DE3613390C2

DE3613390C2 - Einkettige Human-Gewebeplasminogen-Aktivator (t-PA)-Mutanten, kodierende DNA, Expressionsvektor, Mikroorganismus, Zellkultur und pharmazeutische Zusammensetzung

Info

Publication number: DE3613390C2
Application number: DE3613390A
Authority: DE
Inventors: Herbert Louis Heyneker; Gordon Allen Vehar
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1985-04-22
Filing date: 1986-04-21
Publication date: 2001-10-11
Anticipated expiration: 2006-04-22
Also published as: NO861559L; GR861037B; FI98930C; JPS6224A; US5147643A; FI98930B; AU596356B2; PT82429B; EP0199574B1; DD258026A5; EP0199574A2; ES8802184A1; MY102550A; FR2581652B1; GB2173804B; JP2529816B2; NO175216B; DK181286D0; DK181286A; FR2581652A1

Description

Die Erfindung betrifft einkettige Human-Gewebeplasminogen-Aktivator (t-PA)-Mutanten, kodierende DNA, Expressionsvektor, Mikroorganismus, Zellkultur und pharmazeutische Zusammensetzung gemäß den Patentansprüchen. Diese speziellen neuen Mutanten von Human- Gewebeplasminogen-Aktivator (t-PA) zeigen Aktivitäten welche aufgrund der früheren Untersuchungen an dem Human- Gewebeplasminogen-Aktivator-Grundmolekül oder den Modell- Serin-Proteasen Trypsin und Chymotrypsin nicht vorhergesehen werden konnten.

Human-Gewebeplasminogen-Aktivator wurde zuerst von Collen et al., (EP-A-41766) als im wesentlichen reines Isolat aus einer natürlichen Quelle identifiziert und auf die erforderliche Plasminogen-Aktivator-Wirkung getestet.

In der Folgezeit wurde in den Laboratorien der Anmelderin Human-Gewebeplasminogen-Aktivator, der im wesentlichen frei von den Proteinen, die normalerweise damit assoziiert sind, ist, durch rekombinante DNA-Technik hergestellt. Diese Ar beit wurde in wissenschaftlichen Veröffentlichungen und in EP-A-93619 festgehalten. EP-A-93619 betrifft die Herstellung von verschiedenen Human-Plasminogenaktivator- Derivaten, die durch Substitutionen, Deletionen, Additionen oder Ersatz von Aminosäuren auf verschiedene Weise modi fiziert sind, beispielsweise durch stellengerichtete ("site directed") Mutagenese der zugrunde liegenden DNA.

Wie aus der genannten Druckschrift hervorgeht, liegt Human-Gewebeplasminogen-Aktivator (t-PA) sowohl in ein kettiger als auch in zweikettiger Form vor. Beim letztge nannten Produkt handelt es sich um ein proteolytisches Derivat des erstgenannten Produkts. Es wurde gezeigt, dass die proteolytische Umwandlung der einkettigen Form in die zweikettige Form während der Auflösung eines Fibringe rinnsels auftritt; vgl. Rijken et al., J. Biol. Chem., Bd. 257 (1982), S. 2920. Es wird angenommen, dass es sich bei der zweikettigen Form um das Agens handelt, das für die Plasminogenaktivator-Wirkung verantwortlich ist, ob gleich es einige anfängliche Berichte gab, die darauf hin wiesen, dass die einkettige Form von Human-t-PA (Rijken a. a. O.) und die einkettige Form von Schweine-t-PA (vgl. Ranby et al., Thromb. Res., Bd. 27 (1982), S. 176) eine gewisse Aktivität haben können; vgl. auch Rijken et al., Biochem. Biophys. Acta, Bd. 580 (1979), S. 140.

In späteren Untersuchungen wurden jedoch derartige Berichte über die Aktivität des einkettigen Produkts mit dem Argu ment abgetan, es handle sich um eine Verunreinigung der artiger Präparate mit geringen Mengen an der zweikettigen Form; vgl. Andreasen et al., EMBO J., Bd. 30 (1984), S. 151 und Ichinose et al., FEBS Letters, Bd. 175 (1984), S. 412. Diese späteren Berichte bestätigten die allgemeine An schauung, dass Serinproteasen, einschliesslich t-PA, als inaktive, einkettige Zymogene exprimiert werden, die nur bei der Hydrolyse des Proteins an einer bestimmten Stelle, z. B. Arginin in Stellung 275 im Fall von t-PA, aktiv werden.

In vivo-Vergleiche von einkettigen mit zweikettigen Plas minogenaktivatoren in bezug auf die Fähigkeit zur Auflösung von Fibringerinnseln wurden unter Einsatz von Kanin chen und Hunden durchgeführt. Bei Kaninchen wurde für die beiden Formen dieses Enzyms etwa die gleiche Wirksamkeit festgestellt; vgl. Collen et al., J. Clin. Invest., Bd. 71 (1983), S. 368. Bei Untersuchung an einem ähnlichen Modell mit Hunden wurde jedoch davon berichtet, dass die ein kettige Form des Plasminogenaktivators geringfügig weniger aktiv als die zweikettige Form ist; vgl. Korninger et al., J. Clin. Invest., Bd. 69 (1982), S. 573. Diese Untersu chungen zeigen daher, dass der einkettige Plasminogen aktivator in bezug auf die Fähigkeit zur in vivo-Auflösung von Fibringerinnseln nicht besser wirkt als die entspre chende zweikettige Form und tatsächlich sogar weniger wirk sam sein kann als die zweikettige Form.

Gegenstand der Erfindung sind neue Mutanten von Human-t- PA (Human-Gewebeplasminogen-Aktivator), die im Vergleich zu dem von Collen et al., (EP-A-41766) zuerst isolierten Human-t-PA sowie im Vergleich zu den t-PA-Molekülen, die in der vorerwähnten, mit rekombinanter DNA-Technik be fassten EP-A-93619 beschrieben sind, eine gleich gute oder höhere Aktivität aufweisen.

Die Er findung betrifft spezielle Mutanten, bei denen bestimmte Aminosäure substitution in der Stellung 275 der Human-t-PA-Aminosäuresequenz, die von Arginin besetzt ist, vorliegt. Bestimmte enzymatisch aktive Moleküle erkennen diese Stel le(n) (möglicherweise zusammen mit einer oder mehreren benachbarten Aminosäuren) und führen zur funktionellen Hydrolyse der Bindungen im Anschluss an die basischen Aminosäuren, insbesondere zwischen Arginin/Isoleucin und Lysin/Glycin-, was zu zweikettigem Material führt. Diese beiden Ketten bleiben durch eine Disulfidbindung über Cysteinreste assoziiert. Gemäss dieser Ausführungsform der Erfindung dient die Substitution an diesen Stellen mit von Arginin und Lysin abweichenden Aminosäuren zur Bildung von Mutanten, bei denen die entsprechenden Spal tungsstellen so verändert sind, dass in vitro oder in vivo zweikettige Human-t-PA nicht oder in einem verringerten Anteil gebildet wird. Somit wird gemäss dieser Ausführungs form der Erfindung mutagenisierter einkettiger Human-t-PA für die Zwecke der Untersuchung der biologischen Aktivität bereitgestellt. Es wurde festgestellt, dass diese Mutanten immun oder zumindest resistent gegen Hydrolyse an der 275/276-Stelle sind und dass die erhaltenen einkettigen Human-t-PA-Mutanten überraschenderweise bei bestimmten biologischen Tests die gleiche Aktivität wie die vor stehend erwähnten Produkte von Collen et al. und/oder wie rekombinante t-PA-Moleküle besitzen. Ferner gibt es Hin weise, dass diese Mutanten weniger reaktiv mit natürlich vorkommenden t-PA-Inhibitoren sind.

Fig. 1 stellt eine Restriktionskarte der DNA von Human-t- PA dar und umfasst die 5'- und 3'-nicht-translatierten Bereiche sowie die für pre-t-PA kodierenden Sequenzen. Der punktierte Bereich stellt das Strukturgen für t-PA dar.

Fig. 2a, b und c stellen die DNA- und Aminosäuresequenzen 12H 10H von pre-t-PA unter Einschluss der 5'- und 3'- nicht-translatierten Bereiche dar.

Fig. 3 stellt ein Gesamtschema dar, das zur Erzeugung von individuellen Klonen mit Substitutionen in Stellung 275 verwendet wird.

Fig. 4 bis 8 erläutern den Aufbau von pXAPPA18 3'ΔX10trpR.

Fig. 9 zeigt das Plasmid pPADHFR-6 mit relevanten Restrik tionsstellen.

Fig. 10 zeigt die mit radioaktiv markiertem t-PA (linke Seite) und EIKGG t-PA (rechte Seite) gebildeten Plasma protease-Inhibitor-Komplexe nach Nachweis durch Autoradio graphie an SDS-PAGE-Gel.

Fig. 11 zeigt die Fibrinbindungseigenschaften von einketti gem t-PA, zweikettigem T-PA und mutiertem einkettigem t-PA (EIKGG).

Fig. 12 zeigt die Dosis-Wirkungs-Kurve der in vivo Ge rinnungsauflösung (EIK ist mutierter einkettiger t-PA; rt-PA ist nicht-mutierter t-PA).

