DE69002905T2

DE69002905T2 - Verfahren zur Herstellung von lipidischen Mikropartikeln.

Info

Publication number: DE69002905T2
Application number: DE90402509T
Authority: DE
Inventors: Patrick Cerfontaine; Brigitte Leclef; Jean-Marie Nicolas; Andre Trouet; Henri Wantier
Original assignee: Liposome Co Inc
Current assignee: Elan Pharmaceuticals LLC
Priority date: 1989-09-14
Filing date: 1990-09-12
Publication date: 1993-12-23
Anticipated expiration: 2010-09-13
Also published as: MX9203803A; ES2060107T5; JPH03169808A; GR3020068T3; US5100591A; DK0418153T4; DE69002905D1; CA2025298C; EP0418153B2; ATE93385T1; JP2831455B2; EP0418153A1; FR2651680A1; CA2025298A1; ES2060107T3; EP0418153B1; FR2651680B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von Lipid-Mikroteilchen mit mikrokristallinem Aussehen.
Unter dem Ausdruck "kristallines Aussehen" ist hier nicht nur die kristalline Struktur im engen Sinne zu verstehen, wie sie notwendigerweise erhalten wird.
Dieser Typ von Mikroteilchen wurde von der Anmelderin insbesondere in der europäischen Patentanmeldung Nr.270460 bereits beschrieben.
Dabei handelt es sich genauer um Mikroteilchen einer in Wasser unlöslichen Substanz, die eine Affinität für die Phospholipide hat, und mindestens eines Phospholipids.
Unter dem Ausdruck "in Wasser unlösliche Substanz" ist eine Substanz zu verstehen, die in Wasser wenig oder nicht löslich ist, und unter dem Ausdruck "Substanz, die eine Affinität für die Phospholipide hat" ist eine chemische Verbindung zu verstehen, die insbesondere in der Lage ist, auf physikalisch-chemischem Wege mit den Phospholipiden in Wechselwirkung zu treten.
Diese Mikroteilchen bieten im wesentlichen den Vorteil, daß sie die Herstellung einer in wäßriger Lösung stabilen Mikrosuspension einer Substanz erlauben, die im übrigen in wäßriger Phase unlöslich ist, die ihre Verabreichung erlaubt, insbesondere wenn es sich dabei um ein Arzneimittel handelt, das in injizierbarer oder pulverisierbarer Form vorliegt.
Mikroteilchen-Präparate ergeben außerdem wahrscheinlich wegen eines erhöhten Feinregulierungseffekts insbesondere gegenüber den Makrophagen einerseits und wegen eines Effekts der progressiven Freisetzung der aktiven Substanz andererseits deutlich vorteilhaftere Ergebnisse in bezug auf die therapeutische Wirksamkeit und die Toxizität als die Lipid-Vesikula vom Liposom-Typ.
In EP 270460 ist bereits ein Verfahren zur verhältnismäßig komplexen Herstellung dieser Mikroteilchen beschrieben, das von den für die Herstellung von Liposomen angewendeten Verfahren inspiriert ist.
Das in EP 270460 beschriebene Verfahren umfaßt im wesentlichen die folgenden Stufen:
a) man verdampft die Lösungsmittel einer Lösung des Phospholipids in Chloroform und der genannten Substanz in Methanol und
b) man bringt den nach dem Verdampfen der genannten Lösungsmittel erhaltenen Film nach starkem Rühren in einer wäßrigen Lösung wieder in Suspension.
Um den in der Stufe (b) erhaltenen Film wieder in Suspension zu bringen, wurde eine Ultraschallbehandlung durchgeführt.
Im Rahmen einer industriellen Anwendung des Verfahrens stellt die Kompliziertheit desselben insbesondere in Verbindung mit der Durchführung einer Stufe des starken Rührens und insbesondere der Ultraschallbehandlung einen Hauptnachteil dar.
Die Anmeerin hat nun gefunden, daß diese Mikroteilchen nach einem viel einfacheren Verfahren unter Erzielung einer viel besseren Ausbeute hergestellt werden können.
Insbesondere wird bei dem den Gegenstand der vorliegenden Erfindung bildenden Verfahren die Stufe der Ultraschallbehandlung weggelassen und man verwendet kein Chloroform mehr, um das Phospholipid zu solubilisieren.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist nämlich ein Verfahren zur Herstellung von Lipid-Mikroteilchen mit mikrokristallinem Aussehen einer Substanz, die in Wasser unlöslich ist und eine Affinität für die Phospholipide aufweist, und mindestens eines Phospholipids, wobei die Mikroteichen in einer wäßrigen Lösung stabil suspendiert sind, dadurch gekennzeichnet, daß man
a) die genannte Substanz und das oder die genannte(n) Phospholipid(e) in einem für die genannte Substanz und das oder die genannte(n) Phospholipid(e) gemeinsamen organischen Lösungsmittel auflöst,
b) die erhaltene Lösung der genannten Substanz und des oder der genannten Phospholipide mit einer wäßrigen Lösung in einer solchen Menge mischt, daß man eine Insolubilisierung in Form eines Niederschlags beobachtet, und
c) das organische Lösungsmittel eliminiert zur Gewinnung einer wäßrigen Lösung, welche die Mikroteihen in Form von Mikrosuspensionen ent hält.
Die Eliminierung des organischen Lösungsmittels kann durch Eindampfen, Zentrifugieren oder Ultrafiltrieren erfolgen.
Die Einfachheit des erfindungsgemäßen Verfahrens resultiert daraus, daß wahrscheinlich Substanz-Phospholipid-Komplexe gebildet werden als Folge der gleichzeitigen Anwesenheit der verschiedenen Bestandteile, die aus einer physikalisch-chemischen Wechselwirkung resultieren. Die Zugabe der wäßrigen Lösung führt zur Ausfällung der genannten Komplexe in Form von Mikrokapseln.
Erfindungsgemäß erhält man Mikroteilchen mit gleichem Aussehen, gleicher Struktur und gleicher Teilchengröße und Präparate von homogeneren Mikroteilchen, die sogar vorteilhafte pharmakologische Eigenschaften gegenüber den Chargen aufweisen, die nach dem in EP 270460 beschriebenen Verfahren erhalten werden.
Im Vergleich zur Herstellung von Liposomen und zur Herstellung von Mikroteilchen nach dem bekannten Verfahren ist das erfindungsgemäße Verfahren viel einfacher und wirtschaftlicher. Man erhält insbesondere viel weniger freie Substanzen in der Endlösung und somit eine bessere Ausbeute und die erhaltenen Mikroteilchen-Präparate weisen eine größere Reinheit auf als diejenigen, die nach dem bekannten Verfahren erhalten werden. Sie sind im wesentlichen frei von freiem Amphotericin B oder freiem Phospholipid. Außerdem sind die erhaltenen Mikroteilchen auch stabiler als diejenigen, die nach dem bekannten Verfahren erhalten werden, und sie sind viel stabiler als die Liposomen, die unter einer Instabilität leiden, die ihre Verwendungsmöglichkeiten beträchtlich einschränkt. Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist in der Tat auch bemerkenswert im Hinblick auf die Reproduzierbarkeit und die Homogenität der Chargen von Multiteilchen-Produkten. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit auch die Mikroteilchen-Präparate, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie im wesentlichen frei von freier aktiver Substanz und freiem Phospholipid sind und daß die Mikroteilchen eine homogene Teilchengröße haben.
Als organische Lösungsmittel, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendbar sind, können insbesondere genannt werden die Lösungsmittel mit einer mittleren Polarität, wie Methanol, Dimethylformamid (DMF), Dimethylacetamid (DMA) oder Propylenglycol oder Ethanol.
Als wäßrige Lösung, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendbar ist, können mit Vorteil verwendet werden reines Wasser oder ein Phosphatpuffer oder Salzlösungen, z.B. eine NaCl-Lösung, beispielsweise mit einer Konzentration von 0,5 bis 1 %, z.B. von 0,9 % (Gewicht/Volumen), oder eine 1 bis 10 %ige (Gewicht/Volumen) Saccharose-Lösung, wobei beispielsweise eine Lactose- oder Glucoselösung besonders gut geeignet ist wegen einer am Ende erfolgenden Lyophilisierung.
Zu nennen ist insbesondere eine 50 mM Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,8, die 6 % Lactose enthält, welche die Herstellung von Präparaten mit sehr homogener Teilchengröße erlaubt.
Erfindungsgemäß kann das Molverhältnis Phospholipid(e)/Substanz, die an dem erfindungsgemäßen Verfahren beteiligt sind, zwischen 0,1 und 10 liegen.
Wie man sieht, resultieren die erfindungsgemäßen Mikroteilchen wahrscheinlich aus einer Substanz-Phospholipid-Komplexbildung in einem Molverhältnis in der Nähe von 1/1. Deshalb beobachtet man dann, wenn das Molverhältnis ≤ 2 ist d h. beispielsweise zwischen 0,5 und 2, vorzugsweise zwischen 0,5 und 1, liegt, eine spezifische Wechselwirkung mit einer optimalen homogenen Bildung von Mikroteilchen, deren mittlere Teilchengröße unterhalb 1 µm liegt.
Bei den nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Mikroteilchen-Präparaten ist die Größe der Mikroteilchen einheitlich und sie liegt im allgemeinen zwischen 0,5 und 2 µm, wobei bestimmte Teilchen diesen Bereich überschreiten können, jedoch zwischen 0,1 und 10 µm bleiben.
