoalkyl
Repräsentative Beispiele basischer Kerne sind Thiazol, 4-Methylthiazol, 4-Phenylthiazol, 4,5-Dimethylthiazol, 4,5-Diphenylthiazol, Benzothiazol, 4-Chlorbenzothiazol, 5-Chlorbenzothiazol, 6-Chlorbenzothiazol, 7-Chlorbenzothiazol, 5-Nitrobenzothiazol, 6-Nitrobenzothiazol, 4-Methylbenzothiazol, 5-Methylbenzothiazol, 6-Methylbenzothiazol, 5-Brombenzothiazol, 6-Brombenzothiazol, 5-Jodbenzothiazol, 5-Phenylbenzothiazol, 5-Methoxybenzothiazol, 6-Methoxybenzothiazol, 5-Ethoxybenzothiazol, 5-Ethoxycarbonylbenzothiazol, 5-Phenethylbenzothiazol, 5-Fluorbenzothiazol, 5-Chlor-6-nitrobenzothiazol, 5-Trifluormethylbenzothiazol, 5,6-Dimethylbenzothiazol, Tetrahydrobenzothiazol, 4-Phenylbenzothiazol, 5-Phenylbenzothiazol, Naphtho(2,1-d)thiazol, Naphtho(1,2-d)thiazol, Naphtho(3,4-d)thiazol, 5-Methoxynaphtho(1,2-d)thiazol, 7-Ethoxynaphtho(2,1-d)thiazol, 8-Methoxynaphtho(2,1-d)thiazol, 5-Methoxynaphtho(3,4-d)thiazol, Oxazol, 4-Methyloxazol, 4-Nitrooxazol, 5-Methyloxazol, 4-Phenyloxazol, 4,5-Diphenyloxazol, 4-Ethyloxazol, Benzoxazol, 5-Chlorbenzoxazol, 5-Methylbenzoxazol, 5-Brombenzoxazol, 5-Fluorbenzoxazol, 5-Phenylbenzoxazol, 5-Methoxybenzoxazol, 5-Trifluormethylbenzoxazol, 5-Nitrobenzoxazol, 5-Methylbenzoxazol, 6-Chlorbenzoxazol, 6-Nitrobenzoxazol, 6-Methoxybenzoxazol, 6-Hydroxybenzoxazol, 5,6-Dimethylbenzoxazol, 4,6-Dimethylbenzoxazol, 5-Ethoxybenzoxazol, Naphtho(2,1-d)oxazol, Naphtho(1,2-d)oxazol, Naphtho(3,4-d)oxazol, 5-Nitronaphtho(3,2-d)oxazol, 4-Methylselenazol, 4-Nitroselenazol, 4-Phenylselenazol, Benzoselenazol, 5-Chlorbenzoselenazol, 5-Nitrobenzoselenanzol, 5-Methoxybenzoselenazol, 5-Hydroxybenzoselenazol, 6-Nitrobenzoselenazol, 5-Chlor-6-nitrobenzoselenazol, Naphto(2,1-d)selenazol, Naphto(1,2-d)selenazol, 3,3-Dialkylindolenin und Ring-substituierte 3,3- Dialkylindolenine, 1-Alkylimidazol, 1-Alkyl-4-phenylimidazol, 1-Alkylbenzimidazol, 1-Alkyl-5-methoxybenzimidazol, 1-Alkyl- 5-cyanobenzimidazol, 1-Alkyl-5-fluorbenzimidazol, 1-Alkyl-5- trifluormethylbenzimidazol, 1-Alkylnaphtho(1,2-d)imidazol, 1-Aryl-5,6-dichlorbenzimidazol, 1-Aryl-5-chlorbenzimidazol, 1-Arylimidazol, 1-Arylbenzimidazol, 1-Aryl-5- chlorbenzimidazol, 1-Aryl-5,6-dichlorbenzimidazol, 1-Aryl-5- methoxybenzimidazol, 1-Aryl-5-cyanobenzimidazol, 1-Arylnaphtho(1,2-d)imidazol, worin die Alkyl-Gruppe eine Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, 2-Hydroxyalkyl-, 3-Hydroxypropyl-Gruppe und dgl. und die Aryl-Gruppe eine Phenyl-, substituierte Phenyl-, Methyl- substituierte Phenyl- oder eine Methoxy-substituierte Phenyl- Gruppe sind. Beispiele der basischen Kerne schließen ferner 2-Pyridin-, 4-Pyridin-, 5-Methyl-2-pyridin-, 3-Methyl-4- pyridin- und Chinolin-Kerne (z.B. 2-Chinolin, 3-Methyl-2- chinolin, 5-Ethyl-2-chinolin, 6-Methyl-2-chinolin, 6-Methoxy- 2-chinolin, 8-Chlor-2-chinolin, 4-Chinolin, 6-Ethoxy-4- chinolin, 6-Nitro-4-chinolin, 8-Chlor-4-chinolin, 8-Fluor-4- chinolin, 8-Methyl-4-chinolin und 8-Methoxy-4-chinolin) ein.
Besonders bevorzugte basische Kerne sind die substituierten und unsubstituierten Formen von Indolenin, Naphthothiazol, Benzoxazol, Benzothiazol, Chinolin, Thiazol, Rhodanin, Benzoselenazol und Benzimidazol, insbesondere schließen diese 4-Methylthiazol, 4-Phenylthiazol, Benzothiazol, 5-Chlorbenzothiazol, 5-Methylbenzothiazol, 6-Methoxybenzothiazol, Naphtho(2,1-d)thiazol, Naphtho(1,2-d)thiazol, Benzoxazol, 5-Methylbenzoxazol, Benzoselenazol, 3,3-Dimethylindolenin, 4-Chinolin, 2-Chinolin, 6-Methoxy-2-chinolin und 4-Pyridin ein.
Die Substituenten R¹ am basischen Kern, wie in Formel (A) dargestellt, können ganz allgemein die oben definierten Alkyl- oder Aryl-Gruppen und vorzugsweise substituierte oder unsubstituierte Niedrigalkyl- oder Phenyl-Gruppen sein. Beispiele sind, ohne einschränkende Wirkung, Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Benzyl-, Phenyl-, β-Phenylethyl-, 1-Hydroxyethyl-, 2-Methoxyethyl-, 2-(2-Methoxyethoxy)ethyl-, Carboxymethyl-, 2-Carboxyethyl-, 3-Carboxypropyl-, 4-Carboxybutyl-, 2-Sulfoethyl-, 3-Sulfopropyl-, 3-Sulfobutyl-, 4-Sulfobutyl-, 2-(Pyrrolidin-2-on-1-yl)ethyl-, Tetrahydrofurfuryl-, 2-Acetoxyethyl-, Carbomethoxymethyl- und 2-Methansulfonylaminoethyl-Reste.
Wie in Formel (A) dargestellt und bei der Beschreibung kationischer basischer Kerne gemäß Fig. 1 angenommen, weisen die Merocyanin-Verbindungen ein entsprechendes Gegenion (Anion) X auf. Die Natur des Gegenions, sei es, daß die Verbindung der Formel (A) in einer ionisierten oder nicht- ionisierten Form vorliegt, sollte bei der vorliegenden Erfindung nicht kritisch sein, obwohl die Löslichkeit durch die Natur des Gegenions beeinflußt sein kann (siehe The Chemistry of Synthetic Dyes, Vol. 4, siehe oben, S. 294). Demnach kann ein solches Gegenion in einer großen Vielzahl von Formen vorliegen. Nur einige wenige der gewöhnlich vorkommenden Gegenionen (die mit dem Merocyanin aus der Reaktionsmischung, in welcher sie synthetisiert werden, oder aus den Lösungen komplexieren, worin sie gelöst sind) sind Chlorid, Bromid, Jodid, Tetrafluorborat, Trifluoracetat, Acetat, Sulfat, Tosylat, Phosphat und Perchlorat.