Die hier verwendeten Ausdrücke "Human-Gewebeplasminogen- Aktivator", "Human-t-PA" oder "t-PA" bedeuten einen humanen, exogenen (Gewebetyp) Plasminogenaktivator, der beispiels weise durch rekombinante Zellkultursysteme in bioaktiven Formen gebildet wird, die einen Proteasebereich umfassen und ansonsten dem für Humangewebe nativen Plasminogen aktivator entsprechen. Es ist darauf hinzuweisen, dass von Individuum zu Individuum abweichend natürliche allele Variationen auftreten können, was durch Unterschiede be züglich einer oder mehrerer Aminosäuren in der Gesamt sequenz nachgewiesen werden kann. Ferner hängen die Glycosylierungsmuster von der Natur der Wirtszellenumgebung ab.

Bei Human-Gewebeplasminogen-Aktivator handelt es sich um ein Polypeptid, das zwei funktionelle Bereiche aufweist, die aus einem Proteasebereich, der zur Umwandlung von Plasminogen zu Plasmin in der Lage ist, und einem kringel haltigen Bereich bestehen, von dem angenommen wird, dass er für die Fibrinbindung verantwortlich ist. t-PA umfasst daher Polypeptide mit einem Gehalt an diesen funktionellen Bereichen als Teil der Gesamtsequenz.

In Analogie zu Trypsin und Chymotrypsin wird angenommen, dass die Bildung der zweikettigen Form von allen Serin proteasen eine Folge der Anwesenheit der freien-α-Amino gruppe in t-PA in Stellung 276 ist. Somit wird bei Spaltung von Arg 275 die α-Aminogruppe 276 frei und tritt in Wech selwirkung mit der Polypeptidkette im Bereich des aktiven Se rins von t-PA. Erfindungsgemäß werden alle Mutanten um fasst, die die Wechselwirkung dieser α-Aminogruppe mit dem aktiven Proteasezentrum stören, ohne dass die Gesamt aktivität des Moleküls verringert wird.

Zur Erzeugung von Mutationen der zugrundeliegenden DNA so wie zur Herstellung der entsprechenden Mutanten können eine Reihe von Verfahren angewandt werden. Ein derartiges Verfahren, das hier als besonders bevorzugte Ausführungs form erläutert wird, umfasst zunächst die Insertion eines Fragments des nativen t-PA-Gens, das die für den zu mu tierenden Bereich kodierenden Sequenzen aufweist, in die replikative Form der Phage M13mp8 unter Bildung von M13mp8PA. Ein synthetisches Oligonucleotid, das zur insertierten t-PA-Sequenz komplementär ist, aber ein oder mehr Nucleo tidtripletts, die für die zu substituierende Aminosäure kodieren, enthält, wird sodann mit der einzelsträngigen Form von M13mp8PA unter Bildung eines doppelsträngigen Bereichs verschmolzen. Dieser Bereich dient als Primer für die DNA-Polymerase I-Synthese des restlichen komple mentären Strangs. Nach Replikation und Identifikation kann die mutierte t-PA-Sequenz weiter modifiziert oder zum Aufbau eines prokaryotischen oder eukaryotischen Vektors zur Expression des mutierten t-PA-Polypeptids verwendet werden.

A. Allgemeines

Erfindungsgemässe mutierte t-PA-Derivate werden herge stellt, 1) die Methionin als erste Aminosäure (vorhanden aufgrund der Insertion des ATG-Startsignalcodons vor dem Strukturgen) aufweisen, oder 2) worin das Methionin intra- oder extrazellulär abgespalten ist und die übliche erste Aminosäure vorliegt, oder 3) zusammen entweder mit ihrem Signalpolypeptid oder einem konjugierten Protein, das vom üblichen Signalpolypeptid abweicht, wobei das Signalpoly peptid oder das Konjugat spezifisch in intra- oder extra zellulärer Umgebung abspaltbar sind, oder 4) durch direkte Expression in reifer Form ohne Notwendigkeit der Abspal tung von äusseren, überflüssigen Polypeptiden. Auf jeden Fall wird der so gebildete mutierte Human-t-PA in den ver schiedenen Formen gewonnen und bis zu einem solchen Grad gereinigt, dass sich das Produkt zur Behandlung von ver schiedenen vaskulären Zuständen oder Erkrankungen eignet, z. B. von Myokardinfarkt, Schlaganfall, Lungenembolie, tiefer Venenthrombose, peripherer arterieller Okklusion und anderen thrombotischen Zuständen.

Mutierter Human-t-PA wird auch funktionell dadurch defi niert, dass er in der Läge ist, sich an Fibrin zu binden und die in vivo oder in vitro-Umwandlung von Plasminogen zu Plasmin, das wiederum Fibringerinnsel auflöst, zu ver mitteln.

Der Ausdruck "Expressionsvektor" umfasst Vektoren, die in der Lage sind, darin enthaltene DNA-Sequenzen zu exprimie ren, wobei derartige Sequenzen funktionell mit anderen Sequenzen, die zur Durchführung ihrer Expression in der Lage sind, verknüpft sind und die in den Wirtsorganismen entweder als Episomen oder als integrierender Bestandteil der chromosomalen DNA replizierbar sind.

Der Ausdruck "rekombinante Wirtszellen" bezieht sich auf Zellen, die mit den unter Anwendung von rekombinanten DNA- Techniken aufgebauten Expressionsvektoren transformiert worden sind.

B. Wirtszellkulturen und Vektoren

Die hier beschriebenen Vektoren und Verfahren eignen sich für eine Verwendung in Wirtszellen aus einem breiten Be reich von prokaryotischen und eukaryotischen Organismen. Beispielsweise ist E. coli K12 Stamm 294 (ATCC 31446) be sonders geeignet. Andere Mikroorganismenstämme, die ver wendet werden können, sind E. coli B und E. coli X1776 (ATCC 31537). Diese Beispiele dienen aber lediglich der Erläuterung und stellen keine Beschränkung dar.

Neben Prokarionten können eukaryotische Organismen, wie Hefekulturen, verwendet werden. Gegenwärtig werden Kulturen von Zellen, die sich von multizellulären Organismen ab leiten, als Wirte bevorzugt. Im Prinzip eignen sich alle derartigen Zellkulturen. Von besonders grossem Interesse sind Wirbeltierzellen. Die Vermehrung derartiger Zellen in Kulturen (Gewebekulturen) hat sich zu einem wieder holbaren Verfahren entwickelt; vgl. Tissue Culture, Academic Press, Hrsg. Kruse und Patterson, 1973. Beispiele für derartige wertvolle Wirtszellinien sind VERO und HeLa- Zellen, Zellinien aus dem Ovarium des Chinesischen Hamsters (CHO), W138-, BHK-, COS-7- und MDCK-Zellinien.

Die nachfolgenden Beispiele beschreiben die Verwendung von E. coli unter Einsatz des trp-Promotorsystems und die Verwendung con CHO-Zellen unter Einsatz von Expressions vektoren, die als einen Promotor die SV40-Replikations ursprungsstelle umfassen. Für den Fachmann ist es jedoch möglich, andere prokaryotische oder eukaryotische Wirts zellkulturen einzusetzen.

C. Angewandte Methoden 1. Transfektion

Bei Verwendung von Zellen ohne erhebliche Zellwandbarrieren als Wirtszellen kann die Transfektion durch das Verfahren der Calciumphosphatfällung gemäss Graham et al., Virology, Bd. 52 (1978), S. 546, durchgeführt werden. Jedoch kann auch eine nukleare Injektion oder Protoplastenfusion an gewandt werden.

Bei Verwendung von prokaryotischen Zellen oder Zellen, die erhebliche Zellwandbauten aufweisen, besteht die be vorzugte Transfektionsmethode in der Verwendung von Calciumchlorid gemäss Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), Bd. 69 (1972), S. 2110.

2. Vektoraufbau

Zum Aufbau (Konstruktion) von geeigneten Vektoren, die die gewünschte Codier- und Kontrollsequenz enthalten, werden an sich bekannte übliche Ligationstechniken angewandt. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, zugeschnitten und zur Bildung der erforderlichen Plas mide religiert.

Ausführungsbeispiele 1. Aufbau von M13mp8PAbglII für die t-PA-Mutagenese

Human-t-PA-DNA wurde aus den Plasmiden pPADHFR-6 (auch als pETPFR bezeichnet) und pA25E10 erhalten. Die Herstellung dieser beiden t-PA-Plasmide ist in der vorstehend beschrie benen EP-A-93619, auf die hier Bezug genommen wird, be schrieben.

Das Plasmid pA25E10 enthält Sequenzen, die für die letzten 508 Aminosäuren des t-PA-Gens kodieren, und 772 Basenpaare des 3'-nicht-translatierten Bereichs. Dieses Plasmid wurde mit SacI und BglII verdaut, um ein 744-Basenpaar-Fragment zu erhalten, das nach vorstehend erwähnten üblichen Verfah ren isoliert wurde. Wie aus der bekannten Sequenz- und Restriktionskarte von t-PA in Fig. 1 ersichtlich ist, ent hält dieses Fragment die Codons für die t-PA-Aminosäuren 411 bis 527 und umfasst einen Teil des 3'-nicht-transla tierten Bereichs.

