DE60222809T2

DE60222809T2 - Biosensor

Info

Publication number: DE60222809T2
Application number: DE60222809T
Authority: DE
Inventors: Miwa Ako-gun HASEGAWA; Tomohiro Hirakata-shi YAMAMOTO; Motokazu Toyonaka-shi WATANABE; Takahiro Toyonaka-shi NAKAMINAMI; Shin Katano-shi Ikeda; Toshihiko Hirakata-shi Yoshioka; Shiro Hirakata-shi Nankai
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp
Priority date: 2002-03-01
Filing date: 2002-12-27
Publication date: 2008-06-26
Anticipated expiration: 2022-12-28
Also published as: EP1482307B1; CN1599865A; EP1482307A1; WO2003074999A1; EP1482307A4; DE60222809D1; CN100339702C; US20050072670A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Biosensor, der eine schnelle, hochempfindliche, einfache Bestimmung eines spezifischen Bestandteils in einer nachzuweisenden Probe, wie etwa Blut, Serum und Plasma, durchführen kann, insbesondere auf einen Biosensor, der Glucose, Gesamtcholesterin und Ähnliches messen kann.
Stand der Technik
Es wird eine Beschreibung eines Beispiels eines herkömmlichen Biosensors mit Blick auf einen Glucosesensor gegeben. Als ein typisches Beispiel gibt es einen Glucosesensor, der durch Ausbildung eines Elektrodensystems, das wenigstens eine Messelektrode und eine Gegenelektrode auf einer isolierenden Grundplatte enthält, durch ein Verfahren, wie etwa Siebdruck, erhalten wird und dann Ausbilden einer Enzymreaktionsschicht einschließlich eines hydrophilen Polymers, einer Oxidoreduktase und einem Elektronenvermittler auf dem Elektronensystem. Als Oxidoreduktase wird Glucoseoxidase verwendet; als der Elektronenvermittler wird ein Metallkomplex, eine organische Verbindung oder Ähnliches verwendet, wie etwa Kaliumferricyanid, Ferrocenderivate oder Chinonderivate. Ein Puffer wird Wie erforderlich zu der Enzymreaktionsschicht hinzugegeben.
Wenn eine Probenlösung, die ein Substrat enthält, tropfenweise auf die Enzymreaktionsschicht in diesem Biosensor gegeben wird, löst sich die Enzymreaktionsschicht, um eine Reaktion des Enzyms mit dem Substrat zu verursachen, was die Reduktion des Elektronenvermittlers begleitet. Nach Abschluss der Enzymreaktion kann die Substratkonzentration in der Probenlösung aus einem Wert eines Oxidationsstroms bestimmt werden, welcher erhalten wird, wenn der reduzierte Elektronenvermittler elektrochemisch oxidiert wird.
Bei dieser Art von Glucosesensor wird ein Reduktant des Elektronenvermittlers, der als ein Ergebnis der Enzymreaktion gebildet wird, an der Elektrode oxidiert, und die Glucosekonzentration wird aus dem Oxidationsstromwert bestimmt.
Ein derartiger Biosensor ist theoretisch in der Lage, verschiedene Substanzen durch Verwendung eines Enzyms zu messen, dessen Substrat ein zu messendes Objekt ist. Wenn zum Beispiel Cholesterinoxidase oder Cholesterindehydrogenase als Oxidoreduktase verwendet wird, ist es möglich, einen Cholesterinwert in einem Serum zu messen, der als ein diagnostischer Indikator bei verschiedenen medizinischen Einrichtungen zu verwenden ist.
Da die Enzymreaktion der Cholesterinesterase sehr langsam voran schreitet, kann mit einer dazu gegebenen, geeigneten oberflächenaktiven Substanz die Aktivität der Cholesterinesterase verbessert werden, um die für die Gesamtreaktion erforderliche Zeit zu verringern.
Jedoch hat die oberflächenaktive Substanz, die in dem Reaktionssystem enthalten ist, eine nachteilige Wirkung auf Hämozyten, die es unmöglich macht, das Gesamtblut selbst zu messen, wie es beim Glucosesensor erfolgt.