Als Phospholipide, die in dem Verfahren verwendbar sind, können ver wendet werden das Phosphatidylcholin, das Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC), das Distearylphosphatidylcholin (DSPC), das Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC), das Phosphatidylethanolamin, das Phosphatidylserin, das Dipalmitoylphosphatidylserin (DPPS), das Phosphatidylinosit, das Phosphatidylglycerin, das Dimyristoylphosphatidylglycerin (DMPG), das Distearylphosphatidylglycerin (DSPG), das 3'-O-Lysylphosphatidylglycerin, das Diphosphatidylglycerin oder auch Cholesterinester, die allein oder im Gemisch verwendet werden können, wobei diese Liste keinesfalls beschränkend ist.
Erfindungsgemäß verwendet man vorzugsweise als Phospholipid das Phosphatidylcholin oder Dimyristoylphosphatidylcholin im Gemisch mit Dimyristoylphosphatidylglycerin. Das Phosphatidylcholin kann aus Eigelb-Lecithin, hydriertem oder nicht-hydriertem Soja-Lecithin oder jeder anderen industriellen Lecithinquelle hergestellt werden.
Bestimmte Substanzen weisen eine größere Solubilität in organischer Lösung in einem gegebenen Lösungsmittel auf, wenn man sich in einem sauren oder basischen Medium befindet und sie in Form eines Salzes vorliegen und wenn sie ionisiert sind.
In diesem Falle stellt man zweckmäßig die erfindungsgemäßen Mikroteilchen auf die folgende Weise her:
a) man löst die genannte Substanz und das oder die genannte(n) Phospholipid(e) in ihrem gemeinsamen organischen Lösungsmittel in basischem oder saurem Medium,
b) man mischt die erhaltene Lösung mit einer wäßrigen Lösung unter Bildung eines Niederschlags und man neutralisiert die Lösung durch Zugabe einer Säure bzw. einer Base, wobei die Neutralisation vor oder nach der Zugabe der wäßrigen Lösung erfolgen kann, und
c) man eliminiert das Lösungsmittel zur Gewinnung einer wäßrigen Phase, welche die Mikroteilchen in Form von Mikrosuspensionen enthält.
Man kann die Mikroteilchen auch mit Wasser waschen durch wiederholte Zyklen des Zentrifugierens und der Eliminierung der überstehenden Flüssigkeit, um das Maximum an organischem Lösungsmittel zu eliminieren.
In die Stufe (a) führt man gegebenenfalls auf geeignete Weise ein 1 bis 1,5 Basen- oder Säureäquivalente, bezogen auf die genannte Substanz und neutralisiert mit der gleichen Menge Säure bzw. Base.
In der Stufe (a) beobachtet man einen Beginn der Ausfällung.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders vorteilhaft für die Herstellung von Mikroteilchen von antimykotischen Polyen-Makrolid-Arzneimitteln, wie Nystatin und Amphotericin B und ihren Derivaten, die auch eine Antifungi- Aktivität aufweisen.
Wenn in dem erfindungsgemäßen Verfahren die genannte Substanz Amphotericin B ist, werden die besten Ergebnisse erhalten bei Verwendung einer Mischung aus Phosphatidylcholin (Ei-Lecithin oder hydriertem Soja-Lecithin) oder DMPC und DMPG in Molverhältnissen, die von 5:5 bis 9:1 variieren.
Für den Fall, daß die aktive Substanz ein Makrolid vom Polyen-Typ ist, wie Amphotericin B oder Nystatin, ist dann, wenn sie in Methanol oder Propylenglycol gelöst wird, die anfängliche Lösung der Substanz und des Phospholipids zweckmäßig eine basische Lösung, beispielsweise eine Lösung, die 1 bis 1,5 Basenäquivalente, wie NaOH oder KOH, bezogen auf die aktive Substanz, enthält. Man neutralisiert die Lösung schließlich durch Zugabe von 1 bis 1,5 Säureäquivalenten wie HCl. Das Äquivalent repräsentiert in diesem Falle ebenso viel Mole Base oder Säure wie Mole Amphotericin.
Für den Fall, daß die aktive Substanz ein Makrolid vom Polyen-Typ ist, wie Amphotericin B oder Nystatin, und wenn sie in einer Ethanol- oder DMF- Lösung gelöst ist, ist die anfängliche Lösung der Substanz und des Phospholipids zweckmäßig eine saure Lösung, beispielsweise eine Lösung, die 1 bis 1,5 Äquivalente Säure, wie HCl, bezogen auf die aktive Substanz, enthält. Schließlich neutralisiert man die Lösung in dem Verfahren durch Zugabe von 1 bis 1,5 Basenäquivalenten wie NaOH oder KOH.
Wenn das Lösungsmittel das DMA ist, kann man auch eine saure Lösung verwenden, obgleich dies nicht obligatorisch ist, wobei die Löslichkeit der Polyen-Makrolide wie Amphotericin B in DMA ausreicht, um die Verwendung einer Säure zu vermeiden. Es gilt jedoch, daß die Löslichkeit von Amphotericin B in saurer Lösung in DMA verbessert ist.
In bestimmten Fällen, insbesondere wenn die Eliminierung des Lösungsmittels nicht durch Erwärmung erfolgt, die zweckmäßig durchgeführt wird zur Bildung von stabileren Mikroteilchen, erwärmt man die Mischung vor der Eliminierung des Lösungsmittels in der Stufe (c) beispielsweise 30 min lang auf mindestens 40ºC, vorzugsweise 60ºC.
Um die Gefahr des Abbaus der aktiven Substanz in saurem oder basischem Medium zu vermeiden, kann man sie auch solubilisieren, indem man sie in einem Eisbad in der Stufe (a) abkühlt.
Die Behandlung von Pilzinfektionen, die durch Candida und Aspergillus hervorgerufen werden, ist schwierig und in der Regel schlecht verträglich. Es sind nur wenige Arzneimittel gegenüber diesen beiden Typen von Mikroorganismen aktiv (wirksam).
Die antimykotischen Polyen-Makrolide wie Nystatin und Amphotericin B sind die am häufigsten verwendeten Produkte und sie sind gekennzeichnet durch eine Aktivität (Wirksamkeit) sowohl gegenüber der Species Aspergillus als auch gegenüber der Species Candida.
Die klinische Verwendung von Amphotericin B ist durch zwei Hauptnachteile stark eingeschränkt:
- in erster Linie durch seine große Unlöslichkeit, die seine Verabreichung in Lösung in Natriumdesoxycholat erforderlich macht, und
- in zweiter Linie durch die Toxizität des Desoxycholats, die sich addiert zur bereits erwähnten toxischen Aktivität des Amphotericins B und die vor allem sich im Bereich der Nieren und des Knochenmarks auswirkt.
Unabhängig von seinen Sekundäreffekten bleibt dieses Antibiotikum jedoch wirksam bei Pilzinfektionen, die ohne diese Behandlung eine tödliche Prognose haben. In diesem Zusammenhang scheint es wichtig, die Toxizität des Amphotericins zu verringern durch Modifizierung seiner intrazellulären Penetration.
Ein sehr wichtiger Faktor für die antimykotische Wirksamkeit allgemein und für das Amphotericin B speziell ist nämlich die Notwendigkeit, eine antibiotische Wirkung hervorzurufen, die mit derjenigen der Wirtszellen synergistisch ist, die für die Antiinfektions-Abwehr des Organismus verantwortlich sind. Es wurde nämlich gezeigt, daß die Polymorphonucleine und die Makrophagen mit Erfolg Pilzinfektionen in dem Maße beherrschen können, in dem diese Zellen die Mikroorganismen phagozytieren und in ihrem lysosomialen System kontrollieren können. Antimykotische Arzneimittel dürfen daher nicht nur die Multiplikation von infektiösen Agentien, die in dem extrazellulären Medium vorhanden sind, vermindern, sondern müssen auch eine Wirkung auf das Innere der Phagosomen und Lysosomen von Polymorphonucleinen und Macrophagen haben. Es sind jedoch nur sehr wenige Dinge bekannt bezüglich der intrazellulären Penetration der Polyen-Makrolide und diese lassen darüber hinaus vermuten, daß diese Substanzen sich im Bereich der perizellulären Membranen anreichern und nur dank des Membran-Flusses von der Oberfläche in Richtung auf die intrazellulären Räume nach außen gelangen, wo sie die intrazellulären Lysosomial-Abschnitte erreichen.
Die Erfindung führt zu einer Lösung dieser Probleme, indem sie eine neue galenische Form von Amphotericin B vorschlägt, die basiert auf der Wechselwirkung dieses Arzneimittels mit Phosphatidylcholin unter Bildung der obengenannten Mikroteilchen-Suspension.
Diese galenische Form erlaubt in erster Linie die Verabreichung von Amphotericin B, ohne auf das Desoxycholat zurückgreifen zu müssen, und sie erlaubt die sehr signifikante Verringerung der akuten Toxizität der Produkte nach der intravenösen Injektion. Diese Mikroteilchen haben die gleiche Aktivität wie das mit dem Desoxycholat solubilisierte Amphotericin gegenüber extrazellulärem Candida und sie sind in vitro aktiver bei den intrazellulären Infektionen mit Makrophagen.
Die Eigenschaften der Amphotericin B-Mikroteilchen sind auch vorteilhaft im Vergleich zu denjenigen der Liposome, die das gleiche Polyen- Makrolid enthalten, und die ebenfalls als Träger vorgeschlagen worden sind, welche die Sekundäreffekte von Amphotericin verringern können.
Weitere Eigenschaften und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen.
Die Fig. 1 und 2 stellen die Stabilitätskurven von Amphotericin B in saurem bzw. basischem Medium bei verschiedenen Konzentrationen und bei Umgebungstemperatur dar.
Die Fig. 3 bis 16 stellen die Dichteprofile von Zentrifugaten als Saccharose-Gradient für verschiedene Fraktionen des Amphotericin B-Präparats dar, die bei den jeweiligen Verfahren 1 bis 14 erhalten wurden.

