DE69021885T2

DE69021885T2 - Mutanten des menschlichen plasminogenaktivator-inhibitors 1 (pai-1), ihre herstellung und verwendung.

Info

Publication number: DE69021885T2
Application number: DE69021885T
Authority: DE
Inventors: Hans Pannekoek
Original assignee: Stichting Centraal Laboratorium Van de Bloedtransfusiedienst Van
Current assignee: Stichting Centraal Laboratorium Van de Bloedtransfusiedienst Van
Priority date: 1989-10-03
Filing date: 1990-10-03
Publication date: 1996-05-02
Anticipated expiration: 2010-10-04
Also published as: WO1991005048A1; DK0494929T3; ATE126828T1; NL8902454A; DE69021885D1; EP0494929A1; ES2078979T3; JPH05503211A; EP0494929B1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der genetischen Technik unter Verwendung der Rekombinant-DNA-Technik, dem Aufbauen und Herstellen modifizierter Enzyme und dem Verwenden dieser modifizierten Enzyme in der Medizin.
Im speziellen bezieht sich die Erfindung auf Mutanten des menschlichen Plasminogenaktivator-Inhibitors (PAI-1) mit veränderter Spezifizität gegenüber Serinprotease und auf ein Verfahren für die Herstellung derartiger Mutanten unter Verwendung genetisch hergestellter Organismen, im speziellen Mikroorganismen, und die Verwendung der Mutanten in fibrinolytischer/thrombolytischer Therapie mit einem Plasminogenaktivator.
Es hat sich herausgestellt, dass eine fibrinolytische Therapie mit einem Plasminogenaktivator, im speziellen dem menschlichen Gewebetyp Plasminogenaktivator t-PA, oder dem Urokinasetyp Plasminogenaktivator u-PA, oder nicht natürlichen Zusammensetzungen mit Plasminogenaktivatorwirkung, ein effektives Mittel für die Behandlung von thrombotischen Verstopfungen (Gerinnung) von Blutgefässen darstellt, wie Thrombose von tiefen Venen oder ein Myokardialinfarkt. Allerdings besteht ein ernsthaftes Problem bei der fibrinolytischen/thrombolytischen Therapie darin, dass schon bald nach der anfänglichen erfolgreichen Thrombolysis erneut Gerinnung auftritt (Reokklusion). In verschiedenen Studien wurden Reokklusionen in 10% bis 33% der Fälle nach t-PA-Therapie für Herzinfarkt in der Herzarterie beobachtet (Collen et al., 1984; Verstraete et al.,h 1988; TIMI study group, 1985; Verstraete et al., 1987).
Die offensichtliche Aktivierung des Koagulationssystems während der fibrinolytischen Therapie führt zur Bildung des Enzyms Thrombin, welches in der Folge die erneute Reokklusion bewirkt aufgrund der Tatsache, dass es die Bildung des unlöslichen Proteins Fibrin von Fibrinogen fördert (Owen et al., 1988) und die Blutthrombozyten aktiviert, was die Anlagerung von Blutthrombozyten und die Bindung von Blutthrombozyten an Fibrin fördert (Kerins et al., 1988). Die Tatsache, dass die Reokklusion auftritt, sogar wenn der Antikoagulenswirkstoff Heparin verabreicht wird, zeigt, dass eine grosse Notwendigkeit für therapeutische Alternativen zu diesem Antikoagulenswirkstoff besteht.
Der Plasminogenaktivator-Inhibitor Typ 1 (PAI-1) wird als der physiologische Inhibitor sowohl des Gewebetyp-Plasminogenaktivators (t-PA) wie auch des Urokinasetyp-Plasminogenaktivators (u-PA) betrachtet. Der PAI-1 wird durch gebildete Vaskularendothelialzellen produziert und ist in den Alpha- Granulaten der Blutthrombozyten anwesend, von welchen er bei Aktivierung nachfolgend abgegeben wird (s. Schleef und Loskutoff, 1988). Eine Klonierung des gesamten PAI-1 cDNA und Bestimmung von dessen nukleotider Sequenz hat die Voraussage der Aminosäurensequenz des pre-PAI-1-Proteins ermöglicht, bestehend aus 402 Aminosäuren (Pannekoek et al., 1986). Es ist eine wichtige Tatsache, dass gereifter PAI-1 keine Zystinrückstände enthält, was die Möglichkeit eines direkten Ausdrückens von biologisch funktionalem PAI-1 im Bakterium Escherichia coli ohne eines Reduktions-Oxidationsverfahrens für die Disulfidbrücken ergibt (Pannekoek et al., 1986). Weiter ergab ein Vergleich zwischen der Aminosäuresequenz von PAI-1 und derjenigen von anderen Proteinen, dass PAI-1 zur Proteinsuperfamilie der Serinproteaseinhibitoren gehört (den sogenannten Serpinen) (Pannekoek et al., 1986). Es ist anzunehmen, dass die Mitglieder dieser Inhibitorfamilie von einem gemeinsamen Ausgangsstoff abstammen und in bezug auf die Aehnlichkeitshomologie von ihren Aminosäurensequenzen eine ähnliche dreidimensionale Struktur besitzen (Carrell und Boswell, 1986). Serpine bilden einen Aequimolar-inaktiven Komplex mit ihren jeweiligen Targetproteasen, welche Komplexe Natrium-Dodecylsulfat (SDS)-resistent sind. Das Prinzip der Serpinreaktivität basiert auf einem spezifischen Karboxyl- Bindungsbereich des Moleküls, namentlich der reaktiven Stelle P1-P1' (für PAI-1, Arginin in Position 346 und entsprechend Methionin in Position 347: s. Andreasen et al., 1986), welcher als ein Pseudosubstrat zur Targetserinprotease dargestellt ist (Travis und Salvesen, 1983). Die Spezifizität von einem Serpin gegen verschiedene Targetproteasen wird mindestens zum Teil durch die Sequenz von und um das reaktive Zentrum ausgelöst, welches stark zwischen den verschiedenen Serpinen variiert und wahrscheinlich wesentlich schneller evolutionärer Variation unterzogen wird als der Rest des Moleküls (Hill und Hastie, 1987). Die Interaktion zwischen der Serinprotease und dem Serpin wird durch den Serinrest im aktiven Zentrum der Protease und dem P1-Rest des Serpins ausgelöst. Die Bildung eines Komplexes zwischen der Serinprotease und dem Serpin führt letztlich zu einer Hydrolyse der Peptidbindung zwischen den P1- und P1'-Resten. Im Gegensatz zu diesem Mechanismus der Abspaltung vom realen Substrat mittels Protease wird angenommen, dass der Serpinproteasekomplex ein relativ stabiler Zwischenschritt im proteolytischen Prozess darstellt, dessen Hydrolyse der Peptidbindung zwischen P1 und P1' extrem langsam vor sich geht (Travis und Salvesen, 1983).
Verglichen mit den anderen Serpinen, weist PAI-1, abgesondert durch die gebildeten Vaskularendothelialzellen, das spezielle Merkmal auf, indem es nicht nur eine aktive Konformation aufweist und eine inaktive abgespaltete Konformation, sondern dass es auch meistens in einer latenten Form vorgefunden wird (Hekman und Loskutoff, 1985). Durch eine Behandlung mit Denaturierungsmitteln (Hekman und Loskutoff, 1985) oder negativ beladenen Phospholipiden (Lambers et al., 1987) kann diese latente Form reaktiviert werden. Eine andere Eigenschaft von PAI-1 besteht darin, dass dessen aktive Form in der Subendothelialmatrix abgelagert ist, wo es in Form von einem Komplex mit dem Bindungsprotein Vitronectin gefunden wird (Mimuro und Loskutoff, 1989). Kürzlich wurden ebenfalls binäre Komplexe von PAI-1 mit Vitronectin im Plasmamedium gefunden (Wiman et al., 1988; Declerck et al., 1988). Es ist bekannt, dass die Assoziation von diesen Molekülen in der Subendothelialmatrix oder im Plasma zu einer partiellen Stabilisation der aktiven Form von PAI-1 führt (Mimuro et al., 1987; Declerck et al., 1988). Im weiteren werden Vitronectin und PAI-1 beide durch aktivierte Thrombozyten abgesondert und in der Folge in der Form von Komplexen gefunden. Diese Beobachtung zeigt an, dass Vitronectin als lokal auftretender Regulator der Proteaseinhibition wirken kann.
