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Die Erfindung bezieht sich auf eine neue alkalische
Protease, insbesondere auf eine neue alkalische Protease,
wobei eine oder zwei spezielle Aminosäuren in einer von
Bacillus licheniformis stammenden alkalischen Protease durch
eine andere oder durch andere ersetzt sind, wodurch bessere
Eigenschaften erreicht werden. Die vorliegende alkalische
Protease ist als Reinigungshilfsmittel verwendbar, welches
Detergentien oder einem Agens zum Entfernen der Proteine auf
Kontaktlinsen beigemischt wird.
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Proteasen, die als Reinigungshilfsmittel in
Detergentien oder Agentien zum Entfernen der Proteine auf
Kontaktlinsen verwendbar sind, werden aus jenen ausgewählt,
die in der Natur vorhanden sind. Von gewissen Bakterien, zum
Beispiel von solchen der Gattung Bacillus stammende Proteasen
werden als Keinigungshilfsmittel in Detergentien verwendet
und Papain oder alkalische Proteasen, die von gewissen
Bakterien, zum Beispiel von solchen der Gattung Bacillus
stammen, als Agentien zum Entfernen der Proteine von
Kontaktlinsen.
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Als Reinigungshilfsmittel in Detergentien verwendbare
Proteasen müssen einer Vielzahl von Anforderungen genügen,
wie z.B. hohe Aktivität im Bereich von pH-Werten zwischen 10
und 11, Beständigkeit gegen Bestandteile von Detergentien,
wie z.B. oberflächenaktive Verbindungen und/oder deren
Vorläufer, Stabilität innerhalb eines weiten Bereichs von pH-
Werten, Beständigkeit gegen Bleichmittel, weitgehende
Substratspezifizitäten und ätinliches. Heutzutage erhältliche
Proteasen werden durch oberflächenaktive Verbindungen
und/oder Bleichmittel, die wesentliche Bestandteile von
Detergentien sind, vollständig abgebaut. Einer der Ansätze
zur Stabilisierung von Proteasen ist die Granulatbildung mit,
beispielsweise, einer Beschichtung. Dieser Ansatz wird bei
flüssigen Detergentien kaum verwendet, so daß die
Stabilisierung flüssiger Detergentien, die Proteasen enthalten,
schwierig ist. Obwohl alkalische Proteasen verwendbar sind,
die gegenüber solchen Oxidatiansmitteln, wie
Peroxidbleichmitteln, beständig sind, weisen die natürlichen alkalischen
Proteasen eine so geringe Beständigkeit gegenüber solchen
Oxidationsmitteln auf, daß die Verwendung derselben begrenzt
ist. Die geringe Beständigkeit der natürlichen alkalischen
Proteasen gegenüber Oxidationsmitteln beruht auf der
Tatsache, daß Methionin in der 222. Position durch die
Oxidationsmittel oxidiert wird, bis es in Methioninsulfoxid
umgewandelt worden ist (C.E. Stauffer, Don Etson: J. Biol.
Chem., 244, 5333, 1969). Mittels einer Substitution des
Methionins in der 222. Position durch andere, gegenüber den
Oxidationsmitteln inerte Aminosäuren könnten durch Mutation
veränderte, durch Oxidationsmittel kaum beeinflußbare Enzyme
erwartet werden. Auf der Grundlage dieser Tatsachen wird
berichtet, daß veränderte Enzyme geschaffen worden sind,
indem das Methionin in der 222. Position der von Bacillus
amvyoliquefaciens stammenden alkalischen Protease durch 19
andere Aminosäuren substituiert wurde (D.A. Estell et al.: J.
Biol. Chem. 260, 6518, 1985; US-Patent 4 760 025).
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Die Substitution der Aminosäuren in natürlichen
Enzymen durch andere Aminosäuren führt oft zu einer
Erniedrigung der spezifischen Aktivität aufgrund der
Veränderung der dreidimensionalen Strukturen der Enzyme. Eines
der oben erwähnten, durch Mutation veränderten Enzyme, z. B.,
ein Alanin-substituiertes Enzym, das unter den veränderten
Enzymen die höchste spezifische Aktivität aufweist, ist nicht
zufriedenstellend, weil seine spezifische Aktivität lediglich
53 % der Aktivität des natürlich vorkomiiienden Enzyms
entspricht. Die Erniedrigung der spezifischen Aktivität
erschwert die Verwendung der veränderten Enzyme anstelle der
natürlich vorkommenden Enzyme des Wildtyps, auch wenn die
Beständigkeit gegenüber Oxidationsinitteln durch die
Substitution der Aminosäuren verbessert wird. Das Feld für
die praktische Anwendung der durch Mutation veränderten
Enzyme ist gegenüber den natürlich vorkommenden Enzymen des
Wildtyps verhältnismäßig eingeschränkt. Daher sind Enzyme,
die sowohl gegenüber Oxidationsmitteln eine hohe
Beständigkeit aufweisen, als auch zumindest über eine zu derjenigen
der natürlich vorkommenden Enzyme ähnliche spezifische
Aktivität verfügen, unter praktischen Gesichtspunkten
erforderlich.
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Alkalische Proteasen, die kommerziell für
Detergentien genutzt werden, sind jene, die von der Gattung
Bacillus stammen, z.B., von Bacillus lichenformis, Bacillus
amyloliquefaciens oder Bacillus subtilis. Jene alkalischen
Proteasen sind den anderen für Detergentien verwendeten in
vieler Hinsicht überlegen, obwohl sie die oben erwähnten
Schwierigkeiten aufweisen. Nachdem eine Untersuchung auf der
Grundlage der alkalischen Proteasen angestellt wurde, die von
Bacillus stammten, um durch Mutation veränderte, für
Detergentien verwendbare Enzyme zu erhalten, haben die
vorliegenden Erfinder gefunden, daß die Substitution des Glycins in
der 105. Position der von Bacillus licheniformis stammenden
alkalischen Protease durch Asparaginsäure die Beständigkeit
gegenüber oberflächenaktiven Verbindungen verbessert. Wir
haben auch gefunden, daß die Substitution des Methionins in
der 221. Position der von Bacillus licheniformis stammenden
alkalischen Protease, wobei eine Aminosäure in der 222.
Position nicht Methionin, sondern Alanin ist, durch Glutamin
ein Enzym erzeugt, das beinahe die gleiche spezifische
Aktivität wie das natürlich vorkommende Enzym des Wildtyps
aufweist und gegenüber Oxidationsmitteln beständig ist.
Zusätzlich haben wir gefunden, daß lediglich die Substitution
des Methionins in der 221. Position durch Glutamin die
Beständigkeit gegenüber Oxidationsmitteln erhöht, die
Beständigkeit
gegenüber oberflächenaktiven Verbindungen indes
abbaut, daß allerdings die Substitution des Glycins in der
105. Position durch Asparaginsäure zusammen mit der
Substitution des Methionins in der 221. Position durch
Glutamin die Beständigkeit gegenüber oberflächenaktiven
Verbindungen wiederherstellt.
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Entsprechend der vorliegenden Erfindung wird eine
neue alkalische Protease bereitgestellt, insbesondere eine
von Bacillus licheniformis stammende alkalische Protease, in
der das Glycin in der 105. Position durch Asparaginsäure
substituiert und/oder das Methionin in der 221. Position
durch Glutamin substituiert sind/ist. Die 105. oder 221.
