DE3586999T2 - Verfahren zur bestimmung von leucinaminopeptidase (lap). - Google Patents
Verfahren zur bestimmung von leucinaminopeptidase (lap).Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für die Aktivitätsbestimmung des Enzyms Leucinaminopeptidase (nachstehend als LAP bezeichnet) sowie eine Zusammensetzung, die dabei verwendet werden kann.
- Es ist bekannt, daß bei der Bestimmung der LAP-Aktivität das Enzym mit einem geeigneten Substrat, das durch Bindung von Leucin an ein Chromogen erhalten wird, umgesetzt wird, wobei eine farbige Verbindung entsteht, die dann kolorimetrisch bestimmt wird.
- Zu den für diesen Zweck vorgeschlagenen Chromogenen gehören p-Nitroanilid, β-Naphthylamid, 4-Hydroxy-3-carboxyanilid, p-Hydroxyanilid, 4-N,N-Dialkylamino-3-carboxyanilid und 4-N,N-Dialkylaminoanilid.
- Die Löslichkeit dieser Verbindungen beträgt jedoch bestenfalls 6,5 mg/ml, und diese Löslichkeit regelt und begrenzt die Reaktionsgeschwindigkeit. Dieses Verfahren zur Bestimmung der LAP-Aktivität ist daher langsam, da zur Vervollständigung der enzymatischen Umsetzung ein langer Zeitraum erforderlich ist. Andere Nachteile liegen darin, daß die Ergebnisse durch andere Komponenten in der Probe beeinflußt werden, die Umsetzung unter stark alkalischen Bedingungen durchgeführt werden muß und die Empfindlichkeit aufgrund der niedrigen molaren Extinktionskoeffizienten der gebildeten Pigmente gering ist. Folglich ist insgesamt die Genauigkeit dieses Verfahrens zur Bestimmung der LAP-Aktivität gering.
- In GB-A-2 022 079 werden neue L-Leucyl-4-Hydroxyanilid- Derivate zur Verwendung bei der Bestimmung der LAP-Aktivität beschrieben, von denen geltend gemacht wird, daß sie von hoher Löslichkeit und Reaktivität sind und daß sie Probleme der damalig bekannten Chromogene bei der Bestimmung der LAP-Aktivität, nämlich Sicherheit, Reproduzierbarkeit, Stabilität, Reaktivität und Selektivität, überwinden. Die neuen in GB-A-2 022 079 beschriebenen L-Leucyl-4-hydroxyanilid-Derivate entsprechen der Formel
- in der der Rest R eine Carboxy- oder Sulfogruppe darstellt. Von den zwei beschriebenen Verbindungen (R ist gleich -COOH oder -SO&sub3;H) wird die höchste Substratreaktivität (263 Einheiten) der Verbindung L-Leucyl-3-sulfo-4-hydroxyanilid zugeschrieben.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, daß durch Verwendung von L-Leucinaniliden von Anilinderivaten mit einer sulfoalkyl-substituierten Aminogruppe in der 4-Position gute Ergebnisse erhalten werden. Solche Anilinderivate sind an sich bekannt und wurden als schnell diffundierende, farbbildende Entwicklungsmittel in photographischen Verfahren vorgeschlagen; siehe GB-A-1 309 133. L-Leucylanilide solcher Derivate sind jedoch nicht bekannt und gerade diese L-Leucinanilid-Derivate, die
- - sowohl als neue Verbindungen an sich, als auch als chromogene Substrate - bei der Bestimmung der LAP-Aktivität, den Gegenstand der vorliegenden Erfindung bilden, zeigen für diesen Zweck ausgezeichnete Löslichkeit und stellen ein Pigment von großer Stabilität und mit einem großen molekularen Extinktionskoeffizienten bereit, so daß es möglich ist die kolorimetrische Bestimmung des Pigments im sichtbaren Bereich des Spektrums durchzuführen.
