DE60317039T2

DE60317039T2 - Peptidborsäuren und deren Verwendung in der Herstellung von Salzen derselben

Info

Publication number: DE60317039T2
Application number: DE60317039T
Authority: DE
Inventors: David Jonathan Madge; Mark Dolman; Sophie Marie Combe-Marzelle; John Joseph Richmond Deadman; Anthony James Kennedy; Sanjay Kumar Kakkar; Armin Walter; Alfred Olbrich; Dieter Krimmer; Andrea Maria Theresia Weiland-Weibel
Original assignee: Trigen Ltd
Current assignee: Trigen Ltd
Priority date: 2002-09-09
Filing date: 2003-09-09
Publication date: 2008-07-31
Anticipated expiration: 2023-09-10
Also published as: EP1695711A3; CA2535788A1; MXPA05002661A; ATE376551T1; SI1396270T1; CN1684693A; PT1396270E; CN100447151C; BR0314450A; NZ539333A; EP1695712A2; CA2535792A1; MXPA05002662A; EP1400245A1; EP1561466A3; ES2263924T3; KR20050057295A; EP1466916B1; ATE324899T1; AU2003263328A1

Description

HINTERGRUND
Die vorliegende Offenbarung bezieht sich auf pharmazeutisch nützliche Produkte, die aus Organoboronsäuren gewonnen werden können. Die Offenbarung bezieht sich außerdem auf die Verwendung von Mitgliedern aus der zuvor erwähnten Produktklasse, auf deren Formulierung, Präparation, ihre synthetischen Intermediate und auf andere Themenbereiche.
Die Offenbarung bezieht sich ferner auf parenterale pharmazeutische Formulierungen, die die beschriebenen Produkte enthalten.
Boronsäure-Verbindungen
Es ist seit einigen Jahren bekannt, dass Boronsäure-Verbindungen und ihre Derivate, z. B. Ester, vor allem als Inhibitoren oder Substrate von Proteasen biologisch aktiv sind. In Koehler et al., Biochemistry 10:2477, 1971, wird zum Beispiel berichtet, dass 2-Phenylethan-Boronsäure die Serinprotease Chymotrypsin auf millimolarer Ebene inhibiert. In Philip et al, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 68:478-480, 1971, wird von der Inhibierung von Chymotrypsin und Subtilisin durch Aryl-Boronsäuren (Phenyl-Boronsäure, m-Nitro-Phenyl-Boronsäure, m-Aminophenyl-Boronsäure, m-Bromphenyl-Boronsäure) berichtet. In Seufer-Wasserthal et al, Biorg. Med. Chem. 2 (1):35-48, 1994, wird eine Studie der Inhibierung von Subtilisin Carlsberg durch eine Vielfalt von Boronsäuren, insbesondere Phenyl-Boronsäuren, die durch Cl, Br, CH₃, H₂N, MeO und andere substituiert werden, beschrieben.
Bei der Beschreibung von Inhibitoren oder Substraten von Proteasen bezeichnen P1, P2, P3, etc. Substrat- oder Inhibitorrückstände, die zur spaltbaren Peptidbindung aminoterminal angeordnet sind, und S1, S2, S3 etc. bezeichnen die entsprechenden Subsites der verwandten Protease gemäß: Schechter, I. and Berger, A. On the Size of the Active Site in Proteases, Biochem. Biophys. Res. Comm., 27:157-162, 1967. Bei Thrombin ist die S1-Bindungsstelle oder „Spezifizitätstasche" ein klar definierter Schlitz im Enzym, während die S2- und S3-Bindungs-Subsites (auch jeweils die proximalen und distalen hydrophoben Taschen genannt) hydrophob sind und unter anderem stark mit jeweils Pro und (R)-Phe interagieren.
Die pharmazeutische Erforschung von Serinprotease-Inhibitoren hat sich von den einfachen Aryl-Boronsäuren weg und zu Boro-Peptiden, d. h. Peptiden, die ein Boronsäure-Analog einer α-Aminocarbonsäure enthalten, hinbewegt. Die Boronsäure kann derivatisiert werden, wodurch häufig ein Ester entsteht. Shenvi ( EP-A-145441 und US 4499082 ) offenbarte, dass Peptide, die eine α-Aminoboronsäure mit einer neutralen Seitenkette enthalten, wirksame Inhibitoren von Elastase darstellen, woraufhin eine Vielzahl von Patentpublikationen folgte, die sich mit Boro-Peptid-Inhibitoren von Serinproteasen beschäftigten. Es ist von spezifischen, fest bindenden Boronsäure-Inhibitoren für Elastase (K_i, 0,25nM), Chymotrypsin (K_i, 0,25nM), Cathepsin G (K_i, 21 nM), α-lytische Protease (K_i, 0,25 nM), Dipeptidyl-Aminopeptidase Typ IV (K_i, 16 pM) und kürzlich auch Thrombin (Ac-D-Phe-Pro-boroArg-OH) (DuP 714 anfänglicher K_i 1,2nM) berichtet worden.
Claeson et al ( US 5574014 und andere) und Kakkar et al ( WO 92/07869 und Familienmitglieder einschließlich US 5648338 ) offenbaren Thrombininhibitoren mit einer neutralen C-terminalen Seitenkette, zum Beispiel einer Alkyl- oder Alkoxyalkyl-Seitenkette.
Abänderungen der durch Kakkar et al beschriebenen Verbindungen sind in WO 96/25427 beinhaltet und auf Peptidyl-Serinprotease-Inhibitoren ausgerichtet, in denen die natürliche Peptidbindung P2-P1 durch eine andere Bindung ersetzt wird. Als Beispiele der nicht-natürlichen Peptidbindungen können die folgenden erwähnt werden: -CO₂-, -CH₂O-, -NHCO-, -CHYCH₂-, -CH=CH-,
-CO(CH₂)_pCO- wobei p 1, 2 oder 3 ist, -COCHY-, -CO₂-CH₂NH-, -CHY-NX-, -N(X)CH₂-N(X)CO-,
-CH=C(CN)CO-, -CH(OH)-NH-, -CH(CN)-NH-, -CH(OH)-CH₂- oder -NH-CHOH-, wobei X H oder eine Aminoschutzgruppe ist und Y H oder Halogen, insbesondere F ist. Besondere nicht-natürliche Peptidbindungen sind -CO₂- oder -CH₂O.
Metternich ( EP 471651 und US 5288707 , das letztere wurde auf Trigen Limited übertragen) offenbart Varianten der Phe-Pro-BoroArg Boro-Peptide, in denen das P3 Phe durch eine unnatürliche, hydrophobe Aminosäure wie zum Beispiel Trimethylsilylalanin, p-Tert.Butyl-Diphenyl-Silyloxymethyl-Phenylalanine oder p-Hydroxymethylphenylalanin ersetzt wird und die P1-Seitenkette neutral sein kann (Alkoxyalkyl, Alkylthioalkyl oder Trimethylsilylalkyl).
Das Ersetzen des P2-Pro-Rests von Boro-Tripeptid-Thrombininhibitoren durch ein N-substituiertes Glycin wird in Fevig, J. M. et al Bioorg. Med. Chem. 8: 301-306 und Rupin, A. et al Thromb. Haemost. 78(4):1221-1227, 1997 beschrieben. Siehe auch US 5.585.360 (de Nanteuil et al).
Amparo ( WO 96/20698 und Familienmitglieder einschließlich US 5698538 ) offenbart Peptidmimetika der Struktur Aryl-Linker-Boro(Aa), wobei Boro(Aa) ein Aminoboronatrest mit einer nicht-basischen Seitenkette sein kann, zum Beispiel BoroMpg. Der Linker hat die Formel -(CH₂)_mCONR- (wobei m 0 bis 8 ist und R H oder eine bestimmte organische Gruppe ist) oder Analoge dieser, in denen die Peptidbindung -CONR- durch -CSNR-, -SO₂NR-, -CO₂-, -C(S)O- oder -SO₂O- ersetzt wird. Aryl ist Phenyl, Naphthyl oder Biphenyl, das durch einen, zwei oder drei Anteile, die aus einer festgelegten Gruppe ausgewählt wurden, substituiert wird. Normalerweise weisen diese Verbindungen die Struktur Aryl-(CH₂)_n-CONH-CHR²-BY¹Y² auf, wobei R² zum Beispiel wie oben beschrieben eine neutrale Seitenkette ist und n 0 oder 1 ist.
Im pharmazeutischen Bereich gibt es Patentliteratur, die Boronat-Inhibitoren von Serinproteasen beschreibt, zum Beispiel Thrombin, Faktor Xa, Kallikrein, Elastase, Plasmin und auch andere Serinproteasen, wie Prolyl-Endopeptidase und Ig AI Protease. Thrombin ist die letzte Protease in der Koagulationsabfolge und agiert, um vier kleine Peptide aus jedem Fibrinmolekül zu hydrolysieren und so die Schutzgruppen seiner Polymerisationsstellen zu entschützen. Einmal gebildet, können die linearen Fibrinpolymere durch Faktor XIIIa vernetzt werden, welcher selber durch Thrombin aktiviert wird. Darüber hinaus ist Thrombin ein wirksamer Aktivator von Blutplättchen, auf die es selber durch spezifische Rezeptoren einwirkt. Thrombin potenziert außerdem seine eigene Produktion durch die Aktivierung der Faktoren V und VIII.
Andere Aminoboronat- oder Peptidboronat-Inhibitoren oder Substrate von Serinproteasen werden in den folgenden Veröffentlichungen beschrieben:

• US 4935493
• EP 341661
• WO 94/25049
• WO 95/09859
• WO96/12499
• WO 96/20689
• Lee S-L et al, Biochemistry 36:13180-13186, 1997
• Dominguez, C. et al, Bioorg. Med. Chem. Lett. 7:79-84, 1997
• EP 471651
• WO 94/20526
• WO 95/20603
• WO 97/05161
• US 4450105
• US 5106948
• US 5169841 .

Peptidboronsäure-Inhibitioren der Hepatitis-C-Virusprotease werden in WO 01/02424 beschrieben.
Den Einsatz von α-Halogenboronsäureestern als Intermediate für die Synthese von unter anderem Aminoboronsäuren und ihrer Derivate bespricht Matteson D S Chem. Rev. 89: 1535- 1551, 1989. Matteson beschreibt den Einsatz von Pinacolboronsäureestern in der nicht-chiralen Synthese und den Einsatz von Pinandiolboronsäureestern für die chirale Kontrolle, einschließlich der Synthese von Amino- und Amidoboronsäureestern.
Contreras et al J. Organomet. Chem. 246: 213-217, 1983 beschreiben, wie die intramolekulare N→B-Koordination durch spektroskopische Untersuchungen von zyklischen Boronsäureestern bewiesen wurde, die durch Reaktion von Me₂CHCMe₂-BH₂ mit Diethanolaminen erhalten wurden.
Leider sind Organoboronsäuren in analytisch reiner Form ziemlich schwer erhältlich. So sind Alkylboronsäuren und ihre Boroxine häufig luftempfindlich. Korcek et al, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2:242, 1972 lehrt uns, dass Butylboronsäure in der Luft schnell oxidiert, um 1-Butanol und Borsäure zu erzeugen.
Viele Medikamente umfassen einen aktiven Anteil, der eine Carbonsäure ist. Zwischen Carbonsäuren und Boronsäuren besteht eine Anzahl von Unterschieden, deren Auswirkungen auf die Medikamentenverteilung, -stabilität und -transport (unter anderem) noch nicht untersucht worden sind. Ein Merkmal der dreiwertigen boronischen Verbindungen ist, dass das Boratom sp² hybridisiert ist, wodurch ein leeres 2p_z Orbital auf dem Boratom zurückbleibt. Ein Molekül des Typs BX₃ kann deshalb als ein Elektronenpaarakzeptor, oder Lewis-Säure, agieren. So kann es das leere 2p_z Orbital verwenden, um ein Paar nichtbindender Elektronen aus einer Lewis-Base aufzunehmen und eine kovalente Bindung zu bilden. BF₃ reagiert also mit Lewis-Basen so wie NH₃ und formt Säure-Base-Komplexe, in denen alle Atome eine mit Valenzelektronen gefüllte Schale aufweisen.
Borsäure kann demzufolge als Lewissäure agieren, OH- akzeptierend: B(OH)₃ + H₂O → B(OH)₄ ^– + H⁺
Außerdem sind Boronsäuren des Typs RB(OH)₂ zweibasig und haben zwei pKa's. Ein weiterer Unterscheidungspunkt bei Borverbindungen ist die ungewöhnlich kurze Länge der Bindungen zum Bor, wofür drei Faktoren verantwortlich sein könnten:

1. Formation von pπ-pπ-Bindungen;
2. Kovalent-ionische Resonanz;
3. Geringere Abstoßung zwischen nichtbindenden Elektronen.

Die angenommenen Gleichgewichte von Boron- und Carbonsäuren in wässrigem KOH werden unten gezeigt (ausschließlich der Formation von RBO₂ ^2–):
Synthese von Aminoboronat
Gemäß der bekannten Technik werden TRI 50c Ester mithilfe des folgenden Prozesses synthetisiert:
Das Produkt des obigen Schrittes wird dann mithilfe bekannter Verfahren zum Beispiel zu TRI 50b umgewandelt. Man siehe zum Beispiel Deadman J et al, J. Medicinal Chemistry 1995, 38, 1511-1522.
Thrombose
Der normale physiologische Zustand von Blut, in dem sich die Komponenten des Blutes in einem dynamischen Gleichgewicht befinden, heißt Hämostase. Wenn dieses Gleichgewicht gestört wird, zum Beispiel als Folge einer Verletzung eines Blutgefäßes, werden bestimmte biochemische Mechanismen ausgelöst, um, in diesem Beispiel, die Blutung mithilfe von Blutgerinnung (Koagulation) zu stoppen. Die Koagulation ist ein dynamischer und komplexer Prozess, bei dem proteolytische Enzyme wie zum Beispiel Thrombin eine Schlüsselrolle spielen. Blutkoagulation kann über zwei unterschiedliche Kaskaden der Zymogenaktivierung stattfinden, über den extrinsischen oder den intrinsischen Weg der Koagulationskaskade. Die letzte Protease auf jedem Weg ist Thrombin, das agiert, um vier kleine Peptide (zwei FpA und zwei FpB) aus jedem Fibrinogenmolekül zu hydrolysieren und so die Schutzgruppen seiner Polymerisationsstellen abzuspalten. Einmal gebildet, können die linearen Fibrinpolymere durch Faktor XIIIa vernetzt werden, der selbst durch Thrombin aktiviert wird. Außerdem ist Thrombin ein potenter Aktivator von Blutplättchen, auf die es an bestimmten Rezeptoren einwirkt. Die Aktivierung der Blutplättchen durch Thrombin führt zu einer Aggregation der Zellen und zur Sekretion zusätzlicher Faktoren, die das Entstehen eines hämostatischen Thrombus beschleunigen. Durch die Aktivierung der Faktoren V und VIII potenziert Thrombin außerdem seine eigene Produktion (siehe Hemker und Beguin in Jolles, et al., „Biology and Pathology of Platelet Vessel Wall Interactions", pp. 219-26 (1986), Crawford and Scrutton in: Bloom and Thomas, „Haemostasis and Thrombosis", pp. 47-77 (1987), Bevers, et al., Eur. J. Biochem. 122: 429-36, 1982, Mann, Trends Biochem. Sci. 12: 229-33, 1987).
Ein Thrombus kann als ein abnormales Produkt eines normalen Mechanismus betrachtet und als eine Masse oder Ablagerung definiert werden, die durch Blutbestandteile auf einer Oberfläche des kardiovaskulären Systems geformt wird, zum Beispiel dem Herz oder einem Blutgefäß. Eine Thrombose kann als der pathologische Zustand betrachtet werden, bei dem die falsche Aktivität des hämostatischen Mechanismus zu einer intravaskulären Thrombusformation führt.
Bei der Behandlung von Thrombosen wird häufig auf die Verwendung von Antiblutplättchen-Medikamenten (Inhibitoren der Blutplättchenaggregation) zurückgegriffen, um zukünftige Thrombogenese zu kontrollieren, und auf thrombolytische Wirkstoffe, um den neu geformten Thrombus zu lysieren, wobei jeder dieser Wirkstoffe oder beide zusammen in Verbindung oder Kombination mit Antikoagulanzien verwendet wird. Antikoagulanzien werden auch präventativ (prophylaktisch) zur Behandlung von Patienten verwendet, bei denen ein Thromboserisiko vermutet wird.
Derzeit sind die beiden wirksamsten Medikamentenklassen, die im klinischen Gebrauch als Antikoagulanzien verwendet werden, Heparine und Vitamin K-Antagonisten. Die Heparine sind unzureichend definierte Mischungen sulfatierter Polysaccharide, die sich an Antithrombin III binden und dessen Wirkung auf diese Art und Weise potenzieren. Antithrombin III ist ein natürlich vorkommender Inhibitor der aktivierten Gerinnungsfaktoren IXa, Xa, XIa, Thrombin und wahrscheinlich XIIa (siehe Jaques, Pharmacol. Rev. 31:99-166, 1980). Die Vitamin-K-Antagonisten, von denen Warfarin sicher das bekannteste Beispiel darstellt, agieren indirekt, indem sie die postribosomalen Karboxylierungen der vom Vitamin K abhängigen Koagulationsfaktoren II, VII, IX und X inhibieren (siehe Hirsch, Semin. Thromb. Hemostasis 12:1-11, 1986). Heparine und Vitamin-K-Antagonisten sind zwar wirksame Therapiemittel zur Behandlung von Thrombosen, weisen aber leider unerwünschte Nebenwirkungen wie Blutungen, Heparin-induzierte Thrombozytopenie (im Falle von Heparin) und starke Abweichungen von Patient zu Patient auf, was zu einer kleinen und unvorhersehbaren therapeutischen Sicherheitsmarge führt.
Von der Verwendung direkt agierender Inhibitoren von Thrombin und anderen Serinproteaseenzymen des Koagulationssystems erhofft man sich eine Minderung dieser Probleme. Zu diesem Zweck ist eine große Anzahl von Serinproteaseinhibitoren getestet worden, einschließlich Boro-Peptiden, d. h. Peptiden, die ein Boronsäure-Analog einer α-Aminosäure enthalten. Während direkt agierende Boronsäure-Thrombininhibitoren bereits früher in dieser Beschreibung erwähnt wurden, werden sie im folgenden Teil noch einmal genauer beschrieben.
Neutrale P1-Rest Boro-Peptid-Thrombininhibitoren
Claeson et al ( US 5574014 und andere) und Kakkar et al ( WO 92/07869 und Familienmitglieder einschließlich US 5648338 ) offenbaren lipophile Thrombininhibitoren mit einer neutralen (ungeladenen) C-terminalen (P1) Seitenkette, zum Beispiel einer Alkoxyalkyl-Seitenkette.
Die Claeson et al und Kakkar et al Patentfamilien offenbaren Boronatester, welche eine Aminosäuresequenz D-Phe-Pro-BoroMpg [(R)-Phe-Pro-BoroMpg] enthalten, die hochspezifische Inhibitoren von Thrombin darstellen. Von diesen Verbindungen sollte vor allem Cbz-(R)-Phe-Pro-BoroMpg-OPinacol (auch als TRI 50b bekannt) erwähnt werden. Die entsprechende freie Boronsäure ist als TRI 50c bekannt. Für weitere Informationen bezüglich TRI 50b und verwandten Verbindungen wird der Leser auf die folgenden Veröffentlichungen verwiesen:

• Elgendy S et al., in The Design of Synthetic Inhibitors of Thrombin, Claeson G et al Eds, Advances in Experimental Medicine, 340:173-178, 1993.
• Claeson G et al, Biochem J. 290:309-312, 1993.
• Tapparelli C et al, J Biol Chem, 268:4734-4741, 1993
• Claeson G, in The Design of Synthetic Inhibitors of Thrombin, Claeson G et al Eds, Advances in Experimental Medicine, 340:83-91, 1993
• Phillip et al., in The Design of Synthetic Inhibitors of Thrombin, Claeson G et al Eds, Advances in Experimental Medicine, 340:67-77, 1993.
• Tapparelli C et al, Trends Pharmacol. Sci. 14:366-376, 1993
• Claeson G, Blood Coagulation and Fibrinolysis 5:411-436, 1994
• Elgendy et al, Tetrahedron 50:3803-3812, 1994
• Deadman J et al, J. Enzyme Inhibition 9:29-41, 1995
• Deadman J et al, J. Medicinal Chemistry 38:1511-1522, 1995.

Ein Boronsäureanaloges zu TRI 50c, welches aber Dpa als die P3-Aminosäure und Morpholinocarbonyl als N-terminale Schutzgruppe hat, wird in Skordalakes et al, J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 9935-9936 erwähnt.
Die Tripeptid-Sequenz von TRI 50b weist drei Chiralitätszentren auf. Der Phe-Rest weist eine (R)-Konfiguration und der Pro-Rest eine natürliche (S)-Konfiguration auf, zumindest in Verbindungen mit kommerziell nützlicher Inhibitoraktivität; es wird angenommen, dass der Mpg-Rest in Isomeren mit kommerziell nützlicher Inhibitoraktivität eine (R)-Konfiguration aufweist. So wird angenommen, dass der aktive, oder aktivste TRI 50b Stereoisomer eine R,S,R-Konfiguration aufweist und wie folgt dargestellt werden kann:
(RSR)-TRI 50b: Cbz-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-boroMpg Pinacol
Viele Organoboronsäure-Verbindungen können als lipophil oder hydrophob klassifiziert werden. Zu diesen Verbindungen gehören meist unter anderem:

• Boro-Peptide, bei denen alle oder die Mehrzahl der Aminosäuren hydrophob ist
• Boro-Peptide, bei denen mindestens die Hälfte der Aminosäuren hydrophob ist und die einen hydrophoben N-terminalen Substituenten aufweisen (Aminoschutzgruppe)
• Nicht-Peptide, die auf hydrophoben Anteilen basieren.

HINWEISE ZUR BESCHREIBUNG
Diese Beschreibung, die unten in größerem Detail beschrieben wird, beschäftigt sich insbesondere mit verschiedenen Gegenständen, die sich auf neuartige Verbindungen und Zusammensetzungen beziehen. Aus praktischen Gründen wird in der Beschreibung manchmal (aber nicht immer) der Begriff „Neuartige Produkte" verwendet, um auf Produkte hinzuweisen, die diese neuartigen Verbindungen und Zusammensetzungen umfassen; der Begriff wird beispielsweise auch in Überschriften eingesetzt.
Die Gegenstände der Offenbarung schließen synthetische Verfahren ein, die in einem früheren Teil des Forschungs- und Entwicklungsprogramms, das sich mit diesen neuartigen Produkten beschäftigt, entwickelt wurden und die einen oder mehrere Verunreinigungen erzeugten und ansonsten als solches für die industrielle Verwendung ungeeignet waren. Der Begriff „Synthetische Verfahren I" wird manchmal (aber nicht immer) in der Beschreibung verwendet, um auf diese früheren Verfahren hinzuweisen; der Begriff wird zum Beispiel in Überschriften eingesetzt. Die Themenbereiche, die sich auf die Neuartigen Produkte beziehen, beinhalten auch verschiedene Aspekte später entwickelter synthetischer Techniken zur Herstellung der neuartigen Verbindungen (oder Intermediate dieser) und mithilfe dieser Techniken gewinnbare Produkte mit relativ hoher Reinheit; der Begriff „Synthetische Verfahren II" wird manchmal (aber nicht immer) in der Beschreibung verwendet, um auf solche späteren Verfahren hinzuweisen; der Begriff wird beispielsweise in Überschriften eingesetzt. Zumindest in gewisser Hinsicht stellen die Synthetischen Verfahren II eine Subklasse der Synthetischen Verfahren I dar. Die spezifischen Produkte der Synthetischen Verfahren II werden manchmal aus praktischen Gründen als „Hochreine Produkte" bezeichnet. Die Hochreinen Produkte sind eine Subklasse der Neuartigen Produkte.
Die Begriffe Neuartige Produkte, Synthetische Verfahren I, Synthetische Verfahren 11 und Hochreine Produkte werden lediglich aus rein praktischen Gründen verwendet und grenzen das Ausmaß der Erfindung auf keine Weise ein; diese beinhaltet alle Themenbereiche der Offenbarung, einschließlich aller Materialien, Spezies, Prozesse und Verwendungen dieser.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER OFFENBARUNG
Es ist entdeckt worden, dass TRI 50b Tendenz hat, zu hydrolysieren. Unter sauren Bedingungen, zum Beispiel während einer HPLC-Untersuchung, wird TRI 50b in die saure Form mit einer kurzen Halbwertszeit umgewandelt, was in wasserhaltigen parenteralen Präparationen auf eine potenzielle Hydrolyse in Spezies hinweist, die die freie Säure und ihre mit ihr im Gleichgewicht stehenden entsprechenden Boronat-Anionen umfassen, welche der Literatur zufolge einem Abbau durch Entboronisierung gegenüber (Kohlenstoff-Bor-Bindungsspaltung) über einen oxidativen Weg unstabil sind (siehe z. B. Wu et al, oben besprochen).
Die Instabilität von TRI 50b mit Hinblick auf Hydrolyse bedeutet außerdem potenzielle Nachteile sowohl bei der Präparation der Verbindung und ihrer Formulierung, als auch bei der Lagerung pharmazeutischer Formulierungen, die diese enthalten.
TRI 50c leidet außerdem unter Instabilität, da die problematische Tendenz besteht, dass sich der Boropeptid-Anteil selbst durch Entboronisierung (Kohlenstoff-Bor-Bindungsspaltung) abbaut, wobei eine solche Entboronisierung von der Literatur als oxidativ angesehen wird (z. B. Wu et al, oben besprochen). Der Grad des Abbaus kann erstaunlich hoch sein.
Die oben besprochenen Eigenschaften von TRI 50b und TRI 50c sind nicht auf solche Verbindungen beschränkt sondern werden auch anderen Boro-Peptid-Estern und -Säuren eigen sein, auch wenn die Eigenschaften solch anderer Boro-Peptide quantitativ unterschiedlich ausfallen können.
Die vorliegende Anmeldung ist abgeteilt aus der europäischen Patentanmeldung No.03255590.6 , welche Boronsäurederivate betrifft, die relativ stabil gegenüber Hydrolyse und Entboronisierung sind, und die nützlich sind in parenteralen Formulierungen zum Inhibieren von Thrombin, nämlich ein pharmazeutisch verträgliches Basenadditionssalz von bestimmten Organoboronwirkstoffen, besonders hydrophobe Boronpeptide (zum Beispiel di- oder tri-Peptide), und insbesondere Thrombin-Inhibitoren, die über eine nicht-basische P1-Gruppe verfügen. Als eine Klasse, stehen solche Salze nicht nur im Gegensatz zur Ausrichtung des Stands der Technik, sondern haben zusätzlich auch einen verbesserten Grad an Stabilität, der nicht auf Basis der bekannten Chemie erklärt oder vorhergesagt werden kann. Aufgenommen in die Offenbarung der europäischen Patentanmeldung No. 03255590.6 sind parenterale pharmazeutische Formulierungen, die ein pharmazeutisch verträgliches Basenadditionssalz einer Boronsäure enthalten, zum Beispiel der Formel (IIIa);
wobei:
X H (um NH₂ zu bilden) oder eine Aminoschutzgruppe ist;
aa¹ eine Aminosäure mit einer Kohlenwasserstoffreste-Seitenkette ist, die nicht mehr als 20 Kohlenstoffatome enthält und die mindestens eine zyklische Gruppe mit bis zu 13 Kohlenstoffatomen umfasst;
aa² eine Iminosäure mit 4 bis 6 Ringmitgliedern ist;
R¹ eine Gruppe der Formel -(CH₂)_S-Z ist, wobei Z -OMe oder -OEt ist und s 2, 3 oder 4 ist.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Boronsäuren, die nützlich sind zur Herstellung der oben beschriebenen Salze und Formulierungen, nämlich Boronsäuren der Formel (IIIa), die frei von jeder Verbindung sind, welche dieselbe Struktur aufweist, mit der Ausnahme eines Ersetzens der R¹-Gruppe durch eine Gruppe der Formel -(CH₂)_S-H.
Die Erfindung liegt auch in der Verwendung einer Säure der Formel (IIIa) zur Herstellung eines pharmazeutisch verträglichen Basenadditionssalzes davon, durch Inkontaktbringen der Verbindung mit einer Base, die in der Lage ist, solch ein Salz zu bilden.
In einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen einer pharmazeutischen Formulierung, umfassend das Inkontaktbringen einer Verbindung der Formel (IIIa) mit einer Base, die in der Lage ist, ein Salz davon zu bilden, und das Formulieren des resultierenden Produktes in eine pharmazeutische Formulierung
In der Literatur wird diskutiert, ob Boronate in wässriger Lösung die „trigonale" B(OH)₂ oder die „tetraedische" B(OH)₃ ^– Borspezies formen, doch NMR-Daten scheinen darauf hinzuweisen, dass bei einem pH-Wert unter dem ersten pKa der Boronsäure die am meisten vorliegende Borspezies das neutrale B(OH)₂ ist. Im Duodenum liegt der pH-Wert vermutlich zwischen 6 und 7, so dass es wahrscheinlich erscheint, dass die trigonale Spezies hier vorherrschen wird. In jedem Fall beinhaltet das Symbol -B(OH)₂ sowohl tetraedische als auch trigonale Borspezies und im Laufe dieser Beschreibung schließen Symbole trigonaler Borspezies auch tetraedische Spezies ein. Das Symbol kann außerdem boronische-Gruppen in anhydrider Form beinhalten.
Die hierin beschriebenen Salze beinhalten Produkte, die durch eine Reaktion der Boronsäure mit einer starken Base gewonnen werden können (und die Charakteristika eines Produkts aufweisen, das durch eine solche Reaktion gewonnen wurde) und der hierin verwendete Begriff „Salz" sollte dementsprechend verstanden werden. Der Begriff „Salz" mit Bezug auf die offenbarten Produkte bedeutet deshalb nicht unbedingt, dass die Produkte einzelne Kationen und Anionen enthalten und sollte so verstanden werden, dass er Produkte einschließt, die mithilfe einer Reaktion einer Boronsäure und einer Base gewonnen werden können. Die Offenbarung schließt Produkte ein, die in größerem oder kleinerem Ausmaß die Form einer Koordinationsverbindung annehmen. Die Offenbarung stellt demnach außerdem Produkte bereit, die durch eine Reaktion einer Boronsäure (I) mit einer starken Base gewonnen werden können (und die Charakteristika eines Produkts aufweisen, das durch eine solche Reaktion gewonnen wurde), und die therapeutische, einschließlich prophylaktische, Verwendung solcher Produkte.
Die vorliegende Offenbarung ist nicht begrenzt, was das Herstellungsverfahren der Salze angeht, vorausgesetzt, dass die Salze eine Boronat-Spezies enthalten, die von Boronsäure (I) und einem Gegenion deriviert ist. Solche Boronat-Spezies können Boronat-Anionen in einer beliebigen Gleichgewichtsform dieser sein. Der Begriff „Gleichgewichtsform" bezieht sich auf unterschiedliche Formen derselben Verbindungen, die in einer Gleichgewichtsgleichung (z. B. Boronsäure im Gleichgewicht mit einem Boronsäure-Anhydrid und im Gleichgewicht mit verschiedenen Boronat-Ionen) dargestellt werden können. Boronate in der Festphase können Anhydride formen und wenn sich die offenbarten Boronat-Salze in der Festphase befinden, können diese Boronat-Anhydride als eine Boronische-Gleichgewichtsspezies umfassen. Es ist nicht notwendig, dass die Salze durch die Reaktion einer das Gegenion enthaltenden Base und der Boronsäure (I) präpariert werden. Ferner beinhaltet die Offenbarung Salzprodukte, die als durch eine solche Säure/Base-Reaktion indirekt präpariert angesehen werden können und Salze, die durch eine solche indirekte Präparation gewonnen werden können (und die Charakteristika von Produkten aufweisen, die durch eine solche Reaktion gewonnen wurden). Beispiele dieser möglichen indirekten Präparation sind beispielsweise Prozesse, bei denen nach einer ersten Rückgewinnung des Salzes dieses gereinigt und/oder behandelt wird, um seine physiochemischen Eigenschaften zu modifizieren, zum Beispiel um die feste Form oder Hydratform oder beide zu modifizieren.
In einigen Ausführungsformen sind die Kationen der Salze monovalent.
In einigen Ausführungsformen umfassen die Salze anhydride Spezies; in anderen sind sie im Wesentlichen frei von anhydriden Spezies.
Weitere Aspekte und Ausführungsformen der Offenbarung werden in der folgenden Beschreibung und den Ansprüchen vorgestellt. Als solches ebenfalls aufgenommen sind die Salze, die hier beschrieben werden.
Die im Laufe dieser Beschreibung und Ansprüche verwendeten Worte „umfassen" und „enthalten" und Variationen dieser Worte, zum Beispiel „umfassend" oder „umfasst", bedeuten „einschließlich aber nicht auf diese begrenzt" und sollen und dürfen keine anderen Anteile, Zusatzstoffe, Komponenten, Ganzzahlen oder Schritte ausschließen.
Dieses Patent enthält Daten, die darauf hinweisen, dass die Stabilität (Resistenz der Entboronisierung gegenüber) von Organoboronsäuren gesteigert werden kann, indem sie in Form von Salzen, z. B. Metallsalzen bereitgestellt werden. In einzelnen Experimenten schien sich das Ammoniumsalz von TRI 50c bei der Trocknung zu zersetzen, um Ammoniak zu ergeben, während sich das Cholinsalz schnell in eine entboronisierte Verunreinigung zersetzte. Obwohl keine Experimente durchgeführt wurden, um diese einmaligen Beobachtungen zu reproduzieren, wird eine Subklasse bereitgestellt, aus der die Ammonium- und Cholinsalze ausgeschlossen sind. Das Salz kann ein saures Salz sein. In jedem Fall formt diese Stabilisierungstechnik Teil der Offenbarung und ist inter alia auf Organoboronsäuren anwendbar, wie sie unter der Überschrift „HINTERGRUND" beschrieben werden und auf Organoboronsäuren, die in den unter dieser Überschrift erwähnten Publikationen beschrieben werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Diagramm, auf welches in Beispiel 35 Bezug genommen wird und das die Ergebnisse einer amidolytischen Thrombinuntersuchung von TRI 1405 (TRI 50c Magnesiumsalz) und TRI 50b zeigt, wobei Vmax die maximale Reaktionsgeschwindigkeit darstellt, die durch die amidolytische Untersuchung gemessen wird.
2 ist eine graphische Darstellung, auf welche in Beispiel 39 Bezug genommen wird und die die Clearance und Kinetik während der intravenösen Phase nach einer einzelnen Dose von TRI 50b oder TRI 50c zeigt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG MEHRERER BEISPIELE
Glossar
In dieser Beschreibung werden die folgenden Begriffe und Abkürzungen verwendet:
Der Ausdruck „saures Salz", wie er für ein Salz einer Boronsäure verwendet wird, bezieht sich auf Salze, bei denen eine einzelne -OH-Gruppe der trigonal dargestellten Säuregruppe -B(OH)₂ deprotoniert ist. Demzufolge sind Salze, in denen die Boronsäure-Gruppe eine einzelne negative Ladung trägt und durch B(OH)(O^–) oder als [-B(OH)₃]^– dargestellt werden kann, saure Salze. Der Ausdruck umfasst Salze eines Kations mit einer Valenz n, wobei das molare Verhältnis von Boronsäure zu Kation ungefähr bei n zu 1 liegt. Aus praktischer Sicht ist es unwahrscheinlich, dass die beobachtete Stöchiometrie genau bei n:1 liegt; sie wird jedoch mit einer fiktiven n:1 Stöchiometrie im Einklang stehen. Die beobachtete Masse des Kations kann von der berechneten Masse für eine n:1 Stöchiometrie um nicht mehr als 10% abweichen, z. B. nicht mehr als 7,5%; in einigen Fällen kann die beobachtete Masse eines Kations von der berechneten Masse um nicht mehr als ungefähr 1% abweichen. Berechnete Massen basieren angemessenerweise auf der trigonalen Form der Boronsäure. (Auf atomarer Ebene kann ein Salz, das stöchiometrisch einem sauren Salz entspricht, Boronsäuren in einer Mischung von Protonierungszuständen enthalten, deren Durchschnitt dem einer einfachen Deprotonierung nahe kommt; solche „gemischten" Salze sind im Begriff „saures Salz" inbegriffen.) Beispiele für saure Salze sind Mononatriumsalze und Hemicalcium-Salze.
α-Aminoboronsäure oder Boro(aa) bezieht sich auf eine Aminosäure, in der die CO₂-Gruppe durch BO₂ ersetzt wurde.
Der Begriff „Aminogruppe schützender Anteil" bezieht sich auf eine Gruppe, die zur Derivatisierung einer Aminogruppe verwendet wird, vor allem eine N-terminale Aminogruppe eines Peptids oder einer Aminosäure. Solche Gruppen beinhalten ohne Begrenzung Alkyl-, Acyl-, Alkoxycarbonyl-, Aminocarbonyl- und Sulfonyl-Anteile. Der Begriff „Aminogruppe schützender Anteil" soll jedoch nicht auf jene speziellen Schutzgruppen begrenzt sein, die häufig bei organischer Synthese eingesetzt werden und soll auch nicht auf Gruppen begrenzt sein, die einfach zu spalten sind.
Die Phrase „pharmazeutisch verträglich" wird hierin benutzt, um auf jene Verbindungen, Materialien, Zusammensetzungen und/oder Dosierungsformen Bezug zu nehmen, die im Rahmen einer begründeten medizinischen Beurteilung für die Verwendung im Kontakt mit menschlichem oder tierischem Gewebe geeignet sind und nicht mit exzessiver Giftigkeit, Reizungen, allergischen Reaktionen oder anderen Problemen oder Komplikationen einhergehen, und gleichzeitig ein annehmbares Nutzen/Risiko-Verhältnis aufweisen.
Der Ausdruck „Thrombininhibitor" bezieht sich auf ein Produkt, das innerhalb des Rahmens einer begründeten pharmakologischen Beurteilung potenziell oder tatsächlich pharmazeutisch als ein Inhibitor von Thrombin nützlich ist und beinhaltet Bezüge auf eine Substanz, die eine pharmazeutisch aktive Spezies umfasst und als ein Thrombininhibitor beschrieben, gefördert oder autorisiert wird. Solche Thrombininhibitoren können selektiv sein, was bedeutet, dass sie innerhalb des Rahmens einer begründeten pharmakologischen Beurteilung Thrombin im Gegensatz zu anderen Proteasen gegenüber selektiv sind; der Begriff „selektiver Thrombininhibitor" beinhaltet Bezüge auf eine Substanz, die eine pharmazeutisch aktive Spezies umfasst und als ein selektiver Thrombininhibitor beschrieben, gefördert oder autorisiert wird.
Der Begriff „Heteroaryl" bezieht sich auf ein Ringsystem mit mindestens einem (z. B. 1, 2 oder 3) im Ring enthaltenen Heteroatom, das ein konjugiertes im Ring enthaltenes Doppelbindungssystem aufweist. Der Begriff „Heteroatom" beinhaltet Sauerstoff, Schwefel und Stickstoff, wobei Schwefel manchmal weniger bevorzugt wird.
„Natürliche Aminosäure" bedeutet eine L-Aminosäure (oder ein Rest davon), die aus der folgenden Gruppe neutraler (hydrophober oder polarer), positiv geladener oder negativ geladener Aminosäuren ausgewählt wird:
Hydrophobe Aminosäuren