Position bezeichnet eine vom N-terminalen Ende des fertigen
Proteins der alkalischen Protease aus gezählte Position. Das
durch Mutation veränderte Enzym, welches eine verbesserte
Beständigkeit gegenüber oberflächenaktiven Verbindungen
aufweist, wird erhalten durch Klonen eines alkalischen
Proteasegens eines Mikroorganismus, der zur Gattung Bacillus
gehört, Behandeln des geklonten Gens mit einem Agens, das die
Mutation auslöst, Herstellen eines Gens des durch Mutation
veränderten Enzyms, welches für ein Enzym codiert, das an
einer bestimmten Position oder bestimmten Positionen (eine)
gegenüber jenen (jener) des natürlich vorkommenden Enzyms
abweichende Aminosäuren (Aminosäure) aufweist, Kultivieren
eines umgewandelten Mikroorganismus, der das Gen des durch
Mutation veränderten Enzyms aufweist, und Selektieren
("screenen") einer alkalischen Protease, die gegenüber
oberflächenaktiven Verbindungen einen verbesserte
Beständigkeit aufweist, aus den erzeugten Proteasen. Der
Strukturunterschied zwischen dem natürlichen Enzym des Wildtyps und
der Mutante wird durch Seguenzanalyse der Nukleinsäuren
bestimmt. Ein durch Mutation verändertes Enzym, das ebenso
beständig gegenüber Oxidationsmitteln ist wie auch hohe
spezifische Aktivität aufweist, wird erhalten durch Anwenden
einer auf die Position ausgerichteten Mutagenese auf das
alkalische Proteasegen, solange bis das darin enthaltene
Methionin, das durch Oxidationsmittel oxidiert werden kann,
durch die andere Aminosäure ersetzt ist, und Selektion des
gewünschten Gens.
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Die oben erwähnte Vorgehensweise wird anschließend
ausführlicher erklärt werden.
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Das alkalische Proteasegen von Bacillus licheniformis
wird entsprechend der JP 63-214187 isoliert. Das bedeutet,
daß die Isolierung durch "Schrotflintenklonen" ("shot gun
cloning") vorgenommen wird, wobei der Wirt ein wenig Protease
erzeugender Stamm ist, der zur Gattung Bacillus subtilis
gehört, oder durch Koloniehybridisierung ("colony
hybridization"), wobei eine Referenzsubstanz mit dem alkalischen
Proteasegen DNA-homolog ist. Das "Schrotflintenklonen" zum
Erhalten eines Stammes, der das alkalische Proteasegen
aufweist, wird in einer solchen Weise durchgeführt, daß durch
Verdauen von Ohromosomen-DNA's von Bacillus licheniformis mit
Kestriktionsenzymen erhaltene Bruchstücke mit einer Vektor-
DNA von zur Gattung Bacillus gehörenden Mikroorganismen
verbunden werden, zum Beispiel mit solchen Plasmiden wie pUB
110 oder pE 194, oder mit einem Trägervektor ("shuttle
vector") von sowohl Mikroorganismen, die zu Bacillus, als
auch solchen, die zu Esherichia coli gehören, so wie z.B.
pHY 300 PLK, solange bis die Umwandlung eines wenig Protease
erzeugenden Stammes von Bacillus subtilis erfolgt ist und
anschließend umgewandelte Mikroorganismen, deren Fähigkeiten
zum Erzeugen von Proteasen verbessert sind, ausgewählt
werden.
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Die Umwandlung von Bacillus subtilis durch
rekombinierte DNA's wird nach einer Protoplastmethode
ausgeführt (S. Chang, S. N Cohen: Molec. Gen. Genet., 168,
111, 1979) oder nach einer Methode unter Verwendung
kompetenter Zellen (D. Dubnau, R. D. Abelson: J. Mol. Biol., 56,
209, 1971). Die erstgenannte Methode wird in einer solchen
Weise ausgeführt, daß eine Lysozymbehandlung angewandt wird,
solange bis Protoplasten erzeugt sind, und die DNA's werden
in Anwesenheit von Polyethylenglykol eingeführt. Die
letztere Methode wird in einer solchen Weise durchgeführt,
daß der Mikroorganismus in einem Minimal-Nährmedium
kultiviert wird, welches Glucose enthält, um eine Veränderung
dahingehend auszulösen, daß die DNA's leicht eingeführt
werden.
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Die Koloniehybridisierung ("colony hybridization")
wird unter Verwendung der unten erwähnten DNA's als eine
Referenzsubstanz durchgeführt. Einzelstrang-Oligonukleotide
können eingesetzt werden, die gewöhnlich 14 bis 18 Nukleotide
aufweisen, wobei die Nukleotidsequenz der Sequenz von etwa 5
oder 6 von in Serie verbundenen Aminosäuren entspricht, die
in irgendeinem Teil einer bekannten Aminosäuresequenz in von
Bacillus lichiniformis stammenden alkalischen Proteasen
vorkommen (M. Ottensen, I. Svendsen: Methods in Enzymology,
19 199 Academic Press, New York, 1979), zum Beispiel eine
Mischung von 16 Sorten Oligonukleotiden, die 14 Nukleotide
enthalten, wobei jedes eine Nukleotidsequenz wie folgt
aufweist:
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ATGAA(X)CA(Y)GC(Z)GT
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und wobei X und Y: gleich oder verschieden; A oder G sind;
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Z: T, C, A oder G ist,
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was der Sequenz der Aminosäuren
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Met-Lys-Gln-Ala-Val
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entspricht und zwar auf den Positionen 134 bis 138, ausgehend
von der N-terminalen Aminosäure. Wenn ein zu der gewünschten
alkalischen Protease homologes Gen erhalten wird, so kann
dieses Gen als Referenzsubstanz eingesetzt werden. Nach dem
Verknüpfen der Chromosomen-DNA-Bruchstücke mit dem Plasmid
von Escheria coli, zum Beispiel pBR 322, in Übereinstimmung
mit der gleichen Vorgehensweise, wie beim
"Schrotflintenklonen", wird, um kompetente Zellen von E. coli umzuwandeln,
die dahingehend verändert worden sind, daß sie zur Einführung
von DNA's mittels, beispielsweise einer Behandlung mit MnCl&sub2;-
CaCl&sub2; vorgesehen sind, wird ein Stamm, der das alkalische
Proteasegen trägt, durch "Koloniehybridisierung" mit einer
Referenzsubstanz, insbesondere mit homologen, mit ³²P
markierten DNA's isoliert (M. Grunstein, J. Walls: Methods in
Enzymology, 68, 379, Academic Press, New York, 1979).
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Eine rekombinierte Form, die in der Lage ist, die
alkalische Protease herzustellen, wird erhalten, indem das
erhaltene alkalische Proteasegen erneut in Plasmide von
Bacillus subtilis geklont wird ("recloning") und Bacillus
subtilis umgewandelt wird.
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In den beigefügten Zeichnungen stellt Figur 1 die
vollständige Nukleotidsequenz der von Bacillus licheniformis
HP 19611 stammenden alkalischen Protease dar,
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die Figuren 2, 3, 4 und 5 sind Aminosäuresequenzen in
einer alkalischen Protease des Wildtyps, einer gegenüber
oberflächenaktiven Verbindungen beständigen alkalischen
Protease, einer gegenüber Oxidationsmitteln beständigen
alkalischen Protease und einer sowohl gegenüber
oberflächenaktiven Verbindungen als auch gegenüber Oxidationsmitteln
beständigen alkalischen Protease.
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Figur 6 ist eine Restriktionskarte eines
rekombinierten Plasmids pHLP 352,
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Figur 7 ist eine Kestriktionskarte eines
rekombinierten Phagen M13LP1,
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Figur 8 ist eine Restriktionskarte eines
rekombinierten Plasmids pULP 355, und
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Figur 9 ist die Nukleotidsequenz eines Primers zur
Substitution des Methionins in der 221. Position durch
Glutamin.
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In den Figuren 2 bis 5 und 9 sind die Abkürzungen wie folgt
definiert:
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Gly = Glycin,
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Ala = Alanin,
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Val = Valin,
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Leu = Leucin,
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Ile = Isoleucin,
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Ser = Serin,
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Thr = Threonin,
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Asp = Asparaginsäure,
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Glu = Glutaminsäure,
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Asn = Asparagin,
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Gln = Glutamin,
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Lys = Lysin,
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Arg = Arginin,
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Met = Methionin,
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Phe = Phenylalanin,
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Tyr = Tyrosin,
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Trp = Tryptophan,
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His = Histidin,
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Pro = Prolin.
