DE68916532T3

DE68916532T3 - Varianten von menschlichem gewebeplasminogenaktivator sowie verfahren zu deren herstellung.

Info

Publication number: DE68916532T3
Application number: DE68916532T
Authority: DE
Inventors: Stephen Anderson; Deborah Higgins; Adair Hotchkiss; Cara Marks
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1988-03-21
Filing date: 1989-03-06
Publication date: 2000-02-03
Anticipated expiration: 2009-03-07
Also published as: EP0401303B1; US5094953A; AU635892B2; ES2018367A6; JPH09168387A; IL89500A0; JP2605155B2; DK227390A; DK227390D0; EP0401303B2; ATE107960T1; US5314818A; GR890100164A; WO1989009266A1; CA1341612C; AU3414889A; GR1000387B; US5770425A; DK175776B1; DE68916532D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft spezielle neue Varianten von menschlichem Gewebeplasminogenaktivator (t-PA) und offenbart Verfahren zu deren Herstellung und Verfahren und Zusammensetzungen, bei denen solche Varianten eingesetzt werden, um pharmazeutisch wirksame Hauptsubstanzen mit unerwartet verbesserten pharmakokinetischen und pharmakologischen Eigenschaften herzustellen, sowie Verfahren zum Modulieren der pharmakokinetischen und pharmakologischen Eigenschaften von t-PA und verschiedener Varianten davon. Im spezielleren werden Mittel und Verfahren zur Erhöhung der Fibrinbindung von t-PA in Fällen geoffenbart, in denen festgestellt wurde, daß sie als Folge bestimmter Modifikationen in anderen Domänen der t-PA-Einheit unterdrückt wird.
Menschlicher Gewebeplasminogenaktivator ist als ein besonders wichtiges und wirksames neues biologisches pharmazeutisches Mittel identifiziert und beschrieben worden, das aufgrund seiner hohen Fibrinspezifität und starken Fähigkeit, Blutgerinnsel in vivo aufzulösen, außergewöhnliche Ergebnisse bei der Behandlung von Gefäßerkrankungen, wie z. B. Myokardinfarkt, gezeigt hat.
Menschlicher Plasminogenaktivator ist Gegenstand zahlreicher wissenschaftlicher und Patentanmeldungs-Offenbarungen gewesen. Seine Existenz hat zwar zahlreiche Untersuchungen von mehreren Wissenschaftergruppen veranlaßt, aber erstmals als im wesentlichen reines Isolat aus natürlicher Quelle identifiziert und in vivo auf erforderliche Plasminogenaktivatorwirkung getestet wurde er von Collen et al., EP-A-41.766, veröffentlicht am 16. Dezember 1981, die auf einer ersten Einreichung vom 11. Juni 1980 basiert. Siehe auch die entsprechende wissenschaftliche Veröffentlichung von Rijken et al., J. Biol. Chem. 256, 7035 (1981).
In der Folge wurde menschlicher Gewebeplasminogenaktivator basierend auf erfolgreicher Arbeit, bei der DNA-Rekombinationstechnologie eingesetzt wurde, was zum Erhalt großer t-PA-Mengen in einem besonderen Medium führt, durch die zugrundeliegende DNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz identifiziert und charakterisiert. Die se Arbeit wurde in der wissenschaftlichen Literatur (Pennica et al., Nature 301, 214 (1983)) und in der am 9. November 1983 veröffentlichten EP-A-93.619 festgehalten, die auf einer ersten Einreichung vom 5. Mai 1982 basiert.
Unter Verwendung letzterer Offenbarung als Basiswerkzeug haben zahlreiche andere Forscher über die so ermöglichte Herstellung des Moleküls über DNA-Rekdmbinationstechnologie berichtet. Einige dieser Forscher haben auch das Potential von Varianten der Grundstruktur veröffentlicht und mental Derivate vorhergesagt, die variieren können, was die biologischen oder pharmakokinetischen Gesamtwirkungen betrifft. Die resultierenden Offenbarungen waren größtenteils prophetisch und unbestimmt, was die tatsächlichen biologischen oder pharmakologischen Gesamtergebnisse betrifft.
Analoge Bemühungen in den Laboratorien, bei denen es erstmals gelang, t-PA rekombinant zu erzeugen, sind sowohl in der wissenschaftlichen Literatur als auch in verschiedenen Patentanmeldungen als Fakten hinsichtlich der bestätigten Molekülcharakterisierung und beobachteten biologischen Wirkung festgehalten worden. In jedem Fall scheint der Trend zur Forschung in die Richtung zu gehen, daß man sich bemüht, die Grundstruktur von menschlichem Gewebeplasminogenaktivator zu modifizieren, um sein kommerzielles Potential gemäß verschiedener biologisch begründeter Endpunkte voll zu ergründen und auszuschöpfen.
Teilweise auf solcher Forschung und solchen Offenbarungen basierend scheint nun klar, daß das menschliche Gewebeplasminogenaktivator-Molekül 5 Domänen (Aminosäuresequenzbereiche) enthält, die unter Bezugnahme auf homologe oder auf andere Art ähnliche Strukturen definiert worden sind, die in verschiedenen anderen Proteinen, wie z. B. Trypsin, Chymotrypsin, Plasminogen, Prothrombin, Fibronektin und Epidermiswachstumsfaktor (EG F), identifiziert wurden. Diese Bereiche sind, am N-Terminus der Aminosäuresequenz von menschlichem Gewebeplasminogenaktivator beginnend, folgendermaßen benannt worden: 1) der Fingerbereich (F), der verschiedentlich als Aminosäure 1 bis hinauf zu etwa 44 einschließend definiert worden ist, 2) der Wachstumsfaktor bereich (G), der verschiedlichtlich als sich von etwa Aminosäure 45 hinauf bis Aminosäure 91 erstreckend definiert worden ist (basierend auf seiner Homologie mit EG F), 3) Kringle 1 (K1), der als sich von etwa Aminosäure 92 bis etwa 173 erstreckend definiert worden ist, 4) Kringle 2 (K2), der als sich von etwa Aminosäure 180 bis etwa Aminosäure 261 erstreckend definiert worden ist, und 5) der sogenannte Serinproteasebereich (P), der allgemein als sich von etwa Aminosäure 264 bis zum C-terminalen Ende des Moleküls erstreckend definiert worden ist. Diese Domänen sind im allgemeinen aufeinander folgend angeordnet oder sind durch kurze "Linker"-Bereiche getrennt und machen die gesamte Aminosäuresequenz von Aminosäure 1 bis 527 in ihrer vermutlich reifen Form aus.
Jede Domänen ist verschiedentlich als bestimmte spezifische Wirkung beitragend beschrieben worden: das heißt, die Fingerdomäne ist verschiedentlich als eine Sequenz enthaltend beschrieben worden, die essentiell oder zumindest von großer Wichtigkeit für die hohe Bindungsaffinität an Fibrin ist. (Es wird angenommen, daß diese Aktivität wichtig für die hohe Spezifität ist, die menschlicher Gewebeplasminogenaktivator bezüglich Gerinnsellyse an der Stelle eines fibrinreichen Thrombus aufweist.) Der wachstumsfaktorartige Bereich ist ebenso mit Zelloberflächenbindungsaktivität assoziiert worden, zumindest was Urokinase betrifft. Der Kringle 2-Bereich ist ebenfalls stark mit Fibrinbindung und mit der Fähigkeit von Fibrin assoziiert worden, die Aktivität von t-PA zu stimulieren. Es scheint Einstimmigkeit darüber zu herrschen, daß die Serinproteasedomäne im Molekül Zugpferdfunktion hat, was die plasminogenaktivierende Wirkung betrifft.
Es wird nochmals angemerkt, daß allgemein angenommen worden ist, daß der Fingerbereich die Aminosäuren 1 bis 44 des N-Terminus überspannt, und verschiedene Forscher haben sich bemüht, Mutanten oder Varianten zu erzeugen, indem Segmente dieses Bereichs gelöscht oder teilweise gelöscht wurden.
N-gebundene Glykosylierungsstellen existieren im Molekül an den Aminosäurepositionen 117, 184, 218 und Aminosäure 448. Die Stelle bei Aminosäure 218 ist nicht glykosyliert. Die Glykosylierungsstelle an Aminosäure 117 ist so charakterisiert worden, daß es sich dabei um einen mannosereichen Typ handelt, während die anderen beiden Stellen sogenannte Komplexoligosaccharidstrukturen aufweisen. Die Stellen 117 und 448 scheinen immer glykosyliert zu sein, wenn das Molekül von einer Wirtszelle abgeleitet ist, die Glykosylierung bewirken kann, während angenommen wird, daß Stelle 184 bei etwa 50% der Moleküle glykosyliert ist. Dieses letztere Phänomen der Glykosylierung/Nichtglykosylierung an 184 ist mittels SDS-PAGE-Analyse demonstriert worden, wo zwei Banden zu sehen sind, von denen eine mit an 184 glykosylierten Molekülen und die andere mit an 184 nichtglykosylierten Molekülen assoziiert ist: sogenannter t-PA vom Typ I und Typ II. Dieses Muster der teilweisen Glykosylierung kann davon herrühren, daß die Stelle 184 in einer konformationsgeschützten Position zwischen den beiden Kringlestrukturen angeordnet ist.
Eine dritte Stelle, der wissenschaftliche Aufmerksamkeit gewidmet worden ist, ist die sogenannte proteolytische Spaltstelle innerhalb des Bereichs, der durch die Aminosäuren 275 bis etwa 279, und im speziellen die Bindung zwischen Aminosäure 275 und 276 des nativen Moleküls begrenzt ist. Mutagenese an dieser Stelle, um sie weniger anfällig für proteolytischen Abbau zu machen, erzeugt ein Molekül, das in einer Einzel- oder Einkettenform verbleibt, von der angenommen wird, daß sie biologisch und kommerziell bestimmte Vorteile bietet.
Alle diese definierten Domänen, Glykosylierungsstellen und Einketten-/Zweiketten- Spaltstellen sind so beschrieben und definiert worden, daß sie spezifische Komponenten mit potenter biologischer Aktivität aufweisen. Beispielsweise führt das Entfernen eines beträchtlichen Abschnitts der oder der gesamten Fingerdomäne zu einem Molekül mit im wesentlichen beeinträchtigten Fibrinbindungseigenschaften, obwohl es im Gegenzug eine Abnahme der Gesamtclearancerate der resultierenden Einheit ergibt.
Die Modifikation des nativen Moleküls, um die Einketten-zu-Zweiketten-Spaltstelle zu zerstören, führt als solches zu einem Molekül mit einer etwas geänderten biologischen Aktivität und mehr Stabilität, während die Fibrinbindung und Fibrinstimulation bezogen auf den zweikettigen t-PA erhöht werden.
Die Änderung der Glykosylierungsstellen, insbesondere an Aminosäure 117, scheint unweigerlich zu einem Molekül zu führen, das beeinflußte Solubilitätseigenschaften aufweist, die außerdem zu einem geänderten Halbwertszeitmuster und/oder Fibrinbindungseigenschaften führen.
In Anbetracht der Tatsache, daß hohe Fibrinspezifität und Bindungseigenschaften wünschenswerte Ergebnisse sind, die ein menschlicher Gewebeplasminogenaktivator, insbesondere verschiedene veränderte Derivate oder Varianten davon, aufweisen soll(en) (siehe beispielsweise EP-A-234.051, veröffentlicht am 2. September 1987), wird nach dem Stand der Technik davon abgeraten, den Fingerbereich zu ändern, abgesehen von der überraschenden Entdeckung, daß solche geänderten Spezies dramatisch verringerte Clearanceraten aufweisen. Aber dennoch ist in Anbetracht der kommerziellen Bedeutung von Fibrinbindung und Fibrinspezifität ein von Forschern wahrgenommenes Ziel, Varianten oder Derivate von menschlichem Plasminogenaktivator zu erzeugen, die hohe Fibrinbindungsaktivität haben, ohne die anderen wünschenswerten biologischen und pharmakokinetischen Eigenschaften zu ändern, die ansonsten mit dem nativen Material verbunden sind. Jedoch ist der Forschungsweg zur Herstellung solcher Varianten oder Derivate von menschlichem Plasminogenaktivator aus dem bestehenden Stand der Technik nicht völlig klar. Siehe beispielsweise die am 12. August 1987 veröffentlichte EP-A-231.624.
Die Ungewißheit, ob und wo das t-PA-Nativmolekül für beabsichtigte verbesserte fibrinolytische Eigenschaften zu verändern ist, wird besonders durch eine vor relativ kurzer Zeit veröffentlichte Patentveröffentlichung unterstrichen, die die Bezeichnung WO 87/ 04722 (veröffentlicht am 13. August 1987) hat. Diese Veröffentlichung bespricht ein ausgearbeitetes Papiermosaik potentieller Varianten von t-PA. Obwohl sich die Veröffentlichung auf drei Bereiche bezieht, nämlich den Amino-N-Terminus, Glykosylierungsstellen und eine einzige Kettenspaltstelle, gibt es keine Hinweise auf eine tatsächliche Gewinnung einer t-PA-Spezies und keine Bioaktivität oder andere Daten; daher wurde in der Veröffentlichung lediglich "in Betracht gezogen", daß die Proteine verbesserte fibrinolytische Profile im Verhältnis zu nativem menschlichem t-PA aufweisen, die Veröffentlichung nahm jedoch nicht Bezug darauf, was damit entweder qualitativ oder quantitativ genau gemeint ist. Viele der wohl unter einem Sammelbegriff zusammengefaßten Varianten haben unter Umständen schwächere fibrinolytische Aktivität. Als solches dient sie bestenfalls als relativ komplexes Mosaik, von dem aus man zu Experimenten eingeladen wird - mehr nicht.
Ein grundlegendes Ziel der vorliegenden Erfindung liegt in der Gewinnung, Identifizierung und Charakterisierung von t-PA-Varianten mit modulierten Fibrin-Bindungsaktivitäten sowie in den Verfahren und Mitteln zur Erreichung dieser Ziele. In ihren bevorzugtesten Ausführungsformen richtet sich das Ziel auf die Herstellung erhöhter Fibrinbindung an t-PA-Varianten über Domänen, die hier als jene angeführt sind, die für eine solche Fibrinbindung verantwortlich sind, und insbesondere an t-PA-Varianten, die möglicherweise im Vergleich zu nativem t-PA weniger Fibrinbindung aufweisen, was durch unterschiedliche Modifizierungen im t-PA-Molekül zum Zweck der Verbesserung einer oder mehrerer anderer Eigenschaften verursacht wird, die für die fibrinolytische Gesamtaktivität, z. B. Halbwertszeit und/oder die Clearancerate, relevant sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher t-PA-Varianten mit modulierter Fibrinbindung und alle Rekombinationsmittel in Zusammenhang mit ihrer Herstellung, z. B. DNA-Isolate, die für dieselben kodieren, DNA, die mit solchen Isolaten hybridisiert, Klonvektoren, die solche DNA enthalten, operable Expressionsvektoren davon, mit solchen Vektoren transfizierte Wirte, Kulturen, die demnach fähig sind, die t-PA-Varianten zu produzieren, vor allem als in das umgebende Medium sekretierte Expressionsprodukte, sowie die zur Erreichung aller obigen Punkte notwendigen Verfahren. Die vorliegende Erfin dung betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die wirksame Mengen solcher t-PA-Varianten enthalten, und Verfahren zur Verabreichung solcher Zusammensetzungen an Menschen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch verschiedene Verfahren, die t-PA-Varianten davon verwenden. Die Varianten können durch Herstellung einer menschlichen t-PA-Variante, die modulierte Fibrinbindung in bezug auf nativen t-PA aufweist, durch Herstellung einer pharmazeutisch verträglichen, die t-PA-Variante enthaltenden Zusammensetzung in therapeutisch wirksamen Konzentrationen und durch Verabreichen dieser Zusammensetzung an den Patienten zur Behandlung von Gefäßerkrankungen bei einem Patienten verwendet werden.