Als Teil einer weiteren Studie von Determinanten von Proteasespezifizität von Serpinen, im speziellen PAI-1, wurden Mutanten von durchgehenden PAI-1 cDNA entwickelt, enthaltend Substitutionen im Bereich des reaktiven Zentrums. Diese Mutanten wurden in Escherichia coli-Bakterien ausgedrückt, zur Homogenität gereinigt und aktiviert. Diese Studie enthält klare Indikationen, dass spezifische Mutationen in und um die reaktiven Stellen die Reaktivität von PAI-1 in Richtung zu seiner Targetserinprotease t-PA und in Richtung zu Serinproteasethrombin bewirken, welches normalerweise kein Target von PAI-1 ist. Es hat sich gezeigt, dass, verglichen mit dem natürlichen Enzym (d.h. natürlichem PAI-1), die fraglichen Mutanten eine grössere Reaktivität in bezug auf Thrombin zeigen, speziell in Anwesenheit von Vitronectin. Aus den erhaltenen Resultaten scheint die Folgerung naheliegend, dass Vitronectin ein Proteinkofaktor für die Aktivität des Serpins ist, stark beeinflussend die Targetspezifizität vom Serpin PAI-1. Ueberraschenderweise wurde gefunden, dass die PAI-1- Mutanten, welche nachfolgend zu definieren sind, mehr oder weniger wirkungsvolle Thrombininhibitoren in Anwesenheit von Vitronectin werden und gleichzeitig eine wesentlich kleinere Reaktivität in bezug auf t-PA zeigen, was eine wirkungsvolle Möglichkeit ergibt, das Problem der fibrinolytisch/thrombolytischen Therapie zu lösen, wie vorab angeführt. Die physiologische Signifikanz der Kombination der Eigenschaften der neuen Mutanten gemäss der Erfindung kann wie folgt erklärt werden. Modulation der Thrombinaktivität ergibt sich an der Endothelial-Zelloberfläche und zieht Thrombomodulin (Esmon, 1989) oder Heparin in Verbindung mit Antithrombin III (Rosenberg und Damus, 1973) mit ein. Bis heute wurde die Regulierung der Thrombinaktivität bei einem wachsenden thrombozytreichen Thrombus nicht beschrieben. Kürzlich wurde gezeigt, dass aufgrund Aktivierung der Thrombozyten mit Thrombin sowohl Vitronectin als auch PAI-1 abgegeben werden und als Komplexe isoliert werden können. In einer derartigen Umgebung können die Komplexe als ein wirkungsvoller Regulator der Thrombinaktivität funktionieren. Das heisst, dass PAI-1 neben seiner bekannten antifibronolytischen Funktion, agierend als primärer Inhibitor sowohl von t-PA als auch von u-PA, ebenfalls eine unbekannte Anticoagulierungsaktivität zeigt. Bei natürlichen PAI-1 ist diese Anticoagulierungsaktivität relativ schwach, jedoch haben die hier beschriebenen Mutanten in Anwesenheit von ihrem Kofaktor Vitronectin die Fähigkeit, in einem grösseren oder kleineren Masse eine effiziente Inhibition von Thrombin zu bewirken.
Da Plasma eine grosse Menge von Vitronectin, wirkend als Kofaktor, enthält (die Konzentraion von Vitronectin im Plasma ist ungefähr 200ug/ml), kann diese Eigenschaft in einer thrombolytischen Therapie verwendet werden. Wenn ein PAI-1- Mutant, gemäss der Erfindung, intravenös verabreicht wird, wird es an das Vitronectin gebunden und wird somit ein starker Thrombininhibitor, währenddem es gleichzeitig weit weniger effektiv als ein Inhibitor des Plasminogenaktivators wirkt, was das wirkliche Ziel von PAI-1 ist. Ein zusätzlicher Vorteil der Mutanten gemäss der vorliegenden Erfindung besteht darin, da PAI-1 an Fibrin gebunden ist (Murayama und Bang, 1987; Keijer et al., 1988), dass die Mutanten wahrscheinlich zum Thrombus hin gerichtet werden (welcher im wesentlichen aus Fibrin und Thrombozyten gebildet wird) in Form von ihrem Komplex mit Vitronectin, und damit verhindern die Mutanten in der Folge die Wirkung von Thrombin und verhindern damit Reokklusion.
Entsprechend schafft die vorliegende Erfindung primär spezielle Mutanten des nienschlichen Plasminogenaktivator-Innibitors (PAI-1), namentlich Mutanten, in welchen der Bereich des reaktiven Zentrums, welches im wesentlichen aus der Aminosäuresequenz besteht (entsprechend dem ein-Buchstaben-Code) SGTVASSSTAVIVSARMAPEEIIMD, gänzlich oder teilweise durch den entsprechenden Teil des Antithrombin III (ATIII) ersetzt wird, dessen Bereich des reaktiven Zentrums im wesentlichen aus der Aminosäuresequenz (entsprechend dem ein-Buchstaben- Code) EGSFAAASTAVVIAGRSLNPNRVTFKAN besteht.
Bevorzugt sind solche Mutanten, in welchen mindestens die Aminosäuren RM in den Stellungen P1 und P1' des PAI-1 durch die Aminosäuren RS von ATIII in entsprechenen Stellungen ersetzt sind, wobei weiter bevorzugt solche Mutanten sind, in welchen mindestens die Aminosäuren ARMA in den Stellungen P2 bis P2' des PAI-1 durch die Aminosäuren GRSL von ATIII in entsprechenden Stellungen ersetzt sind. Am meisten bevorzugt sind diejenigen Mutanten, in welchen mindestens die Aminosäuren SARMAP in den Stellungen P3 bis P3' des PAI-1 durch die Aminosäuren AGRSLN von ATIII in entsprechenden Positionen ersetzt sind.
Obschon diese Bevorzugung den Eindruck erwecken kann, dass die Erfindung sich nur auf Mutanten bezieht, in welchen eine symmetrische Substitution relativ zum Reaktivzentrum P1-P1' vorgenommen wurde, ist dies keinesfalls der Fall, und entsprechend umfasst die Erfindung auch mehr oder weniger asymmetrische Mutanten.
Die Stellen des reaktiven Zentrums, wie oben angeführt, sind in Tabelle 1 sowohl für ATIII wie auch für PAI-1 spezifiziert. Die Veränderungen gemäss der Erfindung sind auf die Bereiche des reaktiven Zentrums beschränkt, d.h. auf den Bereich in Tabelle 1 zwischen den zwei Umrandungen (EVNE und RPFL). Tabelle 1 Sequenzen des Bereichs des reaktiven Zentrums von ATIII und PAI-1, ausgerichtet zu maximaler Homologie.
Die Erfindung bezieht sich nicht nur auf die eigentlichen Mutanten, sondern beinhaltet auch rekombinante Polynukleotide, mindestens einen Teil davon, welcher für neue PAI-1-Mutanten gemäss der Erfindung kodiert. Die rekombinanten Polynukleotide gemäss der Erfindung können aus mutierten Genen selbst bestehen oder können aus einem Vektorteil und einem Insertteil bestehen, wobei der Insertteil eine nukleotide Sequenz umfasst, die für einen PAI-1-Mutanten gemäss der Erfindung kodiert. Der Ausdruck "rekombinante Polyflukleotide" ist so zu verstehen, dass er sowohl rekombinante DNA wie auch rekombinante RNA miteinschliesst. Mit dem vorliegenden Stand der Technik werden meistens rekombinante DNA involviert sein, z.B. in der Form eines rekombinanten Plasmides, welches auf einem Vektor basiert, welcher geeignet ist für Klonierung und/oder Darstellung in spezifischen Wirtorganismen. Für eine grosse Anzahl von Wirtorganismen sind geeignete Vektoren bekannt, wie die verschiedenen pUC-Plasmide für Escherichia coli-Bakterien. Wirtorganismen, umgewandelt mittels eines derartigen rekombinanten Polynukleotides, können in der Folge in einem Verfahren für die Herstellung des PAI-1-Mutanten verwendet werden. Dieses Verfahren für die Herstellung eines PAI-1-Mutanten fällt ebenfalls unter den Bereich der vorliegenden Erfindung.
Im Lichte der oben erwähnten physiologischen Signifikanz der überraschenden Eigenschaften der Mutanten gemäss der Erfindung, umfasst die vorliegende Erfindung weiter pharmazeutische Präparationen, welche einen PAI-1-Mutanten gemäss der Erfindung enthalten, in Kombination mit einem oder mehreren pharmazeutisch zulässigen Träger- und/oder Hilfsstoffen, und die Verwendung des PAI-1-Mutanten gemäss der Erfindung in einer fibrinolytisch/thrombolytischen Therapie mit einem Plasminogenaktivator für die Verhinderung des Auftretens von Reokklusion.
Die Erfindung wird nun nachfolgend unter Bezug auf die folgenden experimentellen Abschnitte und die entsprechenden Figuren beschrieben.

Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt die Resultate einer Titration der t-PA-Inhibitierungswirkung von PAI-1 und Mutanten davon. Verschiedene Mengen der verschiedenen Inhibitoren wurden für eine Stunde bei 37ºC mit Zwei-Ketten t-PA (1.5nM) in einem Gesamtvolumen von 50ul inkubiert. Darauf wurden 0.5mM des synthetischen Substrates H-D-ile-pro-arg-p-Nitroanilid (S2288) hinzugefügt, und die Rest-tPA-Aktivität wurde aus einem Lineardiagramm bestimmt, in welchem der Anstieg der Absorption bei 405nm gegen die Inkubationszeit aufgetragen worden ist. Fig. 1 zeigt, wie für die verschiedenen untersuchten Inhibitoren die Rest-t-PA- Aktivität (in %) mit der Menge des hinzugefügten Inhibitors (in Nanogramm) variiert. Die Resultate für PAI-1, erhalten von konditioniertem Medium von kultivierten Endothelialzellen (ECCM-PAI-1), werden durch die Quadrate dargestellt, diejenigen für rekombinant natürlich-Typ PAI-1 durch Kreise, diejenigen für den Mutanten PAI-1 P3-P3'ATIII durch Dreiecke und diejenige für den Mutanten PAI-1 P1-P1'ATIII durch Diamanten.
Fig. 2 zeigt die Wirkung von Vitronectin und die Inhibition von Thrombin sowohl mittels natürlichem PAI-1 und durch Mutanten gemäss der Erfindung. In dieser Darstellung ist das Mol-Verhältnis von Vitronectin zum (Mutanten) PAI-1 gegen den prozentualen Anteil von Thrombininhibition in Diagramm A dargestellt. Die Kreise zeigen die Resultate, wenn 3.75nM natürliches PAI-1 für 60min mit 0.15nM Thrombin und mit der spezifizierten Menge von Vitronectin inkubiert wurde. Die Dreiecke zeigen die Resultate für ein ähnliches Experiment mit 0.75nM des Mutanten PAI-1 P1-P1'ATIII, währenddem die Quadrate die Resultate darstellen, wenn 0.75nM des Mutanten PAI-1 P3- P3'ATIII für 10min mit den oben angegebenen Konzentrationen von Thrombin und Vitronectin inkubiert wurden.
Diagramm B von Fig. 2 bezieht sich auf Experimente, in welchen 0.15nM Thrombin für eine Stunde bei 37ºC mit 0.75nM des Mutanten PAI-1 P3-P3'ATIII in der Gegenwart oder in Abwesenheit von 0.8nM Vitronectin inkubiert wurde. Die restliche Thrombinaktivität wurde in der vorab beschriebenen Art und Weise bestimmt und bei ungefähr 50% in Anwesenheit von Vitronectin und bei 100% bei Abwesenheit von Vitronectin festgelegt. Ein Polyklonal-Antiserum (4mg/ml) eines Kaninchens wurde gegen gereinigtes Vitronectin (Preissner et al., 1985) und teilweise mittels Ammoniumsulfat-Ausfällung und Chromatographie auf DEAE-Sephacel-gereinigtem Vitronectin erhoben. Zur Kontrolle wurden Kaninchen-Immunoglobuline verwendet, erhoben gegen gereinigten menschlichen Von Willebrand-Faktor (Dakopatts, Glostrup, Dänemark). Antiseren wurden zu den Reaktionsmischungen hinzugefügt, in den Verdünnungen vorab spezifiziertes Vitronectin wurde hinzugefügt, und die Rest- Thrombinaktivität wurde gemessen.
Die Rest-Thrombinaktivität in Abwesenheit von Antiseren, jedoch in Anwesenheit von 0.8nM Vitronectin wurde willkürlich bei 100% fixiert. Die Dreiecke geben die Resultate in dem Falle an, wo Antivitronectin anwesend war, währenddem die Diamanten die Resultate darstellen, wenn Anti-Von Willebrand anwesend war.