Daselbst wurde ein Vorschlag gemacht, einen Filter (Hämozyten filtrierender Teil) in der Nähe eines Einlasses eines Probenlösungszufuhrweges für die rasche Zufuhr nur von Plasma mit darin filtrierten Hämozyten in einen Sensor vorzusehen. Die 9 zeigt eine schematische Schnittansicht einer Filtervorrichtung für die Verwendung bei der Erklärung eines Mechanismus der Auftrennung von Blut.
Es gibt drei Arten von Verfahren für die Auftrennung von Blut, wie folgt:
• Laterales Auftrennungsverfahren:
Wie in (a) in der 9 gezeigt, wird Blut auf das Seitenende des Probenlösungszufuhrteilseitenteilbereichs eines Filters "a" getropft, welches in der Lateralrichtung filtriert wird, um Plasma von dem Ende des Luftöffnungsseitenteilbereichs des Probenlösungszufuhrweges des Filters "a" abzusondern.
• Vertikales Auftrennungsverfahren:
Wie in (b) in der 9 gezeigt, wird Blut direkt auf die obere Oberfläche eines Filters "b" getropft, welches in der vertikalen Richtung von dem Ende des Bodens oder in der Nähe davon des Filters "b" filtriert wird, um Plasma abzusondern.
• Kombinationsauftrennungsverfahren:
Wie in (c) in der 9 gezeigt, wird Blut direkt auf die obere Oberfläche eines Probenlösungszufuhrwegseitenteilbereichs eines Filters "c" getropft, welches in der vertikalen Richtung als auch in der lateralen Richtung filtriert wird, um von dem Ende des Luftöffnungsseitenteilbereichs des Probenlösungszufuhrweges des Filters "c" abgesondert zu werden.
Die herkömmlich allgemein verwendete Art ist die laterale Auftrennung (z. B. japanische Patentanmeldung Nr. 2000-399056 ) oder die Kombinationsauftrennung (z. B. japanische Patentanmeldung Nr. 2001-152868 ).
Wenn der Filter unsachgemäß in den Sensor eingebaut wird, werden die in dem Filter eingeschlossenen Hämozyten zerstört und Hämoglobin tritt aus. Da die Hämozyten zerstört werden und kleine Komponenten von etwa der Größe des Hämoglobins werden, wird es schwierig, derartige kleine Bestandteile mit dem Filter zu filtrieren. Folglich fließt das Hämoglobin in den Probenlösungszufuhrweg, was einen Messfehler verursachen kann.
Dies wird vermutlich durch die Tatsache verursacht, dass ein Unterschied in der Dicke zwischen dem Filter vor der Absorption einer Probenlösung und dem expandierten Filter nach Absorption der Probenlösung nicht in eine Lücke zwischen Druckteilen für das Halten des Filters von oben und von unten eingepasst ist. Wenn die Lücke zwischen den Druckteilen für das Halten des Filters von oben und von unten zu schmal für die Dicke des expandierten Filters ist, wird der Filter daran gehindert zu expandieren. Die Porengröße des auf diese Weise am Expandieren gehinderten Filters kann sich nicht ausreichend aufweiten, wobei die darin infiltrierten Hämozyten zerstört werden.
Im Gegensatz dazu, wenn die Lücke zwischen den oberen und den unteren Druckteilen vorher auf eine Breite für die angenommene Dicke des expandierten Filters eingestellt wird, kann der Filter während der Erhaltung gleiten, weil die Hämatokritwerte (Verhältnisse des Volumens der roten Zellen) unterschiedlich in Abhängigkeit von den Probenlösungen sind, was zu unterschiedlichen Expansionsgraden des Filters führt.
Um dieses Problem zu lösen wurde erwogen, dass in dem Kombinationsauftrennungsverfahren das Pressteil für das Halten der Filteroberfläche in Kontakt mit einem Teilbereich entweder des oberen oder des unteren Teils des Filters gebracht wird (z. B. japanische Patentanmeldung Nr. 2001-152868 ).