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In den Figuren 6 bis 8 sind dünne Linien Bereiche von
Vektorplasmiden, dicke Linien sind von Chromosomen-DNA's
stammende Bereiche und Pfeile bezeichnen Bereiche auf
Vektorplasmiden, wo gegen Antibiotika beständige Gene
anwesend sind.
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Die Nukleotidsequenz innerhalb des durch die oben
erwähnten Vorgehensweisen erhaltenen alkalischen Proteasegens
ist in Figur 1 dargestellt, wobei sich ein Code für fertiges
Protein der alkalischen Protease im Bereich der 539. bis
1360. Position befindet. Die Aminosäuresequenz im fertigen
Protein der von der in Figur 1 dargestellten Nukleotidsequenz
abgeleiteten alkalischen Protease ist in Figur 2 gezeigt.
Das obige Gen stammt vom Bacillus licheniformis-Stamm HP
19611 (FERM BP 3020).
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Eine durch Mutation veränderte alkalische Protease
wird erhalten, indem beispielsweise eine Mutation in der
alkalischen Protease ausgelöst wird. Ein DNA-Bruchstück, das
die Codierung für eine alkalische Protease beinhaltet, wird
mit replizierenden DNA-Formen ("replicative DNA's, RF-DNA's")
eines Einzelstrang-Phagen verknüpft, so wie z. B. M13mp18 von
M13mp19, um Escherichia coli umzuwandeln, z.B. E.coli JM 109,
und der umgewandelte Miokroorganismus wird auf eine H-Agar-
Platte*) übertragen, welche X-Gal (= 5-Brom-4-chlor-3-
indolyl-β-D-galactosid) enthält.
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*) Polypepton 1 Gewichtprozent,
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Natriumchlorid 0,8 Gewichtsprozent,
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Agar 1,2 Gewichtsprozent.
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Die Phagen, die einen farblosen Belag erzeugen, werden
gesammelt und es wird E. coli damit infiziert. Die RF-DNA
wird aus dem infizierten E. coli extrahiert und Phagen, die
DNA's mit einer gegebenen Länge aufweisen, werden ausgewählt.
E. coli wird mit den ausgewählten Phagen in gleicher Weise,
wie oben beschrieben, infiziert und eine Einzelstrang-DNA
wird von den in der überstehenden Lösung der Kultur
anwesenden Phagen erhalten. Diese Einzelstrang-Phagen-DNA
wird mit Agentien behandelt, die eine Mutation auslösen, z.B.
mit Natriumnitrit, Natriumsulfit oder Hydroxylamin, und dann
wird ein Universalprimer, der eine zu der M 13-Phagen-DNA
komplementäre Sequenz aufweist, hinzugegeben. Die Mischung
wird für 20 bis 60 Minuten bei 60 bis 70 ºC und dann für 20
bis 60 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen, bis sich
der Primer mit der Phagen-DNA verbunden hat. Die oben
erwähnte Behandlung mit Agentien, die eine Mutation auslösen,
wird vorzugsweise unter solchen Bedingungen durchgeführt, daß
die Substitution von mindestens einer Base im alkalischen
Proteasegen ausgelöst wird. Beispielsweise wird im Fall von
Natriumnitrit die Behandlung bei Raumtemperatur 2 bis 5
Minuten lang für ein Agens mit einer Konzentration von etwa 1
M durchgeführt, und bei Raumtemperatur 20 bis 40 Minuten lang
für ein etwa auf eine Konzentration von 75 mM verdünntes
Agens.
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Vier Varianten von Nukleotiden nämlich dATP, dGTP,
dCTP und dTTP (die Endkonzentration betrug jeweils 0,1 bis
0,3 mM) und ein "Klenow-Bruchstück" von 1 bis 5
Struktureinheiten/ug DNA werden zu dem phagen hinzugefügt,
und die Mischung wird 60 bis 120 Minuten lang bei 30 bis
37 ºC stehengelassen, bis die DNA sich verlängert hat.
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Die DNA wird mit Restriktionsenzymen verdaut, um ein
Bruchstück zu erhalten, welches das ganze alkalische
Proteasegen aufwies, und das Bruchstück wird mit Plasmiden
von Bacillus subtilis verknüpft, solange bis Bacillus
subtilis umgewandelt ist. Alternativ wird ein Bruchstück
abgespalten, welches einen Teil oder den ganzen Bereich des
fertigen Proteins der alkalischen Protease aufweist, und
anschließend mit dem korrespondierenden Bereich in einem
rekombinierten Plasmid verknüpft, in welchen das alkalische
Proteasegen eingeführt worden ist, solange bis Bacillus
subtilis umgewandelt ist. Der umgewandelte Mikroorganismus
wird auf eine mit einer Nährlösung versehene Agarplatte*)
geimpft, welche 1 Gewichtsprozent oder einen ähnlich hohen
Anteil Kasein enthält und über Nacht bei 37 ºC kultiviert, um
die umgewandelten Zellen auszuwählen, die Höfe ("Halos")
erzeugen können.
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*) Pepton 1 Gewichtsprozent,
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Fleischextrakt 0,5 Gewichtsprozent,
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Natriumchlorid 0, 5 Gewichtsprozent,
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Agar 1 2 Gewichtsprozent,
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pH-wert 7,4.
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Die Auswahl eines Stammes, der zum Erzeugen von
gegenüber oberflächenaktiven Verbindungen beständigen
Proteasen fähig ist, wird in solcher Weise durchgeführt, daß
die "Halo-erzeugenden" Stämme kultiviert werden, die
Proteaseaktivitäten der überstehenden Lösung in Anwesenheit
und in Abwesenheit von oberflächenaktiven Verbindungen
gemessen werden und die Stämme, bei denen die Verhältnisse
der Aktivitäten in Anwesenheit oberflächenaktiver
Verbindungen zu jenen in Abwesenheit derselben größer sind, als es
bei natürlich vorkommenden Stämme der Fall ist, werden
ausgewählt. Die Mutationsstellen der durch Mutation veränderten
alkalischen Proteasen weiden auf der Grundlage der
Nukleotidsequenzen
identifiziert, beispielsweise mittels einer dem
Fachmann vertrauten "Dideoxy-Sequenzierungsmethode".
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Die Isolierung eines durch Mutation veränderten Gens,
das die Codierung für alkalische Protease trägt, die an der
221. Position Glutamin aufweist, welches das Methionin
substituiert hat, wird beispielsweise in solch einer Weise
durchgeführt, daß ein aus 20 bis 40 Nukleotideinheiten
zusammengesetztes, synthetisches Oligonukleotid, dessen
Sequenz, von der 221. Position sowohl in Aufwärts-, als auch
in Abwärtsrichtung der Sequenz der Aminosäuren an etwa drei
bis sechs Resten entspricht, mit der Abwandlung, daß ein
Codon für das Methionin in der 221. Position durch eines für
Glutamin ersetzt ist, und eine positionsgerichtete Mutagenese
unter Verwendung des Oligonucleotids als Primer im Rahmen
eines handelsüblich verfügbaren Ausstattungssatzes, wie zum
Beispiel "mutagen" (Handelsname; Bio-Rad Co.) wie unten
erwähnt durchgeführt wird. Das bedeutet, ein das alkalische
Proteasegen enthaltende Bruchstück wird mit einer
replizierenden DNA-Form (RF-DNA) einer Einzelstrang-Phagen-DNA
verknüpft, wie zum Beispiel M13mp18 oder M13mp19, um E. coli
, z. B. E. coli JM 109 umzuwandeln, das E. coli wird auf eine
H-Agarplatte aufgebracht, die X-Gal enthält, ein Phage, der
farblose Beläge erzeugen kann, wird gesammelt, das E. coli
wird mit dem Phagen infiziert, die RF-DNA wird aus dem
infizierten E. coli extrahiert und ein Phage, der eine DNA
von gegebener Länge aufweist, wird ausgewählt. E. coli CJ
236 wird mit dem so ausgewählten Phagen und einer
Einzelstrang-Phagen-DNA, die Uracil von den Phagenteilchen in der
überstehenden Lösung der Kultur enthält, infiziert. Die
Einzelstrang-Phagen-DNA wird mit dem oben erwähnten,
synthetischen Oligonukleotid, dessen 5'-Ende phosphoryliert
ist, vereinigt. Danach werden vier Nukleotidsorten, nämlich
dATP, dGTP, dCTP und dTTP, welche jeweils in
Endkonzentrationen von 0,2 bis 1 mM vorliegen, und T4DNA-Polymerase
entsprechend 1 bis 5 Einheiten/ug DNA hinzugefügt. Die
Mischung wird 60 bis 120 Minuten lang bei 30 bis 37 ºC
stehengelassen, um eine Verlängerung der DNA hervorzurufen.