Hierin wird ein Verfahren zur Bereitstellung eines Proteins einer menschlichen t-PA-Variante geoffenbart, die in bezug auf nativem t-PA modulierte Fibrinbindung aufweist, wobei das Verfahren die Gewinnung einer t-PA-Variante umfassend einen modifizierten t-PA, das Vergleichen der Fibrinbindung der Variante mit jener des nativen t-PA und das Selektieren einer so gewonnenen t-PA-Variante umfaßt, die eine modulierte Fibrinbindung in bezug auf nativen t-PA aufweist.
Die Gesamtwirkung der vorliegenden Erfindung besteht darin, Fibrinbindung und Fibrinstimulierung, eine gewünschte, für nativen t-PA als fibrinolytisches Mittel einzigartige Eigenschaft vor allem dort wiederherzustellen, wo es sich herausstellte, daß diese Eigenschaft als Folge der Modifizierung von nativem t-PA in anderer Hinsicht fehlte, um eine oder mehrere andere gewünschte Eigenschaften zu verleihen. Das Entfernen der gesamten oder eines Teils der Fingerdomäne und/oder Wachstumsdomäne und/oder Kringle 1-Domäne führt dazu, daß die Varianten beispielsweise die gewünschte Eigenschaft einer erhöhten Halbwertszeit und einer verminderten Clearancerate im Verhältnis zu nativem t-PA aufweisen. Diese Varianten haben jedoch als Folge verringerte Fibrinbindungseigenschaften, eine für die einzigartige t-PA-fibrinolytische Aktivität wesentliche Eigenschaft. In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die letztere wieder her, wodurch Varianten geschaffen werden, die im Verhältnis zu nativem t-PA allgemein verbesserte Eigenschaften aufweisen, z. B. nativem t-PA ähnliche Fibrinbindungseigenschaften und eine höhere Halbwertszeit/niedrigere Clearancerate im Vergleich zu nativem t-PA.
Genauer gesagt wird hierin ein Verfahren zur Bereitstellung einer menschlichen t-PA- Variante geoffenbart, die im Vergleich zu nativem t-PA modulierte Fibrinbindung aufweist.
Die Erfindung betrifft menschliche Gewebeplasminogenaktivator-(t-PA-)Varianten, wie in den Ansprüchen definiert, die durch funktionelle Entfernung zumindest eines Abschnittes einer Domäne modifiziert sind, die für die Fibrinbindung verantwortlich ist, die aber wiederhergestellte, mit der Fibrinbindung von nativem t-PA vergleichbare Fibrinbindung aufweisen.
Die vorliegende Erfindung beruht unter anderem auf spezifischer erfolgreicher Forschung, die zeigt, daß große Veränderungen der Fingerdomäne, was selbst schon die Fibrinbindungsaktivität deutlich senkt, sowie molekulare Veränderungen der 184 Glykosylierungsstelle, der einkettigen oder zweikettigen Spaltstelle und/oder der mutmaßlichen Lysin-Bindungsstelle von Kringle 2 dazu führen, daß die Varianten des menschlichen Plasminogenaktivators überraschenderweise die grundlegenden biologischen und pharmakologischen Eigenschaften oder Merkmale des nativen Gewebeplasminogenaktivators beibehalten und die wesentliche Wiederherstellung der guten Fibrinbindungseigenschaften aufweisen. Das Ergebnis sind Moleküle, die, obwohl sie sich wesentlich von nativem Material in der Gesamt-Aminosäuresequenz unterscheiden, dessen gewünschte fibrinolytische Eigenschaften der Art beibehalten und bis zu einem bestimmten Grad deren mit nativem Material konkurrierende Nutzung im kommerziellen Bereich ermöglichen.
Hierin werden menschliche Plasminogenaktivatorvarianten geoffenbart (von den Ansprüchen umfaßt oder nicht), die zumindest einen Abschnitt der Fingerdomäne nicht aufweisen, die an der Aminosäure 184 umgebenden Glykosylierungsstelle kein Glykosylierungspotential aufweisen und Beständigkeit gegenüber protolytischer Spaltung an der Aminosäuren 275 und 276 umgebenden Stelle und/oder Aminosäuremodifizierungen an der mutmaßlichen Lysin-Bindungsstelle von Kringle 2 aufweisen. Diese Ausführungsform ist durch neuartige t-PA-Variantenpezies gekennzeichnet: beispielsweise ein Molekül ohne die Aminosäuren 1 bis 44 (bezeichnet als des 1-44), das gegebenenfalls an Position 184 (bezeichnet als D184) Asparaginsäure aufweist und an Position 275 (bezeichnet als E275) Glutaminsäure aufweist, wobei diese Spezies daher hierin als Gesamtbezeichnung mit der Abkürzung des 1-44D184E275-t-PA und des 1-44E275-t-PA versehen sind, und z. B. ein Molekül ohne die Aminosäuren 1-44 (bezeichnet als des 1-44) mit Glutaminsäure an Position 275 und RARR an Aminosäurepositionen 210-3, das hierin als des 1-44R210A211R212R213E275-t-PA bezeichnet wird.
Hinsichtlich dieser abkürzenden Bezeichnungen von t-PA-Varianten ist anzumerken, daß sich die Zahlen auf den/die Aminosäurerest/Position entlang der 527 Aminosäurensequenz von mutmaßlich reifem t-PA gemäß EP-A-093.619 beziehen. Die Identifizierung der Aminosäuren bedient sich des Einbuchstaben-Aminosäure-Alphabets, d. h.:
Asp D Asparaginsäure Ile I Isoleucin
Thr T Threonin Leu L Leucin
Ser S Serin Tyr Y Tyrosin
Glu E Glutaminsäure Phe F Phenylalanin
Pro P Prolin His H Histidin
Gly G Glycin Lys K Lysin
Ala A Alanin Arg R Arginin
Cys C Cystein Trp W Tryptophan
Val V Valin Gln Q Glutamin
Met M Methionin Asn N Asparagin
Die Zahl hinter den Einzelbuchstaben bezieht sich auf die Aminosäureposition, z. B. D184 bedeutet eine Variante, die unter anderem eine Asparaginsäure an Position 184 aufweist.
Speziell werden t-PA-Varianten geoffenbart, denen zumindest einen Abschnitt der Fingerdomäne fehlt, z. B. des 1-44, und/oder die gegenüber der Spaltung an der 275/6 Spaltstelle durch auferlegte Modifizierungen im Aminosäurebereich 275 bis 279 resistent sind, z. B. E275 und E275I277, weswegen z. B. des 1-44E275, des 1-44E2751277 und alle oben erwähnten gegebenenfalls in verschiedenen anderen Bereichen des Moleküls modifiziert sind, z. B.:
1) Kringle 2-Modifizierungen, z. B. im Aminosäurebereich von etwa 205-215, insbesondere 210-3, und/oder
2) an den Aminosäuren von etwa 244-255, insbesondere an 252 oder deren Stelle, und/oder
3) an den Aminosäuren von etwa 233-242, insbesondere 236-8, und/oder
4) bekannte oder neu eingeführte Glykosylierungsstellen, z. B. Aminosäure 184, und/oder
5) Andere Modifizierungen, die zu t-PA-Varianten führen, die durch erhöhte Fibrinbindung im Vergleich zu nativem t-PA oder zu einer Variante davon identifizierbar sind, die im Vergleich zu nativem t-PA eine verringerte Fibrinbindung, aber eine andere verbesserte biologische Eigenschaft aufweist, die im Prinzip nicht beeinflußt wird.
Spezielle Ausführungsformen der oben erwähnten Varianten sind:
des 1-44D184E275-t-PA,
des 1-44S184E275-t-PA,
des 1-44K213E275-t-PA,
des 1-44R210A211R212R213E275-t-PA (besonders bevorzugte Spezies, siehe oben),
des 1-44R252E275-t-PA,
des 1-44K210E275-t-PA,
des 1-44R210H211Q212K213E275-t-PA,
sowie alle obigen, die zusätzlich die 1277 Modifizierung aufweisen, und Kombinationen und Permutationen davon, z. B. des 1-44R212R252E275-t-PA etc.
Zusätzliche Ausführungsformen umfassen t-PA-Varianten mit oder ohne einen intakten (Abschnitt einer) Fingerdomäne (z. B. die Aminosäuren 1-44), und/oder mit einer gelöschten (oder partiellen) Wachstumsfaktordomäne (z. B. etwa des 44-84) und/oder einer gelöschten (oder partiellen) Kringle 1-Domäne (z. B. etwa des 92-179), und/oder einer gelöschten (oder partiellen) Kringle 2-Domäne (z. B. etwa des 174-261), die alle die Clearanceraten im Vergleich zu nativem t-PA merklich verändern können, alle der obigen kombiniert mit den oben erwähnten bevorzugten Varianten, z. B. E275, E275I277, Q275I277 usw. Weiters kann die Fibrinbindung von t-PA durch geeignete Substitutionen von positiv oder negativ geladenen Aminosäureresten auf den gegenüberliegenden Rändern der mutmaßlichen Ligandenbindungstasche von t-PA moduliert, am bevorzugtesten wiederhergestellt oder erhöht, werden.
So werden die folgenden Varianten hierin geoffenbart:
des 1-44D184R210A211R212R213R252E275-t-PA,
des 92-179D184R210A211R212R213R252E275-t-PA,
des 44-8DD184R210A211R212R213R252E275-t-PA oder die N184- und S184-Analogen davon.
Fig. 1 ist eine schematische Darstellung, wie Plasmid pETPFR (pPADHFR-6) hergestellt werden kann, und zeigt auch eine partielle Restriktionskartierung davon.
Fig. 2 ist eine schematische Darstellung, wie Plasmid pCVSVPA-N44D22 hergestellt werden kann, und zeigt auch eine partielle Restriktionskartierung davon.
Fig. 3 ist eine schematische Darstellung, wie Plasmid p1154 hergestellt werden kann, und zeigt auch eine partielle Restriktionskartierung davon.
Fig. 4 ist eine schematische Darstellung, wie Plasmid p652 hergestellt werden kann, und zeigt auch eine partielle Restriktionskartierung davon.
Die Fig. 5 und 6 sind schematische Darstellungen, wie Plasmid pCISt-PA hergestellt werden kann, und zeigen auch eine partielle Restriktionskartierung davon.
Fig. 7 ist eine schematische Darstellung, wie Plasmid p1060 hergestellt werden kann, und zeigt auch eine partielle Restriktionskartierung davon.
Fig. 8 ist eine schematische Darstellung, wie Plasmid p1179 hergestellt werden kann, und zeigt auch eine partielle Restriktionskartierung davon.
Fig. 9 zeigt die Sequenz der von Plasmid p1179 kodierten des 1-44E275-t-PA-Mutante.
Fig. 10 zeigt die pharmakokinetischen Profile der verschiedenen Dömänenlöschungsmutanten bei Hasen: Wachstumsfaktorlöschung, des 44-84 ("d-GF"); Kringle 1-Löschung, des 92-179 ("d-K1"); Kringle 2-Löschung, des 174-261 ("d-K2") und nativer t-PA ("rt-PA") als Vergleich.
Fig. 11 zeigt die Fibrinbindungseigenschaften der verschiedenen Domänenlöschungsmutanten (siehe Fig. 10), einschließlich der Fingerlöschung des 1-44, als Prozentsatz an Bindung über der Fibrin(ogen)konzentration ausgedrückt.
Fig. 12 zeigt die Fibrinbindung der folgenden Moleküle bei einer t-PA-Konzentration von 30 ng/ml: zweikettiger nativer t-PA, des 1-44E275, des 1-44K210E275, des 1-44R252 E275, des 1-44D184E275, des 1-44N238E275, des 1-44R210A211R212R213E275. Die Ergebnisse zeigen Mittelwerte mehrerer unabhängiger Beobachtungen (Anzahl der Be obachtungen in Klammern). (Alle außer nativem werden in 293-Zellen vorübergehend exprimiert.)
Fig. 13 zeigt die Fibrinbindung der folgenden Moleküle bei einer t-PA-Konzentration von 100 ng/ml: des 1-44E275, des 1-44K210E275, des 1-44K213E275, des 1-44R252E275, des 1-44D184E275, des 1-44N238E275, des 1-44R210A211R212R213E275. Die Ergebnisse zeigen Mittelwerte von mehreren unabhängigen Beobachtungen (Anzahl der Beobachtungen in Klammern). (Alle stammten vom in 293-Zellen vorübergehend exprimierten Material.)
Fig. 14 zeigt die Fibrinbindung der folgenden Moleküle bei einer t-PA-Konzentration von 500 ng/ml: zvveikettiges des 1-44, des 1-44E275, des 1-44K210E275, des 1-44K213 E275, des 1-44D184E275. Die Ergebnisse zeigen Mittelwerte mehrerer unabhängiger Beobachtungen (Anzahl der Beobachtungen in Klammern). (Alle außer nativem und des 1- 44 stammten aus vorübergehend in 293-Zellen exprimierten Material.)
Fig. 15 zeigt die Fibrinbindung der folgenden Moleküle bei einer t-PA-Konzentration von 100 ng/ml: rt-PA, zweikettiger nativer rt-PA, des 1-44E275 und des 1-44D184E275. Alle Moleküle wurden in stabilen CHO-Zellinien produziert.
Fig. 16 zeigt in vitro-Gerinnsel-Lyse-Ergebnisse, ausgedrückt als Prozentsatz der nativen spezifischen Aktivität, für die folgenden Moleküle: des 1-44, des 1-44E275, des 1-445184, E275, des 1-44E253E275, des 1-44D184E275, des 1-44N238E275, des 1-44R252E275, des 1-44K210E275, des 1-44K213E275, des 1-44R210A211R212R213E275, des 1-44R210 Q211Q212K213E275. Die Ergebnisse zeigen Mittelwerte mehrerer Beobachtungen (Anzahl der Beobachtungen in Klammern). (Alle außer des 1-44 stammten aus vorübergehend in 293-Zellen exprimiertem und durch ELISA quantifiziertem Material.)
Fig. 17 zeigt in vitro Gerinnsel-Lyse-Ergebnisse, ausgedrückt als Prozentsatz der nativen spezifischen Aktivität, für die folgenden Moleküle: rt-PA, des 1-44, des 1-44E275, des 1- 44D184E275. (Alle Moleküle wurden in stabilen CHO-Zellinien produziert.)
Fig. 18 zeigt die pharmakokinetischen Profile der folgenden Moleküle (alle in stabilen CHO-Zellinien produziert) bei Hasen: nativer t-PA ("rt-PA"), des 1-44 ("N44"), des 1- 44E275 ("N44-EIK"), des 1-44D184E275 ("N44-EIL-D184").
Es folgt eine ausführliche Beschreibung der Verfahren, die zur spezifischeren praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung angewendet werden können und enthält Details, die zu dieser Zeit als bester verfügbarer Modus galten. Die folgende Beschreibung ist zwar sehr ausführlich, doch darf dies nicht den Gesamtschutzbereich einschränken; der Schutzbereich der vorliegenden Erfindung ist nur durch den gesetzmäßigen Aufbau der beigelegten Patentansprüche definiert.