Mit diesem Aufbau, selbst wenn der Abstand zwischen dem oberen Druckteil und dem unteren Druckteil für das Halten des Filters nicht in die Dicke des bei Absorption der Probenlösung expandierten Filters eingepasst ist, ist es möglich, zu vermeiden, dass die Expansion des Filters gehemmt wird, und ferner einen Messfehler, der durch die Hämozytenzerstörung aufgrund der Hemmung der Expansion verursacht wird, zu verhindern.
Das heißt, da die Pressteile für das Halten des Filters den Filter nicht von oben und von unten halten, kann der Filter in den Raumteilbereich und dem Probenlösungszufuhrpfadteilbereich, ausgenommen das Druckteil, expandieren, so dass die Porengröße des Filters frei geändert werden kann und keine Hämozytenzerstörung auftreten wird.
Während sie als Methoden für die Reduktion einer Menge einer Probenlösung effektiv sind, haben diese Verfahren ein Problem, dass die Struktur eines auf diese Weise erhaltenen Biosensors komplex wird. In dem Fall der Verwendung eines flachen Filters in Dreieckform in einer vertikal schraffierten Ansicht, war es zum Beispiel hinsichtlich der Produktion sehr schwierig, den Scheitelpunktteilbereich des Kopfes davon in den Einlass (Breite 0,8 mm) des Probenlösungszufuhrwegs selbst nur für etwa 1 mm einzubringen.
Es gab ebenfalls ein Problem in dem lateralen Auftrennungsverfahren als auch dem Kombinationsauftrennungsverfahren, dass die Fließgeschwindigkeit des Filtrats geringer als die in dem vertikalen Auftrennungsverfahren ist. Obwohl es möglich ist, die Struktur des erhaltenen Biosensors zu vereinfachen, um mit diesem Problem fertig zu werden, war es aufgrund der Notwendigkeit des Transports eines Reagenz in einen Teilbereich gegenüber der Elektrode strukturell unmöglich, das normale vertikale Auftrennungsverfahren einzusetzen, wenn der Biosensor als ein Cholesterinsensor angewendet wird. Dies ist so aufgrund eines strukturellen Problems und eines Problems hinsichtlich der Position des Transports des Reagenz.
Zunächst wurde, wenn das vertikale Auftrennungsverfahren verwendet wird, wie in der japanischen Patentanmeldung Nr. Sho 62-180434 und der japanischen Patentanmeldung Nr. Sho 62-292323 herausgestellt wird, es zum Beispiel erforderlich, die in den 10 bis 12 gezeigten Strukturen einzusetzen.
In dem Biosensor des in der 10 gezeigten Typs werden eine Arbeitselektrode 402 und eine Gegenelektrode 403 auf einer isolierenden Grundplatte 401 vorgesehen, auf welchem eine Oxidoreduktaseschicht 405, ein Raum 406, ein Filter 407 und eine poröse Platte 408 vorgesehen werden. Die Filtration zu diesem Zeitpunkt wird als ein natürliches Filtrierungsverfahren unter Nutzung der Schwerkraft klassifiziert, aber die Fließgeschwindigkeit daselbst ist gering, da Blasen in der Probenlösung gebildet werden, oder die Probenlösung widerstrebt in die poröse Platte 409 zu gelangen. Dies mag in einer Ankunft einer ungenügenden Menge des Filtrats an der Elektrode resultieren, was zu einem Auftreten eines Problems der geringen Messgenauigkeit führt. Zu diesem Zweck wird eine Druckvorrichtung 411 vom Pumpentyp in dem oberen Teil vorgesehen und Druck 414 wird angelegt, um die Probenlösung 412 zu filtrieren.
In dieser Hinsicht wird in dem Sensor, der in der japanischen Patentanmeldung Sho Nr. 62-292323 beschrieben wird, eine induzierende Schicht 507 in dem Sensor für die Führung des Filtrats, das durch einen Filter 508 getreten ist, zu den Elektroden 502', 503' und 504' anstelle der Druckvorrichtung, wie in den 11 und 12 gezeigt, angeordnet. Bei dieser Anordnung wird das Filtrat durch die induzierende Schicht 507 geführt, damit die Elektroden zunächst benetzt werden und dann es sich über die Elektroden mit der Hilfe einer hydrophilen Polymerschicht 512 ausbreitet, was eine hochgenaue Messung ohne Erzeugung von Blasen auf der Arbeitselektrode ermöglicht.
