DE69017090T2

DE69017090T2 - Chromogene Dibenzoxazepinon- und Dibenzothiazepinon-Enzymsubstrate.

Info

Publication number: DE69017090T2
Application number: DE69017090T
Authority: DE
Inventors: Paul F Corey
Original assignee: Miles Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1989-06-12
Filing date: 1990-05-30
Publication date: 1995-06-14
Anticipated expiration: 2010-05-31
Also published as: AU609008B2; JPH0341073A; EP0402699A3; US5104980A; AU5396790A; JP3072350B2; EP0402699B1; CA2013525C; DD297965A5; EP0402699A2; CA2013525A1; DE69017090D1

Description

Die Erfindung betrifft Chromogenverbindungen, die als optische Indikatorverbindungen in analytischen Test systemen nützlich sind. Insbesondere betrifft die Erfindung neue chromogene Enzym-Substratverbindungen und ihre Verwendung in analytische Testsystemen zum Enzymnachweis in einer flüssigen Testprobe.
Die Bestimmung von Enzymen ist in einer Vielzahl von Bereichen, wie der biochemischen Forschung, Umwelt und Industrieuntersuchungen und bei medizinischen Diagnostika wichtig. Die Quantifizierung von Enzymspiegeln in Körperflüssigkeiten, wie Serum und Plasma, liefert dem Arzt sehr nützliche Informationen bei der Diagnose von Krankheitszuständen und ihre Behandlung. Zusätzlich zu ihrer Funktion als zu untersuchende Analyte in biologischen Flüssigkeiten können Enzyme auch als Nachweisreagenzien in einer Vielzahl von analytischen Systemen, wie Immuntests und Nukleinsäure-Hybridisierungstechniken dienen. In solchen Systemen sind die Enzyme direkt oder indirekt als Markierungen zur Überwachung des Ausmaßes an Antigen- Antikörperbindung oder Nukleinsäurehybridisierung, die auftritt, geeignet.
Demnach war das Bedürfnis, Enzym-Analyte nachzuweisen und Enzym-Markierungen als diagnostisches Mittel bei verschiedenen analytischen Testsystemen zu verwenden, Anlaß für die Entwicklung optischer Indikatorverbindungen zur Verwendung beim Nachweis und Messung der Aktivität solcher Enzyme. Typischerweise umfassen solche bekannten optischen Indikatorverbindungen eine detektierbare chemische Gruppe, wie ein Fluorogen oder ein Chromogen, die mit einer Enzymabspaltbaren Substratgruppe derivatisiert worden ist, die für das zu messende Enzym spezifisch ist. Solche optischen Indikatorverbindungen liefern ein optisches Signal, das verschieden von dem optischen Signal ist, das von der abgespalteten nativen Form des Fluorogens oder Chromogens erzeugt wird. Im Prinzip spaltet das Enzym die Indikatorverbindung unter Freisetzung des Fluorogens oder Chromogens in Form eines spezifisch fluoreszierenden oder gefärbten Produkts, wobei eine Veränderung der Fluoreszenz oder Farbe erzeugt wird, die proportional zur Menge des vorhandenen Enzyms ist, die ihrerseits mit der Menge des in einer flüssigen Testprobe vorhandenen Analyten in Beziehung gesetzt werden kann.
Insbesondere ist der Nachweise und/oder die Bestimmung von Hydrolase, d. h. Enzymen die Hydrolysereaktionen von Estern, glycosidischen Bindungen, Peptidbindungen, anderen Kohlenstoff-Stickstoff-Bindungen und Säureanhydriden katalysieren [siehe Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., New York, NY, 1970) S. 148] von Interesse bei Diagnose und Überwachung verschiedener Krankheiten, wie z. B. der Amylase- und Lipasebestimmung bei der Diagnose von Fehlfunktionen der Bauchspeicheldrüse [siehe Kaplan und Pesce, Clinical Chemistry - Theory, Analysis and Correlation (C.V. Mosby Co., St. Louis, MO, 1984) Kapitel 56], Bestimmung der N-Acetylglucosaminidase (NAG) als Indikator von Erkrankungen des Harnwegtraktes [siehe Price, Curr. Probl. Clin. Biochem. 9, 150 (1979)} und dem Nachweis von Esterase als Indikator für Leukozyten [siehe Skjold, Clin. Chem. 31, 993 (1985)]. Zusätzlich zu ihrem Wert bei der Überwachung des Krankheitsverlaufes haben Hydrolasen in den letzten Jahren Bedeutung bei diagnostischen wie auch biotechnologischen Bereichen gewonnen. Z. B. wurde gefunden, daß alkalische Phosphatase und vorzugsweise β-D-Galactosidase in steigendem Masse als Indikatorenzyme für Enzym-Immuntests [siehe Annals of Clinical Biochemistry, 16, 221-40 (1979)] verwendet werden.
Demnach war die Verwendung von Enzymen, wie Glycosidasen, insbesondere β-D-Galactosidase als Indikator-Enzym- Markierungen bei analytischen Testsystemen der Auslöser für die Entwicklung von Substrat-Glycosiden, wie Phenyl-β-D- galactosid, o-Nitrophenyl-β-D-galactosid und p-Nitrophenyl-β- D-galactosid [siehe Biochem. Z, Bd. 333, S. 209 (1960)], die durch β-D-Galactosidase unter Freisetzung der Phenole hydrolysiert werden, die photometrisch im ultravioletten Bereich gemessen werden, oder von ortho-Nitrophenolen, die iin kurzwelligen sichtbaren Bereich gemessen werden. EP- PS 156 347 und US-PS 4 810 636 beschreiben Glycoside von Resorufin- und Acridinonderivate, die für bestimmte Glycosidasen von Bedeutung spezifisch sind und von diesen unter Freisetzung nachweisbarer Chromogene gespalten werden. US-PS 3 950 322 beschreibt eine mit einem Fluorogen wie 4- Methylumbelliferon, Fluorescein, Methylfluorescein, Resorufin oder Umbelliferon derivatisierter N-Acety1neuraminsäure zum Nachweis von Neuraminidase, wo das fluorogene Substrat- Glycosid in gleicher Weise vom Enzym unter Freisetzung des Fluorogens umgesetzt wird.
Die Verwendung von β-D-Galactosidasen wird auch im Zusammenhang mit histochemischen Untersuchungen beschrieben, wie z. B. Naphthyl-β-D-galactosidasen, beschrieben in Histochemie, Bd. 35, S. 199 und Bd. 37, S. 89 (1973) und die 6-Brom-α-naphthylderivate davon, beschrieben in J. Biol. Chem., Bd. 195, S. 239 (1952). Gemäß diesen Testsystemen werden die nach Wechselwirkung des Galactosids mit dem Enzym freigesetzten Naphthole mit verschiedenen Diazoniumsalzen unter Erzeugung der entsprechenden Azo-Farbstoffe freigesetzt, die dann sichtbar gemacht werden können.
Obwohl solche bekannten optischen Indikatorverbindungen zum Nachweis von Enzym-Analyten und als Markierungen in einem analytischen Testsystem geeignet sind, treten eine Vielzahl von Problemen auf, die die Testempfindlichkeit und Genauigkeit betreffen, wie niedrige Extinktionskoeffizienten, schlechte Wasserlöslichkeit, Adsorptionsmaxima, die mit verschiedenen Pigmenten und anderen üblicherweise in biologischen Flüssigkeiten vorhandenen Bestandteilen in Wechselwirkung treten, und Farbveränderungen zwischen der optischen Indikatorverbindung und dem freigesetzten Chromogen oder Fluorogen, die schwierig ohne den Einsatz komplizierter Instrumente zu messen sind.
Es ist demnach eine Aufgabe der Erfindung, chromogene Enzym- Stubstratverbindungen bereitzustellen, die als optische Indikatorverbindungen in analytischen Testsystemen für den genauen und empfindlichen Nachweis von Enzymen in einer flüssigen Testprobe verwendet werden können.
Zusätzlich ist es eine erfindungsgemäße Aufgabe, chromogene Enzym-Substratverbindungen bereitzustellen, die in eine feste poröse Matrix einer analytischen Testvorrichtung als optische Indikatorverbindungen zur Messung der hierin enthaltenen Enzyme, oder in einer hierauf aufgebrachten flüssigen Testprobe zu imprägnieren.
Die Erfindung stellt neue chromogene Enzymsubstratverbindungen mit der Formel zur Verfügung:
worin Y eine Enzym-abspaltbare Gruppe bedeutet, die ausgewählt ist, um die Spezifizität für ein spezifisches entsprechendes Enzym von analytischem Interesse zu verleihen; W ist Sauerstoff oder Schwefel; und R und R', die gleich oder verschieden sein können, sind Wasserstoff, Alkyl oder Aryl. Die Enzym-spaltbare Gruppe Y ist ein Rest einer Verbindung Y-OH, umfassend eine Enzym-spezifische Einheit, die so ausgewählt werden kann, um Spezifität gegenüber einer großen Vielzahl an Enzymen zu verleihen und umfaßt, ist jedoch nicht notwendigerweise darauf beschränkt, Enzym-spezifische Einheiten, wie Zucker und Derivate davon, Acylgruppen, einschließlich aliphatischer und aromatischer Carbonsäuren, Aminosäuren und Peptide, und anorganisches Säuren, wie Phosphorsäure und Schwefelsäure.
Die Erfindung zieht ihre Hauptvorteile aus der Verwendung von Dibenzoxazepinon- und Dibenzothiazepinon-Chromogenen als Zwischenprodukte, die mit einer geeigneten enzymatisch abspaltbaren Gruppe Y derivatisiert sind. Insbesondere wird, wenn die enzyinatisch abspaltbare Gruppe Y durch ein dafür spezifisches Enzym in basischer Lösung, vorzugsweise bei einem pH zwischen 7,0 bis 10,0, abgespalten wird, die deprotonierte Form des Chromogens mit einem Absorptionsmaximum, das wesentlich größer als das Absorptionsmaximum der chromogenen Enzym-Substratverbindung der Erfindung ist, freigesetzt, wodurch ein deutlicher Unterschied in der Absorption dazwischen auftritt. Der deutliche Unterschied in der Absorption liefert ein leicht ablesbares und nachweisbares optisches Signal, das genau gemessen werden kann, und mit der in einer flüssigen Testprobe vorhandenen Menge an Enzym korreliert werden kann.