A = Ala = Alanin
V = Val = Valin
I = Ile = Isoleucin
L = Leu = Leucin
M = Met = Methionin
F = Phe = Phenylalanin
P = Pro = Prolin
W = Trp = Tryptophan

Polare (neutrale oder ungeladene) Aminosäuren

N = Asn = Asparagin
C = Cys = Cystein
Q = Gln = Glutamin
G = Gly = Glycin
S = Ser = Serin
T = Thr = Threonin
Y = Tyr = Tyrosin

Positiv geladene (basische) Aminosäuren

R = Arg = Arginin
H = His = Histidin
K = Lys = Lysin

Negativ geladene Aminosäuren

D = Asp = Asparaginsäure
E = Glu = Glutaminsäure
ACN = Acetonitril
Aminosäure = α-Aminosäure
Cbz = Benzyloxycarbonyl
Cha = Cyclohexylalanin (eine hydrophobe unnatürliche Aminosäure)
Dcha = Dicyclohexylalanin (eine hydrophobe unnatürliche Aminosäure)
Dpa = Diphenylalanin (eine hydrophobe unnatürliche Aminosäure)
Geladen (wie für Medikamente oder Fragmente von Medikamentmolekülen verwendet, z. B. Aminosäurereste) = eine Ladung bei physiologischem pH-Wert tragend, wie im Falle einer Amino-, Amidino- oder Carboxygruppe.
i.v. = intravenös
Mpg = 3-Methoxypropylglycin (eine hydrophobe unnatürliche Aminosäure)
Medikament = eine pharmazeutisch nützliche Substanz, sowohl das aktive in vivo Prinzip oder ein Promedikament
Multivalent = Valenz von mindestens zwei, zum Beispiel zwei oder drei Neutral (wie auf Medikamente oder Fragmente von Medikamentmolekülen angewandt, z. B. Aminosäurereste) = ungeladen = keine Ladung bei physiologischem pH-Wert tragend
Pinac = Pinacol = 2,3-Dimetyl-2,3-Butandiol
Pinandiol = 2,3-Pinandiol = 2,6,6-Trimethylbicyclo[3.1.1]Heptan-2,3-Diol
Pip = Pipecolinsäure
Raumtemperatur = 25°C ± 2°C
s.c. = subkutan

Salz nach Zusatz einer Base = ein Salz, das durch Zusatz einer anorganischen Base oder einer organischen Base zu einer freien Säure (in diesem Fall der Boronsäure) präpariert wird. Starke Base = eine Base mit einem genügend hohem pKb, um mit einer Boronsäure reagieren zu können Solche Basen sollten einen pKb von 7 oder mehr, z. B. 7,5 oder mehr, zum Beispiel ungefähr 8 oder mehr aufweisen

THF = Tetrahydrofuran
Thr = Thrombin

Neuartige Produkte – Die Verbindungen
In allgemeinen Worten umfassen die Produkte der Erfindung Boronsäuren, die einen neutralen Aminoboronsäurerest aufweisen, der in der Lage ist, an die Thrombin S1-Subsite zu binden, die durch eine Peptidbindung an eine hydrophobe Einheit gebunden ist, die in der Lage ist, an die Thrombin S2- und S3-Subsites zu binden.
Die Offenbarung bezieht sich daher auf Boronsäuren, die Thrombin-Inhibitoren sind, insbesondere selektive Thrombin-Inhibitoren, die eine neutrale P1-(S1-Bindungs)-Einheit besitzen. Für weitere Informationen über Einheiten, die an die S3-, S2- und S1-Stellen von Thrombin binden, siehe zum Beispiel Tapparelli C et al, Trends Pharmacol. Sci. 14: 366-376, 1993; Sanderson P et al, Current Medicinal Chemistry, 5: 289-304, 1998; Rewinkel J et al, Current Phamaceutical Design, 5: 1043-1075, 1999; and Coburn C Exp. Opin. Ther. Patents 11(5): 721-738, 2001. Die Thrombin inhibierenden Säuren der Offenbarung sind nicht beschränkt auf solche, die S3-, S2- und S1-Affinitätsgruppen haben, wie sie in den Veröffentlichungen beschrieben sind, die in dem voran stehenden Satz aufgelistet sind.
Die Boronsäuren können für Thrombin einen Ki von ungefähr 100 nM oder weniger aufweisen, z. B. ungefähr 20 nM oder weniger.
Insbesondere entsprechen die Boronsäuren der Formel (IIIa):
Wie bereits erwähnt, ist R¹ eine Gruppe der Formel -(CH₂)_S-Z worin Z -OMe oder -OEt und s 2, 3 oder 4 ist, und die Verbindung frei von jeder Verbindung ist, welche dieselbe Struktur aufweist, mit der Ausnahme eines Ersetzens der R¹-Gruppe durch eine Gruppe der Formel -(CH₂)_S-H.
X ist ein Anteil, der an die N-terminale Aminogruppe gebunden ist und kann H sein, um NH₂ zu bilden. Die Identität von X ist nicht entscheidend, kann aber ein bestimmter Anteil X wie oben beschrieben sein. In einem Beispiel kann Benzyloxycarbonyl erwähnt werden.
In bestimmten Beispielen ist X R⁶-(CH₂)_p-C(O)-, R⁶-(CH₂)_p-S(O)₂-, R⁶-(CH₂)_p-NH-C(O)- oder R⁶-(CH₂)_p-O-C(O)-, wobei p 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 ist (wovon 0 und 1 bevorzugt werden) und R⁶ ist H oder eine 5- bis 13-gliedrige zyklische Gruppe, die optional durch 1, 2 oder 3 Substituenten substituiert werden kann, die aus Halogen, Amino, Nitro, Hydroxy, einer zyklischen C₅-C₆-Gruppe, C₁-C₄-Alkyl, oder C₁-C₄-Alkyl, das entweder ein in der Kette enthaltenes O enthält und/oder durch dieses mit der 5- bis 13-gliedrigen zyklischen Gruppe verknüpft ist, ausgewählt werden, wobei die erwähnten Alkylgruppen optional durch einen Substituenten substituiert werden können, der aus Halogen, Amino, Nitro, Hydroxy und einer zyklischen C₅-C₆-Gruppe ausgewählt werden kann. Genauer gesagt ist X R⁶-(CH₂)_p-C(O)- oder R⁶-(CH₂)_p-O-C(O)- und p 0 oder 1. Die besagte 5- bis 13-gliedrige zyklische Gruppe ist häufig aromatisch oder heteroaromatisch, zum Beispiel eine 6-gliedrige aromatische oder heteroaromatische Gruppe. In vielen Fällen ist die Gruppe nicht substituiert.
Beispielgruppen für X sind (2-Pyrazin) Carbonyl, (2-Pyrazin) Sulfonyl und insbesondere Benzyloxycarbonyl.
aa¹ ist ein Aminosäurerest, der eine Hydrocarbyl-Seitenkette mit nicht weniger als 20 Kohlenstoffatomen (z. B. bis zu 15 und optional bis zu 13 C-Atomen) aufweist und mindestens eine zyklische Gruppe umfasst, die bis zu 13 Kohlenstoffatome aufweist. In bestimmten Beispielen haben/hat die zyklische/n Gruppe/n von aa¹ 5 oder 6 Ringglieder. Die zyklische/n Gruppe/n von aa¹ kann/können Arylgruppen und insbesondere Phenyl sein. Typischerweise gibt es in der aa¹ Seitenkette eine oder zwei zyklische Gruppen. Bestimmte Seitenketten umfassen oder bestehen aus Methyl, das durch eine oder zwei 5- oder 6-gliedrige Ringe substituiert worden ist.
Genauer gesagt ist aa¹ Phe, Dpa oder ein ganz oder teilweise hydrogenisiertes Analog dieser. Die ganz hydrogenisierten Analoge sind Cha und Dcha.
aa² ist ein Iminosäurerest mit zwischen 4 und 6 Ringgliedern.
Eine beispielhafte Klasse von Produkten umfasst jene, in denen aa² ein Rest einer Iminosäure mit der Formel (IV) ist
wobei R¹¹ -CH₂-, CH₂-CH₂-, -S-CH₂- oder -CH₂-CH₂-CH₂- ist, wobei die Gruppe, wenn der Ring 5- oder 6-gliedrig ist, optional an einer oder mehreren -CH₂-Gruppen durch 1 bis 3 C₁-C₃-Alkylgruppen substituiert wird, zum Beispiel, um die R¹¹-Gruppe -S-C(CH₃)₂- zu bilden. Von diesen Iminosäuren sind Azetidin-2-Carbonsäure, besonders (S)-Azetidin-2-Carbonsäure und ganz speziell Prolin veranschaulichend.
Obigem kann entnommen werden, dass eine besonders bevorzugte Klasse von Produkten aus jenen besteht, in denen aa¹-aa² Phe-Pro ist. In einer weiteren bevorzugten Klasse ist aa¹-aa² Dpa-Pro. In anderen Produkten ist aa¹-aa² Cha-Pro oder Dcha-Pro. Natürlich sind auch die entsprechenden Produktklassen beinhaltet, in denen Pro durch (s)-Azetidin-2-Carbonsäure ersetzt wird.
R¹ entspricht der Formel -(CH₂)_s-Z. Die Ganzzahl s ist 2, 3 oder 4 und W ist -OMe und -OEt, besonders -OMe. In bestimmten Beispielen ist s für alle Z-Gruppen und in der Tat für alle Verbindungen der Offenbarung 3. Particular R¹ groups are 2-bromoethyl, 2-chloroethyl, 2-methoxyethyl, 4-bromobutyl, 4-chlorobutyl, 4-methoxybutyl und, especially, 3-bromopropyl, 3-chloropropyl and 3-methoxypropyl. Am Bevorzugtesten ist R¹ 3-Methoxypropyl. 2-Ethoxyethyl ist eine weitere bevorzugte R¹-Gruppe.
Die Säure der Formel (IIIa) ist frei von der analogen Verbindung, in der R¹ -(CH₂)_S-H ist.
Eine spezifische Klasse von Säuren hat die Formel X-Phe-Pro-Mpg-B(OH)₂, besonders Cbz-Phe-Pro-Mpg-B(OH)₂; auch aufgenommen sind die Analoga dieser Verbindungen, in welchen Mpg ersetzt ist durch einen Rest mit einer anderen der R¹-Gruppen und/oder Phe durch Dpa oder einen anderen aa¹-Rest ersetzt ist.
Der aa¹-Anteil weist R-Konfiguration auf. Der aa²-Anteil weist (S)-Konfiguration auf. Das Chiralitätszentrum NH-CH(R¹)-B- weist eine (R)-Konfiguration auf, wie zum Beispiel im Falle von Cbz-Phe-Pro-BoroMpg-OH:
Cbz-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-boroMpg-OH
Die Boronsäure kann genutzt werden, um pharmazeutisch verträgliche Bassenadditionsalze davon herzustellen, durch Inkontaktbringen der Säure mit einer geeigneten Base.
Allgemein ausgedrückt können die hierin beschriebenen Salze als Entsprechungen von Reaktionsprodukten einer oben beschriebenen Organoboronsäure mit einer starken Base gesehen werden, z. B. einer basischen Metallverbindung; die Salze sind jedoch nicht auf Produkte begrenzt, die aus einer solchen Reaktion resultieren und können auch auf anderem Wege gewonnen werden.
Die Salze können deshalb durch die Berührung einer Säure der Erfindung mit einer starken Base gewonnen werden. Die Offenbarung beschäftigt sich also mit dem Einsatz von Säuren um Produkte herzustellen (Zusammensetzungen von Stoffen), die die Charakteristika eines Reaktionsprodukts einer Säure der Erfindung und einer starken Base aufweisen. Die Base ist pharmazeutisch verträglich.
Als geeignete Salze können Metallsalze, z. B. monovalente oder zweiwertige Metalle und stärkere organische Basen erwähnt werden, zum Beispiel:

1. Alkalimetallsalze;
2. Zweiwertige Salze, z. B. Erdalkalimetallsalze;
3. Metalle der Gruppe III;
4. Salze von stark basischen, organischen, stickstoffhaltigen Verbindungen, einschließlich:
4A. Salze von Guanidinen und ihren Analogen;
4B. Salze von stark basischem Amin, beispielsweise (i) Aminozucker und (ii) andere Amine.

Von den obigen Salzen sind besonders Alkalimetalle und vor allem Na und Li veranschaulichend. Ebenfalls veranschaulichend sind Aminozucker.
Spezifische Salze sind die des Boronats, auch wenn die sauren Salze in Wirklichkeit einen proportionell sehr kleinen Teil des doppelt deprotonierten Boronats enthalten. Der Begriff „saures Boronat" bezieht sich auf trigonale -B(OH)₂-Gruppen, in denen eine der B-OH-Gruppen sowohl zu entsprechenden tetraedischen Gruppen deprotoniert ist als auch mit diesen im Gleichgewicht steht. Saure Boronate weisen eine Stöchiometrie auf, die mit einfacher Deprotonierung im Einklang steht.
Die Offenbarung beinhaltet deshalb Produkte (Zusammensetzungen von Stoffen), die Salze umfassen, welche durch die Formel (V) dargestellt werden können:
wobei Yⁿ⁺ ein pharmazeutisch verträgliches Kation ist, das aus einer starken Base gewonnen werden kann und aa¹, aa², X und R¹ wie oben definiert sind, die Salze, die natürlich frei sind von analogen Salzen, in denen R¹ -(CH₂)_S-H ist.
Eine Klasse von Salzen weist eine Löslichkeit von ungefähr 10 mM oder mehr auf, z. B. mindestens 20 mM, wenn ihre Löslichkeit wie in den Beispielen beschrieben durch eine Auflösung von 25 mg/ml bestimmt wird. Noch genauer weisen sie eine Löslichkeit von mindestens 50 mM auf, wenn ihre Löslichkeit wie in den Beispielen beschrieben durch eine Auflösung von 50 mg/ml bestimmt wird.
Die Säuren können verwendet werden, um Salze der Boronsäuren herzustellen, die eine beobachtete Stöchiometrie aufweisen, die damit übereinstimmt, dass das Salz die Formel „(Boronsäure^–)_n Kationⁿ⁺" aufweist (oder duch diese dargestellt werden kann). Eine Klasse von Salzen wird durch die folgende Formel dargestellt: [Cbz-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-Mpg-B(OH)(O^–)]M⁺ wobei M⁺ ein monovalentes Kation darstellt, insbesondere ein Alkalimetallkation. Es sollte deutlich sein, dass die obige Darstellung eine fiktive Darstellung eines Produkts ist, dessen beobachtete Stöchiometrie wahrscheinlich nicht tatsächlich und genau 1:1 sein wird. In jedem Fall ist ein besonderes Salz das Mononatriumsalz (TGN 255) der Formel Cbz-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-Mpg-B(OH)₂. In der obigen Formel stellt das trigonal dargestellte Boronat wie immer Boronate dar, die trigonal, tetraedisch oder gemischt trigonal/tetraedisch sind.
Besonders beispielhaft sind Produkte, die folgendes umfassen:

(i) Spezies, die aus (a) Säuren mit der Formel (VIII) ausgewählt werden: X-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-Mpg-B(OH)₂ wobei X H oder eine Aminoschutzgruppe ist, besonders Cbz, (b) Boronat-Anionen hiervon, und (c) eine Gleichgewichtsform des vorherigen ist (z. B. ein Anhydrid); und
(ii) Ionen, die eine Valenz n in Kombination mit der genannten Spezies aufweisen, wobei die Spezies und genannten Ionen eine beobachtete Stöchiometrie aufweisen, die mit einer fiktiven Spezies:Ion Stöchiometrie von n:1 übereinstimmt. In einer Klasse von Salzen ist n 1.

