DE68928496T2

DE68928496T2 - Zuckerester-Derivate, Reagenzien zur Messung der Hydrolase-Aktivität und Verfahren zur Messung der Hydrolase-Aktivität

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Publication number: DE68928496T2
Application number: DE68928496T
Authority: DE
Inventors: Shigenori C O Tsuruga Enzy Emi; Tsuneo C O Tsuruga Enzym Hanyu; Minoru C O Sapporo Br Kamimura; Toshio C O Sapporo Br Kurihara; Toshiyuki C O Sapporo B Nishio; Shinichi C O Tsuruga E Teshima; Hisao C O Sapporo Bre Yamamoto
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1988-06-17
Filing date: 1989-06-16
Publication date: 1998-04-16
Anticipated expiration: 2009-06-17
Also published as: JPH0676431B2; EP0346912B1; EP0346912A3; EP0346912A2; US6162614A; JPH01319493A; DE68928496D1

Description

Hintergrund der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich auf Zuckeresterderivate, Reagentien zur Messung der Aktivität von Lipasen, die die Zuckeresterderivate als Substrat umfassen, sowie Verfahren zur Messung der Aktivität von Lipasen.
JP-A-60-233560, von dem Abstracts in Patent Abstracts of Japan, Vol 10, Nr. 101, vom 17. April 1986 und in Chemical Abstracts, 1986, Vol 104, Abstr. 144640x zu finden sind, offenbart, daß Zuckerfettsäureester als Substrate zum Nachweis von Lipaseaktivität verwendet werden.
EP-A-0 135 758 offenbart Oligoglucosidderivate als Substrate für die Bestimmung von Amylase. Die Substrate sind Oligoglucoside, die 3 bis 8 Glucoseeinheiten enthalten, bei denen eine chromophore Gruppe an die Glucose des reduzierenden Endes gebunden ist und eine Hydroxygruppe an das Kohlenstoffatom an der 4- oder 6-Position der Glucose des nichtreduzierenden Endes gebunden ist, an die ein geradkettiger oder verzweigter Alkyl- oder Alkoylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder ein Phenyl gebunden wurde.
EP-A-0 085 348 bezieht sich auf Analysereagentien für die Bestimmung der Enzymaktivität von α-Amylase, α-Glucosidase β-Glucosidase usw. Die nichtreduzierende terminale Glucose des Substrats ist nicht modifiziert. Das offenbarte Substrat kann nicht als Substrat für die Bestimmung von Lipaseaktivität verwendet werden.
Die Diagnose verschiedener Krankheiten, wie Krankheiten der Bauchspeicheldrüse, erfolgt durch Messen der Aktivitäten von Lipasen und Esterasen, die in der Flüssigkeit, wie Serum, Urin und Bauchspeichel, enthalten sind.
Als Verfahren zur Messung der Aktivität von Lipasen sind zum Beispiel Verfahren bekannt, bei denen ein Olivenöl als Substrat verwendet wird. Zu diesen Verfahren gehören ein Verfahren, das das In-Kontakt-Bringen der Probe mit dem Olivenöl und das Durchführen einer alkalischen Titration der isolierten Fettsäuren umfaßt, sowie ein Verfahren, das das Messen der Änderung der Temperatur in der Olivenölemulsion als Index umfaßt. Diese Verfahren weisen jedoch einige Mängel auf, zum Beispiel, daß sich die Meßwerte bei diesen Verfahren je nach dem Unterschied in der Qualität des Olivenöls als Ausgangssubstanz und dem Unterschied in der Art der Herstellung der Emulsionen ändern, so daß die Reproduzierbarkeit unbefriedigend ist.
Die Verfahren zur Messung von Lipaseaktivitäten, die die Verwendung von α-Naphthylpalmitat als Substrat umfassen, weisen einige Probleme auf, zum Beispiel, daß es nicht möglich ist, das Substrat in einer ausreichenden Menge hinzuzufügen, um die Enzymaktivitäten zu messen, da das Substrat schwerlöslich ist, daß die Meßwerte je nach dem Unterschied in der Art der Herstellung der Substratlösung variieren und daß ihre Reproduzierbarkeit schlecht ist.
Die Verfahren zur Messung von Lipaseaktivitäten unter Verwendung eines synthetischen Thioesters, 2,3-Dimercaptopropan-l-oltributylat (BALB), als Substrat sind weit verbreitet, da ihre Reproduzierbarkeit und Genauigkeit besser sind. Sie weisen jedoch ebenfalls einige Probleme auf, zum Beispiel, daß der Fettsäureester als Substrat eine kurze Kette hat und das Substrat nicht nur durch Lipasen, sondern auch durch Esterasen hydrolysiert wird und den Verfahren daher die Substratspezifität fehlt. Außerdem weisen die Verfahren insofern noch weitere Mängel auf, als sie wegen der Notwendigkeit einer die Reaktion abbrechenden Flüssigkeit komplizierte Vorgehensweisen beinhalten und Verfahren zur Geschwindigkeitsbestimmung, die als für die Messung von Enzymaktivitäten als am besten geeignet gelten, nicht auf das Verfahren angewendet werden können.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, die oben genannten Probleme zu lösen und die Mängel zu überwinden. Das primäre Ziel ist es, Verbindungen bereitzustellen, die sich als Substrate eignen, die keine Variation in Abhängigkeit von der Qualität der Ausgangssubstanzen zeigen, eine eindeutige Struktur haben und eine ausgezeichnete Löslichkeit besitzen.
Das zweite und das dritte Ziel besteht darin, Reagentien zur Messung von Lipaseaktivitäten bereitzustellen bzw. ein Verfahren zur Messung dieser Aktivität bereitzustellen, das eine ausgezeichnete Reproduzierbarkeit und Empfindlichkeit aufweist und das die Messung nach einem Geschwindigkeitsbestimmungsverfahren mit einfacher Vorgehensweise erlaubt.

Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auffolgendes:
- ein Zuckeresterderivat der allgemeinen Formel (I)
G O-R&sub3; (I)
zur Bestimmung von Lipaseaktivität nach einem Verfahren, das die Schritte des Einwirkenlassens der Probe auf den Zuckerester (1) als Substrat in Gegenwart wenigstens eines Hilfsenzyms, das aus α-Glucosidase, Glucoamylase und β-Glucosidase ausgewählt ist, und des Messens der isolierten Phenolverbindung beinhaltet, wobei G für eine Gruppe der Formel (A)
oder eine Gruppe der Formel (B)
steht, wobei l 0 oder 1 bedeutet, wenigstens einer der Reste R&sub1; und R&sub2; einen Esterrest einer gesättigten oder ungesättigten Fettsäure mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen bedeutet und der übrige ein Wasserstoffatom oder eine Acetylgruppe bedeutet und R&sub3; eine Gruppe der Formel (C)
bedeutet, wobei X ein Halogenatom bedeutet, m eine ganze Zahl von 0 bis 4 bedeutet, Y eine Hydroxygruppe, eine Alkoxygruppe, eine carboxygruppe oder eine Sulfonsäuregruppe bedeutet, n 0 oder 1 bedeutet und Z eine Nitrogruppe oder Nitrovinylgruppe bedeutet, mit der Maßgabe, daß für e = 1 Fettsäuren, die 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthalten, von der Definition für R&sub1; und R&sub2; ausgenommen sind;
- Reagentien zur Messung von Lipaseaktivitäten, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie das Zuckeresterderivat (I) als Substrat enthalten;
- ein Verfahren zur Messung von Lipaseaktivität, umfassend das Einwirkenlassen einer Probe auf ein Zuckeresterderivat der allgemeinen Formel (I)
G O-R&sub3; (I)
wobei G für eine Gruppe der Formel (A)
oder eine Gruppe der Formel (B)
steht, wobei l 0 oder 1 bedeutet, wenigstens einer der Reste R&sub1; und R&sub2; einen Esterrest einer gesättigten oder ungesättigten Fettsäure mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen bedeutet und der übrige ein Wasserstoffatom oder eine Acetylgruppe bedeutet und R&sub3; eine Gruppe der Formel (C)
bedeutet, wobei X ein Halogenatom bedeutet, m eine ganze Zahl von 0 bis 4 bedeutet, Y eine Hydroxygruppe, eine Alkoxygruppe, eine Carboxygruppe oder eine Sulfonsäuregruppe bedeutet, n 0 oder 1 bedeutet und Z eine Nitrogruppe oder Nitrovinylgruppe bedeutet, als Substrat in Gegenwart wenigstens eines Hilfsenzyms, das aus α-Glucosidase, Glucoamylase und β-Glucosidase ausgewählt ist, und das Messen der isolierten Phenolverbindung, mit der Maßgabe, daß das in-vivo-Verfahren nicht beansprucht wird.
Das heißt, die vorliegende Erfindung betrifft Zuckeresterderivate (I), und zwar 4-Nitrophenyl- oder 4-(Nitrovinyl)phenyl-α-glucoside oder -maltooligoside, bei denen die Hydroxygruppe(n) an der 4-Position und/oder 6-Position der nichtreduktiven terminalen Glucose modifiziert ist (sind), und/oder 4-Nitrophenyl- oder 4- (Nitrovinyl)phenyl-β-glucoside oder -maltooligoside, bei denen die Hydroxygruppe(n) an der 4-Position und/oder 6-Position der nichtreduktiven terminalen Glucose modifiziert ist (sind), Reagentien, die das Zuckeresterderivat (1) als Substrat umfassen, sowie Verfahren zur Messung von Lipaseaktivitäten mit diesen Reagentien.
Das Maltooligosaccharid, das den Rahmen des Zuckeresterderivats (I) der vorliegenden Erfindung bildet, besteht aus 2 bis 3 Zuckereinheiten [siehe Formel (A)].
Als Maltooligosaccharid sind Maltose und Maltotriose zu bevorzugen.
Die Substituenten R&sub1; und R&sub2; des Glucosids oder der nichtreduktiven terminalen Glucose des Maltooligosaccharids können gleich oder verschieden sein. Wenn einer der beiden Reste R&sub1; und R&sub2; ein Fettsäureesterrest mit nicht weniger als 5 Kohlenstoffatomen ist, wird das Glucosid Maltooligosaccharid vorzugsweise als Substrat zur Messung der Lipaseaktivitäten verwendet.
Was R&sub1; und R&sub2; betrifft, so kann der Fettsäureesterrest gesättigt oder ungesättigt und geradkettig oder verzweigt sein.
Als Fettsäureester, die von diesen Fettsäureesterresten gebildet werden, seien erwähnt Stearolsäureester, Arachidonsäureester, Linolensäureester, Linolsäureester, Sorbinsäureester, Brassidinsäureester, Erucasäureester, Cetoleinsäureester, Elaidinsäureester, Ölsäureester, Undecylensäureester, Heptacosansäureester, Pentacosansäureester, Cerotinsäureester, Lignocerinsäureester, Behensäureester, Arachidinsäureester, Nonadecansäureester, Stearinsäureester, Heptadecansäureester, Palmitinsäureester, Pentadecansäureester, Myristinsäureester, Tridecansäureester, Laurinsäureester, Undecansäureester, Caprinsäureester, Pelargonsäureester, Caprylsäureester, Önanthsäureester, Capronsäureester, Valeriansäureester, Buttersäureester, Propionsäureester, Essigsäureester, Ameisensäureester, Isokrotonsäureester, Krotonsäureester und Acrylsäureester
R&sub3;, das ein Aglycon des modifizierten Glucosids oder Maltooligosids ist, ist eine Gruppe, die durch die oben genannte Formel (C) dargestellt wird.
Was X in Formel (C) betrifft, so umfaßt das Halogen ein Fluoratom, Chloratom, Bromatom und Iodatom, vorzugsweise ein Fluoratom oder Chloratom, und m ist eine ganze Zahl von 0 bis 4.
Y in Formel (C) steht für eine Hydroxygruppe, Alkoxygruppe, Carboxygruppe oder Sulfonsäuregruppe, und n ist 0 oder 1.
Was Y betrifft, so kann die Alkoxygruppe geradkettig oder verzweigt sein und ist vorzugsweise eine Niederalkoxygruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, für die Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy, Isopropoxy, n-Butoxy usw. spezielle Beispiele sind.
R&sub3; kann in einer Bindung des α-Typs oder des β-Typs an die Hydroxygruppe auf der 1-Position der nichtreduktiven terminalen Glucose gebunden sein.