Experimenteller Abschnitt

Darstellung und Reinigung von PAI-1 und PAI-1-Mutanten aus Escherichia coli.
Zwei Substitutionsmutanten wurden hergeleitet, in welchen Aminosäurereste vom und um die reaktive Stelle P1-P1' von PAI-1 durch diejenigen vom Thrombininhibitor Antithrombin III (ATIII) substituiert wurden; s. Bock et al., 1982; Carrell und Boswell, 1986. Der erste Mutant enthielt die P1-P1'-Sequenz von Antithrombin III, währenddem der Rest vom PAI-1- Protein unverändert belassen wurde. Der zweite Mutant enthielt die P3-P3'-Sequenz von Antithrombin III, währenddem wiederum der Rest des PAI-1-Proteins unverändert belassen wurde. Für die Darstellung in den umgewandelten E. coli-Zellen von PAI-1 und PAI-1-Mutanten wurde der genau regulierte Tryptophan-Promotoroperator verwendet, was zu einer hohen Ausbeute von 10-40mg/l kultivierter Zellen führt. Nach Lysis der Zellen PAI-1 und den davon abgeleiteten Mutanten wurden diese unter Verwendung eines dreistufigen Reinigungsverfahrens gereinigt, in welchem Q-Sepharose-Schnellfluss-Chromatographie und Immunoaffinitäts-Chromatographie mit einem immobilisierten Anti-PAI-1-Monoklonal-Antikörper ausgeführt wurden. Die Analyse der Proteine mittels Elektrophorese auf SDS- Polyacrylamidgelen (10%w/v Polyacrylamidgel, in welchem 0.2%w/v SDS) unter nicht reduzierenden Bedingungen und Silbereinfärbung ("staining") ergaben Ein-Protein-Bande (die Resultate sind hier nicht dargestellt). Wie infolge der Abwesenheit von Glykosylation in Escherichia coli zu erwarten, war das scheinbare Molekulargewicht der Rekombinantproteine etwas tiefer als dasjenige des glykosilierten PAI-1 vom konditionierten Medium der kultivierten Endothelialzellen (ECCM- PAI-1; s. Lambers et al., 1987). In einer Immunofleckenanalyse ("Immunoblot-analysis"), in welcher ein Murin-Monoklonal- Antikörper verwendet wurde, gerichtet gegen gereinigtes menschliches PAI-1, isoliert aus konditioniertem Medium von kultivierten Vaskolar-Endothelialzellen, wurde dasselbe Muster beobachtet wie in den Proteinflecken (diese Resultate sind hier ebenfalls nicht dargestellt).
Die gereinigten Inhibitoren wurden verwendet, um die Umsetzungskonstanten zweiter Ordnung mit dem Target Serinprotease t-PA and dem Serinproteasethrombin, welches normalerweise kein Target ist, zu bestimmen. Die Präparationen wurden ebenfalls verwendet, um den Einfluss von Vitronectin, der PAI-1- Bindung Protein von der Endothelial-Zellmatrix und Plasma auf die kinetischen Konstanten und den Inhibitionsmechanismus zu untersuchen.

Inhibition von t-PA

Die Inhibitionsfähigkeit von gereinigtem PAI-1, PAI-1-Mutanten und ECCM-PAI-1 für t-PA wurde bestimmt durch Inkubierung der Enzyme während einer relativ langen Periode von einer Stunde mit einer zunehmenden Menge von verschiedenen Inhibitoren, gefolgt durch eine Bestimmung der Rest-t-PA-Aktivität. Wie in Fig. 1 dargestellt, war die Inhibitionstendenz virtuell gleich für alle getesteten Inhibitoren, was zu einer vergleichbaren Antwort zu einer Guanidin-HCl-induzierten Aktivierung hinausläuft. Die Assoziations-Umsetzungskonstanten zweiter Ordnung für gereinigte ECCM-PAI-1, PAI-1 und PAI- 1 P1-P1'ATIII waren virtuell gleich (3.4, 3.2 und 2.5 x 10&sup7; M&supmin;¹ sec&supmin;¹). Diese Beobachtung zeigt, dass Glykosilierung von PAI-1 nicht essentiell für die Interaktion mit t-PA ist. Im weiteren erscheint die Substitution des Methionin-Restes in der P1'-Position durch Serin, im Hinblick auf die Eigenschaften des Mutanten PAI-1 P1-P1'ATIII, nicht essentiell die Inhibition von t-PA zu beeinflussen. Der PAI-1 P3-P3'ATIII-Inhibitor weist anderseits eine 25-50 mal tiefere Umsetzungskonstante zweiter Ordnung auf (0.84 x 106 M&supmin;¹ sec&supmin;¹) als PAI- 1 für t-PA-Inhibition, was die Wichtigkeit der Reste, benachbart zu P1-P1', für die Spezifizität in bezug auf t-PA unterstreicht. Im weiteren scheint die Anwesenheit von einem molaren Ueberschuss von Vitronectin gegenüber PAI-1 in irgendeinem der Inhibitoren die Umsetzungskonstante zweiter Ordnung der Inhibitoren mit t-PA nicht beeinflusst, was in Uebereinstimmung ist mit den vorab angeführten Beobachtungen für ECCM-PAI-1 (Declerck et al., 1988).