- In Übereinstimmung mit einem Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird daher die LAP-Aktivität bestimmt, indem das Enzym mit einem Substrat der Formel (I):
- umgesetzt wird, in der Z die Gruppe (CH&sub3;)&sub2;CHCH&sub2;CH(NH&sub2;)- darstellt, R&sub1; ein Wasserstoffatom, einen Alkylrest oder einen substituierten Alkylrest bedeutet, R&sub2; einen Alkylen- oder Hydroxyalkylenrest darstellt, R&sub3; und R&sub4; gleich oder verschieden sind und ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine Nitrogruppe eine Hydroxylgruppe, eine Sulfogruppe, eine Carboxylgruppe, einen Alkylrest und einen Alkoxyrest oder ein Salz davon darstellen, zur Gewinnung einer Produktverbindung der Formel (II):
- in der R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; wie für Formel (I) definiert sind; und entweder durch Umsetzung der Verbindung der Formel (II) mit einem Chromogen zur Erzeugung eines Pigments oder Umwandlung der Verbindung der Formel (II) in eine Diazoniumsalz und Umsetzung des Diazoniumsalzes mit einem Kupplungsmittel zur Erzeugung eines Azofarbstoffes; und Messung der Absorption der farbigen Lösung, die das Pigment oder den Azofarbstoff umfasst.
- In Übereinstimmung mit einem anderen Gesichtspunkt stellt die Erfindung neue chromogene Substrate zur Bestimmung der LAP-Aktivität bereit, die Verbindungen der vorstehenden Formel (I) sind, sowie Reagenzlösungen zur Bestimmung der LAP- Aktivität, umfassend ein solches Substrat in Kombination mit entweder einem Chromogen, das mit dem Reaktionsprodukt dieses Substrats mit LAP unter Erzeugung eines Pigments reaktiv ist, oder mit einem Diazotierungsmittel, das damit reaktiv ist und dann mit einem Kupplungsmittel einen Azofarbstoff erzeugt.
- In der Definition von R&sub1;-R&sub4; schließt die Bezeichnung Alkylrest einen Alkylrest mit 1-5 Kohlenstoffatomen, wie zum Beispiel Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl- und Pentylrest, ein, Halogen schließt Chlor, Brom oder Jod ein, die Alkyleinheit in einem Alkoxyrest hat die gleiche Bedeutung wie es vorstehend für Alkylreste definiert wurde, der Alkylenrest schließt einen Alkylenrest mit 1-5 Kohlenstoffatomen, wie zum Beispiel Methylen-, Ethylen-, Tetramethylen und Pentamethylenrest, ein, die Alkyleneinheit eines Hydroxyalkylenrests hat die gleiche Bedeutung und zu den möglichen Substituenten in substituierten Alkylresten gehören Sulfo-, Hydroxyaryl-, Nitro-, Carboxyl- und Halogenreste, wie zum Beispiel Chlor oder Brom.
- Die Verbindungen (I) können nach dem folgenden Verfahren synthetisiert werden:
- wobei Z' ein Rest ist, der wie der Rest Z definiert ist, die Aminogruppe aber durch eine Aminoschutzgruppe geschützt ist. Beispiele geeigneter Schutzgruppen sind Benzyloxycarbonyl- und tert.-Butoxycarbonyl-(BOC-)reste.
- Ein Beispiel für Verbindung (III) ist N-BOC-L-Leucin. Als Verbindung (IV) können Phenylendiamin oder Phenylendiamine mit Substituenten, die mit den Resten R&sub3; oder R&sub4; der gewünschten Verbindung übereinstimmen, verwendet werden. Ein geeignetes Kondensationsmittel ist zum Beispiel DCC.
- Die erste Umsetzung wird bei Raumtemperatur bis zu einer Temperatur von 60ºC in einem Zeitraum von 1 bis zu 10 Stunden in einem organischen Lösungsmittel durchgeführt. Zu dem Reaktionsgemisch als solchem oder der daraus isolierten Verbindung (V) wird die Verbindung (VI) gegeben. Die zweite Umsetzung wird dann bei Raumtemperatur bis zu einer Temperatur von 60ºC in 15 bis zu 30 Stunden durchgeführt.