Die Phenylgruppen mit der Formel, die durch die Formel (C) dargestellt wird, sind mit anderen Worten Nitro- oder Nitrovinylphenolreste. Als bevorzugte substituierte Phenole, die diese Gruppen bilden, seien zum Beispiel erwähnt 4-Nitrophenol, 2-Chlor-4-nitrophenol, 2-Fluor-4-nitrophenol, 2-Brom-4-nitrophenol, 2-Iod-4-nitrophenol, 2,6-Dichlor-4-nitrophenol, 2,6-Difluor-4-nitrophenol, 2,6-Dibrom-4-nitrophenol, 2,6-Diiod-4- nitrophenol, 2,3-Difluor-4-nitrophenol, 2,5-Difluor-4-nitrophenol, 2,3,6-Trifluor-4-nitrophenol, 4-(2'-Nitrovinyl)phenol, 2-Methoxy-4-(2'-nitrovinyl)phenol, 2-Hydroxy-4-(2'-nitrovinyl)phenol, 2-Fluor-4-(2'-nitrovinyl)phenol, 2-Chlor-4-(2'-nitrovinyl)phenol, 2-Brom-4-(2'-nitrovinyl)phenol, 2-Iod-4-(2'-nitrovinyl)phenol, 2,6-Difluor-4-(2'-nitrovinyl)phenol, 2,6-Dichlor- 4-(2'-nitrovinyl)phenol, 2,6-Dibrom-4-(2'-nitrovinyl)phenol und 2,6-Diiod-4-(2'-nitrovinyl)phenol.
Die oben genannten Zuckeresterderivate (1), d.h. modifizierte 4-Nitrophenyl- oder 4- (Nitrovinyl)phenyl-α-(oder β-) glucoside oder -maltooligoside, sind neue Verbindungen. Als bevorzugte dieser Verbindungen seien zum Beispiel die folgenden Verbindungen genannt.
Die folgenden Verbindungen werden zuweilen kurz so bezeichnet, wie es jeweils in den eckigen Klammern angegeben ist.
(1) 2-Fluor-4-nitrophenyl-6-O-oleoyl-β-D-glucopyranosid [Oleoyl-2-fluor-4-nitrophenyl-β-glucopyranosid];
(2) 4-Nitrophenyl-6-O-palmitoyl-α-D-glucopyranosid [Palmitoyl-4-nitrophenyl-α-glucopyranosid];
(3) 4-Nitrophenyl-4-O-acetyl-6-O-linoleoyl-O-α-D-glucopyranosyl-(1T4)-α-D-glucopyranosid [4-Acetyl-6-linoleoyl-4- nitrophenyl-α-maltosid];
(4) 2,3-Difluor-4-nitrophenyl-6-O-lauroyl-O-α-D-glucopyranosyl- (1T4)-β-D-glucopyranosid [6-Lauroyl-2,3-difluor-4-nitrophenyl-β-rnaltosid];
(5) 2-Methoxy-4-(2'-nitrovinyl)phenyl-6-O-acetyl-β-D-glucopyranosid [Acetyl-2-methoxy-4-(nitrovinyl)phenyl-β-glucopyranosid];
(6) 4-Nitrophenyl-4,6-O-diacetyl-O-α-D-glucopyranosyl-(1T4)-α- D-glucopyranosid [Diacetyl-4-nitrophenyl-α-maltosid];
(7) 2-Chlor-4-nitrophenyl-6-O-acetyl-O-β-D-glucopyranosid [Acetyl-2-chlor-4-nitrophenyl-β-glucopyranosid];
(8) 4-Nitrophenyl-6-O-pentanoyl-O-α-D-glucopyranosid [Pentanoyl-4-nitrophenyl-α-glucopyranosid];
(9) 4-Nitrophenyl-4,6-D-dipentanoyl-O-α-D-glucopyranosid [Dipentanoyl-4-nitrophenyl-α-glucopyranosid];
(10) 2-Fluor-4-nitrophenyl-6-O-butyroyl-O-β-D-glucopyranosid [Butyroyl-2-fluor-4-nitrophenyl-β-glucopyranosid].
Die Zuckeresterderivate (I) der vorliegenden Erfindung können zum Beispiel hergestellt werden, indem man die oben genannten Phenole (das Aglycon) nach einem an sich bekannten Verfahren unter Bildung einer O-glycosidischen Bindung des α-Typs oder β-Typs am reduktiven Terminus der Glucoside oder Maltooligosaccharide (z.B. Maltose, Maltotriose) reagieren läßt und anschließend die Hydroxygruppe(n) nur an der 6-Position und/oder 4-Position der nichtreduktiven terminalen Glucose selektiv nach einem an sich bekannten Verfahren mit der Fettsäure oder einem reaktiven Derivat davon, das R&sub1; und R&sub2; entspricht, verestert.
Die Verfahren zur Bindung der Phenole (des Aglycons) in einer Bindung des α-Typs können gewöhnlich nach dem Helferich-Verfahren [Methods in Carbohydrate Chemistry, Vol II, S. 345 (1963), oder Bull. Chem. Soc. Jpn., 54, 1985 (1981)] oder dazu analogen Verfahren durchgeführt werden. Die Verfahren zur Bindung in einer Bindung des β-Typs können nach dem Polyacylglycosylhalogenid-Verfahren [Angew. Chem., 86, 173 (1974)] oder dazu analogen Verfahren durchgeführt werden.
Als Veresterungsreaktion der Zuckerhydroxygruppen (der Hydroxygruppen an der 6-Position und/oder 4-Position der nichtreduktiven terminalen Glucose) mit den Fettsäuren oder ihren reaktiven Derivaten können in der Regel chemische Syntheseverfahren oder enzymatische Syntheseverfahren zur Anwendung kommen. Vorzugsweise können selektive Syntheseverfahren verwendet werden. Bei den Verfahren werden vorzugsweise Lipasen verwendet. Als bei diesen Reaktionen zu verwendende Lipasen kann jede Lipase verwendet werden, solange sie in der Lage ist, die Bildung von Monoestern zwischen den Zuckerhydroxygruppen und den Fettsäuren zu bewirken. Als spezielle Beispiele für solche Lipasen seien Lipasen von Mikroorganismen genannt, die zur Gattung Pseudomonas und zur Gattung Chromobacteriuzn gehören. Insbesondere seien Lipasen von Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas fragi und Chroniobacterium viscosuin erwähnt. Als handelsübliche Produkte dieser Lipasen gibt es Lipase P (hergestellt von Amano Pharmaceutical Inc.), Lipase B (hergestellt von Sapporo Breweries Limited), Lipase LP (hergestellt von Toyo Jozo Co., Ltd.). In der Regel können diese handelsüblichen Produkte verwendet werden. Die enzymatischen Reaktionen werden gewöhnlich bei 20 bis 30ºC durchgeführt. Vorzugsweise werden die Reaktionen unter Schütteln oder Rühren durchgeführt, damit die Enzyme richtig im ganzen Reaktionssystem verteilt werden können. Nach der Beendigung der Reaktionen werden die Enzyme durch Filtration gewonnen und können wiederholt verwendet werden. Als Reaktionslösungsmittel sind organische Lösungsmittel wäßrigen Lösungsmitteln vorzuziehen. Jedes trockene organische Lösungsmittel kann verwendet werden, und vorzugsweise werden zum Beispiel Acetonl Dioxan, Diethylether, Pyridin und Hexan verwendet. Obwohl bereits zahlreiche Veresterungsreaktionen durch Enzyme in organischen Lösungsmitteln bekannt sind [z.B. Proc. Natl. Acad. Sci. USAI 82, 3192 (1985)], kommen für die vorliegende Erfindung vorzugsweise Umesterungsreaktionen unter Verwendung von Fettsäureestern zur Anwendung. Als solche Fettsäureester werden hochgradig hydrophile Ester bevorzugt, zum Beispiel Vinylester, Phenylester, Tributyrylester und Trichlorethylester.