Das Plasmid pPADHFR-6 enthält das gesamte Strukturgen für t-PA und einen Teil des 3'-nicht-translatierten Bereichs. Dieses Plasmid wurde mit SacI und BglII verdaut, um ein 1230-Basenpaar-Fragment zu erhalten, das isoliert wurde. Dieses Fragment enthält Codons für die ersten 410 Amino säuren der reifen Form von t-PA.

Diese Fragmente wurden unter Anwendung von üblichen Ver fahren miteinander verknüpft und mit BglII verdaut. Ein 1974-Basenpaar-Fragment, das die Codons für die gesamte reife t-PA-Sequenz plus einen Teil des 3'-nicht-trans latierten Bereichs enthielt, wurde isoliert. Doppel strängige M13mp8 (Messing et al., Third Cleveland Sym posium on Macromolecules Recombinant DNA, Hrsg. A. Walton, Elsevier, Amsterdam (1981), S. 143) wurde mit BamHI ver daut und mit dem durch BglII verdauten t-PA unter Bildung von M13mp8PABglII verschmolzen. E. coli JM 101-Zellen (ATCC 33876) wurden mit der doppelsträngigen replikativen Form von M13mp8PABglII transformiert. Die einzelsträngigen und doppelsträngigen (RF) Formen von M13mp8PABglII können aus E. coli JM 101-Zellen, die mit dieser Phage infiziert sind, isoliert werden. Die einzelsträngige Form wurde für die stellenspezifische Mutagenese von t-PA verwendet.

2. Synthese von Primern für die stellenspezifische Muta genese

Das Human-t-PA-Strukturgen wurde durch stellenspezifische Mutagenese zur Expression von t-PAs mit Aminosäuresubsti tutionen an verschiedenen Stellungen modifiziert. Synthe tische Oligonucleotide wurden hergestellt, beispielsweise gemäss dem Festphasen-Phosphotriesterverfahren von Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA), Bd. 75 (1978), S. 5765. Die folgenden synthetischen Primer wurden hergestellt und für die stellenspezifische Mutagenese verwendet:

Die Aminosäure- und Gensequenz von nativem t-PA ist in den ersten beiden Zeilen wiedergegeben. Die Primer haben Tripletts, die sich am angegebenen Rest von der nativen Gensequenz unterscheiden. Die entsprechende Aminosäure substitution ist oberhalb des für diese Aminosäure ko dierenden Tripletts angegeben.

3. Stellenspezifische Mutagenese

Das nachstehend beschriebene Verfahren wurde zur Erzeugung von unterschiedlichen t-PA-Klonen, die die mutierte Sequenz der synthetischen Primer enthielten, verwendet. Es wird das allgemeine Verfahren von Adelman et al., DNA, Bd. 2 (1983), S. 183, angewandt. Das Gesamtschema zur Erzeugung der einzelnen Klone ist in Fig. 3 dargestellt. M13RF1B8, M13RF2C9 und M13RF4A10 wurden unter Verwendung der Primer, die die gezeigten Mutationen für die einzelnen Aminosäuren enthielten, erzeugt. Einzelstängiges M13RF4A10, das eine Mutation in Stellung 277 enthielt, wurde mit Primer 3A7 oder 4B3 zur Erzeugung von M13RF3A7 bzw. M13RF4B3 ver schmolzen. Gereinigte M13-RF-DNA aus diesen mutierten t-PA-Genen wurde aus E. coli JM 101-Zellen hergestellt. Anschliessen wurden DNA-Fragmente mit einem Gehalt an der mutierten t-PA-DNA-Sequenz zum Aufbau der Expressions vektoren für den mutierten t-PA verwendet.

50 ng eines synthetischen Oligonucleotids wurde 30 Minuten bei 37°C in 10 µl 50 millimolar Tris-HCl vom pH-Wert 7,5, 10 millimolar MgCl₂, 10 millimolar Dithiothreit, 1 milli molar ATP mit einem Gehalt an 8 U T4-Polynucleotidkinase phosphoryliert. Zur Verwendung als Tracer wurden 400 ng synthetisches Oligonucleotid auf die vorstehende Weise phosphoryliert, mit der Abänderung, dass ATP durch 60 mCi [γ³²-P-]-ATP (3000 µCi/mMol) ersetzt wurden, wodurch man etwa 50 bis 60 × 10⁶ cpm/400 ng des 24-meren erhielt. Zur Heteroduplexbildung wurden 10 ng einzelsträngiges M13mp8- PABglII 10 Minuten auf 95°C erwärmt und langsam (30 mm) in 40 µl 10 millimolar Tris-HCl vom pH-Wert 7,5, 10 millimolar MgCl₂, 1 millimolar Dithiothreit mit einem Gehalt an 10 ng phosphoryliertem Primer und 50 ng mit EcoRI ver dautem grossem Fragment von M13mp8PABglIIRF abgekühlt. Die Primerextension wurde durch Zugabe von 10 µl Ligasepuffer mit einem Gehalt an 2 millimolar ATP, jeweils 0,25 milli molar dGTP, dTTP, dCTP und dATP, 5 U E. coli-DNA-Poly merase I-grossem Fragment und 400 U T4-DNA-Ligase gestartet. Nach 1 h bei 12°C wurde das Reaktionsgemisch zur Trans formation von E. coli JM 101-Zellen verwendet.

Die Transformation wurde durch Vermischen von 10 µl des Li gationsgemisches mit 200 µl kompetenten JM 101-Zellen und anschliessende 30-minütige Inkubation auf Eis und 5-minüti ge Inkubation bei 37°C erreicht. Sodann wurden 3,5 ml 2YT-Topagar bei 55°C mit 300 µl gesättigten JM-101-Zellen, 10 µl IPTG (200 millimolar) und 50 µl Xgal vermischt und nach Zugabe der transformierten Zellen auf 9 cm-Petri schalen mit einem Gehalt an LB ohne Arzneistoffe ausgestri chen.

Farblose Plaques wurden entnommen und auf eine Mikrotiter platte mit einem Gehalt an 100 µl 2YT-Medium übertragen. Die inokulierten Mikrotiterflüssigkeiten wurden auf LB- Agarplatten von 15 cm Durchmesser, die mit einem Rasen von 600 µl JM 101-Zellen in 8 ml 2YT-Topagar überschichtet waren, aufgedrückt und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die gebildeten Plaques wurden durch 1-minütigen physi kalischen Kontakt auf eine Nitrocellulosescheibe über tragen. Die Nitrocellulosescheibe wurde 3 min mit 0,5 m NaOH und 1,5 m NaCl behandelt und 2 mal 15 Minuten mit 3 m NaCl-0,5 m Tris-HCl vom pH-Wert 7,5 und sodann 15 min mit 2X SSC gewaschen. Das Prähybridisierungsgemisch ent hielt 10 millimolar Tris vom pH-Wert 7,5, 5 millimolar EDTA, 0,9 m NaCl, 1X Denhardt, 0,5% NP40, 100 mikromolar ATP, 1 millimolar Natriumpyrophosphat, 1 millimolar Na triumphosphat und 50 µg/ml E. coli tRNA. 1X Denhardt ent hält pro Liter 200 mg Ficoll, 200 mg Polyvinylpyrrolidon und 200 mg Rinderserumalubin (BSA; Fraktion V). Die Scheibe wurde 90 Minuten bei 80°C unter vermindertem Druck erwärmt. Anschliessend wurde die Scheibe 3 h mit 6 ml Prähybridi sierungsflüssigkeit in einer Petrischale unter darauffol gender Zugabe von markiertem Primer mit 5 × 10⁶ cpm in kubiert und über Nacht hybridisiert. Die selektive Waschung der Scheibe wurde mit 0,4 × SSC bei 49°C durchgeführt. Nach dem Trocknen wurde die Scheibe auf einen Röntgenfilm aufgelegt. Positive Hybridisierungsklone wurden ferner durch Dides oxysequenzierung analysiert; vgl. Aldemann, a. a. O.

4. Aufbau von Vektoren zur Expression der t-PA-Mutante in E. coli pXAPPA18 3'Δ10trpR

Das Plasmid pXAPPA18 3'Δx10trpR wurde zur Verwendung als Expressionsvektor für die verschiedenen mutierten t-PA- DNA-Sequenzen aufgebaut. Das zum Aufbau dieses Plasmids verwendete Gesamtschema ist in Fig. 4 bis 8 dargestellt. Das erhaltene Plasmid ergibt sich aus Fig. 8. Es enthält trpR-Repressorgen und eine Deletion von pBR322-DNA-Se quenzen, die die Plasmidamplifikation hemmen. Diese Deletion, als XAP-Deletion bekannt, besteht in der Ent fernung von 641 Basenpaaren der pBR322-DNA-Sequenzen zwi schen den AvaI- und PvuII-Restriktionsstellen von pBR322 gemäss Sutcliff, Cold Spring Harbor Symposium on Quanti tative Biology, Cold Spring Harbor Press, Bd. 43 (1979), S. 77. Das trpR-Repressorgen kompensiert die vorzeitige Derepression der t-PA-Expression, verursacht durch die erhöhte Plasmidkopienanzahl. Beim Zwischenprodukt zum Aufbau von pXAPPA18 3'Δx10trpR handelt es sich um das Plasmid pPA18, das gemäss Fig. 4 aufgetragen wurde. Dieses Plasmid enthält das gesamte pre-t-PA-Strukturgen sowie die 5'- und 3'-nicht-translatierten Bereiche. Ein mit dem t-PA-Gen assoziierter trp-Promotor und Sequenzen, die Ampicillin- und Tetracyclinresistenz verleihen, sind ebenfalls für dieses Plasmid charakteristisch.