Fig. 1 zeigt ein Fließdiagramm für einen Syntheseweg zur Herstellung von 8-Hydroxy-11H- dibenz [b,e][1,4]oxazepin-2-on-Chomogene.
Fig. 2 zeigt ein Fließdiagramm eines Syntheseweges zur Herstellung von 8-Hydroxy-11H- dibenzo[b,e][1,4]thiazepin-2-on-Chromogene.
Fig. 3 zeigt ein Fließdiagramm der Synthesewege zur Herstellung von erfindungsgemäßen chromogenen Enzym- Substratverbindungen.
Fig. 4 zeigt eine graphische Darstellung zur Erläuterung des Dosissignals einer Testvorrichtung, die mit dem erfindungsgemäßen chromogenen Enzym-Substrat in Gegenwart von β-D-Galactosidase versehen ist.
Die erfindungsgemäßen chromogenen Enzym-Substratverbindungen leiten sich von Chromogenen mit der allgemeinen Formel ab:
Wenn W Sauerstoff ist, ist das Chromogen eine Mischung der Isomere 8-Hydroxy-11H-dibenz[b,e][1,4]oxazepin-2-on und 2- Hydroxy-11H-dibenz[b,e][1,4]oxazepin-8-on, solche O-analoge Chromogene und ihre Derivate werden im folgenden als Dibenzoxazepinone bezeichnet). Wenn W Schwefel ist, ist das Chromogen eine Mischung der Isomere 8-Hydroxy-11H- dibenz[b,e][1,4]thiazepin-2-on und 2-Hydroxy-11H- dibenz [b,e][1,4]thiazepin-8-on (solche S-analogen Chromogene und ihre Derivate werden im folgenden als Dibenhothiazepinone bezeichnet). Das Dibenzoxazepinon, worin R H und R' Methyl sind, wurde in der Literatur beschrieben [R. Hill, Journal of Bioenergetics, Bd. 4, S. 229 (1973) und R. Hill, et al., New Phytology, Bd. 77, S. 1 (1976)]. Die sichtbaren Absorpitonsspektren dieses Chromogens wurden von T. Graan et al., Analytical Biochemistry, Bd. 144, S. 193 (1985) beschrieben, worin eine Veränderung in der Absorption (λmax) von 122 nm zwischen der protonierten Form und der deprotonierten Form von diesen Chromogenen berichtet wurde. Solche Deprotonierung tritt in schwach-sauren Lösungen auf, im allgemeinen zwischen pH 5,75 bis 6,75 bei der phenolischen Hydroxylgruppe des Chromogens durch Delokalisierung der negativen Ladung des Anions über das gesamte Molekül. Bei den gegenwärtigen Enzym-Substratverbindungen (1) liefert die enzymatische Spaltung des Y-Restes, und anschließende Protonierung, die chromogene Spezies:
worin W, R und R' wie oben definiert sind.
Gemäß der erfindungsgemäßen Lehre, sind, wenn die phenolische Hydroxylgruppe des Chromogens mit einer enzymatisch abspaltbaren Gruppe, umfassend den Rest einer Verbindung Y-OH, die eine Enzym-spezifische Einheit ist, derivatisiert ist, die erhaltenen Verbindungen neue isomere chromogene Enzym-Substratverbindungen der allgemeinen isomeren Formel:
worin Y eine Enzym-abspaltbare Gruppe bedeutet, und W, R und R' wie oben definiert sind (im folgenden sollen Verweise auf erfindungsgemäße Verbindungen unter Verwendung von nur einer der beiden isomeren Strukturen, die in einer der Formeln (1) bis (4) angegeben sind, so verstanden werden, daß sie einen Verweis auf die anderen isomeren Strukturen mitumfaßt). Die isomeren Formen der vorliegenden Substratverbindungen können als eine MS-1577-Mischung verwendet werden, oder können durch übliche Mittel, wie Chromatographie, getrennt werden. Die Dibenzoxazepinone, worin W O ist, sind insbesonders bevorzugt. Ferner ist bevorzugt, daß R und R' ausgewählt sind aus H, Niederalkyl und Phenyl, einschließlich substituierten Formen davon. Wenn eines von R und R' H oder Phenyl ist, ist es im allgemeinen bevorzugt, daß das andere nicht ebenfalls H oder Phenyl ist. Besonders bevorzugt sind Dibenzoxazepinone (W=O) worin R und R' gleich oder verschieden H oder Niedrigalkyl sind, insbesondere wenn eines von R und R' H ist und das andere Niederalkyl ist, z. B. Methyl, oder wenn beide R und R' Methyl sind.
Es ist selbstverständlich, daß die Erfindung die erste Verwendung von Dibenzoxazepinon- und Dibenzothiazepinonklassen von Chromogenen als Indikatorgruppen in chromogenen Enzym-Stubstraten beschreibt, und demnach eine große Vielzahl an substituierten Dibenzoxazepinon- und Dibenzothiazepinonderivaten umfaßt. Es wird offensichtlich, daß die aromatischen Ringe A und B in der Formel (4) eine Vielzahl von Substituentengruppen tragen können, ohne vom Bereich der Erfindung abzuweichen. Wie in Einzelheiten im folgenden erläutert, sind solche Substituentengruppen nur durch die Fähigkeit des Fachmanns limitiert, stabile Verbindungen herzustellen, die chromogene Enzym-Stubstrateigenschaften der Erfindung haben, und umfassen solche Gruppen wie unsubstituiertes und substituiertes Alkyl, unsubstituiertes und substituiertes Aryl, Alkoxy, Aryloxy, Halo (z. B. Fluor, Chlor, Brom), Nitro und substituiertes Amino, wie Dialkylamino.
Im erfindungsgemäßen Zusammenhang soll "Alkyl" lineare und verzweigte Formen unsubstituierter Kohlenwasserstoffreste der allgemeinen Formel - CnH2n + 1 umfassen, bevorzugt den 'Niederalkyl" aliphatischen Typ, worin n 6 oder weniger ist, wie Methyl, Ethyl, n-Propyl, iso-Propyl, n-Butyl, iso-Butyl, tert-Butyl, n-Hexyl und ähnliche, wie auch substituierte Formen davon.
Ferner soll im erfindungsgemäßen Zusammenhang "Aryl" organische Reste, abgeleitet vom aromatischen Kohlenwasserstoffring und Ringsystem durch Entfernung eines Wasserstoffatoms bedeuten, und die unsubstituierten Kohlenwasserstoffringresten, wie Phenyl und Naphthyl und substituierte Formen davon umfassen. Für den Zweck der Erfindung umfassen Arylreste solche, die eine oder mehrere gleiche oder verschiedene funktionelle Gruppen oder Substituenten tragen, die vom Fachmann ausgewählt werden können, um die chromogenen Enzym-Substratverbindungen der Erfindung bereitzustellen.
Insbesondere, wenn "Aryl" und "Alkyl" substituiert sind, soll solche Substitution Gruppen oder Substituenten umfassen, wenn sie mit funktionellen Gruppen mono- oder polysubstituiert sind, die nicht wesentlich von den nützlichen Merkmalen der vorliegenden Erfindungen ablenken. Solche funktionellen Gruppen umfassen chemische Gruppen, die synthetisch eingeführt werden können, und führen zu stabilen und geeigneten chromogenen Enzym-Substrat-Indikatorverbindungen der Erfindung. Beispiele solcher funktionellen Gruppen umfassen Halogen (z. B. Fluor, Chlor, Brom), substituiertes Amino, wie Dialkylamino, Nitro, Alkoxy, Aryloxy, Alkyl und Aryl, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Insbesondere wenn R und/oder R' Alkyl sind, bevorzugt Niederalkyl, umfassend solche Alkylgruppen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Methyl, Ethyl, n-Propyl, iso-Propyl, n- Butyl, iso-Butyl, tert-Butyl, n-Hexyl und substituierte Formen davon, einschließlich Benzyl, Dialkylaminomethyl, insbesondere Dimethylaminomethyl oder Halogenmethyl, insbesondere Brommethyl und ähnliche, sind jedoch nicht notwendigerweise darauf beschränkt. Wenn R und/oder R' Aryl sind, umfassen solche Arylgruppen Naphthyl, Phenyl, p- Chlorphenyl, 2,4-Dimethoxyphenyl und ähnliche, sollen jedoch nicht darauf beschränkt sein.
Die chromogenen Enzym-Substratverbindungen (1) besitzen im wesentlichen die gleichen Farbeigenschaften wie die protonierte Form des Chromogens, unbeachtlich des pHs der umgebenden Flüssigkeit, worin nach Kontakt der derivatisierten chromogenen Enzym-Substratverbindung (1) mit einem geeigneten Enzym in der Umgebung, umfassend eine Lösung von pH 6,5 bis pH 10, die enzymatisch abspaltbare Gruppe Y durch das Enzym unter Freisetzung der dissoziierten oder deprotonierten Form des Chromogen (3) mit einem Absorptionsmaximum, das wesentlich größer als das Absorptionsmaximum der chromogenen Enzym-Substratverbindung unter Bereitstellung eines deutlichen Unterschieds im Absorptionsmaximum dazwischen abgespalten wird. Demnach sind die chromogenen Enzym-Substratverbindungen der vorliegenden Erfindung besonders geeignet in einem analytischen Testsystem, das den Nachweis eines darin verwendeten Enzymmarkierten Testreagenses erfordert. Die unterschiedliche und meßbare Veränderung im Absorptionsmaximum, die zwischen der Substratverbindung und der deprotonierten Form des Chromogens auftritt, kann genau nachgewiesen, gemessen und der Menge des in einer flüssigen Testprobe vorhandenen Analyten zugeordnet werden.