Saure Kerne

Der saure Kern wird ganz grundsätzlich ein substituiertes oder unsubstituiertes Naphthalin sein.
Besonders bevorzugte saure Kerne sind substituiertes oder unsubstituiertes 1,2-Naphthalin, 1,4-Naphthalin und 2,6-Naphthalin. Repräsentative Beispiele saurer Kerne sind 4-Hydroxy-1-naphthyl-, 2-Hydroxy-1-naphthyl-, 6-Hydroxy-2- naphthyl- und 5-Hydroxy-1-naphthyl-Kerne. Bevorzugte saure Kerne schließen 4-Hydroxy-1-naphthyl-, 2-Hydroxy-1-naphthyl-, 6-Hydroxy-2-naphthyl- und 5-Hydroxy-1-naphthyl-Kerne ein.
Die basischen und sauren Kerne sind, wie in Formel (A) dargestellt, durch eine Einfachbindung (m=0) oder durch konjugierte Vinylen-Gruppen (m=1-3) verbunden. Dimethinmerocyanine, worin m=1, sind am meisten üblich und bevorzugt. Die Geometrie dieser Doppelbindung ist gewöhnlich trans, aber die cis-Orientierung ist ebenfalls in Betracht gezogen. Im Falle von m=1, können die Brücken- Kohlenstoffatome substituiert sein oder nicht, beispielsweise können R² und R³ gleich oder verschieden und Wasserstoff, eine Niedrigalkyl- oder Cyano-Gruppe sein.
Eine besonders bevorzugte Klasse der Merocyanin- Enzymsubstrat-Verbindungen der vorliegenden Erfindung ist durch die Formel (F) dargestellt:
worin Y eine enzymatisch-spaltbare Gruppe ist, die wiederum der Rest einer Verbindung Y-OH ist, die aus Zuckern und Derivaten davon, aliphatischen und aromatischen Carboxylsäuren, Aminosäuren, Peptiden, Phosphor- und Schwefelsäure ausgewählt ist, und worin B eine Gruppe nicht- metallischer Atome oder einen entsprechenden Rest darstellt, der einen 5- oder 6-gliedrigen N-haltigen heterocyclischen Ring oder ein kondensiertes Ringsystem aus drei oder weniger 5- und/oder 6-gliedrigen heterocyclischen oder carbocyclischen Ringen vervollständigt, R¹ eine substituierte oder unsubstituierte Niedrigalkyl- oder Aryl-, z.B. eine Phenyl-Gruppe, Ar ein substituierter oder unsubstituierter Phenylen-, Naphthylen- oder Anthrylen-Rest, n eine ganze Zahl von 1 bis 3 und X ein Gegenion (Anion) sind. Am häufigsten wird Y-OH α-D-Galactose, β-D-Galctose, α-Glucose, β-Glucose, α-Mannose, N-Acetylglucosamin, N-Acetylneuraminsäure oder eine Oligosaccharid-Kette von ca. 2 bis 20 Monosaccharid- Einheiten, z.B. Maltopentose, Maltohexose und Maltoheptose, sein. In den Verbindungen der Formel (F) ist Ar vorzugsweise ein substituierter oder, häufiger, ein unsubstituierter 1,2- Naphthylen-, 1,4-Naphthylen- oder 2,6-Naphthylen-Rest, und B vervollständigt den Rest eines substituierten oder unsubstituierten Indolenium-, β-Naphthothiazolium-, Benzoxazolium-, Benzothiazolium-, Chinolium-, Thiazolium- oder Rhodaninium-Restes und weist noch bevorzugter die Formel (E) auf.
Verbindungen, die ganz besonders geeignet sind, weisen die Formel (G) auf:
worin Y ein Rest einer Verbindung Y-OH ist, die aus Zuckern oder Derivaten davon, insbesondere aus β-D-Galactose ausgewählt ist, und worin Ar der 1,4-Naphthylen- oder 2,6-Naphthylen-Rest, R¹ eine substituierte oder unsubstituierte Niedrigalkyl-, insbesondere die Ethyl- oder Methyl-Gruppe, Z ein Di(niedrigalkyl)methylen-, Vinylen-Rest, O, S oder Se sind, und worin der Phenyl-Ring substituiert oder unsubstituiert und X ein Gegenion (Anion) sind.