Die Gegenionen werden wiederum unten betrachtet. In jedem Fall ist das beschriebene Salz frei vom analogen, in welchem R¹ eher -(CH₂)S-H als -(CH₂)_S-Z ist.
1. Monovalente Metall-, insbesondere Alkalimetallsalze
Zu den geeigneten Alkalimetallen gehören Lithium, Natrium und Kalium. Diese sind alle erstaunlich löslich. Lithium und Natrium sind aufgrund ihrer hohen Löslichkeit besonders veranschaulichend. Die Lithium- und vor allem Natriumsalze weisen im Vergleich zu unter anderem Kalium eine erstaunlich hohe Löslichkeit auf. Natrium wird in vielen Fällen am meisten verwendet. Die Offenbarung befasst sich außerdem mit Salzen, die Mischungen von Alkalimetallen enthalten.
Zu erwähnen sind Salze der Formel (VI)
wobei M⁺ ein Alkalimetallion und aa¹, aa², X und R¹ wie oben definiert sind, und Salze, in denen beide Hydroxygruppen der Boronatgruppe in Salzform auftreten (vorzugsweise mit einer anderen identischen M⁺-Gruppe) und Mischungen solcher Salze.
2. Zweiwertige Salze, z. B. Erdalkalimetallsalze (Metalle der Gruppe II);
Ein Beispiel eines zweiwertigen Metalls ist Calcium. Ein weiteres geeignetes zweiwertiges Metall ist Magnesium. Ebenfalls in Betracht gezogen wird Zink. Die zweiwertigen Metalle werden normalerweise in einem Boronsäure:Metall-Verhältnis von 2:1 verwendet, um den bevorzugten monovalenten Boronat-Anteil zu erzielen. Salze, die Mischungen zweiwertiger Metalle enthalten, z. B. Mischungen von Erdalkalimetallen, werden ebenfalls in Betracht gezogen.
Zu erwähnen sind Salze, die durch die Formel (VII) dargestellt werden können:
wobei M²⁺ ein zweiwertiges Metallkation ist, z. B. ein Erdalkalimetall- oder Zinkkation und aa¹, aa², X und R¹ wie oben definiert sind, und auch Salze, in denen beide Hydroxygruppen der Boronat-Gruppe deprotoniert sind und Mischungen solcher Salze. Wie zuvor erwähnt kann das Boronat eine tetraedrische Spezies umfassen.
3. Metalle der Gruppe III
Zu den geeigneten Metallen der Gruppe III gehören Aluminium und Gallium. Salze, die Mischungen von Metallen der Gruppe III enthalten, werden ebenfalls in Betracht gezogen.
Zu erwähnen sind Salze mit der Formel (VIII):
wobei M³⁺ ein Metallion der Gruppe III ist und aa¹, aa², X und R¹ wie oben definiert sind, und auch Salze, in denen beide Hydroxygruppen der Boronatgruppe in Salzform und als Mischungen solcher Salze auftreten. Wie zuvor erwähnt kann das Boronsat eine tetraedische Spezies umfassen.
4. Stark basische, organische, stickstoffhaltige Verbindungen
Eine wie oben definierte Peptidboronsäure kann mit einer einer starken, organischen Base in Kontakt gebracht werden. Zwei veranschaulichende Klassen organischer Basen werden in Abschnitten 4A und 4B unten beschrieben. Besonders bevorzugt als Produkte werden saure Salze (in denen eine der zwei -OH-Gruppen des Bors deprotoniert ist). Am Häufigsten enthalten die Salz eine einzige Art von organischem Gegenion (wobei Spuren von Schadstoffen außer Acht gelassen werden), doch die Offenbarung beschäftigt sich mit Salzen, die Mischungen von organischen Gegenionen enthalten; in einer Subklasse fallen alle verschiedenen Gegenion unter die in Abschnitt 4A unten beschriebene Familie oder gegebenenfalls unter die in Abschnitt 2B beschriebene Familie; in einer weiteren Subklasse umfassen die Salze eine Mischung von organischen Gegenionen, die nicht alle aus derselben Familie stammen (4A oder 4B).
Zu den geeigneten organischen Basen gehören jene mit einem pKb von 7 oder mehr, z. B. 7,5 oder mehr, zum Beispiel um 8 herum liegend oder mehr. Basen, die weniger lipophil sind [z. B. mindestens eine polare funktionelle Gruppe (z. B. 1, 2 oder 3 solche Gruppen) zum Beispiel Hydroxy aufweisen] werden bevorzugt; deshalb gehören Aminozucker zu einer der bevorzugten Klassen von Basen.
4A. Guanidine und ihre Analoge
Die Guanidino-Verbindung (Guanidin) kann prinzipiell irgendeine lösliche und pharmazeutisch verträgliche Verbindung mit einem Guanidino oder einer substituierten Guanidino-Gruppe, oder einem substituierten oder unsubstituierten Guanidinanalog sein. Zu den geeigneten Substituenten gehören Aryl (z. B. Phenyl), Alkyl oder Alkyl, das durch eine Ether- oder Thioetherbindung unterbrochen ist, und enthalten in jedem Fall typischerweise zwischen 1 und 6 und insbesondere 1, 2, 3 oder 4 Kohlenstoffatome, wie im Falle von Methyl oder Ethyl. Die Guanidino-Gruppe kann 1, 2, 3 oder 4 Substituentengruppen aufweisen, hat aber normalerweise 1 oder 2 Substituentengruppen, zum Beispiel auf einem terminalen Stickstoff. Eine Klasse von Guanidinen ist monoalkyliert; eine andere Klasse ist dialkyliert. Von den Guanidin-Analogen sollten Thioguanidine und 2-Amino-Pyridine erwähnt werden. Verbindungen, die unsubstituierte Guanidino-Gruppen aufweisen, zum Beispiel Guanidin und Arginin, bilden eine besondere Klasse.
Die Offenbarung befasst sich außerdem mit Salzen, die Mischungen von Guanidinen enthalten.
Eine besondere Guanidino-Verbindung ist L-Arginin oder ein L-Arginin-Analog, zum Beispiel D-Arginin oder die D- oder vorzugsweise L-Isomere von Homoarginin oder Agmatin [(4-Aminobutyl) Guanidin]. Weniger bevorzugte Argininanaloge sind zum Beispiel NG-Nitro-L-Arginin Methylester und erzwungene Guanidin-Analoge, insbesondere 2-Amino-Pyrimidine, zum Beispiel 2,6-Quinazolindiamine wie beispielsweise 5,6,7,8-Tetrahydro-2,6-Quinazolindiamin. Die Guanidino-Verbindung kann auch ein Peptid, zum Beispiel ein Dipeptid sein, das Arginin enthält; ein solches Peptid ist L-Tyrosyl-L-Arginin.
Einige spezifische Guanidino-Verbindungen sind Verbindungen mit der Formel (VII):
wobei n zwischen 1 und 6 liegt und zum Beispiel mindestens 2, z. B. 3 oder mehr ist und in vielen Fällen nicht mehr als 5. Noch genauer ist n 3, 4 oder 5. R² ist H oder Carboxylat oder deriviertes Carboxylat, zum Beispiel um einen Ester zu bilden (z. B. einen C₁-C₄-Alkylester) oder Amid. R³ ist H, C₁-C₄-Alkyl oder ein Rest einer natürlichen oder unnatürlichen Aminosäure (z. B. Tyrosin). Die Verbindungen mit der Formel (IV) weisen normalerweise eine L-Konfiguration auf. Die Verbindungen mit der Formel (IV) sind Arginin (n = 3; R² = Carboxyl; R³ = H) und Arginin-Derivate oder -Analoge.
Zu erwähnen sind Salze der Formel (IX)
wobei aa¹, aa², X und R¹ wie zuvor definiert sind und G⁺ die protonierte Form einer pharmazeutisch verträglichen organischen Verbindung ist, die eine Guanidino-Gruppe oder ein Analog dieser umfasst, als auch Salze, in denen beide Hydroxygruppen der Boronat-Gruppen in Salzform auftreten (vorzugsweise mit einer weiteren identischen G⁺-Gruppe) und Mischungen solcher Salze.
4B. Stark basische Amine
Die Offenbarung beinhaltet Produkte, die durch die Reaktion einer wie oben definierten Peptid-Boronsäure und einer starken, organischen Base, die ein Amin ist, gewonnen werden können (und die Charakteristika eines so gewonnenen Produkts aufweisen). Das Amin kann prinzipiell jedes lösliche und pharmazeutisch verträgliche Amin sein.
Unter einer wünschenswerten Klasse von Aminen stellt man sich jene vor, die neben polaren, funktionellen Gruppen auch eine einzelne Amingruppe aufweisen, da solche Verbindungen hydrophiler und deshalb löslicher als andere sein werden. In bestimmten Salzen ist die oder jede zusätzliche funktionelle Gruppe Hydroxy. Einige Amine weisen 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 zusätzliche funktionelle Gruppen auf, insbesondere Hydroxygruppen. In einer veranschaulichenden Klasse von Aminen liegt das Verhältnis von (Amin- plus Hydroxygruppen):Kohlenstoffatomen zwischen 1:2 und 1:1, wobei das letztere Verhältnis besonders bevorzugt wird. Diese Amine mit einer oder mehreren zusätzlichen polaren, funktionellen Gruppen kann ein Kohlenwasserstoff, insbesondere ein Alkan sein, das durch die Aminogruppe und die zusätzliche(n) polare(n) Gruppe(n) substituiert wird. Die Aminogruppe kann substituiert oder unsubstituiert sein und Aminosubstituenten ausgeschlossen kann die polare Base zum Beispiel bis zu 10 Kohlenstoffatome enthalten; normalerweise sind es nicht weniger als drei solche Kohlenstoffatome, z. B. 4, 5 oder 6. Aminozucker sind in dieser Kategorie polarer Basen beinhaltet.
Zu erwähnen sind Salze mit der Formel (X)
wobei aa¹, aa², X und R¹ wie zuvor definiert sind und A⁺ die protonierte Form eines pharmazeutisch verträglichen Amins ist, als auch Salze, in denen beide Hydroxygruppen der Boronsat-Gruppe in Salzform auftreten (vorzugsweise mit einer weiteren identischen A⁺-Gruppe) und Mischungen solcher Salze. In einer solchen Produktklasse ist A⁺ die protonierte Form eines in Abschnitt 2B(i) unten beschriebenen Amins; in einer weiteren Klasse ist A⁺ die protonierte Form eines in 2B(ii) unten beschriebenen Amins.
Zwei veranschaulichende Klassen von Aminbasen werden in Abschnitten 4B(i) und 4B(ii) unten beschrieben. Besonders bevorzugt werden saure Salze (in denen eine der zwei boronischen -OH-Gruppen deprotoniert ist). Am Häufigsten enthalten die Salze eine einzige Art von Amin-Gegenion (wobei Spuren von Kontaminierungen außer Acht gelassen werden), doch die Offenbarung beschäftigt sich mit Salzen, die Mischungen von Amin-Gegenionen enthalten; in einer Subklasse fallen alle verschiedenen Gegenionen unter die in Abschnitt 4B(i) unten beschriebene Familie oder gegebenenfalls unter die in Abschnitt 4B(ii) beschriebene Familie; in einer anderen Subklasse umfassen die Salze eine Mischung von organischen Gegenionen, die nicht alle aus derselben Familie stammen (4B(i) oder 4B(ii)).
4B(i) Aminozucker
Die Identität des Aminozuckers ist nicht entscheidend. Zu den bevorzugten Aminozuckern gehören ring-geöffnete Zucker, vor allem Glucamine. Zyklische Aminozucker werden auch als nützlich in Betracht gezogen. Eine Klasse der Aminozucker ist N-unsubstituiert und eine weitere, bevorzugte Klasse ist durch einen oder zwei N-Substituenten (z. B. einen) N-substituiert. Geeignete Substituenten sind Hydrocarbylgruppen, die zum Beispiel und ohne Begrenzung 1 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten; die Substituenten können Alkyl- oder Arylanteile oder beides umfassen. Beispielhafte Substituenten sind C₁, C₂, C₃, C₄, C₅, C₆, C₇ und C₈ Alkylgruppen, insbesondere Methyl und Ethyl, von denen Methyl veranschaulichend ist. Die Daten weisen darauf hin, dass Aminozucker, insbesondere N-Methyl-D-Glucamin, eine erstaunlich hohe Löslichkeit aufweisen.
Ein am meisten bevorzugter Aminozucker ist N-Methyl-D-Glucamin:
4B(ii) Andere Amine
Andere geeignete Amine beinhalten Aminosäuren (ob natürlich vorkommend oder nicht), deren Seitenkette durch eine Aminogruppe, insbesondere Lysin, substituiert wird.
Einige Amine sind Verbindungen mit der Formel (XI):
wobei n, R² und R³ wie mit Bezug auf Formel (IV) definiert sind. Die Verbindungen mit der Formel (VI) weisen normalerweise eine L-Konfiguration auf. Die Verbindungen mit der Formel (VI) sind Lysin (n = 4; R² = Carboxyl; R³ = H) und Lysin-Derivate oder -Analoge. Ein am meisten bevorzugtes Amin ist L-Lysin.
Andere geeignete Amine sind stickstoffhaltige Heterozyklen. Solche heterozyklischen Verbindungen sind zumindest meistens alizyklisch; eine Klasse der heterozyklischen Verbindungen ist N-substituiert und eine weitere, bevorzugte Klasse ist N-unsubstituiert. Die Heterozyklen können 6 Ring formende Atome enthalten, wie im Falle von Piperidin, Piperazin und Morpholin. Eine Klasse von Aminen beinhaltet N-enthaltende Heterozyklen, die durch polare Substituenten, insbesondere Hydroxy, substituiert werden, z. B. 1-, 2- oder 3-fach.
Die Offenbarung beinhaltet deshalb Amine, die nicht Aminozucker sind und zusätzlich zu einer Amingruppe einen oder mehrere (z. B. 1, 2, 3, 4, 5 oder 6) polare Substituenten aufweisen, insbesondere Hydroxy. Solche Verbindungen können ein Verhältnis von (Amin- plus Hydroxygruppen):Kohlenstoffatomen zwischen 1:2 und 1:1 aufweisen, wobei das letztere Verhältnis besonders bevorzugt wird.
Die Offenbarung beinhaltet gemischte Salze, d. h. Salze, die eine Mischung von Boro-Peptid-Anteilen und/oder Gegenionen enthalten, es werden jedoch einzelne Salze bevorzugt.
Die Salze in fester Form können ein Lösungsmittel, z. B. Wasser enthalten. Es wird auch eine Produktklasse beinhaltet, in der die Salze im Wesentlichen wasserfrei sind. Ebenfalls beinhaltet wird eine Klasse, in der die Salze Hydrate sind.
Synthetische Verfahren I
1. Synthese von Peptiden und Peptidomimetika
Die Synthese von Boro-Peptiden, einschließlich beispielsweise Cbz-D-Phe-Pro-BoroMpg-Opinacol, ist den Fachleuten bekannt und wird in dem zuvor erwähnten Stand der Technik beschrieben, unter anderem bei Claeson et al ( US 5574014 und andere) und Kakkar et al ( WO 92/07869 und Familienmitglieder einschließlich US 5648338 ). Sie wird ebenfalls von Elgendy et al, Adv. Exp. Med. Biol. (USA) 340:173-178, 1993; Claeson, G. et al Biochem. J. 290:309-312, 1993; Deadman et al J. Enzyme Inhibition 9:29-41, 1995 und von Deadman et al J. Med. Chem. 38:1511-1522, 1995 beschrieben.
Die stereoselektive Synthese mit S- oder R-Konfiguration an dem chiralen B-terminalen Kohlenstoff kann mithilfe etablierter Methodologien durchgeführt werden (Elgendy et al Tetrahedron. Lett. 33:4209-4212, 1992; WO 92/07869 und Familienmitglieder einschließlich US 5648338 ) unter Verwendung von (+) oder (–)-Pinandiol als chiralem Direktor (Matteson et al J. Am. Chem. Soc. 108:810-819, 1986; Matteson et al Organometallics. 3:1284-1288, 1984). Eine andere Vorgehensweise wäre die Auflösung des erforderlichen Aminoboronsäure-Intermediats (z. B. Mpg-BOPinacol), um das gewünschte (R)-Isomer selektiv zu gewinnen und es mit dem Dipeptidanteil zu verknüpfen (z. B. Cbz-(R)-Phe-(S)-Pro, welches Cbz-D-Phe-L-Pro entspricht), das den Überrest des Moleküls formen wird.
Die Boro-Peptide können vorerst in Form von Boronsäureestern synthetisiert werden, insbesondere Ester mit Diolen. Solche Diolester können zu den Peptid-Boronsäuren umgewandelt werden wie nächstens beschrieben.
Für ein Syntheseverfahren, das anwendbar ist zur Herstellung von Säuren der Formel (IIIa) frei von analogen Verbindungen, in denen R¹ -(CH₂)_S-H ist, wird der Leser an die nachfolgende Beschreibung unter der Überschrift „Syntheseverfahren II" verwiesen.
2. Umwandlung von Ester zu Säure
Ein Peptid-Boronatester wie Cbz-(R)-Phe-Pro-BoroMpg-OPinacol kann hydrolysiert werden, um die entsprechende Säure zu formen.
Eine neue Technik, um ein Diolester einer Peptid-Boronsäure der Formel (I) in die Säure umzuwandeln, umfasst die Auflösung des Diolesters in einem Ether und insbesondere einem Dialkylether, die Reaktion des so aufgelösten Diols mit einem Diolamin, zum Beispiel einem Dialkanolamin, die Bildung eines Produktniederschlags, die Zurückgewinnung dieses, die Auflösung des Niederschlags in einem polaren organischen Lösungsmittel und die Reaktion des so aufgelösten Produkts mit einem wässrigen Medium, z. B. einer wässrigen Säure, um die Peptid-Boronsäure zu bilden. Die Boronsäure kann aus der durch die Reaktion entstandenen organischen Schicht der Mischung zurückgewonnen werden, beispielsweise durch die Entfernung des Lösungsmittels, z. B. durch Verdunstung im Vakuum oder Destillation. Die Reaktion zwischen dem Diolester und dem Diolamin kann beispielsweise unter Rückfluss durchgeführt werden.
Die Identität des Diols ist nicht entscheidend. Zu den geeigneten, zu erwähnenden Diolen gehören aliphatische und aromatische Verbindungen mit Hydroxygruppen, die auf benachbarten Kohlenstoffatomen substituiert werden oder auf Kohlenstoffatomen, die durch einen weiteren Kohlenstoff substituiert werden. Mit anderen Worten beinhalten geeignete Diole Verbindungen mit mindestens zwei Hydroxygruppen, die durch mindestens zwei verbindende Kohlenstoffatome in einer Kette oder einem Ring getrennt sind. Eine Klasse von Diolen umfasst Kohlenwasserstoffe, die durch genau zwei Hydroxygruppen substituiert werden. Ein solches Diol ist Pinacol und ein weiteres ist Pinandiol; ebenfalls erwähnt werden sollten Neopentylglycol, 1,2-Ethandiol, 1,2-Propandiol, 1,3-Propandiol, 2,3-Butandiol, 1,2-Diisopropylethandiol, 5,6-Decandiol und 1,2-Dicyclohexylethandiol.
Die Alkylgruppen des Dialkylethers weisen vorzugsweise 1, 2, 3 oder 4 Kohlenstoffatome auf und die Alkylgruppen können gleich oder unterschiedlich sein. Ein beispielhafter Ether ist Diethylether.
Die Alkylgruppen des Dialkanolamins weisen vorzugsweise 1, 2, 3 oder 4 Kohlenstoffatome auf und die Alkylgruppen können gleich oder unterschiedlich sein. Ein beispielhaftes Dialkanolamin ist Diethanolamin. Das Reaktionsprodukt von Diethanolamin/Boronsäure hydrolysiert in Wasser bei Raumtemperatur und die Geschwindigkeit der Hydrolyse kann durch den Zusatz einer Säure oder Base beschleunigt werden.
Das polare organische Lösungsmittel ist vorzugsweise CHCl₃. Andere Beispiele sind polyhalogenisierte Alkane im Allgemeinen und Ethylacetat. Prinzipiell ist jedes polare organische Lösungsmittel außer Alkoholen akzeptabel.
Die wässrige Säure ist passenderweise eine starke anorganische Säure mit einem pH-Wert im Bereich von 1, wie zum Beispiel Hydrochloridsäure.
Nach der Reaktion mit der Säure wird die Reaktionsmischung passenderweise zum Beispiel mit NH₄Cl oder einer anderen milden Base gewaschen.
Ein Beispiel eines spezifischen Arbeitsverfahrens ist wie folgt.

1. Der Pinacol- oder Pinandiolester der ausgewählten Peptid-Boronsäure wird in Diethylether aufgelöst.
2. Diethanolamin wird zugesetzt und die Mischung wird bei 40°C refluxiert.
3. Das niedergeschlagene Produkt wird entfernt (gefiltert), mit Diethylether oder einem anderen polaren organischen Lösungsmittel außer einem Alkohol gewaschen (normalerweise mehrere Male) und getrocknet (z. B. durch Verdunstung im Vakuum).
4. Das trockene Produkt wird in einem polaren organischen Lösungsmittel außer einem Alkohol aufgelöst, z. B. in CHCl₃, Eine wässrige Säure oder Base wird zugesetzt, z. B. eine Hydrochloridsäure (pH-Wert 1) und die Mischung wird z. B. ungefähr 1 Std. lang bei Raumtemperatur gerührt.
5. Die organische Schicht wird entfernt und mit einer NH₄Cl-Lösung gewaschen.
6. Das organische Lösungsmittel wird destilliert und das zurückbleibende feste Produkt wird getrocknet.

3. Salzsynthese
Im Allgemeinen können die Salze präpariert werden, indem man die jeweilige Peptid-Boronsäure mit einer starken Base in Berührung bringt, die geeignet ist, das gewünschte Salz zu bilden. Im Falle von Metallsalzen stellen die Metallhydroxide geeignete Basen dar (als Alternative können beispielsweise Metallcarbonate verwendet werden), während es manchmal praktischer ist, die Säure mit einem angemessenen Metallalkoxid in Berührung zu bringen (z. B. Methoxid), wobei für diesen Zweck das entsprechende Alkanol ein geeignetes Lösungsmittel darstellt. Salze mit organischen Basen können präpariert werden, indem die Peptid-Boronsäure mit der organischen Base selbst in Berührung gebracht wird. Veranschaulichende Salze sind saure Salze (in denen ein -BOH-Proton ersetzt wird), wobei, um saure Salze mit einem monovalenten Kation herzustellen, die Säure und die Base passenderweise in im Wesentlichen gleichwertigen molaren Quantitäten miteinander reagieren sollten. Allgemein ausgedrückt liegt das normale Molverhältnis von Säure:Base im Wesentlichen bei n:1, wobei n die Valenz des Kations der Base ist.
In einem Arbeitsverfahren wird eine Lösung der Peptid-Boronsäure in einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel, zum Beispiel Acetonitril oder einem Alkohol (z. B. Ethanol, Methanol, einem Propanol, zum Beispiel Iso-Propanol oder einem anderen Alkohol) mit einer wässrigen Lösung der Base kombiniert. Es wird eine Reaktion zwischen der Säure und der Base zugelassen und das Salz wird zurückgewonnen. Die Reaktion wird typischerweise bei Umgebungstemperatur durchgeführt (z. B. bei einer Temperatur zwischen 15 bis 30°C, z. B. 15 bis 25°C), doch eine erhöhte Temperatur kann ebenfalls verwendet werden, zum Beispiel bis zum Siedepunkt der Reaktionsmischung, doch generell niedriger, z. B. eine Temperatur von bis zu 40°C oder 50°C. Die Reaktionsmischung kann stehen gelassen oder bewegt werden (normalerweise durch Rühren).
Die Zeitspanne, während der die Säure und die Base miteinander reagieren können, ist nicht entscheidend, es wurde jedoch als wünschenswert festgestellt, dass die Reaktionsmischung mindestens eine Stunde lang aufrechterhalten werden sollte. Normalerweise ist eine Zeitspanne zwischen einer und zwei Stunden am Besten geeignet, es können jedoch auch längere Reaktionszeiten eingesetzt werden.
Das Salz kann aus der Reaktionsmischung durch jedwede geeignete Verfahren zurückgewonnen werden, zum Beispiel mithilfe von Verdunstung oder Fällung. Fällung kann durch den Zusatz eines Überschusses eines mischbaren Lösungsmittels durchgeführt werden, in welchem das Salz eine begrenzte Löslichkeit aufweist. In einer bevorzugten Technik wird das Salz durch Evakuierung der Reaktionsmischung, bis diese in trockener Form vorliegt, zurückgewonnen. Das Salz sollte danach vorzugsweise gereinigt werden, zum Beispiel durch eine erneute Auflösung des Salzes, bevor die entstehende Lösung gefiltert und dann getrocknet wird, zum Beispiel durch Evakuierung, bis sie in trockener Form vorliegt. Die erneute Auflösung kann mithilfe von Wasser durchgeführt werden, z. B. destilliertem Wasser. Das Salz kann dann weiter gereinigt werden, zum Beispiel um Restwasser durch eine weitere Auflösung in einem geeigneten Lösungsmittel zu entfernen, das vorzugsweise Ethylacetat oder THF sein sollte, gefolgt von Verdunstung, bis es in trockener Form vorliegt. Das Reinigungsverfahren kann bei Umgebungstemperatur durchgeführt werden (zwischen 15 und 30°C, z. B. 15 bis 25°C) oder bei einer leicht erhöhten Temperatur, so wie z. B. einer Temperatur, die nicht 40°C oder 50°C überschreitet; zum Beispiel kann das Salz in Wasser und/oder einem Lösungsmittel unter Bewegung und mit oder ohne Erwärmung auf eine Temperatur von beispielsweise 37°C aufgelöst werden.
Auch aufgenommen ist ein Verfahren, um die Salze der Offenbarung und andere Peptidboronsäuresalze zu trocknen, umfassend ihr Auflösen in einem organischen Lösungsmittel, zum Beispiel Ethylacetat oder THF, und anschließendes Verdunsten zur Trockne, zum Beispiel durch Evakuieren.
Im Allgemeinen sind die bevorzugten Lösungsmittel für die Reinigung der Salze Ethylacetat oder THF oder vielleicht ein anderes organisches Lösungsmittel.
Ein allgemeines Verfahren für die Synthese von Salzen von Cbz-Phe-Pro-BoroMpg-OH ist wie folgt:
Cbz-Phe-Pro-BoroMpg-OH (20,00 g, 38,1 mM) wird unter Rühren in Acetonitril (200 ml) bei Raumtemperatur aufgelöst. Dieser Lösung wird die jeweilige Base als Lösung in destilliertem Wasser (190 ml) zugesetzt; die Base wird als eine 0,2M Lösung für ein monovalentes Kation zugesetzt. Die entstehende klare Lösung wird dann zum Beispiel stehen gelassen oder bewegt, um reagieren zu können, wobei dies für eine Zeitspanne von in beiden Fällen normalerweise zwischen einer und zwei Stunden geschieht. Die Reaktion wird typischerweise bei Raumtemperatur (z. B. 15–30°C, z. B. 15 bis 25°C) durchgeführt, wobei die Temperatur jedoch auch erhöht werden kann (z. B. bis zu 30°C, 40°C oder 50°C). Die Reaktionsmischung wird dann bei einer Temperatur von nicht mehr als 37°C im Vakuum evakuiert, bis sie in trockener Form vorliegt; typischerweise entsteht so ein weißer, brüchiger Festkörper oder ein Ölklebrige Flüssigkeit. Das Ölklebrige Flüssigkeit wird in einer notwendigen, minimalen Menge destillierten Wassers (200 ml bis 4L) erneut aufgelöst, typischerweise begleitet von Erwärmung (z. B. bis 30–40°C), normalerweise bis zu 2 Stunden lang. Die Lösung wird gefiltert, passenderweise durch Filterpapier, und dann evakuiert, wobei die Temperatur der Lösung auch hier 37°C nicht überschreiten sollte, oder gefriergetrocknet, bis sie im trockenen Zustand vorliegt. Das entstehende Produkt wird im Vakuum über Nacht getrocknet, wodurch normalerweise ein weißer, brüchiger Festkörper entsteht. Wenn das Produkt als Öl oder klebriger Festkörper präsent ist, wird es in Ethylacetat aufgelöst und evakuiert, bis es im trockenen Zustand vorliegt, um das Produkt als weißen Festkörper zu produzieren. Der weiße Festkörper ist typischerweise ein grober, amorpher Puder.
In Variationen des oben beschriebenen allgemeinen Verfahrens wird das Acetonitril durch ein anderes wassermischbares organisches Lösungsmittel, namentlich einen Alkohol, wie oben erwähnt ersetzt, insbesondere durch Ethanol, Methanol, Isopropanol oder einen anderen Propanol.
Wenn ein Salz einer Boronsäure in einem ausgewählten Reaktionsmedium zur Salzformation weniger löslich ist, so dass seine direkte Präparation aus der entsprechenden Säure und Base unpraktisch wird, kann das weniger lösliche Salz aus einem Salz präpariert werden, das in dem Reaktionsmedium löslicher ist.
Der Einsatz einer Boronsäure, um ein Salz der Offenbarung herzustellen, wird auch bereitgestellt. Ebenfalls eingeschlossen ist ein Verfahren zum Herstellen eines Produktes der Offenbarung, umfassend Inkontaktbringen einer Boronsäure, zum Beispiel der Formel (I), (II) oder (III) mit einer Base, die in der Lage ist, solch ein Salz zu bilden.
Die Peptidboronsäure der Formel (I), die benutzt wird, um die pharmazeutischen Präparate darzustellen, ist typischerweise von GLP- oder GMP-Qualität, oder in Übereinstimmung mit GLP (good laboratory practice) oder GMP (good manufacturing practise); solche Säuren sind in die Offenbarung aufgenommen.
In ähnlicher Weise sind die Säuren gewöhnlich steril und/oder akzeptabel für den pharmazeutischen Gebrauch, und ein Aspekt der Offenbarung besteht in einer Zusammensetzung, die steril oder akzeptabel für den pharmazeutischen Gebrauch ist, oder beides, und eine Peptidboronsäure der Formel (I) umfasst. Solch eine Zusammensetzung kann in Partikelform oder in Form einer flüssigen Lösung oder Dispersion vorliegen.
Die intermediäre Säure kann in isolierter Form vorliegen und solche isolierte Säuren sind in die Offenbarung eingeschlossen, insbesondere isolierte Säuren, die eine Peptidboronsäure der Formel (VII) sind: X-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-Mpg-B(OH)₂ (VIII)worin X H (um NH₂ zu bilden) oder eine Aminsosäureschutzgruppe ist.
Eine typische Art zum Bereitstellen der intermediären Säuren besteht in Form einer partikulären Zusammensetzung, bestehend vorrangig aus solch einer Peptidboronsäure, und diese Zusammensetzungen sind in die Offenbarung eingeschlossen. Die Peptidboronsäure macht oft mindestens 75 Gew.-% der Zusammensetzung aus und typischerweise mindestens 85 Gew.-% der Zusammensetzung, zum Beispiel mindestens 95 Gew.-% der Zusammensetzung.
Eine andere typische Art, die intermediären Säuren bereitzustellen, ist als flüssige Zusammensetzung, bestehend aus, oder im wesentlichen bestehend aus einer Peptidboronsäure der Formel (II) und einem flüssigen Trägerstoff, in welchem sie gelöst oder suspendiert ist. Der flüssige Trägerstoff kann ein wässriges Medium sein, zum Beispiel Wasser, oder ein Alkohol, zum Beispiel Methanol, Ethanol, Isopropanol, oder ein anderes Propanol, ein anderes Alkanol oder eine Mischung der vorhergehenden.
Im Allgemeinen sind die Zusammensetzungen der intermediären Säuren steril. Um die Weiterverarbeitung zu erleichtern, können die Zusammensetzungen die Peptidboronsäure in fein verteilter Form enthalten.
4. Trennung von Stereoisomeren
Die Stereoisomere eines Peptid boronischem Esters oder eines synthetischen intermediären Aminoboronats können zum Beispiel auf einem der bekannten Wege gelöst werden. Insbesondere können Stereoisomere von boronischen Ester mithilfe von HPLC gelöst werden.
Synthetische Verfahren II – Stabilität und Reinheit der Verbindungen
Bereits existierende Publikationen lehren uns, dass Organoboronsäuren durch Oxidation der C-B-Bindung abgebaut werden. Man siehe beispielsweise Wu et al (siehe oben). Frühere Arbeiten mit den Salzen von TRI 50c haben bestätigt, dass diese Salze und/oder Intermediate bei ihrer Präparation leicht instabil sind; so wurde beispielsweise bei den Salzen eine von Borfreie Verunreinigung, auch als Verunreinigung I bezeichnet, vorgefunden, der augenscheinlich durch die C-B-Bindungsspaltung erzeugt worden war. Die Salze als Klasse sind einem solchen Abbau gegenüber wesentlich stabiler als die freie Säure.
Diese früheren TRI 50c Salze wurden mithilfe der in Beispielen 5 und 9 dieser Beschreibung beschriebenen allgemeinen Verfahren hergestellt. Verunreinigung I weist die folgende Struktur auf:

Ein HPLC-Chromatogramm zum Beispiel, das mithilfe eines in Beispiel 34 genauer beschriebenen Reversed-Phase-Verfahrens präpariert wurde, produzierte die folgenden Daten für das Mononatriumsalz von TRI 50c, das unter Befolgung der Arbeitsverfahren von Beispielen 5 und 9 hierin hergestellt worden war:

	Name	Laufzeit (Min)	Fläche	Höhe	Menge	Einheiten	% Fläche
1	Benzaldehyd	6,145	2487	224			0,39
2	Verunreinigung I	11,022	6379	539			1,00
3	TRI50c	11,679	628872	51108	946.063	ug/mL	98,61

Die Versuche, die mit Verunreinigung I verunreinigten Salze zu reinigen blieben erfolglos und es hatte zum Beispiel den Anschein, dass Verunreinigung I aus den Salzen in HPLC-Säulen erzeugt wurde.
Die relative chirale Reinheit der mithilfe der allgemeinen Arbeitsverfahren aus Beispielen 5 und 9 hergestellten Salze wurde durch Auflösung des Pinacolesters von TRI 50c, als TRI 50b gekennzeichnet, durch HPLC und die Umwandlung des so aufgelösten TRI 50b in die Salze erzielt. Eine solches HPLC-Arbeitsverfahren ist im Rahmen der normalen kommerziellen Medikamentherstellung nicht akzeptabel.
Ferner wurde festgestellt, dass die im Stand der Technik geläufige Synthese, die unter der Überschrift „Aminoboronsäure-Verfahrenr" oben zusammengefasst wurde, wenn diese auf die Synthese von TRI 50c oder einen Ester dieser angewandt wird, zur Bildung einer als Verunreinigung IV gekennzeichneten Verunreinigung führt:
Versuche, dien Verunreinigung IV von TRI 50c zu trennen, blieben bislang erfolglos. Das Gleiche gilt für TRI 50c Salze und Ester und die entsprechenden Salze und Ester der Verunreinigung IV. Solange die erwähnte Synthese aus dem Stand der Technik verwendet wird, ist keine der versuchten Reinigungstechniken in der Lage, der Präsenz von Verunreinigung IV vorzubeugen.
Synthetisches Verfahren II – Die Verfahren
Die vorliegende Offenbarung beschäftigt sich in einer Ausführungsform unter anderem mit dem Problem der Kontrolle von C-B-Bindungsspaltungen in Organoboronsäure-Verbindungen und stellt chiralisch gereinigte Salze von TRI 50c und anderen Organoboronsäuren für den kommerziellen Gebrauch bereit. In diesem Zusammenhang ist festgestellt worden, dass C-B-Bindungen durch einen nicht-oxidativen Mechanismus gespalten zu werden scheinen, der in Präsenz vieler Lösungsmittel auftritt, einschließlich Wasser und z. B. unter anderem wässrigen Säuren und Basen.
Außerdem wurde festgestellt, dass chiral-selektive Fällung verwendet werden kann, um Organoboronsäuren hoher Reinheit zurückzugewinnen.
So kann die C-B-Bindungsspaltung (und daher insbesondere die Erzeugung von Verunreinigung I) wie folgt kontrolliert werden:

• Auswahl von Acetonitirl als ein Lösungsmittel, wenn ein Lösungsmittel zur Verarbeitung benötigt wird und Acetonitril die notwendige Solvatationskraft aufweist; Acetonitril wird vor allem dann zur Verarbeitung ausgewählt, wenn ein polares Lösungsmittel wünschenswert oder notwendig ist.
• Vermeidung exzessiver Berührung mit Wasser.

Mit Hinblick auf die TRI 50c-Salzproduktion beinhaltet die Offenbarung deshalb eins, zwei oder drei der folgenden Merkmale:

(i) Auflösung der (R,S,S) und (R,S,R) Epimere von TRI 50c durch chiralisch selektive Fällung mithilfe von Diethanolamin und aus praktischen Gründen, aber nicht notwendigerweise, mithilfe von TRI 50c in Form eines Esters, zum Beispiel des Pinacolesters, als Startmaterial;
(ii) Kontrolle der Dauer und/oder Bedingungen der Hydrolyse von zum Beispiel durch eine solche Fällung gewonnenem TRI 50c Diethanolaminester, um den C-B-Bindungsbruch zu kontrollieren;
(iii) Verwendung von Acetonitril als Lösungsmittel für zum Beispiel durch eine solche Hydrolyse gewonnenes TRI 50c, zum Zwecke einer Reaktion von TRI 50c mit einer Base, um das Salz zu bilden. Ein weiteres zu bevorzugendes Lösungsmittel kann Tetrahydrofuran sein.