ENZYMATISCH ABSPALTBARE GRUPPEN

Erfindungsgemäß ist die Enzym-abspaltbare Gruppe Y ein Rest einer Verbindung Y-OH umfassend eine Enzym-spezifische Einheit unter Bereitstellung neuer chromogener Enzym- Substratverbindungen, die einer großen Anzahl an Enzymen, die in der analytischen Chemie, insbesondere der klinischen Chemie angetroffen werden, und insbesondere Hydrolasen Spezifität verleiht. Die Verbindung Y-OH soll Zucker und Derivate davon, Acylgruppen einschließlich aliphatischer und aromatischer Carbonsäuren einschließlich Aminosäuren und Peptide und anorganisches Säuren wie Phosphorsäure und Schwefelsäuregruppen umfassen, ist jedoch nicht notwendigerweise darauf eingeschränkt.
Es ist für den Fachmann selbstverständlich, daß die Auswahl der enzymatisch abspaltbaren Gruppe Y natürlich vom jeweiligen Enzym abhängt. Z. B. wenn dieses Enzym eine Glycosidase ist, kann ein Glycosid hergestellt werden, indem die enzymatisch abspaltbare Gruppe Y der glycosidische Rast entsprechend dem natürlichen Substrat für bestimmte Glycosidase ist. Geeignete glycosidische Reste umfassen, sind jedoch nicht darauf eingeschränkt, Mono- und Oligosaccharidreste, die in der Lage sind, in ein Glycosidsubstrat eingebaut zu werden, spezifisch für ein bestimmten Glycosidaseenzym sind, und von diesem Enzym gespaltet werden, die Reste von β-D-Galactopyranose, α-D- Galactopyranose, β-D-Glycopyranose, α-D-Glycopyranose und α- D-Mannopyranose, wie auch Aminozucker wie N-Acetylglycosamin und N-Acetylneuraminsäure und ähnliche Reste. Andere geeignete glycosidische Reste umfassen Oligosaccharidketten von zwischen ca. 2 bis 20, vorzugsweise 2 bis 7 Monosaccharideinheiten, die über α-1-4-glycosidische Bindungen verknüpft sind, die durch Saccharidketten spaltende Enzyme zu Mono- oder Oligosacchariden abgebaut werden können, die ihrerseits mit einer korrespondierenden Glycosidase gespaltet werden können, wie z. B. Reste von Maltopentose, Maltohexose und Maltoheptose.
-Es ist klar, daß in einigen Fällen, wenn der glycosidische Rest eine Oligosaccharidkette, wie zuvor beschrieben, ist, eine solche Kette zuerst modifiziert oder auf ein kürzeres Oligosaccharid oder Monosaccharid durch das zu messende Enzym unter Bereitstellung einer sekundären Substratverbindung abgebaut wird, bei der die enzymatisch abspaltbare Gruppe vom Kern der Substratverbindung durch ein Sekundärenzym abgespalten wird, wobei die Sekundärsubstratverbindung dann mit dem Sekundärenzym in Kontakt gebracht wird unter Erzeugung einer meßbaren Veränderung in der Absorption wie zuvor beschrieben. Wenn z. B. das zu messende Enzym α-Amylase ist, wird die Oligosaccharidkette unter Bereitstellung einer sekundären Glycosid-Substratverbindung gespalten, z. B. eines α-Glycosids oder β-Glycosids, in der die erhaltene Glycosidgruppe vom Kern der Substratverbindung durch ein sekundäres Glycosidaseenzym, z. B. α-Glycosidase oder β- Glycosidase abgespalten werden kann.
Bei nicht-spezifischen Esteraseenzymen ist die enzymatisch abspaltbare Gruppe Y ein Rest einer Acylgruppe unter Bereitstellung eines chromogenen Esters der Formel:
worin Z Niederalkyl oder Aryl ist, solche Verbindungen können zum Nachweis nicht-spezifischer Esteraseenzyme, wie Chloinesterase, Acylase, Lipase und ähnliche eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäßen chromogenen Enzym-Substratverbindungen können auch zum Nachweis proteolytischer Enzyme verwendet werden, die üblicherweise in Leukocyten gefunden werden. In solchen Verbindungen ist ein Rest der Verbindung Y-OH, welche eine N-geschützte Aminosäure oder ein kurzes Peptid ist, z. B. bestehend aus zwischen ca. 2 bis 5 Aminosäureeinheiten. Z. B. kann Y ein Rest der N-geschützten Aminosäure-N-tosyl-L- alanin dargestellt durch die folgende Formel sein:
Es soll darauf hingewiesen werden, daß die Erfindung andere Carbonsäurereste, Aminosäurereste und N-Schutzgruppen als Äquivalente umfaßt, wie im folgenden in Einzelheiten beschrieben.
In gleicher Weise ist die enzymatisch abspaltbare Gruppe Y zum Nachweis alkalischer Phosphatase aus einer flüssigen Testprobe ein Rest einer Verbindung Y-OH, worin Y-OH eine Phosphorsäuregruppe der Formel ist:

HERSTELLUNG DER CHROMOGENEN ENZYM-SUBSTRATVERBINDUNGEN

Die erfindungsgemäßen chromogenen Enzym-Substratverbindungen (1) können hergestellt werden durch Umsetzen der Verbindung Y-OH, worin Y eine ausgewählte enzymatisch abspaltbare Gruppe ist, mit einem geeignet derivatisierten Dibenzoxazepinon oder Dibenzothiazepinon-Chromogen, wie in Einzelheiten im folgenden beschrieben, unter bekannten Kondensations- Reaktionsbedingungen. Im allgemeinen wird das geeignete Dibenzoxazepinon- oder Dibenzothiazepinon-Chromogen unter geeigneten Bedingungen mit einem reaktiven Derivat der Verbindung Y-OH, vorzugsweise einem Kohlenhydrat (Zucker) oder Kohlenhydratderivat oder einer Säure wie zuvor beschrieben, unter Bereitstellung eines chromogenen Enzym- Substrats mit der erwünschten Stereochemie gekoppelt.
Wie oben erwähnt, umfaßt die Erfindung verschiedene Substituenten, die an den aromatischen Ringen A und E des in Formel (4) gezeigten Kerns substituiert werden können. Substituierte Äquivalente werden hergestellt durch die Verwendung der geeignet derivatisierten Dibenzoxazepinone oder Dibenzothiazepinone, die nach bekannten Verfahren hergestellt werden können.
Die Herstellung von Dibenzoxazepinonen (Fig. 1) umfaßt als Ausgangsmaterialien ein 3-Hydroxyacetophenon, ein 3- Hydroxybenzophenon oder ein 3-Hydroxybenzaldehyd (8) und ein geeignetes Grignard-Reagens, die unter Erhalt eines substituierten Phenols (9) umgesetzt werden [Reaktion (a)]. Gegebenenfalls kann das 3-Hydroxyactophenon, 3- Hydroxybenzophenon oder 3-Hydroxybenzaldehyd (8) unter Verwendung eines geeigneten Reduktionsmittels reduziert werden [Reaktion (a')]. Das Phenol (9) seinerseits wird mit [Reaktion (b)] einem substituierten Benzochinon-N-chlorimin (10) unter Erhalt eines funktionalisierten Indophenols (12) umgesetzt. Man läßt dann das Indophenol (12) in basischer Lösung unter Erhalt der erwünschten Substratverbindung (13 und 14) zyklisieren.
Insbesondere werden die Phenole (9) hergestellt nach dem Verfahren beschrieben von Hill et al., supra, worin R und R' beide Methyl oder Phenyl und A, B und C Wasserstoff sein können, aus dem entsprechenden 3-Hydroxyacetophenon oder 3- Hydroxybenzophenon (8), die mit einem Methylmagnesiumbromid- Grignard-Reagens oder Phenylmagnesiumjodid-Grignard-Reagens [Reaktion (a)] umgesetzt werden können. Es ist selbstverständlich, daß das Grignard-Reagens aus einer Vielzahl solcher Reagenzien, die im Stand der Technik beschrieben sind, ausgewählt werden kann, und Alkyl- und Aryl-Grignard-Reagenzien umfassen, jedoch nicht notwendigerweise darauf beschränkt sind, so z. B. solche, worin X Brom oder Jod darstellt, wie auch solche, die funktionelle Gruppensubstituenten tragen, wie O- Alkyl(alkoxy), O-Aryl(aryloxy), Alkyl und Aryl. In ähnlicher Weise wurde die Synthese einer Vielzahl von substituierten 3- Hydroxyacetophenonen (8), worin R Alkyl oder substituiertes Alkyl sein kann, und 3-Hydroxybenzophenonen (8), worin R Aryl oder substituiertes Aryl sein kann, beschrieben und umfassen Verbindungen der allgemeinen Formel (a), worin R, A, B und C aus einer Vielzahl von bekannten Substituenten ausgewählt werden kann. z. B. kann R Methyl sein, A und C können Wasserstoff sein und B kann Brom, Chlor, Jod, Methyl oder Cyclohexyl sein [J. Med. Chem., Bd. 23, S. 738 (1980)]; oder R und C können Methyl sein, A und B können Nitro und Wasserstoff oder Wasserstoff und Nitro, oder A und B können Wasserstoff sein [Chem. Ber., Bd. 92, S. 2172 (1959)]; oder R kann Methyl sein, A und B können Wasserstoff sein, und B kann Methoxy sein [Chem. Ber., Bd. 55B, S. 1892 (1922)]; oder Cyclohexylether [J. Chem. Soc., S. 3430 (1951)]; oder R und A können Methyl sein, B kann Wasserstoff sein und C kann Nitro sein [J. Org. Chem., Bd. 14, S. 397 (1949)]; oder R kann Methyl sein, A und B können Methoxy sein und C kann Wasserstoff sein [J. Prakt. Chem., Bd. 103, S. 329 (1922)]; oder R kann Methyl sein, A und C können Wasserstoff sein und B kann p-Hydroxyphenol sein [Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., Bd. 292, S. 58 (1953)]; oder A, B und C können Wasserstoff sein, und R kann Dimethylaminomethyl [Monatsh., Bd. 80, S. 517 (1949)] oder Benzyl oder Phenylethyl [Medd. Norsk. Farm. Selskap., Bd. 24, S. 45 (1962)] oder p- Chlorphenyl [J. Chem. Soc. S. 5 (1946)] oder 2,4- Dimethoxyphenyl [Bull. Soc. Chim. France, S. 1682 (1959)] oder R kann Brommethyl sein, und wenn A, B oder C Nitro ist, dann können B und C, A und C oder A und B Wasserstoff sein [Acta Univ. Szeged., Acta Phys. Chem., Bd. 9, S. 48 (1963)]; oder R kann Phenyl sein und A und C können Wasserstoff und B kann Methyl sein [Helv. Chim. Acta., Bd. 29, S. 1413 (1946)] oder A und B können Methoxy sein und C kann Wasserstoff sein [J. Org. Chem., Bd. 24, S. 952 (1959)]; und ähnliche.
Die Phenole (9), bei denen entweder R oder R' oder beide Wasserstoff sind, werden aus dem entsprechenden 3- Hydroxybenzaldehyd, 3-Hydroxyacetophenon oder 3- Hydroxybenzophenon (8) durch Reduktion [Reaktion (a')] der Carbonylgruppe in eine Hydroxylgruppe unter Verwendung einer Vielzahl von Reduktionsmitteln hergestellt. Solche Reduktionsmittel sind im Stand der Technik bekannt (siehe House, Modern Synthetic Reactions, zweite Ausgabe, W.A. Benjamin Inc., Menlo Park, CA, 1972, S. 1-227) und umfassen Lithiumhydrid, Lithiumaluminiumhydrid, Natriumborhydrid und katalytische Hydrierung.
Das erwünschte Indophenol (12) wird durch Umsetzen eines geeignet substituierten Phenols (9), erhalten aus der Reaktion (a) oder (a'), mit einem geeignet substituierenden Benzochinon-N-chlorimin (10) in wäßrigem Alkali [Reaktion (b)] wie bei Hill et al., supra beschrieben, umgesetzt, worin alle A bis G Wasserstoff sein können, und wie allgemeiner bei Gibbs et al., Supplement Nr. 69 im Public Health Reports, Washington, D.C. (1928) beschrieben, wo alle Substituenten D, E, F und G der allgemeinen Struktur (10) Wasserstoff sein können, oder D kann Methyl sein und E, F und G können Wasserstoff sein, oder D, E und G können Wasserstoffs ein und F kann Methyl sein, oder D und E können Chlor oder Brom sein und F und G können Wasserstoff sein. Ein alternativer Syntheseweg zur Herstellung des Indophenois (12) wird auch von Corbett beschrieben, J. Chem. Soc. (B), S. 1502 (1970), wo ein geeignetes substituiertes Phenol (9) mit einem geeignet substituierten p-Aminophenol (11) und Sauerstoff in Gegenwart wäßrigen Alkalis [Reaktion (c)] umgesetzt wird. Die Substituenten D, E, F und G des p-Aminophenols (11) werden beschrieben, worin D, E und G Wasserstoff sein können, und F kann Methyl oder Chlor sein, oder D, F und G können Wasserstoff sein und E kann Methyl sein, oder D und G können Methyl sein und E und F können Wasserstoff sein, oder D und E können Methyl oder Chlor sein und F und G können Wasserstoff sein, oder D kann Chlorid sein und E, F und G können Wasserstoff sein.
Das Indophenol (12), entweder aus der Reaktion (b) oder (c), wird dann unter Herstellung der Substratverbindungen (13) und (14) nach dem von Hill et al., beschriebenen Verfahren eingesetzt, New Phytology, Bd. 77, S. 1 (1976) [Reaktion (d)], worin das Indophenol (12) in wäßriger Base (Schritt 2), vorzugsweise Natriumborat (Borax) mehrere Tage bei Raumtemperatur zyklisiert wird. Es ist wichtig darauf hinzuweisen, daß es nicht notwendig ist, die verschiedenen Zwischenprodukte aus den Schritten 1 bis 3 der Reaktion (d) unter Erhalt zufriedenstellender Ausbeuten an Substratverbindung (13) und (14) zu isolieren.
Die Herstellung der Dibenzothiazepinone (Fig. 2) verwendet als Ausgangsmaterialien substituierte 3-Mercaptomethylphenole (16) die aus den zuvor beschriebenen substituierten 3- Hydroxymethylphenolen (9) über ein zweistufiges Verfahren umfassend die Bromierung [Reaktion (a)] unter Bereitstellung substituierter 3-Brommethylphenole (15) und anschließend die Reaktion mit Thioharnstoff und basische Hydrolyse [Reaktion (a')] erhalten werden. Die Phenole (16) werden ihrerseits [Reaktion (b) mit einem substituierten Benzochinon-N- chlorimin (10) unter Erhalt eines funktionalisieren Indophenols (17) umgesetzt. Man läßt dann das Indophenol (17) in einer Base unter Erhalt der erwünschten Substratverbindung (18 und 19) zyklisieren.
Insbesondere ist die Synthese von 3-Hydroxybenzylbromid (15, R=R'=A=B=C=H) aus 3-Hydroxybenzylalkohol (9, R=R'=A=B=C=H) in J. Med. Chem. Bd. 23, S. 1013 (1980) beschrieben, und seine Umwandlung in 3-Mercaptomethylphenol (16, R=R'=A=B=C=H) wird in J. Chem. Soc. Perkin I, S. 1555 (1980) berichtet. Allgemein gehört die Umwandlung einer Vielzahl substituierter 3-Hydroxybenzylalkohole (9) in die entsprechenden 3- Mercaptomethylphenole (16) mit diesen Verfahren unter anderen geeigneten Verfahren zum Kenntnisstand des Fachmanns.