Synthese

Die Farbstoff-Synthese ist ganz allgemein in der Literatur als eine Reaktion vom Kondensations-Typ beschrieben worden, d.h. zwei Zwischenprodukt-Verbindungen reagieren unter geeigneten Bedingungen unter Eliminierung eines einfachen Moleküls. Diese allgemeine Beschreibung des Zusammenschlusses nukleophiler und elektrophiler Reagentien deckt die meisten Verfahren der nicht-oxidativen Farbstoff-Synthese ab. In typischer Weise ist das Nukleophil eine Methylen-Base, die aus einem quaternären Salz mit aktiver Methyl-Gruppe abgeleitet ist, und das Elektrophil ist eine Orthoester oder Aldehyd. Die Kupplung eines eine aktive Methyl-Gruppe aufweisenden quaternären Salzes (basischer Kern) mit einem aromatischen Aldehyd (saurer Kern) unter basischen Bedingungen ist ein bei der Herstellung von Merocyanin- Farbstoffen allgemeinen angewandtes Verfahren. Weitere Verfahren sind ebenfalls bekannt und in der hierin zitierten Literatur beschrieben.
Grundsätzlich kann man zuerst einen Merocyanin-Farbstoff mit einer verfügbaren Hydroxyl-Gruppe am sauren Kern herstellen, um ihn anschließend zur Bildung der enzymatisch spaltbaren Gruppe zu modifizieren. In der Praxis hat sich dies allerdings als im allgemeinen nicht erfolgreich erwiesen, indem der kondensierte Merocyanin-Farbstoff im wesentlichen unreaktiv ist, um an die enzymatisch spaltbare Gruppe gebunden zu werden. Dies wahrscheinlich deshalb, weil das Merocyanin in der ungeladenen oder neutralen tautomeren Form [siehe Formel (B)] unter den basischen Bedingungen vorliegt, die zur Kondensation mit der die enzymatisch spaltbare Gruppe aufweisenden Vorstufen-Verbindung erforderlich sind.
Demzufolge ist eine Zusammenschluß-Synthese ausgearbeitet worden, wobei der basische Kern mit einem sauren Kern kondensiert wird, welcher bereits modifiziert worden ist, um die enzymatisch spaltbare Gruppe aufzuweisen bzw. zu enthalten. Als erste Stufe der Synthese wird eine Klasse von Arylaldehyd-Zwischenprodukt-Verbindungen durch Reaktion eines Hydroxyl-funktionalsierten Arylaldehyds unter geeigneten Bedingungen gebildet, um die entsprechende enzymatisch spaltbare Gruppe einzuführen. Die sich ergebenden Verbindungen weisen die Formel (H) auf:
worin A, Y und p wie oben beschrieben definiert und R&sup4; Wasserstoff oder eine Niedrigalkyl-Gruppe sind. Insbesondere neu sind die Zwischenprodukt-Verbindungen der Formel (J):
OHC-Ar-O-Y (J)
worin Ar ein substituierte oder unsubstituierter Phenylen-, Naphthylen-, insbesondere ein 1,4-Phenylen-, 1,4-Naphthylen- oder 2,6-Naphthylen-Rest, ist.
Zur Herstellung der vorliegenden Substrat-Verbindungen werden diese Arylaldehyde mit einer in Salzform vorliegenden quaternären Derivat-Verbindung der Formel (K):
worin B, R¹, n und X wie oben beschrieben definiert und R&sup5; Wasserstoff, eine Niedrigalkyl- oder Cyano-Gruppe sind, unter geeigneten, im Stand der Technik bekannten basischen Bedingungen zur Reaktion gebracht. Im allgemeinen werden die Arylaldehyde der Formel (J) zuerst in einem geeigneten basischen Lösungsmittel, einer basischen Lösungsmittelmischung oder einem eine Base enthaltenden Lösungsmittel gelöst oder suspendiert, welche dazu befähigt sind, den Arylaldehyd mindestens teilweise zu lösen. Geeignete basische Lösungsmittel schließen Pyridin, Chinolin, Piperidin, Pyrrolidin, Hexamethylphosphoramid und Di- und Trialkylamine ein. Mischungen dieser basischen Lösungsmittel mit weiteren Lösungsmitteln, einschließlich Alkoholen wie Methanol und Ethanol, Ethern wie Tetrahydrofuran und Dioxan, Amiden wie Dimethylformamid und Dimethylacetamid, aromatischen Lösungsmitteln wie Toluol und Benzol, Haloalkanen wie Chloroform und Dichlormethan, Ketonen wie Aceton und Methylethylketon, sowie einschließlich Estern wie Ethylacetat, sind ebenfalls einsetzbar. Außerdem sind bestimmte Alkoxid-Basen wie Natriummethoxid, Natriumethoxid und Kalium-t-butoxid in alkoholischen Lösungsmitteln wie Methanol, Ethanol und t-Butanol günstig. Ein bevorzugtes Lösungsmittel ist Pyridin. Die Lösung oder Suspension des Arylaldehyds der Formel (J) wird dann, entweder auf einmal oder in Anteilen, über einen Zeitraum von 10 min bis 5 h, vorzugsweise von 0,25 bis 2,25 h, mit 0,5 bis 5,0, vorzugsweise mit 1,0 bis 1,5, Moläquivalenten des quaternären Salzes der Formel (K) behandelt. Die Reaktionsmischung wird bei einer Temperatur von 0 bis 150ºC, vorzugsweise 50 bis 100-ºC, über eine Zeitdauer von 1 min bis 36 h, vorzugsweise 5 bis 20 h, gehalten, dann werden das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und die Verbindung der Formel (E) gemäß im Stand der Technik bekannter Verfahren, wie der Chromatographie, gereinigt.
Die Herstellung der mit der enzymatisch abspaltbaren Gruppe modifizierten Arylaldehyde erfolgt in einer für die beteiligte abspaltbare Gruppe geeigneten Weise.
Glycoside des reaktiven sauren Kerns können gemäß Verfahren hergestellt werden, die auf dem Gebiet der Kohlenhydrat- Chemie bekannt sind, wobei bekannte Derivate von Kohlenhydraten der Formel Y-OH eingesetzt werden, die mit einem geeigneten sauren Kern zur Reaktion gebracht werden. Derartige Kohlenhydrat-Derivate, die in einigen Fällen Schutzgruppen aufweisen, sind im Handel erhältlich (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, USA; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) oder können gemäß im Stand der Technik bekannter Verfahren hergestellt werden (Methods in Carbohydrate Chemistry [Academic Press, 1963], Vol. 2). Glycosidische Reste, die sich zur Kupplung mit dem sauren Kern zur Bereitstellung geeigneter Glycoside der Formel (H) eignen, schließen, ohne darauf eingeschränkt zu sein, Reste von Zuckern wie von β-D-Galactopyranose, α-D-Galactopyranose, β-D-Glucopyranose, α-D-Glucopyranose, α-D-Mannopyranose, N- Acetylglucosamin, β-Glucuronsäure und Neuraminsäure ein. Weitere geeignete glycosidische Reste schließen Reste von Oligosaccharid-Ketten ein, welche durch Saccharid-Ketten spaltende Enzyme auf die Stufe eines Mono- oder Oligosaccharids gebrochen werden können, welche ihrerseits vom Farbstoff-Kern mit der entsprechenden Glycosidase direkt abgespalten werden können. Es sollte klar sein, daß derartige Oligosaccharid-Ketten Ketten aus 2 bis 20, vorzugsweise 2 bis 7, Monosaccharid-Einheiten, wie Maltopentose, Maltohexose oder Maltoheptose, sind. Der saure Kern wird mit einem Mono- oder Oligosaccharid oder einem 1-Halo-Derivat davon, in denen allen Hydroxyl-Gruppen mit einer Schutzgruppe gemäß auf dem Gebiet der Kohlenhydrat-Chemie bekannter Verfahren substituiert sind, zur Reaktion gebracht, um per-O- substituierte Glycoside zu ergeben, aus denen die Glycoside des sauren Kerns erhalten werden, indem man die Schutzgruppen gemäß einschlägig bekannter Verfahren abspaltet.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel (H), worin Y=H, werden mit den per-O-substituierten 1-Halosacchariden, vorzugsweise in der Gegenwart von Protonenakzeptoren wie von Alkalihydroxiden oder Alkalicarbonaten, in wäßrigem Aceton oder (unter Phasentransferbedingungen) in einer Mischung aus Wasser/Chloroform oder Wasser/Benzol zur Reaktion gebracht. Dieser Verfahrensvorgang kann ferner durchgeführt werden, indem man zuerst den sauren Kern mit Alkalihydroxid oder -alkoholat in Alkalisalze oder, unter Einsatz von möglichst substituierten Aminen, in Ammoniumsalze überführt und dann diese mit den per-O-substituierten 1-Halosacchariden in dipolaren aprotischen Lösungsmitteln wie Aceton, Dimethylsulfoxid, Dichlormethan, Tetrahydrofuran oder Dimethylformamid umsetzt. Ferner haben sich bei der Synthese von per-O-substituierten Glycosiden aus sauren Kernen und per-O-substituierten 1-Halosacchariden Additive in der Form einzelner Silbersalze oder von Mischungen aus Silbersalzen, wie von Silberoxid, Silbercarbonat, Silbercarbonat auf Celite (Johns-Manville Corp., Denver, CO, USA), Silbertriflat oder Silbersalicylat, und/oder in der Form einzelner Quecksilbersalze oder von Mischungen aus Quecksilbersalzen, wie von Quecksilberbromid, -cyanid, -acetat oder -oxid, und/oder einzelner Cadmiumsalze oder von Mischungen aus Cadmiumsalzen wie von Cadmiumcarbonat oder Cadmiumoxid, möglichst unter Mitverwendung von Trocknungsmitteln wie von Calciumchlorid, einem Molekularsieb oder von Drierite (W. A. Hammond Drierite Co., Xenia, OH, USA), in Lösungsmitteln wie Methylenchlorid, Chloroform, Benzol, Toluol, Ethylacetat, Chinolin, Tetrahydrofuran oder Dioxan als wirksam erwiesen. Bei der Synthese α-gebundener Glycoside wird ein saurer Kern der allgemeinen Formel (H), worin Y=H, mit einem Saccharid, dessen Hydroxy-Gruppen mit einer Schutzgruppe, vorzugsweise einer Acetyl-Gruppe, substituiert sind, in der Gegenwart einer Lewis-Säure, wie Zinkchlorid, verschmolzen (siehe Chem. Ber. 66, 378-383 [1933] und Methods in Carbohydrate Chemistry, Academic Press, 1967, Vol. 2, S. 345-347). Die Temperatur der Reaktion beträgt vorzugsweise 80 bis 130ºC, noch bevorzugter 110 bis 130ºC.
Die Entfernung der Schutzgruppen aus den per-O-substituierten Glycosiden zur Bildung der Glycoside der allgemeinen Formel (H) wird gemäß auf dem Gebiet der Kohlenhydrat-Chemie bekannter Verfahren durchgeführt (siehe Advances in Carbohydrate Chem. 12, 157 (1976)), wie bei Acyl- Schutzgruppen mit Natriummethylat, Bariummethylat oder mit Ammoniak in Methanol. Besonders geeignet als eine in der Kohlenhydrat-Chemie gewöhnlich verwendete Schutzgruppe ist ein Acetyl-, Benzoyl-, Benzyl- oder Trimethylsilyl-Rest.
Saure Kerne der allgemeinen Formel (H), worin Y der Rest einer Oligosaccharid-Kette aus ca. 2 bis 20 Monosaccharid- Einheiten ist, die über α-1,4-Glucosid-Bindungen gebunden sind, können außerdem aus den α- und β-Glucosiden durch ein enzymatisches Verfahren hergestellt werden, das zuerst beschrieben wurde von French et al., J. Am. Chem. Soc. 76, 2387 (1954) und später von Wallenfels et al., Carbohydrate Research 61, 359 (1978), wobei der Transfer des Glucosids auf eine vorgebildete Polysaccharid-Kette durch das Enzym (1-4)- α-Glucan-4-glucosyltransferase (auch bekannt als Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase; EC 2.4.1.19) als Reaktionsstufe enthalten ist.
Ester von Merocyanin-Farbstoffen der allgemeinen Formel (A) eignen sich als chromogene Esterase- und Protease-Substrate. Solche Ester können gemäß auf dem Gebiet der organischen Chemie bekannter Verfahren hergestellt werden, indem man zuerst bekannte Derivate von Carboxylsäuren mit einem geeigneten sauren Kern reagieren läßt, um ein reaktives elektrophiles Derivat eines sauren Kerns der Formel (H) zu ergeben, worin Y die Formel aufweist:
- -V
worin V ein Alkyl-, substituierter Alkyl- (insbesondere Aminoalkyl-) oder ein Aryl-Rest ist. Dieses Derivat wird dann mit einem eine aktive Methyl-Gruppe aufweisenden quaternären Salz der Formel (K) (basischer Kern) kondensiert, um chromogene Merocyanin-Enzymsubstrate zu ergeben.
Derartige bekannte Derivate von Carboxylsäuren der Formel Y-OH schließen, ohne darauf eingeschränkt zu sein, Aminosäure-Reste, vorzugsweise Reste von natürlich vorkommenden α-Aminosäuren in deren L- oder D-Form oder auch in deren racemischer Form, ein, wobei die Reste von Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin und Tyrosin bevorzugt und die L-Formen davon noch bevorzugter sind. Jede, möglicherweise vorhandene freie Hydroxyl-Gruppe kann acyliert und vorzugsweise acetyliert werden. Als Peptid-Reste in dieser Definition von Y-OH sollen beispielsweise Aminosäuren oder Peptide von ca. 2 bis 5 Aminosäure-Einheiten wie Di-, Tri-, Tetra- und Pentapeptide verstanden sein, wobei Di- und Tripeptide bevorzugt und die entsprechenden Aminosäure- Komponenten die oben genannten Aminosäuren sind. Ebenfalls sollte klar sein, daß die Amino-Gruppen dieser Aminosäuren oder Peptide mit Schutzgruppen für Stickstoffatome geschützt werden können, welche auf dem Gebiet der Peptid-Chemie bekannt sind (siehe T. W. Green, Protectiv Groups in Organic synthesis, J. Wiley and Sons, New York, NY, 1981, S. 218- 287), einschließlich von z.B. Acyl-, Oxycarbonyl-, Thiocarbonyl-, Sulfonyl-, besonders p-Toluolsulfonyl- (Tosyl-, Ts-), Sulfenyl-, Vinyl-, Cyclohexenyl- und Carbamoyl-, besonders t-Butyl-(BOC)- und Benzyl-(CBz)- Carbamoyl-Resten. Derartige Ester können auch in ähnlicher Weise hergestellt werden, indem man eine Verbindung der allgemeinen Formel (H), worin Y=H, mit einer Carboxylsäure, Aminosäure oder einem Peptid, wobei Y-OH wie oben definiert ist, oder mit einem geeigneten reaktiven Derivat davon umsetzt, wobei auf dem Gebiet der organischen Chemie bekannte Verfahren angewandt werden (siehe J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanism and Structure, McGraw-Hill Book Co., New York, NH, 1968, S. 319-323). Die eingesetzten reaktiven Derivate können beispielsweise Säurechloride oder -bromide oder gemischte Anhydride, die gewöhnlich in Peptid- Synthesen verwendet werden, wie bei denjenigen mit Ethylchlorformat, oder aktive Ester wie diejenigen von N- Hydroxysuccinimid sein.
Ganz ähnlich können anorganische Ester gemäß auf dem Gebiet der organischen Synthese bekannter Verfahren hergestellt werden. Die bekannten Derivate der anorganischen Säuren Y-OH, wie Phosphorsäure, z.B. Verbindungen, worin
Y =
oder Schwefelsäure, worin Y =
werden mit einer Verbindung der allgemeinen Formel (H), worin Y=H, zur Reaktion gebracht, wobei Verfahren angewandt werden, die auf dem Gebiet der organischen Chemie bekannt sind, wie dargelegt in Koller und Wolfbeis, Monatsh. 116, 65 (1985) für anorganische Ester bestimmter Coumarine.