A. Definitionen/Allgemeine Verfahren

1. Stellenspezifische Mutagenese

Die Herstellung von t-PA-Varianten gemäß vorliegender Erfindung erfolgt vorzugsweise durch stellenspezifische Mutagenese von DNA, die für eine zuvor hergestellte Variante oder eine keine Variante darstellende Version des Proteins kodiert. Stellenspezifische Mutagenese ermöglicht die Herstellung von t-PA-Varianten durch die Verwendung spezifischer Oligonukleotidsequenzen, die für die DNA-Sequenz der gewünschten Mutation sowie eine ausreichende Anzahl angrenzender Nukleotide kodiert, um eine Primersequenz mit ausreichender Größe und Sequenzkomplexizität zu schaffen, um ein stabiles Duplex an beiden Seiten des überquerten Löschungsknotenpunktes zu schaffen. Typischerweise wird ein Primer mit einer Länge von etwa 20 bis 25 Nukleotiden bevorzugt, wobei etwa 5 bis 10 Reste an beiden Seiten des Knotenpunktes geändert werden. Im allgemeinen ist die Technik der stellenspezifischen Mutagenese nach dem Stand der Technik bekannt, wie beispielsweise durch Veröffentlichungen wie Adelman et al., DNA 2, 183 (1983). Wie anerkannt werden wird, wird für die Technik typischerweise ein Phagenvektor eingesetzt, der sowohl in einstrangiger als auch doppelstrangiger Form vorliegt. Typische Vektoren, die für Stellengerichtetheit und Mutagenese nützlich sind, umfassen Vektoren wie z. B. den M13-Phagen, wie beispielsweise von Messing et al., "Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA", A. Walton (Hrsg.), Elsevier, Amsterdam (1981), geoffenbart. Diese Phagen sind problemlos im Handel erhältlich, und ihre Verwendung ist Fachleuten allgemein bekannt. Alternativ dazu können Plasmidvektoren, die einen einstrangigen Phagen-Replikationsursprung enthalten (Veira et al., Meth. Enzymol. 153, 3 (1987), eingesetzt werden, um einstrangige DNA zu erhalten.
Im allgemeinen wird stellengerichtete Mutagenese gemäß vorliegender Erfindung durchgeführt, indem zuerst ein einstrangiger Vektor erhalten wird, der innerhalb seiner Sequenz eine DNA-Sequenz enthält, die für Gewebeplasminogenaktivator kodiert. Ein Oligonukleotidprimer, der die gewünschte mutierte Sequenz aufweist, wird, im allgemeinen synthetisch, beispielsweise nach dem Verfahren von Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 5765 (1978), hergestellt. Dieser Primer wird dann mit dem einstrangige t-PA-Sequenz enthaltenden Vektor ringgeschlossen und DNA-Polymerisations-Enzymen, wie z. B. E. coli-Polymerase I-Klenow-Fragment ausgesetzt, um die Synthese des Mutation aufweisenden Stranges abzuschließen. So wird ein Heteroduplex gebildet, worin ein Strang für die ursprüngliche nicht-mutierte Sequenz kodiert und der zweite Strang die gewünschte Mutation aufweist. Dieser Heteroduplexvektor wird dann verwendet, um geeignete Zellen, wie z. B. JM101-Zellen, zu transformieren, und es werden Klone selektiert, die rekombinierte Vektoren enthalten, welche die mutierte Sequenzanordnung aufweisen.
Nachdem ein solcher Klon selektiert wurde, kann der mutierte t-PA-Bereich entfernt und zur t-PA-Produktion in einen geeigneten Vektor eingebracht, im allgemeinen in einen Expressionsvektor des Typs, der zur Transformation eines geeigneten eukaryotischen Wirts verwendet werden kann. Im Kontext der vorliegenden Erfindung werden CHO- Zellen oder 293-Zellen zur Herstellung von langfristig stabilen t-PA-Produzenten bevorzugt. Jedoch ist die Erfindung nicht auf CHO-Produktion beschränkt, da bekannt ist, daß zahlreiche andere Zelltypen eingesetzt werden können, insbesondere, wenn nur die vorübergehende Produktion des Enzyms für Testzwecke gewünscht wird. Beispielsweise wird nachstehend ein Übergangssystem unter Verwendung von 293-Zellen beschrieben (Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 59 (1977), das ein geeignetes System zur Herstellung von t-PA-Varianten für analytische Zwecke darstellt.