Zum Aufbau von pPA18 werden vier Plasmide verwendet, näm lich pFIFtrp69, pHKY10, ptPAtrp12 und pPA25E10. Das Plas mid pFIFtrp69 ist bei Goeddel et al., Nucleic Acids Res., Bd. 8 (1980), S. 4057, beschrieben. Das Plasmid pHKY10 ist in PE-A-36776 beschrieben. Die Plasmide ptPAtrp12 und pPA25E10 sind bei Pennica et al., Nature, Bd. 301 (1983), S. 214 und in der vorerwähnten EP-A-93 619 beschrieben.

Allgemein wird das Plasmid pFIFtrp 69 mit PstI und XbaI zur Bildung des 950-Basenpaar-Fragments, das in Fig. 1 als Fragment 1 bezeichnet ist, verdaut. Das Plasmid ptPAtrp12 wurde mit XbaI und NarI verdaut. Daraus wurde die 340-Basenpaar-Sequenz, die in Fig. 4 mit Fragment 4 bezeichnet ist, isoliert. Das Plasmid pPA25E10 wurde mit NarI und BglII verdaut. Daraus wurde das 1604-Basenpaar- Fragment, das in Fig. 4 mit Fragment 3 bezeichnet ist, isoliert. Das Plasmid pHKY10 wurde mit PstI und BglII unter Bildung eines 2900-Basenpaar-Fragments, das in Fig. 4 mit Fragment 2 bezeichnet ist, verdaut. Diese vier Frag mente wurden verknüpft. Diese DNA wurde zur Transformation von E. coli-Zellen unter Bildung von pPA18 verwendet.

Das Plasmid pPA18 wurde isoliert und mit Sau3A verdaut und anschliessend mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I zum Auffüllen der Restriktionsstelle behandelt. Das nicht zirkuläre Plasmid wurde mit SacI behandelt. Eine 389- Basenpaar-Sequenz, die in Fig. 5 mit Fragment 5 bezeichnet ist, wurde isoliert. Das Plasmid pPA18 wurde auch mit SacI und BamHI verdaut. Daraus wurde das Vektorfragment 6 isoliert. Das Plasmid pBR322 (vgl. Boyer et al., Gene, Bd. 2 (1977), S. 95) wurde mit EcoRI verdaut und an schliessend mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I behandelt. Diese offenendige DNA-Sequenz wurde mit BamHI unter Bildung der 375-Basenpaar-Sequenz, die in Fig. 5 als Fragment 7 bezeichnet ist, behandelt. Die Fragmente 5, 6 und 7 wurden verknüpft. Dieses Präparat wurde zur Trans formation von E. coli verwendet, wodurch das Plasmid pPA183'Δ erhalten wurde. Dieses Plasmid ist äquivalent zu pPA18, mit der Ausnahme, dass ein Teil des 3'-nicht-trans latierten, Bereichs des t-PA-Gens entfernt worden ist.

Das Plasmid pPA183'Δ wurde mit PstI und NarI verdaut, um ein 313-Basenpaar-Fragment zu bilden, das in Fig. 6 als Fragment 8 bezeichnet ist. Dieses Fragment kodiert für die Aminosäuren 8 bis 109. Das synthetische Oligonucleotid fragment 9 hat folgende Sequenz:

Diese synthetische DNA wurde mit der PstI-Stelle von Frag ment 8 verknüpft, um das Arginineodon in Stellung 7 und die ersten 6 Aminosäurecodons des reifen t-PA-Moleküls zu regenerieren. Ferner wurde eine Ribosomenbindungsstelle in 5'-Stellung zum synthetischen N-terminalen Methionincodon, das sich unmittelbar in 5'-Stellung zum Rest 1 der reifen t-PA-Aminosäure-Codierungssequenz befindet, positioniert. Das 5'-Ende dieses Oligonucleotids enthält eine XbaI- Restriktionsstelle. Somit wurde das Fragment 8 in Gegen wart des synthetischen Oligonucleotidfragments 9 verknüpft und das behandelte Gemisch mit XbaI und NarI unter Bildung des Fragments 10 (vgl. Fig. 6) behandelt.

Das Plasmid pPA183'Δ wurde mit NarI und SacI unter Bil dung der 900-Basenpaar-Sequenz, die in Fig. 7 mit Frag ment 11 bezeichnet ist, verdaut. Dieses Plasmid wurde auch mit SacI und XbaI unter Bildung des Vektorfragments 12 von Fig. 7 verdaut. Die Fragmente 10, 11 und 12 wurden verknüpft und zur Transformation von E. coli verwendet, woraus dann pPA183'ΔX10 isoliert wurde. Eine DNA-Sequenz mit der XAP-Deletion und dem trpR-Repressorgen wird von pFMBtrpR, das in EP-A-136907 beschrieben ist, abgeleitet. Kurz zusammengefasst, wurde das Plasmid aus drei bekannten Plasmiden aufgebaut: phGH107 (EP-A-22242) wurde als Quelle für den lac-induzierbaren Promotor verwendet; ptrpR3 (Roeder et al., Molecular Genetics, Bd. 176 (1979), S. 361) wurde als Quelle für die für den trp-Repressor kodieren de Sequenz verwendet; und pFMB1 (EP-A-68693) wurde als Quelle für die Kodierungssequenz für das vom Stamm A24 abgeleitete FMD-Antigen verwendet.

Um die trp-Repressorsequenz zu erhalten, wurde ptrpR3 mit HaeIII behandelt, und die 334-Basenpaar-Fragment wurde aus einem 6% Acrylamidgel isoliert. Das isolierte Fragment wurde mit 16-mer EcoRI-Linkern der Sequenz

5'CCATAGAATTCTATGG

verknüpft.

Um das Vektorgerüst und den lac-Promotor zu erhalten, wurde phGH107 zuerst mit EcoRI verdaut und sodann mit bak terieller alkalischer Phosphatase behandelt. Das grosse Vektorfragment mit einem Gehalt am lacUV5-Promotor wurde sodann mit dem zugeschnittenen trpR-Plasmid unter Ver wendung von T4-Ligase verknüpft. Das Ligationsgemisch wurde in E. coli transformiert. Plasmid-DNA aus Trans formanten wurde isoliert, und die Anwesenheit des gewünsch ten Plasmids mit der Bezeichnung ptpR/hGH107 bestätigt; Messing et al., Nucleic Acids Res., Bd. 9 (1981), S. 309.

ptrpR/hGH107 wurde partiell mit EcoRI verdaut, unter Ver wendung von Klenow stumpfendig gemacht und mit PvuII be handelt, wodurch man das lac-Promotor/trp-Repressoroperon (das 530 bp-Fragment) bereitstellte. Durch partielle PvuII- Verdauung von pFMB1 und Isolierung des Vektorfragments an 6% Polyacrylamid erhielt man das Expressionsvektorgerüst mit einem Gehalt an der für FMB unter Kontrolle des trp-Promotors kodie renden Sequenz. Das ptrpR/hGH107-Fragment wurde mit dem pFMB1-PvuII-Ver dauungsprodukt vermischt und mit T4-Ligase verknüpft. Das Ligationsge misch wurde dann zur Transformation von E. coli Stamm 294 verwendet. Die Transformanten wurden als Quelle für Plasmid-DNA verwendet. Das erhal tene Plasmid pFMB/trpR wurde durch Miniscreening bestätigt und zur Orientierung der Insertion durch AvaI-PvuII-Verdauung bereitgestellt. Das Plasmid pFMB/trpR wurde mit NdeI und BamHI verdaut. Das Fragment mit einem Gehalt an dem trpR-Repressor wurde isoliert. Das Plasmid pPA183'ΔX10 wurde mit NdeI und BamHI verdaut. Das Hauptvektorfragment wurde isoliert. Die ses Vektorfragment und das trpR-Repressorsegment aus pFMB/ trpR wurden verknüpft, und das DNA-Gemisch zur Transfor mation von E. coli verwendet, woraus dann das Plasmid pXAPA183'ΔX10trpR isoliert wurde, wie in Fig. 8 gezeigt ist.