Analytische Verfahren

Die chromogenen Enzymsubstrat-Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind in analytischen Testsystemen, in denen die Messung der darin vorliegenden Menge an Enzym erforderlich ist, und insbesondere in jenen analytischen Testsystemen verwendbar, in denen Enzym-markierte Assay-Reagentien zur Anwendung gelangen. Solche analytischen Testsysteme schließen, ohne darauf eingeschränkt zu sein, Enzym- Immunoassy-Verfahren, die auf dem einschlägigen Gebiet als konkurrierend bekannt sind, Sandwich- und immunometrische Verfahrensweisen ein, bei denen die Menge an Enzym- Markierungsmittel in einer besonderen Fraktion davon gemessen und mit der Menge an zu bestimmendem Analyt korreliert werden kann, die aus einer flüssigen Testprobe erhalten wird.
Die Anwendung spezifischer bindender Substanzen, wie von Antigenen, Haptenen, Antikörpern, Lektinen, Rezeptoren, Avidin und weiterer bindender Proteine, sowie von Polynukleotiden, welche mit einem Enzym markiert sind, ist vor nicht allzulanger Zeit entwickelt und auf die Messung von Substanzen in biologischen Flüssigkeiten angewandt worden (siehe z.B. Clin. Chem., Vol. 22, S. 1232 (1976); US Reissue Patent Nr. 31 006; und GB 2 019 308). Im allgemeinen hängt eine solche Messung von der Befähigung einer bindenden Substanz, z.B. eines Antikörpers oder Antigens, ab, an einen spezifischen Analyt gebunden zu werden, wobei ein markiertes Reagens, das eine solche mit einem Enzym markierte, bindende Substanz enthält, angewandt wird, um das Ausmaß einer solchen Bindung zu bestimmen. In typischer Weise wird das Ausmaß der Bindung ermittelt, indem man die Menge an Enzym-Markierung mißt, die im markierten Reagens vorhanden ist, welches entweder an der Bindungsreaktion mit dem Analyt teilgenommen hat oder nicht, wobei die Menge an nachgewiesenem und gemessenen Enzym zur Menge an in einer flüssigen Testprobe vorhandenem Analyt in Korrelation gebracht werden kann.
Die chromogenen Enzymsubstrat-Verbindungen der vorliegenden Erfindung eignen sich insbesondere für die oben beschriebenen analytischen Testsysteme, wobei eine analytische Testvorrichtung aus einer Trägermatrix, die mit der chromogenen Enzymsubstrat-Verbindung der vorliegenden Erfindung beaufschlagt ist, angewandt wird, und wobei die Natur des entsprechenden Enzym-spezifischen Einheitsrestes natürlich von dem besonderem Enzym abhängt, das nachgewiesen wird.
Das jeweilige Material einer solcher Trägermatrix kann aus jeder Substanz beschaffen sein, die dazu befähigt ist, mit der chromogenen Enzymsubstrat-Verbindung der vorliegenden Erfindung beaufschlagt zu werden, wie aus denjenigen Materialien, die für Reagenzstreifen für eine Analyse in Lösung eingesetzt werden. Beispielsweise ist in US 3 846 247 die Verwendung eines Filzes, poröser keramischer Streifen und von Geweben oder Matten aus Glasfasern beschrieben. Als Ersatz für Papier ist in US 3 552 928 die Verwendung von Holzstäben, Tuch-, Schwammaterial und tonartiger Substanzen beschrieben. Der Einsatz von Vliesstoffen aus synthetischem Harz und Filzmaterialien aus Glasfaser anstatt von Papier wird in GB 1 369 139 vorgeschlagen, und in GB 1 349 623 ist die technische Lehre enthalten, ein leicht-permeables Maschenwerk aus dünnen Filamenten als Bedeckung für eine Papiermatrix-Unterschicht zu verwenden. In dieser Literaturstelle ist auch die technische Lehre enthalten, das Papier teilweise mit einem Reagenzsystem und das Maschenwerk mit weiteren, möglicherweise unverträglichen Reagentien zu imprägnieren. In FP 2 170 397 ist die Verwendung von Trägermatrices mit darin enthaltenen Polyamid-Fasern von mehr als 50 % beschrieben. Eine weitere Ausführungsform von Trägermatrices ist in US 4 046 513 beschrieben, worin das Konzept angewandt ist, Reagentien auf eine geeignete Trägermatrix zu drucken. In US 4 046 514 ist beschrieben, Filamente als Web- oder Strickwaren heranzuziehen, welche die entsprechenden Reagentien in einem System von Reaktionsteilnehmern aufweisen. Alle derartigen Konzepte für eine Trägermatrix können in der vorliegenden Erfindung zur Anwendung gelangen, wie dies auch andere Konzepte können. Vorzugsweise umfaßt die Trägermatrix ein saugfähiges Material, wie Filterpapier, wobei eine Lösung der chromogenen Enzymsubstrat-Verbindung der vorliegenden Erfindung zum Imprägnieren der Matrix angewandt wird. Sie kann auch ein System umfassen, das die Assay-Reagentien physikalisch gefangen hält, wie polymere Mikrokapseln, die dann bei Kontakt mit der Testprobe brechen. Ebenfalls kann die Matrix ein System umfassen, worin die Assay-Reagentien homogen mit der Trägermatrix in einem fluiden oder halb-fluiden Zustand zusammengebracht sind, welcher später härtet oder sich verfestigt, wodurch die Assay-Reagentien gefangen gehalten bleiben.
In einer bevorzugten Ausgestaltungsform ist die Trägermatrix ein saugfähiges Material in der Form einer Zone oder Schicht, welche mit der chromogenen Enzymsubstrat-Verbindung der vorliegenden Erfindung beaufschlagt sind, wobei diese Ausführungsform angewandt wird, wenn ein besonderes Assay- Verfahren in flüssiger Umgebung durchgeführt wird, wobei ein unlösliches Assay-Reagens eingesetzt ist, das im Stand der Technik bekannt ist, um die freie Spezies des markierten Reagens von der gebundenen Spezies des markierten Reagens physikalisch abzutrennen. Gemäß einem solchen Assay-System wird ein Anteil einer Flüssigkeit, die die freie Spezies enthält, entnommen und auf die Trägermatrix gegeben, wobei die darin eingebrachte chromogene Enzymsubstrat-Verbindung mit der Enzym-Markierung des markierten Reagens der freien Spezies aus der flüssigen Testprobe in Wechselwirkung tritt, um ein nachweisbares Signal zu ergeben, das in Augenschein genommen und/oder mit einem geeigneten Gerät, wie mit einem Spektrophotometer, gemessen werden kann.
Ganz ähnlich kann eine Testvorrichtung aus zwei oder mehr Trägermatrices in der Form von z.B. einer oberen und einer unteren Schicht oder Zone angewandt werden. Die unterste Schicht einer solchen Testvorrichtung kann mit der chromogenen Enzymsubstrat-Verbindung der vorliegenden Erfindung beaufschlagt werden, wobei eine flüssige Testprobe, die den zu bestimmenden Analyt enthält, auf die oberste Schicht der Vorrichtung aufgebracht wird. Der eindiffundierende Analyt nimmt an den notwendigen Bindungsreaktionen teil, um eine freie und gebundene (d.h. immobilisierte) Spezies des darin enthaltenen Enzym- markierten Reagens zu erzeugen, wie oben bereits beschrieben. Demzufolge ist die so erzeugte bzw. vorliegende freie Spezies des markierten Reagans frei, in die unterste Schicht zu wandern, wo die Enzym-Markierung der freien Spezies die enzymatisch-spaltbare Gruppe der darin eingebrachten chromogenen Enzymsubstrat-Verbindung der vorliegenden Erfindung spaltet, um ein meßbares, nachweisbares Signal zu ergeben, wie vorher bereits beschrieben.
Die vorliegende Erfindung wird nun, ohne darauf eingeschränkt zu sein, durch die folgenden Beispiele noch weiter erläutert.

Beispiele

Die Synthese der in den unten angegebenen Beispielen beschriebenen Merocyanin-Substrate schließt zwei wichtigere Stufen ein. Unter Bezug auf Fig. 2 bis 5 der Zeichnungen ist die erste Stufe die Synthese des β-D- Galactopyranosyloxyarylaldehyds aus Tetra-Acetyl-geschützter Brom-α-D-galactose und dem entsprechenden Hydroxyarylaldehyd in der Gegenwart von Silber(I)oxid und Chinolin, worauf die Abspaltung der Hydroxyl-Gruppe durch alkalische Hydrolyse mit Natriummethoxid erfolgt. Die zweite Stufe ist die Kupplung des Substrat-modifizierten Arylaldehyds mit einem eine aktive Methyl-Gruppe aufweisenden quaternären Aminsalz, um die entsprechenden Merocyanin-Substrate zu ergeben.