2. Wirtszellkulturen und Vektoren

Die CHO-Expression wird zwar schlußendlich für die t-PA-Produktion bevorzugt, aber die hierin geoffenbarten Vektoren und Verfahren eignen sich zur Verwendung in Wirtszellen über einen weiten Bereich prokaryotischer und eukaryotischer Organismen.
Im allgemeinen werden Prokaryoten selbstverständlich für das anfängliche Klonieren von DNA-Sequenzen und Konstruieren der Vektoren bevorzugt, die für die vorliegende Erfindung nützlich sind. Beispielsweise ist E. coli K12-Stamm 294 (ATCC Nr. 31446) besonders gut geeignet. Andere Mikrobenstämme, die verwendet werden können, sind E. coli-Stämme wie z. B. E. coli B und E. coli X1776 (ATTC Nr. 31537). Diese Beispiele sind selbstverständlich zur Veranschaulichung und nicht zur Einschränkung bestimmt.
Prokaryoten können auch zur Expression verwendet werden. Die obengenannten Stämme, sowie E. coli W3110 (F-, λ-, prototroph, ATTC Nr. 27325), Bazillen, wie z. B. Bacillus subtilis, und andere Enterobakteriaceae, wie z. B. SaImonella typhimurium oder Serratia marcesans, und verschiedene Pseudomonasspezien können verwendet werden.
Im allgemeinen werden in Verbindung mit diesen Wirten Plasmidvektoren verwendet, die Replikon- und Kontrollsequenzen enthalten, die aus Spezies abgeleitet sind, die mit der Wirtszelle kompatibel sind. Der Vektor trägt üblicherweise eine Replikationsstelle sowie Markierungssequenzen, die fähig sind, für phänotypische Selektion in transfor mierten Zellen zu sorgen. Beispielsweise wird E. coli typischerweise unter Verwendung von pBR322 transformiert, ein Plasmid, das von E. coli-Spezies abgeleitet ist (siehe beispielsweise Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977). pBR 322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetrazyklinresistenz und bietet so eine einfache Einrichtung zur Identifizierung transformierter Zellen. Das pBR322-Plasmid oder ein anderes/-er mikrobielles/-er Plasmid oder Phage muß auch Promotoren enthalten, die vom mikrobiellen Organismus zur Expression seiner eigenen Proteine verwendet werden können, oder so modifiziert werden, daß er diese enthält.
Zu den bei der DNA-Rekombinations-Konstruktion am häufigsten verwendeten Promotoren gehören β-Lactase (Penicillinase) und Lactosepromotorsysteme (Chang et al., Nature 375, 615 (1978); Itakura et al., Science 198, 1056 (1977), Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)) und ein Tryptophan-(trp-)Promotorsystem (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980); EP-A-0.036.776). Dabei handelt es sich zwar um die am häufigsten verwendeten, aber es sind auch andere mikrobielle Promotoren entdeckt und eingesetzt worden, und Details bezüglich ihrer Nukleotidsequenzen sind veröffentlicht worden, was es einem Fachmann möglich macht, sie funktionell mit Plasmidvektoren zu ligieren (siehe z. B. Siebenlist et al., Cell 20, 269 (1980).
Neben Prokaryoten können auch eukaryotische Mikroben wie Hefekulturen verwendet werden. Saccharomyces cerevisiae, oder gemeine Backhefe, ist die am häufigsten verwendete unter den eukaryotischen Mikroorganismen, obwohl auch eine Anzahl anderer Stämme allgemein erhältlich ist. Zur Expression in Saccharomyces wird beispielsweise üblicherweise das Plasmid YRp7 verwendet (Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); Tschemper et al., Gene 10, 157 (1980)). Dieses Plasmid enthält bereits das trp1-Gen, das eine Selektionsmarkierung für einen Mutantenstamm von Hefe darstellt, dem die Fähigkeit zum Wachstum in Tryptophan fehlt, beispielsweise ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones, Genetics 85, 12 (1977)). Das Vorhandensein der trp1-Läsion als ein Merkmal des Hefewirtszellengenoms bietet dann eine wirksame Umgebung zum Nachweisen von Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan.
Geeignete Promotorsequenzen in Hefevektoren sind die Promotoren für 3-Phosphoglycerat-Kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); Holland et al., Biochemistry 17, 4900 (1978)), wie z. B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat-Decarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphat-Isomerase, 3-Phosphoglycerat-Mutase, Pyruvat-Kinase, Triosephosphat-Isomerase, Phosphoglucose-Isomerase und Glucokinase. Beim Konstruieren geeigneter Expressionsplasmide werden die mit diesen Genen assoziierten Terminationssequenzen ebenfalls in den Expressionsvektor ligiert, 3' von der Sequenz, deren Exprimierung gewünscht wird, um für Polyadenylierung der mRNA und Termination zu sorgen. Andere Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil von durch Wachstumsbedingungen gesteuerter Transkription haben, sind der Promotorbereich für Alkohol-Dehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, mit dem Stickstoffstoffwechsel assoziierte Abbauenzyme und die obengenannte Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, sowie Enzyme, die für den Maltose- und Galaktose-Verbrauch verantwortlich sind. Es ist jeder Plasmidvektor geeignet, der hefekompatiblen Promotor, Replikationsursprungs- und Terminationssequenzen enthält.
Neben Mikroorganismen können auch Zellkulturen als Wirte verwendet werden, die von mehrzeiligen Organismen abgeleitet sind. Im Prinzip ist jede solche Zellkultur einsetzbar, gleichgültig, ob sie von Wirbeltier- oder Wirbellosen-Kulturen stammt. Allerdings war das Interesse an Wirbeltierzellen am größten, und die Vermehrung von Wirbeltierzellen in Kultur (Gewebekultur) ist in den letzten Jahren ein Routineverfahren geworden ["Tissue Culture, Academic Press, Kruse und Patterson (Hrsg.) (1973)]. Beispiele für solche geeigneten Wirtszellinien sind VERO und HeLa-Zellen, China-Hamster-Eierstock-(CHO-)Zellinien, und W138-, BHK-, COS-7-, 293- und MDCK-Zellinien. Expressionsvektoren für solche Zellen enthalten üblicherweise (falls erforderlich) einen Repli kationsursprung, einen Promotor, der vor dem zu exprimierenden Gen angeordnet ist, zusammen mit allen notwendigen Ribosombindungsstellen, RNA-Spleißstellen, Polyadenylierungsstellen und Transkriptionsterminationssequenzen.
Zur Verwendung bei Säugetierzellen werden die Kontrollfunktionen über die Expressionsvektoren häufig von viralem Material erfüllt. Beispielsweise werden üblicherweise verwendete Promotoren von Polyoma, Adenovirus 2 und am häufigsten Affen Virus 40 (SV40) abgeleitet. Die frühen und späten Promotoren von SV40-Virus sind besonders nützlich, weil beide leicht als Fragment aus dem Virus erhalten werden, welches Fragment auch den viralen SV40-Replikationsursprung enthält (Fiers et al., Nature 273, 113 (1978)). Kleinere oder größere SV40-Fragmente können ebenfalls verwendet werden, vorausgesetzt, daß die Sequenz mit etwa 250 bp enthalten ist, die sich von der HindIII- Stelle zur BgII-Stelle hin erstreckt, die im viralen Replikationsursprung angeordnet ist. Weiters ist es auch möglich und oft wünschenswert, Promotor- oder Kontrollsequenzen einzusetzen, die normalerweise mit der gewünschten Gensequenz assoziiert sind, vorausgesetzt, daß solche Kontrollsequenzen mit dem Wirtszellensystem kompatibel sind.
Ein Replikationsursprung kann entweder geschaffen werden, indem der Vektor so konstruiert wird, daß er einen exogenen Ursprung enthält, wie er von SV40 oder einer anderen viralen Quelle (z. B. Polyoma, Adeno, VSV, BPV) abgeleitet werden kann, oder kann durch den chromosomalen Replikationsmechanismus der Wirtszelle geschaffen werden. Wenn der Vektor in das Wirtszellenchromosom integriert ist, reicht letzteres oft aus.
Bei der Auswahl einer bevorzugten Wirtszelle zur Transfektion durch die Vektoren gemäß vorliegender Erfindung, die DNA-Sequenzen umfassen, die sowohl für t-PA-Varianten als auch DHFR-Protein kodieren, wird der Wirt geeigneterweise je nach dem Typ des verwendeten DHFR-Proteins ausgewählt. Wenn Wildtyp-DHFR-Protein verwendet wird, wird vorzugsweise eine Wirtszelle gewählt, der DHFR fehlt, wodurch die Ver wendung der DHFR-Kodiersequenz als Markierung für die erfolgreiche Transfektion in selektivem Medium ermöglicht wird, dem Hypoxanthin, Glycin und Thymidin fehlen. Eine geeignete Wirtszelle ist in diesem Fall die China-Hamster-Eierstock-(CHO-)Zellinie, der DHFR-Aktivität fehlt, wie sie von Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77, 4216 (1980), beschrieben, hergestellt und vermehrt wird.
Andererseits ist, wenn DHFR-Protein mit geringer Bindungsaffinität für Methotrexat (MTX) als Kontrollsequenz verwendet wird, nicht notwendig, Zellen mit DHFR-Mangel zu verwenden. Da die mutierte DHFR gegen Methotrexat resistent ist, kann MTX-hältiges Medium als Mittel zur Selektion verwendet werden, vorausgesetzt, die Wirtszellen sind selbst methotrexat-empfindlich. Die meisten eukaryotischen Zellen, die zur Absorption von MTX fähig sind, scheinen methotrexat-empfindlich zu sein. Eine solche nützliche Zellinie ist eine CHO-Linie, CHO-K1 (ATCC Nr. CCL 61).
Von Zellkulturen werden zufriedenstellende Mengen an menschlichem t-PA produziert; allerdings dienen Verfeinerungen unter Verwendung einer sekundären Kodiersequenz dazu, die Produktionsmengen noch weiter zu erhöhen. Die sekundäre Kodiersequenz enthält Dihydrofolat-Reduktase (DHFR), die durch einen extern gesteuerten Parameter, wie z. B. Methotrexat, beeinflußt wird, sodaß eine Steuerung der Expression durch Steuerung der MTX-Konzentration ermöglicht wird.

3. Typische einsetzbare Methodik

Wenn Zellen ohne unüberwindliche Zellmembranbarrieren als Wirtszellen verwendet werden, werden Transfektionen nach dem Kalziumphosphatfällungsverfahren durchgeführt, wie von Graham und Van der Eb, Virology 52, 546 (1978), beschrieben. Allerdings können auch andere Verfahren zum Einbringen von DNA in Zellen eingesetzt werden, wie z. B. durch Kerninjektion oder durch Protoplastenfusion.
Wenn prokaryotische Zellen oder Zellen, die nennenswerte Zellwandkonstruktionen enthalten, verwendet werden, ist das bevorzugte Transfektionsverfahren Kalziumbehandlung unter Verwendung von Kalzium, wie von Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 69, 2110 (1972), beschrieben.
Bei der Konstruktion geeigneter Vektoren, welche die gewünschten Kodier- und Kontrollsequenzen enthalten, werden Standard-Ligationstechniken eingesetzt. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, zugeschnitten und in der Form erneut ligiert, die gewünscht wird, um die erforderlichen Plasmide zu bilden.
Die Spaltung wird durch Behandlung mit Restriktionsenzym (oder -enzymen) in geeignetem Puffer durchgeführt. Im allgemeinen wird etwa 1 ug Plasmid oder DNA-Fragmente mit etwa 1 Einheit Enzym in etwa 20 ul Pufferlösung verwendet. (Geeignete Puffer und Substratmengen für bestimmte Restriktionsenzyme sind vom Hersteller angegeben.) Inkubationszeiten von etwa 1 Stunde bei 37ºC sind einsetzbar. Nach der Inkubation wird Protein durch Extraktion mit Phenol und Chloroform entfernt, und die Nukleinsäure wird aus der wäßrigen Fraktion durch Fällung mit Ethanol gewonnen.
Wenn stumpfe Enden erforderlich sind, kann das Präparat 15 Minuten lang bei 15ºC mit 10 Einheiten Polymerase I (Klenow) behandelt, mit Phenol-Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt werden.
Die Größentrennung der gespaltenen Fragmente wird unter Verwendung von 6% Polyacrylamidgel durchgeführt, wie von Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980), beschrieben.
Zur Ligation werden in etwa äquimolare Mengen der gewünschten Bestandteile mit auf geeignete Art zugeschnittenen Enden, um für korrektes Zusammenpassen zu sorgen, mit etwa 10 Einheiten T4-DNA-Ligase pro 0,5 ug DNA behandelt. (Wenn gespaltene Vektoren als Bestandteile verwendet werden, kann es nützlich sein, erneute Ligation des ge spaltenen Vektors durch Vorbehandlung mit bakterieller alkalischer Phosphatase zu verhindern.)
Wie oben besprochen, werden t-PA-Varianten vorzugsweise durch spezifische Mutation hergestellt. In der Praxis der vorliegenden Erfindung nützliche Mutanten werden am einfachsten unter Verwendung spezifischer Oligonukloetidsequenzen gebildet, die für die DNA-Sequenz der gewünschten Löschungsknotenpunkte sowie eine ausreichende Anzahl angrenzender Nukleotide kodieren, um eine Sequenz mit ausreichender Größe und Sequenzkomplexität zu schaffen, um ein stabiles Duplex auf beiden Seiten des überquerten Löschungsknotenpunkts zu bilden.
Zur Analyse zur Bestätigung der korrekten Sequenzen in den konstruierten Plasmiden werden die Ligationsgemische typischerweise verwendet, um E. coli K12-Stamm 294 (ATCC 31446) oder andere geeignete E. coli-Stämme zu transformieren, und erfolgreiche Transformanten gegebenenfalls anhand von Ampicillin- oder Tetrazyklinresistenz selektiert. Plasmide aus den Transformanten werden hergestellt, durch Restriktionskartierung und/oder DNA-Sequenzierung nach dem Verfahren von Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981), oder nach dem Verfahren von Maxam et al., Methods of Enzymology 65, 499 (1980), analysiert.
Nach der Einführung der DNA in den Säugetierzellenwirt und der Selektion in Medium auf stabile Transfektanten, erfolgt Amplifikation von DHFR-Protein-Kodiersequenzen, indem Wirtszellkulturen in Gegenwart von Konzentrationen etwa 20-500.000 nM von MTX, eines kompetitiven Inhibitors der DHFR-Aktivität, gezüchtet werden. Der tatsächliche Konzentrationsbereich ist natürlich in hohem Maße abhängig von der Beschaffenheit des DHFR-Gens, des Proteins und den Eigenschaften des Wirts. Klarerweise können allgemein definierte Ober- und Untergrenzen nicht (mit Bestimmtheit) festgelegt werden. Geeignete Konzentrationen anderer Folsäureanaloge oder anderer Verbindungen, die DHFR hemmen, können ebenfalls verwendet werden. MTX selbst jedoch ist geeignet, leicht erhältlich und wirksam.

B. Herstellung von Vergleichsvarianten von t-PA

Die Konstruktion von Plasmid pCVSVPA-N44 D22 wird unten in Verbindung mit der Beschreibung der Herstellung von Plasmid p1154 im Detail beschrieben.
Ebenso werden stellengerichtete Mutageneseversuche unten in Verbindung mit der Herstellung von Plasmid pPADHFR-6 2C9 im Detail beschrieben.
Die des 44-84-Wachstumsfaktordomänen-Löschung, des 92-179-Kringle 1-Domänen-Löschung und des 174-261-Kringle 2-Domänenlöschung wurden ebenfalls durch stellengerichtete Mutagenese unter Verwendung der folgenden Oligonukleotide durchgeführt:
des 44-84 GCAGGGCACAGTGCGAAATAGATACTCGAGCCACGTGCTACG
des 92-179 TGTGAAATAGATACTCGAGCCACGTGCTACTTTGGGAATGGA TCCGCCTACCGTGGC
des 174-261 TTCTGCAGCACCCCTGCCTGCCCACCTGCGGCCTG
(wobei die Delta-Markierungen die Stelle der gelöschten Sequenz anzeigen), und diese wurden verwendet, um Expressionsplasmide auf eine Art analog zur unten angeführten des 1-44-Konstruktion herzustellen, mit der Ausnahme, daß Mutagenese am 1,4 kb BgIII/ApaI-Fragment (in einem einstrangigen Vektor) durchgeführt wurde, der den Großteil der t-PA-Kodiersequenzen enthielt (siehe Fig. 3). Ebenfalls auf eine Art analog zur des 1- 44-Konstruktion könnten prinzipiell die des 44-84- und des 92-179-Mutationen auch auf BgIII/ScaI-Fragmenten isoliert und an die Glu275-Mutationen und die C-terminalen t-PA- Kodiersequenzen auf dem 0,63 kb ScaI/ApaI-Fragment gebunden werden, wodurch Plasmide geschaffen werden, die p1154 wie nachstehend beschrieben ähnlich sind.