- Geeignete Beispiele für Verbindung (VI) werden später im "Referenz Beispiel 2(< gezeigt. Die gewünschte Verbindung (I) an sich, wird schließlich durch die Isolierung der Verbindung (VII) nach Vervollständigung der zweiten Umsetzung und Entfernung der Aminoschutzgruppe nach bekannter Art und Weise erhalten.
- Beispiele geeigneter Chromogene, die verwendet werden, um das Pigment durch Umsetzung mit der durch enzymatische Umsetzung gebildeten Verbindung (II) zu erzeugen, sind Amine, wie zum Beispiel N,N-Diethyl-m-toluidin, N-Ethyl-N-hydroxyethyl-mtoluidin, N-Ethyl-N-3-methylphenyl-N'-acetyl-ethylendiamin (EMAE), N-Ethyl-N-3-methylphenyl-N'-succinyl-ethylendiamin (EMSE), N,N-Di-3-sulfopropyl-m-toluidin, N-Ethyl-N-2-hydroxy-3- sulfopropyl-m-toluidin (TOOS), N,N-Dimethyl-m-toluidin, N-Ethyl- N-2-cyanoethyl-m-toluidin, N-(2-Hydroxy-3-sulfopropyl)-m toluidin, Anilinderivate, wie zum Beispiel N-Ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxy-anilin, N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfo propyl)-3,5-dimethoxy-anilin, N-Ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3- methoxy-anilin, N-Ethyl-N-2-cyanoethyl-anilin, N,N-Dimethylanilin und N,N-Diethyl-anilin sowie Phenole, wie zum Beispiel α- Naphthol, β-Naphthol, o- oder p-Bromphenol, o- oder m-Anisol, 2,6-Xylenol, 3,4-Xylenol, 2,5-Xylenol, 2,3-Xylenol und o- oder m-Kresol.
- Diese Chromogene werden in einer Konzentration von 0,01-5 mg/ml verwendet, zusammen mit einem oberflächenaktiven Mittel, wie zum Beispiel Triton X-100, Brij-35 und Brij-80 in einer Konzentration von 0,01-2%, besonders im Falle niedriger Löslichkeit des Chromogens.
- Zimtaldehyde, wie zum Beispiel p-N,N-Dimethylamino-zimtaldehyd, p-N,N-Diethylamino-zimtaldehyd, können ebenfalls als Chromogene in einer Konzentration von 0,01-100 mg/ml verwendet werden. In diesem Fall wird ein Azofarbstoff als Pigment erzeugt.
- In dem alternativen Verfahren der Überführung einer Verbindung (II) in ein Diazoniumsalz, können Natrium-, Kalium oder Ammoniumnitrit in Konzentrationen von 0,1-100 mg/ml verwendet werden, und als abschließende Kupplungsmittel können Phenole, wie zum Beispiel Phenol und 3,5-Xylenol, in einer Konzentration von 0,01-100 mg/ml verwendet werden.
- Wenn das erzeugte Pigment kein Azofarbstoff ist, wird die Umsetzung von Verbindung (II) mit einem Chromogen in der Regel in der Gegenwart eines Oxidationsmittels oder einer Oxidase durchgeführt.
- Beispiele geeigneter Oxidationsmittel sind anorganische Verbindungen, wie zum Beispiel Wasserstoffperoxide, Natrium- oder Kalium-metaperjodate, Natrium- oder Kalium-permanganate, Natrium- oder Kalium-dichromate, Natrium- oder Kalium-metavanadate, Pentacyano-Eisenkomplexe sowie Peroxysäuren, wie zum Beispiel Peressigsäure. Geeignete Oxidasen sind Wasserstoffperoxid-Peroxidase (HRP) und Oxidasen, wie zum Beispiel Ceruloplasmin und Laccase (E C. 1. 10. 3. 2.).
- Die anorganischen Qxidationsmittel können in einer Konzentration von 0,01-100 mg/ml und die Oxidasen in einer Konzentration von 0,1-10 U/ml verwendet werden.