5. E. coli-Expressionsvektoren für t-PA-Mutanten

Fig. 8 stellt den zur Expression von t-PA und t-PA-Mutanten in E. coli verwendeten Vektor pXAPPA183'ΔX10trp dar. Wie ersichtlich ist, wird die Expression des nativen t-PA- Strukturgens durch den trp-Promotor kontrolliert. Es wird auf die XbaI-, NarI- und SacI-Restriktionsstellen hinge wiesen. Das Plasmid pXAPPA183'ΔX10trpR wurde mit NarI und XbaI verdaut. Ein in Fig. 1 als Fragment 1 bezeichnetes 340-Basenpaar-Fragment wurde isoliert. Ein in Fig. 8 als Fragment 2 bezeichnetes Vektorfragment wurde erhalten, indem man das grosse Fragment, das durch Verdauung von pXAPPA183'ΔX10trpR mit XbaI und SacI erhalten wurde, iso lierte. Das Fragment 3 (900 bp) wurde erhalten, indem man RF-DNA der einzelnen mutierten t-PA M13-Klone, die durch stellenspezifische Mutagenese erhalten worden waren, mit NarI und SacI verdaute (Fig. 3). Die unterschiedliche mu tierte t-PAs exprimierenden Vektoren wurden erhalten, indem man die Fragmente 1 und 2 mit den entsprechenden Fragmenten 3 verknüpfte und zur Transformation von E, coli verwendete, woraus dann die einzelnen mutierten E. coli-t-PA-Expressions vektoren erhalten wurden:

pXAPPA18 3'Δx10trpR 1B8

pXAPPA18 3'Δx10trpR 2C9

pXAPPA18 3'Δx10trpR 4A10

pXAPPA18 3'Δx10trpR 3A7

pXAPPA18 3'Δx10trpR 4B3

Diese Plasmide sowie der Wildtyp-t-PA-Expressionsvektor pXAPPA183'ΔX10trpR wurden zur Transformation von E. coli W3110fhuA^- verwendet.

E. coli W3110fhuA^- ist ein gegen T1-Phagen resistentes Bakterium, das durch Deletion oder Inversion von DNA-Se quenzen, die mit dem fhuA-Gen assoziiert sind, gekenn zeichnet ist. Kurz zusammengefasst, wird E. coli 21.11.1984 hervorgeht. Kurz zusammengefasst, wird E. coli W 3110 (ATCC 27325) mit λ-Bakteriophagen mit einem Ge halt an dem transponierbaren Element Tn10, das die Tetra cyclinresistenz verleiht, transduziert. Stämme von mit Tn10 transduziertem W3110 werden in bezug auf die Resistenz gegen Phageninfektion ausgewählt. Phagenresistente Stämme werden vereinigt und mit dem Bakteriophagen P1 infiziert. Das erhaltene Lysat wird zur Transduktion von E. coli AT982 (Bukhari et al., J. Bacteriology, Bd. 105 (1971), S. 844) verwendet. Der Stamm AT 982 enthält eine Dap-Mutation in der Nähe des fhuA-Gens. Demgemäss zeigt die Transduktion des Stamms AT982 durch das P1-Lysat und die Auswahl der Trans duktanten, die gegen Tetracyclin resistent sind und die die Dap-Funktion regenerieren, dass das Transposon Tn10 sich innerhalb des fhuA-Gens befindet. Stämme die gegen Te tracyclin resistent sind und die regenerierte Dap-Punktion aufweisen, werden als DNA-Quelle für Bakteriophagen P1- Transduktion von E. coli W3110 verwendet. Transduzierte W3110-Stämme, die die Tetracyclinresistenz und die Phagen resistenz exprimieren, werden ausgewählt. Aus diesen Stämmen wird sodann auf der Basis der Resistenz gegen Phageninfektion und der Reversion zur Tetracyclinempfind lichkeit eine Auswahl getroffen; Naloy et al., J. Bacterio logy, Bd. 145 (1981), S. 1110. Die mit der Beibehaltung der Resistenz gegen T1-Phageninfektion gekoppelte Re version zur Tetracyclinempfindlichkeit zeigt, dass die mit dem fhuA-Gen assoziierte DNA-Sequenz entweder deletiert oder irreversibel invertiert worden ist. So aufgebaute Stämme werden als E. coli W3110fhuA^- bezeichnet.

Die das transponierbare Element Tn10 enthaltenden Phagen, die zur Insertion von Tn10 in W3110 verwendet wurden, wurden folgendermassen aufgebaut. Als Ausgangsmaterial diente λ-CI857b 2210am29. Diese Phage ist bekannt; Kleckner, J. Mol. Biol., Bd. 116 (1977), S. 125, und wurde aus drei bekannten λ-Mutanten nach üblichen Verfahren aufgebaut. Ein Lysat dieser λ-Phage wurde an amber-Suppressor-E. coli C600 (ATCC 23724), das nach bekannten Verfahren zum Einbau des Tn10-Transposons manipuliert worden war, hergestellt; Kleckner et al., J. Mol. Biol., Bd. 116 (1977), S. 125. Dieses Lysat wurde zur Infektion von E. coli C600 (λ-CI857), das einen amber-Suppressor und eine den cI857-Genotyp tra genden λ-Prophagen enthält. Die Lysate von gegen Tetra cyclin resistenten Kolonien wurden durch Wärmeinduktion un ter Züchtung der gegen Tetracyclin resistenten Kolonien zunächst in Brühe bei 32°C und anschliessend 90 Minuten bei 42°C hergestellt. Das Lysat wurde sodann auf E. coli C600 ausgestrichen und der Replikaplattierung unterworfen. Die auf E. coli C600 erscheinenden Plaques wurden bei 32°C auf E. coli C600 und E. coli W3102 sup+ (λimm434), das die Heteroimmunprophage λimm434 enthält, replikaplattiert; N. Kleckner et al., Genetics, Bd. 90 (1978), S. 427. Auf dem heteroimmunen Stamm auftretende Plaques wurden auf Tetracyclinplatten ausgestrichen. Auf diesen Platten auf tretende Plaques eignen sich zur Transduktion von Tetra cyclinresistenz und werden im vorstehend beschriebenen Verfahren zur Erzeugung von E. coli W3110fhuA^- verwendet.

Nativer t-PA und mutierter t-PA wurden aus 10 Liter-Kul turen dieser Zellen, die mit dem entsprechenden t-PA oder mutierten t-PA-Plasmid transformiert worden waren, er halten. Die Expression wurde durch Tryptophanmangelmedien induziert.

6. Expressionsvektoren für die t-PA-Mutanten in Säugetier zellen

Das Plasmid pPADHFR-6 (auch als pETPFR bezeichnet, vgl. die vorgenannte EP-A-93619) ist in Fig. 9 dargestellt. Die Expression des nativen t-PA-Strukturgens erfolgt unter der Kontrolle des frühen Promotors für das SV40 T-Antigen. Dieser Promotor kontrolliert auch die Expression des DHFR-Gens. Hingewiesen wird auf die BglII-, BstXI- und BstEII-Restriktionsstellen. Ein in Fig. 9 als Fragment 1 bezeichnetes Vektorfragment wurde durch Isolation des grossen Fragments erhalten, das durch Verdauung von pPADHFR-6 mit BglII und BstEII erhalten worden war. Das in Fig. 9 als Fragment 2 bezeichnete Fragment wurde durch Isolation des 400 Basenpaar t-PA-Fragments erhalten, das durch Verdauung von pPADHFR-6 mit BglII und BstXI erhalten worden war. Ein 1141-Basenpaar-t-PA-Fragment, das die gewünschten Mutationen enthielt und dem Fragment 3 in Fig. 9 entsprach, wurde durch Verdauung von RF-DNA aus den mutierten t-PA-Klonen mit BstXI und BstEII erhalten. Die Fragmente 1 und 2 wurden mit den jeweiligen Fragmenten 3 verknüpft. Die DNA-Gemische wurden zur Transformation von E. coli verwendet. Aus den einzelnen Transformanten wurden die jeweiligen eukaryotischen Expressionsvektoren er halten:

pPADHFR-6 1B8

pPADHFR-6 2C9

pPADHFR-6 4A10

pPADHFR-6 3A7

pPADHFR-6 4B3

Diese Plasmide sowie die nicht-mutierten t-PA-Expressions vektoren pPADHFR-6 wurden zur Transfektion von DHFR-Mangel- CHO-Zellen gemäss den vorstehenden Angaben (Graham et al., Virology, Bd. 52 (1973), S. 456 und EP-A-93619) verwendet. Die Expression von nativem und mutiertem t-PA wurde ver stärkt, indem man die Kulturen steigenden Konzentrationen an Methotrexat aussetzte.

Beispielsweise wurden die Plasmide pPADHFR-6 2C9 und pPADHFR-6 1B8 zur Transfektion von DHRF-Mangel-CHO-Zellen (Urlab & Chasin, PNAS, Bd. 77 (1980), S. 4216) unter Einsatz der Calciumphosphat-Fällungsmethode von Graham et al., Virology, Bd. 52 (1973), S. 456, verwendet.

In sämtlichen Fällen wurden die Kolonien, die im selek tiven Medium (Medium ohne Hypoxanthin, Glycin und Thymidin (-HGT))vereinigt und im -HGT-Medium weiter gezüchtet. Diese Zellen wurden in einer Menge von 2 × 10⁵ Zellen pro 100 ml Platte in 250 nanomolar Methotrexat (MTX) ausge strichen, um eine Auswahl für die Amplifikation der Plas midsequenzen zu treffen. 5 Klone, die in 250 nanomolar MTX wuchsen, wurden von der Platte extrahiert. Bei allen diesen Klonen wurde festgestellt, dass sie t-PA in das Medium sekretierten. Diese Klone wurden zur weiteren Unter suchung herangezogen.