Die spezifische Natur der substituierten Benzochinon-N- chloriminie (10) und substituierten p-Aminophenole (11) ist die gleiche, wie zuvor beschrieben, und die übrigen Schritte (b), (c) und (d) sind die gleichen, wie solche zuvor für die Dibenzoxazepinone (13 und 14) beschrieben.
Es ist wichtig darauf hinzuweisen, daß die Auswahl der geeignete deriviatisierten Ausgangsmaterialien und ein geeignetes Gringnard-Reagens oder Reduktionsmittel zur einer Vielzahl von substituierten Phenolen führt, und demnach kann der Fachmann auf dem Gebiet der organischen chemischen Synthese spezifische Indophenole mit einer Vielzahl von Substituenten herstellen, die in erwünschte geeignet deriviatisierte Dibenzoxazepinone und Dibenzthiazepinone zur Verwendung als Chromogen für die erfindungsgemäßen chromogenen Acridinon-Enzym-Substratverbindungen umgewandelt werden.
Die Glycosidderivate der allgemeinen Formel (1) können nach bekannten Verfahren der Kohlenhydratchemie unter Verwendung bekannter Derivate von Kohlenhydraten der Formel Y-OH hergestellt werden, die mit einem geeigneten Chromogen umgesetzt werden. Solche Kohlenhydratderivate, die in einigen Fällen Schutzgruppen tragen, sind handelsüblich erhältlich (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, USA; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) oder können nach bekannten Verfahren hergestellt werden [Methods in Carbohydrate Chemistry (Academic Press, 1963), Bd. 2]. Glyosidische Reste umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Reste von Zuckern wie β- D-Galactopyranosen, α-D-Galactopyranose, β-D-Glucopyranose, α-D-Glucopyranose, α-Mannopyranose, N-Acetylglycoseamin, β- Glucuronsäure und Neuraminsäure. Andere geeignete glycosidische Reste umfassen Rest von Oligosaccharidketten, die durch Saccharidketten spaltende Enzyme auf dem Grad von Mono- oder Oligosacchariden abgebaut werden können, die ihrerseits direkt vom Kern der Substratverbindung mit der entsprechenden Glycosidase abgespalten werden können. Es ist klar, daß solche Oligoschaccharidketten Ketten sind, die von ca. 2 bis ca. 20, vorzugsweise 2 bis 7 Monosaccharideinheiten bestehen, wie Maltopentose, Maltohexose oder Maltoheptose. Die Chromogene der allgemeinen Formel (2) werden mit einem Mono- oder Oligosaccharid oder einem 1-Halogenderivat davon umgesetzt, worin alle Hydroxylgruppe mit einer Schutzgruppe nach bekannten Verfahren der Kohlenhydratchemie unter Erhalt per-O-subsituierter Glycoside substituiert werden, aus denen Glycoside der allgemeinen Formel (1) durch Abspalten der Schutzgruppen nach bekannten Verfahren erhalten werden.
Die geeigneten Chromogene werde mit dem per-O-substituierten 1-Halogensacchariden, vorzugsweise in Gegenwart von Protonakzeptoren, wie Alkalihydroxiden oder Alkalicarbonaten in wäßrigem Aceton, oder (unter Phasentransferbedingungen) in einer Wasser/Chloroform- oder Wasser/Benzolmischung umgesetzt. Dieses Verfahren kann weiterhin durchgeführt werden durch zunächstes Umwandeln des Chromogens mit Alkalihydroxid oder einem Alkoholat in ein Alkalisalz, oder unter Verwendung möglicher substituierter Amine, in ein Ammoniumsalz, und dann Umsetzen dieser mit den per-O- substituierten 1-Holgensacchariden in dipolaren aprontischen Lösungsmitteln, wie Aceton, Dimethylsulfoxid, Dichlormethan, Tetrahydrofuran oder Dimethylformamid. Ferner ist es bei der Synthese von per-O-substituierten Glycosiden und per-O- substituierten 1-Halogensacchariden wirksam, Additive in Form einzelner Silbersalze oder Mischungen von Silbersalze zuzusetzen, wie Silberoxid, Silbercarbonat, Silbercarbonat auf Celite (Johns-Manville Corp., Denver, CO, USA), Silbertriflat oder Silbersalicylat, und/oder einzelne Quecksilbersalze oder Mischungen von Quecksilbersalzen, wie Quecksilberbromid, Quecksilbercyanid, Quecksilberacetat oder Quecksilberoxid und/oder einzelner Kadmiumsalze oder Mischung von Kadmiumsalzen, wie Kadmiumcarbonat oder Kadmiumoxid, möglicherweise unter Verwendung von Trocknungsmitteln wie Kalziumchlorid, einem Molekularsieb oder Drierite (W.A. Hammond Drierite Co., Xenia, OH, USA) in Lösungsmitteln wie Methylenchlorid, Chloroform, Benzol, Toluol, Ethylacetat, Chinolin, Tetrahydrofuran oder Dioxan. Bei der Synthese von α-verknüpften Glycosiden wird das Chromogen mit einem Saccharid geschmolzen, dessen Hydroxygruppen mit einer Schutzgruppe substituiert sind, vorzugsweise einer Acetylgruppe, in Gegenwart einer Lewissäure, wie Zinkchlorid [siehe Chem. Ber. 66, 378-383 (1933) und Methods in Carbohydrat Chemistry (Academic Press, 1967) Bd. 2, S. 345- 347]. Die Temperatur der Reaktion ist vorzugsweise zwischen 80 und 130ºC, besonders bevorzugt zwischen 110 und 130ºC. Die erhaltenen per-O-substituierten Glycoside sind ihrerseits neue Verbindungen. Entfernen der Schutzgruppen aus dem per-O- substituierten Glycosiden unter Bildung der per-O- substituierten Glycoside erfolgt nach in der Kohlenhydratchemie bekannten Methoden [siehe Advances in Carbohydrate Chem. 12, 157 (1976)], so z. B. bei den Acylschutzgruppen mit Natriummethylat, Bariummethylat oder Ammoniak in Methanol. Geeignet als "Schutzgruppe", die üblicherweise in der Kohlenhydratchemie verwendet wird, ist insbesondere ein Acetyl-, Benzoyl-, Benzyl- oder Trimethylsilylrest.
Derivate der allgemeinen Formel (1), worin Y der Rest einer Oligosaccharidkette von ca. 2 bis ca. 20 Monosaccharideinheiten, verbunden über α-1-4-glycosidische Bindungen ist, können zusätzlich aus α- und β-Chromogen- Glycosiden durch ein enzymatisches Verfahren hergestellt werden, das zuerst von French et al., J. Am. Chem. Soc. 76, 2387 (1954) und später von Wallenfels et al., Carbohydrate Research 61, 359, (1978) beschrieben wurden, umfassen den Transfer des Glycosids auf eine zuvor gebildete Polysaccharidkette durch das Enzym (1-4)-α-glucan-4- glycosyltransferase (ebenfalls bekannt als Cyclomaltodextringlucanotransferase; EC 2.4.1.19).
Esterderivate der allgemeinen Formel (1) können nach in der organischen Chemie durch Umsetzen eines geeigneten Chromogens mit bekannten Derivaten von Carbonsäuren der Formel Y-OH umgesetzt werden, worin Y=Z-C(O)- ist, und worin Z wie R und R' oben definiert ist. Solche bekannten Derivate von Carbonsäuren der Formel Y-OH umfassen vorzugsweise Reste natürlich vorkommender α-Aminosäuren in ihrer L- oder D-Form oder auch in ihrer razemischen Form, wobei die Reste von Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin und Tyrosin bevorzugt sind, und die L-Formen davon besonders bevorzugt sind, sollen jedoch nicht darauf beschränkt sein. Alle freien Hydroxylgruppen, die möglicherweise vorliegen, können acetyliert sein und sind bevorzugt acetyliert. Die Peptidreste in dieser Definitiön von Y-OH sollen z. B. Aminosäuren oder Peptide von ca. 2 bis ca. 5 Aminosäureeinheiten sein, wie z. B. Di-, Tri-, Tetra- und Pentapeptide, wobei Di- und Tripeptide bevorzugt sind, und wobei die Aminosäurekomponenten davon die oben erwähnten Aminosäuren sind. Die Aminogruppen solcher Aminosäuren oder Peptide können auch mit Stickstoffschutzgruppen, die in der Peptidchemie bekannt sind, geschützt sein [siehe T.W. Green, Protective Groups in Organic Synthesis (J. Wiley and Sons, New York, NY, 1981), S. 218-287] umfassen z. B. Acyl, Oxycarbonyl, Thiocarbonyl, Sulphonyl, insbesondere p- Toluolsulphonyl (Tosyl, Ts), Sulphenyl, Vinyl, Cyclohexenyl und Carbamoyl, insbesondere t-Butyl-(BOC)- und Benzyl-(CBz)- Carbamoylreste. Solche Ester können in ähnlicher Weise durch Umsetzen eines geeigneten Chromogens mit einer Carbonsäure oder mit einem geeigneten reaktiven Derivat davon hergestellt werden unter Einsatz von im Bereich der organischen Chemie bekannten Methoden [siehe J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanism and Structure (McGraw-Hill Book Co., New York, NY, 1968) S. 319-323]. Die verwendeten reaktiven Derivate können z. B. Säurechloride oder Bromide oder gemischte Anhydride sein, die üblicherweise bei der Peptidsynthese verwendet werden, wie solche mit Ethylchlorformiat, oder aktive Ester, wie solche von N- Hydroxysuccinimid.
In ähnlicher Weise können anorganische Ester der Formel (1) nach im Bereich der organischen Synthese bekannten Verfahren hergestellt werden. Die bekannten Derivate organischer Säuren Y-OH, wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure, werden mit dem Chromogen unter Einsatz in der anorganischen Chemie bekannter Verfahren umgesetzt, wie bei Koller und Wolfbeis, Monatsh. 116, 65 (1985) für anorganische Ester bestimmter Coumarine gezeigt.