Beispiel 1

Mikroteilchen von Amphotericin B und von Phosphatidylcholin

1. Löslichkeit von Amphotericin B

Das Amphotericin B ist eine amphotere Verbindung, die eine Struktur aufweist, die gleichzeitig teilweise polar ist (mit Säure-Gruppen und Amingruppen) und teilweise nicht-polar ist. Außer in DMSO und in DMF ist das Amphotericin B in den meisten organischen Lösungsmitteln nur wenig löslich. Die lonisierung der Säure- und Amin-Gruppen erhöht jedoch seine Löslichkeit (vgl. Tabelle 1). Tabelle 1
Löslichkeit von Amphotericin B in verschiedenen LösungsmittelnDimethylformamid neutral sauer basisch unlöslich
Für die nachstehend beschriebenen Tests wurden verschiedene Portionen von Amphotericin B verwendet:
- Amphotericin B für den topischen Auftrag,
- Amphotericin B für die i.v.-Injektion 1.1 Löslichkeit von Amphotericin B mit "topischer Qualität" Lösungsmittel Löslichkeit (mg/ml) * vgl. den folgenden Abschnitt 2.3 1.2 Löslichkeit von Amphotericin B von "i.v. Qualität" Lösungsmittel Löslichkeit (mg/ml) * bezüglich der Auflösung vgl. den folgenden Abschnitt 2.3
Essigsäure und Ammoniak NH&sub3; in Methanol lösen das Amphotericin B nicht auf (5 mg/ml in CH&sub3;OH) nach der Zugabe von 2 Äquivalenten der genannten Reagentien.

2. Stabilität der Lösungen von Amphotericin B

2.1 Verfahren

Die Stabilität von Lösungen von Amphotericin B wurde ermittelt durch HPLC-Analyse unter Verwendung einer Umkehrphasen-Kolonne (C18 Bondapak von 25 x 25 cm, Waters Associates). Als Eluierungsmittel wurde ein CH&sub3;CN/10 mM Acetat-Puffer, pH 7-System (39:61) verwendet. Die UV-Aufzeichnung wurde bei 404 und 362 nm durchgeführt. Die Durchflußmenge betrug 2 ml/min. Die Retentionszeit (R.T.) des Amphotericins B betrug 9,5 min. Die Ergebnisse wurden als Prozentsatz der Fläche der Peaks ausgedrückt.