Ein optionales, oder sogar alleinstehendes, viertes Merkmal ist die Trocknung der TRI 50c Salze durch azeotrope Trocknung unter Verwendung von Acetonitril.
Es wird angenommen, dass C-B-Bindungsspaltungen durch einen nukleophilen Mechanismus verursacht werden, weshalb die Offenbarung Verfahren beinhaltet, in denen die Gelegenheiten für nukleophile Angriffe minimiert werden.
Die obigen vier Merkmale oder eins, zwei oder drei dieser Merkmale können auf die Herstellung und Verarbeitung anderer boronische-Verbindungen, insbesondere Säuren der Formel (IIIa) und deren Derivate (z. B. Ester und Salze) angewandt werden.
Diese Beschreibung lehrt daher den Einsatz von Diethanolamin zur Auflösung der Diastereomere von Boronsäuren der Formel (IIIa) durch selektive Fällung. Das Startmaterial kann eine Säure (I) oder ein Derivat dieser sein, das in der Lage ist, ein Diethanolaminester der Boronsäure zu bilden. Die Fällung wählt Säuren mit einem Chiralitätszentrum C* mit (R)-Konfiguration als Niederschlag aus. Der Niederschlag kann zurückgewonnen und in die entsprechende Boronsäure oder ein Salz dieser umgewandelt werden. Das Salz kann zu einer pharmazeutischen Formulierung verarbeitet werden.
Für optimale chirale Reinheit und Ausbeute kann das Diethanolamin in einer Menge von ungefähr 1,25 ± 0,1 Äquivalenten verwendet werden, basierend auf anfänglichen Äquivalenten von Boronsäure mit einem Chiralitätszentrum C* mit (R)-Konfiguration.
Die anfängliche Boronsäure oder Säurederivat kann beispielsweise zwischen 50% und 60% Moleküle mit einem Chiralitätszentrum C* mit (R)-Konfiguration und zwischen 40% und 50% Moleküle mit einem Chiralitätszentrum C* mit (S)-Konfiguration umfassen.
Das Verfahren ebnet den Weg für eine Kommerzialisierung der Boronsäuren (I) und deren Derivate, insbesondere Salze, als Pharmazeutika. Deshalb werden Produkte und Aktivitäten kommerziellen Maßstabs unter Verwendung der Boronsäuren (I) und ihrer Derivate bereitgestellt.
Diese Beschreibung lehrt auch einen Prozess zur Trennung von Diastereomeren von einer Boronsäure mit der Formel (I)
umfassend:
Das Kombinieren in Diethyletherlösung (A) einer boronischen-Spezies, die aus der Boronsäure (I) und deren Ester ausgewählt wurde, wobei die boronische-Spezies Moleküle mit einem Chiralitätszentrum C* mit (R)-Konfiguration und Moleküle mit einem Chiralitätszentrum C* mit (S)-Konfiguration beinhaltet, und (B) Diethanolamin, wobei das Diethanolamin in Mengen von ungefähr 1,25 ± 0,1 Äquivalenten auftritt, die auf der Boronischen-Spezies basieren, in der das Chiralitätszentrum C* eine (R)-Konfiguration aufweist, und das Mischen, um eine Mischung zu bilden;
Das Anregen oder Zulassen einer Reaktion zwischen der Boronsäure-Spezies und dem Diethanolamin, bis sich ein Niederschlag bildet; und
die Rückgewinnung des Niederschlags.
Wenn das Startmaterial ein Ester ist, kann es ein Ester der Boronsäure mit einem Alkohol sein, der aus der Gruppe ausgwählt wurde, die aus Alkoholen besteht, deren einzige potenzielle Elektronendonator-Heteroatome Sauerstoffe sind, die in dem boronischen Ester den Sauerstoffen der funktionellen Gruppe des Esters entsprechen.
In einigen Verfahren tritt das Diethanolamin in Mengen von zwischen 1,2 und 1,3 Äquivalenten auf, basierend auf der boronischen-Spezies, in der das Chiralitätszentrum C* eine (R)-Konfiguration aufweist.
Beinhaltet sind Prozesse, in denen die Boronat-Spezies ein Ester der Boronsäure und ein Diol ist, insbesondere ein Diol, das nicht sterisch gehindert ist. Als beispielhafte Diole sollten Pinacol, Neopentylglycol, 1,2-Ethandiol, 1,2-Propandiol, 1,3-Propandiol, 2,3-Butandiol, 1,2-Diisopropylethandiol oder 5,6-Decandiol erwähnt werden. Ein besonderes Diol ist Pinacol.
Durch Erhitzung der Mischung auf eine erhöhte Temperatur kann es zur Reaktion der boronischen-Spezies und des Diethanolamins kommen, die Mischung kann zum Beispiel refluxiert werden, z. B. mindestens 10 Stunden lang.
Der Niederschlag kann durch Filtration zurückgewonnen werden. Der zurückgewonnene Niederschlag kann mit Diethylether gewaschen werden. Der zurückgewonnene Niederschlag kann, nach möglicher Wäsche, in einem Lösungsmittel aufgelöst werden, das aus CH₂Cl₂ und CHCl₃ ausgewählt wird und erneut durch eine Kombination der entstehenden Lösung mit Diethylether gefällt werden. Ein besonderes Lösungsmittel ist CH₂Cl₂.
Der zurückgewonnene Niederschlag kann in die Säure mit der Formel (I) umgewandelt werden, passenderweise durch Hydrolyse, zum Beispiel durch Auflösung des Niederschlags in einem organischen Lösungsmittel, das aus z. B. Halogenkohlenwasserstoffen und Kombinationen dieser ausgewählt wird, durch Bewegung der entstehenden Lösung mit einer wässrigen Flüssigkeit, z. B. einer wässrigen Säure mit einem pH-Wert von unter 3, wobei der aufgelöste Niederschlag in die Säure mit der Formel (I) umgewandelt wird und die Säure der Formel (I) durch Verdunstung zurückgewonnen wird. Das organische Lösungsmittel kann CH₂Cl₂ oder CHCl₃ sein. Ein besonderes Lösungsmittel ist CH₂Cl₂. Bei manchen Prozessen wird das organische Lösungsmittel aus der zurückgewonnenen Säure mit der Formel (I) weiter verdunstet.
Die Offenbarung schließt Verfahren ein, bei denen ein Ester einer Boronsäure (I), insbesondere ein Diethanolaminester, auf eine Art und Weise hydrolysiert wird, mithilfe derer die C-B-Bindungsspaltung kontrolliert wird. Dies bedeutet insbesondere, dass die Hydrolysedauer bei der ausgewählten Temperatur begrenzt wird. Im Falle der Diethanolaminesterhydrolyse wird die Hydrolyse passenderweise bei Raumtemperatur oder einer niedrigeren Temperatur durchgeführt, für eine Dauer von nicht mehr als 30 Minuten, z. B. nicht länger als 20 Minuten und optimal ungefähr 20 Minuten.
So kann der zurückgewonnene Niederschlag, auf den im vorletzten Paragraph Bezug genommen wurde, mithilfe einer wässrigen Säure hydrolysiert werden, insbesondere mithilfe einer 2%igen Hydrochloridsäure oder einer anderen mineralischen Säure mit ähnlichem pH-Wert, und dies nicht länger als als ungefähr 30 Minuten bei ungefähr Raumtemperatur, oder weniger. Geeigneterweise wird der Niederschlag in einem nicht-nukleophilen organischen Lösungsmittel (z. B. einem Halogenkohlenwasserstoff oder einer Halogenkohlenwasserstoffmischung, zum Beispiel CH₂Cl₂) aufgelöst und die entstehende Lösung wird mit der wässrigen Säure für eine wie zuvor beschriebene Dauer in Berührung gebracht. Der Niederschlag wird dabei hydrolysiert, um die frei Säure der Formel (I) zu bilden, die im organischen Lösungsmittel zurückbleibt. Das organische Lösungsmittel kann von dem wässrigen Medium getrennt und dann verdunstet werden, um die feste Säure der Formel I zu gewinnen.
Eingeschlossen sind Prozesse, in welchen eine Säure mit der Formel (I), die zum Beispiel wie im vorherigen Paragraph beschrieben gewonnen wurde, getrocknet wird. In einer Klasse von Prozessen wird die Säure mit der Formel (I) getrocknet, wenn sie sich im organischen Lösungsmittel befindet, indem das Lösungsmittel mit einem hygroskopischen Festkörper in Berührung gebracht wird.
Eingeschlossen sind Prozesse, bei denen die Säure der Formel (I), wenn sie sich im organischen Lösungsmittel befindet, mit einem wässrigen Ammoniumsalz gewaschen wird.
Chiralisch gereinigte Boronsäure kann in ein pharmazeutisch verträgliches Salz dieser nach Zusatz einer Base umgewandelt werden, insbesondere, indem die Säure in Acetonitril aufgelöst wird, die entstehende Lösung mit einer wässrigen Lösung oder Suspension einer pharmazeutisch verträglichen Base kombiniert wird und eine Reaktion der Base und der Säure verursacht oder zugelassen wird, woraufhin das Ganze verdunstet wird, bis es im trockenen Zustand vorliegt, um einen Abdampfrückstand zu gewinnen. Der Schritt der Anregung oder des Zulassens einer Reaktion zwischen der Säure und der Base kann die Bewegung der Kombination von Acetonitril-Lösung der Säure und wässriger Lösung oder Suspension der Base bei einer Temperatur von nicht mehr als 35°C und häufig nicht mehr als 30°C, z. B. nicht mehr als 25°C, umfassen; eine optimale Temperatur ist die Raumtemperatur, in welchem Fall eine Reaktionszeit von ungefähr 2 Stunden angemessen sein kann. Der Prozess kann ferner umfassen:

(i) die erneute Auflösung des Abdampfrückstands in Acetonitril und die Verdunstung der entstehenden Lösung, bis sie im trockenen Zustand vorliegt; und
(ii) die Wiederholung von Schritt (i), so häufig wie dies notwendig ist, um einen trockenen Abdampfrückstand zu gewinnen.

Bei einigen Prozessen wird der trockene Abdampfrückstand in Acetonitril oder Tetrahydrofuran aufgelöst, um eine Lösung zu bilden und die Lösung wird mit einer 3:1 bis 1:3 v/v Mischung von Diethylether und einem aliphatischen oder cycloaliphatischen Lösungsmittel kombiniert (z. B. langsam zugesetzt, mit einer Geschwindigkeit, die langsam genug ist, um Klumpenbildung zu vermeiden), um einen Niederschlag zu bilden, wobei die genannte Lösung der Mischung von Diethylether/(cyclo)aliphatischem Lösungsmittel in einem Verhältnis (Lösung:Mischung) von ungefähr 1:5 bis 1:15 v/v zugesetzt wird. Der Niederschlag wird zurückgewonnen und etwas oder im Wesentlichen das gesamte zurückbleibende Lösungsmittel wird aus dem zurückgewonnenen Niederschlag entfernt, z. B. unter reduziertem Druck, während die Temperatur bei nicht mehr als 35°C gehalten wird. Beinhaltet sind Prozesse, bei denen die Temperatur zu Beginn des Trocknungsprozesses bei ungefähr 10°C liegt und während des Prozesses auf 35°C gesteigert wird. Das aliphatische oder cycloaliphatische Lösungsmittel kann 6, 7 oder 8 Kohlenstoffatome aufweisen; das Lösungsmittel kann ein Alkan sein, zum Beispiel ein n-Alkan, z. B. n-Heptan. Einige Reaktionen können bei Umgebungstemperatur durchgeführt werden, die z. B. bei 15–30°C, z. B. 20–30°C liegen kann; manchmal kann die Umgebungstemperatur der Raumtemperatur entsprechen.
Die Salze können eine Spurenmenge des aliphatischen oder cycloaliphatischen Lösungsmittels enthalten, z. B. eine Menge von weniger als 0,1%, insbesondere weniger als 0,01%, zum Beispiel eine Menge von ungefähr 0,005%.
Im Prozess der Herstellung des Salzes kann die Base ein Kation der Valenz n umfassen und in einer Stöchiometrie (Boronsäure:Base) von ungefähr n:1 verwendet werden. Bei bestimmten Prozessen ist die Base eine Alkalimetall- oder Erdalkalimetallbase, zum Beispiel ein Alkalimetallhydroxid oder ein Erdalkalimetallhydroxid. Als eine mögliche Base soll Natriumhydroxid erwähnt werden. Als eine weitere mögliche Base soll Calciumhydroxid erwähnt werden. Die Offenbarung beinhaltet Prozesse, in denen die Base Natriumhydroxid ist und der trockene Abdampfrückstand in Acetonitril aufgelöst wird. Die Offenbarung beinhaltet Prozesse, bei denen die Base Calciumhydroxid ist und der trockene Abdampfrückstand in Tetrahydrofuran aufgelöst wird.
Die Säure der Formel (I) hat eine R¹-Gruppe der Formel, in welcher R³ Methyl oder Ethyl und s unabhängig 2, 3 oder 4 ist frei von Verunreinigung, in welcher R¹ -(CH₂)_S-H ist, und die Säure mit der Formel (I) über ein Intermediat mit der Formel (XXV) herstellbar ist: (HO)₂B-(CH₂)_s-O-R³ (XXV),wobei das Intermediat durch eine Reaktion zwischen einem Boratester und einem geeigneten 1-Metalloalkoxyalkan hergestellt wird.
Ein neuer Aspekt der Offenbarung umfasst die Intermediate der Formel (XXV).
Die Intermediate der Formel (XXV) können durch eine Reaktion eines 1-Metalloalkoxyalkans, wobei das Alkoxyalkan die Formel -(CH₂)_s-O-R³ aufweist, mit einem Boratester hergestellt werden, um eine Verbindung der Formel (XXV) zu bilden.
Die Startmaterialien für die Reaktion können ein Metalloalkoxyalkan, z. B. ein Grignard-Reagens, das aus 1-Halogenalkoxyalkan der Formel Hal-(CH₂)_s-O-R³ (wobei Hal ein Halogen darstellt) gewonnen werden kann, und ein Boratester sein. Das Metall ist insbesondere Magnesium. Ein weiteres Metall ist Lithium, in welchem Fall das Metallreagens durch eine Reaktion des 1-Halogenalkoxyalkans mit Butyllithium präpariert werden kann. Wenn das Verfahren die Präparation des Metallreagens aus Halogenalkoxyalkan beinhaltet, kann das Halogenalkoxyalkan ein Chloralkoxyalkan sein; die entsprechenden Bromverbindungen können ebenfalls verwendet werden. Zur Herstellung eines Grignard-Reagens kann eine Reaktion mit dem Halogenalkoxyalkan herbeigeführt werden.
Zu den geeigneten Boratestern gehören Ester mono- und difunktioneller Alkohole (z. B. von EtOH, MeOH, BuOH, Pinacol, Glycol, Pinandiol u.s.w.). Der Ester kann zum Beispiel die Formel B(OR^a)(OR^b)(OR^c) aufweisen, wobei R^a, R^b und R^c und C₁-C₄-Alkyl und einander entsprechen können.
Ein beispielhaftes Arbeitsverfahren zur Herstellung eines Intermediats der Formel (XXV), mit Bezugnahme auf Methoxypropan als die Alkoxyalkanspezies veranschaulicht, ist:
Die Reaktionen werden passenderweise in einem organischen Lösungsmittel durchgeführt, z. B. THF.
Das oben beschriebene Arbeitsverfahren zur Herstellung von Alkoxyalkylboronsäuren vermeidet die Erzeugung von Verunreinigung IV (siehe oben), oder dessen Analogen in den Fällen, in denen das Endprodukt nicht TRI 50c oder ein Derivat (Salz, Ester, u.s.w.) dieses ist. Deshalb stellt das Arbeitsverfahren einen einzigartigen Weg zur Herstellung von nicht durch Verunreinigung IV verunreinigtem TRI 50c und seinen Ester und Salzen und zur Herstellung anderer Aminoboronsäuren bereit, die durch eine Alkoxyalkylgruppe zu dem Bor α-substituiert und nicht durch Verunreinigungen, die analog zu Verunreinigung IV sind, verunreinigt sind.
Eine Alkoxyalkylboronsäure, d. h. eine Verbindung, die durch die Formel R^Z-O-R^Y-B(OH)₂ dargestellt werden kann, kann mithilfe eines geeigneten Arbeitsverfahrens, z. B. eines der Technik bekannten, in eine Aminoboronverbindung umgewandelt werden, zum Beispiel in ein Boropeptid. Ein Reaktionsschema zur Wandlung von Alkoxyalkylboronsäuren zu Aminoboronaten und zur Umwandlung von Aminoboronaten zu Peptidboronaten wird mit Bezugnahme auf die Synthese von TRI 50c zu Beginn der Beispiele in dieser Beschreibung veranschaulicht. Das Reaktionsschema kann wie gewünscht geändert werden, z. B.: Diethanolaminfällung und folgende Schritte können unterlassen werden, und/oder Reagenssubstitutionen können gemacht werden. Pinacol kann beispielsweise durch ein anderes Diol ersetzt werden. LDA ist eine nicht-nukleophile starke Base und kann durch eine andere solche Base ersetzt werden. Andere Beispiele beinhalten, ohne auf diese beschränkt zu sein, Lithium-Diisopropylamid, Lithium 2,2,6,6-Tetramethylpiperidin, 1-Lithium 4-Methylpiperazid, 1,4-Dilithium Piperazid, Lithium bis(trimethylsilyl)amid, Natrium bis(trimethylsilyl)amid, Kalium bis(trimethylsilyl)amid, Isopropylmagnesiumchlorid, Phenylmagnesiumchlorid, Lithiumdiethylamid und Kalium tert-butoxid. Die Reaktionen können in irgendeinem geeigneten Lösungsmittel durchgeführt werden. Dort, wo n-Heptan in den Beispielen verwendet wird, kann es durch ein anderes inertes nicht-polares Lösungsmittel ersetzt werden, z. B. durch ein anderes aliphatisches oder cycloaliphatisches Lösungsmittel, zum Beispiel ein Alkan, z. B. ein n-Alkan.
Aus dem Vorhergehenden sollte deutlich werden, dass die oben beschriebenen Verfahren wie beschrieben bei der Herstellung von Organoboronsäuresalzen verwendet werden können. Es ist nicht notwendig, dass die sequenziellen Schritte als ein Vorgang oder am selben Ort durchgeführt werden: Sie können auf diese Art und Weise oder als verschiedene Prozesse (verschiedene Teile der Synthese insgesamt) durchgeführt werden, die über Zeit und/oder Raum verteilt sind. Zu den besonderen Endproduktsalzen gehören Mononatrium-, Monolithium-, Hemicalcium- und Hemimagnesiumsalze, zum Beispiel von TRI 50c.
Generell können die Reaktionen geeigneterweise mit einem nicht-nukleophilen Lösungsmittel durchgeführt werden. Wenn ein nukleophiles Lösungsmittel präsent ist, wird eine minimale Berührung bevorzugt, zum Beispiel im Falle der Hydrolyse von Diethanolaminestern.
Die hochreinen Produkte
Die „hochreinen Produkte" der Erfindung beinhalten unter anderem Boronsäuren, die durch die offenbarten Verfahren gewonnen werden können (und die Charakteristika eines auf diese Art und Weise gewonnenen Produkts aufweisen). Auch eingeschlossen sind Produkte, die direkt oder indirekt durch die offenbarten Verfahren erhalten werden.
Die Produktidentitäten werden aus der vorhergehenden Beschreibung und den folgenden Beispielen deutlich. Außerdem werden Produkte der Offenbarung in den Ansprüchen beschrieben. Besonders beachtenswert sind die Daten in Beispiel 43, die darauf hindeuten, dass die Prozesse der Erfindung beeindruckenderweise Endproduktsalze erzielen können, die frei von durch HPLC nachweisbaren Verunreinigungen sind. In anderen Fällen sind die Salze im Wesentlichen frei von Verunreinigungen, z. B. mindestens zu 98% rein, häufiger mindestens zu 99% rein, z. B. mindestens 99,5% rein, im Sinne der HPLC-Reversed Phase (RP) Peakfläche in Prozent. Salze können zu mindestens 99,3%, 99,4%, 99,5% 99,6%, 99,7%, 99,8% oder 99,9% rein sein, im Sinne der HPLC-Reversed Phase (RP) Peakfläche in Prozent. Die geeigneten RP-HPLC-Arbeitsverfahren stimmen mit der Referenz 1 und/oder Referenz 2 und/oder Referenz 3 aus Beispiel 43 überein. Ebenfalls beinhaltet sind Produkte, die zumindest im Wesentlichen frei von Verunreinigung I und Analogen sind, Produkte, die frei von Verunreinigung IV und Analogen sind und Produkte, die kleine Spuren eines nicht-polaren Lösungsmittels enthalten, z. B. n-Heptan. Die Spurenmenge des nicht-polaren Lösungsmittels kann weniger als 0,2%, 0,1%, 0,05%, 0,01% oder 0,005% betragen, wie durch GC-Headspace-Chromatographie festgelegt.
Ebenfalls beinhaltet sind Salze, die weniger als 410 ppm Acetonitril enthalten.
Einige Salze enthalten Verunreinigungen von weniger als 10.000 ppm, 5000 ppm, 1000 ppm oder 500 ppm.
Verwendung der Produkte der Offenbarung
Bei den Salzen der Offenbarung handelt es sich um Thrombininhibitoren. Diese sind demzufolge für die Inhibierung von Thrombin nützlich. Deshalb werden Verbindungen bereitgestellt, die das Potenzial haben, die Hämostase zu kontrollieren und vor allem die Koagulation zu inhibieren, zum Beispiel bei der Behandlung oder Vorbeugung sekundärer Ereignisse nach einem Myokardininfarkt. Die medizinische Verwendung der Verbindungen kann prophylaktisch (zur Behandlung von Thrombosen und zur Vorbeugung des Auftretens von Thrombosen) und therapeutisch (zur Vorbeugung eines erneuten Auftretens von Thrombosen oder sekundären thrombotischen Ereignissen) sein.
Die Salze können eingesetzt werden, wenn ein antithrombogener Wirkstoff gebraucht wird. Ferner wurde festgestellt, dass die Salze, einschließlich jener von Boronsäuren mit der Formel (III) in dem Sinne vorteilhaft sind, als dass die Klasse für die Behandlung arterieller Thrombose durch Therapie oder Prophylaxe nützlich ist. Die offenbarten Salze sind also zur Behandlung oder Prophylaxe von Thrombosen und Hyperkoagulabilität im Blut und Gewebe von Tieren, einschließlich des Menschen indiziert. Der Begriff „Thrombose" beinhaltet inter alia atrophische Thrombose, arterielle Thrombose, Herzthrombose, Koronarthrombose, „Creeping"-Thrombose, infektiöse Thrombose, mesenterische Thrombose, plazentale Thrombose, sich ausbreitende Thrombose, traumatische Thrombose und venöse Thrombose.
Es ist bekannt, dass Hyperkoagulabilität zu thromboembolischen Erkrankungen führen kann.
Beispiele venöser Thromboembolien, die mit Verbindungen der Offenbarung behandelt oder denen mit diesen vorgebeugt werden kann, beinhalten die Verschluß einer Vene, die Verschluß einer Lungenarterie (pulmonale Embolie), tiefe Venenthrombose, Thrombosen, die mit Krebs oder Krebs-Chemotherapie zusammenhängen können, Thrombosen, die mit thrombophilen Erkrankungen wie zum Beispiel einer Protein-C-Defizienz, einer Protein-S-Defizienz, Antithrombin III-Defizienz und Faktor-V-Leiden vererbt werden können, und Thrombosen, die durch erworbene thrombophile Erkrankungen wie zum Beispiel systemischem Lupus Erythematosus (entzündliche Bindegewebserkrankung) verursacht werden können. Ebenfalls mit Hinblick auf venöse Thromboembolien können sich Verbindungen der Offenbarung bei der Aufrechterhaltung der Durchgängigkeit von Dauerkathetern als nützlich erweisen.
Beispiele kardiogener Thromboembolien, die mit Verbindungen der Offenbarung behandelt oder denen mit diesen vorgebeugt werden kann, beinhalten thromboembolische Schlaganfälle (wenn ein losgelöster Thrombus neurologische Beschwerden verursacht, die mit einer verschlechterten zerebralen Blutzufuhr zusammenhängen), kardiogene Thromboembolien, die mit Vorhofflimmern einhergehen (schnellem, unregelmäßigem Zucken der Muskelfasern der oberen Herzkammer), kardiogene Thromboembolien, die mit Herzklappenprothesen wie zum Beispiel mechanischen Herzklappen zusammenhängen können und kardiogene Thromboembolien, die durch Herzerkrankungen auftreten können.
Zu den Krankheiten, bei denen arterielle Thrombosen auftreten können, gehören instabile Angina (starke, beengende Schmerzen in der Brust mit koronarer Ursache), Myokardininfarkt (aufgrund unzureichender Blutzufuhr sterben Herzmuskelzellen ab), ischämische Herzerkrankung (lokale Ischämie aufgrund von Obstruktion (wie zum Beispiel durch arterielle Verengungen) der Blutzufuhr), Reokklusion während oder nach perkutaner transluminaler Koronarangioplastie, Restenose nach perkutaner tranluminaler Koronarangioplastie, Okklusion von Koronararterien-Bypass-Gefäßprothese und verschließende zerebrovaskuläre Erkrankung. Ebenfalls mit Hinblick auf arteriovenöse (gemischte) Thrombosen sind antithrombotische Verbindungen der Offenbarung für die Aufrechterhaltung der Durchgängigkeit von arteriovenösen Shunts nützlich.
Weitere Krankheiten, die mit Hyperkoagulabilität und thromboembolischen Erkrankungen zusammenhängen und die hier erwähnt werden sollten, vererbte oder erworbene Mängel an Heparin-Cofaktor-II, zirkulierende Antiphospholipid-Antikörper (Lupus antikoagulans), Homocysteinämie, heparininduzierte Thrombozytopenie und Defekte bei der Fibrinolyse.
Besondere Verwendungen, die erwähnt werden sollten, beinhalten die therapeutische und/oder prophylaktische Behandlung von venösen Thrombosen und pulmonalen Embolien. Zu den für die Produkte der Offenbarung (insbesondere die Salze von TRI 50c) in Betracht gezogenen Indikationen gehören:

• Vorbeugung venöser thromboembolischer Ereignisse (z. B. tiefe Venenthrombose und/oder pulmonale Embolie). Zu den Beispielen gehören Patienten, bei denen orthopädische Operationen durchgefürhrt werden, zum Beispiel ein vollständiger Hüftersatz, vollständiger Knieersatz oder größere Hüft- oder Knieoperationen; Patienten, bei denen allgemeine Operationen durchgeführt werden, bei denen ein hohes Thromboserisiko besteht, wie zum Beispiel bei abdominalen Operationen oder Beckenoperationen wegen Krebs; und Patienten, die für mehr als 3 Tage ans Bett gebunden sind und unter akutem Herzversagen, akutem respiratorischem Versagen, Infektionen leiden.
• Vorbeugung von Thrombosen im Hämodialysekreislauf von Patienten mit einer Nierenerkrankung im Endstadium.
• Vorbeugung von kardiovaskulären Ereignissen (Tod, Myokardininfarkt, u.s.w.) bei Patienten mit einer Nierenerkrankung im Endstadium, egal, ob diese Hämodialyse-Sitzungen benötigen oder nicht.
• Vorbeugung venöser thromboembolischer Ereignisse bei Patienten, die Chemotherapie über einen Dauerkatheter empfangen.
• Vorbeugung thromboembolischer Ereignisse bei Patienten, bei denen durch einen rekonstruktiven Eingriff in unteren Körpergliedern Arterien wiederhergestellt werden (Bypass, Endarteriektomie, transluminale Angioplastie, u.s.w.).
• Behandlung von venösen thromboembolischen Ereignissen.
• Vorbeugung kardiovaskulärer Ereignisse bei akuten Koronarsyndromen (z. B. instabile Angina, nicht Q-Welle Myokardischämie/infarkt), in Kombination mit einem weiteren kardiovaskulären Wirkstoff, zum Beispiel Aspirin (Acetylsalicylsäure; Aspirin ist eine in Deutschland angemeldete Marke), Thrombolytika (siehe unten für Beispiele), Antiblutplättchen-Wirkstoffe (siehe unten für Beispiele).
• Behandlung von Patienten mit akutem Myokardininfarkt in Kombination mit Acetylsalicylsäure, Thrombolytika (siehe unten für Beispiele).