- In den Tabellen 1 und 2 sind die Löslichkeit, Wellenlänge des Absorptionsmaximums, Empfindlichkeit und Stabilität der gebildeten Pigmente aufgeführt: TABELLE 1 Verbindung Nr. R&sub3; R&sub4; R&sub1; R&sub2; Kontrolle
- Die Zahlen in den Klammern bei den Resten R&sub3; und R&sub4; geben die Positionen dieser Reste am Benzolkern an. TABELLE 2 λmax (nm) SE ST(5) S(mg/ml) Kontrolle λmax: Wellenlänge des Absorptionsmaximums SE: Pigmentempfindlichkeit ST: Pigmentstabilität S: Löslichkeit
- Empfindlichkeit:
- 50 ul von 1 mM jeder freien Verbindung wurden zu 3 ml 0.1 M Phosphatpuffer, der 0,5 mg/ml EMSE und 1 U/ml Laccase enthielt, gegeben und bei 37ºC für 5 Minuten inkubiert. Die Absorption der Reaktionslösung wurde bei λmax gemessen. Als Kontrolle wurde 5-Aminosalicylsäure verwendet und die Umsetzung der Verbindung mit 2,6-Xylenol wurde in der Gegenwart von Metaperjodat unter stark alkalischen Bedingungen durchgeführt.
- Die Ergebnisse sind aufgeführt, wobei die Empfindlichkeit von 5-Aminosalicylsäure als 100 definiert wurde.
- Die enzymatische Umsetzung wird in der Regel in einer Pufferlösung mit einem pH von 6 bis 10, vorzugsweise bei 8, durchgeführt. Als Puffer kann Good-Puffer, Phosphatpuffer, Acetatpuffer usw. verwendet werden. Das vorliegende Verfahren ist sehr einfach und ausgezeichnet. Zum Beispiel ist die Löslichkeit des vorliegenden Substrats sehr hoch und es ist daher nicht nötig oberflächenaktive Mittel oder organische Lösungsmittel zur Steigerung der Löslichkeit hinzuzugeben. Die Absorptionsmessung wird bei einer Wellenlänge von 560 nm oder mehr durchgeführt und die Ergebnisse werden daher nicht durch andere Komponenten, die im Testserum vorhanden sind, beeinflußt. Da die Empfindlichkeit und Stabilität der vorliegenden Substrate ausgezeichnet sind, können genauere Ergebnisse erhalten werden.
- Ein anderer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung besteht aus einer Testzusammensetzung für die Bestimmung der LAP-Aktivität, die eine Verbindung der Formel (I) und ein Chromogen umfaßt. Die Zusammensetzung kann auch ein Oxidationsmittel, eine Oxidase, ein Diazotierungsmittel, ein Kupplungsmittel oder einen Puffer enthalten.
- Bestimmte besondere Ausführungsformen der Erfindung werden durch die folgenden charakteristischen Beispiele erläutert.
- Reagenzlösung (pH 7,3)
- Verbindung Nr. 2 0,03 g/ml
- EMSE 0,5 mg/ml
- Magnesiumnitrat 1 mg/ml
- Good-Puffer 8 mg/ml
- Laccase 1 U/ml
- 3 ml der Reagenzlösung wurde bei 37ºC zehn Minuten inkubiert. Zu der Lösung wurden 0,05 ml einer Serumprobe gegeben, das Gemisch wurde sofort gerührt und die Absorptionsänderung der Lösung wurde bei 745 nm eine Minute lang gemessen.
- Die LAP-Aktivität in der Probe kann nach der folgenden Gleichung berechnet werden:
- ΔE bedeutet das Maß der Absorptionsänderung pro Minute.
- Die gleichen wie vorstehend beschriebenen Verfahren wurden wiederholt, mit der Ausnahme das folgende Substanzen verwendet wurden.