2.2 Lösungen in neutralem CH&sub3;OH

Bei einer Konzentration von 0,1 mg/ml ist das Amphotericin B mehrere Tage lang bei 4ºC stabil. Das Amphotericin B von topischer Qualität hat eine Reinheit von 88,5 % (Verunreinigung von 7,6 % mit einer Retentionszeit von 4,5 min).
Das Amphotericin B von i.v.-Qualität hat eine Reinheit von 94,5 % (Verunreinigung von 3,5 % bei einer Retentionszeit von 4,5 min).

2.3 Methanol-Lösungen in saurem Medium

Die Versuche mit Amphotericin B von topischer Qualität haben gezeigt, daß die Verbindung bei einer Konzentration von 0,1 mg/ml in Gegenwart von 1,5 Äquivalenten HCl in methanolischer Lösung stabil ist, daß sie jedoch abgebaut wird in diesem sauren Medium bei einer Konzentration von 5 mg/ml (vgl. Fig. 1). Die für eine Amphotericin B-Lösung von 0,1 mg/ml erhaltenen HPLC- Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 2 wiedergegeben. Die Neutralisation wurde durch Kontrolle des pH-Wertes durchgeführt. Die Zugabe eines Überschusses an NaOH beeinflußt die Stabilität der Verbindung nicht (Tabelle 2). Tabelle 2 Probe pH-Wert Amphotericin B (%RT:9,5min) Verunreinigung (%RT:4,5min) Amphotericin B 0, 1mg/ml id. + NaOH-Überschuß
Um den Einfluß der Zugabe von HCl auf die Stabilität von Amphotericin B zu untersuchen, wurden steigende Mengen an Amphotericin B (i.v.-Qualität) in Methanol gelöst in Gegenwart von 1 Äquivalent HCl (methanolische Lösung). Der Abbau der Substanz Amphotericin B in saurem Medium nimmt stark zu, wenn die Amphotericin B-Konzentration bei über 2 mg/ml liegt (vgl. Fig. 1) und dies gilt selbst dann, wenn die Zugabe von HCl in methanolischer Lösung bei 0ºC erfolgte (mit einer Verunreinigung von 31 %). Zur Herstellung einer Amphotericin B/HCl-Lösung mit einer Konzentration von 5 mg/ml ohne Abbau des Amphotericins B wurde das Amphotericin B in Methanol gelöst in Gegenwart eines Äquivalents HCl in einer Konzentration von 2 mg/ml. Das Lösungsmittel wurde anschließend abgedampft und das Amphotericin B-Salz wurde in dem erforderlichen Volumen Alkohol wieder aufgelöst.

2.4 Basische CH&sub3;OH-Lösungen

Steigende Mengen an Amphotericin B (i.v.-Qualität) wurden in Methanol in Gegenwart von 1 Äquivalent NaOH gelöst (methanolische Lösung). Die Lösungen wurden anschließend durch HPLC analysiert. Wie aus der Fig. 2 hervorgeht, weist das Amphotericin B eine gute Stabilität in methanolischer NaOH-Lösung auf bis zu einer Konzentration von 5 mg/ml. Die Neutralisation mit methanolischer HCl hat keinen Einfluß auf die Stabilität des Produkts.

3. Bestimmung von Amphotericin B

Zur Bestimmung von Amphotericin B durch UV-Analyse wurde der Wert E bestimmt durch Messung der Extinktion bei 404 nm für steigende Mengen an Amphotericin B, gelöst in DMF.
Amphotericin B (mg/ml): (Abs./49,8) x Verdünnungsfaktor.
Geeignete Kontrollen haben gezeigt, daß die Phospholipide und die Saccharose die Bestimmung des Amphotericins B nicht stören.

4. Herstellung von Mikroteilchen

4.1 Einführung

In dem Bestreben, die Herstellung der Mikroteilchen zu verbessern, wurden verschiedene Verfahren miteinander verglichen. Es wurden mehrere Parameter bewertet:
a) Zugabe von NaOH oder HCl zur Erhöhung der Löslichkeit von Amphotericin B in Methanol,
b) Effekt der Auflösung des Phospholipids in Chloroform vor Zugabe der methanolischen Lösung von Amphotericin B,
c) Effekt der Bildung eines Phospholipid-Films vor der Zugabe der methanolischen Lösung von Amphotericin B.
Das Zentrifugieren nach dem Dichtegradienten wurde als analytisches Verfahren zur Bestimmung der Qualität der Mikroteilchen ausgewählt.

4.2 Materialien und Verfahren

Materialien

Das L-α-Phosphatidylcholin wurde hergestellt aus Eigelb-Lecithin (Reinheit 99 %, Molekularmasse 789) oder Soja-Lecithin. Das Amphotericin B war ein solches von i.v.-Qualität (Reinheit 94 %, Molekularmasse 924). Es wurde eingedampft unter Verwendung eines Verdampfers vom Buchi- Rotationsverdampfer-Typ (wenn nichts anderes angegeben ist).

Herstellungsverfahren

Alle nachstehend beschriebenen Präparate enthielten das Amphotericin B in einer Endkonzentration von 5 mg/ml.

Verfahren 1:

Herstellung einer Suspension von Amphotericin B

25 mg Amphotericin B wurden in Methanol gelöst (0,1 mg/ml). Das Lösungsmittel wurde eingedampft und der trockene Rückstand wurde in 5 ml einer Phosphatpuffer-Salzlösung mit pH 7,4 (PBS) wieder aufgenommen. Die Probe wurde einer Ultraschallbehandlung unterzogen.

Verfahren 2:

Es wurden Präparate von Amphotericin B-Mikroteilchen hergestellt unter Verwendung eines aufsteigenden Filmverdampfers von der Firma QUICK FIT.
In einem 5 I-Erlenmeyerkolben löst man 1 g Amphotericin B und 0,85 g L-α-Phosphatidylcholin (Ei-Lecithin, Reinheit über 99 %) in 1,5 I eines Chloroform/Methanol-Gemisches (Volumenverhältnis 1:1), dem man 100 ml 0,9 % NaCl zugibt, wenn die Lösung klar ist.
Die Lösungsmittel werden unter Vakuum in dem aufsteigenden Filmverdampfer eliminiert. Die Maximaltemperatur der Lösung im oberen Abschnitt des Verdampfers beträgt 35 bis 45ºC. Nach der Phasentrennung gewinnt man die wäßrige Phase, welche die Mikroteilchen enthält, die man einem zweiten Verdampfungszyklus unterwirft.
Das System wird mit destilliertem Wasser gespült und das Endvolumen wird mit einem Rotationsverdampfer auf 200 ml gebracht, dessen Erwärmungsbad 40ºC nicht übersteigt.
Man erhält im allgemeinen 82 bis 86 % Amphotericin in Form einer Mikroteilchen-Suspension mit einer Konzentration zwischen 4 und 5 mg/ml.