Es sollte bemerkt werden, dass in den 11 und 12 ein Filter 508, ein Halterahmen 509, eine poröse Platte 510 und eine Abdeckung 511 auf dem oberen Teil der induzierenden Schicht 507 vorgesehen werden. Elektroden 502, 503 und 504 werden auf dem oberen Teil der Grundplatte 501 angeordnet und eine isolierende Schicht 505 wird darauf vorgesehen.
Da jedoch eine Druckvorrichtung, eine induzierende Schicht und Ähnliches in jedem Fall erforderlich sind, kann das Problem auftreten, dass der Sensor strukturell komplex ist.
Außerdem wird ein Problem hinsichtlich der Position des Tragens des Reagenz in der japanischen Patentanmeldung Nr. 2000-018834 beschrieben. In dem in dieser Schrift offenbarten Cholesterinsensor wird ungleich einem Blutzuckersensor ein Reagenz mit einer sehr hohen Konzentration getragen,. Wenn ein notwendiges Reagenz in einer Stelle wie in dem Blutzuckersensor getragen wird, kann daher ein Problem auftreten, dass die Dispersion des Reagenz verhindert wird, um in einer geringeren Genauigkeit des Antwortstromwertes zu resultieren. Da ferner eine oberflächenaktive Substanz in dem Reagenz enthalten ist, welche nicht in dem Blutzuckersensor vorhanden ist, und eine negative Wirkung auf die Konservierungsstabilität anderer Reagenzien ausübt, müssen die Reagenzien vor dem Transport entfernt werden. Es war daher unmöglich, eine herkömmliche Struktur einzusetzen, in der das zu tragende Reagenz oberhalb und unterhalb (zu der Elektrode und zu der Deckseite) separiert wird, und dass der Filter auf dem oberen Teil der Elektrode angeordnet wird.
Das Dokument WO 02/10734 A offenbart einen Biosensor mit einer isolierenden Grundplatte; einem auf der Grundplatte vorgesehenen Elektrodensystem, das eine Messelektrode und eine Gegenelektrode hat; einer Reaktionsschicht mit wenigstens einer Oxidoreduktase und einem Elektronenvermittler; einem Probenlösungszufuhrweg einschließlich dem Elektrodensystem und der Reaktionsschicht; und einer Probenzufuhreinheit, wobei der Sensor so strukturiert ist, dass, zwischen der Probenzufuhreinheit und dem Probenlösungszufuhrweg, ein Filter vorgesehen wird, der eine Funktion hat, die Hämozyten herauszufiltrieren und der eine Querschnittsfläche hat, die größer als die Öffnung des Probenlösungszufuhrwegs ist, und das Plasma eines Bluts mit daraus herausfiltrierten Hämozyten in das Innere des Probenlösungszufuhrwegs aufgrund des Kapillarphänomens hereingesaugt wird (vergleiche Zusammenfassung). Überdies wird ein Luftloch 22 offenbart (vergleiche [0022]), ebenfalls wird ein Öffnungsteilbereich 18 vorgesehen.
Das Dokument WO 02/095385 A beschreibt einen Cholesterinsensor mit hoher Genauigkeit und hervorragendem Ansprechen, dessen zu messender Gegenstand Vollblut ist, in dem Plasma mit darin filtrierten Hämozyten schnell ein Elektrodensystem erreichen kann. In einem Biosensor, in dem Plasma mit darin mit einem Filter filtrierten Hämozyten in einen Probenlösungszufuhrweg aufgrund der Kapillarität hineingezogen wird werden ausgebildet: ein erstes Pressteil für das Halten eines primären Seitenteilbereichs des Filters vom Boden; ein zweites Druckteil für das Halten eines sekundären Seitenteilbereichs des Filters von oben und vom Boden; ein drittes Druckteil für das Halten des zentralen Teilbereichs des Filters von oben; und eine Aussparung für das Einbetten des Filters zwischen das zweite Pressteil und das dritte Pressteil.