- (a) Substrat : L-Leucyl-3-carboxy-4-hydroxy-anilid
- Oxidationsmittel : Natrium-metaperjodat
- Kupplungsmittel : p-Xylenol
- Wellenlänge für die Messung : 635 nm
- (b) Substrat : L-Leucyl-p-nitroanilid
- Kupplungsmittel : p-Dimethylamino-zimtaldehyd
- Wellenlänge für die Messung : 565 nm
- (c) Substrat : L-Leucyl-p-N,N-diethylaminoanilid
- Oxidationsmittel : Metaperjodat
- Kupplungsmittel : 1-Naphthol-2-sulfonsäure
- Wellenlänge für die Messung : 675 nm
- Das Maß der Absorptionsänderung innerhalb einer Minute wurde für zehn Proben gemessen und die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt. TABELLE 3 (a) (b) (c) Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung Serum
- Die Reagenzlösung des Beispiels 1, ausschließlich der Laccase, wurde verwendet.
- 3 ml der Reagenzlösung wurden bei 37ºC 10 Minuten inkubiert und zu dem Gemisch wurden 0,05 ml Serumprobe gegeben. Das Gemisch wurde sofort gerührt und bei 37ºC 10 Minuten inkubiert.
- Nachdem zehn Minuten vergangen waren, wurden
- (a) 0,03 ml einer (x-Naphthol/Methanol-Lösung (10 mg/ml) und 0,1 ml einer 1N-NaOH-Lösung, die 50 mg/ml Natrium-metaperjodat enthielt, zu der Lösung gegeben. Das Gemisch wurde bei 37ºC 10 Minuten inkubiert und die Absorption der Reaktionslösung wurde bei 600 nm gemessen.
- (b) 1 ml einer p-N,N-Dimethylamino-zimtaldehyd/Ethanol- Lösung (10 mg/ml) und 1 ml einer 0,4N HCl-Lösung zu der Lösung gegeben und das Gemisch bei 37ºC 10 Minuten inkubiert. Die Absorption der Reaktionslösung wurde bei 570 nm gemessen.
- (c) 0,5 ml IN HCl und 0,5 ml Natriumnitrit (1 mg/ml) zu der Lösung gegeben und das Gemisch bei 37ºC 10 Minuten inkubiert. Dann wurden dazu 0,1 ml einer 3,5-Xylenol/Ethanol- Lösung (1 mg/ml) gegeben und die Absorption der Reaktionslösung wurde bei 650 nm gemessen.
- Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufgeführt. TABELLE 4 (a) (b) (c) Beispiel 1 Serum Sensitivitätsverhältnis
- 2,49 g N-BOC-L-Leucin (nachstehend als BLL bezeichnet) wurden in 100 ml Dioxan gelöst. Zu der Lösung wurden 4,12 g DCC und 2,16 g p-Phenylendiamin (nachstehend als PDD bezeichnet) gegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 4 Stunden inkubiert. Das Gemisch wurde filtriert und das Filtrat unter reduziertem Druck bis zur Trockne konzentriert. Das Produkt wurde in Methanol/Wasser = 80/20 (vol/vol) erneut gelöst und einer Chromatographie unter Verwendung von Diaion HP-20 (hergestellt von Mitsubishi Chemical Industries Ltd.) und Methanol/Wasser = 80/20 als Eluierungsmittel unterzogen.
- Aus dem Eluat wurde unter reduziertem Druck Methanol entfernt, wobei N-BOC-L-Leucyl-p-aminoanilid in einer Ausbeute von 1,25 g erhalten wurde. 1 g des Produkts wurde in 50 ml Chloroform gelöst. Zu dem Gemisch wurden 2 ml Triethylamin und 5 g 1,3-Propansulton gegeben und das Gemisch wurde bei 50ºC einen Tag inkubiert. 50 ml Ethylether wurden zu dem Gemisch gegeben, das sich in zwei Schichten trennte. Zu der unteren Schicht wurden 5 ml Essigsäure und 20 ml 25% -Bromwasserstoff/Essigsäure zur Entfernung der BOC-Gruppe gegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur stehengelassen. Zu dem Gemisch wurden 50 ml Ethylether gegeben, wobei als ein Niederschlag L-Leucyl-p-N,N-disulfopropyl-aminoanilid HBr gebildet wurde. Nach Filtration mit einem Glasfilter wurde der Niederschlag in 50 ml Methanol gelöst und die Lösung mit 6N NaOH neutralisiert. Nach Entfernung des gebildeten NaCls durch Filtration, wurde zur Bildung eines Niederschlags Ethylether hinzugegeben. Der Niederschlag wurde durch Filtration abgetrennt, wobei 0,63 g der gewünschten Verbindung mit einem Schmelzpunkt von 221-223ºC erhalten wurde.