Verfahren 3

25 mg Amphotericin B werden in Methanol (5 mg(ml) in Gegenwart von 1 Äquivalent NaOH (205 µl einer 0,132 M methanolischen Lösung) gelöst. Es werden 21,2 mg Phosphatidylcholin in die Mischung eingeführt. Dies entspricht einem Molverhältnis zwischen Amphotericin B und Phosphatidylcholin von 1:1. Das Präparat wurde gerührt, bis es vollständig aufgelöst war. Es wurden 5 ml 0,9 Gew.-% NaCl zugegeben. Es wurde die Bildung eines gelben Niederschlags beobachtet. Die Mischung wurde anschließend durch Zugabe von 1 Äquivalent Säure (30,7 µl einer 0,88 M HCl-Lösung in Methanol) neutralisiert. Das Methanol wurde anschließend eingedampft und das Endvolumen wurde mit einer 0,9 gew.-%igen NaCl-Lösung auf 5 ml eingestellt.

Verfahren 4

21,2 mg Phosphatidylcholin wurden in Form eines Films am Boden eines 500 ml-Kolbens durch Rotationsverdampfung des Chloroforms einer Chloroform-Lösung des Phospholipids abgeschieden. Der Film wurde in 250 ml einer Lösung von Amphotericin B in Methanol (25 mg mit 0,1 mg/ml) solubilisiert und erneut in einem Rotationsverdampfer eingedampft bis ein dünner Film erhalten wurde. Nach der Zugabe von 5 ml PBS-Lösung wurde die Mischung 0,5 h lang einer Ultraschallbehandlung unterzogen.

Verfahren 5

Es wurde das gleiche Verfahren wie das "Verfahren 3" durchgeführt, jedoch mit der Ausnahme, daß das Phospholipid vor der Zugabe der Amphotericin B-Lösung in dem Chloroform gelöst wurde. In diesem Falle wurde nach der Zugabe der wäßrigen PBS-Lösung (2 ml) kein Niederschlag beobachtet.
Es wurde jedoch ein fester gelber Niederschlag während des Eindampfens der Lösungsmittel festgestellt.

Verfahren 6

Es wurde ein identisches Verfahren wie das "Verfahren 4" durchgeführt, wobei diesmal jedoch Soja-Lecithin anstelle von Eigelb-Lecithin verwendet wurde.

Verfahren 7

Es wurde ein identisches Verfahren wie das "Verfahren 3" durchgeführt unter Verwendung von hydriertem Soja-Lecithin anstelle von Eigelb-Lecithin.

Verfahren 8

Es wurde ein identisches Verfahren wie das "Verfahren 3" durchgeführt unter Verwendung von Wasser anstelle einer 0,9 %igen NaCl-Lösung.

Verfahren 9

Es wurde ein zu dem "Verfahren 3" identisches Verfahren durchgeführt unter Verwendung einer 5 %igen Lactose-Lösung anstelle der 0,9 %igen NaCl-Lösung.

Verfahren 10

Es wurde ein zu dem "Verfahren 3" identisches Verfahren durchgeführt, jedoch mit der Ausnahme, daß nur 1 ml einer 0,9 %igen NaCl-Lösung der Lösung zugesetzt wurde. In diesem Falle war die Ausfällung nicht vollständig bei der Zugabe der wäßringen Lösung. Diese Ausfällung wurde in der Neutralisationsphase vervollständigt.

Verfahren 11

Es wurde das gleiche Verfahren wie das "Verfahren 3" durchgeführt, jedoch mit der Ausnahme, daß die Mischung durch Zugabe von 1 Äquivalent HCl in methanolischer Lösung vor der Zugabe der 0,9 %igen NaCl-Lösung neutralisiert wurde.

Verfahren 12

25 mg Amphotericin B wurden in Gegenwart von 1 Äquivalent HCl in methanol ischer Lösung in einer Konzentration von 2 mg/ml aufgelöst zur Herstellung einer Lösung von 5 mg/ml Arzneimittel ohne zu starken Abbau. Das Lösungsmittel wurde eingedampft und die Verbindung in dem erforderlichen Volumen an Methanol aufgelöst. Es wurden 21,2 mg Eigelb-Phosphatidylcholin in die Mischung eingeführt. Das Präparat wurde bis zur vollständigen Auflösung gerührt. Es wurden 5 ml einer 0,9 %igen NaCl-Lösung zugegeben. Es wurde die Bildung eines gelben Niederschlags festgestellt. Die Mischung wurde durch Zugabe von 1 Äquivalent Säure neutralisiert. Das Methanol wurde eingedampft und das Endvolumen wurde mit einer 0,9 %igen NaCl-Lösung auf 5 ml eingestellt.

Verfahren 13

Es wurde das gleiche Verfahren wie das "Verfahren 12" durchgeführt, jedoch mit der Ausnahme, daß die Mischung durch Zugabe von 1 Äquivalent NaOH, gelöst in Methanol, vor Zugabe der 0,9 %igen NaCl-Lösung neutralisiert wurde.

Verfahren 14

Es wurde das gleiche Verfahren wie das "Verfahren 13" durchgeführt, jedoch mit der Ausnahme, daß das Phospholipid in Chloroform gelöst wurde vor Zugabe der Amphotericin B-Lösung. Nach der Zugabe von 0,9 % NaCl (2 ml) wurde kein Niederschlag festgestellt. Während des Eindampfens der Lösungsmittel trat ein gelber Niedershlag auf.

Verfahren 15

Es wurde das gleiche Verfahren wie das "Verfahren 3 durchgeführt, jedoch mit der Ausnahme, daß das Lecithin durch ein Gemisch von 1,2- Dimyristoyl-sn-glycerin(3)-phosphocholin (12,84 mg) und 1,2-Dimyristoyl-sn- glycero(3)phospho(1)-rac-glycerin (5,59 mg) ersetzt wurde.

Verfahren 16

2 g Amphotericin B, suspendiert in 500 ml Methanol, werden durch Zugabe von 1 Äquivalent NaOH, gelöst in Methanol, aufgelöst. Zu der klaren Lösung werden 1,7 g Ei-Lecithin (1 Äquivalent) zugegeben. Letztere wird gerührt bis zur vollständigen Auflösung des Lipids. Unter starkem Rühren werden 300 bis 500 ml Wasser zugegeben, danach wird der pH-Wert der Lösung auf 7,8 eingestellt, wobei man eine Ausfällung von Mikroteilchen erhält. Das Methanol wird unter Vakuum eingedampft unter Verwendung eines aufsteigenden Filmverdampfers (Quick Fit). Die maximale Temperatur im oberen Abschnitt der Verdampfungskolonne beträgt 35 bis 45ºC.

Verfahren

Zentrifugieren entsprechend dem Dichtearadienten

(A.S. Janoff, L.T. Boni, M.C. Popescu, S.R. Minchey, P.R. Cullis, T.D. Maden, T. Taraschi, S.M. Gruner, E. Shyamsunder, M.W. Tate, R. Mendelsohn und D. Bonner, "Proc. Nat. Acad. Sci" USA 85 6122-8126 (1988)).
500 µl einer Probe wurden auf einem kontinuierlichen Saccharose- Gradienten (d = 1,0 bis 1,18 g/ml) in einer Lösung von 150 mM NaCl/20 mM Hepes, pH 7,4, abgeschieden. Der Gradient wurde 21 h lang bei 22ºC in einem Rotor SW-41 (Beckman) bei 230 000 g zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren wurde der Gradient in Fraktionen von 0,53 ml fraktioniert und bezüglich ihres Gehates an Amphotericin B und Phospholipid analysiert.