C. Herstellung und Verwendung von Expressionsvektoren zur Rekombinations-Produktion von t-PA-Varianten gemäß vorliegender Erfindung

1. Plasmidkonstruktionen

a. Plasmid p1154

1) Plasmid pPADHFR-6

Plasmid pPADHFR-6 (auch als pETPFR bezeichnet) wurde hergestellt, wie beispielsweise in der EP-A-93.619, s. o., beschrieben. Perspektivische Details sind Fig. 1 zu entnehmen. Zusätzlich ist dieses Plasmid an sich und in in CHO-Zellen transfizierter Form am 15. Dezember 1987 bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, unter den ATCC-Nummern 40403 bzw. CRL 9606 hinterlegt worden.

2) Plasmid pCVSVPA-N44 D22

Plasmid pPADHFR-6 (s. o.) wurde mit StuI und EcoRI gespalten, um ein Fragment mit 826 Basenpaaren freizusetzen, das Sequenzen enthielt, die für die t-PA-Präsequenz bis zu Aminosäure 203 kodierten. Dieses Fragment wurde mit dem Vektorfragment von SmaI/EcoRI-gespaltenem M13mpIORF, dem M13-Phagenvektor in replikativer Form [siehe beispielsweise Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules Recombinant DNA, A. Walton (Hrsg.), Elsevier, Amsterdam (1981)] ligiert. Das Zwischenproduktplasmid pPA-N44intA war somit eine replikative Form von M13-Phagen, die den Abschnitt des t-PA-Gens enthielt, aus dem die Codons für die Aminosäuren 1-44 durch stellengerichtete Löschungsmutagenese zu entfernen waren.
Um die Mutagenese durchzuführen, wurde ein Oligonukleotidprimer nach einem Verfahren wie z. B. dem Phosphotriesterverfahren von Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 75, 5765 (1978), hergestellt. Der Primer, der zur Herstellung einer des(1-44)-Mutante eingesetzt wurde, war der folgende: BgIII

Präsequenz

Wie anerkannt werden wird, kodieren die zehn 5'-Nukleotide dieses Primers für die Präsequenzaminosäuren -3 bis -1 (gly-ala-arg), während die siebzehn 3'-Nukleotide für die Aminosäuren 45 bis 49 (SER-VAL-PRO-VAL-LYS) kodieren. Es ist anzumerken, daß das "TCT"-Codon für Serin-45 eingesetzt wurde, um die BgIII-Stelle beizubehalten.
Ca. 200 mg des synthetischen Oligonukleotids wurden 30 Minuten lang bei 37ºC in 30 ul 50 mM-Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreitol, 1 mM ATP phosphoryliert, das etwa 8 U T4-Polynukleotid-Kinase enthielt. Zur Heteroduplexbildung wurden etwa 50 ng einstrangiges pPA-N44intA in etwa 40 ul 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM Dithiothreitol, das 100 ng des phosphorylierten Primers enthielt, auf 95ºC erhitzt (10 min) und langsam (30 min) auf Raumtemperatur, dann auf 4ºC abgekühlt. Die Primerverlängerung wurde durch Zugabe von 10 ul Ligasepuffer in Gang gesetzt, der 2 mM ATP, je 0,25 mM dGTP, dCTP, dATP, dTTP, 5 U des großen (Klenow-) Fragments von E. coli-Polymerase I und 400 U T4-DNA-Ligase enthielt. Nach 1 Stunde bei 15ºC wurde das Reaktionsgemisch verwendet, um JM101-Zellen zu transformieren.
Die Transformation wurde durchgeführt, indem das gesamte Ligationsgemisch mit 200 ul kompetenten JM101-Zellen vermischt wurde, gefolgt von Inkubation auf Eis für 30 min und 5 min bei 37ºC. Dann wurden 3,5 ml 2YT-Topagar bei 55ºC mit 200 ul der phagengesättigten Zellen, 10 ul IPTG (200 mM) und 50 ul X-Gal vermischt, und nach der Zugabe wurden die Zellen auf Petri-Schalen plattiert, die 2YT ohne Arzneimittel enthielten.
Farblose Plaques wurden entnommen und auf eine Mikrotiterplatte übertragen, die 100 ul 2YT-Medium enthielt. Die geimpften Mikrotiterflüssigkeiten wurden auf 1B-Agarplat ten mit 15 cm Durchmesser aufgebracht, mit einem Bewuchs aus 600 ul JM101-Zellen in 8 ml 2YT-Topagar überlagert und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Die gebildeten Plaques wurden durch 1-minütigen physischen Kontakt auf eine Nitrocellulosescheibe übertragen. Die Nitrocellulosescheibe wurde 3 Minuten lang mit 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl behandelt und zweimal mit 3 M NaCl-0,5 M Tris-HCl, pH 7,5, 15 Minuten lang und dann mit 2X SSC 15 Minuten lang gewaschen. Das Prähybridisierungsgemisch enthielt 10 mM Tris, pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,9 M NaCl, 1X Denhardt 0,5% NP40, 100 uM ATP, 1 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM Natriumphosphat und 50 gg/ml E. coli-tRNA. 1X Denhardt-Lösung enthält pro Liter 200 mg FicoII, 200 mg Polyvinylpyrrolidon, 200 mg Rinderserumalbumin (BSA; Fraktion V). Die Scheibe wurde bei 80ºC im Vakuum 90 Minuten lang gebacken. Die Scheibe wurde dann in einer Petri-Schale 3 Stunden lang mit 6 ml Prähybridisierungsflüssigkeit inkubiert, gefolgt von der Zugabe von 5 · 10&sup6; cpm markiertem Primer, und über Nacht hybridisiert. Selektive Wäschen der Scheibe wurden mit 0,4X SSC bei 49ºC durchgeführt, und nach dem Lufttrocknen wurde die Scheibe Röntgenfilm ausgesetzt. Positiv hybridisierende Klone wurden durch Didesoxysequenzierung weiter analysiert. Siehe Aldeman, s. o.. Aus den positiven Kolonien wurde ein rekombiniertes Plasmid mit der Bezeichnung pPA-N44intA-delta selektiert, das die richtige Löschung aufwies.
Um die mutierte Gensequenz vom M13-Phagen wieder in entsprechenden Expressionskontext in den DHFR-hältigen Expressionsvektor zu setzen, wurde Plasmid pPADHFR-6 getrennt mit BgII/KpnI gespalten, um das große Fragment, das für das DHFR-Gen kodiert, und BstXI/KpnI zu isolieren, um ein Fragment mit 2240 Basen zu isolieren, das für das 3'-Ende (Aminosäuren 45-527) von natürlichem t-PA kodiert. Ein Fragment mit 400 Basen, das die N44(des 1-44) Mutation trug, wurde durch Spaltung mit BgIII/BstXI aus pPA-N44intA-delta isoliert und gemeinsam mit den beiden von pPADHFR-6 abgeleiteten Fragmenten ligiert. Das Produkt dieser Ligation mit der Bezeichnung CVSVPA-N44 D22 war somit die Kopie des Ausgangsplasmids pPADHFR-6, mit der Ausnahme, daß die für die Aminosäuren 1-44 kodierenden Codons entfernt waren.
Perspektivische Details sind Fig. 2 zu entnehmen.

3) Plasmid pPADHFR-6 2C9

Menschliche t-PA-DNA wurde aus den Plasmiden pPADHFR-6 (auch als pETPFR bezeichnet) und pA25EIO erhalten. Die Herstellung dieser beiden t-PA-Plasmide wird in der EP-A-093.619, s. o., beschrieben.
Plasmid pA25EIO enthält Sequenzen, die für die letzten 508 Aminosäuren des t-PA- Gens und 772 Basenpaare des untranslatierten 3'-Bereichs kodieren. Dieses Plasmid wurde mit SacI und BgIII gespalten, um ein Fragment mit 744 Basenpaaren zu erzeugen, das nach Standardverfahren isoliert wurde, wie zuvor beschrieben. Dieses Fragment enthält die Codons für die t-PA-Aminosäuren 411 bis 527 und enthält einen Teil des untranslatierten 3'-Bereichs.
Das Plasmid pPADHFR-6 enthält das gesamte Strukturgen für t-PA und einen Teil des untranslatierten 3'-Bereichs. Dieses Plasmid wurde mit SacI und BgIII gespalten, um ein Fragment mit 1230 Basenpaaren zu erzeugen, das isoliert wurde. Dieses Fragment enthält Codons für die ersten 410 Aminosäuren der reifen Form von t-PA.
Diese Fragmente wurden unter Anwendung von Standardverfahren miteinander ligiert und mit BgIII gespalten. Ein Fragment mit 1974 Basenpaaren, das Codons für die gesamte reife t-PA-Sequenz plus einen Teil des untranslatierten 3'-Bereichs enthielt, wurde isoliert. Doppelstrangiges M13mp8 (Messing, s. o.) wurde mit BamHI gespalten und mit dem BgIII-gespaltenen t-PA fusioniert, um M13mp8PABgIII zu bilden. E. coli JM101-Zellen (ATCC Nr. 33876) wurden mit der doppelstrangigen replikativen Form von M13mp8PABgIII transformiert. Die einstrangigen und doppelstrangigen (RF-) Formen von M13mp8PABGIII können aus E. coli-JM101-Zellen isoliert werden, die mit diesem Phagen infiziert wurden. Die einstrangige Form wurde für die stellenspezifische Mutagenese von t-PA verwendet.
Das menschliche t-PA-Strukturgen wurde durch stellenspezifische Mutagenese modifiziert, um t-PA mit Aminosäuresubstitution an der entsprechenden unterschiedlichen Positionen zu exprimieren. Ein synthetisches Oligonukleotid wurde z. B. nach dem Festphasen-Phosphotriesterverfahren von Crea, E. coli (s. o.) hergestellt. Zu den synthetischen Primern, die für solche stellenspezifische Mutagenese hergestellt und verwendet wurden, gehören:
Das in der Folge beschriebene Verfahren wurde eingesetzt, um unterschiedliche t-PA- Klone zu erzeugen, welche die mutierte Sequenz der synthetischen Primer enthielten. Das allgemeine eingesetzte Verfahren ist das von Adelman, s. o. Beispielsweise wurde 3M13RF2C9 unter Verwendung des obigen Primers erzeugt. Gereinigte M13-RF-DNA vom mutierten t-PA-Gen wurde aus E. coli-JM101-Zellen hergestellt. In der Folge wurden DNA-Fragmente, welche die mutierte t-PA-DNA-Sequenz enthielten, verwendet, um Expressionsvektoren für den mutierten t-PA zu konstruieren.
50 ng eines synthetischen Oligonukleotids wurden 30 Minuten lang bei 37ºC in 10 ul 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreitol, 1 mM ATP, der 8 U T4- Polynukleotid-Kinase enthielt, phosphoryliert. Zur Verwendung als Sonde wurden 400 ng des synthetischen Oligonukleotids wie oben phosphoryliert, mit der Ausnahme, daß ATP durch 60 mCi [γ³²P]-ATP (3000 uCi/mmol) ersetzt wurde, was zu etwa 50 bis 60 · 10&sup6; cpm/400 ng 24-mer führte. Zur Heteroduplexbildung wurden 10 ng einstrangiges M13mp8PABgIII in 40 ul 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM Dithiothreitol, das 10 ng des phosphorylierten Primers und 50 ng EcoRl-gespaltenes großes M13mp8-PABgIIIRF Fragment enthielt, auf 95ºC erhitzt (10 min) und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt (30 min). Primerverlängerung wurde durch Zugabe von 10 ul Ligasepuffer in Gang gesetzt, der 2 mM ATP, je 0,25 mM dGTP, dTTP, dCTP und dATP, 5 U des großen Fragments von E. coli-DNA-Polymerase I und 400 U T4-DNA-Ligase enthielt. Nach einer Stunde bei 12ºC wurde das Reaktionsgemisch verwendet, um E. coli JM101- Zellen zu transformieren.
Die Transformation wurde erreicht, indem 10 ul des Ligationsgemischs mit 200 ul kompetenten JM101-Zellen vermischt wurden, gefolgt von Inkubation für 30 Minuten auf Eis und für 5 Minuten bei 37ºC. Dann wurden 3,5 ml 2YT-Topagar bei 55ºC mit 200 ul gesättigten JM101-Zellen, 10 ul IPTG (200 mM) und 50 ul X-Gal vermischt, und nach der Zugabe der transformierten Zellen auf 9 cm-Petri-Schalen plattiert, die LB ohne Arzneimittel enthielten.
Farblose Plaques wurden entnommen und auf eine Mikrotiterplatte übertragen, die 100 ul 2YT-Medium enthielt. Die geimpften Mikrotiterflüssigkeiten wurden auf LB-Agarplatten mit 15 cm Durchmesser aufgebracht, mit einem Bewuchs aus 600 ul JM101-Zellen in 8 ml 2YT-Topagar überlagert und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Die gebildeten Plaques wurden durch 1-minütigen physischen Kontakt auf eine Nitrocellulosescheibe übertragen. Die Nitrocellulosescheibe wurde 3 Minuten lang mit 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl behandelt und zweimal mit 3 M NaCl-0,5 M Tris-HCl, pH 7,5, 15 Minuten lang und dann mit 2X SSC 15 Minuten lang gewaschen. Das Prähybridisierungsgemisch enthielt 10 mM Tris, pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,9 M NaCl, 1X Denhardt 0,5% NP40, 100 uM ATP, 1 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM Natriumphosphat und 50 ug /ml E. coli tRNA. 1x Denhardt-Lösung enthielt pro Liter 200 mg FicoII, 200 mg Polyvinylpyrrolidon, 200 mg Rinderserumalbumin (BSA; Fraktion V). Die Scheibe wurde bei 80ºC im Vakuum 90 Minuten lang gebacken. Die Scheibe wurde dann in einer Petri-Schale 3 Stunden lang mit 6 ml Prähybridisierungsflüssigkeit inkubiert, gefolgt von Zugabe von 5 · 10&sup6; cpm markiertem Primer, und über Nacht hybridisiert. Selektive Wäschen der Scheibe wurden mit 0,4X SSC bei 49ºC durchgeführt, und nach dem Lufttrocknen wurde die Scheibe Röntgenfilm ausgesetzt. Positiv hybridisierende Klone wurden durch Didesoxysequenzierung weiter analysiert. Siehe Aldeman (s. o.).
Als Fragment 1 bezeichnetes Vektorfragment wurde erhalten, indem das durch Spaltung von pPADHFR-6 mit BgIII und BstEII erhaltene große Fragment isoliert wurde. Ein als Fragment 2 bezeichnetes Fragment wurde erhalten, indem das durch Spaltung von pPADHFR-6 mit BgIII und BstXI erhaltene t-PA-Fragment mit 400 Basenpaaren isoliert wurde. Ein t-PA-Fragment mit 1141 Basenpaaren, das die gewünschten Mutationen enthielt (Fragment 3) wurde erhalten, indem RF-DNA aus den mutierten t-PA-Klonen (s. o.) mit BstXI und BstEII gespalten wurde. Die Fragmente 1 und 2 wurden jeweils mit Fragment 3 ligiert. Die DNA-Mischungen wurden verwendet, um E. coli zu transformieren. Aus jedem der Transformanten wurden die jeweiligen eukaryotischen Expressionsvektoren erhalten, beispielsweise: pPADHFR-6 2C9.