Die Herstellung der Diester in 4- und 6-Position kann in der folgenden Weise erfolgen. Zuerst können Dihydroxyverbindungen mit einer primären Hydroxygruppe in der 6-Position und einer sekundären Hydroxygruppe in der 4-Position hergestellt werden, indem man eine selektive Acetalisierung nur der 4- und der 6-Position der nichtreduktiven terminalen Glucose von Zuckerderivaten, die am reduktiven Terminus modifiziert sind, vornimmt und das Acetal an den Termini mit den anderen Hydroxygruppen, die mit einer anderen Schutzgruppe als Acylgruppen geschützt sind, entfernt. Durch Umwandlung der Dihydroxyverbindungen in ihre an der primären Hydroxygruppe auf der 6-Position monoveresterten Verbindungen durch eines der oben genannten enzymatischen Veresterungsverfahren und anschließende Veresterung der Hydroxygruppe auf der 4-Position durch ein chemisches Syntheseverfahren und Entfernung der Schutzgruppen können die an der 4- und 6-Position zweifach veresterten Verbindungen hergestellt werden. Die Acetalisierung an den Termini erfolgt über die Acetalverbindung mit Benzyliden oder Isopropyliden, die an die 4- und 6-Position gebunden sind, indem man zum Beispiel Benzaldehyd, Aceton und dergleichen in Gegenwart einer Lewis-Säure umsetzt. Als andere Schutzgruppen als Acylgruppen seien zum Beispiel erwähnt Benzylether, Allylether, Methoxymethylether und p-Bromphenacylether.
Die oben erwähnten Reagentien der vorliegenden Erfindung erlauben die Messung von Lipase- und Esterase-Aktivität durch Einwirkenlassen der Probe, die eine Lipase oder eine Esterase enthält, auf ein Zuckeresterderivat (I) als Substrat in Gegenwart wenigstens eines Hilfsenzyms, das aus α-Glucosidase, Glucoamylase und/oder β-Glucosidase ausgewählt ist, und Messen der isolierten Phenolverbindung.
Entsprechend enthalten die Reagentien der vorliegenden Erfindung die oben genannten Zuckeresterderivate (I) als Substrate, und sie enthalten gewöhnlich weiterhin ein Hilfsenzymsystem, das α-Glucosidasen, Glucoamylasen und/oder β-Glucosidasen einzeln oder in Kombination sowie, falls notwendig, weitere Additive umfaßt.
Die Herkunft der für die Messung zu verwendenden α-Glucosidasen, β-Glucosidasen und Glucoamylasen unterliegen keiner Einschränkung.
Vorzugsweise werden zum Beispiel α-Glucosidasen, die aus Hefen stammen, aus Mandeln erhaltene β-Glucosidasen und aus Rhizopus delemar erhaltene Glucoamylasen verwendet.
Wenn zum Beispiel ein Substrat verwendet wird, bei dem das Aglycon in einer Bindung des α-Typs gebunden ist (Substrat des α-Typs), verwendet man eine α-Glucosidase allein oder eine Kombination einer oi-Glucosidase und einer Glucoamylase als Hilfsenzymsystem. Wenn ein Substrat verwendet wird, bei dem das Aglycon in einer Bindung des β-Typs gebunden ist (Substrat des β-Typs), kann eine β-Glucosidase allein, eine Kombination einer α-Glucosidase und einer β-Glucosidase oder eine Kombination einer
α-Glucosidase, einer Glucoamylase und einer β-Glucosidase als Hilfsenzymsystem verwendet werden.
Ein Gemisch eines Zuckeresterderivats, bei dem das Aglycon in einer Bindung des α-Typs gebunden ist, und eines Zuckeresterdenvats, bei dem das Aglycon in einer Bindung des β-Typs gebunden ist, kann als Substrat verwendet werden.
Vorzugsweise umfassen die Reagentien der vorliegenden Erfindung Aktivierungsmittel für Lipasen und Stabilisatoren, wie Colipase, Cholate, Magnesiumsalze und Calciumsalze.
Zusätzlich können Puffersubstanzen, Tenside, Antiseptika und dergleichen hinzugefügt werden.
Bei der Messung der Lipase können Inhibitoren für die Esterase hinzugefügt werden.
Die Reaktionsgleichungen für die Substrate bei der Messung der Lipase- und Esteraseaktivität unter Verwendung der Reagentien der vorliegenden Erfindung werden anhand von 4-Acetyl-6-linoleoyl-4- nitrophenyl-α-(oder β-)maltosid als Beispiel erklärt.
(1) Wenn 4-Acetyl-6-linoleoyl-4-nitrophenyl-α-maltosid als Substrat verwendet wird
1. 4-Acetyl-6-linoleoyl-4-nitrophenyl-α-maltosid Lipase
4-Nitrophenyl-α-maltosid + Linoleinsäure + Essigsäure
2. 4-Nitrophenyl-α-maltosid α-Glucosidase und/oder Glucoamylase
4-Nitrophenol + Glucose
(2) Wenn 4-Acetyl-6-linoleoyl-4-nitrophenyl-β-maltosid als Substrat verwendet wird:
1. 4-Acetyl-6-linoleoyl-4-nitrophenyl-β-maltosid Lipase
4-Nitrophenyl-β-maltosid + Linoleinsäure + Essigsäure
2. 4-Nitrophenyl-α-maltosid α-Glucosidase und/oder Glucoamylase
4-Nitrophenyl-β-glucosid + Glucose
3. 4-Nitrophenyl-β-glucosid β-Glucosidase
4-Nitrophenol + Glucose
Durch Messung der bei den obigen Reaktionen isolierten Phenolverbindungen (im oben genannten Beispiel 4-Nitrophenol) in einer geeigneten Weise können die Lipaseaktivitäten gemessen werden. Wenn die isolierten Phenolverbindungen eine spektrale Absorption zeigen, die sich von der der Substrate unterscheidet, werden die Spektren des Reaktionsgemischs direkt gemessen. Wenn die von den Substraten isolierten Phenolverbindungen fast dieselbe spektrale Absorption zeigen, werden die Phenolverbindungen einer oxidativen Kondensation mit einem Färbemittell z.B. einer färbenden Substanz, wie 4-Aminoantipyrin, und Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Peroxidase unterzogenl und die Farbintensität wird gemessen.
Die vorliegende Erfindung kann als Reagens des Zwei-Flüssigkeiten-Typs, bei dem das Substrat [ein Zuckeresterderivat (1)] und das Hilfsenzym voneinander getrennt sind, und als Reagens des Eine-Flüssigkeit-Typs, bei dem das Substrat und das Hilfsenzym miteinander kombiniert sind, verwendet werden.
Im folgenden wird die vorliegende Erfindung anhand von erläuternden Arbeitsbeispielen speziell erklärt.