Demgemäß ist eine erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung einen Biosensor zur Verfügung zu stellen, der derartig verbessert ist, dass, wenn das vertikale Auftrennungsverfahren eingesetzt wird, der vorher erwähnte Nachteil vermieden wird, und Plasma, das durch Abtrennung von Hämozyten durch Filtration von Blut erhalten wird, schnell das Elektrodensystem erreicht.
Sekundär können in jedem Filtrierungsverfahren des lateralen Auftrennungsverfahrens (z. B. japanische Patentanmeldung Nr. 2000-296131 , japanische Patentanmeldung Nr. 2000-399056 und japanische Patentanmeldung Nr. 2001-152868 ), des vertikalen Auftrennungsverfahren (z. B. japanische Patentanmeldung Nr. 2001-180362 ) und des Kombinationsauftrennungsverfahren Fälle sein, wo Hämozyten, die in dem Filter gefangen sind zerstört werden und Hämoglobin austritt, wenn ein Filter nicht geeignet ist. Es ist schwierig, kleine Hämozytenbestandteile von etwa der Größe des Hämoglobins zu filtrieren und Hämoglobin fließt in den Probenlösungszufuhrweg, was einen Messfehler verursacht.
Es gab insbesondere ein Problem, speziell in dem Fall des lateralen Auftrennungsverfahrens, dass die Sensorstruktur komplex wird, und es gab ein allgemeines Problem des häufigen Auftretens eines Messfehlers aufgrund der Mischung der Hämozyten. Dies ist so, weil ein Reservierungsverhältnis eines herkömmlichen Glasfaserfilterpapiers (Tiefenfilter) 98% aufgrund seiner Eigenschaften ist, und folglich fließen 2% davon aus. Es gab weiterhin ein Problem, selbst bei einem reduzierten Sensorvolumen, dass Vollblut in einem Filter aufgebaut durch dickes Glasfaserfilterpapier (z. B. Dicke von 200 bis 800 μm) absorbiert wird, wodurch die Reduktion der Probenmenge limitiert ist.
Es ist daher eine zweite Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die vorher erwähnten Nachteile zu überwinden und einen Biosensor zur Verfügung zu stellen, der derartig verbessert ist, dass filtriertes Plasma zu dem Probenlösungszufuhrweg aufgrund der Kapillarwirkung ohne Druck bewegt wird, und das Filtrat an der Luftöffnung anhält, während keine Hämozyten gemischt werden. Ferner ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung einen Biosensor zu erhalten, in dem, speziell im Fall der Messung auf der Grundlage einer Sammlung von Blut durch Punktieren einer Fingerspitze, das Vollblut auf der Fingerspitze wirkungsvoll mit Leichtigkeit gegen den Sensor abreibbar ist, und Plasma,, als ein zu messender Gegenstand, rasch zu dem Elektrodensystem geführt werden kann.
Drittens werden die konventionellen Beispiele hinsichtlich der Auftrennung von Blut durch die Verwendung von zwei oder mehreren Typen von Filtern z. B. im US-Patent Nr. 5,240,862 (Anmelder: X-Flor B. V. und Primecare B. V.), der WO-Veröffentlichung Nr. 96/15453 (Anmelder: Spectral Diagnostic Inc.) und Ähnlichen beschrieben. Es ist hier kennzeichnend, dass eine Probenlösung sukzessive aus einem Filter mit einer größeren Porengröße zu einem Filter mit einer kleineren Porengröße geführt wird. Mit anderen Worten ist es kennzeichnend, dass eine Probenlösung sukzessive von einem Filter mit einer größeren Porengröße zu einem Filter mit einer kleineren Größe geführt wird, wenn sie von dem Einlass zum Auslass fließt.