- Elementaranalyse
- Gefunden (%) C 46,29 H 6,58 N 9,07
- Berechnet (%) C 46,45 H 6,67 N 9,03
Claims (13)
1. Verfahren zur Bestimmung der Leucin-Aminopeptidase
(LAP)-Aktivität in einer Probe, umfassend das Umsetzen
des Enzyms mit einem Enzymsubstrat zur Gewinnung einer
Produktverbindung, die mit Hilfe einer colorimetrischen
Reaktion bestimmbar ist, gekennzeichnet durch die
folgenden Schritte: (a) Umsetzung des Enzyms mit einem
Enzymsubstrat der Formel (I):
in der Z die Gruppe (CH&sub3;)&sub2;CHCH&sub2;CH(NH&sub2;)- darstellt, R&sub1; ein Wasserstoffatom, einen Alkylrest oder einen
substituierten Alkylrest bedeutet, R&sub2; einen Alkylen- oder
Hydroxyalkylenrest darstellt, R&sub3; und R&sub4; gleich oder
verschieden sind und ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom,
eine Nitrogruppe, eine Hydroxylgruppe, eine Sulfogruppe,
eine Carboxylgruppe, einen Alkylrest und einen
Alkoxyrest oder ein Salz davon darstellen, zur Gewinnung einer
Produktverbindung der Formel (II):
in der R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; wie vorstehend definiert sind;
(b) Umsetzung der Verbindung der Formel (II) mit einem
Chromogen zur Erzeugung eines Pigments oder
Azofarbstoffes oder Umwandlung der Verbindung der Formel (II) in
ein Diazoniumsalz und Umsetzung des Diazoniumsalzes mit
einem Kupplungsmittels zur Erzeugung eines
Azofarbstoffes; und (c) Messung der Absorption der farbigen
Reaktionslösung.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt (b) die
Umsetzung der Verbindung (II) mit dem Chromogen in
Gegenwart eines Oxidationsmittels durchgeführt wird, wobei
diese Umsetzung ein gefärbtes Produkt ergibt, das kein
Azofarbstoff ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Oxidationsmittel
eine Oxidase ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei in den
Formeln (I) und (II) R&sub1; einen Sulfoalkylrest bedeutet.
5. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das in
Schritt (a) verwendete Enzymsubstrat
L-Leucyl-p-N,N-disulfopropylaminoanilid ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei in
Schritt (b) die Verbindung der Formel (II) mit einem
Amin, Anilinderivat oder einem Phenol als Chromogen
umgesetzt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Chromogen EMSE ist.
8. Verfahren nach Anspruch 1, 4 oder 5, wobei in Schritt
(b) die Verbindung der Formel (II) mit Zimtaldehyd
umgesetzt wird, so daß ein Azofarbstoff für die Messung in
Schritt (c) erzeugt wird.
9. Reagens für die Bestimmung der LAP-Aktivität, umfassend
eine Verbindung der Formel (I) gemäß der Definition in
Anspruch 1 und ein Chromogen, das mit dem
Reaktionsprodukt dieser Verbindung mit LAP unter Erzeugung eines
Pigments oder Azofarbstoffs reaktiv ist.
10. Reagens nach Anspruch 9, das weiterhin ein
Oxidationsmittel enthält.
11. Reagens nach Anspruch 10, wobei das Oxidationsmittel
eine Oxidase ist.
12. Reagens zur Bestimmung der LAP-Aktivität, umfassend eine
Verbindung der Formel (I) gemäß der Definition in
Anspruch 1 und ein Diazotierungsmittel, das mit dem
Reaktionsprodukt dieser Verbindung mit LAP reaktiv ist.