ANALYTISCHE TESTSYSTEME

Die erfindungsgemäßen chromogenen Enzym-Substratverbindungen sind nützlich bei analytischen Testsystemen, die die Messung der Menge des darin vorliegenden Enzyms erfordern, insbesondere solche analytische Testsysteme, die Enzymmarkierte Testreagezien verwenden. Solche analytische Testsysteme umfassen Enzym-Immuntests, die im Stand der Technik als Verdrängungs-Sandwich oder immunometrische Techniken bekannt sind, wo die Menge der Enzym-Markierung einer bestimmten Fraktion davon gemessen und der Menge des zu bestimmenden Analyten aus einer flüssigen Testprobe zugeordnet werden kann, sollen jedoch nicht darauf beschränkt sein.
Die Verwendung spezifischer bindender Substanzen, wie Antigene, Haptene, Antikörper, Lectine, Rezeptoren, Avidin und anderer bindender Proteine und Polynukleotide, markiert mit einem Enzym, sind in letzter Zeit entwickelt worden und auf die Messung von Substanzen in biologischen Flüssigkeiten angewendet worden (siehe z. B. Clin. Chem., Bd. 22, S. 1232 (1976); US-Reissue Patent Nr. 31 006; und UK-Patent Nr. 2 019 308). Im allgemeinen hängen solche Messungen von der Fähigkeit einer bindenden Substanz, z. B. eines Antikörpers oder eines Antigens, zur Bindung an einen spezifischen Analyten ab, worin ein markiertes Reagens, umfassend eine solche bindende Substanz, die mit einem Enzym markiert ist, zur Bestimmung des Ausmaßes einer solchen Bindung eingesetzt wird. Typischerweise wird das Bindungsmaß durch Messung der Menge des in der markierten Probe vorhandenen Enzym- Markierung bestimmt, die entweder bei der Bindungsreaktion mit dem Analyten teilnimmt oder nicht teilnimmt, worin die Menge des nachgewiesenen und gemessenen Enzyms der Menge des in der flüssigen Testprobe vorliegenden Analyten zugeordnet werden kann.
Die erfindungsgemäßen chromogenen Enzym-Substratverbindungen sind besonders geeignet in analytischen Testsystemen, wie zuvor beschrieben, wo eine analytische Testvorrichtung eine Trägermatrix enthält, die mit der erfindungsgemäßen chromogenen Enzym-Substratverbindung getränkt ist, wobei die Natur der Enzym-spezifischen Einheit davon natürlich von dem bestimmten zu messenden Enzym abhängt.
Die Natur des Materials einer solchen Trägermatrix kann jeder Substanz sein, die zur Aufnahme der chromogenen Enzym- Substratverbindung der vorliegenden Erfindung geeignet ist, wie solche, die für Reagensstreifen und Analysen in Lösung verwendet werden. Z. B. beschreibt US-PS 3 846 247 die Verwendung von Filz, porösen keramischen Streifen und verwebten oder verfilzten Glasfasern. Als Ersatz für Papier beschreibt US-PS 3 552 928 die Verwendung von Holzstäbchen, saugfähigem Material, Schwammaterial und tonhaltigen Verbindungen. Die Verwendung synthetischer Harzfliese und Glasfaserfilze anstelle von Papier wird in der GB-PS 1 369 139 vorgeschlagen, und GB-PS 1 349 623 lehrt die Verwendung eines hocht-premeablen Netzwerkes dünner Filamente als Abdeckung für eine darunterliegende Papiermatrix. Diese Druckschrift lehrt auch die Imprägnierung des Papiers als Teil eines Reagenssystems und die Imprägnierung des Netzwerks mit anderen möglicherweise inkompatiblen Reagenzien. FR-PS 2 170 397 beschreibt die Verwendung von Trägermatrizes mit mehr als 50 % Polyamidfasern. Ein weiterer Ansatz für Trägermatrizes wird in US-PS 4 046 513 beschrieben, worin das Konzept des Aufdruckens von Reagenzien auf eine geeignete Trägermatrix angewandt wird. US-PS 4 046 514 beschreibt die Verwebung oder Verknotung von Filamenten, die Reagenzien in einem Reaktantensystem tragen. Alle diese Trägermatrixkonzepte können erfindungsgemäß eingesetzt werden, wie auch andere. Vorzugsweise umfaßt die Trägermatrix ein saugfähiges Material, wie Filterpapier, wodurch die Lösung der erfindungsgemäßen chromogenen Enzym- Substratverbindung eingesetzt wird, um die Matrix zu imprägnieren. Sie kann auch ein System umfassen, das physikalisch die Testreagenzien umschließt, wie polymere Mikrokapseln, die dann nach Kontakt mit der Testprobe aufbrechen. Sie kann ein System umfassen, worin die Trägerreagenzien homogen mit der Trägermatrix in einer Flüssigkeit kombiniert werden, oder im halbflüssigen Zustand, welcher später härtet oder sich verfestigt, wodurch die Testreagenzien eingefangen werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Trägermatrix ein saugfähiges Material in Form einer Zone oder einer Schicht, die mit der chromogenen Enzym-Substratverbindung der vorliegenden Erfindung getränkt ist, welche dort eingesetzt wird, wo ein bestimmter Test in einer flüssigen Umgebung unter Einsatz unlöslicher Testreagenzien, die im Stand der Technik bekannt sind, durchgeführt wird, um die freie Spezies des markierten Reagenses von der gebundenen Spezies des markierten Reagenses abzutrennen. Nach einem solchen Testsystem wird ein Aliquot einer Flüssigkeit, die die freie Spezies enthält, entfernt, und auf eine Trägermatrix aufgebracht, worin die chromogene Enzym-Substratverbindung, die dort eingebracht wurde, mit der Enzym-Markierung des markierten Reagenses der freien Spezies aus der flüssigen Testprobe unter Erzeugung eines nachweisbaren Signals, das dann sichtbar beobachtet werden kann und/oder mit einem geeigneten Instrument, wie einem Spektralphotometer gemessen werden kann, in Wechselwirkung tritt.
In gleicher Weise kann eine Testvorrichtung, die zwei oder mehr Trägermatrizes in Form von z. B. einer obersten Schicht oder Zone und einer untersten Schicht oder Zone eingesetzt werden. Die unterste Schicht einer solchen Testvorrichtung kann mit der erfindungsgemäßen chromogenen Enzym Substratverbindung getränkt werden, worin eine flüssige Testprobe, die den zu messenden Analyten enthält, auf die oberste Schicht der Vorrichtung aufgebracht wird. Der Analyt, der darin diffundiert, nimmt an den notwendigen Bindungsreaktionen unter Erzeugung einer freien und gebundenen (d. h. immobilisierten) Spezies des Enzymmarkierten Reagens daran teil, wie zuvor beschrieben. Demnach wird die freie Spezies des so erzeugten markierten Reagens freigesetzt, um in die unterste Schicht zu wandern, wo die Enzym-Markierung der freien Spezies die enzymatisch abspaltbare Gruppe der erfindungsgemäßen chromogenen Enzym- Substratverbindung, die darin enthalten ist, unter Erzeugung eines meßbaren nachweisbaren Signals, wie zuvor beschrieben, abspaltet.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert, soll jedoch nicht darauf beschränkt sein. Kursive Zahlen in Klammern betreffen die Strukturformeln wie in den Figuren und/oder Beschreibung verwendet.