4) Endkonstruktion von p1154

Plasmid pETPFR wurde mit den Restriktionsenzymen BgIII und ApaI gespalten, und die Fragmente wurden durch Agarosegelelektrophorese fraktioniert. Das Fragment mit 6,0 kb, das den t-PA-Präprokodierbereich, den frühen SV40-Promotor, β-Lactamase und DHFR-Gene enthielt, wurde aus dem Gel herausgeschnitten und elektroeluiert.
Plasmid pCVSVPA-N44 D22 wurde mit BgIII und ScaI gespalten, die Fragmente wurden durch Acrylamidgelelektrophorese fraktioniert, und jene Bande, die das Fragment mit 0,63 kb enthielt (das die Kodiersequenzen für die Wachstumsfaktor-, die Kringle 1- und die [partielle] Kringle 2-Domäne von t-PA darstellt) wurde herausgeschnitten und elektroeluiert.
Plasmid pPADHFR-6 2C9 wurde mit ScaI und ApaI gespalten, und das Fragment mit 0,63 kb, das die Kodiersequenzen für die (partielle) Kringle 2- und die Protease-Domäne (mit der Glu275-Mutation) enthielt, wurde durch Acrylamidgelelektrophorese und Elektroelution gereinigt.
Die drei so isolierten, gereinigten Fragmente wurden in Gegenwart von T4-DNA-Ligase und rATP inkubiert, um das Plasmid p1154 zu erzeugen, das Sequenzen enthielt, die für ein t-PA-Molekül kodieren, dem die Reste 1-44 fehlen (Fingerdomänen-Löschung) und in dem eine Arg275 → Glu-Mutation vorliegt (Einzelkettenmutante). Siehe Fig. 3.

b. Plasmid p652

Phagen fI-RFI-DNA (Zinder et al., Microbiol. Rev. 49, 101 (1985)) wurde mit RsaI und AhaIII gespalten, und das Fragment mit 0,4 kb, das den +Strang-Ursprung der DNA-Replikation enthielt, wurde isoliert. BamHI-Linker wurden an dieses Fragment ligiert, dann wurde BamHI-Spaltung durchgeführt, um kohäsive BamHI-Termini zu erzeugen. Dies wurde dann in die BamHI-Stelle von Plasmid pBR322 insertiert (Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977)), um Plasmid pBRflori zu erzeugen. Plasmid pBRflori wurde mit BamHI gespalten, mit dem Klenow-Fragment von E. coli-DNA-Polymerase I und Desoxynukleosidtriphosphaten behandelt, um stumpfe Enden zu erzeugen, und das den fI-+ Strang-Ursprung enthaltende Fragment mit 0,4 kb wurde isoliert. Dieses wurde in die PvuII-Stelle von pBR322 insertiert, um Plasmid p652 zu erzeugen. Siehe Fig. 4.

c. Plasmid p1060

1) Plasmid pCISt-PA

Zuerst wurde der Vektor pCIHt-PA konstruiert, der den Cytomegalovirus-Enhancer und -promotor, die/das Cytomegalovirus-Spleißdonorstelle und -Intron, die Ig-variable Bereichspleißakzeptorstelle, die für t-PA kodierende cDNA (Pennica et al., Nature 301, 214 (1983)) und die Hepatitis-Oberflächenantigen-Polyadenylierungs- und -Transkriptionsterminationsstelle enthielt:
Der Vektor pFBCIS, der den Cytomegalovirus-Enhancer (Boshart et al., Cell 41, 520 (1985)) und -Promotor (Thomsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86, 659 (1984)), die Cytomegalovirus-Spleißdonorstelle und einen Abschnitt eines Introns (Sternberg et al., J. of Virol. 49, 190 (1984)), das/die Ig-variable Bereichsintron und -Spleißakzeptorstelle, den cDNA-Kodierfaktor VIII und die SV40-Polyadenylierungsstelle enthielt, wurde konstruiert. Die drei Teile der Konstruktion sind nachstehend im Detail angeführt.
1. Die Ampicillinresistenzmarkierung und der Replikationsursprung des fertigen Vektors wurden aus dem Ausgangsplasmid pUCI3pML, einer Variante von Plasmid pML, abgeleitet (Lusky et al., Nature 293, 79 (1981)). pUC13pML wurde konstruiert, indem der Polylinker von pUC1 3 (Veira et al., Gene 19, 259 (1982)) an die EcoRI- und HindIII-Stellen von pML transferiert wurde. Ein zweites Ausgangsplasmid pUCBCMV war die Quelle des CMV-Enhancers, des Promotors und der Spleißdonorsequenz. PUCBCMV wurde konstruiert, indem die Nukleotide 1 bis 732 für den CMV-Enhancer, den Promotor und die Spleißdonorsequenz in die abgestumpften PstI- und SphI-Stellen von pUC8 insertiert wurden - Veira et al., s. o. Synthetische BamHI-HindIII-Linker (im Handel erhältlich von New England Biolabs) wurde an das kohäsive BamHI-Ende ligiert, wodurch eine Hind III-Stelle erzeugt wurde. Nach der Ligation wurde HindII-HincII-Spaltung durchgeführt. Diese Spaltung ergab ein Fragment mit etwa 800 bp, das den CMV-Enhancer, den Promotor und die Spleißdonorstelle enthielt. Nach Gelisolierung wurde dieses Fragment mit 800 bp an ein 2900 bp umfassendes Stück von pUCI3pML ligiert. Das für die Konstruktion von pFBCIS erforderliche Fragment wurde durch Spaltung des obigen Zwischenprodukt-Plasmids mit SaII und HindIII erhalten. Dieses 3123 bp umfassende Stück enthielt die Resistenzmarkierung für Ampicillin, den Replikationsursprung von pUC13 pML und die Kontrollsequenzen für den CMV, der den Enhancer, den Promotor und die Spleißdonorstelle enthält.
2. Das Ig-variable Bereichsintron und die Spleißacceptorsequenz wurden unter Verwendung eines synthetischen Oligomers konstruiert. Ein 99-mer und ein 30-mer wurden chemisch synthetisiert, wobei sie die folgende Sequenz für das IgG-Intron und die Spleißacceptorstelle aufwiesen (Bothwell et al., Cell 24, 625 (1981)):
1 5' AGTAGCAAGCTTGACGTGTGGCAGGCTTGA...
31 GATCTGGCCATACACTTGAGTGACAATGA...
60 CATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGT...
88 GTCCACTCCCAG 3'
1 3' CAGGTGAGGGTGCAGCTTGACGTCGTCGGA 5'
DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) wurde in das synthetische Stück gefüllt und erzeugte ein doppelstrangiges Fragment (Wartell et al., Gene 9, 307 (1980)). Dem folgte eine Doppelspaltung mit PstI und HindIII. Dieser synthetische Linker wurde an den PstI- und HindIII-Stellen in pUCI3 kloniert (Veira et al., s. o.). Der das synthetische Oligonukleotid enthaltende Klon mit der Bezeichnung pUCIg. 10 wurde mit PstI gespalten. Eine ClaI-Stelle wurde diesem Fragment unter Verwendung eines PstI-ClaI-Linkers hinzugefügt. Nach der Spaltung mit HindIII wurde ein Stück mit 118 bp, das einen Teil des Ig- Introns und den Ig-variablen Bereichsspleißacceptor enthielt, gelisoliert.
3. Im dritten Teil des Konstruktionsschemas wurde das Hepatitisoberflächenantigen-3'- Ende durch die Polyadenylierungsstelle und die Transkriptionsterminationsstelle des frühen Bereichs von SV40 ersetzt. Der Vektor pUC. SV40, der die SV40-Sequenzen enthielt, wurde an der von Veira et al., s. o., beschriebenen BamHI-Stelle in pUC8 insertiert. pUC.SV40 wurde dann mit EcoRI und HpaI gespalten. Ein Fragment mit 143 bp, das nur die SV40-Polyadenylierungsstelle enthielt, wurde aus dieser Spaltlösung gelisoliert. Zwei zusätzliche Fragmente wurden nach der Spaltung von pSVE.8c1D gelisoliert (EP-A-160.457). Das durch EcoRI- und ClaI-Spaltung erzeugte Fragment mit 4,8 kb enthielt die SV40-DHFR-Transkriptionseinheit, den Replikationsursprung von pML und die Ampicillinresistenzmarkierung. Das nach der Spaltung mit ClaI und HpaI erzeugte Fragment mit 7,5 kb enthält die cDNA für Faktor VIII. Eine Dreikomponenten-Ligation ergibt pSVE.8c24D. Dieses Zwischenproduktplasmid wurde mit ClaI und SaII gespalten, was ein Fragment mit 9611 bp ergab, das die cDNA für Faktor VIII mit SV40-Polyadenylierungs- und Transkriptionsterminationsstellen gefolgt von der SV40 DHFR-Transkriptionseinheit enthielt.
Bei der abschließenden Dreikomponenten-Ligation, um pFBCIS zu erhalten, wurden verwendet: a) das 3123 bp umfassende SaII-HindIII-Fragment, das den Replikationsursprung, die Ampicillinresistenzmarkierung und den CMV-Enhancer, -Promotor und -Spleißdonor enthielt; b) das 118 bp umfassende HindII-ClaI-Fragment, welches das/den Ig-Intron und -Spleißakzeptor enthielt; und c) ein 9611 bp umfassendes ClaI-SaII-Fragment, das die cDNA für Faktor VIII, SV40-Polyadenylierungsstelle und die SV40-DHFR- Transkriptionseinheit enthielt.
Als nächstes wurde die Vervollständigung der Konstruktion von Plasmid pCIHt-PA aus Zwischenproduktplasmid pCIa-t-PA und Plasmid pFBCIS (s. o.) in Angriff genommen:
Die t-PA-cDNA wurde zuerst in pML kloniert, um eine ClaI-Stelle am 5'-Ende des Gens zu erzeugen. Zu diesem Zweck wurde ein HindIII-Fragment mit 3238 bp aus pSVpa- DHFR (auch als pETPFR bezeichnet, s. o.) in die HindIII-Stelle von pML insertiert (Lusky et al., s. o.). Kolonien wurden in Hinblick auf Klone gescreent, die das 5'-Ende der cDNA in Juxtaposition zur ClaI-Stelle aufweisen. Das Zwischenproduktplasmid wurde als pCLAt-PA bezeichnet. t-PA-cDNA gefolgt von den 3'-Polyadenylierungsbereichen wurde als ClaI-KpnI-Fragment mit 2870 bp isoliert. Dieses Fragment wurde an das 5146 bp umfassende Fragment von pFBCIS ligiert. Dieses ClaI-KpnI-Fragment des CIS-Vektors lieferte den 5'-Kontrollbereich, eine SV40-DHFR-Transkriptionseinheit, das Ampicillinresistenzgen und den Ursprungsbereich von pML. Siehe Fig. 5.
t-PA-Expressionsmengen wurden erhalten, indem CHO- und 293-Zellen nach im allgemeinen an sich bekannten und oben beschriebenen Verfahren mit pCIHt-PA transfiziert wurden. Medien beispielsweise von den 293-Zellen wurden einem Assay unterworfen, was zeigte, daß pCIH-t-PA 420 ng/ml t-PA produzierte.
Schließlich wurde der Vektor pCISt-PA konstruiert, der den Cytomegalovirus-Enhancer und -Promotor, die/das Cytomegalovirus-Spleißdonorstelle und -Intron, die Ig-variable Bereichsspleißakzeptorstelle, die für t-PA kodierende cDNA und die pSV40-Polyadenylierungssequenz enthielt:
Die Ausgangsvektoren für diese Konstruktion waren pCIHt-PA und pFBCIS (s. o.). Der letztere Vektor hat die gleichen 5'-Kontrollen wie pCIHt-PA, enthält aber die cDNA für Faktor VIII und die SV40-Polyadenylierungsstelle. SaII wurde verwendet, um 3' von der t-PA-cDNA zu spalten. Der resultierende 3-Überhang wurde mit T4-Polymerase abgestumpft. pCIH-t-PA wurde dann mit ClaI gespalten. Diese Stelle trennt die heterozygote Intronspaltung zwischen den intronischen CMV-Sequenzen und dem Ig-variablen Bereichsintron. Ein Fragment mit 2870 bp wurde aus der ClaI-Behandlung gelisoliert. Die SV40-Polyadenylierungsstelle, DHFR, Transkriptionskontrolle, der bakterielle Replikationsursprung und das ampr-Gen, sowie der CMV-Enhancer und -Promotor und der Spleißdonor wurden aus pFBCIS isoliert. Diese Elemente wurden in Form von Fragmenten als SaI-BamHI-Fragment mit 2525 bp und HpaI-SaI-Fragment mit 3113 bp isoliert. Eine Dreikomponenten-Ligation aus dem (stumpfen) KpnI-ClaI-Fragment mit dem HpaI- SaI-Fragment und dem SaI- bis BamHI-Fragment ergibt pCIS-t-PA, das sowohl in CHO- als auch 293-Zellen exprimiert wurde, wie oben unter Bezugnahme auf Plasmid pCIH-t- PA erörtert, was 55 bzw. 3000 ng/ml t-PA ergab. Siehe Fig. 6.