A. Herstellung von Arylaldehyd-Zwischenprodukt-Verbindungen

4-(β-D-Glactopyranosyloxy)-1-naphthaldehyd (5)

Eine Lösung von 4-Hydroxynaphthaldehyd (2) (Trans World Chemical Co., Rockville, MD, USA) (4,304 g, 25 mMol) in wäßrigem 1,0 M NaOH (25 ml) wurde mit einer Lösung von Acetobrom-α-D-galactose (5,14 g, 12,5 mMol) in Aceton (100 ml) behandelt. Die Reaktionsmischung wurde bei Umgebungstemperatur 21,5 h lang gerührt, dann wurde das Aceton unter vermindertem Druck entfernt. Die entstandene dunkle Mischung wurde 4mal mit CHCl&sub3; (jeweils 40 ml) extrahiert, dann wurden die vereinigten CHCl&sub3;-Schichten 3mal mit wäßriger 1,0 M NaOH (jeweils 50 ml), 2mal mit H&sub2;O (jeweils 50 ml) und einmal mit Salzlösung (50 ml) gewaschen. Die CHCl&sub3;-Lösung wurde dann über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und im Vakuum zur Trockene eingedampft, um ein Rohprodukt als beigen Schaum (4,02 g) zu ergeben. 1 Kristallisation aus EtOAc/Hexan ergab 4-(Tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyloxy)- 1-naphthaldehyd (2,79 g, 44,4 %) als analytisch reine weiße Stäbe mit F. = 177 - 8ºC.
Analyse: für C&sub2;&sub5;H&sub2;&sub6;O&sub1;&sub1;:
C H
berechnet: 59,76 5,22
gefunden: 59,39 5,25
IR (KBr) cm&supmin;¹: 1740, 1682, 1600, 1572, 1510, 1368, 1220, 1060, 770.
¹H-NMR (DMSO-d&sub6;)δ: 2,00 (s, 3H); 2,03 (s, 3H); 2,05 (s, 3H); 2,18 (s, 3H); 4,20 (d, J=6 Hz, 2H); 4,65 (t, J=6 Hz, 1H); 5,48 (br. s, 3H); 5,90 (br. d, J=6 Hz, 1H); 7,37 (d, J=8 Hz, 2H); 7,55 - 7,90 (m, 2H); 8,00 - 8,35 (m, 2H); 9,12 - 9,35 (m, 1H); 10,28 (s, 1H).
¹³C-NMR (DMSO-d&sub6;)ppm: 192,68, 169,92, 169,79, 169,46, 156,72, 138,64, 131,23, 129,60, 126,94, 126,02, 124,66, 124,27, 121,47, 107,56, 97,61, 70,94, 69,90, 68,34, 67,24, 61,32, 20,29 (4 zusammenfallende Banden).
Eine Lösung von 4-(Tetra-O-acetyl)-β-D-galactopyranosyloxy)- 1-naphthaldehyd (1,67 g, 3,32 mMol) in Methanol von HPLC- Reinheit (40 ml) wurde in einem Bad von 60ºC erhitzt und mit Natriummethoxid (15 mg) behandelt. Innerhalb von 3 min hatte sich ein dicker weißer Feststoff abgeschieden. Nach 30 min wurde die Reaktion in Eis gekühlt, der Feststoff wurde abfiltriert, zweimal mit eiskaltem Methanol gewaschen und im Vakuum getrocknet, um (5) (1,08 g, 97 %) als einen analytisch reinen flusenartigen weißen Feststoff mit keinem Schmelzpunkt unterhalb 255ºC zu ergeben.
Analyse: für C&sub1;&sub7;H&sub1;&sub8;O&sub7;:
C H
berechnet: 61,07 5,43
gefunden: 61,10 5,50
IR (KBr) cm&supmin;¹: 3400, 1665, 1574, 1513, 1254, 1223, 1100, 768.
¹H-NMR (DMSO-d&sub6;)δ: 3,44 - 3,64 (m, 3H); 3,68 - 3,88 (m, 3H); 4,60 (d, J=4,6 Hz, 1H); 4,69 (t, J=5,5 Hz, 1H); 4,96 (d, J=5,7 Hz, 1H); 5,19 (d, J=7,7 Hz, 1H); 5,41 (d, J=5,4 Hz, 1H); 7,35 (d, J=8,2 Hz, 1H); 7,61 - 7,67 (m, 1H); 7,72 - 7,78 (m, 1H); 8,14 (d, J=8,2 Hz, 1H); 8,44 (d, J=7,8 Hz, 1H); 9,20 (d, J=8,1 Hz, 1H); 10,21 (s, 1H).
¹³C-NMR (DMSO-d&sub6;)ppm: 192,59, 158,09, 139,14, 131,17, 129,30, 126,25, 125,08, 125,03, 123,95, 122,68, 107,61, 101,00, 75,89, 73,16, 70,32, 68,17, 60,42.

6-(β-D-Galactopyranosyloxy)-2-naphthaldehyd (6)

Unter Argon wurden 6-Hydroxy-2-naphthaldehyd (3) [R. Gandhi, J. Chem. Soc., 2530 (1955)] (4,4 g, 25,6 mMol) in 100 ml Chinolin gelöst, um eine hellgelbe Lösung zu ergeben. Dann wurden Acetobrom-α-D-galactose (21,05 g, 51,2 mMol) und Silber(I)oxid (12,8 g, 55 mMol) zugegeben und die sich ergebende Reaktionsmischung bei Raumtemperatur im Dunklen 22 h lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde abfiltriert, der Filterkuchen wurde gründlich mit EtOAc gewaschen. Das dunkle rötlichbraune Filtrat wurde dann mit 1,25 N HCl gewaschen, bis die Waschflüssigkeit sehr sauer war. Die saure wäßrige Lösung wurde dann mit EtOAc extrahiert. Die EtOAc- Lösungen wurden vereinigt und mit 5%igen NaHCO&sub3;- und gesättigten NaCl-Lösungen gewaschen, über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet, abfiltriert und eingeengt, um ein braunes viskoses Material zu ergeben, das in CHCl&sub3; gelöst und mit 500 ml Kieselgel unter Eluierung mit CH&sub2;Cl&sub2;/CH&sub3;OH (10/0,1, V/V) blitzchromatographiert wurde, um ca. 13 g 6-(Tetra-O- acetyl-β-D-galactopyranosyloxy)-2-naphthaldehyd als einen weißlichen Feststoff zu ergeben.
Unter Argon wurde der oben erhaltene 6-(Tetra-O-acetyl-β-D- galactopyranosyloxy)-2-naphthaldehyd (12,8 g, 25,5 mMol) in 100 ml Methanol gelöst, und es wurde Natriummethoxid (1 g, 18,5 mMol) zugefügt. Die entstandene Reaktionsmischung wurde in einem Ölbad von 60ºC 1/2 h lang erhitzt. Man ließ die Reaktionsmischung auf 60 ml Kieselgel aufziehen und zur Adsorption gelangen, wodurch aufkonzentriert wurde, dann wurde das ganze mit 800 ml Kieselgel unter Eluierung mit CH&sub2;Cl&sub2;/CH&sub3;OH (8,5/1,5, V/V) blitzchromatographiert, um einen weißlichen Feststoff zu ergeben.
Umkristallisation aus absolutem Ethanol ergab 6,7 g (78,8 %) eines weißen Feststoffs (6) mit F. = 193ºC (Zersetzung).
Analyse: für C&sub1;&sub7;H&sub1;&sub8;O&sub7; 1/10H&sub2;O:
C H
berechnet: 60,75 5,46
gefunden: 60,60 5,63
IR (KBr) cm&supmin;¹: 3403, 1681, 1624, 1477, 1267, 1182, 1071, 781.
¹H-NMR (DMSO-d&sub6;)δ: 3,42 - 3,59 (m, 3H); 3,61 - 3,78 (m, 3H); 4,55 (d, J=5, 1H); 4,68 (t, J=5, 1H); 4,90 (d, J=5, 1H); 7,38 (dd, J=9, J=2, 1H); 7,57 (d, J=2, 1H); 7,85 (d, J=8,6, 1H); 7,92 (d, J=8,6, 1H); 8,11 (d, J=9, 1H); 8,51 (s, 1H); 10,09 (s, 1H).
¹³C-NMR (DMSO-d&sub6;)ppm: 60,39, 68,16, 70,31, 73,37, 75,69, 100,91, 110,61, 119,90, 122,92, 127,91, 128,03, 131,20, 132,34, 134,18, 137,41, 157,84, 192,45.

B. Herstellung von Substrat-Verbindungen durch (kondensierende) Zusammenschluß-Synthese

1-Ethyl-2-(4'-β-D-galactopyranosyloxynaphthyl-1-vinylen)-3,3- dimethylindoliniumjodid (17)

Eine gerührte Mischung von 4-(β-D-Galactopyranosyloxy)-1- naphthaldehyd (5) (5,95 g; 17,8 mMol) und Molekularsieb 4 Å (15 g) in wasserfreiem Pyridin (105 ml) wurde bei 65 bis 68ºC unter einer Inertgasatmosphäre gehalten. Das ganze wurde alle 45 min 2,25 h lang mit Anteilen von 1,68 g 2,3,3- Trimethylindoleniumethjodid (7) (H. Richter & R. L. Dresser, siehe oben) (6,72 g insgesamt; 23,1 mMol) behandelt, danach wurde noch 2 h lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde abgekühlt, filtriert und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde an Kieselgel (475 g) unter Eluierung mit Dichlormethan/Methanol (85:15, V/V) chromatographiert, und die Fraktionen, die (17) enthielten, wurden zusammengefaßt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Das Rohprodukt wurde bei Umgebungstemperatur in Methanol (100 ml) gelöst, mit Ethylacetat (700 ml) verdünnt und über Nacht bei 0ºC gekühlt. Der abgeschiedene Feststoff wurde durch Filtration gesammelt, mit Ethylacetat gewaschen und im Vakuum getrocknet, um (17) (3,15 g) zu ergeben. 1 Umkristallisation, wie oben, aus Methanol (75 ml) und Ethylacetat (600 ml) ergab analytisch reines (17) (2,65 g; 24 %) als einen roten Feststoff mit F. = 165ºC (Zersetzung).
IR (KBr) cm&supmin;¹: 3320, 1562, 1509, 1268, 1225, 1078, 762.
¹H-NMR (DMF-d&sub7;)δ: 1,62 (t, J=7, 3H); 2,00 (s, 6H); 3,47 (v br. s, 4H); 3,56 - 3,84 (m, 3H); 3,87 - 4,12 (m, 3H); 4,98 (q, J=7, 2H); 5,37 (d, J=7,7, 1H); 7,52 (d, J=8,5, 1H); 7,71 (m, 3H); 7,84 (t, J=7Hz, 1H); 7,95 - 8,12 (m, 3H); 8,56 (t, J=7, 2H); 8,75 (d, J=8,5, 1H); 9,21 (d, J=16, 1H).
¹³C-NMR (DMF-d&sub7;)ppm: 13,99, 26,73, 43,18, 53,14, 61,59, 69,23, 71,67, 74,54, 77,03, 102,17, 109,80, 112,76, 115,64, 123,45, 123,76, 123,96, 125,07, 126,81, 129,47, 129,86, 129,91, 131,26, 133,62, 141,48, 144,66, 150,10, 159,37, 181,8.
MS (FAB, Glycerin/Methanol) m/z (rel int): 504 (M&spplus;, 4,5 %), 342 (M-162, 100 %), 127 (J&spplus;, 95 %).
Analyse: für C&sub3;&sub0;H&sub3;&sub4;JNO&sub6; H&sub2;O:
C H N
berechnet: 55,47 5,59 2,16
gefunden: 55,31 5,55 2,02