Die Thrombininhibitoren der Offenbarung sind also sowohl für die therapeutische als auch die prophylaktische Behandlung aller obenstehenden Erkrankungen geeignet.
In einem Verfahren werden die Produkte der Offenbarung für die Behandlung von Patienten durch Hämodialyse verwendet, indem das Produkt in der Dialyselösung bereitgestellt wird, wie im Hinblick auf andere Thrombininhibitoren in WO 00/41715 beschrieben. Die Offenbarung beinhaltet deshalb sowohl Dialyselösungen und Dialysekonzentrate, die ein Produkt der Offenbarung umfassen, als auch ein Behandlungsverfahren zur Dialyse eines Patienten, der eine solche Behandlung benötigt, wobei das Verfahren die Verwendung einer Dialyselösung einschließlich eines Thrombininhibitors niedrigen molekularen Gewichts umfasst. Ebenfalls beinhaltet ist die Verwendung eines anti-thrombotischen Produkts der Offenbarung zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung eines Patienten durch Dialyse, wobei das anti-thrombotische Produkt der Offenbarung in der Dialyselösung bereitgestellt wird.
In einem weiteren Verfahren werden die Produkte der Offenbarung zur Bekämpfung unerwünschter Zellproliferation wie mit Hinblick auf andere Thrombininhibitoren in WO 01/41796 beschrieben verwendet. Die unerwünschte Zellproliferation ist typischerweise hyperplastische Zellproliferation, zum Beispiel die Proliferation von glatten Muskelzellen, insbesondere vaskulären glatten Muskelzellen. Die Produkte der Offenbarung sind besonders für die Behandlung intimaler Hyperplasie nützlich, deren eine Komponente die Proliferation von glatten Muskelzellen ist. Restenose kann auf neointimale Hyperplasie zurückgeführt werden; dementsprechend beinhaltet intimale Hyperplasie im Kontext der Offenbarung auch Restenose.
Die Produkte der Offenbarung werden auch für die Behandlung ischämischer Erkrankungen in Betracht gezogen. Insbesondere können sie zur Behandlung (sei es therapeutisch oder prophylaktisch) einer ischämischen Erkrankung eines Patienten verwendet werden, der unter nicht valvulärem Vorhofflimmern (NVAF) leidet oder ein hohes Risiko diesbezüglich aufweist, wie mit Hinblick auf andere Thrombininhibitoren in WO 02/36157 beschrieben. Ischämische Erkrankungen sind Krankheiten, zu deren Auswirkungen eine Einschränkung der Blutversorgung eines bestimmten Körperteils gehört. Der Begriff soll Thrombose und Hyperkoagulabilität im Blut, Gewebe und/oder in Organen beinhalten. Bestimmte Anwendungsmöglichkeiten, die erwähnt werden sollten, beinhalten die Vorbeugung und/oder Behandlung ischämischer Herzerkrankungen, Myokardininfarkten, systemischer embolischer Ereignisse in z. B. Nieren oder Milz und insbesondere zerebraler Ischämie, einschließlich zerebraler Thrombose, zerebraler Embolie und/oder zerebraler Ischämie, die mit nicht-zerebraler Thrombose oder Embolie zusammenhängt (mit anderen Worten die Behandlung (sei es therapeutisch oder prophylaktisch) thrombotischer oder ischämischer Schlaganfälle und transienter ischämischer Attacken), insbesondere bei Patienten mit NVAF oder diesbezüglichem Risiko.
Die Produkte der Offenbarung werden auch für die Behandlung rheumatischer/arthrititischer Erkrankungen in Betracht gezogen, wie mit Hinblick auf andere Thrombininhibitoren in WO 03/007984 beschrieben. So können die Produkte der Offenbarung zur Behandlung chronischer Arthritis, rheumatischer Arthritis, Osteoarthritis oder ankylosierender Spondylitis verwendet werden.
Außerdem wird erwartet, dass die Produkte der Offenbarung bei der Prophylaxe von Reokklusion (d. h. Thrombose) nach der Thrombolyse, perkutanen transluminalen Angioplastie (PTA) und Koronar-Bypass-Operationen von Nutzen sein können; und für die Vorbeugung von erneuten Thrombosen nach Mikrooperationen und vaskulären Operationen im Allgemeinen. Weitere Indikationen beinhalten die therapeutische und/oder prophylaktische Behandlung von disseminierter intravaskulärer Koagulation, die durch Bakterien, multiple Traumata, Vergiftung oder andere Mechanismen verursacht werden kann; die antikoagulante Behandlung, wenn Blut mit fremden Oberflächen im Körper in Berührung kommt, wie zum Beispiel vaskulären Transplantaten, vaskulären Stents, vaskulären Kathetern, mechanischen und biologischen prosthetischen Klappen oder anderen medizinischen Geräten; und die antikoagulante Behandlung, wenn Blut mit medizinischen Geräten außerhalb des Körpers in Berührung kommt, wie zum Beispiel während kardiovaskulärer Operationen unter Verwendung einer Herz-Lungen-Maschine oder während der Hämodialyse.
Die Produkte der Offenbarung sind ferner für die Behandlung von Krankheiten geeignet, bei denen ein unerwünschter Überschuss von Thrombin ohne Zeichen von Hyperkoagulabilität besteht, zum Beispiel bei neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer. Zusätzlich zu diesen Auswirkungen auf den Koagulationsprozess ist von Thrombin bekannt, dass es eine große Anzahl von Zellen aktiviert (wie zum Beispiel Neutrophile, Fibroblasten, Endothelzellen und glatte Muskelzellen). Deshalb können die Verbindungen der Offenbarung auch für die therapeutische und/oder prophylaktische Behandlung von idiopathischem Atemnotsyndrom und Atemnotsyndrom des Erwachsenen, pulmonaler Fibrose nach Behandlung durch Bestrahlung oder Chemotherapie, septischem Schock, Septikämie und entzündlichen Reaktionen geeignet sein, zu denen Ödeme, akute oder chronische Atherosklerose wie zum Beispiel koronare Arterienerkrankung, zerebrale Arterienerkrankung, periphere Arterienerkrankung, Reperfusionsschaden und Restenose nach perkutaner transluminaler Angioplastie (PTA) gehören, ohne auf diese begrenzt zu sein.
Die Salze können auch bei der Behandlung von Pankreatitis nützlich sein.
Die hierin beschriebenen Salze sind außerdem für die Inhibierung der prokoagulatorischen Aktivität von Blutplättchen von Nutzen. Die Offenbarung stellt ein Verfahren zur Inhibierung der prokoagulatorischen Aktivität von Blutplättchen bereit, indem ein Salz einer hierin beschriebenen Boronsäure einem Säugetier, insbesondere einem menschlichen Patienten, verabreicht wird, das unter arterieller Thrombose leidet oder ein hohes Risiko diesbezüglich aufweist. Ebenfalls bereitgestellt wird die Verwendung solcher Salze zur Herstellung von Medikamenten, die der Inhibierung der prokoagulatorischen Aktivität von Blutplättchen dienen.
Die Verwendung der Produkte der Offenbarung als Inhibitoren der prokoagulatorischen Aktiviät von Blutplättchen beruht auf der Beobachtung, dass die hierin beschriebenen Boronsäuren sowohl für die Inhibierung arterieller Thrombose als auch venöser Thrombose geeignet zu sein scheinen.
Indikationen im Zusammenhang mit arterieller Thrombose beinhalten akute Koronarsyndrome (insbesondere Myokardininfarkt und instabile Angina), zerebrovaskuläre Thrombose und periphere arterielle Okklusion und arterielle Thrombose, die als Folge von Vorhofflimmern, valvulärer Herzerkrankung, arteriovenösen Shunts, Dauerkathetern oder Koronarstents auftritt. Dementsprechend wird unter einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur Behandlung einer Erkrankung oder Krankheit bereitgestellt, die aus dieser Gruppe von Indikationen ausgewählt sind, wobei das Verfahren die Verabreichung eines Salzes der Offenbarung an ein Säugetier und insbesondere einen menschlichen Patienten umfasst. Die Offenbarung beinhaltet Produkte zur Verwendung in einer arteriellen Umgebung, z. B. einem Koronarstent oder anderem arteriellen Implantat, die eine Beschichtung aufweisen, welche das Salz gemäß der Offenbarung umfasst.
Die Salze der Offenbarung können prophylaktisch zur Behandlung eines Individuums verwendet werden, das unter arterieller Thrombose oder einer Krankheit oder Erkrankung im Zusammenhang mit arterieller Thrombose leidet oder diesbezüglich ein Risiko aufweist, oder therapeutsch (einschließlich um dem erneuten Auftreten von Thrombosen oder sekundären thrombotischen Ereignissen vorzubeugen).
Deshalb wird sowohl die Verwendung der hierin beschriebenen selektiven Thrombininhibitoren (Salze von Organoboronsäuren) zur Behandlung der obigen Erkrankungen durch Prophylaxe oder Therapie als auch ihre Verwendung in pharmazeutischen Formulierungen und die Herstellung von pharmazeutischen Formulierungen bereitgestellt.
Verabreichung und pharmazeutische Formulierungen
Die Salze können einem Wirt verabreicht werden, beispielsweise wenn das Medikament antithrombogene Aktivität aufweist und ein antithrombogener Effekt erzielt werden soll. Im Falle größerer Tiere, wie zum Beispiel dem Menschen, können die Verbindungen allein oder in Kombination mit pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmitteln, Exzipienten oder Trägern verabreicht werden. Der Begriff „pharmazeutisch verträglich" beinhaltet die Verträglichkeit für sowohl menschliche als auch veterinäre Zwecke, wobei die Verträglichkeit für die pharmazeutische Verwendung beim Menschen bevorzugt wird.
Die Salze der Offenbarung können mit jedem kardiovaskulären Behandlungswirkstoff kombiniert und/oder mit diesem gemeinsam verabreicht werden. Es gibt eine große Anzahl kardiovaskulärer Behandlungswirkstoffe, die für die kommerzielle Verwendung, klinische Bewertung und präklinische Entwicklung zur Verfügung stehen und die für die Verwendung mit einem Produkt der Offenbarung zur Vorbeugung kardiovaskulärer Störungen im Rahmen einer medikamentösen Kombinationstherapie ausgewählt werden könnten. Ein solcher Wirkstoff kann aus einem oder mehreren Wirkstoffen bestehen, die aus mehreren großen Kategorien ausgewählt werden, ohne auf diese begrenzt zu sein, namentlich ein lipidsenkendes Medikament, einschließlich eines IBAT (Ileum Na⁺/Gallensäure-Cotransporter) Inhibitors, eines Fibrats, Niacins, eines Statins, eines CETP (Cholesteryl-Ester- Transfer-Protein) Inhibitors, und eines Gallensäure-Komplexbildners, ein Antioxidans, einschließlich Vitamin E und Probucol, ein IIb/IIIa-Antagonist (z. B. Abciximab, Eptifibatid, Tirofiban), ein Aldosteron-Inhibitor (z. B. Spirolacton und Epoxymexrenon), ein Adenosin-A2-Rezeptor-Antagonist (z. B. Losartan), ein Adenosin-A3-Rezeptor-Agonist, ein Betablocker, Acetylsalicylsäure, ein Schleifendiuretikum und ein ACE (Angiotensin umwandelndes Enzym) Inhibitor.
Die Salze der Offenbarung können mit jeglichen antithrombotischen Wirkstoffen, die einen anderen Aktionsmechanismus aufweisen, kombiniert und/oder mit diesen gemeinsam verabreicht werden, wie zum Beispiel mit den Antiblutplättchen-Wirkstoffen Acetylsalicylsäure, Ticlopidin, Clopidogrel, Thromboxanrezeptor- und/oder Synthetase-Inhibitoren, Prostacyclin-Mimetika und Phosphodiesteraseinhibitoren und ADP-Rezeptor-(P₂T)-Antagonisten.
Die Produkte der Offenbarung können ferner mit Thrombolytika kombiniert und/oder mit diesen gemeinsam verabreicht werden, wie zum Beispiel mit Gewebeplasminogenaktivatoren (natürlich, rekombinant oder modifiziert), Streptokinase, Urokinase, Prourokinase, anisoliertem Plasminogen-Streptokinase-Aktivatorkomplex (APSAC), Plasminogenaktivatoren tierischer Speicheldrüsen und ähnlichem, für die Behandlung thrombotischer Erkrankungen, insbesondere Myokardininfarkte.
Die Salze der Offenbarung können mit einem Medikament zur Kardioprotektion kombiniert und/oder mit diesem gemeinsam verabreicht werden, zum Beispiel einem Adenosin A1- oder A3-Rezeptoragonisten.
Ebenfalls bereitgestellt wird ein Verfahren zur Behandlung einer entzündlichen Erkrankung bei einem Patienten, das die Behandlung des Patienten mit einem Produkt der Offenbarung und einem NSAID, z. B. einem COX-2-Inhibitor umfasst. Solche Erkrankungen beinhalten, ohne auf diese begrenzt zu sein, systemischen Lupus Erythematosus, rheumatische Arthritis, Glomerulonephritis, Vaskulitis und Sarkoidose. Dementsprechend können die anti thrombotischen Salze der Offenbarung mit einem NSAID kombiniert und/oder mit diesem gemeinsam verabreicht werden.
Die hierin beschriebenen Salze können deshalb typischerweise einem Wirt verabreicht werden, um einen thrombininhibierenden Effekt zu erzielen oder in einem anderen hierin erwähnten thrombininhibierenden oder anti-thrombotischen Zusammenhang.
Die tatsächlichen Dosierungshöhen der aktiven Wirkstoffe in den pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Offenbarung können variiert werden, um eine Menge der aktiven Verbindung(en) zu erhalten, die ausreichend ist, um die gewünschte therapeutische Antwort für einen bestimmten Patienten, eine bestimmte Zusammensetzung und einen bestimmten Verabreichungsweg zu erzielen (hierin als eine „therapeutisch wirksame Menge" bezeichnet). Die gewählte Dosierungshöhe wird von der Aktivität der spezifischen Verbindung, dem Schweregrad der behandelten Krankheit und dem Zustand und der medizinischen Vorgeschichte des behandelten Patienten abhängen. Es entspricht jedoch den anerkannten Techniken, mit Dosen der Verbindung anzufangen, die unter dem für die Erzielung des gewünschten therapeutischen Effekts notwendigen Niveau liegen, und dann die Dosen graduell zu steigern, bis der gewünschte Effekt erzielt wird.
Gemäß einem weiteren Aspekt wird eine parenterale Formulierung bereitgestellt, die ein hierin beschriebenes Salz enthält. Die Formulierung kann aus dem Salz allein bestehen oder zusätzliche Komponenten enthalten, insbesondere kann das Salz in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel, Exzipienten oder Träger auftreten, zum Beispiel einem Tonizitätsmittel, um die Formulierung im Wesentlichen mit dem Körper des Subjekts, welches die Formulierung empfangen soll, z. B. menschlichem Plasma, isotonisch zu machen. Die Formulierung kann in gebrauchsfertiger Form oder in einer Form auftreten, die vor der Verabreichung der Rekonstitution bedarf.
Es wird derzeit angenommen, dass im Falle einer parenteralen Verabreichung, zum Beispiel einer i. v. Verabreichung von Salzen von TRI 50c, die Salze beispielsweise in Mengen von zwischen 0,5 und 2,5 mg/Kg über eine maximale Dauer von 72 Stunden verabreicht werden sollten, berechnet wie TRI 50c. Andere Salze könnten in äquivalenten molaren Mengen verabreicht werden. Die Offenbarung ist nicht auf die Verabreichung solcher Quantitäten oder Verabreichungsarten begrenzt und beinhaltet Dosierungen und Verabreichungsarten, die außerhalb der im vorherigen Satz beschriebenen liegen.
Parenterale Präparationen können über einen oder mehrere Wege verabreicht werden, zum Beispiel intravenös, subkutan, intradermal und per Infusion; ein besonderes Beispiel ist die intravenöse Verabreichung. Eine hierin offenbarte Formulierung kann mithilfe einer Spritze, eines Injektors, eines Plungers für feste Formulierungen, einer Pumpe oder eines anderen Geräts, das von der Technik als für die parenterale Verabreichung geeignet anerkannt ist, verabreicht werden.
Flüssige Dosierungsformen für die parenterale Verabreichung können Lösungen, Suspensionen, Liposomformulierungen oder Emulsionen in öligen oder wässrigen Vehikeln beinhalten. Zusätzlich zu den aktiven Verbindungen können die flüssigen Dosierungsformen auch noch andere Verbindungen enthalten. So können zum Beispiel Tonizitätsmittel (um die Formulierungen im Wesentlichen mit dem Körper des Subjekts, z. B. dem menschlichen Plasma, isotonisch zu machen), wie zum Beispiel Natriumchlorid, Natriumsulfat, Dextrose, Mannitol und/oder Glycerol, der parenteralen Formulierung optional zugesetzt werden. Ein pharmazeutisch verträglicher Puffer kann zugesetzt werden, um den pH-Wert zu kontrollieren. Verdickungsmittel oder viskositätserhöhende Mittel, zum Beispiel geläufige Cellulose-Derivate (z. B. Methylcellulose, Carboxymethylcellulose, Hydroxyethylcellulose und Hydroxypropylmethylcellulose), Gelatine und/oder Akaziengummi, können der parenteralen Formulierung optional zugesetzt werden.
Zu den festen Dosierungsformen parenteraler Verabreichung können feste und halbfeste Formen gehören, welche Pellets, Puder, Granulat, Pflaster und Gele beinhalten können. In solchen festen Dosierungsformen wird die aktive Verbindung typischerweise mit mindestens einem inerten, pharmazeutisch verträglichen Exzipienten oder Träger gemischt. Die offenbarten Salze können als Festkörper in fein zerteilter Form präsentiert werden, zum Beispiel gemahlen oder mikronisiert.
Die Formulierungen können auch Antioxidanzien und/oder Konservierungsmittel beinhalten. Als Antioxidanzien sollten Thiolderivate (z. B. Thioglycerol, Cystein, Acetylcystein, Cystin, Dithioerythreitol, Dithiothreitol, Glutathion), Tocopherole, butyliertes Hydroxyanisol, butyliertes Hydroxytoluen, Schwefelsäuresalze (z. B. Natriumsulfat, Natriumbisulfit, Acetonnatriumbisulfit, Natriummetabisulfit, Natriumsulfit, Natriumformaldehydsulfoxylat, Natriumthiosulfat) und Nordihydroguajaretsäure erwähnt werden. Geeignete Konservierungsmittel können beispielsweise Phenol, Chlorbutanol, Benzylalkohol, Methylparaben, Propylparaben, Benzalkoniumchlorid und Cetylpyridiniumchlorid sein.
Die parenteralen Formulierungen können als großvolumige Parenteralia (LVPs), z. B. größer als 100 ml, insbesondere ungefähr 250 ml, einer flüssigen Formulierung der aktiven Verbindung präpariert werden. Beispiele für LVPs sind Infusionsbeutel. Die parenteralen Formulierungen können alternativ dazu als kleinvolumige Parenteralia (SVPs), z. B. ungefähr 100 ml oder weniger einer flüssigen Formulierung der aktiven Verbindung präpariert werden. Beispiele für SVPs sind Viale mit Lösung, Viale zur Rekonstitution, vorgefüllte Spritzen zur Injektion und Doppelkammerspritzen.
Die Formulierungen der Offenbarung beinhalten jene, in denen das Salz ein Alkalimetallsalz ist, zum Beispiel ein Lithium-, Natrium- oder Kaliumsalz, von denen Natriumsalze als besondere Salze erwähnt werden sollten. Eine weitere Klasse von Formulierungen enthält Aminozuckersalze der offenbarten Boronsäuren, zum Beispiel N-Methyl-D-Glucamin-Salze. Die in diesem Paragrafen erwähnten Salze können als Lösungen in Wasser verabreicht werden und enthalten typischerweise einen oder mehrere Zusatzstoffe, zum Beispiel Isotonizitätsminttel und/oder ein Antioxidans/Antioxidanzien. Eine geeignete Lagerungsmethode für die Salze ist es, diese in fester Form, zum Beispiel als trockenen Puder zu lagern und dann vor der Verabreichung in Lösungen zur Verabreichung umzuwandeln.
Eine Klasse der hierin offenbarten Formulierungen sind intravenöse Formulierungen. In intravenös verabreichten Formulierungen kann die aktive Verbindung (oder Verbindungen) in verschiedenen Konzentrationen präsent sein, wobei ein für parenterale Präparationen verträglicher Träger den Rest ausmacht. Insbesondere ist der Träger Wasser, insbesondere pyrogenfreies Wasser, oder weist eine wässrige Basis auf. Der Träger für solche parenterale Präparationen ist insbesondere eine wässrige Lösung, die ein Tonizitätsmittel, zum Beispiel eine Natriumchloridlösung umfasst.
Unter „wässriger Basis" versteht man, dass die Formulierung ein Lösungsmittel umfasst, das aus Wasser oder aus Wasser und einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel oder Lösungsmitteln besteht; das Lösungsmittel kann neben einem Salz der Offenbarung in aufgelöster Form auch eine oder mehrere andere aufgelöste Substanzen aufweisen, zum Beispiel ein Antioxidans und/oder ein Isotonizitätsmittel. Als organische Zusatzlösungsmittel können jene häufig von der Technik verwendeten wassermischbaren Lösungsmittel erwähnt werden, zum Beispiel Propylenglycol, Polyethylenglycol 300, Polyethylenglycol 400 und Ethanol. Vorzugsweise werden organische Zusatzlösungsmittel nur dann verwendet, wenn der Wirkstoff in Wasser nicht ausreichend löslich ist, um eine therapeutisch wirksame Menge in einer einzelnen Dosierungsform bereitzustellen. Wie zuvor angedeutet, beinhaltet die Offenbarung Formulierungen von Alkalimetallsalzen der offenbarten Boronsäuren, z. B. TRI 50c, die ein Lösungsmittel aufweisen, welches aus Wasser besteht.
Die Löslichkeit der aktiven Verbindung in den vorliegenden Formulierungen kann so sein, dass die Trübung der Formulierung unter 50 NTU liegt, z. B. niedriger als 20 NTU, beispielsweise niedriger als 10 NTU ist.
Es ist wünschenswert, dass parenterale Formulierungen bei einem physiologischem pH-Wert oder einem diesem naheliegenden verabreicht werden. Die Verabreichung einer Formulierung mit einem hohen pH-Wert (d. h. größer als 8) oder einem niedrigen pH-Wert (d. h. weniger als 5) wird als nicht wünschenswert angesehen. So wird insbesondere in Betracht gezogen, dass die Formulierungen bei einem pH-Wert von zwischen 6,0 und 7,0 wie zum Beispiel einem pH-Wert von 6,5 verabreicht werden.
Die parenterale Formulierung kann beim Verpacken luftfrei gemacht werden. Die parenterale Formulierung kann in einem sterilen Behälter, z. B. einem Vial, als eine Lösung, Suspension, Gel, Emulsion, ein Feststoff oder Puder verpackt werden. Solche Formulierungen können entweder in gebrauchsfertiger Form oder in einer Form gelagert werden, die vor der Verabreichung der Rekonstitution bedarf.
Parenterale Formulierungen gemäß der Offenbarung können in Behältern verpackt werden. Es können Behälter gewählt werden, die aus Material hergestellt sind, welches mit der parenteralen Formulierung nicht reaktiv oder im Wesentlichen nicht reaktiv ist. Es können Glas- oder Plastikbehälter, z. B. Infusionsbeutel aus Plastik, verwendet werden. Es ist wichtig, dass Behältersysteme die Lösung vor einem Abbau durch UV-Strahlung schützen können. Wenn gewünscht, kann bernsteinfarbenes Glas mit Eisenoxid oder eine dunkle Abdeckung, die über den Behälter gestülpt wird, den angemessenen UV-Schutz bereitstellen.
Plastikbehälter, wie zum Beispiel Infusionsbeutel aus Plastik, sind in dem Sinne vorteilhaft, als dass sie relativ leicht und unzerbrechlich sind, und deshalb leichter gelagert werden können. Dies gilt vor allem für großvolumige Parenteralia.
Die intravenösen Präparationen können durch eine Kombination der aktiven Verbindung oder Verbindungen mit dem Träger präpariert werden. Nachdem die Formulierung gemischt worden ist, kann sie zum Beispiel unter Verwendung bekannter Verfahren sterilisiert werden. Wenn die Formulierung sterilisiert worden ist, kann sie verabreicht oder für die Lagerung verpackt werden, insbesondere in dunklen Verpackungen (z. B. Flaschen oder Plastikverpackungen). Es wird jedoch überlegt, dass die offenbarten Salze nicht als Lösung sondern als trockene Festkörper, insbesondere in fein zerteilter Form wie zum Beispiel als ein Lyophilisat gelagert werden könnten, um ihre Lagerfähigkeit zu verlängern; dies gilt natürlich nicht nur für intravenöse, sondern auch für andere parenterale Formulierungen.
Die intravenösen Präparationen können die Form großvolumiger Parenteralia oder kleinvolumiger Parenteralia wie oben beschrieben annehmen.
In einer spezifischen Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Offenbarung auf Produkte, insbesondere Kits, zur Produktion einer Verabreichungseinheit mit einer einzelnen Dosierung. Die Produkte (Kits) können jeweils sowohl einen ersten Behälter mit der aktiven Verbindung (optional kombiniert mit Zusatzstoffen, zum Beispiel einem Antioxidans, Konservierungsmittel und in manchen Fällen einem Tonizitätsmittel) und einen zweiten Behälter mit dem Träger/Verdünnungsmittel (zum Beispiel Wasser, optional mit einem oder mehreren Zusatzstoffen, zum Beispiel einem Tonizitätsmittel) enthalten. Als Beispiele solcher Produkte können vorgefüllte Spritzen mit einer oder mehreren Kammern (z. B. Doppelkammer) erwähnt werden; beispielhafte vorgefüllte Spritzen sind bei der Vetter GmbH, Ravensburg, Deutschland, erhältlich. Solche Doppelkammerspritzen oder binäre Spritzen weisen in einer Kammer eine trockene Präparation auf, die die aktive Verbindung beinhaltet oder aus dieser besteht, und in einer anderen Kammer einen geeigneten Träger oder geeignetes Verdünnungsmittel, wie hierin beschrieben. Die zwei Kammern sind so miteinander verbunden, dass sich der Festkörper und die Flüssigkeit vermischen, um die abschließende Lösung zu bilden.
Eine Klasse der hierin offenbarten Formulierungen umfasst subkutane oder intradermale Formulierungen (zum Beispiel zur Injektion gedachte Formulierungen), in denen das aktive Salz (oder die Wirkstoffkombination) in eine parenterale Präparation formuliert wird, die subkutan oder intradermal injiziert werden kann. Die zur Verabreichung gedachte Formulierung umfasst das aktive Salz und einen flüssigen Träger.
Der in einer subkutan oder intradermal injizierten parenteralen Präparation verwendete Träger kann ein wässriger Träger (zum Beispiel Wasser, das typischerweise einen Zusatzstoff, z. B. ein Antioxidans und/oder ein Isotonizitätsmittel enthält) oder ein nicht-wässriger Träger sein (auch in diesen können ein oder mehrere Zusatzstoffe inkorporiert sein). Als ein nicht- wässriger Träger für solche parenteralen Präparationen kann hochreines Olivenöl erwähnt werden.
Die aktive Verbindung und der Träger werden typischerweise kombiniert, zum Beispiel in einem Mixer. Nachdem die Formulierung gemischt wurde, wird sie vorzugsweise sterilisiert, zum Beispiel durch U.V.-Bestrahlung. Nachdem die Formulierung sterilisiert worden ist, kann sie injiziert oder für die Lagerung verpackt werden. Es wird jedoch in Betracht gezogen, dass die offenbarten Salze nicht in flüssiger Formulierung gelagert werden, sondern als trockene Festkörper, um ihre Lagerfähigkeit zu verlängern.
Um subkutane Implantate herzustellen, kann das aktive Salz geeigneterweise mit einem oder mehreren Polymeren formuliert werden, die bei der Verwendung stufenweise abgetragen oder abgebaut werden, z. B. Silikonpolymere, Ethylenvinylacetat, Polyethylen oder Polypropylen.
Transdermale Formulierungen können in Form von Matrizen oder Membranen oder als flüssige oder visköse Formulierungen in Öl oder Hydrogelen oder als ein Pellet aus komprimiertem Puder präpariert werden. Bei transdermalen Pflastern kann ein von der Haut verträglicher Klebstoff beinhaltet sein, wie zum Beispiel Polyacrylat, ein Silikonklebstoff oder Polyisobutylen, als auch eine Folie, die aus z. B. Polyethylen, Polypropylen, Ethylenvinylacetat, Polyvinylchlorid, Polyvinylidenchlorid oder Polyester gemacht wird, und eine abziehbare Schutzfolie, die aus z. B. Polyester oder Papier, das mit Silikon oder einem Fluorpolymer beschichtet ist, hergestellt wird. Bei der Präparation transdermaler Lösungen oder Gele können Wasser oder organische Lösungsmittel oder Mischungen dieser verwendet werden. Transdermale Gele können außerdem ein oder mehrere geeignete Geliermittel oder Verdickungsmittel wie zum Beispiel Silikon, Tragant, Stärke oder Stärkederivate, Cellulose oder Cellulosederivate oder Polyacrylsäuren oder Derivate dieser enthalten. Transdermale Formulierungen können außerdem passenderweise eine oder mehrere Substanzen enthalten, die die Absorption über die Haut verstärken, wie zum Beispiel Gallensalze oder Derivate dieser und/oder Phospholipide. Transdermale Formulierungen können gemäß einem z. B. in B. W. Barry, „Dermatological Formulations, Percutaneous Absorption", Marcel Dekker Inc., New York-Basel, 1983, oder Y. W. Chien, „Transdermal Controlled Systemic Medications", Marcel Dekker Inc., New York-Basel, 1987 offenbarten Verfahren präpariert werden.
Aus dem Vorhergehenden wird deutlich, dass pharmazeutische Produkte bereitgestellt werden, die ein Alkalimetallsalz, insbesondere ein Natriumsalz einer Boronsäure mit der Formel (I) in trockener Feinpartikelform umfassen, das für die Rekonstitution in eine wässrige, gebrauchsfertige parenterale Formulierung geeignet ist. Das Alkalimetallsalz ist passenderweise ein saures Salz. Das Alkalimetallsalz kann in einer Dosierungsform einer kleinvolumigen parenteralen Einheit auftreten. Das Alkalimetallsalz kann in einer Form, z. B. einer trockenen Puderform, die für die Rekonstitution als großvolumige Parenteralia geeignet ist, präsentiert werden. Ein Beispiel ist ein Natriumsalz einer Boronsäure der Formel (I), insbesondere TRI 50c, in trockener Puderform zur Rekonstitution als eine flüssige intravenöse Formulierung (Lösung), die ein Tonizitätsmittel enthält, insbesondere ein Natriumchlorid. Die trockene Puderform eines in einer parenteralen Formulierung verwendeten Salzes kann ein Lyophilisat sein. Die rekonstituierte Lösung kann per Injektion oder Infusion verabreicht werden.
BEISPIELE
HINWEISE ZU DEN BEISPIELEN
Alle Beispiele beziehen sich auf die Neuartigen Produkte dieser Offenbarung. Genauer beziehen sich die Beispiele auf die verschiedenen, im „Handbuch zur Beschreibung" erwähnten Kategorien wie folgt:

• Beispiele 1 bis 4 und 42 bis 44 beziehen sich auf Synthetische Verfahren II und damit auf die Hochreinen Produkte (eine Klasse Neuartiger Produkte)
• Beispiele 5 bis 35 und 40 beziehen sich auf Synthetische Verfahren I und auf die Charakterisierung und das Testen der Neuartigen Produkte, die mithilfe der Techniken aus Synthetische Verfahren I hergestellt wurden
• Beispiele 36 bis 39 und 41 enthalten unveröffentlichtes Material, mit dem gezeigt wird, dass TRI 50c und somit die Neuartigen Produkte (einschließlich also der Hochreinen Produkte) in arteriellen als auch venösen Kontexten wirksam sind.

BEISPIELE 1 BIS 4 – EINFÜHRENDE BEMERKUNGEN
Geräte
Im Laufe der folgenden Arbeitsverfahren in Beispielen 1 bis 4 werden die üblichen Labor-Glaswaren und wenn angemessen Spezialgeräte zur Handhabung und für den Transfer von luftempfindlichen Reagenzien verwendet.
Die Glaswaren werden vor der Anwendung bei 140–160°C mindestens 4 Stunden lang erhitzt und dann entweder in einem Exsikkator oder durch Zusammenbau im heißen Zustand gefolgt von Spülung mit trockenem Stickstoff abgekühlt.
Lösungsmittel
Die in den Arbeitsverfahren in Beispielen 1 bis 4 verwendeten organischen Lösungsmittel sind alle trocken. Passenderweise werden sie vor der Anwendung über Natriumdraht getrocknet.
Trockenheit
In den Trocknungsarbeitsverfahren in Beispielen 1 bis 4 werden Produkte auf ihre Trockenheit hin getestet (einschließlich Trockenheit im Sinne von organischen Lösungsmitteln), indem der Gewichtsverlust beim Trocknen beobachtet wird. Das folgende Arbeitsverfahren wurde befolgt, um den Verlust beim Trocknen zu bestimmen: Eine Probe wird unter einen Vakuumtrockner gestellt und bei 40°C und 100 mbar 2 Stunden lang getrocknet. Produkte werden als trocken angesehen, wenn die Gewichtsabnahme beim Trocknen weniger als 0,5% des Gesamtgewichts des Startmaterials ausmacht.
Beispiele 1 bis 4 beschreiben die Durchführung des folgenden Reaktionsschemas und die Konversion des entstehenden TRI 50c in die Natrium- und Calciumsalze davon:

[Diethanolamine = Diethanolamin Acid = Säure]
LDA = Lithium Diisopropylamid
LiHMDS = Lithium Hexamethyldisilazan, auch als Lithium bis(Trimethylsilyl)Amid bekannt