Inhibition von Thrombin

Bevor die Umsetzungskonstanten zweiter Ordnung von PAI-1 und PAI-1/Antithrombin-III-Hybriden, d.h. PAI-1 P1-P1'ATIII und PAI-1 P3-P3'ATIII mit Thrombin bestimmt wurden, wurde untersucht, ob die Bindung Protein von PAI-1 die Interaktion zwischen PAI-1 oder PAI-1-Mutanten und Thrombin beeinflusst hat. Ueberraschenderweise ergab sich, dass Vitronectin signifikanterweise die Thrombin-Inhibizierungstendenz von PAI-1 erhöht, und dies sogar wesentlich stärker in den Mutanten, im speziellen im Mutanten PAI-1 P3-P3'ATIII. Bei einer ungefähren äquimolaren Konzentration von Vitronectin und PAI-1 wurde eine halb maximale Inhibition von Thrombin beobachtet, wie in Diagramm A von Fig. 2 dargestellt. Wenn anstelle von Vitronectin Bovinserumalbinum verwendet wurde, wurde keine Erhöhung in der Thrombin-Inhibition beobachtet (die Resultate sind nicht dargestellt), und ebenfalls bei Anwesenheit sowohl von Vitronectin wie auch einem affinitätgereinigten polyklonalen Antikörper, erhoben gegen gereinigtes Vitronectin, konnte keine Erhöhung in der Thrombin-Inhibition beobachtet werden (s. Diagramm B in Fig. 2). Die Wirkung von Vitronectin auf die Inhibition von Thrombin durch PAI-1 und Mutanten davon ist deshalb äusserst ausgeprägt verschieden von der Wirkung auf die Inhibition von t-PA. Im letzteren Falle führt Vitronectin nur zu einer Stabilisierung von der aktiven Form von PAI-1 durch Verlängerung von dessen Halbwertperiode um einen Faktor 2-3, ohne seine inhibitorische Kapazität zu erhöhen.
Daraufhin wurden die Umsetzungskonstanten zweiter Ordnung für PAI-1, PAI-1 P1-P1'ATIII und PAI-1 P3-P3'ATIII mit Thrombin in der Anwesenheit oder Abwesenheit von einer optimalen Konzentration von Vitronectin bestimmt. Die Resultate sind in Tabelle 2 dargestellt. Dabei ist klar erkennbar, dass PAI-1 P3-P3'ATIII ein zehnmal besserer oder schnellerer Inhibitor von Thrombin ist als PAI-1, was anzeigt, dass die P3-P3'- Reste von Antithrombin III ausschlaggebend sind für die Thrombin-Inhibition. Im Gegensatz ist offensichtlich, dass die Anforderungen für den P1'-Rest, d.h. Methionin im Falle von PAI-1 oder Serin im Falle von PAI-1 P1-P1'ATIII, weniger wichtig sind bei der Thrombin-Inhibition und in ähnlicher Art und Weise bei der t-PA-Inhibition. Die Assoziationsrate mit Thrombin sowohl von PAI-1 und den davon abgeleiteten Mutanten erhöht sich um das 100-200fache in der Anwesenheit von Vitronectin, was in vergleichbaren k1-Werten von PAI-1, PAI-1 P1- P1'ATIII und ECCM-PAI-1 von 1.6-2.9 x 10&sup5; M&supmin;¹ sec&supmin;¹ und für PAI-1 P3-P3'ATIII von 1.8 x 10&sup6; M&supmin;¹ sec&supmin;¹ resultiert. Wiederum führen diese Resultate zu einem anscheinend gleichartigen Verhalten von PAI-1 von E coli-Ursprung und PAI-1 von Endothelialzellen.
Speziell bei Anwesenheit von Vitronectin scheint der Mutant Protein PAI-1 P3-P3'ATIII als ein effizienter Thrombin-Inhibitor zu wirken. Das Protein Vitronectin scheint als ein Kofaktor für Inhibition von Thrombin durch PAI-1 zu wirken.

Komplexbildung mit Thrombin

Um festzustellen, ob die Wirkung von Vitronectin auf Thrombin-Inhibition infolge einer Dosis abhängig der Erhöhung der Bildung von SDS-stabilen Komplexen zwischen Protease und Serpin auftritt, wurde ein ¹²&sup5;I-gekennzeichnetes Thrombin mit PAI-1 oder mit dem effizienten Thrombin-Inhibitor PAI-1 P3- P3'ATIII und erhöhten Konzentrationen von Vitronectin inkubiert. Die Mischungen wurden dann mittels Elektrophorese auf SDS-Polyacrylamidgelen unter nicht reduzierenden Bedingungen und nachfolgender Fluorographie analysiert (die Resultate sind hier nicht dargestellt). Erhöhte Konzentrationen von Vitronectin führten zu einer erhöhten Bildung von SDS-stabilen Komplexen zwischen Thrombin und jedem der zwei Serpine. Mehr als 90% von Thrombin wurde im Komplex unter Bedingungen von 3fach Ueberschuss von PAI-1 P3-P3'ATIII über Thrombin und Vitronectin bei optimaler Konzentration gefunden. Aktivierung von PAI-1, z.B. mit Guanidin-HCl, ist eine Notwendigkeit für Komplexbildung, da im Falle, dass die Aktivierung unterlassen wurde, kein komplexiertes Thrombin gefunden wurde (die Daten sind hier nicht dargestellt). Als Konsequenz scheint die Erhöhung der Assoziationsrate zwischen Thrombin und PAI-1 und davon abgeleiteten Mutanten durch Vitronectin auf einer effizienten Bildung von SDS-stabilen Komplexen zwischen Thrombin und dem Inhibitor zu basieren.
Die Tatsache, dass unter den experimentellen Bedingungen der Mutant PAI-1 P3-P3'ATIII ein dreifach besserer Inhibitor von Thrombin ist als von t-PA, erklärt, dass weitere Mutanten des menschlichen Plasminogenaktivatorinhibitors 1, in welchen ein grösserer Teil des Bereiches des reaktiven Zentrums von PAI-1 durch den entsprechenden Teil von ATIII sübstituiert ist, als mindestens erfolgsversprechende Hilfsstoffe in einer fibrinolytischen/thrombolytischen Therapie zu betrachten sind. Tabelle 2 Umsetzungskonstanten (k1) zweiter Ordnung für die Inhibition von Thrombin durch PAI-1 und Mutanten davon in Abwesenheit oder Anwesenheit von Vitronectin. DERIVATE VITRONECTIN
Die Umsetzungskonstanten (k1) zweiter Ordnung wurden gemäss dem nachfolgend beschriebenen Prozedere bestimmt.

Materialien

Restriktions-Endonukleasen wurden von New England Biolabs oder Bethesda Research Laboratories gekauft. T4-Polynukleotidkinase wurde von Pharmacia (Uppsala, Schweden) und das Klenow Fragment von DNA-Polymerase I von Boehringer Mannheim Biochemicals erhalten. Die replikative Form (RF) von M13mp18am4 DNA wurde von der Anglian Biotechnology Limited, Colchester, U.K. erhalten. Sequenase-DNA-Polymerase wurde von United States Biochemicals beschafft. Casaminosäuren (fehlendes L-Tryptophan) wurden von Difco erhalten. Die synthetischen Substrate H-D-Isoleucin-Prolin-Arginin-p-Nitroanilid (S2288) und H-D-Phenylalanin-Pipecolyl-Arginin-p-Nitroanilid (S2238) wurden von KabiVitrum (Stockholm, Schweden) und Q- Sepharose-Schnellfluss von Pharmacia (Uppsala, Schweden) erhalten. Ampicillin und Pankreazin DNAse I wurden von Sigma und Co., und Ziegen-Antimaus IgG, gebunden an Alkalinphosphatase von Promega erhalten. Das Plasmid-pMBL11, enthaltend den Promotoroperator von dem Escherichia coli-Tryptophanoperon wurde vom Medical Biological Laboratory TNO, Rijswijk, Niederlande, und der Escherichia coli-K12-Stamm 1046 (recA&supmin;) wurde von der Phabagen Collection von der State University von Utrecht, Niederlande, erhalten. Der Murin-Monoklonal- Antikörper MAI-13, gerichtet gegen menschliches PAI-1, kovalent gekoppelt an Sepharose, wurde von Biopool (Umea, Schweden) beschafft.