E. coli MV 1190 wird mit der Reaktionslösung gemäß einer dem
Fachmann vertrauten Calciumchloridmethode umgewandelt, bis
Beläge erhalten werden. Einzelstrang-DNA's werden aus rund
zehn Belägen hergestellt sind es wird eine DNA ausgewählt,
deren mittels der "Dideoxy-Sequenzierungsmethode" ermittelte
Nukleotidsequenz an der durch Mutation veränderten Stelle die
gleiche wie jene des synthetischen Oligonukleotids ist.
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Die Erzeugung der durch Mutation veränderten
alkalischen Protease durch Verwendung des durch die oben
erwähnte, positionsgerichtete Mutagenese erhaltenen,
veränderten alkalischen Proteasegens wird in solch einer Weise
durchgeführt, daß beispielsweise durch mit dem oben erwähnten
Phagen infiziertes E. coli eine RF-DNA hergestellt wird, die
RF-DNA mit Restriktionsenzymen verdaut wird, um ein
Bruchstück abzuspalten, welches die Gesamtheit des alkalischen
Proteasegens aufweist, und anschließend wird das Bruchstück
mit Bacillus subtilis-Plasmiden verknüpft, solange bis
Bacillus subtilis umgewandelt ist. Alternativ wird mit einem
Bruchstück, welches einen Teil oder die Gesamtheit des
Bereichs des fertigen Proteins der alkalischen Protease
aufweist, der entsprechende Bereich in einem rekombinierten
Plasmid substituiert, in welches das alkalische Proteasegen
eingeführt worden ist, um Bacillus subtilis umzuwandeln, und
danach wird der umgewandelte Mikroorganismus in üblicher
Weise kultiviert.
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Die Aminosäuresequenz der vorliegenden, gegenüber
oberflächenaktiven Verbindungen beständigen alkalischen
Protease und jene der alkalischen Protease, welche sowohl
hohe spezifische Aktivität als auch Beständigkeit gegenüber
Oxidationsmitteln aufweist, werden in der Figur 3, bzw. der
Figur 4 gezeigt. Figur 5 ist eine Aminosäuresequenz in einer
alkalischen Protease, die sowohl gegenüber oberflächenaktiven
Verbindungen als auch gegenüber Oxidationsmitteln beständig
ist. Der Unterschied gegenüber der in Figur 2 gezeigten
Aminosäuresequenz einer natürlich vorkommenden alkalischen
Protease besteht lediglich in den in der 105.- und 221.
Position befindlichen Aminosäuren.
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Eine der vorliegenden alkalischen Proteasen,
insbesondere jene gegenüber oberflächenaktiven Verbindungen
Beständige weist eine Aktivität auf, deren Höhe 45 % jener
entspricht, die vorliegt, wenn kein unverzweigtes
Alkylbenzolsulfonat ("linear alkylbenzene sulfonate", im weiteren
Text als "LAS" bezeichnet) anwesend ist, sogar bei
Anwesenheit von 0,12 Gewichtsprozent LAS. Die Beständigkeit ist
daher größer als jene der natürlichen alkalischen Protease,
die 36 % beträgt. Die spezifische Aktivität des durch
Mutation veränderten Enzyms, die mit Kasein als Substrat
gemessen wird, beträgt 7860 Einheiten/mg Protein.
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Eine weitere alkalische Protease, insbesondere das
durch Mutation veränderte Enzym, welches sowohl beständig
gegenüber Oxidationsmitteln ist, als auch hohe spezifische
Aktivität aufweist, verfügt über eine spezifische Aktivität
von 7170 Einheiten/mg Protein, was nahezu auf gleichem Niveau
liegt, wie die 7680 Einheiten/mg Protein der natürlichen
alkalischen Protease. Die Restaktivität nach einer
Behandlung mit 1 M Wasserstoffperoxid, d.h. die Beständigkeit der
vorliegenden, gegenüber Oxidationsmitteln beständigen
alkalischen Protease gegenüber Wasserstoffperoxid beträgt
94 % im Vergleich zu den 14 % der natürlichen alkalischen
Protease.
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Die sowohl gegenüber Oxidationsmitteln, als auch
gegenüber oberflächenaktiven Verbindungen beständige Protease
wird durch Rekombination der entsprechend veränderten
Proteasegene erhalten, um ein Gen herzustellen, welches beide
durch Mutation veränderte Stellen aufweist. Alternativ wird
ein Gen, welches beide durch Mutation veränderte Stellen
aufweist, durch eine positionsgerichtete Mutagenese unter
Verwendung eines jeden veränderten Gens als Templat
hergestellt.
Anschließend wird der umgewandelte Mikroorganismus
in gleicher Weise kultiviert, wie oben erwähnt.
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Die sowohl gegenüber oberflächenaktiven Verbindungen
als auch gegenüber Oxidationsmitteln beständige alkalische
Protease weist eine spezifische Aktivität von
6200 Einheiten / mg Protein auf und verfügt über 94 % der
Beständigkeit gegenüber Wasserstoffperoxid. Beispielsweise
entspricht die Aktivität in Anwesenheit von LAS 28 % der in
Abwesenheit von LAS vorliegenden.
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Die nachfolgenden Beispiele erklären die vorliegende
Erfindung ausführlicher. Es können hinsichtlich der
Restriktionsenzyme, der T4DNA-Ligasen und der Klenow-Bruchstücke
jegliche im Handel erhältlichen Enzyme eingesetzt werden, wie
z. B. die von der Firma Takara Shuzo Co. Ltd., Japan oder der
Firma Toyobo Co. Ltd., Japan hergestellten. Die
Behandlungsschritte der DNA's mit diesen Enzymen können unter den in den
Firmenprospekten dieser Enzyme aufgeführten Bedingungen
vorgenommen werden. Als Vektor-DNA's können irgendwelche im
Handel erhältlichen eingesetzt werden. Darüberhinaus können
irgendwelche durch Extraktion oder Aufarbeitung in einer dem
Fachmann vertrauten Weise erhaltenen Erzeugnisse aus Bacillus
subtilis oder E. coli, welche die betreffende DNA enthalten,
verwendet werden.
Beispiel 1
Herstellung eines Gens einer gegenüber
oberflächenaktiven Verbindungen beständigen, alkalischen
Protease
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In üblicher Weise wurde ein rekombiniertes Plasmid
(pHLP352) aus Bacillus subtilis PW 10 (pHLP352) (FERM BP
3021) hergestellt. Ein rekombiniertes Plasmid pHLP352 (Fig.