Bei der Technik unter Verwendung von zwei oder mehreren Typen von Filtern, wie sie auf diese Weise beschrieben wird, gab es jedoch in dem Fall der Anordnung eines Filters mit einer 100%-igen Einschlussrate, welcher keine Hämozyten durchlassen wird, auf der untersten Schicht ein Problem, dass eine geringe Menge eines Filtrats, das von den Luftöffnungsseitenteil des Probenlösungszufuhrwegs erhalten wurde, zu dem hohlen Probenlösungszufuhrweg durch natürliches Tropfen, wie etwa Schwerkraft, ohne Ausübung von Druck nicht bewegt werden kann. Es gab nämlich ein Problem, dass das Filtrat nicht in den Probenlösungszufuhrweg aufgrund der Kapillarwirkung eingebracht werden konnte.
Es ist daher eine dritte Aufgabe der vorliegenden Erfindung die vorher erwähnten Nachteile zu überwinden und einen Biosensor zur Verfügung zu stellen, der derartig verbessert ist, dass ein Filter mit einer derartig kleinen Größe, dass er gar keine Hämozyten durch sich durchlässt, als ein erster Filter verwendet wird, ein erhaltenes Filtrat zu dem Probenlösungszufuhrweg aufgrund der Kapillarwirkung ohne Anwenden von Druck bewegt wird, und das Filtrat an der Luftöffnung stoppt. Spezieller ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Glucosesensor und einen Cholesterinsensor zur Verfügung zu stellen, welche eine hohe Genauigkeit und eine hervorragende Ansprechfähigkeit haben, und deren gemessener Gegenstand Vollblut ist.
Offenbarung der Erfindung
Um die vorher erwähnten Aufgaben zu lösen, stellt die vorliegende Erfindung einen Biosensor zur Verfügung, der umfasst:
eine isolierende Grundplatte; ein Elektrodensystem mit einer Arbeitselektrode und einer Gegenelektrode, welche auf der Grundplatte vorgesehen sind; eine Reaktionsschicht einschließlich wenigstens einer Oxidoreduktase und einem Elektronenvermittler; einen Probenlösungszufuhrweg, welcher das Elektrodensystem und die Reaktionsschicht enthält und einen Einlass und eine Luftöffnung hat; einen Probenlösungszufuhrteil für das Einbringen einer Probenlösung, welches in einer Position abseits von dem Probenlösungszufuhrweg ist; und einem ersten Filter, welcher zwischen dem Probenlösungszufuhrweg und dem Probenlösungszufuhrteil zum Filtrieren der Probenlösung angeordnet ist, wo ein mit dem ersten Filter filtriertes Filtrat in den Probenlösungszufuhrweg aufgrund der Kapillarwirkung zugeführt wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Richtung, in welcher die Probenlösung durch den ersten Filter tritt und die Richtung, in welcher das Filtrat durch den Probenlösungszufuhrweg tritt, sich im rechten Winkel überschneiden, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Filter nicht in den Probenlösungszufuhrweg hineinragt bzw. eindringt.
Es ist bevorzugt, dass der erste Filter entweder aus einer Glasfaser oder einer Zellulosefaser aufgebaut ist.
Es ist ebenfalls bevorzugt, dass der erste Filter nicht in Kontakt mit dem Elektrodensystem ist.
Es ist ebenfalls bevorzugt, dass wenigstens ein Teil des ersten Filters in Kontakt mit der isolierenden Grundplatte ist.
Es ist bevorzugt, dass der erste Filter mit einem Polyvinylalkohol, Ethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Carboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Gelatine, Agarose, Polyacrylsäure und den Salzen davon, Stärke und den Derivaten davon, Polymeren von Maleinsäureanhydrid und den Salzen davon, Polyacrylamid, Methacrylatharz, oder Poly-2-hydroxyethylmethacrylat beschichtet ist.
Es ist bevorzugt, dass die Reaktionsschicht ein Reagenziensystem für den Nachweis des Gesamtcholesterins enthält.
Es ist hier wirkungsvoll, dass der erste Filter zylindrisch ist. Es ist zu diesem Zeitpunkt wirkungsvoll, dass die kreisförmige Endfläche des ersten Filters einen Durchmesser von nicht mehr als 5 mm hat.
Es ist ebenfalls wirkungsvoll, dass ein Einlass in dem oberen Teil des ersten Filters zum Tropfen der Probenlösung vorgesehen wird.