Proteine

Bowes Melanoma-abgeleitetes zwei-Ketten t-PA (91000 IU/mg) wurde von Biopool (Umea, Schweden) beschafft. Menschliches Thrombin, gereinigt zu offensichtlicher Homogenität, wurde vom Central Laboratory of the Blood Transfusion Institute des Niederländischen Roten Kreuzes, Department of Blood Coagulation, erhalten. Aktive Stellentitration von gereinigtem Thrombin mit p-Nitrophenyl p'-Guanidino-Benzoat (Chase und Shaw, 1970) ergab eine Konzentration von 5.0mg/ml: Dieser Wert stimmt gut mit einer Bestimmung der Proteinkonzentration von 4.5mg/ml, entsprechend der Bradford Methode, überein. Thrombin wurde gekennzeichnet mit einer ¹²&sup5;I-Bezeichnung, unter Verwendung der Iodogenmethode, resultierend in einer spezifischen Radioaktivität von 1,6uCi/ug Protein. Vitronectin wurde gereinigt aus menschlichem Plasma zu offensichtlicher Homogenität, wie vorab beschrieben durch Preissner et al. im Jahre 1985. PAI-1 wurde aus konditionierten Medien von kultivierten, menschlich-zentral-Venen-Endothelialzellen (ECCM- PAI-1) gereinigt, unter Verwendung der vorab beschriebenen dreistufigen Methode, für die Reinigung von Rekombinant-PAI-1 aus Lysaten von kultivierten, umgewandelten Escherichia coli- Zellen.

Generelle Methoden

Standard-mikrobiologische Techniken, miteinschliessend Plasmid DNA und bakteriophage M13 DNA-Isolationen, Restriktionsfragmentisolationen, Enzymreaktionen mit Nukleinsäuren und bakterielle Transformationen wurden, wie von Maniatis et al. (1982) beschrieben, ausgeführt. Nukleotide Sequenzbestimmungen wurden unter Verwendung der Dideoxy-Kettenbestimmungsmethode von Sanger et al., 1977, mit Sequenase-DNA-Polymerase ausgeführt. Synthetische Oligonukleotide wurden mittels Festphasenphosphor-Amiditchemie auf einem automatisierten Herstellapparat (synthesizer) (Applied Biosystems, model 381A) synthetisiert.

Herstellung von dargestellten Plasmiden

Plasmide, welche menschliches PAI-1-Protein und Mutanten davon kodieren und welche geeignet sind für die Darstellung von biologisch funktionalen PAI-1-Proteinen in transformiertem Escherichia coli, wurden wie folgt dargestellt. Vollängen menschliche PAI-1 cDNA wurden aus Plasmid pUC8/PAIex erhalten, vorab durch die Erfinder beschrieben (Pannekoek et al., 1986). Die gesamte nukleotide Sequenz des Vollängen-PAI-1 cDNA und der abgeleiteten PAI-1-Aminosäurensequenz wurden vorab beschrieben (Pannekoek et al., 1986). Plasmid pUC8/PAIex DNA wurde mit der Restriktions-Endonuklease ApaL1 inkubiert, und die generierten Fragmente wurden end-abgestumpft unter Verwendung des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase I. In der Folge wurde die resultierende DNA-Präparation mit der Restriktions-Endonuklease BglII inkubiert, und die generierten Fragmente wurden mittels Agarosegel-Elektrophorese abgetrennt. Das gewünschte ApaL1(end-abgestumpft)- BglII-Fragment (ungefähr 1300 Basispaare), enthaltend die gesamte PAI-1-Kodierungssequenz, wurde identifiziert, isoliert und vom Gel gereinigt, unter Verwendung von Standardverfahren (Maniatis et al., 1982). Plasmid pMBL11 wurde als ein Ausdrucksvektor für die verschiedenen Rekombinantproteine in Escherichia coli verwendet. Die Wahl des Ausdruckvektors ist nicht speziell wesentlich für die hier beschriebenen Erkenntnisse. Viele andere, bestens etablierte Ausdrucksvektoren für Escherichia coli können gleich gut funktionieren wie der hier verwendete Vektor. Der Vektor pMBL11 trägt die Escherichia coli-Tryptophan-Promotoroperator-Regulationselemente und das Gen für Beta-Lactamase, vorgesehen für Resistenz gegen das antibiotische Ampicillin. Eine Mehrfach-Klonierungsstelle (5'ACTCGAGATCTAGGATCC 3'), enthaltend einmalige Restriktionsstellen für die Restriktions-Endonuklease XhoI, BGglII und BamHI, wurde unmittelbar nach dem sechsten Kodon des trpE- Gens eingeführt, d.h. dem am meisten Promotor-Proximal-Gen des Tryptophanoperons. pMBL11 wurde mit der Restriktions- Endonuklease BglII abgespalten, nachfolgend end-abgestumpft mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I und dann mit der Restriktions-Endonuklease BamHI behandelt. Das resultierende BglII(end-abgestumpft)-BamHI-Fragment von ungefähr 4800 Basispaaren wurde von einem Agarosegel nach Elektrophorese isoliert und an das ungefähr 1300 Basispaar-lange ApaL1(end-abgestumpft)-BglII-Fragment, wie oben erwähnt, gebunden, um Plasmid pMBL11/PAI-1 zu erhalten. Die nukleotide Sequenz der relevanten verschmelzten Restriktionsstellen wurde mittels der Methode von DNA-Sequenzierung, wie oben ausgeführt, hergestellt.