6, 5 ug), bei dem ein alkalisches Proteasegen (Fig. 1) von
Bacillus licheniformis HP 19611 (FERM BP 3020) an einen
Vektor pHY300PLK gebunden ist, wurde mit Sma I und Egl II
(jeweils 10 Einheiten) verdaut. Die erhaltenen Bruchstücke
wurden mittels Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert, um ein
2,0 Kb-Bruchstück zu erhalten (etwa 1,4 ug). Andererseits
wurde RF-DNA von M13mp19 (1 ug) mit Sma I und BamH I (jeweils
2 Einheiten) verdaut und 10 Minuten lang auf 65 ºC erwärmt,
anschließend wurden die DNA's mittels Ausfällung mit Ethanol
gewonnen. Beide DNA's wurden vermischt und mittels T4DNA-
Ligase (2 Einheiten) miteinander verbunden. Escherichia coli
JM 109 wurde mit der verbundenen DNA (0,12 ug) umgewandelt
und ein rekombinierter Phage, der farblosen Belag auf einem
X-Gal enthaltenden Nährmedium einer H-Agar-Platte erzeugte,
wurde erhalten. Der rekombinierte Phage, dessen
DNA-Restriktionskarte in Figur 7 gezeigt ist, wurde M13LP1 genannt.
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Die vorkultivierte Lösung (50 ul), die erhalten wurde
durch Kultivierung von Escherichia coli JM 109 bei 37 ºC über
Nacht in einem 2 x TY-Nährmedium (pH-Wert: 7,4), welches 1,6
Gewichtsprozent Bactotrypton, 1 Gewichtsprozent Hefeextrakt,
0,5 Gewichtsprozent Natriumchlorid und den Belag des oben
erwähnten, rekombinierten Phagen M13LP1 enthielt, wurde auf
das 2 x TY-Nährmedium (5 ml) geimpft. Die Kultivierung wurde
5 Stunden lang bei 37 ºC durchgeführt, um eine
Phagenkeimlösung zu erhalten. Zu dem 2 x TY-Nährmedium (200 ml) wurde
die oben erwähnte, vorkultivierte Lösung (2 ml) und die
Phagenkeimlösung (2 ml) hinzugefügt und dann wurde die
Kultivierung 5 Stunden lang bei 37 ºC durchgeführt. Die
Zentrifugation ergab eine überstehende Flüssigkeit (185 ml),
die Phagenteilchen enthielt.
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In die überstehende Flüssigkeit wurden 20
Gewichtsprozent Polyethylenglykol 6000/2,5 M NaCl (37 ml) eingetragen
und die Mischung wurde 15 Minuten lang stehengelassen, um die
Phagen auszufällen. Der erhaltene Niederschlag wurde nach
der Zentrifugation in 1 ml einer TE-Pufferlösung (10 mM
tris-HCl Pufferlösung (pH-Wert: 8,0)/0,1 mM EDTA) suspendiert.
Phenol (1 ml, gesättigt mit TE-Pufferlösung) wurde
hinzugefügt und innig vermischt, solange bis das DNA extrahiert war.
Eine Zentrifugation wurde durchgeführt, um eine wäßrige
Schicht zu gewinnen, zu der Ethanol gegeben wurde, um eine
Einzelstrang-Phagen-DNA zu erhalten (etwa 200 ug).
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Zur Lösung der Einzelstrang-Phagen-DNA (100 ug) in
0,5 M Natriumacetat (PH-Wert: 4,2, 500 ul) wurden 2 M
Natriumnitrit (500 ul) hinzugefügt und die Mischung wurde 5
Minuten lang bei 20 ºC stehengelassen, bis die Mutation der
DNA ausgelöst worden war. Die durch Eintragen von Ethanol
gewonnene DNA wurde in der TE-Pufferlösung aufgelöst (1 ml).
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In die Lösung der durch Mutation umgewandelten DNA
wurde ein Universalprimer (72 p Mol, 15 Basen eines
Oligonukleotids, welches eine zu der M 13 Phagen-DNA komplementäre
Sequenz aufwies), eingetragen und sie wurde 20 Minuten lang
auf 60 ºC erwärmt, ehe sie 20 Minuten lang bei
Raumtemperatur stehengelassen wurde, um eine Verschmelzung zu bewirken.
Dazu wurden vier Oligonukleotidsorten, d.h. dGTP, dATP, dTTP
und dCTP (jeweils 182 p Mol) und ein Klenow-Bruchstück (126
Einheiten) gegeben, und die Verlängerungsreaktion wurde 90
Minuten lang bei 30 ºC durchgeführt. Es wurde 10 Minuten
lang auf 65 ºC erwärmt, um die Reaktion abzubrechen. Nachdem
die Extraktion mit Phenol durchgeführt worden war, wurde
Ethanol eingetragen, um eine DNA zu sammeln.
-
Diese DNA wurde mit Sma I und Xba I (jeweils 500
Einheiten) verdaut und der Fraktionierung mittels Agarose-
Gelelektrophorese unterworfen, um ein 2 Kb-Bruchstück
herzustellen. Andererseits wurde pUB 110 (125 ug) mit Pvu II
und Xba I (jeweils 250 Einheiten) verdaut und in gleicher
Weise wie oben der Fraktionierung unterworfen, solange bis
ein 4 Kb-Bruchstück erhalten worden war. Die beiden
Bruchstücke wurden vermischt und die DNA's unter Verwendung von T4
DNA-Ligase (50 Einheiten) miteinander verknüpft. Zur
Kontrolle wurden ein 2 Kb-Bruchstück des unveränderten, mit Sma
I - Xba I verdauten M13LP1 und ein 4 Kb-Bruchstück des mit
Pvu II - Xba I verdauten pUB 110 in gleicher Weise wie oben
miteinander verknüpft, um ein Plasmid pULP 355 herzustellen,
welches eine Gensorte des Wildtyps enthält (Figur 8).
-
Bacillus subtilis PW 10 (FERM BP 3019), ein wenig
Protease erzeugender Stamm wurde mit den oben erwähnten,
verknüpften DNA's wie folgt umgewandelt:
-
Bacillus subtilis PW 10 wurde in ein Nährmedium
geimpft (5 ml, pH-Wert: 7,4), das 1 Gewichtsprozent Pepton,
0,5 Gewichtsprozent Fleischextrakt und 0,5 Gewichtsprozent
Natriumchlorid enthielt, und über Nacht kultiviert. Die
erhaltene, kultivierte Lösung (0,3 ml) wurde in das gleiche
Nährmedium wie oben (30 ml) geimpft und 1,5 Stunden lang bei
37 ºC weiterkultiviert. Die Zellen wurden durch
Zentrifugation gewonnen und in SMMP (2,5 ml) suspendiert, einer 1:1-
Mischung von 2 x SMM*) und vierfach konzentriertem Penassay-
Medium (hergestellt von Difco Co.).
-
*) Saccharose 1M
-
Maleinsäure 0,04 M
-
MgCl&sub2; 0,04 M
-
PH-Wert 6,5
-
Zu der Suspension wurde Lysozyin hinzugefügt (5 mg) und die
Mischung wurde für 2 Stunden bei 37 ºC stehengelassen,
solange bis die Suspension des Protoplasten erhalten worden
war.
-
Zu der Suspension (1,5 ml) wurden die Lösung der oben
erwähnten, verbundenen DNA (2 ug) und eine 40 %-ige
Polyethylenglycol-4000-Lösung (4,5 ml) in 2 x SMM hinzugefügt
und die Lösung wurde 2 Minuten lang sanft gerührt.
Zusätzlich wurde SMMP (15 ml) eingetragen. Der Protoplast wurde in
SMMP (3 ml) suspendiert und die Suspension wurde 1,5 Stunden
lang bei 30 ºC stehengelassen.
-
Die Suspension des Protoplasten (jeweils 100 ul)
wurde auf ein DM3-Regenerationsmediuin aufgetragen, welches
Kanamycin (200 ug/ml) enthielt und das Medium wurde zwei Tage
lang bei 37 ºC stehengelassen, um Kolonien zu bilden.