BEISPIEL 1 – SYNTHESE VON TRI 50D
Schritt 1: Z-DIPIN B
Arbeitsverfahren A
17,8 g (732,5 mmol) Magnesiumdrehspäne, 0,1 g (0,4 mmol) Iodin und 127 ml trockenes Tetrahydrofuran werden geladen und unter Rückfluss erhitzt. Dann werden 15 ml einer Lösung von 66 g (608 mmol) 1-Chlor-3-Methoxypropan in 185 ml trockenem Tetrahydrofuran zugesetzt und unter Rückfluss gerührt, bis die kraftvolle Reaktion einsetzt. Nach der anfänglichen exothermen Phase wird die Lösung von 1-Chlor-3-Methoxypropan langsam zugesetzt, um einen sanften Rückfluss aufrechtzuerhalten, bis das gesamte Magnesium verbraucht ist. Nachdem die Reaktion vorbei ist, wird die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur abgekühlt und langsam einer Lösung von 64,4 g (620 mmol) Trimethylborat in 95 ml trockenem Tetrahydrofuran zugesetzt; die letztere Lösung wird dann auf unter 0°C abgekühlt und falls sie sich im Laufe der Reaktion erwärmen sollte, muss die Reaktionsmischung ausreichend langsam zugesetzt werden, um die Temperatur dieser Lösung unter –65°C zu halten. Nach Beendigung des Zusatzes lässt man die Reaktionsmischung stehen, bis sie sich auf ungefähr 0°C erwärmt hat und rührt sie noch ungefähr 60 Minuten lang. Dann wird eine Lösung von 22,4 ml Schwefelsäure in 400 ml Wasser langsam zugesetzt, um die Temperatur unter 20°C zu halten. Dann wird zugelassen, dass sich die Schichten absetzen und sich die Phasen trennen. Die wässrige Schicht wird mit 200 ml Tert.-Butylmethylether drei Mal erneut gewaschen. Dann wird zugelassen, dass sich die kombinierten organischen Schichten absetzen und überschüssiges Wasser, das sich von der Lösung getrennt hat, wird entfernt. Die organische Schicht wird über Magnesiumsulfat getrocknet, gefiltert und verdunstet, bis sie im trockenen Zustand vorliegt. Der Abdampfrückstand wird aus dem niedergeschlagenen Festkörper gefiltert und das Filtrat wird in 175 ml Toluen aufgelöst. 34,8 g (292 mmol) Pinacol werden in die Lösung geladen, woraufhin das Ganze bei Umgebungstemperatur für nicht weniger als 10 Stunden gerührt wird. Die Lösung wird verdunstet, bis sie im trockenen Zustand vorliegt, in 475 ml N-Heptan aufgelöst und drei Mal mit 290 ml gesättigter, wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Die N-Heptan-Lösung wird verdunstet, bis sie im trockenen Zustand vorliegt, der Abdampfrückstand wird destilliert und die Fraktion mit Bp 40–50°C bei 0,1–0,5 mBar zurückgewonnen.
Siedepunkt: 40–50°C/0,1–0,5 mbar
Ausbeute: 40,9 g (70%) Z-DIPIN B (Öl)
Arbeitsverfahren B
17,8 g (732,5 mmol) Magnesiumdrehspäne, 0,1 g (0,4 mmol) Iodin und 127 ml trockenes Tetrahydrofuran werden geladen und unter Rückfluss erhitzt. Dann werden 15 ml einer Lösung von 66 g (608 mmol) 1-Chlor-3-Methoxypropan in 185 ml trockenem Tetrahydrofuran zugesetzt und unter Rückfluss gerührt, bis die kraftvolle Reaktion einsetzt. Nach der anfänglichen exothermen Phase wird die Lösung von 1-Chlor-3-Methoxypropan langsam zugesetzt, um einen sanften Rückfluss aufrechtzuerhalten. Nachdem die Reaktion beendet ist, wird die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur abgekühlt und langsam einer Lösung von 64,4 g (620 mmol) Trimethylborat in 95 ml trockenem Tetrahydrofuran zugesetzt, wobei die Temperatur dieser Lösung unter minus 65°C gehalten wird. Nach Beendigung des Zusatzes lässt man die Reaktionsmischung stehen, bis sie sich auf ungefähr 0°C erwärmt hat und rührt sie noch ungefähr 60 Minuten lang. Dann wird eine Lösung von 22,4 ml Schwefelsäure in 400 ml Wasser langsam zugesetzt, um die Temperatur unter 20°C zu halten. Das organische Lösungsmittel wird durch Destillation unter Vakuum entfernt. 300 ml n-Heptan werden in die wässrige Lösung des Abdampfrückstands geladen, gefolgt von einem Zusatz von 34,8 g (292 mmol) Pinacol. Die Zwei-Phasen-Mischung wird bei Umgebungstemperatur nicht weniger als 2 Stunden lang gerührt. Nachdem sich die Schichten absetzen konnten, wird die wässrige Phase getrennt. 300 ml n-Heptan werden in die wässrige Lösung geladen und die Zwei-Phasen-Mischung wird bei Umgebungstemperatur nicht weniger als 2 Stunden lang gerührt. Nachdem sich die Schichten absetzen konnten, wird die wässrige Phase getrennt. Die organischen Schichten werden kombiniert und einmal mit 200 ml Wasser gewaschen, gefolgt von 200 ml gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und zwei weiteren Wäschen mit jeweils 200 ml Wasser. Die N-Heptan-Lösung wird verdunstet, bis sie im trockenen Zustand vorliegt, der Abdampfrückstand wird destilliert und die Fraktion mit Bp 40–50°C bei 0,1–0,5 mBar zurückgewonnen.
Siedepunkt: 40–50°C/0,1–0,5 mbar
Ausbeute: 40,9 g (70–85%) Z-DIPIN B (Öl)
Schritt 2: Z-DIPIN C
16,6 g (164 mmol) Diisopropylamin und 220 ml Tetrahydrofuran werden geladen und auf –30 bis –40°C abgekühlt. Dieser Lösung werden 41,8 g (163 mmol) N-Butyl-Lithium, 25% in N-Heptan zugesetzt, gefolgt von einstündigem Rühren bei 0 bis –5°C. Diese frisch zubereitete Lösung von Lithium-Diisopropylamid wird auf –30°C abgekühlt und dann einer Lösung von 27,9 g (139 mmol) Z-DIPIN B in 120 ml Tetrahydrofuran und 35,5 g (418 mmol) Dichlormethan bei einer Temperatur zwischen –60°C und –70°C zugesetzt. Die Lösung wird bei dieser Temperatur eine halbe Stunden lang gerührt, gefolgt von einem Zusatz von 480 ml (240 mmol) 0,5N wasserfreiem Zink(II)-Chlorid in Tetrahydrofuran oder 32,5 g (240 mmol) wasserfreiem, festem Zink(II)-Chlorid. Nach einstündigem Rühren bei –65°C lässt man die Reaktionsmischung bis zur Umgebungstemperatur erwärmen und rührt sie weitere 16–18 Stunden lang. Die Reaktionsmischung wird verdunstet, bis sie im trockenen Zustand vorliegt (d. h. bis das Lösungsmittel entfernt ist), woraufhin 385 ml N-Heptan zugesetzt werden. Die Reaktionsmischung wird mit 150 ml 5%iger Schwefelsäure, mit 190 ml gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und 180 ml gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen. Die organische Schicht wird über Magnesiumsulfat getrocknet, gefiltert und verdunstet, bis sie im trockenen Zustand vorliegt (d. h. bis das Lösungsmittel entfernt ist). Der ölige Rückstand wird ohne weitere Reinigung in den nächsten Schritt transferiert.
Ausbeute: 19g (55%) Z-DIPIN C
Schritt 3: Z-DIPIN D
Einer Lösung von 23,8 g (148 mmol) Hexamethyldisilazan in 400 ml Tetrahydrofuran bei –15°C werden 34,7g (136 mmol) n-Butyl-Lithium, 25% in N-Heptan, zugesetzt und dann eine Stunde lang gerührt. Die Lösung wird auf –55°C abgekühlt, gefolgt von einem Zusatz von in 290 ml Tetrahydrofuran aufgelösten 30,6 g (123 mmol) Z-DIPIN C und 35 ml Tetrahydrofuran zu dieser frisch zubereiteten Lösung von LiHMDS. Dann lässt man die Lösung auf Umgebungstemperatur abkühlen und rührt sie 12 Stunden lang. Die Reaktionsmischung wird verdunstet, bis sie im trockenen Zustand vorliegt, der Abdampfrückstand wird in 174 ml n-Heptan aufgelöst und mit 170 ml Wasser und 75 ml gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet, gefiltert und verdunstet, bis sie im vollständig trockenen Zustand vorliegt (d. h. bis das Lösungsmittel entfernt ist). Der ölige Rückstand wird in 100 g n-Heptan aufgelöst. Diese Lösung wird ohne weitere Reinigung in den nächsten Schritt übernommen.
Ausbeute: 32,2 g (70%) Z-DIPIN D
Schritt 4: Z-DIPIN (TRI50b, roh)
Eine Lösung von 26,6 g (71 mmol) Z-DIPIN D in 82,6 g n-Heptan wird mit 60 ml n-Heptan verdünnt und durch Zufuhr von 10,5 g (285 mmol) Hydrogenchlorid auf –60°C abgekühlt. Die Reaktionsmischung wird daraufhin evakuiert und mit Stickstoff gespült, während die Temperatur in Inkrementen von ungefähr 20°C auf Umgebungstemperatur gesteigert wird. Das Lösungsmittel wird aus dem öligen Niederschlag entfernt und mehrfach mit 60 ml frischem n-Heptan ersetzt. Der ölige Rückstand wird in 60 ml Tetrahydrofuran (Lösung A) aufgelöst.
In einen anderen Kolben werden 130 ml Tetrahydrofuran, 24,5 g (61,5 mmol) Z-D-Phe-Pro-OH und 6,22 g (61 mmol) N-Methylmorpholin geladen und auf –20°C abgekühlt. Dieser Lösung wird eine Lösung von 8,4 g (61,5 mmol) Isobutylchlorformat in 20 ml Tetrahydrofuran zugesetzt und das Gemisch 30 Minuten lang gerührt, gefolgt von einem Zusatz von Lösung A bei –25°C. Nach vollendetem Zusatz werden bis zu 16 ml (115 mmol) Triethylamin zugesetzt, um den pH-Wert auf 9–10 zu justieren, der mithilfe eines pH-Messstabs gemessen wird. Dann lässt man die Reaktionsmischung auf Umgebungstemperatur erwärmen und rührt diese 3 Stunden lang, immer noch unter Stickstoff. Das Lösungsmittel wird verdunstet, bis es im trockenen Zustand vorliegt und der Abdampfrückstand wird in 340 ml tert.-Butylmethylether (t-BME) aufgelöst. Die Lösung von Z-DIPIN in t-BME wird zweimal mit 175 ml 1,5%iger Hydrochloridsäure gewaschen. Die kombinierten sauren Wäschen werden mit 175 ml t-BME einer erneuten Wäsche unterzogen. Die kombinierten organischen Schichten werden mit 175 ml Wasser, mit 175 ml gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und mit 175 ml 25%iger Natriumchloridlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und gefiltert. Diese Lösung wird ohne weitere Reinigung in den nächsten Schritt übernommen.
Ausbeute: 29,9 g (80%) Z-DIPIN
BEISPIEL 2 – SYNTHESE VON TRI 50D (DIETHANOLAMIN ADDUKT VON TRI 50C)
Das in diesem Beispiel verwendete Startmaterial ist die in Beispiel 1 gewonnene Lösung von TRI 50b („Z-DIPIN"). Die Lösung wird für die Synthese von TRI 50d ohne weitere Reinigung übernommen. Die Lösung von Z-DIPIN in t-BME (7,0 g (11,5 mmol) (R,S,R) TRI 50b enthaltend, auf HPLC-Ergebnissen von Z-DIPIN basierend berechnet) wird verdunstet, bis sie im trockenen Zustand vorliegt und der Abdampfrückstand wird in 80 ml Diethylether aufgelöst. 1,51 g (14,4 mmol) Diethanolamin wird zugesetzt und die Mischung daraufhin unter Rückfluss mindestens 10 Stunden lang erhitzt, ein Prozess, während dem sich das Produkt niederschlägt. Die Suspension wird auf 5–10°C abgekühlt, gefiltert und der Filterrückstand mit Diethylether gewaschen.
Um die chirale und chemische Reinheit zu verbessern, wird der nasse Filterkuchen (7 g) in 7 ml Dichlormethan aufgelöst, auf 0–5°C abgekühlt und das Produkt durch Zusatz von 42 ml Diethylether niedergeschlagen und gefiltert. Das isolierte, nasse Produkt wird bei 35°C im Vakuum oder mindestens 4 Stunden lang getrocknet.
Ausbeute: 5,5 g (80%) TRI 50d
Schmelzpunkt: 140–145°C
BEISPIEL 3 – PRÄPARATION VON NATRIUMSALZ VON TRI50C
1,5 kg (2,5 mol) TRI50d aus Beispiel 2 werden in 10,5 L Dichlormethan aufgelöst. 11 L 2%ige Hydrochloridsäure werden zugesetzt und die Mischung höchstens 30 Minuten lang (optimal ungefähr 20 Minuten) bei Raumtemperatur gerührt. In der organischen Phase formt sich ein Niederschlag. Nach dem Rühren lässt man zu, dass sich die Schichten absetzen und trennen. Die wässrige Schicht wird zweimal mit 2,2 L Dichlormethan erneut gewaschen. Die kombinierten organischen Schichten werden mit einer Lösung von 625 g Ammoniumchlorid in 2,25 L Wasser gewaschen. (Das Ammoniumchlorid puffert den pH-Wert der wässrigen Extraktionen, so dass dieser innerhalb eines Bereichs von ungefähr 1–2 bis ungefähr 4–5 liegt, da stark saure Bedingungen Peptidbindungen spalten könnten). Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet, gefiltert und das Filtrat verdunstet, bis es im trockenen Zustand vorliegt. Es wird eine Untersuchung der freien Boronsäure durchgeführt (mithilfe des RP HPLC-Verfahrens aus Beispiel 43, höchstens 30 Minuten lang (optional ungefähr 20 Minuten) bei Raumtemperatur) und die Mengen der Lösungsmittel und Base, die zur Umwandlung der Säure in das Salz notwendig sind, berechnet. Wenn 2,5 Mol der freien Säure gewonnen wurden, wird der Abdampfrückstand in 5 L Acetonitril aufgelöst, gefolgt von einem Zusatz einer Lösung von 100 g (2,5 Mol) Natriumhydroxid als eine 5%ige Lösung in 2,2 L Wasser. Die Lösung wird zwei Stunden lang bei Umgebungstemperatur (z. B. 15–30°C, optimalerweise Raumtemperatur) gerührt und dann im Vakuum (von ca. 10 mmHg) bei einer Temperatur verdunstet, die 35°C nicht überschreitet. Der Abdampfrückstand wird wiederholt in 3,5 L frischem Acetonitril aufgelöst und verdunstet, bis er im trockenen Zustand vorliegt, um Wasserspuren zu entfernen. Wenn der Abdampfrückstand trocken ist, wird er in 3 L Acetonitril (oder alternativ dazu in 6 L THF) aufgelöst und langsam einer Mischung von 32 L n-Heptan und 32 L Diethylether zugesetzt. Der Zusatz wird langsam genug durchgeführt, um ein Verklumpen oder Verkleben des Produkts zu vermeiden und über eine Zeitspanne von nicht weniger als 30 Minuten. Das niedergeschlagene Produkt wird ausgefiltert, mit n-Heptan gewaschen und unter Vakuum bei einer anfänglichen Temperatur von ungefähr 10°C getrocknet, welche dann bis zu einer Grenze von 35°C gesteigert wird, bis das Produkt trocken ist.
Ausbeute: 1,0 kg (70%) TRI50c Natriumsalz
BEISPIEL 4 – PRÄPARATION VON CALCIUMSALZ VON TRI50C
1,5 kg (2,5 mol) TRI50d aus Beispiel 2 werden in 10,5 L Dichlormethan aufgelöst. 11 L 2%ige Hydrochloridsäure werden zugesetzt und die Mischung höchstens 30 Minuten lang (optimal ungefähr 20 Minuten) bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Rühren lässt man zu, dass sich die Schichten absetzen und trennen. Die wässrige Schicht wird zweimal mit 2,2 L Dichlormethan erneut gewaschen. Die kombinierten organischen Schichten werden mit einer Lösung von 625 g Ammoniumchlorid in 2,25 L Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet, gefiltert und das Filtrat verdunstet, bis es im trockenen Zustand vorliegt. Es wird eine Untersuchung der freien Boronsäure durchgeführt und es werden die Mengen der Lösungsmittel und Base für die Umwandlung der Säure in das Salz berechnet. Wenn 2,5 Mol der freien Säure gewonnen wurden, wird der Abdampfrückstand in 5 L Acetonitril aufgelöst, gefolgt von einem Zusatz einer Suspension von 93 g (1,25 Mol) Calciumhydroxid in 1 L Wasser. Die Lösung wird zwei Stunden lang bei Umgebungstemperatur (z. B. 15–30°C, optimalerweise Raumtemperatur) gerührt und dann im Vakuum (von ca. 10 mmHg) bei einer Temperatur von anfangs ungefähr 10°C, welche dann bis zu einer Grenze von 35°C gesteigert wird, verdunstet. Der Abdampfrückstand wird wiederholt in 3,5 L frischem Acetonitril aufgelöst und verdunstet, bis er im trockenen Zustand vorliegt, um Wasserspuren zu entfernen. Wenn der Abdampfrückstand trocken ist, wird er in 6 L Tetrahydrofuran aufgelöst und langsam einer Mischung von 32 L n-Heptan und 32 L Diethylether zugesetzt. Der Zusatz wird langsam genug durchgeführt, um ein Verklumpen oder Verkleben des Produkts zu vermeiden und über eine Zeitspanne von nicht weniger als 30 Minuten. Das gefällte Produkt wird abgefiltert, mit n-Heptan gewaschen und unter Vakuum (von ca. 10 mmHg) bei einer Temperatur von unter 35°C getrocknet, bis es im trockenen Zustand vorliegt.
Ausbeute: 0,98 kg (70%) TRI50c Calciumsalz
Die Arbeitsverfahren aus Beispielen 1 bis 4 können maßstabsvergrößert werden und produzieren, wenn man sie vorsichtig benutzt, hochreine Salze. Für den Schritt des Diethanolaminniederschlags ist es wichitg, 1,25 Äquivalente von Diethanolman pro Äquivalent von (R,S,R) TRI 50b zu verwenden. Bei der Hydrolyse des Diethanolaminesters ist es wichtig, exzessiv langen Kontakt mit der wässrigen Säure zu vermeiden. Auch sollte TRI 50b über die Grignard-Reaktion zu Z-DIPIN A synthetisiert werden.
BEISPIEL 5 – ALTERNATIVE UMWANDLUNG VON TRI 50B ZU TRI 50C
Die in diesem und den folgenden synthetischen Beispielen beschriebenen Arbeitsverfahren wurden im Allgemeinen unter Stickstoff und unter Verwendung trockener Lösungsmittel, wie sie aus kommerziellen Quellen erhältlich sind, durchgeführt.

1. Ungefähr 300 g TRI 50b, durch die HPLC-Reinigung von razemischem TRI 50b gewonnen, wurden in ungefähr 2,5 L Diethylether aufgelöst. Es wird geschätzt, dass unterschiedliche Ansätze von TRI 50b isomere Reinheiten aufwiesen, die zwischen 85% R,S,R und über 95% R,S,R lagen.
2. Ungefähr 54 ml Diethanolamin wurden zugesetzt (1:1 Stöchiometrie mit gesamtem TRI 50b Gehalt) und die Mischung bei 40°C refluxiert.
3. Das niedergeschlagene Produkt wurde entfernt, mehrfach mit Diethylether gewaschen und getrocknet.
4. Das trockene Produkt wurde in CHCl₃ aufgelöst. Hydrochloridsäure (pH-Wert 1) wurde zugesetzt und die Mischung ungefähr 1 Std lang bei Raumtemperatur gerührt.
5. Die organische Schicht wurde entfernt und mit einer NH₄Cl-Lösung gewaschen.
6. Das organische Lösungsmittel wurde destilliert und das zurückbleibende feste Produkt wurde getrocknet.

BEISPIEL 6 – PRÄPARATION VON LITHIUMSALZ VON TRI50C
Cbz-Phe-Pro-BoroMpg-OH (20,00 g, 38,1 mM), das durch das Verfahren in Beispiel 5 gewonnen wurde, wird unter Rühren in Acetonitril (200 ml) bei Raumtemperatur aufgelöst. Dieser Lösung wird LiOH als eine 0,2 M Lösung in destilliertem Wasser (190 ml) zugesetzt. Die entstehende, klare Lösung wird 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und dann unter Vakuum evakuiert, bis sie im trockenen Zustand vorliegt, wobei ihre Temperatur 37°C nicht überschreiten sollte. Die entstehende ölige/klebrige Flüssigkeit wird in 500 ml destilliertem Wasser, wenn nötig mit leichter Erwärmung, 20 Minuten lang erneut aufgelöst. Die Lösung wird durch Filterpapier gefiltert und dann evakuiert, bis sie im trockenen Zustand vorliegt, wobei die Temperatur der Lösung auch hier 37°C nicht überschreiten sollte. Das entstehende Produkt wird im Vakuum über Nacht getrocknet, wodurch normalerweise ein weißer, brüchiger Festkörper entsteht.

Dann wurde das Salz unter Vakuum über Silicagel getrocknet, bis es ein konstantes Gewicht erreicht hatte (72 Std).
Ausbeute 17,89g. Mikroanalyse:

C % Gefunden (Berechnet)	H % Gefunden (Berechnet)	N % Gefunden (Berechnet)	B % Gefunden (Berechnet)	Metall % Gefunden (Berechnet)
57,14	6,60	7,34	2,07	Li 1,26
(61,03)	(6,64)	(7,90)	(2,03)	(1,31)

BEISPIEL 7 – UV/SICHTBARE SPEKTREN VON LITHIUMSALZ VON TRI 50C
UV/Sichtbare Spektren des durch das Arbeitsverfahren in Beispiel 6 entstandenen Salzes wurden in destilliertem Wasser bei 20°C zwischen 190 nm und 400 nm aufgezeichnet. Das Salz gab λ_max 210 und 258 nm. Das Gewicht des getrockneten Salzes wurde dann zum Zweck der Berechnung des Extinktionskoeffizienten gemessen. Der λ_max von 258 nm wurde verwendet. Der Extinktionskoeffizient wurde mithilfe der folgenden Formel berechnet: A = εcl wobei A das Absorptionsvermögen bezeichnet
C die Konzentration bezeichnet
l die Weglänge der UV-Zelle bezeichnet
und ε der Extinktionskoeffizient ist.
Extinktionskoeffizient: 451
BEISPIEL 8 – WÄSSRIGE LÖSLICHKEIT VON LITHIUMSALZ VON TRI50C
Das in diesem Beispiel verwendete Salz wurde mithilfe einer Modifizierung des in Beispiel 6 beschriebenen Prozesses hergestellt. Der modifizierte Prozess unterscheidet sich von dem beschriebenen insofern, als dass 100 mg des TRI 50c als Startmaterial verwendet wurden, das Produkt der erneuten Auflösung in Wasser durch Gefriertrocknung getrocknet wurde und die Filtration durch einen 0,2 μm Filter durchgeführt wurde. Es wird angenommen, dass das Salz ungefähr 85% des R,S,R-Isomers enthält.
Um die maximale wässrige Löslichkeit zu bestimmen wurden 25 mg des getrockneten Salzes bei 37°C in Wasser geschüttelt, die Probe gefiltert und das UV-Spektrum gemessen. Das Salz hinterließ einen weißen Rückstand nicht aufgelösten Materials. Das Lithiumsalz war vergleichsweise löslich und wurde deshalb erneut bei 50 mg/ml auf die zuvor beschriebene gleiche Art und Weise aufgelöst.
Löslichkeit, wenn zu 25 mg/ml aufgelöst: 43 mM (23 mg/ml).
Löslichkeit, wenn zu 50 mg/ml aufgelöst: 81 mM (43 mg/ml).
BEISPIEL 9 – PRÄPARATION VON NATRIUMSALZ VON TRI50C
Cbz-Phe-Pro-BoroMpg-OH (20,00 g, 38,1 mM), das durch das Verfahren in Beispiel 5 gewonnen wurde, wird unter Rühren in Acetonitril (200 ml) bei Raumtemperatur aufgelöst. Dieser Lösung wird NaOH als eine 0,2 M Lösung in destilliertem Wasser (190 ml) zugesetzt. Die entstehende, klare Lösung wird 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und dann unter Vakuum evakuiert, bis sie im trockenen Zustand vorliegt, wobei ihre Temperatur 37°C nicht überschreiten sollte. Das entstehende Öl/die klebrige Flüssigkeit wird in 500 ml destilliertem Wasser mit leichter Erwärmung 15–20 Minuten lang erneut aufgelöst. Die Lösung wird durch Filterpapier gefiltert und dann evakuiert, bis sie im trockenen Zustand vorliegt, wobei die Temperatur der Lösung auch hier 37°C nicht überschreiten sollte. Das entstehende Produkt wird im Vakuum über Nacht getrocknet, wodurch normalerweise ein weißer, brüchiger Festkörper entsteht. Das Produkt kann aufgrund von Restwasser als ein Öl oder klebriger Festkörper auftreten, in welchem Fall es in Ethylacetat aufgelöst und evakuiert wird, bis es im trockenen Zustand vorliegt, um das Produkt als weißen Festkörper zu produzieren.
Dann wurde das Salz unter Vakuum über Silicagel getrocknet, bis es ein konstantes Gewicht erreicht hatte (72 Std).
Ausbeute: Über 50%. Mikroanalyse:

C % Gefunden (Berechnet) H % Gefunden (Berechnet) N % Gefunden (Berechnet) B % Gefunden (Berechnet) Metall % Gefunden (Berechnet)

59,93 (59,24) 6,47 (6,44) 7,31 (7,67) 1,91 (1,98) Na 3,81 (4,20)
BEISPIEL 10 – UV/SICHTBARE SPEKTREN VON NATRIUMSALZ VON TRI 50C
UV/Sichtbare Spektren des durch die Arbeitsverfahren in Beispiel 9 entstandenen Natriumsalzes wurden in destilliertem Wasser bei 20°C zwischen 190 nm und 400 nm aufgezeichnet. Das Salz gab λ_max 210 und 258 nm. Das Gewicht des getrockneten Salzes wurde dann zum Zweck der Berechnung des Extinktionskoeffizienten gemessen. Der λ_max Von 258 nm wurde verwendet. Der Extinktionskoeffizient wurde mithilfe der folgenden Formel berechnet: A = εcl wobei A das Absorptionsvermögen bezeichnet
C die Konzentration bezeichnet
l die Weglänge der UV-Zelle bezeichnet
und ε der Extinktionskoeffizient ist.
Extinktionskoeffizient: 415.
BEISPIEL 11 – WÄSSRIGE LÖSLICHKEIT VON NATRIUMSALZ VON TRI50C
Das in diesem Beispiel verwendete Salz wurde mithilfe einer Modifizierung des in Beispiel 9 beschriebenen Prozesses hergestellt. Der modifizierte Prozess unterscheidet sich von dem beschriebenen insofern, als dass 100 mg des TRI 50c als Startmaterial verwendet wurden, das Produkt der erneuten Auflösung in Wasser durch Gefriertrocknung getrocknet wurde und die Filtration durch einen 0,2 μm Filter durchgeführt wurde. Es wird angenommen, dass das Salz ungefähr 85% des R,S,R-Isomers enthält.
Um die maximale wässrige Löslichkeit zu bestimmen wurden 25 mg des getrockneten Salzes bei 37°C in Wasser geschüttelt, die Probe gefiltert und das UV-Spektrum gemessen. Das Salz hinterließ einen weißen Rückstand nicht aufgelösten Materials. Das Natriumsalz war vergleichsweise löslich und wurde deshalb erneut zu 50 mg/ml auf die zuvor beschriebene gleiche Art und Weise aufgelöst.
Löslichkeit, wenn zu 25 mg/ml aufgelöst: 44 mM (25 mg/ml).
Löslichkeit, wenn zu 50 mg/ml aufgelöst: 90 mM (50 mg/ml).
BEISPIEL 12 – PRÄPARATION VON KALIUMSALZ VON TRI50C
Cbz-Phe-Pro-BoroMpg-OH (20,00 g, 38,1 mM), das durch das Verfahren in Beispiel 5 gewonnen wurde, wird unter Rühren in Acetonitril (200 ml) bei Raumtemperatur aufgelöst. Dieser Lösung wird KOH als eine 0,2 M Lösung in destilliertem Wasser (190 ml) zugesetzt. Die entstehende, klare Lösung wird 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und dann unter Vakuum evakuiert, bis sie im trockenen Zustand vorliegt, wobei ihre Temperatur 37°C nicht überschreiten sollte. Das entstehende Öl/die klebrige Flüssigkeit wird in 1 L destilliertem Wasser unter leichter Erwärmung auf 37°C ungefähr 2 Stunden lang erneut aufgelöst. Die Lösung wird durch Filterpapier gefiltert und dann evakuiert, bis sie im trockenen Zustand vorliegt, wobei die Temperatur der Lösung auch hier 37°C nicht überschreiten sollte. Das entstehende Produkt wird im Vakuum über Nacht getrocknet, wodurch normalerweise ein weißer, brüchiger Festkörper entsteht.
Ausbeute: 14,45 mg.

Dann wurde das Salz unter Vakuum über Silicagel getrocknet, bis es ein konstantes Gewicht erreicht hatte (72 Std). Mikroanalyse:

C % Gefunden (Berechnet)	H % Gefunden (Berechnet)	N % Gefunden (Berechnet)	B % Gefunden (Berechnet)	Metall % Gefunden (Berechnet)
54,84 (57,55)	6,25 (6,26)	7,02 (7,45)	2,01 (1,92)	K 4,29 (6,94)

BEISPIEL 13 – UV/SICHTBARE SPEKTREN VON KALIUMSALZ VON TRI 50C
UV/Sichtbare Spektren des durch die Arbeitsverfahren in Beispiel 12 entstandenen Kaliumsalzes wurden in destilliertem Wasser bei 20°C zwischen 190 nm und 400 nm aufgezeichnet. TRI 50C und das Salz gaben λ_max 210 und 258 nm. Das Gewicht des getrockneten Salzes wurde dann zum Zweck der Berechnung des Extinktionskoeffizienten gemessen. Der λ_max von 258 nm wurde verwendet. Der Extinktionskoeffizient wurde mithilfe der folgenden Formel berechnet: A = εcl wobei A das Absorptionsvermögen bezeichnet
C die Konzentration bezeichnet
l die Weglänge der UV-Zelle bezeichnet
und ε der Extinktionskoeffizient ist.
Extinktionskoeffizient: 438.
BEISPIEL 14 – WÄSSRIGE LÖSLICHKEIT VON KALIUMSALZ VON TRI50C
Das in diesem Beispiel verwendete Salz wurde mithilfe einer Modifizierung des in Beispiel 12 beschriebenen Prozesses hergestellt. Der modifizierte Prozess unterscheidet sich von dem beschriebenen insofern, als dass 100 mg des TRI 50c als Startmaterial verwendet wurden, das Produkt der erneuten Auflösung in Wasser durch Gefriertrocknung getrocknet wurde und die Filtration durch einen 0,2 μm Filter durchgeführt wurde. Es wird angenommen, dass das Salz ungefähr 85% des R,S,R-Isomers enthält.
Um die maximale wässrige Löslichkeit zu bestimmen wurden 25 mg des getrockneten Salzes bei 37°C in Wasser geschüttelt, die Probe gefiltert und das UV-Spektrum gemessen. Das Salz hinterließ einen weißen Rückstand nicht aufgelösten Materials.
Löslichkeit, wenn zu 25 mg/ml aufgelöst: 29 mM (16 mg/ml).
BEISPIEL 15 – PRÄPARATION VON ZINKSALZ VON TRI 50C
Die relative Löslichkeit von Zinkhydroxid ist so, dass, wenn das Hydroxid zur Präparation des entsprechenden TRI 50c Salzes mithilfe des Arbeitsverfahrens in Beispiel 6 verwendet worden wäre, keine homogene Salzformation entstanden wäre. Deshalb wurde ein neues Verfahren zur Präparation des Zinksalzes entwickelt, das in diesem und den nächsten Beispielen beschrieben wird.
TRI 50c Natriumsalz (2,24 g, 4,10 mM) wurde in destilliertem Wasser (100 ml) bei Raumtemperatur aufgelöst und Zinkchlorid in THF (4,27 ml, 0,5 M) wurde vorsichtig unter Rühren zugesetzt. Ein weißer Niederschlag, der sich sofort gebildet hatte, wurde ausgefiltert und mit destilliertem Wasser gewaschen. Dieser Festkörper wurde in Ethylacetat aufgelöst und mit destilliertem Wasser (2 × 50 ml) gewaschen. Die organische Lösung wurde evakuiert, bis sie im trockenen Zustand vorlag und der produzierte weiße Festkörper wurde vor der Mikroanalyse in einem Exsikkator über Silicagel 3 Tage lang getrocknet. Ausbeute 1,20 g.
¹H NMR 400MHz, δ_H(CD₃OD) 7,23-7,33 (20H, m, ArH), 5,14 (4H, m, PhCH₂O), 4,52 (4H, m, αCH), 3,65 (2H, m), 3,31 (12H, m), 3,23 (6H, s, OCH₃), 2,96 (4H, d, J 7.8Hz), 2,78 (2H, m), 2,58 (2H, m), 1,86 (6H, m), 1,40 (10H, m)
¹³C NMR 75MHz δ_C(CD₃OD) 178,50, 159,00, 138,05, 137,66, 130,54, 129,62, 129,50, 129,07, 128,79, 128,22, 73,90, 67,90, 58,64, 58,18, 56,02, 38,81, 30,06, 28,57, 28,36, 25,29 FTIR (KBr Scheibe) ν_max (cm^–1) 3291,1, 3062,7, 3031,1, 2932,9, 2875,7, 2346,0, 1956,2, 1711,8, 1647,6, 1536,0, 1498,2, 1452,1, 1392,4, 1343,1, 1253,8, 1116,8, 1084,3, 1027,7, 916,0, 887,6, 748,6, 699,4, 595,5, 506,5.
BEISPIEL 16 – PRÄPARATION VON ARGININSALZ VON TRI50C
Cbz-Phe-Pro-BoroMpg-OH (20,00 g, 38,1 mM), das durch das Verfahren in Beispiel 5 gewonnen wurde, wird unter Rühren in Acetonitril (200 ml) bei Raumtemperatur aufgelöst. Dieser Lösung wird Arginin als eine 0,2M Lösung in destilliertem Wasser (190 ml) zugesetzt. Die entstehende, klare Lösung wird 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und dann unter Vakuum evakuiert, bis sie im trockenen Zustand vorliegt, wobei ihre Temperatur 37°C nicht überschreiten sollte. Das entstehende Öl/die klebrige Flüssigkeit wird in 2 L destilliertem Wasser unter leichter Erwärmung auf 37°C 2 Stunden lang erneut aufgelöst. Die Lösung wird durch Filterpapier gefiltert und dann evakuiert, bis sie im trockenen Zustand vorliegt, wobei die Temperatur der Lösung auch hier 37°C nicht überschreiten sollte. Das entstehende Produkt wird im Vakuum über Nacht getrocknet, wodurch normalerweise ein weißer, brüchiger Festkörper entsteht.
Dann wurde das Salz unter Vakuum über Silicagel getrocknet, bis es ein konstantes Gewicht erreicht hatte (72 Std).
Ausbeute: 10,54 g. Mikroanalyse:

C % Gefunden (Berechnet) H % Gefunden (Berechnet) N % Gefunden (Berechnet) B % Gefunden (Berechnet)