2) Endkonstruktion von p1060

Plasmid pCIS-t-PA wurde mit KpnI gespalten, mit dem Klenow-Fragment von E. coli- DNA-Polymerase I und Desoxyribonukleosidtriphosphaten behandelt, um stumpfe Enden zu erzeugen, und durch intramolekulare Ligation erneut zirkularisiert. Diese Behandlung zerstörte die KpnI-Stelle, wodurch ein Plasmid mit der Bezeichnung pCIS-t- PA-ΔKpn erzeugt wurde. Plasmid pCIS-t-PA-ΔKpn wurde mit SaII und SstII gespalten und das Fragment mit 4,6 kb isoliert. Das zusätzliche Plasmid pCISt-PA wurde mit PstI und SstII gespalten und das 1,4 kb umfassende Fragment isoliert. Plasmid p652 wurde mit PstI und SaII gespalten und das Fragment mit 3,4 kb isoliert. Diese drei Fragmente wurden in einer Dreiwegligation verbunden, um Plasmid p1060 zu erzeugen. Siehe Fig. 7.

d. Plasmid p1179

Plasmid p1060 wurde mit BgIII (partiell) und ApaI gespalten, und das 8,0 kb umfassende Fragment wurde durch Agarosegel-Elektrophorese und Elektroelution gereinigt. Plasmid p1154 wurde auf ähnliche Weise mit BgIII und ApaI gespalten und das 1,3 kb umfassende Fragment isoliert. Diese beiden Fragmente wurden unter Verwendung von T4-DNA- Ligase und rATP verbunden, um das Plasmid p1179 zu erzeugen. Siehe Fig. 8. Plasmid p1179 enthielt die des(1-44)/Glu-275-t-PA-Mutante (des-1-44E275-t-PA) unter der Kontrolle des CMV-Promotors, sowie das β-Lactamase-Gen, das DHFR-Gen und den fl-Ursprung der DNA-Replikation. Die Sequenz des desl-44E275-t-PA-Kodierbereichs wird in Fig. 9 gezeigt.

2. Mutagenesebeispiele

a. Templatherstellung

Plasmid p1179 wurde über CaCl&sub2;-vermittelte Transformation in den E. coli-Stamm JM101 (ATCC Nr. 33876) eingebracht. Diese Zellen wurden dann mit dem Helfervirus M13K07 infiziert und einstrangige p1179-DNA hergestellt, wie von Veira et al., Meth. Enzymol. 153, 3 (1987), beschrieben. Kurz zusammengefaßt wurden zu 0,3 ml einer gesättigten Kultur aus transformierten Zellen in 2YT-Brühe 10&sup9;-10¹&sup0; pfu M13K07 zugegeben, und das Gemisch wurde bei 37ºC 15 Minuten lang inkubiert. 1,5 ml frische 2YT-Brühe, die 50 ug/ml Carbenicillin enthielt, wurde zugegeben, und die Kultur wurde bei 37ºC 16 Stunden lang sanft gerüttelt. Nach dem Pelletieren der Zellen wurden Phagen- und gepackte Plasmid-DNA geerntet, und einstrangige DNA wurde hergestellt, wie von Anderson, Nucl. Acids. Res. 9, 3015 (1981), beschrieben.

b. Stellengerichtete Mutagenese in vitro

Mutagenese an p1179 wurde unter Verwendung von Oligodesoxyribonukleotiden im wesentlichen wie von Zoller et al., Meth. Enzymol. 100, 468 (1983), beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Mutanten durch Koloniehybridisierung und nicht durch Plaquehybridisierung identifiziert wurden. Mutationen wurden durch DNA- Sequenzierung direkt an der einstrangigen Plasmid-DNA verifiziert, wobei das Didesoxynukleotid-Kettenterminationsverfahren eingesetzt wurde (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977).

c. Plasmide, Mutanten und Primer

Unter Einsatz der oben beschriebenen Verfahren (siehe insbesondere Teil 2b), wurden unter Verwendung der gezeigten Primer (rechte Spalte) die folgenden Plasmide erhalten (linke Spalte), welche die angeführten Modifikationen enthielten (mittlere Spalte):
Plasmid Mutante Primer (5' → 3')
p1184 Val 213 → Lys CTGATAGGCAAGAAGTACACAGC
p1185 Ile 210 → Lys TCCATGATCCTGAAGGGCAAGGTT
p1186 Thr 252 → Arg AACCGCAGGCTGAGGTGGGAGTA
p1188 Asn 184 → Ser TGCTACTTTGGGAGCGGGTCAGCC
p1189 Asn 184 → Asp TGCTACTTTGGGGACGGGTCAGCC
p1193 Asp 238 → Asn AATCCTGATGGGAACGCCAAGCCC
p1194 Ile-Gly-Lys-Val TCCATGATCCTGCGTGCCCGACGATACACAGCA 210-213 → Arg-Ala-Arg-Arg
p1224 Ile-Gly-Lys-Val TCCATGATCCTGCGTGGCCAGAAGTACACAGC 210-213 → Arg-Gly-Gln-Lys
p1192 Trp 253 → Glu CGCAGGCTGACGGAGGAGTACTGT

3. Expression und Reinigung

a. Plasmidherstellung

Transformierte Zellen wurden bis zur Sättigung in 500 ml LB-Brühe gezüchtet, die 50 ug/ml Carbenicillin enthielt. Zellen wurden durch Zentrifugieren pelletiert und in 40 ml von 50 ml mM Glucose, 10 mM EDTA, 25 mM Tris-HCl (pH 8,0) erneut suspendiert. Dieser Suspension wurden 60 ml 1%-iges Natriumdodecylsulfat, 0,1 M NaOH zugegeben und das Gemisch 2 Minuten lang bei 25ºC, dann 10 Minuten lang bei 0ºC inkubiert. Dem wurden 52 ml 4 M Essigsäure, 3 M Natriumacetat zugegeben, und das Gemisch 30 Minuten lang bei 0ºC inkubiert. Dies wurde dann bei 20.000 U/min 20 Minuten lang zentrifugiert, der Überstand mit 2 Volumina 100% kaltem Ethanol vermischt und den resultierenden Niederschlag durch Zentrifugieren geerntet. Das Pellet, das Plasmid-DNA und -RNA enthielt, wurde getrocknet und in 100 mM Tris (pH 8,0), 10 mM EDTA, 1 ug/ml RNase A wiederaufgelöst. Nach dem Klären durch Zentrifugieren wurde auf 0,5 mg/ml Ethidiumbromid eingestellt, und das gleiche Gewicht an CsCI wurde zugegeben. Die DNA wurde dann in einem Beckman VT165-Rotor 16 Stunden lang bei 18ºC bei 55.000 U/min zentrifugiert. Die DNA-Bande wurde durch Seitenpunktion gewonnen, mit n-Butanol extrahiert, um das Ethidiumbromid zu entfernen, mit H&sub2;O verdünnt und mit Ethanol ausgefällt. DNA wurde in 10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA bis zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml wiederaufgelöst.

b. Transfektion und Expression

293-Zellen wurden bis zur Konfluenz gezüchtet. 10 ug t-PA-Plasmid-DNA (beispielsweise p1179 und dessen Derivate, hergestellt wie oben beschrieben) wurden mit 1 ug DNA vermischt, die für das VA-RNA-Gen kodiert (Thimmappaya et al., Cell 31, 543 (1982)), und in 500 ul 1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 0,227 M CaCl&sub2; gelöst. Dem zugegeben (tropfenweise unter Rühren) wurden 500 ul 50 mM HEPES (pH 7,35), 280 mM NaCl, 1,5 mM NaPO&sub4;, und die Bildung des Niederschlags wurde 20 Minuten lang bei 25ºC ermöglicht. Der suspendierte Niederschlag wurde dann den Zellen zugegeben (in 100 mM Platte) und 4 Stunden lang im Inkubator absetzen gelassen. Das Medium wurde dann abgesaugt, und 2 ml 20%-iges Glycerin in phosphatgepufferter SaIzlösung wurden 30 Sekunden lang zugegeben. Die Zellen wurden zweimal mit 10 ml serumfreiem Medium gewaschen, dann wurde frisches Medium zugegeben und die Zellen wurden 5 Tage lang inkubiert.
Zur Erzeugung stabiler CHO-Zellinien, welche die t-PA-Varianten exprimieren, wurde das BgIII/ApaI-Fragment, das den Großteil der t-PA-Kodiersequenzen enthält (Fig. 7 und 8) an die BgIII/ApaI-Fragmente mit 6,0 kb von Vektor pPADHFR.6 ligiert (Fig. 3). Die resultierenden Plasmide wurden dann in CHO-Zellen eingebracht und induziert, die t-PA- Varianten zu überexprimieren, indem die Kodiersequenz durch Selektion in methotrexathältigem Medium amplifiziert wurde.

c. Reinigung

Reinigung der t-PA-Produkte wurde erreicht, indem das konditionierte Medium über eine Säule (1 ml Bettvolumen) aus kontrollierten Glasperlen geschickt wurde, an die ein polyklonaler Anti-t-PA-Ziegen-A6-Antikörper (hergestellt nach an sich bekannten Standardverfahren) gebunden worden war. Vor dem Einbringen des Mediums wurde die Säule mit phosphatgepufferter SaIzlösung äquilibriert, und nach dem Beladen wurde die Säule mit 0,1 M Tris.HCl (pH 7,5), 1 M NaCl, äquilibriert. Der t-PA wurde mit 0,1 M Essigsäure, 0,15 M NaCl, 0,02 M Arginin (pH 2,0), eluiert, und Fraktionen wurden sofort mit Tris-Base neutralisiert. Die Fraktionen wurden vor dem Poolen auf 0,01% Tween® 80 eingestellt. In manchen Fällen wurden t-PA-Varianten vor der Endreinigung auf einer polyklonalen Anti-t-PA-Ziegen-Antikörpersäule auf Lysin-Sepharose vorgereinigt.