Beispiel 1

Synthese von 2-Fluor-4-nitrophenyl-6-O-oleoyl-β-D-glucopyranosid:

(1) In 60 ml Chloroform wurden 7,66 g (18,6 mmol) Tetra-O-acetylα-D-glucopyranosylbromid [M. Barczai-Martos, Nature, 165, 369 (1950)], 2,69 g (17,12 mmol) 2-Fluor-4-nitrophenol und 1,8 g Triethylbenzylammoniumbromid gelöst, und 8,5 ml (17 mmol) einer 2 N wäßrigen Lösung von Natriumhydroxid wurden zu dem Gemisch getropft, das sich in einem Ölbad von 60ºC befand und kräftig gerührt wurde. Man ließ das Gemisch so, wie es war, 3 Stunden lang reagieren. Nach dem Abkühlen wurden 80 ml Wasser zu dem Reaktionsgemisch gegeben, und das Gemisch wurde mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Schicht wurde getrocknet und konzentriert, was 6,5 g eines gelbroten Öls ergab. Bei Zugabe von 1 ml Methanol kristallisierten nadelförmige Kristalle, die aus einem Lösungsmittelgemisch aus Ether/Methanol (1:1) umkristallisiert wurden, was 5,0 92-Fluor-4-nitrophenyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β- D-glucopyranosid ergab. Ausbeute 60%.
(2) In 80 ml wasserfreiem Methanol wurden 3,6 g (7,38 mmol) des oben genannten Produkts suspendiert, und zu der Suspension wurden bei Raumtemperatur unter Rühren 4,0 ml (2,0 mmol) einer 0,5 N Natriummethoxid/Methanol-Lösung getropft. Nachdem das Gemisch 15 Minuten lang gerührt worden war, wurden 4 ml Kationenaustauscherharz Amberlyst 15 (H&spplus;-Typ) zu der erhaltenen blaßgelben Suspension gegeben. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das Austauscherharz wurde abfutriert und mit Methanol gewaschen. Das Filtrat und die Waschflüssigkeit wurden kombiniert und unter reduziertem Druck konzentriert, was weiße Kristalle ergab, die weiter aus Ethanol umkristallisiert wurden, was 2,28 g 2-Fluor-4-nitrophenyl-β-D-glucopyranosid in Form weißer nadelförmiger Kristalle ergab. Ausbeute 97%.
(3) In 40 ml Aceton wurden 0,32 g (1 mmol) des oben genannten Produkts, 1,075 g (3 mmol) Oleinsäurephenylester und 30 mg Lipase B (hergestellt von Sapporo Breweries Limited) suspendiert. Das Gemisch wurde 1 Tag lang bei 25ºC in einer Schüttelvorrichtung umgesetzt.
Nachdem das Enzym abfiltriert worden war, wurde das Filtrat konzentriert, was ein Rohprodukt in Form eines weißen Wachses ergab. Dieses Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie auf Silicagel (Merck Inc.) (5%Methanol/Dichlormethan) gereinigt, was 0,52 g 2-Fluor-4-nitrophenyl-6-O-oleoyl-β-glucopyranosid ergab. Ausbeute 79%.
Die physikalisch-chemischen Eigenschaften dieses Produkts sind unten gezeigt.
IR : νKBrmax 3460, 2925, 2850, 1730, 1530, 1350, 1290, 1080 cm&supmin;¹
¹H-NMR : δTMSCD30D (400MHz-NMR)
0.88 (t, 3H), 1.25 (m, 22H), 1.57 (m, 2H), 1.99 (m, 4H), 3.39 (t, 1H, J=9.7Hz: C&sub4;-H)1 3.53 (m, 2H: C&sub2; und C&sub3;-H), 3.73 (dt, 1H, J=9.5, 2Hz: C&sub5;-H), 4.22 (dd, 1H, J=12, 7Hz: C&sub6;-H), 4.44 (dd, 1H, J=12, 2Hz: C&sub6;-H), 5.16 (d, 1H, J=7,5Hz: C&sub1;-H, β-Typ ), 7.41 (t, 1H, J=9Hz), 8.06 (d, 2H, J=9Hz) ppm
[α]24D= 64,90 (Methanol, c=0.13)
UV=λmax 295nm (Methanol)

Beispiel 2

Synthese von 4-Nitrophenyl-6-O-palmitoyl-α-D-glucopyranosid:

In 40 ml Aceton wurden 0,3 g (1 mmol) handelsübliches 4-Nitrophenyl-α-D-glucopyranosid (hergestellt von Tokyo Kasei Ind., Ltd.), 0,85 g (3 mmol) Vinylpalmitat und 30 mg Lipase B suspendiert, und die Suspension wurde 1 Tag lang bei 25ºC in einer Schüttelvorrichtung umgesetzt. Nachdem das Enzym abfiltriert worden war, wurde das Lösungsmittel konzentriert, was ein Rohprodukt in Form eines weißen Wachses ergab, das durch Chromatographie auf Silicagel (5% Methanol/Dichlormethan) gereinigt wurde, was 0,458 g 4-Nitrophenyl-6-O-palmitoyl-α-D-glucopyranosid in Form eines weißen Wachses ergab. Ausbeute 81%.
Die physikalisch-chemischen Eigenschaften dieses Produkts sind unten gezeigt.
IR : νKBrmax 3550, 3050, 1720, 1360 cm&supmin;¹
¹H-NMR : δTMSCD30D (400MHz-NMR)
0.88 (t, 3H), 1.256 (m, 24H), 1.56 (m, 2H), 2.26 (t, 2H), 3.42 (dd, 1H, J=9, 1Hz: C&sub4;-H)1 3.69 (dd, 1H, J=10, 4Hz: C2-H), 3.77 (m, 1H: C&sub5;-H), 3.89 (dd, 1H, J-10, 1Hz: C&sub3;- H), 4.29 (m, 2H: C&sub6;-H), 5.62 (d, 1 H, J=3.7Hz: C&sub1;H α- Typ ), 7.22 (d, 2H, J=9Hz), 8.21 (d, 2H, J=9Hz) ppm
[α]24D= +109.1º (Methanol, c=0.10)
UV=λmax 295nm (Methanol)

Beispiel 3

Synthese von 4-Nitrophenyl-4-O-acetyl-6-O-linoleoyl-O-α-D-glucopyranosyl-(1T4)-α-D-glucopyranosid:

(1) Ein Kolben wurde mit 0,1 g (0,2 mmol) handelsüblichem p-Nitrophenyl-α-maltosid, 0,1 g (0,65 mmol) (Dimethoxymethyl)benzol, 10 ml Dimethylformamid und 10 mg p-Toluolsulfonsäurehydrat gefüllt, und der Kolben wurde an einem Rotationsverdampfer befestigt, der 1 Stunde lang in einem Wasserbad bei 60ºC unter reduziertem Druck betrieben wurde. Danach wurde die Temperatur des Wasserbades unter reduziertem Druck auf 100ºC erhöht, und DMF wurde abdestilliert. Zu dem so erhaltenen Rohprodukt gab man 10 ml Natriumhydrogencarbonat, und die blaßgelbe unlösliche Substanz (das entsprechende 4, 6-0-Benzylidenderivat) wurde abfiltriert.96 mg, Ausbeute 83%.
(2) In 30 ml Benzol wurden 90 mg des Produkts, 200 mg Methoxymethylchlorid und 10 mg Dusopropylethylamin gelöst, und die Lösung wurde 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nachdem das Lösungsmittel konzentriert worden war, wurde das Rohprodukt durch Chromatographie auf Silicagel gereinigt. Das erhaltene gereinigte Produkt wurde einer Hydrierung mit 5% Palladium/Kohle-Katalysator in Methanol unterzogen, und das Produkt wurde durch Chromatographie auf Silicagel gereinigt, was 101 mg der entsprechenden 4,6- Dihydroxyverbindung (eines farblosen Öls) ergab.
(3) Das oben genannte Produkt (90 mg) wurde gemäß Beispiel 1(3) mit Lipase B in das entsprechende 6-O-Linoleoylderivat umgewandelt. Das erhaltene Rohprodukt wurde in einem Gemisch von Pyndin/Essigsäureanhydrid (2 ml) gelöst, und die Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur umgesetzt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels wurde das erhaltene Rohprodukt in 5 ml Essigsäure gelöst, und dann wurde bei 0ºC ein Tropfen konz. Schwefelsäure hinzugefügt. Das Gemisch wurde 5 Minuten lang gerührt. Nach der Neutralisation wurde das Gemisch konzentriert und durch Säulenchromatographie auf Silicagel (8% Methanol/Dichlormethan) gereinigt, was 25 mg 4-Nitrophenyl-4-O-acetyl-6-O-linoleoyl-O-α-D- glucopyranosyl-(1T4)-α-D-glucopyranosid in Form eines weißen Wachses ergab.
Die physikalisch-chemischen Eigenschaften dieses Produkts sind unten gezeigt.
IR : νKBrmax 3430, 2920, 2850, 1716, 1600, 1510, 1350 cm&supmin;¹
¹H-NMR : δTMSCD30D
0.8 - 2.2 (m, 27H), 2.0 (s, 3H), 3.2 4.7 (m), 5.2 (d, 1H, J=3.8Hz), 5.7 (d, 1H, J=3.7Hz), 7.2 (d, 2H, J=7Hz), 8.2 (d, 2H, J=9Hz) ppm
[α]24D= +61º (Methanol, c=0.09))
UV=λmax 295nm (Methanol)

Beispiel 4

Synthese von 2,3-Difluor-4-nitrophenyl-6-O-lauroyl-O-α-D-glucopyranosyl-(1T4)-β-D-glucopyranosid:

(1) In 50 ml Dichlormethan wurden 5,0 g (7,1 mmol) Maltosidbromid, 2,3 g (14 mmol) 2,3-Difluor-4-nitrophenol und 1,5 g Triethylbenzylammoniumchlorid gelöst, und 3,8 ml (716 mmol) einer 2 N wäßrigen Lösung von Natriumhydroxid wurden zu der Lösung getropft, das sich in einem Ölbad von 40º0 befand und kräftig gerührt wurde. Man ließ das Gemisch 5 Stunden lang reagieren. Nachdem 100 ml Wasser zu dem Reaktionsgemisch gegeben worden waren, wurde das Gemisch mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Schicht wurde getrocknet und konzentriert, was ein rötlichbraunes Öl ergab, das durch Säulenchromatographie auf Silicagel gereinigt und aus Ethanol umkristallisiert wurde, was 3,3 g 2,3-Difluor-4-nitrophenyl-O-peracetyl-β-maltosid in Form weißer Kristalle ergab. Ausbeute 60%.
(2) In 80 ml wasserfreiern Methanol wurden 3,0 g (3,8 mmol) des genannten Produkts suspendiert, und zu der Suspension wurden bei Raumtemperatur unter Rühren 3,0 ml (1,5 mmol) einer 0,5 N Natriummethoxid/Methanol-Lösung getropft. Nachdem das Gemisch 15 Minuten lang gerührt worden war, wurden 4 ml des Kationenaustauscherharzes Amberlyst 15 (H&spplus;-Typ) zu der blaßgelben Lösung gegeben, und das Gemisch wurde 30 Minuten gerührt. Das Austauscherharz wurde abfiltriert und mit Methanol gewaschen. Das Filtrat und die Waschflüssigkeit wurden kombiniert und unter reduziertem Druck konzentriert, was weiße Kristalle ergab, die aus Ethanol umkristallisiert wurden, was 2,1 g 2,3-Difluor-4-nitrophenyl-β- maltosid in Form weißer Kristalle ergab. Ausbeute 90%.
(3) In 40 ml Dioxan wurden 0,46 g (1 mmol) des genannten Produkts, 0,68 g (3 mmol) Vinyllaurat und 30 ml Lipase B suspendiert, und die Suspension wurde 1 Tag lang bei 25ºC in einer Schüttelvorrichtung umgesetzt. Nachdem das Enzym abfiltriert worden war, wurde das Filtrat konzentriert, was ein Rohprodukt in Form eines weißen Wachses ergab, das durch Säulenchromatographie auf Silicagel gereinigt wurde, was 0,35 g 2,3-Difluor-4- nitrophenyl-6-O-lauroyl-O-α-D-glucopyranosyl-(1T4)-β-D-glucopyranosid ergab. Ausbeute 50%.
Die physikalisch-chemischen Eigenschaften dieser Verbindung sind unten gezeigt.
IR : νKBrmax 3450, 3130, 3100, 1730, 1530, 1290, 1080 cm&supmin;¹
¹H-NMR : δTMSCD30D
0.9 (t, 3H), 1.3 (m, 16H), 1.5 (m, 2H), 2.3 (m, 2H), 3.2 - 4.7 (m), 5.2 (d, 1H, J=4Hz), 5.7 (d, 1H, J=8Hz), 7.3 (t, 1H), 8.0 (t, 1H) ppm
[α]24D= -69.0º (Methanol, c=0.10)
UV=λmax 298nm (Methanol)

Beispiel 5

Ein Reagens mit der folgenden Zusammensetzung wurde hergestellt.