-
*) Natriumsuccinat 0,5 M
-
Glucose 0,5 Gewichtsprozent
-
Kasaminsäure 0,5 Gewichtsprozent
-
Hefeextrakt 0,01 Gewichtsprozent
-
Rinderserumalbumin 0,01 Gewichtsprozent
-
Dikaliumhydrogenphosphat 0,35 Gewichtsprozent
-
Kaliumdihydrogenphosphat 0,15 Gewichtsprozent
-
MgCl&sub2; 20 mM
-
Agar 0,8 Gewichtsprozent
-
pH-Wert 7,3
-
Die oben erwähnte Umwandlungsmethode wurde
dreizehnmal wiederholt, solange bis 14099 gegenüber Kanamycin
beständige, umgewandelte Mikroorganismen erhalten worden
waren. Die umgewandelten Mikroorganismen wurden einer
Stempelmethode ("replica-plating method") auf einer
Kaseinplatte unterworfen (eine Nährmedium-Agarplatte, die 1
Gewichtsprozent Kasein enthält), welche weiterhin Kanamycin (20
ug/ml) enthielt, und die Kultivierung wurde 16 Stunden lang
bei 37 ºC ausgeführt, bis man Höfe-("Halos-") bildende Stämme
(4644 Stämme) erhielt. Diese Höfe-erzeugenden Stämme wurden
wiederum der Stempelmethode auf zwei Nährmedium-Agarplatten
unterworfen und nochmals 16 Stunden lang bei 37 ºC
kultiviert, ehe Kolonien abgeschält werden konnten. Das
Agar-Nährmedium, welches 1 Gewichtsprozent Kasein enthielt, wurde
auf eine der oben erwähnten Agarplatten gelegt und das Agar-
Nährmedium, welches sowohl 0,12 Gewichtsprozent LAS als auch
1 Gewichtsprozent Kasein enthielt, wurde auf die andere der
beiden Agarplatten gelegt. Die Kultivierung wurde eine
Stunde lang bei 37 ºC durchgeführt. Die Bildung von Halos in
den beiden Agarplatten wurde mit jener des Stammes (H4), der
das natürlich vorkommende Gen trägt, verglichen, um die 261-
Stämme auszuwählen, welche auf dem LAS-enthaltenden Medium
große Halos bildeten.
-
Die ausgewählten Stämme wurden im Nährmedium 40
Stunden lang kultiviert. Die Aktivitäten der überstehenden
Flüssigkeiten der in Anwesenheit oder Abwesenheit von LAS
erhaltenen Kulturen wurden, nachdem sie bis zu einer
geeigneten Konzentration verdünnt worden waren, in der unten
beschriebenen Weise gemessen.
-
Zu einer Substratlösung (400 ,il, 50 mM Glycin
/Natriumhydroxidpufferlösung (pH-Wert: 10), die 0,75 mM N-
Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilid/1 mM CaCl&sub2;
enthielt) und einer anderen Substratlösung (400 ul), welche
die gleiche Zusammensetzung wie oben aufwies, zu welcher
indes 0,18 Gewichtsprozent LAS hinzugefügt worden waren,
wurden jeweils die oben erwähnten, verdünnten Lösungen
(jeweils 200 ul) hinzugefügt und die Mischungen wurden 20
Minuten lang bei 37 ºC stehengelassen, ehe ein die Reaktion
abbrechendes Reagens (100 pl, 0,35 M Trichloressigsäure
/1,05 M Essigsäure/0,7 M Natriumacetat) dazugegeben wurde.
Nachdem die Reaktionen abgebrochen worden waren, wurde die
Extinktion der Reaktionslösungen bei einer Wellenlänge von
410 nm gemessen. Die LAS-Beständigkeitsgrade, d.h., das
Verhältnis der Extinktion der in Anwesenheit von LAS
erhaltenen Reaktionslösung zu jener der in Abwesenheit von
LAS erhaltenen Reaktionslösung wurde im Hinblick auf alle 261
Stämme berechnet. Der LAS-Beständigkeitsgrad des Stammes
(H4), welcher die natürlich vorkommende Gensorte enthielt,
betrug 36 %, während derjenige eines der veränderten Stämme
(75-L1) 45 % betrug.
-
Die Restriktionskarte des vom Stamm 75-L1
resultierenden Plasmids pDTG75 war die gleiche wie die von
pULP355.
Beispiel 2
Identifizierung der durch Mutation veränderten Stelle
des Gens der gegenüber oberflächenaktiven Verbindungen
beständigen, alkalischen Protease
-
Plasmid, das aus dem nach Beispiel 1 erhaltenen Stamm
75-L1 extrahiert worden war, wurde mit Xba I und Bgl II
verdaut und zum Zweck einer Fraktionierung der Agarose-
Geleelektrophorese unterworfen, um ein 3,3 Kb-Bruchstück
herzustellen. Andererseits wurde pUC19 mit Xba I und BamH I
verdaut. Das Bruchstück wurde mit dem oben erwähnten 3,3 Kb-
Bruchstück verknüpft. Escherichia Coli LE 392 wurde mit der
verknüpften DNA umgewandelt, um einen gegenüber Ampicillin
beständigen Stamm zu erhalten, und daraus wurde ein Plasmid
hergestellt. Die mittels einer Dideoxy-Sequenzierungsmethode
ermittelte Nukleotidsequenz im Plasmid wies eine Substitution
von Basen auf, insbesondere eine Substitution von G durch A,
welche der Substitution von Glycin (Codon GGC) durch
Asparaginsäure (Codon GAC) in der 105. Position der alkalischen
Protease entsprach.
Beispiel 3
Positionsgerichtete Mutagenese eines alkalischen
Proteasegens
-
Die Mutation zwecks Substitution von Methionin durch
Glutamin in der 221. Position des synthetisierten
Oligonucleotids (Figur 9, 33 Basen) wurde mit Hilfe von
Ausstattungssätzen für in-vitro-Mutagenese bewirkt (mutagen
von Bio Rad Co.).
-
Ein rekombiniertes Plasmid pULP 355 (4,5 ug, Figur
8), bei welchem ein alkalisches Proteasegen (Figur 1) von
Bacillus licheniformis in ein Vektor-pUB 110 eingeschoben
ist, wurde mit Kpn I und EcoR I verdaut (jeweils 14
Einheiten). Die erhaltenen Bruchstücke wurden zum Zweck der
Fraktionierung der Agarose-Gelelektrophorese unterworfen, um
ein 0,97 Kb-Bruchstück zu erhalten (etwa 0,7 ug).
Andererseits wurden RF-DNA (reduplizierte DNA-Form, 2 pg)
oder M13mp19 mittels Kpn I und EcoR I (jeweils 5 Einheiten)
verdaut und 10 Minuten lang bei 65 ºC einer Wärmebehandlung
unterworfen, ehe mit Ethanol die Ausfällung vorgenommen
wurde, um die DNA's zu gewinnen. Die beiden DNA's wurden
vermischt und mit T4 DNA-Ligase verknüpft (4 Einheiten).
-
Escherichia coli JM 109 wurde mit der verknüpften DNA
(0,3 ug) umgewandelt und es wurden drei rekombinierte Phagen
erhalten, die farblose Beläge bilden konnten. Die
vorkultivierte Lösung (50 ul), die durch Kultivieren von Escherichia
coli JM 109 in einem 2 x TY-Nährmedium über Nacht bei 37 ºC
erhalten wurde, wurde in das 2 x TY-Nährmedium (5 ml)
geimpft. Auf das Nährmedium wurde auch einer der drei durch
die rekombinierten Phagen gebildeten Beläge geimpft, und das
Nährmedium wurde 5 Stunden lang der Kultivierung bei 37 ºC
unterworfen. Es wurde zweimal zentrifugiert und die
erzeugte, überstehende Flüssigkeit wurde als Phagenkeimlösung
verwendet.