Bestimmung des Phospholidids

(M. Takayama. S. Itom, T. Nagasaki, I. Tanimizu, "Clinica Chimica Acta", 79, (1977) 93-98 "A new Enzymatic method for determination of serum cholinecontaining phospholipids").
In klassischer Weise wurden 20 µl einer Probe mit 3 ml einer Enzymlösung (Boehringer Mannheim GmbH, Kit 691844) gemischt und 10 min lang bei 37ºC inkubiert. Die Extinktion der Probe wurde bei 500 nm gemessen. Als Vergleich wurde eine Cholinchlond-Lösung (entsprechend 3 mg PC/ml) verwendet.

4.3 Ergebnisse

4.3.1 Phopholidid-Bestimmung in den Mikroteilchen

Es wurden Mikroteilchen hergestellt aus 4,15 mg Ei-Lecithin und 5 mg Amphotericin B. Die Mikroteilchen wurden in einer 1 %igen Doc-Lösung suspendiert und bezüglich ihres Gesamtgehaltes an Phospholipid analysiert.
Es wurden mehrere Verdünnungen von Mikroteilchen in einer 1 %igen Doc-Lösung mit einem pH-Wert von 11,3 hergestellt und bezüglich ihres Gehaltes an Phospholipid analysiert. Die Bestimmung ist genau ab 0,1 mg Phospholipid/ml bis zu mindestens 5 mg/ml.

4.3.2 Präzision der Dichteprofile

Es wurde ein Saccharose-Gradient von 0 bis 41 Gew.-% Saccharose erhalten unter Verwendung eines Gradienten-Generators LKB (Gesamtvolumen 11 ml). Das Rohr wurde fraktioniert in aliquote Anteile von 0,53 ml und die Dichte der verschiedenen Fraktionen wurde durch Gravimetrie bestimmt. Es trat ein linearer Gradient auf, der sich von 1 bis 1,18 g/ml erstreckt. Eine Versuchskontrolle hat gezeigt, daß das Dichteprofil das gleiche ist nach dem Zentrifugieren mit 230 000 g.

4.3.3 Bestimmung von Phospholidid und Amphotericin B in den nach dem Verfahren 1 bis 5 erhaltenen Mikroteilchen

Wie aus der nachstehenden Tabelle 3 hervorgeht, werden das Amphotericin und das Phospholipid nahezu vollständig zurückgewonnen unabhängig von dem angewendeten Verfahren. Tabelle 3 Probe Phospholipid mg/ml Amphotericin mg/ml * ausgedrückt in % des theoretischen Wertes ** theoretischer Wert nicht verfügbar

4.3.4 Dichteprofil der Zentrifugate nach dem Saccharosearadienten

Die Fig. 3 bis 16 zeigen isopyknische Saccharose-Dichteprofile von 14 Präparaten von Amphotericin B. Die in den Verfahren 3 und 10 erhaltenen Mikroteuchen (Fig. 5 bzw. 12) führen zu Dichteprofilen, in denen das Amphotericin B in einer einzigen Bande (1,13-1,15 g/ml) eng assoziiert ist mit dem Phosphatidylcholin. Die Schichten sind dünn (schmal) und befinden sich in einem deutlichen Abstand von dem Boden des Rohres. Das Molverhältnis zwischen Amphotericin B und Phospholipid und die Dichte dieser neuartigen Banden lassen vermuten, daß man es mit einem Amphotericin B/Lipid- Komplex zu tun hat. Die Dicken (Breiten) der Mikroteilchen-Schichten und die bei den verschiedenen Verfahren beobachteten Amphotericin B/Phospholipid- Molverhältnisse sind in der nachstehenden Tabelle 4 angegeben.
In dem Verfahren 1 (Fig. 3) ist das Amphotericin zum Boden des Rohres gewandert. Dieses Ergebnis zeigt an, daß die Dichtegradienten- Zentrifugierung anwendbar ist zur Unterscheidung zwischen Amphotericin B/Phospholipid-Mikroteilchen und Aggregaten von freiem Amphotericin B.
Die in dem Verfahren 5 (Fig. 7), in dem Verfahren 6 (Fig. 8) und in dem Verfahren 14 (Fig. 16) erhaltenen Mikroteilchen zeigen eine sehr ähnliche bimodale Dichteverteilung. Die Hauptmenge des Amphotericins B ist am Boden des Rohres zusammen mit einem Teil des Lipids angeordnet. Die restlichen Phospholipide schwimmen in Form einer opaleszierenden Schicht. Für diese Proben ist es schwierig, die Anwesenheit von Mikroteilchen zu zeigen.
Die mit Soja-Lecithinen und hydrierten Soja-Lecithinen erhaltenen Ergebnisse (Verfahren 7, Fig. 9 bzw. Verfahren 8, Fig. 10) ähneln sehr denjenigen, die mit den nach den Verfahren 3 und 10 erhaltenen Mikroteilchen beobachtet wurden, die Mikroteilchen sind jedoch etwas weniger homogen.
Die Mikroteilchen wurden erhalten, wenn eine geringe Menge von 0,9 %igem NaCl zugegeben wurde (Verfahren 11, Fig. 13), wenn die Neutralisation vor der Zugabe der wäßrigen 0,9 %igen NaCl-Lösung erfolgte (Verfahren 13, Fig. 15) oder wenn das Amphotericin B in einem sauren Medium gelöst wurde (Verfahren 14, Fig. 16). Tabelle 4 Verfahren Dicke(Breite)d. Schicht (cm) Molverhältnis Ampho. B/Phospholipid** * gemessen nach der Lyophilisierung ** Verhältnis errechnet für die Gradientenfraktion, die die größte Menge an Mikroteilchen enthält.

5. Lyophilisierung

Die Mikroteilchen werden in lyophilisierter Form aufbewahrt (konserviert). Die Wiederherstellung der Suspension von Mikroteilchen in einer wäßrigen Lösung nach der Lyophilisierung führt zu Teilchen, welche die gleichen physikalisch-chemischen und biologischen Eigenschaften aufweisen wie vor der Lyophilisierung.
Um die Integrität der Mikroteilchen zu bewahren, muß die Lyophilisierung in Gegenwart von verschiedenen Exzipienten, wie Glucose, Lactose, Phosphat-Puffer, Tris, Albumin, Carboxymethylcellulose, durchgeführt werden.

6. Schlußfolgerungen

Die homogensten Präparate wurden erhalten nach den Verfahren 3 und 10, d.h. durch Auflösung des Amphotericin B in einer Konzentration von 5 mg/ml in Gegenwart eines Basen-Äquivalents unter Verwendung von Eigelb- Phosphatidylcholin und unter Zugabe einer 0,9 %igen NaCl-Lösung oder einer 5 %igen Lactose-Lösung (1 mg auf 5 mg Amphotericin B) vor der Neutralisation der Mischung. Das Präparat auf Basis von Soja-Lecithin oder hydriertem Soja-Lecithin war etwas weniger homogen.
Es wurden außerdem Mikroteilen hergestellt durch Neutralisation der Mischung vor der Zugabe der 0,9 %igen NaCl-Lösung oder durch Auflösung des Amphotericins in Methanol unter Verwendung von einem Äquivalent HCl. Bei dem zuletzt genannten Verfahren wurde die Mischung vor oder nach der Zugabe der 0,9 %igen NaCl-Lösung neutralisiert. In allen diesen Präparaten waren die Mikroteilchen weniger homogen, wie die Saccharosegradienten- Zentrifugierung zeigt.
Es wurden keine Mikroteilchen erhalten, wenn Chloroform zur vorherigen Bildung eines Eigelb-Lecithinfilms oder zum Auflösen des Phospholipids vor der Zugabe der basischen methanol ischen Lösung von Amphotericin B verwendet wurde.