E. Testverfahren 1. Reinigung von mutierter t-PA- und t-PA

Die verschiedenen, gemäss den vorstehenden Ausführungen in Säugetierzellen exprimierten t-PAs wurden in das Zell kulturmedium sekretiert. Das diese t-PAs enthaltende Me dium wurde direkt in verschiedenen, nachstehend beschrie benen Tests eingesetzt oder einem oder mehreren der fol genden Reinigungsstufen unterworfen, um die Reinheit an t-PA oder mutierter t-PA vor der Durchführung dieser Tests zu erhöhen.

Medien aus CHO-Zellen mit einem Gehalt an mutierter t-PA wurden absatzweise mit chelatbildender Sepharose (Pharma cia) (10 bis 20 ml Harz/Liter Medium) unter Aktivierung mit Zinkchlorid gemäss Rijken et al., Biochem. Biophys. Acta. Bd. 580 (1979), S. 140 extrahiert und auf einem Filter gesammelt. Das Harz wurde in eine Säule geschüttet, mit einem Puffer mit einem Gehalt an 0,02 m Natriumphos phat vom pH-Wert 8,0, 0,25 m NaCl, 0,01% Tween 80 und 10 mg/Liter Aprotinin gewaschen. Der t-PA wurde mit dem gleichen Puffer mit einem Gehalt an 50 millimolar Imidazol eluiert. Der vereinigte t-PA wurde gegen 0,02 m Natriumphosphat vom pH-Wert 8, 0,25 m NaCl und 0,01% Tween 80 dialysiert und auf ein Lysin-Sepharoseharz (Radcliffe et al., Arch. Biochem. Biophys., Bd. 189 (1978), S. 185 und Allen et al., Thrombosis Heamostasis, Bd. 45 (1981), S. 43) oder auf Benzamidin-Sepharoseharz (Bykowska et al., Biochem. Biophys. Acta Bd. 703 (1982), S. 113) aufgesetzt. Das Zinkchelatharz wurde kurz mit 0,02 m Natriumphosphat vom pH- Wert 8, 1 m NaCl und 0,01% Tween 80 gewaschen. Der t-PA oder mutierte t-PA wurde mit dem gleichen Puffer mit einem Gehalt an 0,5 m Arginin eluiert. Die Benzamidin-Sepharose wurde mit dem Dialysepuffer gewaschen und mit dem Dialyse puffer mit einem Gehalt an 1 m Guanidin eluiert. Die er haltenen Proteine wiesen gemäss Analyse durch SDS-PAGE eine Reinheit von mehr als 90% auf. Zusätzlich zur Anwendung der vorstehenden Reinigungstechniken können immobilisierte monoklonale Antikörper verwendet werden; vgl. Nielsen et al., EMBO J., Bd. 2 (1983), S. 115.

2. SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE)

Medienproben mit einem Gehalt an t-PA-Protein oder den mu tierten t-PA-Proteinen wurden unter vermindertem Druck eingeengt und mit Natriumdodecylsulfat (SDS)-Probenpuffer verdünnt. Sofern indiziert, wurde 10 millimolar Dithiothreit ((DTT) zugesetzt, um die Proteindisulfide zu reduzieren. Eine diskontinuierliche SDS-Elektrophorese unter Verwen dung von 10% oder 7 bis 17% Polyacrylamid-Trenngelen wurde gemäss dem Verfahren von Laemmli, Nature, Bd. 227 (1970), S. 680, durchgeführt. Zur Analyse der Plasmaproben wurden Trenngele mit 4 bis 10% SDS-Polyacrylamidgradienten mit dem Puffersystem von Laemmli eingesetzt. Aus der SDS- PAGE-Analyse wurden die Molekulargewichte durch Vergleich mit der Beweglichkeit von Proteinen bekannter Molekularge wichte ermittelt.

3. Bläschenfreisetzungs-Gerinnselauflösung

Rekombinanter (nicht-mutierter) t-PA und mutierte t-PAs wurden auf ihre Fähigkeit zur Auflösung von Fibringerinnseln mittels des Bläschenfreisetzungs-Gerinnselauf lösungstests untersucht.

Kurz zusammengefasst, wurde Thrombin (Sigma Chemical Co.) in destilliertem Wasser in einer Konzentration von etwa 1000 Einheiten/ml gelöst. Diese Vorratslösung wurde mit Testpuffer, der 0,06 m Dinatriumhydrogenphosphat, 0,06 m Natriumdihydrogenphosphat, 200 mg/Liter Natriumazid und 0,01% Tween 80 enthielt, 1 : 30 verdünnt. Eine Reihe von Teströhrchen mit einem Gehalt an 0,5 ml verdünnter Throm binlösung (30 bis 40 Einheiten/ml) und 0,5 ml unterschied licher Konzentrationen an t-PA (16 ng/ml bis 1 × 10⁶ ng/ml), entsprechender Kontrollen oder unbekannten Proben in ge eigneten Verdünnungen Wurden hergestellt. Eine zweite Reihe von Teströhrchen mit einem Gehalt an 20 µl Plasminogen lösung (1,0 mg/ml) und 1,0 ml Fibrinogenlösung (1 mg/ml) sowie 10 µl Hohlglas-Mikrokügelchen von mehr als 45 mesh (0,354 mm; 3 M Company) wurde ebenfalls hergestellt. Die vorstehenden Reagentien und Teströhrchen wurden bis zur letzten Stufe des Tests auf Eis belassen. 200 µl Thrombin-t-PA- oder Thrombin-mutierter-t-PA-Lösungen wurden zu einem Teströhrchen mit einem Gehalt an Plasmino gen, Fibrinogen und Mikrokügelchen gegeben, sodann 15 Se kunden heftig vermischt und schliesslich in ein Wasserbad von 37°C gebracht. Innerhalb von 30 Sekunden bildeten sich in den einzelnen Röhrchen Gerinnsel. Die Zeit zwischen der t-PA-Zugabe und dem Endpunkt der Reaktion wurde ge messen. Der Endpunkt wurde als der Zeitpunkt definiert, zu dem die Mikrokügelchen beim Test an die Oberfläche aufge stiegen waren.

Die Menge an thrombolytischer Aktivität einer speziellen Probe wurde unter Bezugnahme auf eine t-PA-Eichkurve er mittelt. Die spezifische Aktivität wurde unter Bezug nahme auf die durch Radioimmunoassay ermittelte Menge an t-PA oder mutiertem t-PA berechnet.

4. In vitro-Gerinnselauflösungstest

Rekombinanter t-PA und mutierter t-PA wurden ferner in einem in vitro-Gerinnselauflösungssystem getestet.

Kurz zusammengefasst, wurden Humanblutproben mit 3,13% Natriumcitrat als Antikoagulationsmittel gewonnen. Die zelluläre Fraktion wurde durch Zentrifugation entfernt. Jeweils 1 ml Plasma wurde mit 50 µl 0,5 m CaCl₂, 25 µl Rinderthrombin (100 Einheiten/ml) und 10 µl Human¹²⁵J- Fibrinogen (100000 cpm/10 µl) versetzt. Dieses Plasmage misch wurde in einen Siliconschlauch mit einem Innendurch messer von 4 mm eingesaugt und 1 h bei 37°C inkubiert. Aus auf 1 cm Länge abgeschnittenen Schlauchstücken wurden die Gerinnsel entfernt und in Puffer mit einem Gehalt an 0,3 m NaCl, 0,02 m Natriumcitrat (pH-Wert 5) und 0,01% Tween 80 gegeben. Die Gerinnsel wurden 4 mal innerhalb von 1 h mit frischem Puffer gespült. Die Radioaktivitätsmenge in der letzten Spülflüssigkeit betrug nicht mehr als etwa 10% der Radioaktivitätsmenge im Gerinnsel. Die einzelnen Gerinnsel wurden sodann in 2,5 ml Plasma gebracht. Eine 250 µl-Plasmaprobe wurde zum Zeitpunkt Null entnommen. Proben von t-PA oder mutiertem t-PA wurden in einem Vo lumen von 100 µl zugegeben. Proben von 250 µl wurden nach 1, 2, 3 bzw. 4 Stunden entnommen. Die Radioaktivität die ser Proben wurde bestimmt. Standards mit einem Gehalt an 5, 10, 20 und 40 t-PA-Einheiten pro ml wurden parallel dazu angesetzt. Die prozentuale Auflösung wurde nach Korrektur auf Volumenänderungen der einzelnen Proben be rechnet.

5. Chromogene Tests

S-2288: t-PA kann direkt unter Verwendung des synthetischen, chromogenen Kabi-Tripeptidsubstrats S-2288 (Helena Labora tories, Beaumont, Texas) gemessen werden. Für diesen Test werden t-PA und 1 millimolar S-2288 (Endkonzentration) in 0,05 m Tris (pH-Wert 7,4) mit einem Gehalt an 0,012 m NaCl und 0,01% Tween 80 10 Minuten bei 37°C inkubiert.