13. Verbindung nach Anspruch 1 gemäß der Definition in
Anspruch 1 oder ein Salz davon.
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Publications (2)
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Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2501801B2 (ja) * | 1986-10-07 | 1996-05-29 | ユニチカ株式会社 | γ−グルタミルトランスペプチダ−ゼ定量用試薬 |
| JPH07114709B2 (ja) * | 1987-11-13 | 1995-12-13 | 協和メデックス株式会社 | 酵素活性の定量法 |
| US5252458A (en) * | 1990-12-31 | 1993-10-12 | Symex Corp. | Method for visually detecting the presence of a virus in a clinical specimen |
| US5344753A (en) * | 1992-06-01 | 1994-09-06 | Eastman Kodak Company | Dry analytical element and method for the detection of an aminopeptidase or transpeptidase |
| US5741659A (en) * | 1996-01-04 | 1998-04-21 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Rapid microbial protease assay |
| US5719020A (en) * | 1996-09-25 | 1998-02-17 | Oklahoma Medical Research Foundation | 4,7-dialkoxy N-acetylneuraminic acid derivatives and methods for detection of influenza type A and B viruses in clinical specimens |
| US6303764B1 (en) | 1998-09-24 | 2001-10-16 | Zymetx, Inc. | Synthesis of 4,7-dialkyl chromogenic glycosides of N-acetylneuraminic acids |
| US6420552B1 (en) | 1999-09-10 | 2002-07-16 | Zymetx, Inc. | Syntheses of 4-alkyl chromogenic glycosides and 7-alkyl chromogenic glycosides of N-acetylneuraminic acids |
| EP2345636B1 (de) * | 2008-10-03 | 2016-03-30 | Ajinomoto Co., Inc. | Casr-agonist |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1153561A (en) * | 1966-01-18 | 1969-05-29 | Agfa Gevaert Nv | Improvements relating to the Producion of Colour Images |
| DE1673281C3 (de) * | 1967-08-28 | 1973-12-13 | Veb Arzneimittelwerk Dresden, X 8122 Radebeul | Verfahren zur Bestimmung von Leucinaminopeptidase |
| GB1176968A (en) * | 1967-09-08 | 1970-01-07 | Dresden Arzneimittel | Composition for the Determination of Enzymes |
| DE1931057C2 (de) * | 1969-06-19 | 1982-05-13 | Agfa-Gevaert Ag, 5090 Leverkusen | Verfahren zur Herstellung farbphotographischer Bilder |
| US3971769A (en) * | 1970-01-19 | 1976-07-27 | Crompton & Knowles Corporation | Sulfoalkyl aminophenyl disazo dyes |
| US4087331A (en) * | 1977-01-12 | 1978-05-02 | Coulter Electronics, Inc. | Colorimetric method for determining gamma-glutamyl transpeptidase and compositions useful therein |
| JPS53147034A (en) * | 1977-05-30 | 1978-12-21 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Gamma-glutamyl-p-aminoanilide derivatives and process for their preparation |
| JPS54157691A (en) * | 1978-06-01 | 1979-12-12 | Nitto Boseki Co Ltd | Novel substrate for measuring enzyme activity |
| JPS56148299A (en) * | 1980-04-18 | 1981-11-17 | Toyobo Co Ltd | Measuring method for activity value of gamma-glutamyl transpeptidase |
| JPS589698A (ja) * | 1981-07-10 | 1983-01-20 | Toyo Jozo Co Ltd | γ−グルタミルトランスペプチダ−ゼ活性測定用基質、およびそれを用いる活性測定法 |
| US4588836A (en) * | 1982-09-01 | 1986-05-13 | Toyo Jozo Kabushiki Kaisha | Novel synthetic substrate and assay method using the same |
| DE3234478A1 (de) * | 1982-09-17 | 1984-03-22 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Reagenz und verfahren zur bestimmung von (gamma)-glutamyltransferase |
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