Beispiel 2

Mit anderen Lösungsmitteln hergestellte Mikroteilchen

A) Verwendung von DMF

50 mg Amphotericin B werden bei 0ºC in 1 ml Dimethylformamid in Gegenwart von 1 Äquivalent HCl in Methanol gelöst (47 µl einer 0,87 M Lösung), in die Lösung werden 42,5 mg (1 Äquivalent) Phosphatidylcholin eingeführt. Das Präparat wird bis zur vollständigen Auflösung gerührt, wobei die Zugabe von 1 ml Wasser zur Ausfällung der Mikroteilchen führt. Die Lösung wird durch Zugabe von 1 Äquivalent NaOH neutralisiert. Das Dimethylformamid wird überwiegend durch drei Zyklen der Zentrifugierung und der Eliminierung der überstehenden Flüssigkeit und der erneuten Suspendierung in wäßriger Lösung eliminiert.

B) Verwendung von 1,2-Propandiol

1 g Amphotericin B wird in 250 ml 1,2-Propandiol (4 mg/ml) in Gegenwart von 1 Äquivalent KOH gelöst (10 ml einer 0,1 M Lösung von KOH in Ethanol). 850 mg Phosphatidylcholin, gelöst in 3 ml Ethanol, werden in die Lösung eingeführt; dies entspricht einem Molverhältnis von 1:1 zwischen Amphotericin B und dem Phosphatidylcholin. Die Lösung wird bei 800 UpM bei Umgebungstemperatur gerührt und mit 10 ml 0,1 M HCl (1 Äquivalent) neutralisiert. Zu der Mischung werden 250 ml H&sub2;O zugegeben, was zur Ausfällung der Mikroteilchen führt. Die Eliminierung des 1,2-Propandiols wird durch Tangential-Flitrierung durchgeführt.

C) Verwendung von Dimethylacetamid (DMA)

Die Löslichkeit des Amphotericins B in DMA (6 mg/ml) reicht aus, um die Verwendung einer Base oder einer Säure zu vermeiden.
300 mg Amphotericin B werden in 50 ml DMA (6 mg/ml) gelöst, zu der Lösung werden 255 mg Ei-Lecithin in Ethanol (1 ml) zugegeben. Die Mischung wird mit 1000 UpM gerührt und es werden 75 ml Wasser zu der Mischung zugegeben, wobei eine Ausfällung von Mikroteilchen auftritt. Das DMA wird im Hinblick auf die Inkompatibilität der Filtrationsmembranen mit DMA durch Zentrifugieren eliminiert.

Zentrifugieren nach dem Saccharosearadienten

Die Zentrifugierung nach dem Saccharose-Gradienten zeigt für die in DMF, 1,2-Propandiol und DMA erhaltenen Präparate eine Bande, die in halber Höhe des Rohres angeordnet ist und gekennzeichnet ist durch ein Amphotericin B/Phospholipid-Molverhältnis zwischen 0,8 und 1,4.
Es werden keinerlei Spuren von freiem Amphotericin B oder freiem Phospholipid beobachtet.

Beispiel 3

Mikroteilchen von Amdhotericin B und verschiedenen Phospholidid- Gemischen

Beisiel 3-1

1 g (1,1 mmol) Amphotericin B werden in 250 ml Methanol, das in einem Eisbad gekühlt worden ist, in Gegenwart von 1 Äquivalent NaOH gelöst. Zu der in einem Eisbad gekühlten Amphotericin B-Lösung wird eine Mischung von 0,367 g (0,5 Äquivalenten) DMPC und 0,373 g (0,5 Äquivalenten) DMPG, gelöst in 80 ml Methanol, zugegeben. Das Molverhältnis zwischen Amphotericin B und den Phospholipiden beträgt 1:1. Die Mikroteilchen werden erhalten durch Ausfällung nach der Zugabe von 300 ml eines 50 mM Phosphat-Puffers, pH 7,8, mit 6 % Lactose und Neutralisieren der Mischung. Die Mischung wird 30 min lang auf 60ºC erwärmt und das Methanol wird durch Abdampfen auf einem aufsteigenden Film eliminiert.

Beispiel 3-2

Es wird das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt, wobei man jedoch von 0,35 Äquivalenten DMPC und 0,15 Äquivalenten DMPG, berechnet unter Bezugnahme auf Amphotericin B, ausgeht. Das Molverhältnis zwischen Amphotericin B und den Phospholipiden beträgt dann 2:1.

Beispiel 3-3

Es wird ds gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt, wobei man jedoch von 0,75 Äquivalenten DMPC und 0,08 Äquivalenten DMPG ausgeht, berechnet unter Bezugnahme auf Amphotericin B. Dies entspricht einem Molverhältnis zwischen Amphotericin B und den Phospholipiden von 1,2:1.

Beispiel 3-4

Es wird das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt, wobei man jedoch von 0,7 Äquivalenten Ei-Lecithin und 0,3 Äquivalenten DMPG ausgeht, berechnet unter Bezugnahme auf das Amphotericin B. Dies entspricht einem Molverhältnis zwischen Amphotericin B und den Phospholipiden von 1:1.

Beispiel 3-5

Es wird das gleiche Verfahren wie in Beispiel durchgeführt, wobei man jedoch von 0,7 Äquivalenten hydriertem Soja-Lecithin und 0,3 Äquivalenten DMPG ausgeht, berechnet unter Bezugnahme auf Amphotericin B. Dies ent spricht einem Molverhältnis zwischen Amphotericin B und den Phospholipiden von 1:1.

Beispiel 3-6

1,85 g (2 mmol) Amphotericin B werden in 500 ml 1,2-Propandiol in Gegenwart von 1 Äquivalent NaOH (200 µl einer 10 N NaOH-Lösung) gelöst. Zu der Amphotericin B-Lösung wird eine Lösung zugegeben, die 0,45 g (0,33 Äquivalente) DMPC und 0,46 g (0,33 Äquivalente) DMPG, gelöst in 100 ml 1,2-Propandiol, enthält. Das Auflösen des DMPG in 1,2-Propandiol erfolgt unter Erwärmen der Lösung auf 60ºC. Das Molverhältnis zwischen Amphotericin B und den Phospholipiden beträgt 1,5:1.
Die Mikroteilchen werden erhalten durch Ausfällung nach der Zugabe von 1 I 50mM Phosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 7,8, der 6 % Lactose enthält, und Neutalisieren der Mischung (Zugabe von 2 ml einer 1 N HCl- Lösung).
Nach 30-minütigem Erwärmen der Mischung auf 60ºC wird das 1,2- Propandiol durch Tangential-Filtrieren eliminiert.

Beispiel 3-7

Es wird das gleiche Verfahren durchgeführt wie in Beispiel 6, wobei man diesmal jedoch von einem Molverhältnis Amphotericin B zu den Phospholipiden von 2:1 ausgeht.

Beispiel 3-8

Man arbeitet nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 6, wobei man jedoch von einem Molverhältnis zwischen Amphotericin B und den Phospholipiden von 1:1 ausgeht.