1-Ethyl-2-(6'-β-D-galactopyranosyloxynaphthyl-2'-vinylen)- 3,3-dimethylindoleniumjodid (18)

Unter Argon wurde eine Mischung aus 6-(β-D- Galactopyranosyloxy)-2-naphthaldehyd (6) (2,23 g, 6,7 mMol), aus 2,3,3-Trimethylindoleninethjodid (7) (H. Richter & R. L. Dresser, siehe oben) (2,1 g, 6,7 mMol) und 40 ml wasserfreiem Pyridin in einem Ölbad von 70ºC 21 h lang erhitzt. Dann wurde das Pyridin unter verminderten Druck verdampft, um einen viskosen dunkelrötlich braunen Rückstand zu ergeben, der in CH&sub2;Cl&sub2;/CH&sub3;OH (9/1 , V/V) gelöst und mit 450 ml Kieselgel blitzchromatographiert und mit CH&sub2;Cl&sub2;/CH&sub3;OH (9/1, V/V) eluiert wurde, um 2 g (48 %) Substrat (18) als roten Feststoff zu ergeben. F. = 177ºC (Zersetzung).
IR (KBr) cm&supmin;¹: 3400, 1587, 1470, 1310, 1189, 1072, 760.
¹H-NMR (DMSO-d&sub6;)δ: 1,48 (t, J=5, 3H); 1,85 (s, 6H); 3,43 - 3,59 (m, 3H); 3,61 - 3,77 (m, 3H); 4,57 (d, J=4,5, 1H); 4,69 (t, J=5,5, 1H); 4,76 (q, J=7, 2H); 4,92 (d, J=5,7, 1H); 5,08 (d, J=7,7, 1H); 5,26 (d, J=5,1, 1H); 7,38 (dd, J=9, J=2,4, 1H); 7,58 (d, J=2,2, 1H); 7,64 (m, 2H); 7,76 (d, J=16, 1H); 7,89 - 8,03 (m, 4H); 8,37 (dd, J=9, J=1,4, 1H); 8,61 (d, J=16, 1H); 8,73 (s, 1H).
¹³C-NMR (DMSO-d&sub6;)ppm: 13,35, 25,49, 42,00, 52,09, 60,30, 68,02, 70,24, 73,27, 75,57, 100,93, 110,84, 111,29, 114,77, 119,85, 122,76, 124,68, 127,71, 128,37, 128,86, 129,12, 130,12, 130,79, 134,04, 136,57, 140,15, 143,64, 154,04, 157,85, 181,33.
MS(FAB, Glycerin).
m/z (rel int): 504 (M&spplus;, 10 %); 342 (M-162, 45 %).
MS (EI) m/z: 127 (J&spplus;, 90 %).

3-Ethyl-2-(4'-β-D-glactopyranosyloxynaphthyl-1'- vinylen)benzothiazoliumjodid (20)

Annähernd gleiche Mengen von 4-(β-D-Galactopyranosyloxy)-1- naphthaldehyd (5) und 2-Methylbenzothiazolethjodid (8) (H. Richter & R. L. Dresser, siehe oben) wurden am Rückfluß 1 min lang in Ethanol erhitzt, das eine kleine Menge Piperidin enthielt. Die anfänglich farblose Mischung wurde mit der Zeit rot-orange. Das Vorhandensein von (20) in der Reaktionsmischung wurde ermittelt, indem man einen Anteil der Reaktionsmischung mit einer gleichen Menge Dimethylformamid vermischte, dies mit 0,1 M Phosphat-Puffer eines pH von 7,0 verdünnte und dann die entstandene Lösung mit β-Galactosidase behandelte. Als das Enzym zugefügt wurde, veränderte sich die Farbe der Lösung von Gelb nach Violett.

3-Ethyl-2-(4'-β-D-glactopyranosyloxynaphthyl-1'-vinylen)-6- methoxybenzothiazoliumjodid (21)

Unter Argon wurden 6-Methoxy-2-methylbenzothiazol (5 g, 27,9 mMol, Aldrich Chemical Company, Inc., Milwaukee, WI, USA) und Ethyljodid (5,4 ml, 67 mMol, Aldrich Chemical Company, Inc., Milwaukee, WI, USA) vermischt und in einem Ölbad von 60ºC ca. 20 h lang erhitzt. Der abgeschiedene Feststoff wurde abfiltriert, gründlich mit Aceton gewaschen und getrocknet, um einen weißen Feststoff von 6-Methoxy-2- methylbenzothiazolethjodid (9) (2 g, 21 %) zu ergeben, F. = 180 - 182ºC.
IR (KBr) cm&supmin;¹: 2968, 1601, 1481, 1443, 1251, 1048, 853, 814.
¹H-NMR (DMSO-d&sub6;)δ: 1,50 (t, J=7Hz, 3H); 3,25 (s, 3H); 3,95 (s, 3H); 4,80 (q, J=7 Hz, 2H); 7,40 - 8,50 (m, 3H).
MS (FAB, Glycerin/Methanol)
m/z (rel int): 308 (M&spplus;, 100 %).
Analyse: für C&sub1;&sub1;H&sub1;&sub4;JNOS:
C H N
berechnet: 39,42 4,21 4,18
gefunden: 39,62 4,21 4,34
Unter Argon wurde eine Mischung von 4-(β-D- Galactopyranosyloxy)naphthaldehyd (5) (0,5 g, 1,5 mMol), von 6-Methoxy-2-methylbenzothiazolethjodid (9) (0,75 g, 2,3 mMol) und 10 ml wasserfreiem Pyridin auf einem Ölbad von 65ºC erhitzt. Es schied sich ein oranger Feststoff nach und nach aus der Reaktionsmischung ab. Nach 5-stündiger Reaktion wurde die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur abgekühlt und filtriert, und es wurde der Feststoff mit Pyridin, CHCl&sub3; und CH&sub3;OH gewaschen, um einen hellorangen Feststoff zu ergeben. Nach Trocknung unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur über Nacht ergaben sich 0,5 g (50 %) Substrat (21), F. = 229ºC (Zersetzung).
Analyse: für C&sub2;&sub8;H&sub3;&sub0;JNO&sub7;S:
C H N
berechnet: 51,62 4,64 2,15
gefunden: 51,38 4,53 2,30
IR (KBr) cm&supmin;¹: 3380, 1603, 1566, 1253, 1227, 1079, 770.
¹H-NMR (DMSO-d&sub6;)δ: 1,48 (t, J=7, 3H); 3,48 - 3,64 (m, 3H); 3,71 - 3,87 (m, 3H); 3,95 (s, 3H); 4,62 (d, J=5, 1H); 4,70 (t, J=5, 1H); 4,88 - 5,02 (m, 3H); 5,18 (d, J=7,6, 1H); 5,44 (d, J=5, 1H); 7,37 (d, J=8,5, 1H); 7,46 (dd, J=7,1, J=2,2, 1H); 7,65 (t, J=7,6, 1H); 7,76 (t, J=7,0, 1H); 8,02 (m, 2H); 8,21 (d, J=9,3, 1H); 8,47 (m, 3H); 8,78 (d, J=15,5, 1H).
¹³C-NMR (DMSO-d&sub6;)ppm: 13,36, 43,68, 55,51, 59,68, 67,38, 69,48, 72,30, 75,11, 100,26, 105,95, 107,97, 112,01, 116,63, 117,75, 122,11, 123,04, 124,15, 125,08, 127,30, 128,12, 129,26, 131,19, 134,09, 142,77, 156,29, 158,51, 167,59.
MS (FAB), Glycerin/Methanol/HCl) m/z (rel int): 362-(M-162, 12 %)
MS(EI) m/z (rel int): 127 (J&spplus;, 100 %).