Es ist ebenfalls wirkungsvoll, dass eine Öffnung in Richtung des ersten Filters in dem Boden des Probenlösungszufuhrwegs vorgesehen wird. Es ist außerdem wirkungsvoll, dass die Größe des Einlasses des Probenlösungszufuhrwegs kleiner als die Größe des ersten Filters ist. Es ist wirkungsvoll, dass auf der Oberfläche des ersten Filters ein Teil angeordnet ist, welcher nicht mit anderen Bestandteilen des Biosensors in Kontakt ist.
Es ist in dem erfindungsgemäßen Biosensor bevorzugt, dass der erste Filter durch einen Filter mit einer gleichmäßigen Porengröße in der Form einer Membran aufgebaut ist.
Es ist ebenfalls bevorzugt, dass eine hydrophile Schicht zwischen dem ersten Filter und der Grundplatte vorgesehen ist.
Es ist ebenfalls bevorzugt, dass ein zweiter Filter zwischen dem ersten Filter und dem Probenlösungszufuhrweg vorgesehen ist.
Es ist ebenfalls bevorzugt, dass die mittlere Porengröße des ersten Filters kleiner als die mittlere Porengröße des zweiten Filters ist.
Es ist bevorzugt, dass der zweite Filter ein Tiefenfilter ist.
Der erste Filter kann in Kontakt mit dem zweiten Filter sein.
Außerdem kann der zweite Filter in Kontakt mit dem Einlass des Probenlösungszufuhrwegs sein. Es ist bevorzugt, dass der zweite Filter nicht in Kontakt mit dem Elektrodensystem ist.
Es ist ebenfalls bevorzugt, dass der erste Filter und/oder der zweite Filter ein Reagenz für das unterdrücken einer Reaktion zwischen der Oxidoreduktase und dem Cholesterin enthält, dass in einem Lipoprotein mit hoher Dichte, Lipoprotein mit geringer Dichte und Lipoprotein mit sehr geringer Dichte in der Probenlösung enthalten ist.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1 ist eine auseinander gezogene, perspektivische Ansicht eines Biosensors gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
Die 2 ist eine kombinierte perspektivische Ansicht des Biosensors in der 1.
Die 3 ist eine Schnittansicht des Hauptteils, genommen entlang der Linie X-X der 2, wobei eine Reaktionsschicht und Ähnliches weggelassen werden.
Die 4 ist eine Schnittansicht des Hauptteils, genommen entlang der Linie X-X der 2, wobei speziell die Reaktionsschicht gezeigt wird.
Die 5 ist eine auseinander gezogene, perspektivische Ansicht eines Biosensors in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der Erfindung.
Die 6 ist eine kombinierte perspektivische Ansicht des Biosensors in der 5.
Die 7 ist eine Schnittansicht des Hauptteils, genommen entlang der Linie Y-Y der 6, wobei eine Reaktionsschicht und Ähnliches weggelassen werden.
Die 8 ist eine Schnittansicht des Hauptteils, genommen entlang der Linie Y-Y der 6, wobei die Reaktionsschicht spezifisch gezeigt wird.
Die 9 ist eine schematische Schnittansicht einer Filtervorrichtung für die Erläuterung des Mechanismus der Blutauftrennung.
Die 10 ist eine vertikale Schnittansicht eines herkömmlichen Biosensors.
Die 11 ist eine auseinander gezogene, perspektivische Ansicht eines anderen, herkömmlichen Biosensors.
Die 12 ist eine vertikale Schnittansicht des in der 11 gezeigten Biosensors.
Die 13 ist eine Schnittansicht des Hauptteils, die spezifisch einen ersten Filterteilbereich eines Biosensors in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt.
Die 14 ist eine Schnittansicht des Hauptteils, die spezifisch einen ersten Filterteilbereich eines Biosensors in Übereinstimmung mit einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt.
Die 15 ist eine Schnittansicht des Hauptteils, die spezifisch einen ersten Filterteilbereich eines Biosensors in Übereinstimmung mit noch einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt.
Die 16 ist eine grafische Darstellung, die eine Antworteigenschaft eines Biosensors in Beispiel 1 zeigt.