BEISPIELE

8-(Tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyloxy)-11-methyl-11H- dibenz[b,e][1,4]oxazepin-2-on (21) und 2-(Tetra-O-acetyl-β-D- galactopyranosyloxy)-11-methyl-11H-dibenz[b,f][1,4]oxazepin- 8-on (22)

Eine Mischung von 8-Hydroxy-11-methyl-11H- dibenz[b,e][1,4]oxazepin-2-on ("Methylpurpur") (20) (0,2 f; 0,83 mmol), hergestellt nach dem Verfahren von Hill et al., supra, Acetobromgalactose (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) (0,685 g; 1,66 mmol) und Silber-(I)-Oxid (Ag&sub2;O) (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, USA) (0,425 g; 1,66 mmol) wurde bei Raumtemperatur in wasserfreiem Chinolin (6,25 ml) und Ethylacetat (EtOAc) 2 ml) 16 Stunden in einem mit einem Stöpsel versehenen Kolben, der vor Lichteintritt geschützt wurde, gerührt. Die Reaktionsmischung wurde in EtOAc (ca. 40 ml) verdünnt, durch Cilite filtriert (Johns-Manville Corp., Denver, CO, USA) und mit kleinen Mengen 1 M HCl extrahiert, bis die Extrakte sauer waren (pH = 1). Die kombinierten wäßrigen Extrakte wurden mit EtOAc (25 ml) gewaschen, dann wurden die vereinigen EtOAc-Schichten mit Kochsalzlösung (20 ml) gewaschen, mit Natriumsulfat (Na&sub2;SO&sub4;) getrocknet, filtriert und bis zur Trockne im Vakuum eingedampft unter Erhalt eines gelbgoldenen Schaumes (0,8 g). Das Rohprodukt wurde auf Kieselgel (100 g) unter Verwendung von 7,5 % (V:V) Aceton in Chloroformlösung chromatographiert, und die beiden hellgelben Produktbanden (Rf = 0,28 und 0,34 auf den Kieselgelplatten, entwickelt mit Aceton:Chloroform [1:9]), wurden gesammelt, vereinigt und von Lösungsmittel unter Erhalt einer Mischung der Titelverbindungen als oranger Schaum befreit (9,44 g; 92 %).
IR (KBr) cm&supmin;¹ 2985, 1756, 1641, 1618, 1575, 1511, 1437, 1372, 1230, 1075.
¹H NMR (DMSO-d&sup6;) δ: 1,4-1,7 (m, 3H), 1,9-2,2 (m, 12H), 4,0- 4,2 (m, 2H), 4,45-4,55 (m, 1H), 5,1-5,4 (m, 4H), 5,6-5,76 (m, 1H), 5,85-5,9 (m, 1H), 6,4-7,7 (m, 5H).
¹³C NMR (DMSO-d&sup6;) ppm. 187,93, 187,51, 169,99, 169,93, 169,59, 169,27, 159,48, 158,56, 157,73, 151,67, 144,71, 142,38, 142,00, 140,69, 137,00, 136,48, 134,34, 134,11, 130,51, 130,16, 125,75, 125,64, 116,69, 116,63, 113,04, 112,95, 110,99, 107,38, 96,94, 76,72, 75,03, 70,76, 70,16, 68,19, 67,34, 61,59, 20,52, 17,62, 17,23 (17 zusammenfallende Banden).
Analyse: Berechnet für C&sub2;&sub8;H&sub2;&sub9;NO&sub1;&sub2;:
C, 58,84; H, 5,11; N, 2,45
Gefunden: C, 58,61; H, 5,31; N, 2,29

8-β-D-Galactopyranosyloxy-11-methyl-11H- dibenz[b,e][1,4]oxazepin-1-on (23) und 2-β-D- Galactopyranosyloxy-11-methyl-11H-dibenz[b,e][1,4]oxazepin-8- on (24)

Eine Lösung von (21) und (22) (0,41 g; 0,72 mmol) in Methanol von HPLC-Reinheit (25 ml) wurde bei Raumtemperatur mit Natriummethoxid (31 mg) behandelt, und man ließ 1,5 Stunden rühren. Die Reaktion wurde durch Zusatz von Essigsäure (ca. 25 ml) gelöscht, dann zur Trockne im Vakuum unter Erhalt eines orangen Festkörpers verdampft. Das Rohprodukt wurde auf Kieselgel (100 g) unter Verwendung von 15 % (V:V) Methanol in Chloroformlösungsmittel chromatographiert, und die hellorange Produktbande (Rf = 0,25 auf Kieselgelplatten, entwickelt mit Methanol:Chloroform [1:4]), wurde gesammelt und vom Lösungsmittel in Vakuum unter Erhalt einer Mischung der Titelverbindungen als rotoranger Festkörper befreit. Vakuumtrocknen für 2 Stunden bei 64ºC ergab die analytische Probe (0,195 g; 67 %).
IR (KBr) cm&supmin;¹ 3328, 2925, 2876, 1639, 1612, 1571, 1508, 1384, 1245, 12l9, 1085, 896, 880, 823, 791.
¹H NMR (DMSO-d&sup6;) δ: 1,4-1,7 (m, 3H), 3,3-3,75 (m, 7H), 4,5- 4,75 (m, 5H), 5,85-5,90 (m, 1H), 6,4-7,65 (m, 5.
¹³C NMR (DMSO-d&sup6;) ppm. 187,95, 187,51, 161,18, 159,34, 158,34, 158,67, 152,07, 151,61, 151,00, 144,76, 142,52, 142,11, 140,06, 136,96, 136,36, 134,28, 133,85, 130,31, 129,95, 125,00, 116,93, 116,84, 113,08, 113,04, 110,91, 107,36, 100,76, 100,59, 76,65, 75,94, 75,18, 73,34, 73,24, 70,21, 68,27, 68,19, 60,52, 60,44, 17,68, 17,30 (1 zusammenfallende Banden).
Analyse: Berechnet für C&sub2;&sub0;H&sub2;&sub1;NO&sub8;:
C, 59,55; H, 5,25; N, 3,47
Gefunden: C, 59,57; H, 5,48; N, 3,21
Bei Lösung in 50 mM Phosphatpuffer bei pH 7,4, enthaltend 5 mM Magnesiumchlorid (MgCl&sub2;) hatten Verbindungen (23) und (24) (Mischung) ein λmax von 454 nm (&epsi; = 22000) und 344 nm (&epsi; = 14000). In Gegenwart von β-Galactosidase wurde das Substrat in (20) mit einer Geschwindigkeit von (Kcat) von 1,32 x 10&sup4; mol x min&supmin;¹/mol x aktives Zentrum gespalten und zeigte eine Km von 0,075 mM.

8-Hydroxy-11,11-dimethyl-11H-dibenz[b,e][1,4]oxazepin-2-on (27) und 2-Hydroxy-11,11-dimethyl-11H- dibenz[b,e][1,4]oxazepin-8-on (28)

Eine Lösung von 2-(3'-Hydroxyphenyl)-1-propanol (25) (2,20 g; 14,45 mmol) (hergestellt wie von Bruce et al., J. Chem Soc. (C), 1627 [19663 beschrieben) und Na&sub2;B&sub4;O&sub2; 10H&sub2;O (Borax) (28 g; 73,42 mmol) in H&sub2;O (200 ml) bei Raumtemperatur wurde mit Benzochinonchlorimid (26) (2,0 g; 14,13 mmol) (hergestellt wie von Gibbs et al., Supplement Nr. 69 zur The Public Health Reports, Washington, DC [1928] beschrieben) und Tetrahydrofuran (5 ml) behandelt, anschließend ließ man 7 Tage rühren. Der Ansatz wurde dann mit 1 M HCl angesäuert und 4 mal mit EtOAc (125 ml) extrahiert. Die vereinigten EtOAc- Schichten wurden mit Kochsalzlösung gewaschen (100 ml), getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) filtriert und zur Trockne im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde auf Kieselgel (200 g) unter Verwendung von Aceton:Chloroform (1:9) Lösungsmittel chromatographiert; die rote Produktbande (Rf = 0,33) wurde gesammelt und vom Lösungsmittel im Vakuum unter Erhalt einer Mischung der Titelverbindungen als rotes Pulver (72 mg) befreit.
IR (KBr) cm&supmin;¹ 1634, 1614, 1556, 1311, 1213, 1180, 878.
¹H NMR (DMSO-d&sup6;/Raumtemperatur) δ: 1,52 (br s, 6H), 5,8-7,7 (v. br. m, 6H), 10,75 (br s, 1H).
¹H NMR (DMSO-d&sup6;/100ºC) δ: 1,53 (s, 6H), 2,98 (v.br.s, 1H) (OH), 6,13 (br.s, 1H), 6,57 (br.d, J=9,3 Hz, 1H), 6,66 (br.s, 1H), 6,72 (v.br.d., J=9,1 Hz, 1H), 7,28 (d, J=9,3 Hz, 1H), 7,44 (d, J=9,0 Hz, 1H).
EIMS, m/e (relative Intensität) 255 (M&spplus;, Basispeak), 240 (14,8), 226 (44,3), 212 (41,8), 210 (23,7), 198 (26,8), 184 (30,3)
Analyse: Berechnet für C&sub1;&sub5;H&sub1;&sub3;NO&sub3; 1/4 H&sub2;O:
C, 69,35; H, 5,24; N, 5,39
Gefunden: C, 69,54; H, 5,26; N, 5,38

8-(Tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyloxy)-11,11-dimethyl- 11H-dibenz[b,e][1,4]oxazepin-2-on (29) und 2-(Tetra-O-acetyl- β-D-galactopyranosyloxy)-11,11-dimethyl-11H- dibenz[b,f][1,4]oxazepin-8-on (30)