Die Reaktion wird durch Zugabe von 50 µl Eisessig zu 0,5 ml Reaktionsgemisch gestoppt. Die Aktivität wird aus der Absorption bei 405 nm unter Anwendung der folgenden, vom Hersteller angegebenen Gleichung berechnet:

S-2251: Die Plasminogenaktivierung durch t-PA wurde unter Verwendung des chromogenen, für Plasmin spezifischen Kabi- Tripeptidsubstrats S-2251 (Helena Laboratories) gemessen. Eine Aliquotmenge der Probe wurde mit 0,10 ml einer Lösung mit einem Gehalt an 0,7 mg/ml Plasminogen (0,05 m Tris, pH-Wert 7,4, 0,012 m NaCl) und 0,02 ml einer Humanfibrino genlösung mit einem Gehalt an 20 mg/ml (0,05 m Tris-HCl, pH-Wert 7,4, 0,012 m NaCl) vermischt. Das Volumen wurde auf 0,15 ml eingestellt. Sodann wurde das Gemisch 10 Minu ten bei 37°C inkubiert und anschliessend mit 0,35 ml S-2251 (1,0 millimolare Lösung im vorgenannten Puffer) versetzt. Die Reaktion wurde 5 oder 10 Minuten bei 37°C durchgeführt. Sodann wurde Eisessig (50 µl) zur Beendigung der Reaktion zugesetzt. Die Absorption bei 405 nm wurde gemessen. Die quantitative Aktivitätsmenge wurde durch Vergleich der Ergebnisse unter Verwendung einer Probe von rekombinantem nativem t-PA, die unter Verwendung des S-2288-Tests standardisiert worden war, ermittelt. Dies war zu Beginn erforderlich, da die Absorption bei 405 nm von Tag zu Tag mit Alterung des Plasminogens variierte und sich auch veränderte, wenn unterschiedliche Präparate von Plasminogen und Fibrinogen verwendet wurden. Diese Variation konnte Schliesslich durch sorgfältige Herstel lung von grossen Mengen an Humanplasminogen (glu-Plas minogen) unter anschliessender Lyophilisation von Ali quotmengen des Materials verringert werden. Die Aliquot mengen wurden bei -20°C gelagert. Vor der Verwendung wurden die rekonstituierten Plasminogenpräparate höchstens 4 Stunden bei 0°C aufbewahrt. Die Stimulierung der t-PA- Aktivität durch Fibrinogen wurde gemessen, indem man die Aktivität der Lösungen mit hohen Fibrinogenkonzentrationen mit ähnlichen Reaktionsgemischen, in denen kein Fibrinogen enthalten war, verglich. Aufgrund der Unlöslichkeit von Fi brin wurde bei diesem Test Fibrinogen verwendet. Durch diese Stimulierung durch hohe Fibrinogenkonzentrationen konnte offensichtlich die Stimulierung, die durch unlös liches Fibrin erwartet werden konnte, nachgeahmt werden.

6. In vivo-Inhibitor-Komplextest

Rekombinanter t-PA und mutierter t-PA wurden in vitro zur Ermittlung ihrer Reaktivität mit natürlich auftretenden Inhibitoren der t-PA-Aktivität getestet. Allgemein wurden t-PA und mutierter t-PA mit ¹²⁵J unter Verwendung von Jodobeads (Pierce Chemical Co.) jodiert, wodurch man t-PA oder mutierten t-PA mit einer spezifischen Radioaktivität von etwa 2 × 10⁶ cpm/µg erhielt. Für die in vitro-Komplex bildung wurden der radioaktiv markierte t-PA (1 µg) zu frisch gewonnenem, mit Citrat versetztem Humanvollblut (500 µl) gegeben. Die Proben wurden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde durch Verdünnung einer Aliquotmenge mit 2% SDS gestoppt. Die Proben wurden in 4 bis 10% Polyacrylamidgradienten-SDS-PAGE analysiert. Die Komplexe wurden durch Autoradiographie nachgewiesen.

7. Fibrinbindungstest

Die Methode für die Fibrinbindung stellt eine Modifikation der Methode von Rijkenet al., J. Biol. Chem., Bd. 257 (1982), S. 2920 dar. Die zu untersuchende t-PA-Probe (500 ng) wird zu einer Lösung mit einem Gehalt an 0,05 m Tris vom pH-Wert 7,4, 0,12 m NaCl, 0,01% Tween 80, 1 mg/ml Humanserumalbumin und verschiedenen Konzentrationen an plas minogenfreiem Fibrinogen (0, 0,1, 0,5 bzw. 1,0 mg/ml) ge geben. Das Endvolumen des Reaktionsgemisches beträgt 1 ml. Die Probe wird 5 Minuten bei 37°C inkubiert, wonach 1 Einheit Thrombin zugesetzt wird. Die Proben werden 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Das Gerinnsel wird unter Verwendung eines Glasstabs entfernt. Die Menge an im Überstand unge bunden verbleibendem t-PA wird bestimmt. Die Daten wer den als prozentualer Anteil des gebundenen t-PA gegen die Fibrinkonzentration aufgetragen (Fig. 11).

8. In vivo-Gerinnselauflösung

Das in vivo-Gerinnselauflösungsmodell von Collen et al., J. Clin. Invest., Bd. 71 (1983), S. 368, wurde angewendet. Männliche weisse Neuseeland-Kaninchen mit einem Gewicht von 2,5 bis 3 kg wurden mit Ketamin betäubt. Die Jugular vene wurde katheterisiert, und kleine verbindende Gefässe in dem Bereich wurden abgebunden. Etwa 2 cm der Jugular vene wurden mit reversiblen Ligaturen isoliert. Ein Faden wurde vom proximalen zum distalen Ende des Segments gelegt. Das Segment wurde mit einer Kochsalz-Thrombin-Lösung gespült und mit frischem Kaninchenblut, das ¹²⁵J-Humanfibrinogen enthielt, gefüllt. Nach 30 Minuten wurde der Blutfluss durch das Gerinnsel wieder aufgenommen. Die intravenöse t-PA-Infusion wurde mit einem Anfangsbolus von 10% der Gesamtdosis begonnen. Die Infusion wurde über 4 Stunden hinweg gegeben. 30 Minuten nach Infusionsende wurde das Gerinnsel gewonnen und ausgezählt. Die Radioaktivitäts ausbeute diente als Qualitätskontrolle. Blutproben, Urin, Tupfer und Spritzen wurden ausgezählt, um zu gewähr leisten, dass die im ursprünglichen Gerinnsel bestimmte Radioaktivitätsmenge exakt war.

F. Testergebnisse

t-PA-Mutanten mit folgenden Sequenzen an der Zweiketten aktivierungsstelle, d. h. den Resten 270 bis 279, wurden in E. coli- und Ovariumzellen des Chinesischen Hamsters (CHO- Zellen) exprimiert:

1. Western-Blots und Zymographie

Die in CHO-Zellen exprimierten EIKGG- und GIKGG-Mutanten wurden durch Western-Blots von reduzierten und nicht-redu zierten SDS-PAGE-Gelen analysiert. Nativer einkettiger t-PA ergab zwei Banden mit Molekulargewichten von 52000 und 50000 Dalton aufgrund einer unterschiedlichen Glycosy lierung. Die EIKGG-Mutante aus nicht-reduziertem SDS-PAGE zeigte eine immunoreaktive Hauptbande bei einem Molekular gewicht von etwa 50000 Dalton. Das Western-Blot der Mutante GIKGG von nicht-reduziertem SDS-PAGE wies jedoch ein Molekulargewicht von 55000 Dalton auf. Der offenbare Molekulargewichtsunterschied zwischen der GIKGG-Mutante und nativem t-PA kann auf eine geringfügig unterschied liche Konformation oder Kohlenhydratstruktur im Vergleich zu nativem t-PA hinweisen. Die Spaltung des Proteins bei Arg 275 kann durch ein geringeres Molekulargewicht von t-PA bei Analyse unter anschliessender Reduktion (wobei die Protease- und Kringel-Ketten getrennt werden) nachge wiesen werden. Zymographien der reduzierten SDS-PAGE-Gele ergaben, dass die Plasminogenaktivatorwirkung in diesen Proben sich beim Molekulargewicht der immunoreaktiven Bande der einkettigen Form von t-PA (etwa 60000) befand. Die zweikettige Form von t-PA besitzt eine elektrophoretische Beweglichkeit, die einem Molekulargewicht von etwa 30000 Dalton entspricht. Dieses Verfahren zeigte, dass die ein kettigen Formen von mutierten t-PA-Proteinen in Medien aus transformierten Zellen vorhanden waren.

S-2251-Test

Die Ergebnisse der Analyse von nativem und mutiertem EIKGG- t-PA durch den S-2251-Test sind in Tabelle I angegeben. Diese Werte wurden vor der Anwendung von Glu-Plasminogen beim Test zur Verringerung der Testvarianz erhalten. Der natürlich auftretenden t-PA-Sequenz RIKGG wurde eine will kürliche spezifische Aktivität in Gegenwart von Fibrinogen auf der Basis des S-2288-Tests zugewiesen. Dieser t-PA- Standard wurde mit den einzelnen EIKGG-t-PA-Mutanten ge testet, um die Ergebnisse zu normalisieren.