-
Die durch Kultivieren von Escherichia Coli CJ 236 bei
37 ºC über Nacht erhaltene, vorkultivierte Lösung (10 ul)
wurde in das 2 x TY-Nährmedium (20 ml) geimpft und 6 Stunden
lang bei 37 ºC kultiviert. Zu der Kultur wurde die oben
erwähnte Phagenkeimlösung (100 ul) hinzugefügt und der Phage
wurde 12 Stunden lang bei 37 ºC kultiviert. Die Kultur wurde
zentrifugiert, um eine überstehende Flüssigkeit (18 ml) zu
erzeugen, die Phagenteilchen enthielt. In die überstehende
Flüssigkeit wurden 20 Gewichtsprozent Polyethylenglykol
6000/2,5 M NaCl (3,6 ml) eingetragen und die Mischung wurde
30 Minuten lang in Eis stehengelassen, bis der Phage
ausgefallen war. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren
abgetrennt und in TE-Puffer suspendiert (200 ul, 10 mM tris-
Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösong, pH-Wert: 8,0/l mM EDTA).
-
Die Suspension wurde 30 Minuten lang in Eis stehengelassen
und zentrifugiert, um die überstehende Flüssigkeit
abzutrennen, zu welcher Phenol (200 ul, mit TE-Pufferlösung
gesättigt) hinzugefügt wurde. Nach innigem Vermischen wurde
eine DNA-Spezies extrahiert. Zentrifugation führte zu einer
wäßrigen Schicht, zu welcher Ethanol hinzugefügt wurde, um
eine Einzelstrang-DNA (etwa 15 ug) auszufällen, die Uracil
enthielt.
-
Zu der Einzelstrang-Phagen-DNA (0,1 pmol, 271 ng)
wurde ein synthetisches Oligonukleotid, dessen 5'-Ende
phosphoryliert war (Figur 9, 3 pmol) und 10 x
Verschmelzungspuffer (1 ul, 200 mM tris-Chlorwasserstoffsäure-
Pufferlösung, pH-Wert = 7,4 / 20 mM MgCl&sub2;/500 mM NaCl;
Beigabe zu "Mutagen") zum Zweck der Auslösung der Mutation
hinzugefügt und das alles wurde mit keimfreiem, destilliertem
Wasser auf 10 ul aufgefüllt. Nach 5-minütigem Erhitzen auf
70 ºC wurde die Mischung 40 Minuten lang bei Raumtemperatur
stehengelassen, so lange bis die Verschmelzung stattgefunden
hatte. Während des Abkühlens mit Eis wurden 10 x
Synthesepuffer (1 ul, dATP/dCTP/dGTP/dTTP, jeweils 5 mM; pH-Wert: 7,4
/ 50 mM MgCl&sub2;/20 mM DTT: Beigabe zu "Mutagen"), T4DNA-Ligase
(2,5 Einheiten), T4DNA-Polymerase (1 Einheit) und T4-Gen 32-
Erzeugnis (0,5 ug) hinzugegeben. Die Mischung wurde 5
Minuten lang in Eis stehengelassen, 5 Minuten lang auf 25 ºC
und 90 Minuten lang auf 37 ºC gehalten, um die
Verlängerungsreaktion durchzuführen. TE-Pufferlösung (90 ul) wurde
eingetragen und die Mischung wurde bei -20 ºC eingefroren, um die
Reaktion abzubrechen.
-
Escherichia Coli MV 1190 wurde unter Verwendung der
oben erwähnten Reaktionsmischung (0,5 ul) nach der üblichen
Calciumchloridmethode umgewandelt, solange bis sich auf den
H-Agarplatten Beläge bildeten. Aus etwa 10 Belägen wurden
Einzelstrang-DNA's hergestellt. Mittels einer Dideoxy-
Sequenzierungsmethode wurde die Nukleotidsequenz an den
Stellen ermittelt, an denen die Mutation stattgefunden hatte
und es wurde eine DNA ausgewählt, wo die erwünschte Mutation
auftrat. Somit wurde das veränderte Gen der alkali-schen
Protease erhalten, welches die Codierung für den
Glutaminsubstituenten enthielt.
Beispiel 4
-
Exprimierung der gegenüber Oxidationsmitteln
beständigen alkalischen Protease und Messung der Beständigkeit
gegen Wasserstoffperoxid
-
Die vorkultivierte Lösung (30 ul), die erhalten
wurde, nachdem Escherichia Coli MV 1190 über Nacht in einem 2
x TY-Nährmedium kultiviert worden war, wurde in ein 2 x TY-
Nährmedium (3 ml) geimpft und anschließend wurde der im
Beispiel 3 erwähnte, ausgewählte Belag in das Nährmedium
geimpft. Nachdem 5-stündlges Kultivieren bei 37 ºC
durchgeführt worden war, führte die Zentrifugation zu einem
Niederschlag, der einer üblichen, alkalischen SDS-Methode
unterworfen wurde, um RF-DNA (20 ug) zu erhalten. Die RF-DNA
(5 ug) wurde mittels Tth -111 I und Kpn I (jeweils 50
Einheiten) verdaut und einer Agarose-Gelelektrophorese unterworfen,
um ein 0,74 Kb-Bruchstück (0,4 pg) zu erhalten, welches durch
Mutation veränderte Stellen enthielt. Andererseits wurde
pULP 355 (10 pg) mittels Tth 111 I und Kpn I (jeweils 50
Einheiten) verdaut, und es wurde in gleicher Weise wie oben
ein 5,3 Kb-Bruchstück erhalten.
-
Das 5,3 Kb-Bruchstück (0,25 Pg) und das 0,74 Kb-
Bruchstück (0,07 pg), welche beide die durch Mutation
veränderten Stellen enthielten, wurden vermischt und mittels T4-
DNA-Ligase (1 Einheit) miteinander verknüpft. Bacilllus
subtilis PWIO wurde mittels der verknüpften DNA in der
gleichen Weise wie im Beispiel 1 umgewandelt.
-
Die umgewandelten Mikroorganismen wurden auf Kasein-
Platten repliziert, die Kanamycin (20 ug/ml) enthielten und
10 bis 18 Stunden lang bei 37 ºC kultiviert, um
Haloerzeugende Stämme zu erhalten. Einer der Stämme wurde 40
Stunden lang in einer Nährlösung kultiviert. Der Einfluß von
Wasserstoffperoxid auf die Proteasen in der auf den Kulturen
erzeugten, überstehenden Flüssigkeit wurde geprüft. Das
bedeutet, daß die überstehende Flüssigkeit, nachdem sie auf
eine geeignete Konzentration verdünnt worden war, 5 Minuten
lang bei 37 ºC in den nachstehenden Pufferlösungen A, bzw. B
stehengelassen wurde:
-
A: 0,1 M Borsäure-Natriumhydroxid-Pufferlösung, pH-
Wert: 9,4
-
B: 0,1 M Borsäure-Natriumhydroxid-Pufferlösung/1 M
Wasserstoffperoxid, PH-Wert: 9,4
-
Zu den Lösungen wurde bei der Endkonzentration eine
Substratlösung gegeben, d.h., 0,1 M
tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung, pH-Wert = 8,0/5 mM CaCl&sub2;, welche 0,5 mM
N-Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-Nitroanilid enthielt,
und die entsprechenden Mischungen wurden 20 Minuten lang bei
37 ºC stehengelassen. Ein die Reaktion abbrechendes Reagens
(0,35 M Trichloressigsäure/1,05 M Essigsäure/0,7 M
Natriumacetat) wurde eingetragen, um die Reaktionen abzubrechen.
Bei 410 nm wurde das Verhältnis der Extinktion der Lösung B
zu demjenigen der Lösung A berechnet und das Verhältnis wurde
als Beständigkeitsgrad gegenüber Wasserstoffperoxid
bezeichnet. Der Beständigkeitsgrad des natürlich vorkommenden
Enzyms vom Wildtyp betrug 14 %, während der des
oxidationsmittelbeständigen Enzyms OXY32Q 94 % betrug.