Eine Mischung von (27) und (28) (0,103 g; 0,4 mmol) Acetobromgalactose (,033 g; 2 Äquivalente) und Silber-(I)- Oxid (Ag&sub2;O) (0,188 g; 2 Äquivalente) wurde bei Raumtemperatur im wasserfreien Chinolin (7,0 ml) und EtOAc (2 ml) 18 Stunden in einem mit einem Stöpsel versehenen und vor Licht geschützten Kolben gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit EtOAc (ca. 40 ml) verdünnt, durch Cilite filtriert und 3 mal mit 1,0 M HCl (jeweils 30 ml) extrahiert. die vereinigten wäßrigen Extrakte wurden mit EtOAc (40 ml) gewaschen, anschließend wurden die vereinigen EtOAc-Schichten mit Kochsalzlösung (40 ml) gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;), filtriert und zur Trockne im Vakuum eingedampft. Das Rohprodukt wurde auf Kieselgel (39 g) unter Verwendung von Aceton in Chloroform (7:93) Lösungsmittel chromatographiert, und die beiden gelben Produktbanden (Rf = 0,38 und 0,43 auf Kieselgelplatten, entwickelt mit Aceton:Chloroform [1:9]), wurden gesammelt, vereinigt und von Lösungsmittel im Vakuum unter Erhalt einer Mischung der Titelverbindungen als oranger Schaum (0,216 g; 92 %) befreit.
IR (KBr) cm&supmin;¹ 1750, 1640, 1615, 1573, 1368, 1260, 1070, 955, 898.
¹H NMR (CDCl&sub3;) δ: 1,45-1,70 (m, 6H), 2,0-2,2 (m, 12H), 4,08- 4,26 (m, 3H), 5,10-5,20 (m, 2H), 5,45-5,55 (m, 2H), 6,00-7,70 (m, 6H)
¹³C NMR (CDCl&sub3;) ppm. 188,82, 188,50, 170,25, 170,04, 169,94, 169,26, 159,91, 158,00, 156,55, 151,67, 151,63, 150,56, 146,45, 145,38, 141,78, 140,19, 137,11, 136,59, 135,11, 130,70, 129,46, 129,31, 126,22, 124,96, 155,33, 115,28, 113,81, 112,76, 109,03, 98,54, 98,42, 80,14, 79,78, 71,29, 70,57, 68,32, 66,73, 61,42, 26,44, 26,23, 20,56 (17 zusammenfallende Banden).

8-β-D-Galactopyranosyloxy-11,11-dimethyl-11H- dibenz[b,e][1,4]oxazepin-2-on (31) und 2-β-D- Galactopyranosyloxy-11,11-dimethyl-11H- dibenz[b,f][1,4]oxazepin-8-on (32)

Eine Lösung von (29) und (30) (0,21 g; 0,358 mmol) in Methanol von HPLC-Reinheit (20 ml) wurde bei Raumtemperatur mit Natriummethoxid (22 mg) behandelt, und man ließ mehrere Stunden rühren. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Essigsäure (ca. 23 ml) gelöscht, dann zur Trockne im Vakuum verdampft. Das Rohprodukt wurde auf Kieselgel (60 g) unter Verwendung von Methanol: Chloroform (15:85) Lösungsmittel chromatographiert, und die orangen Produktbande (Rf = 0,23 auf Kieselgelplatten, entwickelt mit Methanol:Chloroform [1:4]) wurde gesammelt und vom Lösungsmittel im Vakuum unter Erhalt der Titelverbindungen als rotoranges Pulver (0,12 g; 80 %) befreit.
IR (KBr) cm&supmin;¹ 3416, 2926, 1634, 1612, 1567, 1503, 1385, 1292, 1227, 1074, 889.
¹H NMR (DMSO-d&sup6;) δ: 1,45-1,65 (m, 6H), 3,30-3,75 (m, 6H), 4,5 (v.br.d, J=1,4 Hz, 1H), 4,68 (br.q., J=6,7 Hz, 1H), 4,91 (v.br.s, 1H), 4,99 (t, J=6,9 Hz, 1H), 5,23 (v.br.s, 1H), 5,9- 7,7 (m, 6H).
¹³C NMR (DMSO-d&sup6;) ppm. 187,91, 187,76, 161,47, 159,68, 156,35, 150,61, 150,48, 150,31, 146,25, 145,62, 141,99, 140,91, 138,65, 137,23, 136,20, 134,09, 130,33, 129,19, 124,75, 116,15, 114,69, 113,32, 113,01, 108,65, 100,58, 100,42, 80,72, 79,99, 76,00, 75,78, 73,30, 73,24, 70,19, 68,26, 68,17, 60,52, 60,38, 26,01 (4 zusammenfallende Banden).
Analyse: Berechnet für C&sub2;&sub1;H&sub2;&sub3;NO&sub8; 1-1/2 H&sub2;O:
C, 56,75; H, 5,90; N, 3,15
Gefunden: C, 56,61; H, 5,82; N, 3,14

TESTVORRICHTUNG

Eine Testvorrichtung, die empfindlich auf das Vorliegen von β-Galactosidase in einer Testprobe war, wurde hergestellt. Die Testvorrichtung enthielt kleine rechteckige Teile von Filterpapier, die an einem Ende auf einem Kupplungsstreifen eines Polystyrolfilms aufgebracht wurde. Das Papier wurde mit verschiedenen Bestandteilen einschließlich (23) und (24) einem Puffer und anorganischen Salzen imprägniert. Ein 2- inch-breiter Streifen von Whatman-54-Filterpapier wurde in eine wäßrige Lösung enthaltend die folgenden Bestandteile getaucht:
0,6M NaEpps-Puffer (pH = 8,4)
4,0 mM MgCl&sub2;
Das Papier wurde dann über Nacht an der Luft getrocknet. Anschließend wurde das Papier in eine DMF-Lösung enthalten
15 mM (23) + (24)
getaucht.
Das Papier wurde dann an der Luft bei 50 bis 80ºC getrocknet. Es wurde ein gelbes Testpapier erhalten.
Ein Teil des getrockneten imprägnierten Papiers wurde in rechteckige Teile von 0,1 inch x 0,4 inch geschnitten und an einem Ende eines länglichen Polystyrolstreifens von 0,1 inch x 3,25 inch aufgebracht. Das Aufbringen des Papiers wurde erreicht unter Verwendung eines doppelt-starken doppelseitigen Klebstoffes (3M Company).
Lösungen von β-D-Galactosidase im pH 6,4 Kaliumphosphat/Citratpuffer wurden zu 0,025, 0,05, 0,075, 0,20, 0,125 und 0,15 IE/ml hergestellt. Drei analytische Testvorrichtungen wurde jeweils in eine Testlösung getaucht. Die entsprechenden analytischen Testvorrichtungen wurden dann in einen SERALYZER -Reflektions-Photometer (Miles, Inc., Elkhart, IN, USA) eingebracht und die Reflektion des Lichtes von der Testvorrichtung enthaltend das freigesetzte Chromogen (20) wurde bei 590 nm nach 70 bis 90 Sekunden gemessen, wobei die Reflektionswerte davon gegen die entsprechenden Testproben-Lösungskonzentrationen aufgetragen wurden, was eine lineare Dosis-Wirkungsbeziehung, wie in Fig. 4 dargestellt, zeigte.
Die Erfindung wurde besonders beschrieben und in Beispielen oben dargelegt. Viele andere Variationen und Modifikationen der Erfindung können gemacht werden, ohne von deren Geist und Umfang abzuweichen.

Claims

1. Chromogene Enzym-Substratverbindung der Formel:

worin Y eine Enzym-abspaltbare Gruppe bedeutet; W ist O oder S; und R und R', die gleich oder verschieden sein können, sind H, Alkyl oder Aryl.

2. Verbindung nach Anspruch 1, worin W gleich 0 ist.

3. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, worin R und R', die gleich oder verschieden sein können, H, Niederalkyl oder Phenyl sind, und worin vorzugsweise R und R' nicht gleichzeitig H oder Phenyl sein können.

4. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin Y ein Rest einer Verbindung Y-OH ist, enthaltend eine Enzymspezifische Einheit, ausgewählt aus Zuckern und Derivaten davon, aliphatischen und aromatischen Carbonsäuren und Phosphorsäure.

5. Verbindung nach Anspruch 4, worin eines von R und R' gleich H ist und das andere Niederalkyl ist, und worin vorzugsweise eines von R und R' gleich H ist und das andere Methyl ist, oder R und R' sind beide Methyl.

6. Verbindung nach Anspruch 4 oder 5, worin die Enzymspezifische Einheit ein Zucker oder ein Derivat davon ausgewählt aus α-D-Galactose, β-D-Galactose, α-D- Glycose, β-D-Glycose, α-D-Mannose, N-Acetylglucosamin und N-Acetylneuraminsäure ist.

7. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Enzym-spezifische Einheit eine Oligosaccharidkette von ca. 2 bis ca. 20 Monosaccharideinheiten ist.

8. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Enzym-spezifische Einheit eine N-geschützte Aminosäure oder ein Peptid von ca. 2 bis ca. 5 Aminosäureeinheiten ist, vorzugsweise N-Tosyl-L-alanin.

9. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Enzym-spezifische Einheit Phosphorsäure ist.

10. Verwendung der Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Bestimmung eines bestimmten Enzyms, das zur Abspaltung der Enzym-abspaltbaren Gruppe in der Lage ist.