Oligonukleotid-gerichtete Mutagenesis

Beide Stränge von einem verketteten Molekül mit der Sequenz (vom "oberen" Strang):
5' GAATTCGAATGCCGGCCCACCTGGCCATGCATCCATGGGTCGAC 3', enthaltend die Restriktionsstellen EcoRI-BsmI-SfiI-NsiI-NcoI-SalI, wurden synthetisiert und verwendet zur Substitution für den EcoRI-SalI-Abschnitt der Mehrfach-Klonierungsstelle vom Phage M13mp18am4 RF DNA. Ein (330 Basispaar) SalI-NsiI-Restriktionsfragment von Vollängen, menschlicher PAI-1 cDNA (entsprechend zu Positionen 1045 und 1375) wurde in dieses modifizierte M13 mp18am4 RF eingeführt. Stellengerichtete Mutagenesis auf dem resultierenden ein-Strang-Templat wurde gemäss Kramer et al., 1984, ausgeführt. Um cDNA-Kodierung für ein Derivat von PAI-1 herzuleiten, in welchem P1' (Methionin) von PAI-1 durch einen entsprechenden Rest (Serin) von Antithrombin III (Bock et al., 1982; Carrell und Boswell, 1986) ersetzt ist, wurde das folgende synthetische Oligonukleotid synthetisiert:
5' GTCATAGTCTCAGCCCGCTCAGCCCCCGAGGAGATCATC 3', um letztendlich einen Mutanten cDNA zu ergeben, bezeichnet als PAI-1 P1- P1'ATIII. Um cDNA-Kodierung für ein Derivat von PAI-1 zu erzeugen, in welchem P3, P2, P1', P2' und P3' von PAI-1 durch die Aminosäurereste der entsprechenden Sequenz von Antithrombin III ersetzt wurden, wurde das folgende synthetische Oligonukleotid synthetisiert:
5' TCCACAGCTGTCATAGTCGCCGGAAGATCACTGAACGAGGAGATCATCATGGAC 3', um schlussendlich einen Mutanten cDNA zu ergeben, bezeichnet PAI-1 P3-P3'ATIII. Die nukleotiden Sequenzen der gesamten mutierten SalI-NsiI-Restriktionsfragmente wurden durch DNA-Sequenzierung verifiziert. Schlussendlich wurden die mutierten NsiI-SalI-Fragmente isoliert, um das nicht mutierte entsprechende Fragment des Darstellungsplasmides pMBL11/PAI-1 zu substituieren, um zu Plasmiden pPAI-1/Pl-P1'-ATIII und pPAI- 1/P3-P3'ATIII zu führen. Die Aminosäuresequenz um das reaktive Zentrum von PAI-1 herum und die Aminosäuresubstitutionen von PAI-1 P1-P1'ATIII und PAI-1 P3-P3'ATIII, verglichen zu "natürlichem" PAI-1, sind in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3 Aminosäuresequenzen um das reaktive Zentrum von PAI-1, PAI-1 P1-P1'ATIII und PAI-1 P3-P3'ATIII DERIVATE
Die Festlegung der Reste, welche das reaktive Zentrum (P1- P1') konstituieren, wurde vorab beschrieben (Andreasen et al., 1986). In Tabelle 3 sind die Aminosäurereste im drei- Buchstaben-Code dargestellt. Der Unterschied zwischen der Aminosäuresequenz von natürlichem PAI-1 und dem Mutanten Protein PAI-1 P1-P1'ATIII besteht in der Substitution von met- 347 durch ser-347. Das Mutantprotein PAI-1 P3-P3'ATIII enthält unterschiedliche Aminosäuren, verglichen mit PAI-1 bei den Positionen P3, P2, P1', P2' und P3', währenddem der Rest des Moleküls identisch ist zum natürlichen PAI-1.

Darstellung von PAI-1 und PAI-1-Mutanten in Escherichia coli

Escherichia coli-K12-Strang 1046, enthaltend eines der oben beschriebenen Plasmide, wurde über Nacht in LB (Maniatis et al., 1982), enthaltend 100ug/ml Ampicillin und 250ug/ml L- Tryptophan, kultiviert. Die Uebernacht-Kultur wurde im selben Medium 100fach verdünnt und weiter kultiviert, bis eine Dichte von ungefähr 6 x 10&sup8; Zellen/ml erreicht worden war. Die Zellen wurden durch Zentrifugation aufgefangen, einmal mit M9-Medium (Maniatis et al., 1982) gewaschen und schlussendlich im M9-Medium resuspendiert, ergänzt mit 0.5% Glukose, 1ug/ml Thiamin, 100ug/ml Ampicillin und 0.2% Casaminosäuren. Nachfolgend wurde der Ansatz, basierend auf Derepression des Tryptophan-Operators, für weitere 16 bis 20 Stunden bei 37ºC belassen, und anschliessend wurde der Prozess durch Zentrifugation der Zellen beendet.

Reinigung von PAI-1 und PAI-1-Mutanten aus E.coli-Lysaten

Bakterienpillen von einer Kultur von 25ml wurden in 2.5ml eines Puffers, enthaltend 10mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA, 100mM NaCl und 0.1% (v/v) Tween-80, suspendiert und dreimal für 30 sec bei 0ºC bei hoher Geschwindigkeit gerührt ("sonicated"). Die Lysate wurden bei 30.000 x g für 10 min zentrifugiert und, nach Zugabe von 1/100 Volumen von 1M MgCl&sub2; mit 10ug/ml Pankreatin DNAse I für 30 min bei 37ºC inkubiert. Darauf wurde Ammoniumsulfat bis zu einer Endkonzentration von 25% (w/v) hinzugefügt, und die resultierenden Pillen bzw. Plättchen wurden abgeschieden. Die Pillen bzw. Plättchen einer nachfolgenden weiteren Ammoniumsulfat-Hinzugabe bis 45% (w/v) wurden in 2.5ml von 20mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.1% (v/v) Tween-80 suspendiert und über Nacht gegen denselben Puffer dyalisiert. Die Lösung, enthaltend PAI-1 oder ein Derivat davon, wurde batchweise für 15 min bei Raumtemperatur auf 2ml Q-Sepharose-Schnellfluss-Harz absorbiert, welches anschliessend in eine Kolonne eingepackt wurde, mit 10ml 20mM Tris-Hcl (pH 8.0), 0.1% (v/v) Tween-80 gewaschen, und die Inhibitoren wurden mit 5ml 20mM TrisHCl (pH 8.0), 0.1% (v/v) Tween-80, 200mM NaCl gespült bzw. eludiert. Für den schlussendlichen Reinigungsschritt wurde das Eluat batchweise für 12 Stunden bei 4ºC mit 1ml Suspension des Anti-PAI-1-Monoklonal-Antikörpers MAI-13, kovalent gebunden an Sepharose, inkubiert. Wiederum wurde das Harz in eine Kolonne gepackt, mit dem 10fachen Kolonnenvolumen von 20mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.1% (v/v) Tween-80, 1M NaCl gewaschen und mit 3ml 100mM Glycin (pH 3.3), 0.1% (v/v) Tween-80 eludiert und direkt in 300ul 1M Tris-HCl (pH 8.0) aufgefangen. Die schlussendlich homogenen Präparationen von PAI-1 oder Mutanten davon lagen zur Hauptsache in latenter Konformation vor.