2-(4'-β-D-Galactopyranosyloxynaphthyl-1'-vinylen)-3-methyl-β- naphthothiazoliumjodid (22)

Unter Argon wurde eine Mischung von 4-(β-D- Galactopyranosyloxy)naphthaldehyd (5) (0,50 g, 1,5 mMol), von 2-Methyl-β-naphthothiazolmethjodid (10) (H. Richter & R. L. Dresser, siehe oben) (0,61 g, 1,8 mMol), 20 ml wasserfreiem Pyridin und 10 ml wasserfreiem DMF in einem Ölbad von 65ºC 5 h erhitzt, um eine dunkelbräunlich rote Mischung zu ergeben. Dünnschichtchromatographie (TLC) zeigte das Vorliegen großer Mengen von Aldehyd-Ausgangsmaterial an. Eine weitere Teilmenge von 2-Methyl-β-D-naphthothiazolmethjodid (10) (0,61 g, 1,8 mMol) wurde der Reaktionsmischung zugefügt. Nach weiteren 2 h Reaktionszeit wurde die Reaktionsmischung filtriert und es wurde Pyridin und DMF unter verminderten Druck verdampft. Es wurde ca. 1 ml einer Lösung KJ in Methanol (1 g KJ/8 ml Methanol) dem Rückstand zugefügt, dann wurde die Mischung an 10 ml Kieselgel adsorbiert, wobei das Methanol unter vermindertem Druck verdampft wurde. Blitzchromatographie mit 200 ml Kieselgel und Eluierung mit CH&sub2;Cl&sub2;/CH&sub3;OH (8,5/1,5, V/V) und anschließende Umkristallisation aus CH&sub3;OH/Et&sub2;O ergaben 27 mg (3 %) Substrat (22) als roten Feststoff, F. = 160ºC.
IR (KBr) cm&supmin;¹: 3440, 1620, 1564, 1230, 1076, 775.
¹H-NMR (DMSO-d&sub6;)δ: 3,40 - 3,68 (m, 3H); 3,72 - 3,90 (m, 3H); 4,63 (d, J=5, 1H); 4,72 (t, J=5, 1H); 4,82 (s, 3H); 4,98 (d, J=5, 1H); 5,19 (d, J=7,7, 1H); 5,44 (d, J=5, 1H); 7,38 (d, J=8,6, 1H); 7,64 (m, 1H); 7,76 (m, 1H); 7,89 (m, 2H); 8,15 (m, 1H); 8,33 (d, J=9, 2H); 8,43 (m, 2H); 8,52 (d, J=8,6, 2H); 8,83 (d, J=15, 1H); 9,00 (d, J=7,7, 1H).
¹³C-NMR (DMSO-d&sub6;)ppm: 42,0, 60,36, 68,18, 70,37, 73,16, 75,87, 100,91, 107,57, 108,85, 113,79, 119,63, 122,75, 122,93, 124,04, 124,95, 125,91, 127,85, 128,09, 128,52, 128,73, 129,92, 131,13, 132,08, 133,58, 137,85, 139,28, 143,15, 145,41, 156,53, 170,15.

3-Ethyl-2-(4'-β-D-galactopyranosyloxynaphthyl-1'-vinylen)-5- methylbenzothiazoliumjodid (23)

Unter Argon wurden 2,5-Dimethylbenzothiazol (10 g, 61 mMol, Aldrich Chemical Company, Inc., Milwaukee, WI) und Ethyljodid (9,8 ml, 123 mMol, Aldrich Chemical Company, Inc., Milwaukee, WI) vermischt und in einem Ölbad von 65ºC ca. 23 h lang erhitzt. Der abgeschiedene Feststoff wurde abfiltriert, gründlich mit Aceton gewaschen, aus absolutem Ethanol umkristallisiert und getrocknet, um einen weißen Feststoff von 2,5-Dimethylbenzothiazolethjodid (11) (3 g, 15,4 %) mit F. = 202 - 3ºC zu ergeben.
Analyse: für C&sub1;&sub1;H&sub1;&sub4;JNS::
C H N
berechnet: 41,39 4,42 4,39
gefunden: 41,71 4,44 4,50
Eine Mischung von 4-(β-D-Galactopyranosyloxy)naphthaldehyd (5) (0,33 g, 1 mMol), von 2,5-Dimethylbenzothiazolethjodid (11) (0,38 g, 1,2 mMol), 3 ml Pyridin und einer geringen Menge an Molekularsieben wurde in einem Ölbad von 120ºC in einem geschlossenen Kolben 7 min lang erhitzt. Dann wurde die Reaktionsmischung abgekühlt, und es wurden 30 ml Aceton zugefügt. Der rote abgeschiedene Feststoff wurde abfiltriert und mit Aceton gewaschen. Der Feststoff wurde dann in Pyridin gelöst und an einer Kieselgel-Säule unter Eluierung mit CH&sub2;Cl&sub2;/CH&sub3;OH (3/7, V/V) gereinigt, um 0,2 g Substrat (23) als roten Feststoff mit F. = 160ºC (Zersetzung) zu ergeben.
MS (FAB, Diethiothreitol/Dithioerythrit/Methanol) m/z: 508 (M&spplus;, 2,3 %), 346 (M-162, 30,1 %).

3-Ethyl-2-(6'-β-D-galactopyranosyloxynaphthyl-2- vinylen)benzoselnazoliumjodid (24)

Eine Mischung von 6-(β-D-Galactopyranosyloxy)-2-naphthaldehyd (6) (34 mg, 0,1 mMol), von 2-Methylbenzoselenazolethjodid (12) (H. Richter & R. L. Dresser, siehe oben) (35 mg, 0,1 mMol) und von 0,5 ml wasserfreiem Pyridin wurde in einem Ölbad von 70ºC 20 h lang erhitzt. TLC-Analyse mit dem Lösungsmittel-Gemisch CH&sub2;Cl&sub2;/CH&sub3;OH (8,5/1,5, V/V) zeigte das Vorliegen eines gelben Produktflecks, der mit 0,3 M Bicen- Puffer (pH = 7,9) extrahiert wurde. Auf Zugabe von Galactosidase und einem Tropfen 1 N NaOH färbte sich die Lösung sofort purpurfarben.

3-(2"-Carboxyethyl)-2-(4'-β-D-galactopyranosyloxynaphthyl-1'- vinylen)-5-methylbenzoxazoliumbromid (25)

Unter Argon wurde eine Mischung von 4-(β-D- Galactopyranosyloxy)naphthaldehyd (5) (0,5 g, 1,5 mMol), von 3-(2'-Carboxyethyl)-2,5-dimethylbenzoxazoliumbromid (13) (Aldrich Chemical Company, Inc.) (1,35 g, 4,5 mMol) und von 10 ml wasserfreiem Pyridin in einem Ölbad von 65ºC 3 1/2 h lang erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde dann auf Raumtemperatur abgekühlt und an 80 ml Kieselgel unter Eluierung mit CH&sub2;Cl&sub2;/CH&sub3;OH (8,5/1,5, V/V) blitzchromatographiert, um 240 mg (30 %) Substrat (25) als roten Feststoff mit F. = 150ºC (Zersetzung) zu ergeben.
IR (KBr) cm&supmin;¹: 3219, 1730, 1606, 1567, 1512, 1270, 1224, 1077, 770.
¹³C-NMR (DMSO-d&sub6;)δ: 20,0, 32,5, 44,07, 60,41, 68,16, 70,41, 73,26, 75,73, 101,49, 108,87, 116,50, 122,80, 124,02, 125,27, 125,49, 127,24, 127,73, 128,14, 129,77, 131,58, 136,79, 137,21, 139,38, 142,06, 145,21, 151,07, 154,20, 165,20, 172,04.
MS (FAB, Glycerin/Methanol/HCl) m/z (rel int): 536 (M&spplus;, 4 %), 374 (M-162, 20 %).

1-Ethyl-2-(4'-β-D-galactopyranosyloxynaphthyl-1'- vinylen)chinoliniumjodid (26)

Eine Mischung von 4-(β-D-Galactopyranosyloxy)naphthaldehyd (5) (0,33 g, 1 mMol), von Chinaldinethjodid (14) (H. Richter & R. L. Dresser, siehe oben) (0,30 g, 1 mMol), von einer geringen Menge Molekularsieb (4 Å, 8 - 12 Mesh) und von 5 ml wasserfreiem Pyridin in einem zugestopften Kolben mit rundem Boden wurde in einem Ölbad von 120ºC 15 min lang erhitzt.
Dünnschichtchromatographie zeigte das Vorhandensein großer Mengen von Aldehyd-Ausgangsmaterial. Eine weitere Teilmenge von Chinaldinethjodid (0,1 g, 0,3 mMol) wurde zugefügt, und es wurde die sich ergebende Reaktionsmischung weitere 10 min lang erhitzt, um eine dunkle, viskose Mischung zu ergeben. Dann wurde die Reaktionsmischung abgekühlt, es wurde Aceton zugefügt und die sich ergebende Aufschlämmung filtriert. Es wurde mit einer großen Menge Aceton gewaschen, um einen hellorangenen Feststoff zu ergeben. Das orangefarbene Rohprodukt wurde in warmem DMSO gelöst und dann an 90 ml Kieselgel unter Eluieren mit CH&sub2;Cl&sub2;/CH&sub3;OH (9/1, V/V) blitzchromatographiert. Ein orangefarbener Feststoff kristallisierte aus der das Produkt enthaltenden Fraktion aus und wurde abfiltriert und unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur über Nacht getrocknet, um 26 mg (4 %) Substrat (26) als hellorangefarbenen Feststoff mit F. = 236 - 237ºC (Zersetzung) zu ergeben.
IR (KBr) cm&supmin;¹: 3367, 1603, 1568, 1339, 1219, 1076, 760.
¹H-NMR (DMSO-d&sub6;)δ: 1,60 (t, J=7, 3H); 3,46 - 3,67 (m, 3H); 3,70 - 3,90 (m, 3H); 4,62 (d, J=4,5, 1H); 4,71 (t, J=5,1, 1H); 4,97 (d, J=5,6, 1H); 5,17 (m, 3H); 5,43 (d, J=5,2, 1H); 7,37 (d, J=8,5, 1H); 7,63 (t, J=7,5, 1H); 7,73 (t, J=7,5, 1H); 7,86 (d, J=15,5, 1H); 7,94 (t, J=7,3, 1H); 8,19 (t, J=7,8, 1H); 8,33 - 8,51 (m, 3H); 8,57 (d, J=9,0, 1H); 8,63 (d, J=8,6, 1H), 8,90 (d, J=9,0, 1H); 9,00 (d, J=15,2, 1H); 9,06 (d, J=9, 1H).
¹³C-NMR (DMSO-d&sub6;)ppm: 12,51, 47,15, 61,91, 70,12, 72,37, 75,36, 78,32, 105,22, 113,35, 123,40, 124,04, 127,10, 128,30, 128,86, 130,49, 130,63, 131,52, 133,60, 133,79, 133,87, 134,68, 136,26, 138,33, 141,25, 144,45, 150,34, 150,70, 162,70, 163,71.
MS (FAB, Dithiothrietol/Dithioerythrit-/Methanol) m/z 488 (M&spplus;, 7,7 %); 326 (M-162, 100 %) (rel int): MS (EI) m/z (rel int): 127 (J&spplus;, 30 %).