D. Biologische und pharmakokinetische Assays

1. t-PA-Quantifizierung

Proteinkonzentrationen wurden routinemäßig durch ein ELISA-Verfahren bestimmt, das für t-PA mit nativer Sequenz genormt war (Siehe EP-A-93.619, s. o.). Proteinreinheit und -homogenität wurden durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat mit dem Puffersystem von Laemmli, Nature 227, 680 (1970), analysiert (PAGE-SDS). Typischerweise wurden 7- bis 17%-ige Gradientengele verwendet, und Proteine wurden mit der Silberfärbungstechnik von Morrissey, Anal. Biochem. 117, 307 (1981), sichtbar gemacht.

2. Gerinnsellyse

Die t-PA-Varianten wurden nach dem Verfahren von Carlsen et al., Anal. Biochem. 168, 428 (1988), hinsichtlich ihrer Fähigkeit, in Gegenwart von Plasminogen-Sättigungskonzentrationen Fibrin zu lysieren, einem Assay unterzogen. Das Gerinnsellyseassay in vitro mißt die Aktivität von Gewebeplasminogenaktivatoren durch Turbidimetrie unter Verwendung eines Mikrozentrifugenanalysators. Ein Gemisch aus Thrombin und t-PA- Testproben wird in ein Gemisch aus Fibrinogen und Plasminogen zentrifugiert, um Gerinnselbildung und darauffolgende Gerinnselauflösung in Gang zu setzen. Das resultierende Profil von Absorptionsvermögen über der Zeit wird analysiert, um den Assayendpunkt zu bestimmen. Die Aktivitäten der t-PA-Varianten wurden mit einer Standardkurve von rt-PA verglichen (EP-A-093.619, s. o.). Der während des gesamten Assays verwendete Puffer war 0,06 M Natriumphosphat, pH 7,4, der 0,01 Vol-% Tween® 80 und 0,01% (w/v) Natriumazid enthielt. Menschliches Thrombin lag in einer Konzentration von 33 U/ml vor. Fibrinogen (2,0 mg/ml gerinnbarem Protein) wurde auf nassem Eis abgeschreckt, um Fibronektin auszufällen, und dann durch Schwerkraft filtriert. Glu- Plasminogen lag in einer Konzentration von 1 mg/ml vor. Die Temperatur in der Analyzerkammer war auf 37ºC eingestellt. Die Ladevorrichtung ist so eingestellt, daß sie 20 ul rt-PA (-500 ng/ml bis 1,5 ug/ml) als Probe für die Standardkurve oder 20 ul Variantenrt-PAs in einer Konzentration, um Lyse innerhalb des Bereichs der Standardkurve zu be wirken, 20 ul Thrombin als sekundäres Reagens und 200 ul eines Fibrinogen-Plasminogen-Gemischs im Volumsverhältnis 50 : 1 als primäres Reagens abgibt. Das Absorptionsvermögen/Zeit-Programm wurde mit einer 5-minütigen Inkubationszeit, 340 nm-Filter und 90-Intervall-Ablesungen eingesetzt.

3. Fibrinbindung

Das Verfahren zur Bestimmung der Fibrinbindung ist eine Modifikation des von Rijken et al., J. Biol. Chem. 257, 2920 (1982), beschriebenen Verfahrens. Die zu testende t-PA- Probe wird einer Lösung zugegeben, die 0,05 M Tris (pH 7,4), 0,12 M NaCl, 0,01% Tween® 80, 1 mg/ml menschliches Serumalbumin und verschiedene Konzentrationen an plasminogenfreiem Fibrin (0; 0,05; 0,1; 0,25 und 0,5 mg/ml) enthält. Das Endvolumen des Reaktionsgemischs betrug 1 ml. Die Probe wurde 5 Minuten lang bei 37ºC inkubiert, gefolgt von der Zugabe einer Einheit Thrombin. Die Proben wurden dann 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert. Das Gerinnsel wurde durch Zentrifugieren entfernt, und die ungebunden im Überstand verbleibende t-PA-Menge wurde durch ELISA bestimmt. Die Daten werden als Prozentsatz an gebundender t-PA-Variante über den Fibrin(ogen)konzentrationen aufgetragen.

4. Pharmakokinetik

a. Ziel

Vergleich der terminalen Halbwertszeiten und Clearancwerte von ¹²&sup5;I-markierten rt-PA- und t-PA-Mutanten.

b. Verfahren

20 Kaninchen wurden nach Zufallsprinzip einer von vier Behandlungsgruppen zugewiesen: rt-PA, des 1-44-t-PA, des 1-44E275-t-PA und des 1-44D184E275-t-PA. Die Proteine wurden mit ¹²&sup5;I auf etwa 10 uCi/kg markiert und mit 0,1 mg/kg rt-PA vermischt, um die nichtspezifische Adsorption des markierten Proteins zu senken. Die Dosis an TCA-fällbarem ¹²&sup5;I-Protein betrug normalerweise 5 uCi/kg.
Die Kaninchen hatten einen Katheter mit einer Heparinsperre in jedem Ohr. Die Dosis wurde in einem IV-Bolus in einem Katheter verabreicht, gefolgt von einer SaIzlösungsspülung. Alle Blutproben wurden am anderen Ohr abgenommen. 1 ml-Blutproben wurden zu den folgenden Zeiten entnommen: 0 (vor der Dosierung) und 2, 5, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 150 und 180 Minuten nach der Dosierung. SaIzlösung wurde zu jedem Zeitpunkt verwendet, um die Katheter zu spülen und Blutvolumen zu ersetzen. Die Blutproben wurden in 1,5 ml-Eppendorfröhrchen gegeben, die 4,2 mM EDTA und 1 mM PPACK enthielten. Die Röhrchen wurden bis zum Zentrifugieren auf Eis gehalten. Nach dem Zentrifugieren wurde das Plasma sofort entfernt, in Eppendorf-Röhrchen gefüllt und bis zum Ende der Untersuchung auf Eis gelagert. Proteine in 100 ul jeder Plasmaprobe wurden mit Trichloressigsäure ausgefällt. Das ¹²&sup5;I, das an Proteine gebunden war, wurde quantifiziert, indem die Gammastrahlenemissionen jedes Niederschlags gezählt wurden. Die Ergebnisse wurden auf CPM/100 ul Probe bezogen und für die Datenanalyse in CPM/ml umgewandelt.

c. Datenanalyse

Die Fläche unter der Kurve (AUC) für jedes Kaninchen wurde nach dem Trapezoidverfahren unter Verwendung des AUC-Verfahrens von 2 bis 180 Minuten berechnet. Die Clearance wurde aus der Formel CL = Dosis/AUC berechnet. Die Clearance jedes Proteins bezogen auf rt-PA ist nachstehend angegeben:

Vergleich Clearanceverhältnis

des 1-44-t-PA 0,12
des 1-44E275-t-PA 0,11
des 1-44D184E275-t-PA 0,38

d. Zusammenfassung

Die Reihung der terminalen Halbwertszeiten für die ¹²&sup5;I-markierten Proteine ist folgende: rt-PA, des 1-44-t-PA, des 1-44E275-t-PA, des 1-44D184E275-t-PA. Die tatsächlichen Halbwertszeitwerte müssen durch pharmakokinetische Untersuchungen mit unmarkierten Proteinen bestimmt werden. Die Clearance von ¹²&sup5;I-markiertem des 1-44-t-PA und des 1-44E275-t-PA war vergleichbar und betrug etwa 1/9 des für ¹²&sup5;I-markierten rt-PA erhaltenen Werts. Die Clearance der Dreifachmutante des 1-44D184E275-t-PA, war dreimal höher als bei den anderen Mutanten und etwa 2,5-mal geringer als beim ¹²&sup5;I-markierten rt-PA.

E. Pharmazeutische Zusammensetzungen

Die Verbindungen gemäß vorliegender Erfindung können nach bekannten Verfahren formuliert werden, um pharmazeutisch nützliche Zusammensetzungen herzustellen, wobei das menschliche Gewebe-Plasminogenaktivator-Produkt gemäß vorliegender Erfindung im Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägervehikel kombiniert wird. Geeignete Vehikel und deren Formulierung, einschließlich anderer menschlicher Proteine, z. B. menschliches Serumalbumin, werden beispielsweise in "Remington's Pharmaceutical Sciences" von E. W. Martin beschrieben. Solche Zusammensetzungen enthalten eine wirksame Menge des Proteins gemäß vorliegender Erfindung gemeinsam mit einer geeigneten Menge an Vehikel, um pharmazeutisch annehmbare Zusammensetzungen herzustellen, die zur wirksamen Verabreichung an den Wirt geeignet sind.
Beispielsweise kann der menschliche Gewebe-Plasminogenaktivator gemäß vorliegender Erfindung an Patienten, die an Herzkreislauferkrankungen oder -zuständen leiden, parenteral verabreicht werden. Die Dosierung und Dosisrate kann parallel zu jener sein, die gegenwärtig bei klinischen Untersuchungen anderer kardiovaskulärer thrombolyti scher Mittel verwendet wird, z. B. etwa 1-2 mg/kg Körpergewicht als intravenöse oder intraarterielle Dosis über 1,5-12 Stunden bei Patienten, die an Myokardinfarkt, Lungenembolie usw. leiden.
Als ein Beispiel für eine geeignete Dosierungsform kann eine Phiole, die 50 mg menschlichen Gewebe-Plasminogenaktivator, Arginin, Phosphorsäure und Polysorbat 80 enthält, zur Injektion mit 50 ml sterilem Wasser rekonstituiert und mit einem geeigneten Volumen an 0,9%-iger Natriumchlorid-Injektionslösung vermischt werden.
Der menschliches Gewebe-Plasminogenaktivator mit verlängerter oder verringerter Halbwertszeit kann für rasche intravenöse Injektion geeignet sein, insbesondere beispielsweise als Bolus. Das würde die Notwendigkeit für komplexe Verabreichungsverfahren ausschalten und die Möglichkeit zur Verwendung von t-PA in Situationen mit begrenzter medizinischer Ausrüstung, wie z. B. in Rettungsfahrzeugen, die mit paramedizinischem Personal besetzt sind, verbessern. Eine verlängerte Halbwertszeit von menschlichem Gewebe-Plasminogenaktivator kann auch geringere, sicherere Dosen ermöglichen und könnte thrombolytisch wirksame Plasminmengen für bis zu 45 Minuten oder länger aufrechterhalten. Eine längere Halbwertszeit von menschlichem Gewebe-Plasminogenaktivator kann auch für längere Therapie mit geringer Dosis nützlich sein, die notwendig sein kann, um Wiederverschluß nach erfolgreicher akuter Thrombolyse zu vermeiden, oder für längere Thrombolyse, die in Fällen peripheren Gefäßverschlusses notwendig sein kann. Eine verringerte Halbwertszeit von menschlichem Gewebe-Plasminogenaktivator kann bei bestimmten Patienten die gewünschte Art der thrombolytischen Therapie sein, indem wirksame Plasminmengen über einen verkürzten Zeitraum bereitgestellt werden.

Claims

1. Menschliche Gewebeplasminogenaktivator-(t-PA-)Variante, die eine erste Modifikation, welche die funktionelle Entfernung der gesamten oder eines Teils der Finger-Domäne und/oder Wachstumsfaktor-Domäne und/oder Kringle 1-Domäne und/oder Kringle 2-Domäne umfaßt, was zu verringerter Fibrinbindungsaktivität führt, sowie zumindest eine weitere Modifikation aufweist, die zu wiederhergestellter Fibrinbindung führt, die mit jener von nativem t-PA vergleichbar ist, worin die weitere Modifikation in der mutmaßlichen Lysin-Bindungsstelle von Kringle 2 liegt.

2. Menschlicher Gewebe-Plasminogenaktivator nach Anspruch 1, der weiters an der Einketten-Zweiketten-Spaltstelle modifiziert ist.

3. Menschlicher Gewebe-Plasminogenaktivator nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, der weiters an der N-gebundenen Glykosylierungstelle modifiziert ist.

4. Menschlicher Gewebeplasminogenaktivator nach einem der Ansprüche 1 bis 3, der weiters im Bereich 244 bis 255 modifiziert ist.

5. Menschlicher Gewebeplasminogenaktivator, der aus der aus des 1-44D184E275-t- PA, des 1-44S184E275-t-PA, des 1-44K213E275-t-PA, des 1-448210A210A211R212R213E275- t-PA, des 1-44R252E275-t-PA, des 1-44K210E275-t-PA und des 1-44R210G211Q212K213 E275-t-PA bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

6. Pharmazeutisches Präparat, umfassend eine t-PA-Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 5.