Aktivierung von PAI-1, PAI-1-Mutanten und Titration von deren jeweiliger Aktivität

PAI-1 or PAI-1-Mutanten (20-30ug/ml) wurden durch Inkubation während 2 Stunden bei Raumtemperatur mit 4M Guanidin-HCl (Hekman und Loskutoff, 1985) aktiviert. Die Proben wurden dann über Nacht gegen 20mM Tris-HCl (ph 8.0), 100mM NaCl, 0.1% (v/v) Tween-80 dialysiert. Nach Dialyse wurde die Konzentration auf 10ug/ml eingestellt, und Arginin wurde bis zu einer schlussendlichen Konzentration von 50mM hinzugefügt, um die aktive Konformation zu stabilisieren. Steigende Mengen von aktiviertem PAI-1 oder PAI-1-Mutanten wurden für eine Stunde bei 37ºC mit 1.5nM von zwei-Ketten-t-PA inkubiert. Dann wurde das chromogenische Substrat S2288 (0.5mM) hinzugefügt, und die Rest-t-PA-Aktivität wurde aus einem linearen Diagramm der Zunahme der Absorption bei 405nm über Zeit bestimmt.

Bestimmung der Reaktionskonstanten von PAI-1 und PAI-1- Mutanten zweiter Ordnung mit t-PA oder Thrombin

Die Reaktionskonstanten (k1) zweiter Ordnung für die Inhibition von t-PA mit verschiedenen Inhibitoren wurde wie folgt bestimmt. 1.5nM von zwei-Ketten-t-PA (15nM in Experimenten mit PAI-1 P3-P3'ATIII) wurde bei 37ºC in 20mM Tris-HCl (pH 8.0), 100mM NaCl, 0.1% (v/v) Tween-80 mit 2nM von ECCM-PM-1 (erhalten von konditioniertem Medium von Endothelialzellen), PM-1, PM-1 P1-P1'ATIII oder 20nM Aktiv-PAI-1 P3-P3'ATIII inkubiert. Bei bestimmten Zeiten (5 sec bis 16 min) wurde die Reaktion durch eine 40fache Verdünnung der Reaktionsmischung mit 1.2mM S2288 gestoppt. Die Rest-t-PA-Aktivität wurde vom anfänglichen Absorptionsanstieg bei 405nm in einem Cary 219 Spektrophotometer gemessen. Die Reaktionskonstante (k1) zweiter Ordnung wurde errechnet unter Verwendung einer Standardgleichung für eine Reaktion zweiter Ordnung unter Bedingungen von einem leichten Ueberschuss von Inhibitorüberenzym:
wobei Eo und Io die Anfangskonzentrationen von Enzym und Inhibitor darstellen und Et die Enzymkonzentration zur Zeit t ist.
Die Reaktionskonstanten zweiter Ordnung für die Inhibition von Thrombin durch PAI-1 oder PAI-1-Mutanten wurden analog bestimmt, wie oben beschrieben für die Inhibition von t-PA. Zu diesem Zweck wurden 2.5nM von Thrombin und 10 bis 40nM von aktiver Komponente von einem der Inhibitoren verwendet. Zu bestimmten Zeiten wurde die Reaktion durch 30faches Verdünnen mit 0.6mM des chromogenischen Substrates S2238 gestoppt. In einigen Experimenten wurde 66nM Vitronectin unmittelbar vor der Zugabe von 10nm PAI-1 oder Mutanten davon hinzugefügt.

Komplexbildung von PAI-1 und PAI-1-Mutanten mit Thrombin

Thrombin, bezeichnet mit ¹²&sup5;I, unter Benutzung des Iodogenverfahrens, wurde in 20ul 20mM Tris-HCl (pH 8.0), 100mM NaCl, 0.1% (v/v) Tween-80 für eine Stunde bei 37ºC mit Vitronectin, mit PAI-1 oder mit Vitronectin und PAI-1 inkubiert. Vitronectin wurde in Konzentrationen von 3.5nM und 70nM und der Inhibitor in Konzentrationen von 0.75nM und 7.5nM verwendet. Die Menge von bezeichnetem Thrombin betrug in allen Fällen 2.5nM. Zu den Reaktionsmischungen wurden 5ul von 0.25M Tris-HCl (pH 6.8), 10% (w/v) SDS, 40% (v/v) Glycerin, 0.05% (w/v) Bromophenol blau hinzugefügt, und die schlussendlichen Mischungen wurden mittels Elektrophorese auf einem 10% (w/v) SDS-Polyacrylamidgel (Laemmli, 1970) analysiert. Thrombin wurde mittels Fluorographie visualisiert.

Literaturzitate:

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Claims

1. Mutant des menschlichen Plasminogenaktivator-Inhibitors (PAI-1), wobei (unter Verwendung des Einbuchstabencodes der Aminosäuren) die Aminosäuren RM, enthalten im reaktiven Zentrum des PAI-1 der Aminosäuresequenz SGTVASSSTAVIVSARMAPEEIIMD, durch die Aminosäuren RS, enthalten im reaktiven Zentrum des Antithrombins III (ATIII) der Aminosäuresequenz EGSEAAASTAVVIAGRSLNPNRVTFKAN, ersetzt worden sind und gegebenenfalls flankierende Aminosäuren innerhalb des PAI-1- reaktiven Zentrums durch die entsprechenden flankierenden Aminosäuren innerhalb des ATIII-reaktiven Zentrums ersetzt worden sind.

2. Mutant nach Anspruch 1, wobei mindestens die Aminosäuren RM in den Stellungen P1 und P1' des PAI-1 durch die Aminosäuren RS des ATIII, die sich in entsprechenden Stellungen befinden, ersetzt sind.

3. Mutant nach Anspruch 1, wobei mindestens die Aminosäuren ARMA in den Stellungen P2 bis P2' des PAI-1 durch die Aminosäuren GRSL des ATIII, die sich in entsprechenden Stellungen befinden, ersetzt sind.

4. Mutant nach Anspruch 1, wobei mindestens die Aminosäuren SARMAP in den Stellungen P3 bis p3' des PAI-1 durch die Aminosäuren AGRSLN des ATIII, die sich in entsprechenden Stellungen befinden, ersetzt sind.

5. Rekombinantes Polynucleotid, dadurch gekennzeichnet, daß es für einen PAI-1-Mutanten nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert.

6. Rekombinantes Polynucleotid, enthaltend einen Vektorteil und einen Insertteil, dadurch gekennzeichnet, daß der Insertteil eine Nukleotidsequenz enthält, die für einen PAI-1-Mutanten nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert.

7. Verfahren zur Herstellung eines PAI-1-Mutanten nach einem der Ansprüche 1 bis 4 durch Züchtung eines Organismus, der, infolge einer genetischen Manipulation unter Verwendung eines rekombinanten Polynucleotids nach Anspruch 6, die Fähigkeit erworben hat, den PAI-1-Mutanten zur Expression zu bringen und den gebildeten PAI-1-Mutanten zu isolieren.

8. Pharmazeutische Präparation, enthaltend einen PAI-1- Mutanten nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und einen oder mehrere pharmazeutisch akzeptable Träger und/oder Hilfsmittel.

9. Verwendung eines PAI-1-Mutanten nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung in einer fibrinolytischen/thrombolytischen Therapie mit einem Plasminogenaktivator zur Verhinderung des Auftretens einer Reokklusion.