52,47 (56,65) 7,12 (7,20) 15,25 (14,01) 1,52 (1,54)
BEISPIEL 17 – UV/SICHTBARE SPEKTREN VON ARGININSALZ VON TRI 50C
UV/Sichtbare Spektren des durch das Arbeitsverfahren in Beispiel 15 entstandenen Salzes wurden in destilliertem Wasser bei 20°C zwischen 190 nm und 400 nm aufgezeichnet. TRI 50C und das Salz gaben λ_max 210 und 258 nm. Das Gewicht des getrockneten Salzes wurde dann zum Zweck der Berechnung des Extinktionskoeffizienten gemessen. Der λ_max von 258 nm wurde verwendet. Der Extinktionskoeffizient wurde mithilfe der folgenden Formel berechnet: A = εcl wobei A das Absorptionsvermögen bezeichnet
C die Konzentration bezeichnet
l die Weglänge der UV-Zelle bezeichnet
und ε der Extinktionskoeffizient ist.
Extinktionskoeffizient: 406.
BEISPIEL 18 – WÄSSRIGE LÖSLICHKEIT VON ARGININSALZ VON TRI50C
Das in diesem Beispiel verwendete Salz wurde mithilfe einer Modifizierung des in Beispiel 16 beschriebenen Prozesses hergestellt. Der modifizierte Prozess unterscheidet sich von dem beschriebenen insofern, als dass 100 mg des TRI 50c als Startmaterial verwendet wurden, das Produkt der erneuten Auflösung in Wasser durch Gefriertrocknung getrocknet wurde und die Filtration durch einen 0,2 μm Filter durchgeführt wurde. Es wird angenommen, dass das Salz ungefähr 85% des R,S,R-Isomers enthält.
Um die maximale wässrige Löslichkeit zu bestimmen wurden 25 mg des getrockneten Salzes bei 37°C in Wasser geschüttelt, die Probe gefiltert und das UV-Spektrum gemessen. Das Salz hinterließ einen weißen Rückstand nicht aufgelösten Materials.
Löslichkeit, wenn zu 25 mg/ml aufgelöst: 14 mM (10 mg/ml).
BEISPIEL 19 – PRÄPARATION VON LYSINSALZ VON TRI50C
Cbz-Phe-Pro-BoroMpg-OH (20,00 g, 38,1 mM), das durch das Verfahren in Beispiel 5 gewonnen wurde, wird unter Rühren in Acetonitril (200 ml) bei Raumtemperatur aufgelöst. Dieser Lösung wird L-Lysin als eine 0,2 M Lösung in destilliertem Wasser (190 ml) zugesetzt. Die entstehende, klare Lösung wird 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und dann unter Vakuum evakuiert, bis sie im trockenen Zustand vorliegt, wobei ihre Temperatur 37°C nicht überschreiten sollte. Das entstehende Öl/die klebrige Flüssigkeit wird in 3 L destilliertem Wasser unter leichter Erwärmung auf 37°C 2 Stunden lang erneut aufgelöst. Die Lösung wird durch Filterpapier gefiltert und dann evakuiert, bis sie im trockenen Zustand vorliegt, wobei die Temperatur der Lösung auch hier 37°C nicht überschreiten sollte. Das entstehende Produkt wird im Vakuum über Nacht getrocknet, wodurch normalerweise ein weißer, brüchiger Festkörper entsteht. Das Produkt kann (aufgrund von Restwasser) als ein Öl oder klebriger Festkörper auftreten, in welchem Fall es dann in Ethylacetat aufgelöst und evakuiert wird, bis es im trockenen Zustand vorliegt, um das Produkt als weißen Festkörper zu produzieren.
Dann wurde das Salz unter Vakuum über Silicagel getrocknet, bis es ein konstantes Gewicht erreicht hatte (72 Std).
Ausbeute: 17,89 g. Mikroanalyse:

C % Gefunden (Berechnet) H % Gefunden (Berechnet) N % Gefunden (Berechnet) B % Gefunden (Berechnet)

57,03 (59,11) 7,43 (7,36) 10,50 (10,44) 1,72 (1,61)
BEISPIEL 20 – UV/SICHTBARE SPEKTREN VON LYSINSALZ VON TRI 50C
UV/Sichtbare Spektren des durch das Arbeitsverfahren in Beispiel 19 entstandenen Salzes wurden in destilliertem Wasser bei 20°C zwischen 190 nm und 400 nm aufgezeichnet. TRI 50C und das Salz gaben λ_max 210 und 258 nm. Das Gewicht des getrockneten Salzes wurde dann zum Zweck der Berechnung des Extinktionskoeffizienten gemessen. Der λ_max von 258 nm wurde verwendet. Der Extinktionskoeffizient wurde mithilfe der folgenden Formel berechnet: A = εcl wobei A das Absorptionsvermögen bezeichnet
C die Konzentration bezeichnet
l die Weglänge der UV-Zelle bezeichnet
und ε der Extinktionskoeffizient ist.
Extinktionskoeffizient: 437.
BEISPIEL 21 – WÄSSRIGE LÖSLICHKEIT VON LYSINSALZ VON TRI50C
Das in diesem Beispiel verwendete Salz wurde mithilfe einer Modifizierung des in Beispiel 19 beschriebenen Prozesses hergestellt. Der modifizierte Prozess unterscheidet sich von dem beschriebenen insofern, als dass 100 mg des TRI 50c als Startmaterial verwendet wurden, das Produkt der erneuten Auflösung in Wasser durch Gefriertrocknung getrocknet wurde und die Filtration durch einen 0,2 μm Filter durchgeführt wurde. Es wird angenommen, dass das Salz ungefähr 85% des R,S,R-Isomers enthält.
Um die maximale wässrige Löslichkeit zu bestimmen wurden 25 mg des getrockneten Salzes bei 37°C in Wasser geschüttelt, die Probe gefiltert und das UV-Spektrum gemessen. Das Salz hinterließ einen weißen Rückstand nicht aufgelösten Materials.
Löslichkeit, wenn zu 25 mg/ml aufgelöst: 13 mM (8,6 mg/ml).
BEISPIEL 22 – PRÄPARATION VON N-METHYL-D-GLUCAMINSALZ VON TRI 50C
Cbz-Phe-Pro-BoroMpg-OH (20,00 g, 38,1 mM), das durch das Verfahren in Beispiel 5 gewonnen wurde, wird unter Rühren in Acetonitril (200 ml) bei Raumtemperatur aufgelöst. Dieser Lösung wird N-Methyl-D-Glucamin als eine 0,2 M Lösung in destilliertem Wasser (190 ml) zugesetzt. Die entstehende, klare Lösung wird 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und dann unter Vakuum evakuiert, bis sie im trockenen Zustand vorliegt, wobei ihre Temperatur 37°C nicht überschreiten sollte. Das entstehende Öl/die klebrige Flüssigkeit wird in 500 ml destilliertem Wasser unter leichter Erwärmung 20 Minuten lang erneut aufgelöst. Die Lösung wird durch Filterpapier gefiltert und dann evakuiert, wobei die Temperatur der Lösung auch hier 37°C nicht überschreiten sollte, oder gefriergetrocknet, bis sie im trockenen Zustand vorliegt. Das entstehende Produkt wird im Vakuum über Nacht getrocknet, wodurch normalerweise ein weißer, brüchiger Festkörper entsteht.
Dann wurde das Salz unter Vakuum über Silicagel getrocknet, bis es ein konstantes Gewicht erreicht hatte (72 Std).
Ausbeute: 21,31 g. Mikroanalyse:

C % Gefunden (Berechnet) H % Gefunden (Berechnet) N % Gefunden (Berechnet) B % Gefunden (Berechnet)

56,67 (56,67) 7,28 (7,41) 7,74 (7,77) 1,63 (1,50)
BEISPIEL 23 – UV/SICHTBARE SPEKTREN VON N-METHYL-D-GLUCAMINSALZ VON TRI 50C
UV/Sichtbare Spektren des durch das Arbeitsverfahren in Beispiel 22 entstandenen Salzes wurden in destilliertem Wasser bei 20°C zwischen 190 nm und 400 nm aufgezeichnet. TRI 50C und das Salz gaben λ_max 210 und 258 nm. Das Gewicht des getrockneten Salzes wurde dann zum Zweck der Berechnung des Extinktionskoeffizienten gemessen. Der λ_max von 258 nm wurde verwendet. Der Extinktionskoeffizient wurde mithilfe der folgenden Formel berechnet: A = εcl wobei A das Absorptionsv bezeichnet
C die Konzentration bezeichnet
l die Weglänge der UV-Zelle bezeichnet
und ε der Extinktionskoeffizient ist.
Extinktionskoeffizient: 433.
BEISPIEL 24 – WÄSSRIGE LÖSLICHKEIT VON N-METHYL-D-GLUCAMINSALZ VON TRI 50C
Das in diesem Beispiel verwendete Salz wurde mithilfe einer Modifizierung des in Beispiel 22 beschriebenen Prozesses hergestellt. Der modifizierte Prozess unterscheidet sich von dem beschriebenen insofern, als dass 100 mg des TRI 50c als Startmaterial verwendet wurden, das Produkt der erneuten Auflösung in Wasser durch Gefriertrocknung getrocknet wurde und die Filtration durch einen 0,2 μm Filter durchgeführt wurde. Es wird angenommen, dass das Salz ungefähr 85% des R,S,R-Isomers enthält.
Um die maximale wässrige Löslichkeit zu bestimmen wurden 25 mg des getrockneten Salzes bei 37°C in Wasser geschüttelt, die Probe gefiltert und das UV-Spektrum gemessen. Es wurde beobachtet, dass sich das Salz vollständig auflöste. Das Salz war vergleichsweise löslich und wurde deshalb erneut zu 50 mg/ml auf die zuvor beschriebene gleiche Art und Weise aufgelöst.
Löslichkeit, wenn zu 25 mg/ml aufgelöst: 35 mM (25 mg/ml).
Löslichkeit, wenn zu 50 mg/ml aufgelöst: 70 mM (50 mg/ml).
BEISPIEL 25 – ALTERNATIVE PRÄPARATION VON ARGININSALZ VON TRI50C
Das Argininsalz wird einfach durch den Zusatz eines leichten molaren Überschusses von L-Arginin zu einer Lösung von 0,2–0,3 mmol TRI50c in 10 ml Ethylacetat gebildet. Das Lösungsmittel ist nach einer Stunde verdunstet und der Rückstand wird zweimal mit Hexan trituriert, um überschüssiges Arginin zu entfernen.
BEISPIEL 26 – ERSTE PRÄPARATION VON CALCIUMSALZ VON TRI 50C
Cbz-Phe-Pro-BoroMpg-OH (20,00 g, 38,1 mM), das durch das Verfahren in Beispiel 5 gewonnen wurde, wird unter Rühren in Acetonitril (200 ml) bei Raumtemperatur aufgelöst. Dieser Lösung wird Ca(OH)₂ als eine 0,1 M Lösung in destilliertem Wasser (190 ml) zugesetzt. Die entstehende, klare Lösung wird 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und dann unter Vakuum evakuiert, bis sie im trockenen Zustand vorliegt, wobei ihre Temperatur 37°C nicht überschreiten sollte. Das entstehende Produkt ist ein weißer, brüchiger Festkörper.
Dann wurde das Salz unter Vakuum über Silicagel getrocknet, bis es ein konstantes Gewicht erreicht hatte (72 Std).
Ausbeute: 17,69g.
BEISPIEL 27 – ZWEITE ALTERNATIVE PRÄPARATION VON CALCIUMSALZ VON TRI 50C
50,0 g TRI 50c (95,2 mmol) wurden unter Rühren in 250 ml Acetonitril bei Raumtemperatur aufgelöst und dann mithilfe eines Eisbads abgekühlt. Dieser eisgekühlten Lösung wurden 100 ml wässriger Suspension von 3,5 g (47,6 mmol) Calciumhydroxid tröpfchenweise zugesetzt, dann wurde das Ganze 2,5 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, gefiltert und die entstehende Mischung verdunstet, bis sie im trockenen Zustand vorlag, wobei die Temperatur 35°C nicht überschritt. Der klare gelbliche, ölige Rückstand wurde in 200 ml Aceton erneut aufgelöst und verdunstet, bis er im trockenen Zustand vorlag. Das Arbeitsverfahren des Auflösens in Aceton wurde noch einmal wiederholt, um einen farblosen Schaum zu gewinnen.
Dieser Schaum wurde in 100 ml Aceton erneut aufgelöst, gefiltert und tröpfchenweise einer eisgekühlten Lösung von 1100 ml Petrolether 40/60 und 1100 ml Diethylether zugesetzt. Der entstehende farblose Niederschlag wurde gefiltert, zweimal mit Petrolether 40/60 gewaschen und unter hohem Vakuum getrocknet, was zu einer Ausbeute von 49,48 g eines farblosen Festkörpers (92%) mit einer Reinheit von 99,4% gemäß einer HPLC-Messung führte.
BEISPIEL 28 – UV/SICHTBARE SPEKTREN VON CALCIUMSALZ VON TRI 50C
UV/Sichtbare Spektren des durch das Arbeitsverfahren in Beispiel 26 entstandenen Salzes wurden in destilliertem Wasser bei 20°C zwischen 190 nm und 400 nm aufgezeichnet. TRI 50C und das Salz gaben λ_max 210 und 258 nm. Das Gewicht des getrockneten Salzes wurde dann zum Zweck der Berechnung des Extinktionskoeffizienten gemessen. Der λ_max von 258 nm wurde verwendet. Der Extinktionskoeffizient wurde mithilfe der folgenden Formel berechnet: A = εcl wobei A das Absorptionsvermögen bezeichnet
C die Konzentration bezeichnet
l die Weglänge der UV-Zelle bezeichnet
und ε der Extinktionskoeffizient ist.
Extinktionskoeffizient: 955.
BEISPIEL 29 – WÄSSRIGE LÖSLICHKEIT VON CALCIUMSALZ VON TRI 50C
Das in diesem Beispiel verwendete Salz wurde mithilfe einer Modifizierung des in Beispiel 27 beschriebenen Prozesses hergestellt. Der modifizierte Prozess unterscheidet sich von dem beschriebenen insofern, als dass 100 mg des TRI 50c als Startmaterial verwendet wurden, das Produkt der erneuten Auflösung in Wasser durch Gefriertrocknung getrocknet wurde und die Filtration durch einen 0,2 μm Filter durchgeführt wurde. Es wird angenommen, dass das Salz ungefähr 85% des R,S,R-Isomers enthält.
Um die maximale wässrige Löslichkeit zu bestimmen wurden 25 mg des getrockneten Salzes bei 37°C in Wasser geschüttelt, die Probe gefiltert und das UV-Spektrum gemessen. Das Salz hinterließ einen weißen Rückstand nicht aufgelösten Materials.
Löslichkeit, wenn zu 25 mg/ml aufgelöst: 5 mM (5 mg/ml).
BEISPIEL 30 – IN VITRO AKTIVITÄT VON CALCIUMSALZ VON TRI 50C
TRI 50c Calciumsalz wurde mithilfe einer amidolytischen Untersuchung als ein Inhibitor menschlichen α-Thrombins untersucht (J. Deadman et al, J. Med. Chem. 38:15111-1522, 1995, das von einem Ki-Wert von 7 nM für TRI 50b berichtet).
Die Inhibierung menschlichen α-Thrombins wurde deshalb über die Inhibierung der enzymkatalysierten Hydrolyse dreier verschiedener Konzentrationen des chromogenen Substrats S-2238 bestimmt.
200 μl der Probe oder des Puffers und 50 μl von S-2238 wurden bei 37°C 1 Minute lang inkubiert und 50 μl menschlichen α-Thrombins (0,25 NIHμ/ml) wurden zugesetzt. Die anfängliche Geschwindigkeit gehemmter und ungehemmter Reaktionen wurden bei 45 nm registriert. Die Steigerung der optischen Dichte wurde gemäß dem Verfahren von Lineweaver und Burke dargestellt. Der Km und augenscheinliche Km wurden bestimmt und Ki wurde unter Verwendung des Verhältnisses berechnet.
Der verwendete Puffer enthielt 0,1 M Natriumphosphat, 0,2 M NaCl, 0,5% PEG und 0,02% Natriumazid, das mit Orthophosphorsäure auf einen pH-Wert von 7,5 abgestimmt wurde.
Die Proben bestehen aus der in DMSO aufgelösten Verbindung.
Der Leser wird auf Dixon, M. und Webb, E.C., „Enzymes", dritte Ausgabe, 1979, Academic Press, verwiesen, dessen Veröffentlichung für eine weitergehende Beschreibung der Messung von Ki per Referenz hierin inkorporiert wird.
Das TRI 50c Calciumsalz wies einen Ki-Wert von 10 nM auf.
BEISPIEL 31 – PRÄPARATION VON MAGNESIUMSALZ VON TRI 50C
TRI 50c (1,00 g, 1,90 mM) wurde in Methanol (10 ml) aufgelöst und bei Raumtemperatur gerührt. Dieser Lösung wurde Magnesiummethoxid (Mg(CH₃O)₂) in Methanol (1,05 ml, 7,84 Gwt%) zugesetzt. Diese Lösung wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, gefiltert und dann auf 5 ml evakuiert. Dann wurde Wasser (25 ml) zugesetzt und die Lösung bis zum trockenen Zustand evakuiert, um einen weißen Festkörper zu erhalten. Dieser wurde über Silicagel 72 Stunden lang getrocknet, bevor er zur Mikroanalyse eingeschickt wurde. Ausbeute: 760 mg.
¹H NMR 300 MHz, δ_H(CD₃C(O)CD₃) 7,14-7,22 (20H, m), 6,90 (2H, m), 4,89 (4H, m, PhCH₂O), 4,38 (2H, m), 3,40 (2H, br s), 2,73-3,17 (20H, breite, nicht aufgelöste Multipletts), 1,05-2,10 (16H, breite, nicht aufgelöste Multipletts).
¹³C NMR 75MHz δ_C(CD₃C(O)CD₃) 206,56, 138,30, 130,76, 129,64, 129,31, 129,19, 129,09, 128,20, 128,04, 74,23, 73,55, 67,78, 58,76, 56,37, 56,03, 48,38, 47,87, 39,00, 25,42, 25,29 FTIR (KBr Scheibe) ν_max (cm^–1) 3331,3, 3031,4, 2935,3, 2876,9, 2341,9, 1956,1, 1711,6, 1639,9, 1534,3, 1498,1, 1453,0, 1255,3, 1115,3, 1084,6, 1027,6, 917,3, 748,9, 699,6, 594,9, 504,5, 467,8.
BEISPIEL 32 – LÖSLICHKEIT VON TRI50C
Die durch das Arbeitsverfahren in Beispiel 5 entstehenden UV/sichtbaren Spektren von TRI 50c und dessen Löslichkeit wurden wie oben mit Hinblick auf die Salze gewonnen. Die Löslichkeit von TRI50c, wenn zu 50 mg/ml aufgelöst, lag bei 8 mM (4 mg/ml).
BEISPIEL 33 – ANALYSE VON NATRIUM-, CALCIUM-, MAGNESIUM- UND ZINKSALZEN VON (R,S,R) TRI 50C

Die folgenden Salze wurden mithilfe einer Boronsäure:Metall Stöchiometrie von n:1 präpariert, wobei n die Valenz des Metalls ist, unter Verwendung von (R,S,R) TRI 50c von höherer chiraler Reinheit als die, die zur Präparation der in Beispielen 8, 11, 14, 18, 21, 24 und 29 beschriebenen Salze verwendet wird. A. Natriumsalz (Produkt aus Beispiel 9)

Analytische Daten	Physische Eigenschaften

HPLC oder LC/MS: HPLC beta-basisch	Form: Amorpher Festkörper
C18 Säule, CH₃CN, Wasser
	Farbe: Weiß
Geschätzte Reinheit: > 95% durch UV
(λ_215nm)	Schmelzpunkt: keine Angabe

Mikroanalyse:	Löslichkeit: In wässrigem
	Berechnet	Gefunden	Medium ca.~
C:	59,24	59,93	50 mg/ml löslich
H:	6,44	6,47
N:	7,67	7,31	M_w: 547,40
Andere:	B:	1,98	1,91
	Na:	4,20	3,81

B. Calciumsalz (Produkt aus Beispiel 26)

Analytische Daten	Physische Eigenschaften

HPLC oder LC/MS: HPLC beta-basisch	Form: Amorpher
C18 Säule, CH₃CN, Wasser	Festkörper

Geschätzte Reinheit: > 95% durch UV	Farbe: Weiß
(λ_215nm)
	Schmelzpunkt: keine
Mikroanalyse:	Angabe

	Berechnet	Gefunden	Löslichkeit: In
C:	59,27	55,08	Medium wässrigem
H:	6,48	6,43	ca.~
N:	7,71	7,08	4 löslich mg/ml
Andere:	B:	1,99	2,01
	Ca:	3,68	3,65	M_w: 1088,89

C. Magnesiumsalz (Produkt aus Beispiel 31)

Analytische Daten	Physische Eigenschaften

HPLC oder LC/MS: HPLC beta-basisch	Form: Amorpher
C18 Säule, CH₃CN, Wasser	Festkörper

Geschätzte Reinheit: > 90% durch UV	Farbe: Weiß
(λ_215nm)
	Schmelzpunkt: keine
Mikroanalyse:	Angabe
	Berechnet	Gefunden	Löslichkeit: In
C:	60,44	57,25	wässrigem Medium
H:	6,57	6,71	ca.~
N:	7,83	7,45	7 mg/ml löslich
Andere:	B:	2,01	2,02
	Mg:	2,26	2,12	M_w: 1073,12

D. Zinksalz (Produkt aus Beispiel 15)

Analytische Daten	Physische Eigenschaften

HPLC oder LC/MS: HPLC beta-basisch	Form: Amorpher
C18 Säule, CH₃CN, Wasser	Festkörper

Geschätzte Reinheit: > 95% durch UV	Farbe: Weiß
(λ_215nm)
	Schmelzpunkt: keine
Mikroanalyse:	Angabe
	Berechnet	Gefunden	Löslichkeit: In
C:	58,21	56,20	wässrigem Medium
H:	6,33	6,33	ca.
N:	7,54	7,18	~ 2 mg/ml löslich
Andere:	B:	1,94	1,84
	Zn:	5,87	7,26	M_w: 1114,18

Bemerkungen: In den berechneten Mikroanalysen wird die trigonale Formel der Boronsäure verwendet. Es wird vermutet, dass in Beispiel 11 von einer niedrigeren Natriumsalzlöslichkeit berichtet wird, weil das in Beispiel 11 getestete Salz eine niedrigere chirale Reinheit aufweist.

Abschließende Bemerkungen
Die Zink-, Calcium- und Magnesiumsalze wurden alle mit einer Stöchiometrie von einem Metallion zu zwei Molekülen von TRI 50c präpariert. Die für die Calcium- und Magnesiumsalze gefundenen Werte liegen nahe bei den für diese 1:2 Stöchiometrie berechneten und stehen daher mit diesen im Einklang. Bei dem Zinksalz wurde ein Überschuss an Zink festgestellt; nichtsdestotrotz umfasst das Zinksalz einen bedeutenden Anteil von saurem Boronat. Das Natriumsalz wurde mit einer Stöchiometrie von einem Metallion zu einem Molekül von TRI 50c präpariert. Der für das Natriumsalz gefundene Wert liegt nahe bei dem für diese 1:1 Stöchiometrie berechneten und steht daher mit diesem im Einklang.
BEISPIEL 34 – STABILITÄT
Eine Untersuchung von TRI 50c und seinen Natrium- und Lysinsalzen vor und nach dem Trocknen.
1. Ergebnisse in Tabellenform

Tabelle 1

Verbindung	Menge [μg/mL]	Reinheit (% Fläche)
TRI 50c trocken	1000,0	82,00
TRI 50c nicht getrocknet	947,3	85,54
TRI 50c Na-Salz trocken	1024	98,81
TRI 50c Na-Salz nicht getrocknet	1005,8	98,61
TRI 50c Lys-Salz trocken	813,3	90,17
TRI 50c Lys-Salz nicht getrocknet	809,8	92,25

Die Reinheit der Säure wurde durch den Trocknungsprozess verringert, doch die Reinheit der Salze war weniger stark betroffen; die Reinheit des Natriumsalzes wurde nicht wesentlich reduziert. Große Unterschiede bei den Responsefaktoren werden die tatsächlichen Verunreinigungsgrade jedoch reduzieren.
2. Analytisches Arbeitsverfahren
2.1 Probenpräparation
TRI 50c und seine Na, Li und Lys Salze werden in HPLC-Vialen gewogen und in einem Exsikkator über Phosphorpentoxid 1 Woche lang gelagert. Für die Probenanalyse wurden 5 mg getrockneten und nicht-getrockneten Materials in einem 5 ml volumetrischen Kolben gewogen, in 1 ml Acetonitril aufgelöst und mit demineralisiertem Wasser auf 5 ml aufgefüllt.
3. Datenauswertung
Die quantitative Auswertung wurde mithilfe eines HPLC-PDA-Verfahrens durchgeführt.
4. Analytische Parameter

4.1 Ausstattung und Software

Autosampler	Waters Alliance 2795
Pumpe	Waters Alliance 2795
Säulenofen	Waters Alliance 2795
Detektion	Waters 996 Diodenarray, MS-ZQ 2000, single quad
Software Version	Waters Millenium Release 4.0

4.2 Stationäre Phase

Analytische Säule ID	S71
Material	X-Terra^TM MS C₁₈, 5 μm
Lieferant	Waters, Eschborn, Deutschland
Dimensionen	150 mm × 2,1 mm (Länge, interner Durchmesser)

4.3 Mobile Phase

Wässrige Phase: A: H₂O + 0.1%
Organische Phase: C: ACN

Gradientbedingungen:

Zeit Durchfluss % A % C

0,00 0,5 90 10

27,0 0,5 10 90

27,1 0,5 90 10

30,0 0,5 90 10
Das Beispiel deutet darauf hin, dass die Salze der Offenbarung, insbesondere die Metallsalze, z. B. Alkalimetallsalze, stabiler sind als die Säuren, namentlich TRI 50c.
BEISPIEL 35 – IN VITRO-UNTERSUCHUNG VON MAGNESIUMSALZ VON TRI 50C ALS THROMBININHIBITOR
Amidolytische Thrombinuntersuchung
TRI 50c Magnesiumsalz (TRI 1405) wurde in einer amidolytischen Thrombinuntersuchung getestet.
Reagenzien:

Untersuchungspuffer:
100 mM Na Phosphat
200 mM NaCl (11,688 g/l)
0,5% PEG 6000 (5 g/l)
0,02% Na Azid
pH-Wert 7,5

Das chromogene Substrat S2238 wurde auf 4 mM (25 mg + 10 ml) in Wasser aufgelöst. Dann wurde es mit dem Untersuchungspuffer zur Verwendung bei der Untersuchung zu 5 μM auf 50 uM verdünnt. (S2238 ist H-D-Phe-Pip-Arg-pNA).
Thrombin wurde von HTI über Cambridge Bioscience erhalten und zu 1 mg/ml mit Untersuchungspuffer aliquotiert. Auf 100 ng/ml mit Untersuchungspuffer verdünnen und dann weiter 1 zu 3 zur Verwendung bei der Untersuchung verdünnen.
Untersuchung:

110 μl Untersuchungspuffer
50 ul 5 μg/ml Thrombin
20 μl Vehikel oder Verbindungslösung
5 Min. bei 37°C
20 μl 50 μM S2238

Bei 405 nm bei 37°C 10 Minuten lang ablesen und Vmax registrieren.
Ergebnisse:
Die Ergebnisse werden in 1 präsentiert.
Diskussion:
In dieser Untersuchung zeigt das Magnesiumsalz von TRI 50c als eine externe Kontrolle dieselbe Aktivität wie TRI 50b auf.
BEISPIEL 36 – TRI 50B INHIBIERUNG DER PROKOAGULATORISCHEN AKTIVITÄT VON BLUTPLÄTTCHEN
Die prokoagulatorische Aktivität von Blutplättchen kann als die Steigerung der Aktivierungsgeschwindigkeit von Prothrombin durch Faktor Xa in Präsenz von Faktor Va nach dem Zusatz von Blutplättchen, die mit Thrombin vorbehandelt wurden, beobachtet werden, die durch Thrombin allein, Kollagen allein oder eine Mischung von Thrombin und Kollagen verursacht werden kann. Diese Eigenschaft beruht auf einer Steigerung der Anzahl anionischer Phospholipide auf der Oberfläche des Blutplättchens mit gleichzeitiger Freisetzung von Mikrovesikeln von der Oberfläche. Dies ist eine entscheidende physiologische Reaktion und Menschen, deren Blutplättchen nur reduziert zur Erzeugung prokoagulatorischer Aktivität fähig sind (Scott-Syndrom), haben eine gesteigerte Tendenz zum Bluten.
Verfahren:
Gewaschene Blutplättchen wurden entweder mit 1,15 nM Thrombin, 23 μg/ml Kollagen oder einer Mischung von beiden mit derselben Konzentration bei 37°C behandelt. TRI 50b wurde entweder 1 Minute vor dem Zusatz des Aktivators oder sofort nach der Inkubation mit dem Aktivator zugesetzt. Die prokoagulatorische Aktivität der Blutplättchen wurde wie zuvor beschrieben bestimmt (Goodwin C A et al, Biochem. J 1995, 8, 308: 15-21).
Es stellte sich heraus, dass TRI 50b ein potenter Inhibitor der prokoagulatorischen Aktivität von Blutplättchen ist, mit IC₅₀-Werten, die unten zusammengefasst werden.
Tabelle 2: Einfluss von TRI 50b auf die Induktion der prokoagulatorischen Aktivität von Blutplättchen durch verschiedene Agonisten: Tabelle 2

Agonist -fache Beschleunigung ohne TRI 50b IC50 mit vorheriger Inkubation (nM) IC50 ohne Inkubation (nM)

Thrombin 30 8 3000

Kollagen 45 200 300

Thrombin/Kollagen 110 3 80
Tabelle 2 verdeutlicht beispielsweise, dass wenn Blutplättchen mit Thrombin vorbehandelt wurden, sie im Vergleich zu Kontrollblutplättchen eine 30-fache Beschleunigung der Aktivierungsgeschwindigkeit von Prothrombin verursachten. Durch eine Behandlung mit TRI 50 wurde eine solche Beschleunigung auf den verschiedenen, gegebenen TRI 50 Konzentrationsebenen zur Hälfte reduziert. Die bedeutende Potenz von TRI 50 wird durch die Tatsache untermauert, dass sich die IC₅₀-Werte im nanomolaren Bereich bewegen.
TRI 50b hat auf eine durch ADP, Kollagen oder Epinephrin induzierte Aggregation gewaschener Blutplättchen keine Auswirkung.
BEISPIEL 37 – EXTRAKORPORALES SHUNT-MODELL BEIM KANINCHEN
Einleitung
Die Technik beschreibt ein tierisches Modell, in dem ein blutplättchenreicher Thrombus produziert wird. Die Aktivität von TRI 50b und Heparin wird verglichen.
Die Halsschlagader und Drosselvene anästhetisierter Kaninchen wurden verwendet, um einen extrakorporalen Kreislauf zu schaffen, der eine suspendierte, fremde Oberfäche enthielt (Seidenfaden). Die Thrombusablagerung wird durch hohen Scherstreß (high shear stress) eines turbulenten arteriellen Blutflusses hervorgerufen, Blutplättchenaktivierung, gefolgt von Koagulation in Präsenz thrombogener Oberflächen initiiert. Histopathologische Studien haben gezeigt, dass der Thrombus blutplättchenreich ist.
Materialien und Verfahren
Tiere:
Es wurden NZW-Kaninchen (Männchen von 2,5–3,5 kg) verwendet. Den Tieren wurde bis zur Induktion der Anästhesie Essen und Wasser gegeben.
Anästhesie:
Die Tiere wurden mit Fentanyl/Fluanison (Hypnorm) 0,15 ml insgesamt durch intramuskuläre Injektion vorbehandelt. Vollnarkose wurde mit Methohexiton (10 mg/ml) induziert, gefolgt von endotrachealer Intubation. Die Anästhesie wurde mit in Sauerstoff/Stickstoffoxid getragenem Isofluran (1–2,0%) aufrechterhalten.
Präparation der Operation:
Die Tiere wurden in liegender Rückenlage platziert und der ventrale Halsbereich für die Operation vorbereitet. Die linke Halsschlagader und rechte Drosselvene wurden freigelegt. Die Arterie wurde mit einem großen Portex^® Katheter (Stärke gelb) kannuliert, der auf eine geeignete Länge zugeschnitten worden war. Die Vene wurde mit einem Silastic^® Katheter kannuliert. Der Shunt umfasste eine 5 cm lange „Autoanalyser"-Linie (Stärke violett/weiß). Shuntverbindungen auf der arteriellen Seite wurden mit mittelgroßen Silastic^®-Schläuchen hergestellt. Der Shunt wurde, bevor er dem Kreislauf ausgesetzt wurde, mit Salzlösung gefüllt. Die rechte Oberschenkelarterie wurde zur Messung des Blutdrucks kannuliert.
Präparation und Einführung des Fadens:
Der mittlere Abschnitt des Shunts enthielt einen 3 Zentimeter langen Faden. Dieser bestand aus Gutterman Nähseide 000-Stärke, um vier Einzelfäden mit einem einzelnen Knoten am Ende bereitzustellen. (Der Knotenabschnitt befand sich außerhalb des Shunts).
Blutfluss
Die Geschwindigkeit des Blutflusses wurde mithilfe von „Doppler"-Sonden (Crystal Biotech) bestimmt. Eine Silastic-Sonde wurde über der Halsschlagader am Punkt der Einführung des arteriellen Katheters positioniert. Der Fluss wurde durch eine Registriermaschine unter Verwendung von wärmeempfindlichem Papier aufgezeichnet.
ERGEBNISSE