Reagenszubereitung A:

50 mM Good-Puffer (pH 8,5)
Natriumcholat 0,1%
β-Glucosidase 100 E/ml
Oleoyl-2-fluor-4-nitrophenyl-β-glucopyranosid 1 mM

Reagenszubereitung B:

50 mM Good-Puffer (pH 8,5)
Natriumcholat 0, 1%
α-Glucosidase 50 E/ml
Palmitoyl-4-nitrophenyl-α-glucopyranosid 1 mM

Reagenszubereitung C:

50 mM Good-Puffer (pH 8,5)
Natriumcholat 0, 1%
α-Glucosidase 100 E/ml
4-Acetyl-6-linoleoyl-4-nitrophenyl-α-maltosid 1 mM

Reagenszubereitung D:

50 mM Good-Puffer (pH 8,5)
Natriumcholat 0, 1%
α-Glucosidase 100 E/ml
Glucoamylase 10 E/ml
β-Glucosidase 50 E/ml
β-Lauroyl-2,3-difluor-4-nitrophenyl-β-maltosid 1 mM
Unter Verwendung dieser Reagentien wurden Lipaseaktivitäten gemessen.
Die Reagentien (jeweils 3 ml) wurden zu 100 µl (1) Pankreas- Lipase-Lösung und (2) Serumprobe gegeben, und die Gemische wurden 4 bis 5 Minuten lang bei 37ºC stehen gelassen. Danach wurde die Änderung der Extinktion pro Minute (als Index für die Lipaseaktivität) abgeschätzt, indem die Änderung der Extinktion bei 400 nm gemessen wurde. Die zeitliche Anderung des Reagensblindwertes und die Anderung der Extinktion pro Minute sind in Tabelle 1 gezeigt. (Für den Blindwert wurde Wasser anstelle der Proben verwendet.) Tabelle 1
Die Reagentien A, B, C und D der vorliegenden Erfindung zeigen wenig Anderung des Blindwertes und besitzen eine ausreichende Meßempfindlichkeit, um die Lipaseaktivität in den Proben zu messen.

Beispiel 6

Synthese von 2-Methoxy-4-(2'-nitrovinyl)phenyl-6-O-acetyl-β-D- glucopyranosid:

(1) Gemäß Beispiel 1 wurden 2,0 g (4,8 mmol) Tetra-O-acetyl-α-D- glucosylbromid, 0,9 g (5,9 mmol) O-Vanilin und 0,5 g Triethylbenzylammoniumbromid in 25 ml Chloroform gelöst, und 5 ml (5 mmol) einer 1 N wäßrigen Lösung von Natriumhydroxid wurden bei Raumtemperatur unter kräftigem Rühren zu dem Gemisch getropft. Man ließ das Gemisch über Nacht reagieren. Wasser (50 ml) wurde zu dem Reaktionsgemisch gegeben, und das Gemisch wurde mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Schicht wurde getrocknet und konzentriert, was ein blaßgelbes Öl ergab. Man ließ das Öl ruhig stehen, damit es kristallisierte. Die Kristalle wurden aus einer wäßrigen Lösung von Aceton umkristallisiert, was 1,4 g 2-Methoxy-4-formylphenyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosidinform weißer Kristalle ergab. Ausbeute 60%.
(2) In 50 ml Methanol wurden 0,96 g (2 mmol) des genannten Produkts suspendiert, und 1 ml (0,5 mmol) einer 0,5 N Natriummethoxid/Methanol-Lösung wurde bei Raumtemperatur unter Rühren hinzugetropft. Fünfzehn Minuten später wurden 2 ml Amberlyst 15 (H&spplus;-Typ) hinzugefügt, und man ließ das Gemisch 30 Minuten lang reagieren. Das Austauscherharz wurde abfiltriert und mit Methanol gewaschen. Das Filtrat und die Waschflüssigkeit wurden kombiniert und unter reduziertem Druck konzentriert, was 0,58 g weiße Kristalle ergab. Ausbeute 92%.
(3) Das Produkt [0,31 g (1 mmol)] wurde in 10 ml Methanol suspendiert, und 1,2 ml Nitromethan, 0,2 ml Essigsäure und 0,2 g Ammoniumacetat wurden zu der Suspension gegeben. Das Gemisch wurde 30 Minuten unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen wurden blaßgelbe Kristalle abgeschieden, was 0,3 g (85%) 2-Methoxy-4- (2'-nitrovinyl)phenyl-β-D-glucopyranosid ergab.
(4) In 40 ml Aceton wurden 0,34 g (1 mmol) des genannten Produkts, 0,34 g (4 mmol) Vinylacetat und 30 mg Lipase B suspendiert, und die Suspension wurde 1 Tag lang bei 25ºC in einer Schüttelvorrichtung umgesetzt. Das Enzym wurde abfiltriert, und das Filtrat wurde konzentriert. Danach wurde aus Ethanol umkristallisiert, was 200 mg blaßgelbes 2-Methoxy-4-(2'-nitrovinyl)phenyl-6-O-acetyl-β-D-glucopyranosid ergab. Ausbeute 52%.
Die physikalisch-chemischen Eigenschaften dieser Verbindung sind unten gezeigt.
¹H-NMR : δTMSCD30D
2.03 (s, 3H), 3.3 - 3.9 (m, 4H), 3.8 (s, 3H), 4.3 (m, 2H), 5.4 (d, 1H, J=8Hz), 7.0 (d, 1H, J=9Hz), 7.44 (dd, 1H), 7.5 (d, 1H, J=14Hz), 7.7 (d, 1H), 7.9 (d, 1H, J=14Hz)

Beispiel 7

Reagentien mit den folgenden Zusammensetzungen wurden hergestellt.

Reagenszubereitung A:

50 mM Good-Puffer (pH 8,0)
Natriumcholat 0,1%
β-Glucosidase 100 E/ml
Acetyl-2-methoxy-4-(nitrovinyl)phenyl-β-glucopyranosid 1 mM

Reagenszubereitung B:

50 mM Good-Puffer (pH 8,0)
Natriumcholat 0, 1%
α-Glucosidase 100 E/ml
Diacetyl-4-nitrophenyl-α-maltosid 1 mM

Reagenszubereitung C:

50 mM Good-Puffer (pH 8,0)
Natriumcholat 0, 1%
α-Glucosidase 100 E/ml
Acetyl-2-chlor-4-nitrophenyl-β-glucopyranosid 1 mM

Reagenszubereitung D:

50 mM Good-Puffer (pH 8,0)
Natriumcholat 0, 1%
α-Glucosidase 100 E/ml
Pentanoyl-4-nitrophenyl-α-glucopyranosid 1 mM

Reagenszubereitung E:

50 mM Good-Puffer (pH 8,0)
Natriumcholat 0, 1%
α-Glucosidase 100 E/ml
Dipentanoyl-4-nitrophenyl-α-glucopyranosid 1 mM

Reagenszubereitung F:

50 mM Good-Puffer (pH 8,0)
Natriumcholat 0,1%
β-Glucosidase 100 E/ml
Butyroyl-2-fluor-4-nitrophenyl-β-glucopyranosid 1 mM
Die Substrate der vorliegenden Erfindung haben die Eigenschaften, daß sie eine eindeutige Struktur haben, da es sich bei R&sub1; und/oder R&sub2; in Formel (I) um einen speziellen Fettsäureesterrest handelt, daß sie nur eine geringe Anderung in Abhängigkeit von der Ausgangssubstanz zeigen und daß sie eine ausgezeichnete Löslichkeit in Wasser aufweisen.
Die Messung mit den Reagentien der vorliegenden Erfindung kann kontinuierlich unter Verwendung eines Analyseautomaten durchgeführt werden und erlaubt eine einfache und kostengünstige Messung von Lipaseaktivitäten.