1-Ethyl-2-(4'-β-D-galactopyranosyloxynaphthyl-1'-vinylen)-6- methoxychinoliniumjodid (27)

Unter Argon wurden 6-Methoxychinaldin (10 g, 58 mMol, Aldrich Chemical Company, Inc., Milwaukee, WI, USA) und Ethyljodid (9,3 ml, 116 mMol) vermischt und in einem Ölbad von 65ºC ca. 20 h lang erhitzt. Aceton wurde der Reaktionsmischung zugefügt. Der Feststoff wurde abfiltriert, gründlich mit Aceton gewaschen, aus absolutem Ethanol umkristallisiert und getrocknet, um einen hellgelben Feststoff aus 6- Methoxychinaldinethjodid (15) (4,2 g, 22 %) zu ergeben.
Eine Mischung von 4-(β-D-Galactopyranosyloxy)naphthaldehyd (5) (0,3 g, 0,9 mMol) von 6-Methoxychinaldinethjodid (15) (0,36 g, 1,1 mMol), einer geringen Menge Molekularsieb (3 Å, 8 bis 12 Mesh) und von 2 ml wasserfreiem Pyridin wurde in einem Ölbad von 120ºC 10 min erhitzt. DMSO wurde zugefügt, dann wurde die sich ergebende Reaktionsmischung an 90 ml Kieselgel unter Eluieren mit CH&sub2;Cl&sub2;/CH&sub3;OH (8/2, V/V) blitzchromatographiert, um 26 mg eines roten Feststoffs des Substrats (27) (6 %) zu ergeben.
MS (FAB, Dithiothreitol/Dithioerythrit/Methanol) m/z: 518 (M&spplus;, 7,1 %); 356 (M&spplus;-162, 48,9 %).

1-Ethyl-4-(4'-β-D-galactopyranosyloxynaphthyl-1'- vinylen)chinoliniumjodid (29)

Eine Mischung von 4-(β-D-Galactopyranosyloxy)naphthaldehyd (5) (34 mg, 0,1 mMol), von Lepidinethjodid (28) (H. Richter & R. L. Dresser, siehe oben) (30 mg, 0,1 mMol) und von 0,5 ml wasserfreiem Pyridin wurde in einem Ölbad von 70ºC 3 h lang erhitzt. Dann wurden weitere 60 mg Lepidinethjodid (28) zugefügt, man ließ die Reaktionsmischung im Ölbad von 70ºC über eine Gesamtdauer von 20 h reagieren. TLC-Analyse mit dem Lösungsmittelgemisch CH&sub2;Cl&sub2;/CH&sub3;OH (8/2, V/V) zeigte das Vorliegen eines gelben Produktflecks, der mit 50 mM Phosphat- Puffer (pH = 7,4) extrahiert wurde. Auf Zugabe von Galactosidase verfärbte sich die gelbe Lösung innerhalb von 5 Sekunden blau.

C. Untersuchung der chromogenen Substrat-Eigenschaften

Die Eigenschaften einiger Verbindungen wurden untersucht, sie sind in Tabelle D angegeben.

D. Teststreifen

Die Substrate wurde mit einer angegebenen Konzentration in 0,3 M Bicen-Puffer, pH = 7,9, und 4 mM MgCl&sub2; auf Whatman 54 Papier (Whatman Inc., Clifton, NJ, USA) imprägniert und dann 1 h lang bei Raumtemperatur an der Luft getrocknet. Eine 0,5 x 1,0 cm Unterlage des Papiers wurde dann auf das Ende eines 0,5 x 8,125 cm Polystyrol-Streifens (Tricite , Dow Chemical Co., Midland, MI, USA) aufgebracht, welcher vorher mit einem 2 mm Streifen eines Double Stick doppelseitigen Klebebands (3M Company, St. Paul, MN, USA) laminiert wurde. 30 ul angegebener Gehaltsmengen von β-Galactosidase in Phosphat-Puffer, pH = 7,4, wurden dann der Substratunterlage zugefügt, und es wurden die Reflexionswerte in Zeitabständen von 5 s beim optischen Absorptionsmaximum einer für das Chromophor spezifizierten Wellenlänge unter Einsatz des SERALYZER -Reflexionsmeßgeräts (Miles Inc., Elkhart, IN, USA) aufgenommen. Die Relfexionswerte wurden durch eine mathematische Funktion linearisiert und in als L(R)-Einheiten identifizierte Einheiten umgerechnet.
Die Ergebnisse sind in Fig. 6 bis 8 angegeben. Tabelle D Verbindung Verschiebung Kcat Mol/min pro Mol aktive Stelle Substrat Chromogen gelb violett purpurfarben blau

Claims

1. Chromogene Merocyanin-Enzymsubstrat-Verbindung der Formel:

worin Y eine enzymatisch-spaltbare Gruppe ist, die aus Zuckern und Derivaten davon, Aminosäuren und Peptiden ausgewählt ist, A einen substituierten oder unsubstituierten Naphthylen-Rest darstellt,

B eine Gruppe oder einen Rest nicht-metallischer Atome darstellt, welche einen 5- oder 6-gliedrigen, N-haltigen heterocyclischen Ring oder ein kondensiertes Ringsystem aus 5- und/oder 6-gliedrigen heterocyclischen oder carbocyclischen Ringen vervollständigen, und worin R¹ eine Alkyl- oder Aryl-Gruppe, R² und R³, welche gleich oder verschieden sein können, ein Wasserstoffatom oder eine Niedrigalkyl-Gruppe, m, n und p, welche gleich oder verschieden sein können, ganze Zahlen von 0 bis 3 sind, mit der Maßgabe, daß m+n+p mindestens 2 beträgt, und worin X ist ein Gegenion (Anion) ist.

2. Verbindung gemäß Anspruch 1, worin A den 1,4-Naphthylen- oder 2,6-Naphthylen-Rest darstellt.

3. Verbindung gemäß Anspruch 1 oder 2, worin B eine Gruppe oder einen Rest nicht-metallischer Atome darstellt, welche einen 5- oder 6-gliedrigen, N-haltigen heterocyclischen Ring oder ein kondensiertes Ringsystem aus drei oder weniger 5- und/oder 6-gliedrigen heterocyclischen oder carbocyclischen Ringen vervollständigen, und worin B vorzugsweise einen Ring oder ein kondensiertes Ringsystem vervollständigt, welche aus substituierten oder unsubstituierten Formen von Indoleninium, β-Naphthothiazolium, Benzoxazolium, Benzothiazolium, Chinolinium, Thiazolium, Benzoselenazolium oder Benzimidazolium ausgewählt sind.

4. Verbindung gemäß Anspruch 1 der Formel:

worin Y einen enzymatisch-spaltbare Gruppe ist, die aus Zuckern oder Derivaten davon, Aminosäuren und Peptiden ausgewählt ist, B eine Gruppe oder einen Rest nicht- metallischer Atome darstellt, welche einen 5- oder 6- gliedrigen N-haltigen heterocyclischen Ring oder ein kondensiertes Ringsystem aus drei oder weniger 5- und/oder 6-gliedrigen heterocyclischen oder carbocyclischen Ringen vervollständigen, R¹ eine Niedrigalkyl- oder Phenyl-Gruppe, Ar ein substituierter oder unsubstituierter Phenylen-, Naphthylen- oder Anthrylen-Rest, n eine ganze Zahl von 0 bis 3 und X ein Gegenion (Anion) sind.

5. Verbindung gemäß Anspruch 4, worin der Ring oder das kondensierte Ringsystem, welche durch die Gruppe oder den Rest aus nicht-metallischen Atomen vervollständigt sind, die durch B in der Formel dargestellt sind, eine substituierte oder unsubstituierte Form von Indoleninium, β-Naphthothiazolium, Benzoxazolium, Benzothiazolium, Chinolinium, Thiazolium, Benzoselenazolium oder Benzimidazolium sind.

6. Verbindung gemäß Anspruch 1 der Formel:

worin X ein Rest eines Zuckers oder Derivats davon, Ar der 1,4-Naphthylen- oder 2,6-Naphthylen-Rest, R¹ eine Niedrigalkyl-Gruppe, Z ein Di(niedrigalkyl)methylen-, Vinylen-Rest, O, S oder Se sind, und worin der Phenyl- Ring substituiert oder unsubstituiert und X ein Gegenion (Anion) sind.

7. Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, worin Y ein Rest einer Verbindung Y-OH ist, die aus β-D- Galactose, β-D-Galactose, α-D-Glucose, β-D-Glucose, α-D- Mannose, N-Acetylglucosamin und aus N- Acetylneuraminsäure ausgewählt ist.

8. Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, worin Y ein Rest von β-D-Galactose ist.

9. Verwendung einer Verbindung gemäß einem jeden der Ansprüche 1 bis 8 zur Bestimmung eines Enzyms.

10. Verwendung gemäß Anspruch 9, worin das Enzym ein Markierungsmittel in einem Immunoassy ist.