Beispiel 5
Messung der spezifischen Aktivität von durch Mutation
veränderter alkalischer Protease.
-
In Nährlösungen (jeweils 20 ml) wurde bacillus
subtilis PWIO (75-L1-Stamm) eingeimpft, welcher das Gen der
gegenüber oberflächenaktiven Verbindungen beständigen,
alkalischen Protease aufwies, welches nach Beispiel 1 erhalten
worden war, und außerdem wurde Bacillus subtilis PW 10
eingeimpft, welcher das Gen der gegenüber Oxidationsmitteln
beständigen, alkalischen Protease, aufwies, welches
entsprechend nach Beispiel 4 erhalten worden war. Die
Kultivierungen wurden 40 Stunden lang bei 37 ºC durchgeführt
und anschließend ergab eine Zentrifugation überstehende
Flüssigkeiten. Zu jeder überstehenden Flüssigkeit wurde
Ammoniumsulfat (8,3 g) hinzugefügt, die Mischung wurde vor
der Zentrifugation zum Abtrennen des Niederschlags eine
Stunde lang bei 4 ºC stehengelassen. Der Niederschlag wurde
jeweils in 1 ml einer Pufferlösung aufgelöst (10 mM
Phosphatpufferlösung, pH-Wert = 5,5 / 1 mM CaCl&sub2;) und dann einer
Dialyse gegen die gleiche Pufferlösung unterworfen. Die
innere Lösung wurde jeweils abgetrennt und in eine Säule
eingeleitet, die ein Kationenaustauscherharz enthielt
("Sepabeads" FP-CM13, 0,6 ml). Die Kolonne wurde jeweils mit
der gleichen Pofferlösung wie oben nachgewaschen (jeweils
3 ml) und die alkalische Protease wurde mit der gleichen,
80 mM NaCl enthaltenden Pufferlösung wie oben eluiert
(jeweils 2 ml).
-
Die Proteaseaktivität und die Menge an Protein im
Eluat wurden jeweils bestimmt wie nachfolgend beschrieben.
Die spezifischen Aktivitäten der gegenüber oberflächenaktiven
Verbindungen beständigen, alkalischen Protease (DTG 75) und
der gegenüber Oxidationsmitteln beständigen, alkalischen
Protease (OXY32Q) wurden berechnet.
-
Proteaseaktivität: Auf der Grundlage der Methode von
H. Uehara et al., J. Bacteriol., 119, 82, 1974.
-
Die Aktivität bei 37 ºC und einem pH-Wert von 10
wurde gemessen und eine Enzymmenge, um Tyrosin herzustellen
(1 ug/Minute) wurde als eine Einheit definiert.
-
Die Menge an Protein: Auf der Grundlage der Lowry-
Methode, bezüglich subtilis nach Carlsberg.
-
Als spezifische Aktivitäten wurden 7860 Einheiten/mg
Protein für DTG 75 und entsprechend 7170 Einheiten/mg Protein
für OXY32Q gefunden, allerdings 7680 Einheiten/mg Protein für
das natürlich vorkommende Enzym vom Wildtyp.
Beispiel 6
Herstellung einer sowohl gegenüber oberflächenaktiven
Verbindungen als auch gegenüber Oxidationsmitteln beständigen
Protease
-
Ein Plasmid pDTG75 (5 ug), welches das Gen des
gegenüber oberflächenaktiven Verbindungen beständigen Enzyms
aufwies, wurde mittels Kpn I (50 Einheiten) und Tth 111 I (60
Einheiten) verdaut und der Agarose-Gelelektrophorese
unterworfen, um ein 5,3 Kb-Bruchstück zu erhalten (etwa 3,5 ug),
welches eine in ihrer Beständigkeit gegenüber
oberflächenaktiven Verbindungen durch Mutation verbesserte Stelle
enthielt. Andererseits wurde RF-DNA (2,5 ug) eines
rekombinierten Phagen mit Kpn I und Tth 111 I (jeweils 40 bis 50
Einheiten) verdaut, welche ein Gen einer alkalischen Protease
aufwies, das die für die in Beispiel 3 erwähnte, glutaminsub
stituierte Stelle codiert und es wurde ein 0,74 Kb-Bruchstück
(etwa 0,2 u9) erhalten, welches eine gegenüber
Oxidationsmitteln in ihrer Beständigkeit verbesserte Stelle aufwies.
-
Das 0,74 Kb-Bruchstück (0,07 ug) und das vom oben erwähnten
pDTG75 abgeleitete 5,3 Kb-Bruchstück (0,25 ug) wurden
vermischt und mit T4-DNA-Ligase verknüpft (1 Einheit). Bacillus
subtilis PW10 wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1
mittels der verknüpften DNA umgewandelt. Der umgewandelte
Mikroorganismus wurde auf Kaseinplatten repliziert, welche
Kanamycin enthielten (20 ug/ml) und 10 bis 18 Stunden lang
bei 37 ºC kultiviert, um Halo-erzeugende Stämme zu erzeugen.
Fünf der Halo-erzeugenden Stämme wurden 40 Stunden lang in
Nährlösung kultiviert. Die in der überstehenden Flüssigkeit
gebildeten Proteasen wurden in gleicher Weise wie in den
Beispielen 1 und 4 einer Untersuchung hinsichtlich der
Beständigkeit gegenüber oberflächenaktiven Verbindungen und
Wasserstoffperoxid unterworfen. Die Beständigkeit der
alkalischen Protease (OD32Q), welche sowohl durch Mutation
verursachte Veränderungen hinsichtlich der Beständigkeit
gegenüber Oxidationsmitteln als auch hinsichtlich der
Beständigkeit gegenüber oberflächenaktiven Verbindungen
aufwies, gegenüber Wasserstoffperoxid betrug 94 %, was auf
dem gleichen Niveau wie OXY32Q in Beispiel 4 ist. Die
Beständigkeit von OD32Q gegen LAS betrug 28 % im Vergleich zu
22 % bei OXY32Q. Die in gleicher Weise wie in Beispiel 5
gemessene spezifische Aktivität von OD32Q betrug
6200 Einheiten/mg Protein.
-
Die vorliegende alkalische Protease ist geeignet als
Hilfsmittel in Detergentien, da sie der konventionellen
alkalischen Protease im Hinblick auf die Beständigkeit
gegenüber oberflächenaktiven Verbindungen und die Langlebig
keit der hohen spezifischen Aktivität überlegen ist, so daß
die Protease in Detergentien mit hoher Aktivität zur Wirkung
kommt. Die vorliegende alkalische Protease ist auch als
Hilfsmittel in Reinigungsmitteln verwendbar, die
Bleichmittel/Desinfektionsmittel auf Peroxidbasis enthalten, oder
als zusammen mit Desinfektionsmitteln, welche
Wasserstoffperoxid enthalten, verwendbares Proteinentfernungsmittel für
Kontaktlinsen, da die. Protease gegen Oxidationsmittel so
beständig ist, daß eine hohe Aktivität selbst in Anwesenheit
von Oxidationsmitteln aufrechterhalten wird. Weiterhin
werden selbst mit einer geringeren Menge der vorliegenden
Protease die gleichen Ergebnisse wie mit konventioneller
alkalischer Protease erreicht, da die spezifische Aktivität
der erstgenannten das gleiche Niveau wie bei natürlichen
Enzymen aufweist. Zusätzlich werden die gleichen
Auswirkungen wie mit bekannten Enzymen mit der gleichen Menge der
vorliegenden Protease wie an bekannten Enzymen erhalten, wenn
keine Oxidationsmittel eingesetzt werden. Die vorliegenden,
sowohl gegenüber oberflächenaktiven Verbindungen als auch
gegenüber Oxidationsmitteln beständigen Proteasen sind in
Detergentien verwendbar, die sowohl Oxidationsmittel als auch
oberflächenaktive Verbindungen enthalten.