Tabelle 3

BEHANDLUNG	DOSE	THROMBUSGEWICHT NACH 20-minütigem Durchlauf	ANTITHROMBOTISCHE AKTIVITÄT
Kontrolle	nicht zutreffend	22.4 ± 2,2 mg (n = 5)
TRI 50b	10 mg/kg iv	9,78 ± 1,9 mg (n = 5)	Aktiv
	3,0 mg/kg iv	15,3 ± 2,2 mg (n = 5)	Aktiv
HEPARIN	100 u/kg iv	22,9 ± 1,65 mg (n = 4)	Inaktiv
	300 u/kg iv	10,5 ± 1,4 mg (n = 4)	Aktiv (Starke Blutung)

Diskussion
Tabelle 3 zeigt, dass unter Bedingungen hoher arterieller Scherspannung eine TRI 50b Dose von 3 mg/kg bis 10 mg/kg iv die Thrombusformation wesentlich inhibiert, ohne Blutungen zu verursachen, während eine Heparindose innerhalb des normalen klinischen Behandlungsbereichs für venöse Thrombosen (100 u/kg iv Heparin) keinen Effekt hatte. Die höhere Dose von Heparin war zwar aktiv, verursachte jedoch starke Blutungen. Diese Ergebnisse, die zeigen, dass TRI 50b arterielle Thrombose wirksam inhibiert, ohne Blutungen zu verursachen, stehen mit der Tatsache im Einklang, dass TRI 50b die prokoagulatorische Aktivität von Blutplättchen inhibiert. Im Gegensatz dazu verursachte der Thrombininhibitor Heparin, wenn dieser zu ungefähr gleich wirksamen Dosen (im Sinne der Inhibierung arterieller Thrombosen) verabreicht wurde, die starken Blutungen, die auftreten, wenn Thrombininhibitoren zur Behandlung arterieller Thrombose verwendet werden.
BEISPIEL 38 – VERGLEICH DER BLUTUNGSZEITEN
Ziel der Studie war es, die Blutungszeiten von Heparin mit denen von TRI 50b in einem geeigneten Modell zu vergleichen. Es wird allgemein akzeptiert, dass Heparin einen schlechten Inhibitor der prokoagulatorischen Aktivität von Blutplättchen darstellt (J. Biol. Chem. 1978 Oct 10; 253(19):6908-16; Miletich JP, Jackson CM, Majerus PWI: J. Clin. Invest. 1983 May; 71(5):1383-91).
Es wurden die Blutungszeiten in einem Modell eines blutenden Rattenschwanzes nach intravenöser Verabreichung von Heparin und TRI 50b bestimmt. Die eingesetzten Dosen wurden auf der Basis ihrer Wirksamkeit bei der Ratte Wessler und dynamischen Modellen ausgesucht und waren wie folgt:

TRI 50b: 5 und 10 mg/kg

Heparin: 100 Einheiten/kg
MATERIALIEN UND VERFAHREN
Anästhesie
Die Ratten wurden mit Natriumpentabarbiton zu 60 mg/kg (2,0 ml/kg von 30 mg/ml Lösung per i.p. Injektion) anästhetisiert. Zusätzliche Anästhetika wurden je nach Bedarf ip. verabreicht.
Präparation der Operation
Eine Drosselvene wurde zur Verabreichung der Testverbindung kannuliert. Die Trachea wurde ebenfalls mit einer geeigneten Kanüle kannuliert und die Tiere durften „Raumluft" spontan einatmen.
Verabreichung der Verbindung
Diese wurden im angemessenen Vehikel zu 1,0 ml/kg intravenös gegeben. Heparin wurde in Salzlösung verabreicht, während TRI 50b in Ethanol aufgelöst und die entstehende Lösung zur Injektion Wasser zugesetzt wurde (1 Teil Ethanol zu 5 Teilen Wasser).
Technik
Zwei Minuten nach Verabreichung der Verbindung wurden die distalen 2 mm des Tierschwanzes mit einem neuen Skalpellmesser sektioniert und der Schwanz in warme Salzlösung (37°C) eingetaucht, die in einem üblichen „universellen" Behälter enthalten war, damit der Blutstrom deutlich sichtbar würde. Die Registrierung der Blutungszeit begann sofort nach der Transektion und dauerte bis zum Versiegen des Blutflusses aus der Schwanzspitze.
Nachdem der Blutfluss aus dem Schwanz aufgehört hatte, wartete man 30 Sekunden, um sicherzustellen, dass die Blutung nicht von neuem anfing; wenn die Blutung wieder einsetzte, wurde die Registrierzeit bis zu maximal 45 Minuten lang weiter aufgenommen.
Ergebnisse
Tabelle 4 bietet eine Zusammenfassung der Blutungsergebnisse und zeigt die Steigerungen, die die Grundlinienwerte überschreiten. Tabelle 4 Zusammenfassende Tabelle der Blutungsergebnisse

Behandlung Blutungszeit Min (± SEM†)

Salzlösung 5,1 ± 0,6

Heparin 100 u/kg iv > 40*

TRI 50b 5 mg/kg iv 11,3 ± 1,2

TRI 50b 10 mg/kg iv 30,4 ± 5,2

*Starke, nach 40 Minuten nicht versiegende Blutungen bei allen Tieren.
†SEM = Standardfehler des Mittelwertes

Diskussion
Die Ergebnisse zeigen, dass TRI 50b Heparin bei allen Dosen überlegen war (verursachte weniger Blutungen). Es sollte beachtet werden, dass wenn 100 u/kg Heparin mit 5 mg/kg TRI 50b verglichen werden, die mit Heparin behandelten Tiere stärker bluteten als jene, die TRI 50b erhielten; zuvor war etabliert worden (Beispiel 25), dass Heparin bei einer Dosierung von 100 u/kg ein weniger wirksamer Inhibitor von arterieller Thrombose ist als TRI 50b bei einer Dosierung von 3,0 mg/kg. Heparin ist hauptsächlich ein Thrombininhibitor und als Inhibitor der prokoagulatorischen Aktivität von Blutplättchen wenig wirksam; die Ergebnisse stehen deshalb damit im Einklang, dass TRI 50b durch Inhibierung der koagulatorischen Aktivität von Blutplättchen sowohl antikoagulatorische Aktivität als auch thrombininhibierende Aktivität ausübt.
BEISPIEL 39 – TRI 50B ALS PROMEDIKAMENT FÜR TRI 50C: PHARMAKOKINETIK UND ABSORPTION
MATERIALIEN UND VERFAHREN
Tiere
Es wurden Ratten mit einem Körpergewicht von circa 250–300 g verwendet. Die Tiere mussten nur am Tag ihrer Verwendung für den iv Schritt fasten. Tabelle 5: iv Phase

Behandlung Dose mg/kg iv n

TRI 50b 1,0 mg/kg 3

TRI 50c 1,0 mg/kg 3
Dosierung
Formulierung (TRI 50b/TRI 50c)
Diese wurden in einer wie folgt präparierten Formulierung dosiert: 48 mg/ml TRI 50b wurden in Ethanol aufgelöst: PEG 300 (2:3 Vol:Vol). Kurz vor der Verabreichung wurden 5 Volumen dieser Lösung mit 3 Volumen 5%igem Kollidon 17 8F gemischt.
i.v. Phase
Beide Verbindungen wurden bei einer Dosierung von 1,0 mg/kg iv gegeben.
Die Verbindungen wurden in einer PEG/Ethanol/Kollidon-Formulierung dosiert, die kurz zuvor präpariert worden war, wie sofort unter der Überschrift „Dosierung" beschrieben. Vorrat 15,0 mg/ml. Dieser wurde zu 1,33 ml/kg dosiert (äquivalent zu 30 mg/kg).
Blutproben
Es wurde eine Probe vor der Dosierung entnommen, gefolgt von Probenentnahmen nach der Dosierung nach: 0, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 60 und 90 Minuten.
Plasma
Dieses wurde durch Zentrifugation (3000 RPM 10 Minuten lang) gewonnen und vor der Analyse bei –20°C gelagert.
ERGEBNISSE
PHARMAKOKINETISCHE ANALYSE
Tabelle 6:
i.v. pharmakokinetische Daten

Die folgenden Ergebnisse werden in 2 dargestellt:

	TRI 50b	TRI 50c
Eliminierungshalbwertszeit: Minuten	35 Minuten	36,6 Minuten
Fläche unter Kurve	1,68	1,48
Mittlere Verweildauer	46 Minuten	45 Minuten 5
Clearance: ml/min/kg	10	11,3
Volumenverteilung Liter/kg	0,5	0,59
Max. Plasmakonzentration (beobachtet)	2,24	2,35

2: Clearance und Kinetik während der intravenösen Phase nach einer einzelnen Dosierung mit TRI 50b oder dessen freier Säure (TRI 50c). Die Abbildung zeigt die beobachteten Untersuchungsdaten.

ABSCHLIESSENDE BEMERKUNGEN
Die i.v.-Kinetik war für sowohl TRI 50b als auch TRI 50c ähnlich. Die Daten stehen damit im Einklang, dass TRI 50b in Plasma schnell zu TRI 50c hydrolysiert und damit, dass TRI 50c das aktive Prinzip darstellt.
Die Ergebnisse der Beispiele 36 bis 39 weisen darauf hin, dass die Verabreichung von TRI 50c in Form eines Salzes einen Weg bereitstellen wird, arterielle Thrombosen und/oder venöse Thrombosen zu behandeln.
BEISPIEL 40 – INTRAVENÖSE VERABREICHUNG VON TRI 50C NATRIUMSALZ
Die Pharmakokinetiken (PK) und Pharmakodynamiken (PD) von TRI 50c Natriumsalz nach der intravenösen Verabreichung wurden bei Beagle-Hunden untersucht.
Die PD wurden als Thrombinzeit und APTT mithilfe eines automatisierten Koagulometers gemessen. Die Plasmakonzentrationen wurden mithilfe eines LCMS/MS-Verfahrens gemessen.
TRI 50c Mononatriumsalz (108,8 g) wurde in 0,9% Natriumchlorid (100 ml) aufgelöst und zu 1,0 mg/kg (1,0 ml/kg über 30 Sekunden) i.v. dosiert. Es wurden Blutproben in 3,8%iges Tri-Natriumcitrat (1 + 8) vor der Dosierung und 2, 5, 10, 20, 30 Minuten nach der Dosierung und dann 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12 und 24 Stunden nach der Dosierung entnommen. Plasma wurde per Zentrifugation präpariert und vor der Analyse bei minus 20°C eingefroren.
ERGEBNISSE
Das Natriumsalz wurde während der gesamten Untersuchungsdauer ohne nachteilige Auswirkungen toleriert.
Männliche und weibliche Hunde reagierten ähnlich mit einem pharmakodynamischen C max: von 2 Minuten (Thrombinzeit von 154 Sekunden, angehoben von einer Basislinie von 14,3 Sekunden). Thrombinzeit betrug eine Stunde nach der Dosierung 26 Sekunden.
Zwischen der APTT und Thrombingerinnungszeit bei Hunden, die Natriumsalz bei einer Dosierung von 1,0 mg/kg i.v. empfingen, bestand ein extrem gutes therapeutisches Verhältnis. Die Thrombingerinnungszeit war zwei Minuten nach der Dosierung über der Basislinie 10,8 fach erhöht worden (auf 154,4 Sekunden von 14,3 Sekunden), verglichen mit einer nur 1,3 fachen Erhöhung der APTT (von 19 Sekunden auf 25 Sekunden nach der Dosierung).
BEISPIEL 41 – Klinische Studien am Menschen
In freiwilligen klinischen Studien am Menschen mit Dosierungen von bis zu 2,5 mg/kg i.v. (Dosierungen, die die Thrombingerinnungszeit wesentlich verlängern), hatte TRI 50b auf die Simplate-Blutungszeit (d. h. Blutungszeit, die mithilfe eines Simplate^®-Blutungszeitgeräts gemessen wurde) keine Auswirkung.
BEISPIEL 42 – RESTLICHES n-HEPTAN VON TRI 50C CALCIUMSALZ

Das mithilfe der Verfahren aus Beispielen 1 und 3 präparierte Salz wurde per Headspace-Gaschromatographie getestet. Die Daten werden unten gezeigt:

Restliche Lösungsmittel: Headspace-Gaschromatographie
GC-Parameter:
Säule:	DB-wax, 30 m, 0,32 mm ID, 5 μ
Trägergas:	Helium 5,0, 80 kPas
Detektor:	FID, 220°C
Injektor Temp.:	150°C
Arbeitsbedingungen:	35°C/7 Min; 10°C/min bis zu 80°C/2 Min; 40°C
bis zu 180°C/2 Min
Injektionsvolumen:	1 ml
Split:	Ein
Headspace-Parameter:
Ofentemperatur:	70°C
Nadeltemperatur:	90°C
Transfertemperatur:	100°C
Andere Parameter:	Temperatur-Zeit: 15 Min., GC-Zykluszeit: 28
Min.,
	Injektionszeit: 0,03 Min., Dauer: 0,4 Min.

Kalibrierungsstandards: Gewicht/Verdünnung der Probe

Standard	Gewicht (mg)	Volumen (ml)	Konzentration (mg/ml)	Fläche (Durchschnitt, n = 3)
n-Heptan	103,12	100	1,0312	2757,74756

Probennr.	Gewicht (mg)	Volumen (ml)	Konzentration (mg/ml)
1	100,84	5	20,17
2	99,12	5	19,82
3	100,03	5	20,01

n-Heptan
	Probe	Konzentration (mg/ml)	Gehalt (%)
	1	0,0010	0.0048
	2	0,0009	0.0044
	3	0,0010	0.0050
		0.00095	0,005

Beispiel 43 – HPLC-CHROMATOGRAMME
TRI 50c Mononatriumsalz, das mithilfe der Verfahren in Beispielen 1, 2 & 3 hergestellt wurde und TRI 50c Hemicalciumsalz, das mithilfe der Verfahren in Beispielen 1, 2 & 4 hergestellt wurde, wurden per HPLC-Chromatographie analysiert.
1. Verfahren
1.1 Ausstattung und Software

Autosampler Waters Alliance 2795

Pumpe Waters Alliance 2795

Säulenofen Waters Alliance 2795

Nachweis Waters 2996 Diodenarray, MS-ZQ single quad

Software Version Waters Millennium 4.0

1.2 Stationäre Phase

Analytische Säule ID S-71

Material XTerra^TM MS C18, 5 μm

Lieferant Waters, Eschborn, Deutschland

Maße 150 mm × 2,1 mm (Länge, ID)

Vorsäule ID keine Vorsäule
Xterra MS C₁₈, 5 μm ist ein Säulenpackmaterial, das von Waters Corporation, 34 Maple Street, Milford, MA 01757, US und regionalen Büros geliefert wurde, wie in den Jahren 2002/2003. Es umfasst hybride organische/anorganische Partikel, die aus spherischen Partikeln mit einer 5 μm Größe, 125 Å Porengröße und 15,5% Kohlenstoffbelastung bestehen. 1.3 Mobile Phase

Wässrige Phase: A: H₂O + 0.1% HCOOH

Organische Phase: C: ACN

H₂O = H₂O durch Ultra Clear Wasserreinigungssystem
ACN = Acetonitril (gradient grade)

Zeit [Min]	A%	C%	Durchfluss [mL/Min]	Gradientform
0,0	90,0	10,0	0,5
27,00	10,0	90,0	0,5	linear
27,10	90,0	10,0	0,5	linear
30,00	90,0	10,0	0,5	linear

Durchfluss	0,5 mL-Min^–1
Temperatur	40 ± 5°C
HPLC-Kontrolle	Waters Millennium Release 4.0
Berechnung	Waters Millennium 4.0

2. Parameter
2.1 Wellenlänge/Retentionszeit/Responsefaktoren

Tabelle: Retentions- und Detektionsparameter (k' F: 0,5 ml/Min, t0 = 0,9 mL/Min)

Substanz	RetZeit [Min]	λ [nm]	m/z	Responsefaktor [Fläche/μg]	Reziproker Responsefaktor
TRI 50c	11,68	258	508,33	660	1
Benzylalkohol	3,862	258	n. b.	1960	0,337
Benzaldehyd	6,13	258	n. b.	79939	0,0083
Benzoesäure	5,52	258	n. b.	5967	0,111
Fremdstoff I	11,18	258	396,17	886	0,745
Fremdstoff II	13,39	258	482,22	552	1,196

2.2 Linearität
Linearitätsbereich 4000 – 10 μg/mL (Detektion UV 258 nm)

Tabelle mit Linearitätsdaten UV 258 nm

Kalibrierungslösung	Fläche [μAU's]	Zielkonz. [μg/mL]	Gef. Konz.¹ [μg/mL]
Tri 50c	5353	10	20,44
Tri 50c	5301	10	20,37
Tri 50c	65809	100	113,35
Tri 50c	66365	100	114,17
Tri 50c	172019	250	270,43
Tri 50c	162587	250	256,48
Tri 50c	339503	500	518,13
Tri 50c	326912	500	499,51
Tri 50c	659257	1000	991,02
Tri 50c	647495	1000	973,63
Tri 50c	1322371	2000	1971,72
Tri 50c	1305196	2000	1946,32
Tri 50c	2724410	4000	4045,24

¹ mit linearer Gleichung erneut berechnet

Parameter linearer Gleichung:

Y = 6,75e + 002 X – 8,45e + 003
r = 0,99975
r² = 0,99950

Linearitätsbereich 10 – 0,10 μg/mL (Detektion SIR m/z 508,33)

Tabelle: Linearitätsdaten SIR 508,33

Kalibrierungslösung	Mittlere Fläche [μAU's]	Zielkonz. [μg/mL]	Gef. Konz.¹ [μg/mL]
Tri 50c	2188860	0,01	0,022
Tri 50c	2702839	0,01	0,045
Tri 50c	3817226	0,1	0,094
Tri 50c	3833799	0,1	0,095
Tri 50c	23153550	1	0,947
Tri 50c	24646892	1	1,013
Tri 50c	223007852	10	9,765
Tri 50c	233753043	10	10,239

¹ mit linearer Gleichung erneut berechnet

Gleichungsparameter

Y = 2,27e + 007 X + 1,69e + 006
r = 0,99958
r² = 0,99916

2.3 Quantifizierungsgrenze
Die Quantifizierungsgrenze wurde mithilfe des Verhältniskriteriums von Signal zu Geräusch S/G > 19 bestimmt,

UV 258 nm: 10 μg/mL
M/z 508,3: 0.1 μg/mL

Injektion

Zielkonzentration [μg/mL]

Fläche

Menge [μg/mL]

Retentionszeit [Min]

1	250	165805	261,24	11,690
2	250	168644	265,44	11,662
3	250	167858	264,27	11,686
4	250	166947	262,93	11,692
5	250	166925	262,89	11,679
6	250	166294	261,96	11,696
Mittel		167079	263,12	11,684
Standardabweichung		1033	1,528	0,01
% RSD		0,6	0,6	0,1

2.5 Robustheit

Tabelle: Robustheitsdaten; Standard 250 μg/mL wässrige Lösung (< 1% ACN enthaltend)

Kalibrierungslösung	Temp./Zeit [°C/h]	Fläche [μAU's]	Rückgewinnung [%]
250 μg/mL Tri 50c	-	172020	-
250 μg/mL Tri 50c	4°C. 16 Std.	166294	96,67
2.5 μg/mL TRI 50c	-	88034891	-
2.5 μg/mL TRI 50c	37°C. 4 Std.	88833175	100,9

Referenzen

1. ICH HARMONISED TRIPARTITE GUIDELINE. TEXT ON VALIDATION OF ANALYTICAL PROCEDURES. Zur Übernahme bei Schritt 4 des ICH-Prozesses am 27. Oktober 1994 vom ICH-Lenkungsausschuss empfohlen.
2. FDA Reviewer Guidance. Validierung chromatographischer Verfahren. Center for Drug Evaluation and Research. Nov. 1994
3. USP 23. <621> Chromatography
4. L. Huber. Validierung analytischer Verfahren. LC-GC International Feb. 1998
5. Handbuch Validierung in der Analytik. Dr. Stavros Kromidas (Ed.) Wiley-VCH Verlag. 2000. ISBN 3-527-29811-8

3. Ergebnisse
3.1 Probenname TRI 50c Mononatriumsalz Injektionsvolumen: 10 μL

Name Ret. Zeit Fläche Fläche Peak-Höhe

(Min) % [μAU's] μAU

TRI 50c 12,136 100,0000 604,27228 32,05369

3.2 Probenname TRI 50c Hemicalciumsalz Injektionsvolumen: 10 μL

Name Ret. Zeit Fläche Fläche Peak-Höhe

(Min) % [μAU's] μAU

TRI 50c 12,126 100,0000 597,11279 32,29640
Die offenbarten Verfahren wurden verwendet, um Salze zu gewinnen, die im Wesentlichen frei von C-B-Bindungsabbauprodukten sind, insbesondere Salze, die keine solchen Produkte in einer Menge enthalten, die durch HPLC und besonders das Verfahren in Beispiel 43 nachweisbar ist. Die offenbarten Verfahren wurden verwendet, um Salze zu gewinnen, die im Wesentlichen frei von Verunreinigung I sind, insbesondere Salze, die keinen Verunreinigung I in einer Menge enthalten, die durch HPLC und besonders das Verfahren in Beispiel 43 nachweisbar ist. Die offenbarten Verfahren wurden verwendet, um Salze zu gewinnen, die im Wesentlichen frei von Verunreinigung IV sind, insbesondere Salze, die keine Verunreinigung IV in einer Menge enthalten, die durch HPLC und besonders das Verfahren in Beispiel 43 nachweisbar ist.
BEISPIEL 44 – BESTIMMUNG DES DIASTEREOMERENÜBERSCHUSSES
TRI 50b, roh, enthält drei Chiralitätszentren. Zwei von diesen sind durch Verwendung enantiomerisch reiner Aminosäuren ((R)-Phe und (S)-Pro) fixiert. Das dritte wird während der Synthese gebildet. Das bevorzugte Epimer ist das gewünschte TRI 50b, Isomer I (R,S,R-TRI 50b). Beide Epimere von TRI 50b sind durch das HPLC-Verfahren deutlich von der Basislinie getrennt, wodurch eine Bestimmung des Diastereomerenüberschusses (de) von TRI 50b möglich wird.
TRI 50d ist unter den bei der HPLC-Reinheitsbestimmung angewandten Bedingungen nicht stabil, sondern zersetzt sich während der Probenpräparation schnell zu TRI 50c, so dass TRI 50d und TRI 50c dieselben HPLC-Spuren zeigen.
Die zwei Isomere von TRI 50c sind in HPLC nicht von der Basislinie getrennt, doch beide Isomere sind deutlich sichtbar. Dies wird offensichtlich, wenn TRI 50b, roh (Mischung beider Isomere), mit Phenylboronsäure zu TRI 50c, roh, umgewandelt wird. Bei beiden Isomeren von TRI 50c wird in HPLC fast dasselbe Verhältnis beobachtet wie zuvor bei TRI 50b, roh.
Bei der Synthese von TRI 50d aus TRI 50b, roh, wird nur ein Diastereomer gefällt. In diesem Fall zeigt HPLC nur einen Peak für TRI 50c, wobei ein sehr kleines Fronting beobachtet wird. Die Fällung von Dichlormethan/Diethylether entfernt das Fronting effektiv. Das Ausmaß der Entfernung des Isomers II kann mithilfe dieses HPLC-Verfahrens nicht quantifiziert werden. Deshalb wurden Proben vor der erneuten Fällung und nach einer oder zwei erneuten Fällungen mit Pinacol esterifiziert und die entstehenden Proben von TRI 50b wurden mithilfe von HPLC analysiert. So wurde für die rohe Probe ein De von 95,4% bestimmt. Die erneut gefällte Probe führte zu einem de-Wert von 99,0% und letztendlich zeigte die zweimal erneut gefällte Probe einen de-Wert von 99,5%.
Diese Ergebnisse zeigen deutlich die bevorzugte Fällung von Isomer I, während Isomer II in Lösung verbleibt.
Aus dem zuvor gesagten kann erkannt werden, dass die Offenbarung Boronsäuresalze bereitstellt, die für pharmazeutische Zwecke von Nutzen sind und die eins oder mehrere der folgenden Merkmale aufweisen: (1) verbesserte hydrolytische Stabilität; (2) verbesserte Stabilität der Entboronisierung gegenüber; und (3) in jedem Fall, nicht von der bekannten Technik genannt.
Die Auswahl von aktiven Wirkstoffen für eine pharmazeutische Zusammensetzung stellt eine komplexe Aufgabenstellung dar, welche nicht nur die Berücksichtigung der biologischen Eigenschaften (einschließlich der biologischen Verfügbarkeit), sondern auch der physikalisch-chemischen Eigenschaften erfordert, welche für Verarbeitung, Formulierung und Lagerung wünschenswert sind. Die biologische Verfügbarkeit selber ist abhängig von verschiedenen Faktoren, häufig einschließlich der in vivo-Stabilität, der Löslichkeits- und Absorptionseigenschaften, jede einzelne wiederum hängt potentiell von multiplen physikalischen, chemischen und/oder biologischen Reaktionen ab.
Die vorliegende Offenbarung schließt den Gegenstand der folgenden Paragraphen ein:

Claims

Eine Verbindung ausgewählt aus Boronsäuren der Formel (IIIa) und isoliert von anderen Enantiomeren der Verbindung
wobei X H (um NH₂ zu bilden) oder eine Aminoschutzgruppe ist; aa¹ eine Aminosäure mit einer Kohlenwasserstoffreste-Seitenkette ist, die nicht mehr als 20 Kohlenstoffatome enthält und die mindestens eine zyklische Gruppe mit bis zu 13 Kohlenstoffatomen umfasst; aa² eine Iminosäure mit 4 bis 6 Ringmitgliedern ist; R¹ eine Gruppe der Formel -(CH₂)_s-Z ist, wobei Z -OMe oder -OEt ist und s 2, 3 oder 4 ist, wobei die Verbindung frei von jeder Verbindung ist, welche dieselbe Struktur aufweist, mit der Ausnahme eines Ersetzens der R¹-Gruppe durch eine Gruppe der Formel -(CH₂)_s-H.
Eine Verbindung nach Anspruch 1, bei der aa¹ ausgewählt ist aus Diphenylalanin („Dpa"), Phenylalanin („Phe"), Dicyclohexylalanin und Cyclohexylalanin.
Eine Verbindung nach Anspruch 1, bei der aa¹ Phe ist.
Eine Verbindung nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, bei der aa² Pro oder Azetidin-2-carbonsäure ist.
Eine Verbindung nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, bei der R¹ 3-Methoxypropyl ist.
Eine Verbindung nach Anspruch 5, die die Formel (VIII) hat: X-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-Mpg-B(OH)₂ (VIII),bei der Mpg-B(OH)₂ Boromethoxypropylglycin ist.
Eine Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, bei der X R⁶-(CH₂)_p-O-C(O)- ist und p 0 oder 1 ist.
Eine Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, bei der X Benzyloxycarbonyl („Cbz") ist.
Eine Verbindung nach Anspruch 1, bei der die Boronsäure eine mit TRI 50c bezeichnete Säure ist, nämlich Cbz-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-Mpg-B(OH)₂ ist.
Eine Verbindung nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, bei der das (R, S, R)-Isomer sich in einem diastereomerischen Überschuss von 95% oder mehr befindet.
Eine Verbindung nach Anspruch 10, bei der das (R, S, R)-Isomer sich in einem diastereomerischen Überschuss von 99% oder mehr, z. B. 99,5% oder mehr befindet.
Eine Verbindung nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, die im Wesentlichen frei von einem Abbauprodukt ist, das von der Spaltung der C-B-Bindung abstammt.
Eine Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12, die Cbz-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-Mpg-B(OH)₂ ist und bei der das Abbauprodukt, von der es im Wesentlichen frei ist,
ist.
Cbz-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-Mpg-B(OH)₂, wenn in einem diastereomerischen Überschuss von mindestens 99%, im Wesentlichen frei von der Verbindung
und frei von der Verbindung
Ein Produkt, das isoliertes, trockenes Cbz-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-Mpg-B(OH)₂ umfasst, frei von der entsprechenden Verbindung, bei der Mpg durch eine Aminosäure ersetzt ist, die eine Propylseitenkette an Stelle einer 3-Methoxypropylseitenkette hat.
Eine Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 14 oder ein Produkt nach Anspruch 15, bei dem die -B(OH)₂-Gruppe die Gruppe in Anhydridform umfasst.
Die Verwendung einer Verbindung oder eines Produkts nach irgendeinem vorherigen Anspruch, um ein pharmazeutisch verträgliches Basenadditionssalz davon zu machen, durch Kontaktieren der Verbindung mit einer Base, die in der Lage ist, solch ein Salz zu machen.
Die Verwendung nach Anspruch 17, bei der das Salz ein Metallsalz, z. B. ein Salz eines Alkalimetalls, ein Erdalkalimetall oder Zink ist.
Die Verwendung nach Anspruch 17, bei der das Salz ein Mononatriumsalz ist.
Die Verwendung nach Anspruch 17, bei der das Salz ein Erdalkalimetallsalz ist.
Die Verwendung nach Anspruch 17, bei der das Salz ein Alkalimetallsalz ist.
Ein Verfahren zum Herstellen einer pharmazeutischen Formulierung, umfassend das Kontaktieren einer Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 14 oder 16 mit einer Base, die in der Lage ist, ein Salz davon zu bilden, und Formulieren des resultierenden Produkts in eine pharmazeutische Zusammensetzung.
Ein Verfahren nach Anspruch 21, bei dem die Base eine basische Natriumverbindung ist.
Ein Verfahren nach Anspruch 21, bei dem die Base eine basische Kalziumverbindung ist.
Ein Verfahren nach Anspruch 31, bei dem die Base ein Aminozucker, ein Guanidin oder ein Amin der Formel (XI) ist:
wobei n von 1 bis 6 ist, R² H, Carboxylat oder ein derivatisiertes Carboxylat ist, R³ H, C₁-C₄-Alkyl oder ein Rest einer natürlichen oder unnatürlichen Aminosäure ist.
Eine Verbindung, die für die pharmazeutische Verwendung verträglich ist, und die Verbindungen wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 14 beansprucht, umfasst.
Eine Verbindung nach Anspruch 26, die in der Form einer Flüssigkeit, Lösung oder Dispersion ist.
Eine flüssige Zusammensetzung, bestehend aus oder im Wesentlichen bestehend aus den Verbindungen wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 14 beansprucht und einem flüssigen Trägerstoff, in dem sie gelöst oder suspendiert sind.
Ein Salz, erhältlich durch die Verwendung von irgendeinem der Ansprüche 17 bis 21.
Eine Formulierung, erhältlich durch ein Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 22 bis 25.
Ein Verfahren, das eine Säure von irgendeinem der Ansprüche 1 bis 14 verwendet, um ein Ester davon herzustellen.