Beisiel 3-9

Es wird das gleiche Verfahren durchgeführt wie in Beispiel 6, wobei man jedoch von 0,35 Äquivalenten DMPC und 0,15 Äquivalenten DPPS ausgeht. Dies entspricht einem Molverhältnis zwischen Amphotericin B und Phospholipiden von 2:1.

Beispiel 3-10

1,85 g (2 mmol) Amphotericin B werden in 400 ml Ethanol, das in einem Eisbad gekühlt worden ist, in Gegenwart von 1 Äquivalent HCl (2 ml einer 1 N HCl-Lösung) gelöst. Zu der in einem Eisbad gekühlten Amphotericin B-Lösung wird eine Lösung, enthaltend 0,45 g (0,33 Äquivalente) DMPC und 0,46 g (0,33 Äquivalente) DMPG, gelöst in 100 ml Ethanol, die 2 ml 1 N HCl enthält, zugegeben. Das Molverhältnis zwischen Amphotericin B und den Phospholipiden beträgt 1,5:1. Mikrokapseln werden erhalten durch Ausfällung nach der Zugabe von 1 I Wasser unter Rühren und Neutralisation der Mischung (Zugabe von 4 ml einer 1 N NaOH-Lösung). Nach dem Erwärmen der Mischung für 30 min auf 60ºC wird das Ethanol durch Tangential-Filtrieren oder durch Verdampfen auf einem aufsteigenden Film eliminiert.

Beispiel 3-11

1,85 mg (2 mmol) Amphotericin B werden in 400 ml Ethanol, das in einem Eisbad gekühlt worden ist, in Gegenwart von 1 Äquivalent HCl (2 ml einer 1 N HCl-Lösung) gelöst. Zu der in dem Eis gekühlten Amphotericin B-Lösung wird eine Lösung von 2,85 g (3 Äquivalenten) Cholesterinvalerat und 0,689 g (0,3 Äquivalenten) DMPG in Ethanol, die 2 ml 1 N HCl enthält, zugegeben. Das Molverhältnis zwischen Amphotericin B und Lecithin beträgt 0,3:1. Die Mischung wird energisch gerührt und die Mikroteilchen werden nach der Zugabe von II Wasser und Neutralisation der Mischung (Zugabe von 4 ml 1 N NaOH) erhalten. Nach dem Erwärmen der Mischung für 30 min auf 60ºC wird das Ethanol durch Tangential-Filtrierung oder durch einen aufsteigenden Film eliminiert.
Diese Präparate der Beispiele 3-1 bis 3-11 sind homogen, sie zeigen das Fehlen eines hämolytischen Effekts, eine in vitro-Aktivität gegenüber Candida tropicalis, die gleich oder etwas besser ist als diejenige von Fungizone sowie eine Abnahme der in vivo gemessenen Toxizität bei OF 1 Mäusen im Vergleich zu derjenigen von Fungizone. In bestimmten Fällen beobachtet man eine LD&sub5;&sub0; von > 30.
Die Verwendung von DSPC, DSPG und DPPS führt zu sehr homogenen Mikroteilchen-Präparaten, die eine gute in vitro-Aktivität gegenüber Candida tropicalis aufweisen (die ED&sub5;&sub0; ist gleich oder etwas besser als bei Fungizone) und sie zeigen sogar eine Abnahme der akuten Toxizität, bestimmt in vivo bei einer OF 1-Maus, verglichen mit Amphotericin B, das in Form von Fungizone verwendet worden ist. Tabelle 5 LD&sub5;&sub0; von Präparaten entsdrechend den Beispielen 1 bis 11 Die Untersuchungen wurden bei einer OF 1-Maus durchgeführt Beispiel

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Lipid-Mikroteilchen mit mikrokristallinem Aussehen einer in Wasser unlöslichen Substanz, die eine Affinität für die Phospholipide aufweist, und mindestens eines Phospholipids, wobei die Mikroteilchen in Suspension in einer wäßrigen Lösung stabil sind, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) die genannte Substanz und das oder die genannten Phospholipide in einem für die genannte Substanz und das oder die genannten Phospholipide gemeinsamen organischen Lösungsmittel in einem basischen oder sauren Milieu löst;

b) die Lösung der genannten Substanz und des oder der genannten Phospholipide mit einer wäßrigen Lösung in einer solchen Menge mischt, daß eine Insolubilisierung in Form eines Niederschlags auftritt;

c) die Lösung durch Zugabe einer Säure bzw. einer Base neutralisiert; und

d) das Lösungsmittel eliminiert zur Gewinnung einer wäßrigen Lösung, welche die Mikroteilchen in Form von Mikrosuspensionen enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Molverhältnis zwischen dem oder den Phospholipiden und der genannten Substanz unter 2, vorzugsweise zwischen 0,5 und 1, liegt.

3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Substanz ausgewählt wird aus antimykotischen Agentien und Polyen-Makroliden.

4. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Substanz ausgewählt wird aus Nystatin, Amphotericin B und ihren Antifungi-Derivaten.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Phospholipid ausgewählt wird aus Phosphatidylcholin, Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC), Distearylphosphatidylcholin (DSPC), Dipalmitoyl phosphatidylcholin (DPPC), Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Dipalmitoylphosphatidylserin (DPPS), Phosphatidylinosit, Phosphatidylglycerin, Dimyristoylphosphatidylglycerin (DMPG), Distearylphosphatidylglycerin (DSPG), 3'-O-Lysylphosphatidylglycerin, Diphosphatidylgly cerin oder auch den Cholesterinestern, einzeln oder in Form einer Mischung.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Phospholipid um das Phosphatidylcholin oder ein Dimyristoylphosphatidylcholin im Gemisch mit Dimyristoylphosphatidylglycerin in einem Molverhältnis von 5:5 bis 9:1 handelt.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das organische Lösungsmittel der Lösung von Phospholipid und der genannten Substanz ausgewählt wird aus organischen Lösungsmitteln, wie Methanol, DMF, DMA, Propylenglycol oder Ethanol.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der wäßrigen Lösung um reines Wasser, eine Salzlösung oder eine Saccharidlösung handelt.

9. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der wäßrigen Lösung um eine 1 bis 10 gew.-%ige Lactoselösung handelt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der wäßrigen Lösung um einen 50 mM Phosphatpuffer, pH = 7,8, handelt, der 6 % Lactose enthälte.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Substanz ausgewählt wird aus den antimykotischen Agentien, den Makroliden vom Polyen-Typ wie Amphotericin B oder Nystatin und daß sie in der Stufe (a) in einer methanolischen Lösung oder in einer Propylenglycollösung in basischem Milieu oder in einer DMF-Lösung oder Ethanollösung in saurem Milieu oder auch in einer DMA-Lösung in neutralem oder saurem Milieu gelöst wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß in der Stufe (a) die verwendete Menge der Säure oder Base 1 bis 1,5 Äquivalente Säure oder Base, bezogen auf die Menge der aktiven Substanz, beträgt und daß man in der Stufe (c) mit einer gleichen Menge Base bzw. Säure neutralisiert.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mischung vor der Stufe (d) erwärmt.

14. Mikroteilchen-Präparat, das nach dem Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche erhältlich ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroteilchen homogene Abmessungen (Größen) haben.