Claims

1. Zuckeresterderivat der allgemeinen Formel (I)

G O-R3 (I)

zur Bestimmung von Lipaseaktivität nach einem Verfahren, das die Schritte des Einwirkenlassens der Probe auf den Zuckerester (I) als Substrat in Gegenwart wenigstens eines Hilfsenzyms, das aus α-Glucosidase, Glucoamylase und β-Glucosidase ausgewählt ist, und des Messens der isolierten Phenolverbindung beinhaltet, wobei G für eine Gruppe der Formel (A)

oder eine Gruppe der Formel (B)

steht, wobei l 0 oder 1 bedeutet, wenigstens einer der Reste R&sub1; und R&sub2; einen Esterrest einer gesättigten oder ungesättigten Fettsäure mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen bedeutet und der übrige ein Wasserstoffatom oder eine Acetylgruppe bedeutet und R3 eine Gruppe der Formel (C)

bedeutet, wobei X ein Halogenatom bedeutet, m eine ganze Zahl von 0 bis 4 bedeutet, Y eine Hydroxygruppe, eine Alkoxygruppe, eine Carboxygruppe oder eine Sulfonsäuregruppe bedeutet, n 0 oder 1 bedeutet und Z eine Nitrogruppe oder Nitrovinylgruppe bedeutet,

mit der Maßgabe, daß für l = 1 Fettsäuren, die 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthalten, von der Definition für R1 und R&sub2; ausgenommen sind.

2. Verbindung gemäß Anspruch 1, die ausgewählt ist aus:

(1) 2-Fluor-4-nitrophenyl-6-O-oleoyl-β-D-glucopyranosid [Oleoyl-2-fluor-4-nitrophenyl-β-glucopyranosid];

(2) 4-Nitrophenyl-6-O-palmitoyl-α-D-glucopyranosid [Palmitoyl-4-nitrophenyl-α-glucopyranosid];

(3) 4-Nitrophenyl-4-O-acetyl-6-O-linoleoyl-O-α-D-glucopyranosyl-(1T4)-α-D-glucopyranosid [4-Acetyl-6-linoleoyl-4-nitrophenyl-α-maltosid];

(4) 2,3-Difluor-4-nitrophenyl-6-O-lauroyl-O-α-D-glucopyranosyl-(1T4)-ß-D-glucopyranosid [6-Lauroyl-2,3-difluor- 4-nitrophenyl-β-maltosid];

(5) 2-Methoxy-4-(2'-nitrovinyl)phenyl-6-O-acetyl-β-D- glucopyranosid [Acetyl-2-methoxy-4-(nitrovinyl)phenyl- β-glucopyranosid];

(6) 4-Nitrophenyl-4,6-O-diacetyl-O-α-D-glucopyranosyl(1T4)-α-D-glucopyranosid [Diacetyl-4-nitrophenyl-α- maltosid];

(7) 2-Chlor-4-nitrophenyl-6-O-acetyl-O-β-D-glucopyranosid [Acetyl-2-chlor-4-nitrophenyl-β-glucopyranosid];

(8) 4-Nitrophenyl-6-O-pentanoyl-O-α-D-glucopyranosid [Pentanoyl-4-nitrophenyl-α-glucopyranosid];

(9) 4-Nitrophenyl-4,6-O-dipentanoyl-O-α-D-glucopyranosid [Dipentanoyl-4-nitrophenyl-α-glucopyranosid];

(10) 2-Fluor-4-nitrophenyl-6-O-butyroyl-O-β-D-glucopyranosid [Butyroyl-2-fluor-4-nitrophenyl-β-glucopyranosid].

3. Reagens zur Messung von Lipaseaktivität nach einem Verfahren, das die Schritte des Einwirkenlassens der Probe auf ein Substrat in Gegenwart wenigstens eines Hilfsenzyms, das aus α-Glucosidase, Glucoamylase und β-Glucosidase ausgewählt ist, und des Messens der isolierten Phenolverbindung beinhaltet, wobei das Reagens dadurch gekennzeichnet ist, daß es als Substrat ein Zuckeresterderivat gemäß Anspruch 1 oder 2 enthält.

4. Reagens zur Messung von Lipaseaktivität gemäß Anspruch 3, das weiterhin ein Hilfsenzym enthält.

5. Reagens zur Messung von Lipaseaktivität gemäß Anspruch 4, wobei das Zuckeresterderivat eine Verbindung ist, bei der das Aglycon in einer Bindung des α-Typs gebunden ist, und es sich bei dem Hilfsenzym um α-Glucosidase allein oder um eine Kombination von α-Glucosidase und Glucoamylase handelt.

6. Reagens zur Messung von Lipaseaktivität gemäß Anspruch 4, wobei das Zuckeresterderivat eine Verbindung ist, bei der das Aglycon in einer Bindung des β-Typs gebunden ist, und es sich bei dem Hilfsenzym um β-Glucosidase allein oder um eine Kombination von α-Glucosidase und β-Glucosidase oder eine Kombination von α-Glucosidase, Glucoamylase und β-Glucosidase handelt.

7. Verfahren zur Messung von Lipaseaktivität, umfassend das Einwirkenlassen einer Probe auf ein Zuckeresterderivat der allgemeinen Formel (I)

G O-R&sub3; (1)

wobei G für eine Gruppe der Formel (A)

oder eine Gruppe der Formel (B)

steht, wobei l 0 oder 1 bedeutet, wenigstens einer der Reste R&sub1; und R&sub2; einen Esterrest einer gesättigten oder ungesättigten Fettsäure mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen bedeutet und der übrige ein Wasserstoffatom oder eine Acetylgruppe bedeutet und R&sub3; eine Gruppe der Formel (C)

bedeutet, wobei X ein Halogenatom bedeutet, m eine ganze Zahl von 0 bis 4 bedeutet, Y eine Hydroxygruppe, eine Alkoxygruppe, eine Carboxygruppe oder eine Sulfonsäuregruppe bedeutet, n 0 oder 1 bedeutet und Z eine Nitrogruppe oder Nitrovinylgruppe bedeutet, als Substrat in Gegenwart wenigstens eines Hilfsenzyms, das aus α-Glucosidase, Glucoamylase und β-Glucosidase ausgewählt ist, und das Messen der isolierten Phenolverbindung, mit der Maßgabe, daß das in-vivo-Verfahren nicht unter den Anspruch fällt.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei das Zuckeresterderivat der allgemeinen Formel (I) ausgewählt ist aus:

(4) 2,3-Difluor-4-nitrophenyl-6-O-lauroyl-O-α-D-glucopyranosyl-(1T4)-β-D-glucopyranosid L6-Lauroyl-2,3-difluor- 4-nitrophenyl-β-maltosid];

(9) 4-Nitrophenyl-4,6-O-dipentanoyl-O-α-D-glucopyranosid Ldipentanoyl-4-nitrophenyl-α-glucopyranosid];