Es ist ersichtlich, dass die EIKGG-t-PA-Mutante unabhängig vom Reinigungsgrad eine spezifische Aktivität beim S-2251- plus-Fibrinogentest aufweist, die grösser als die Aktivität von rekombinanter t-PA ist.

Tabelle I

Die Daten von Tabelle IA wurden unter Verwendung von hoch wertigem, lyophilisiertem Glu-Plasminogen erhalten. Bei dem besser reproduzierbaren Test ergab sich, dass die EIKGG-Mutante eine gleich grosse Aktivität beim S-2251- Test in Gegenwart von Fibrinogen aufweist. In Abwesenheit von Fibrinogen ist die Mutante noch weniger aktiv als das native Produkt (Tabellen I und IA), was eine grössere Spezifität beweist.

Tabelle IA

2. Bläschenfreisetzung-Gerinnselauflösung und in vitro- Gerinnselauflösungstest

Der Bläschenfreisetzungs-Gerinnselauflösungstest wurde zur Ermittlung der spezifischen Aktivität von rekombinantem t-PA und gereinigter EIKGG-t-PA-Mutante durchgeführt. Die Aktivität der einzelnen t-PAs wurde gemäss den vor stehend beschriebenen Verfahren ermittelt. Die Konzentra tion an t-PA und EIKGG-mutiertem t-PA wurden durch Radio immunoassay ermittelt. Die Ergebnisse dieses Tests sind zusammen mit der spezifischen Aktivität in Tabelle II angegeben.

Tabelle II

Der Bläschenfreisetzungs-Gerinnselauflösungstest zeigt, dass eine einkettige Mutante von t-PA, speziell der EIKGG- mutierte t-PA, eine spezifische Aktivität aufweist, die um 50% über der von rekombinantem t-PA liegt. Wie ersichtlich ist, führt wiederholtes Einfrieren und Auftauen zu einer leichten Abnahme der spezifischen Aktivität des EIKGG- mutierten t-PA. Jedoch behält die mutierte t-PA immer noch eine grössere spezifische Aktivität als rekombinanter t-PA.

3. In vivo-Inhibitorkomplextest

Die Inaktivierung von Proteasen durch Plasmaproteaseinhibi toren stellt einen gut untersuchten Mechanismus zur Inakti vierung von Serumproteasen dar. Die erhaltenen Komplexe sind gegen Denaturierung stabil und können durch Elektro phorese an SDS-PAGE bestimmt werden. Bei diesem Ver fahren wird radioaktiv markierter t-PA zu Plasma oder Vollblut gegeben und die Probe bei 37°C inkubiert. So dann wird die Probe durch SDS-PAGE behandelt und anschlie ssend der Autoradiographie unterworfen. Der Nachweis der radioaktiven Markierung in Stellungen mit einem Molekular gewicht, das grösser als das Molekulargewicht von freiem t-PA ist, ist ein Hinweis für die Menge an gebildetem t-PA-Proteaseinhibitorkomplex. Bei Analyse in Rattenblut bildete t-PA langsam Komplexe mit einem Molekulargewicht von mehr als 200000. Nach einer Inkubationszeit von einigen Stunden konnten mehr als 70% der radioaktiven Markierung in diesen Komplexen nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu bildete mutierter t-PA keine derartigen Komplexe. Der Grossteil der durch Autoradiographie nach gewiesenen radioaktiven Markierung blieb in der Position von freiem, nicht-inaktiviertem Enzym. Bei Durchführung einer ähnlichen Analyse in Humanblut (Fig. 10) bildete t-PA ebenfalls derartige Komplexe, aber zusätzlich auch Komplexe mit Molekulargewichten zwischen 100000 und 200000. Wie bei Rattenblut bildete der mutierte t-PA deutlich weniger Inhibitorkomplexe mit Molekulargewichten von mehr als 200000. Die Proteaseinhibitorkomplexe mit Molekulargewichtswerten von 100000 bis 200000 waren noch anwesend. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Mutante nicht durch Proteinaseinhibitoren, die Komplexe mit Molekular gewichten von mehr als 200000 bilden, inaktiviert wird. Spezielle Unterschiede lassen sich in der Reaktivität von t-PA und mutiertem t-PA bei der Bildung von Komplexen zwischen 100000 und 200000 feststellen.

4. Fibrinbindung

Es wurde früher berichtet, dass die einkettigen und zwei kettigen Formen von t-PA etwa die gleiche Affinität gegen über Fibrin aufweisen (Rijken et al., J. Biol. Chem., Bd. 257 (1982), S. 2920. Bei dem hier beschriebenen Test wird im Gegensatz dazu für die einkettige Form von t-PA im Vergleich zur zweikettigen Form eine deutlich höhere Fibrinaffinität festgestellt (Fig. 11).

5. In vivo-Gerinnselauflösung

Fig. 12 zeigt die relativen Dosis-Wirkungs-Kurven für t-PA (o) und die EIK-Mutante (⚫). Die Daten werden als Mittel werte ± mittlerer Standardfehler für 5 Kaninchen pro Gruppe angegeben. Der Abstand zwischen den beiden Kurven bei 50-%iger Auflösung wurde gemessen. Die Fähigkeit zur EIK- Bildung von t-PA war um den Faktor 2,4 grösser als bei der nicht-mutierten Form (RIK). Eine statistisch signifi kante Differenz wurde bei der Dosis von 0,25 mg/kg (p < 0,01) erreicht.

G. Schlussfolgerungen

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, dass die Mutante in bezug auf den Rest 275 von t-PA aus zwei Gründen wirk samer als die natürliche Form ist.

1. Erhöhte Spezifität: Tests der t-PA-Funktion weisen auf ein aktiveres/spezifischeres Protein hin.
2. Verringerte in vivo-Plasmainhibitorbindung: Die in vivo- Hemmung von derartigen Mutanten zeigt eine Abnahme der Inaktivierung durch bestimmte Proteaseinhibitoren.
Dies ermöglicht die Zirkulation der aktiven nicht-kom plexierten Form von t-PA, wodurch sich eine erhöhte t-PA-Wirkung zur Gerinnselauflösung ergibt.

Die wissenschaftliche Literatur ist in bezug auf die enzy matischen Eigenschaften der einkettigen Form von t-PA widersprüchlich. Um die Funktion von t-PA besser zu ver stehen, kann man homologe Proteine berücksichtigen. Ein gehende Untersuchungen wurden an den Serinproteasen Trypsin und Chymotrypsin durchgeführt. Der t-PA-Proteasebereich weist eine sehr grosse Ähnlichkeit zu diesen Proteinen auf. Eine ähnliche Funktionsweise wird angenommen. Auf der Basis des für Trypsin und Chymotrypsin bestimmten Funktions mechanismus ist zu erwarten, dass eine Verhinderung der Spaltung in der Position Arginin 275 von t-PA nur die funktionellen Eigenschaften des Proteasebereichs beein flusst. Die erhöhte Fibrinaffinität für die Mutanten ist daher überraschend.

Unabhängig von den beteiligten Reaktionsmechanismen (er höhte Spezifität, Mangel an Proteaseinhibitorbindung, erhöhte Fibrinaffinität oder Kombinationen dieser Eigen schaften) wurde beim Testen einer Mutante auf ihre Fähig keit zur in vivo-Auflösung einer blockierten Vene festge stellt, dass die Mutante um den Faktor etwa 2,5 aktiver ist als t-PA mit natürlicher Sequenz. Wie vorstehend er örtert, wurde gezeigt, dass die einkettige Form von t-Pa an der Gerinnselstelle in die zweikettige Form übergeführt wird. Eine derartige Umwandlung führt zu einem Verlust der Vorteile der einkettigen Form. Nur bei einer mutierten Form von t-PA, die durch physiologische Proteasen nicht in die zweikettige Form übergeführt wird, bleiben die Vor teile an der Gerinnselstelle erhalten.

Claims

1. Einkettige Human-Gewebeplasminogen-Aktivator (t-PA)-Mutanten, bei denen in Position 275 eine von Arginin verschiedene Aminosäure vorliegt.

2. Mutante nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure in Position 275 Glycin oder Glutaminsäure ist.

3. Mutante nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich in Position 277 eine von Lysin verschiedene Aminosäure vorliegt.

4. Mutante nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure in Position 277 Isoleucin ist.

5. DNA, kodierend für eine Mutante nach den Ansprüchen 1 bis 4.

6. Expressionsvektor, enthaltend eine DNA nach Anspruch 5.

7. Mikroorganismus, transformiert mit dem Vektor nach Anspruch 6.

8. Zellkultur, transformiert mit dem Vektor nach Anspruch 6.

9. Säugetier-Zellkultur, transformiert mit dem Vektor nach Anspruch 6.

10. Zellkultur nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Ovarial- Zellinien des chinesischen Hamsters besteht.

11. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine Human-Gewebeplas minogen-Aktivator-Mutante nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in Mischung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.