Die 17 ist eine grafische Darstellung, die eine Antworteigenschaft eines Biosensors in Beispiel 2 zeigt.
Die 18 ist eine auseinander gezogene, perspektivische Ansicht eines Biosensors in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
Die 19 ist eine kombinierte perspektivische Ansicht des Biosensors in der 18.
Die 20 ist eine vertikale Schnittansicht des Biosensors, genommen entlang der Linie X'-X' gezeigt in der 19, wobei eine Reaktionsschicht und Ähnliches weggelassen werden.
Die 21 ist eine vertikale Schnittansicht des Biosensors genommen entlang der Linie X'-X' gezeigt in der 19, wobei speziell die Reaktionsschicht gezeigt wird.
Die 22 ist eine grafische Darstellung, die die Beziehung zwischen der Gesamtcholesterinkonzentration in der Probenlösung und dem Stromantwortwert in Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung zeigt.
Die 23 ist eine grafische Darstellung, die die Beziehung zwischen der Glucosekonzentration in der Probenlösung und dem Stromantwortwert in Beispiel 2 der vorliegenden Erfindung zeigt.
Die 24 ist eine auseinander gezogene, perspektivische Ansicht eines Biosensors in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
Die 25 ist eine kombinierte perspektivische Ansicht des Biosensors in der 24.
Die 26 ist eine vertikale Schnittansicht des Biosensors, genommen entlang der Linie X''-X'' gezeigt in der 25, wobei eine Reaktionsschicht, ein Elektrodensystem und Ähnliches weggelassen werden.
Die 27 ist eine vertikale Schnittansicht des Biosensors, genommen entlang der Linie X''-X'' gezeigt in der 25, wobei speziell die Reaktionsschicht, das Elektrodensystem und Ähnliches gezeigt werden.
Die 28 ist eine grafische Darstellung, die die Antworteigenschaft des Biosensors mit Bezug auf das Gesamtcholesterin in Beispiel 5 der vorliegenden Erfindung zeigt.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Biosensor mit:
einer isolierenden Grundplatte; einem Elektrodensystem mit einer Arbeitselektrode und einer Gegenelektrode, welche auf der Grundplatte vorgesehen sind; einer Reaktionsschicht einschließlich wenigstens einer Oxidoreduktase und einem Elektronenvermittler; einem Probenlösungszufuhrweg, welcher das Elektrodensystem und die Reaktionsschicht enthält und einen Einlass und eine Luftöffnung hat; einem Probenlösungszufuhrteil für das Einbringen einer Probenlösung, welches in einer Position abseits von dem Probenlösungszufuhrweg ist; und einem ersten Filter, welcher zwischen dem Probenlösungszufuhrweg und dem Probenlösungszufuhrteil zum Filtrieren der Probenlösung angeordnet ist, wo ein mit dem ersten Filter filtriertes Filtrat in den Probenlösungszufuhrweg aufgrund der Kapillarwirkung zugeführt wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Richtung, in welcher die Probenlösung durch den ersten Filter tritt und die Richtung, in welcher das Filtrat durch den Probenlösungszufuhrweg tritt, sich im rechten Winkel überschneiden, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Filter nicht in den Probenlösungszufuhrweg eindringt.
Der erhaltene Biosensor kann in Bezug auf seine Struktur durch Umfassen dieser technischen Gegenstände vereinfacht werden. Es ist weiterhin möglich, in diesem Biosensor Nachteile durch Einsetzen des vertikalen Auftrennungsverfahrens zu vermeiden und Plasma herzustellen, das durch Abtrennung von Hämozyten mittels der Filtration von Blut erhalten wird, das schnell an dem Elektrodensystem ankommt.
Es ist ebenfalls möglich, dass das filtrierte Plasma zu dem Probenlösungszufuhrweg der Kapillarwirkung ohne Druck bewegt wird, und das Filtrat an der Luftöffnung ankommt, während keine Hämozyten gemischt werden. Spezieller ist es möglich, den Biosensor in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung bei einem Glucosesensor, einem Cholesterinsensor und Ähnlichem anzuwenden, welche eine hohe Genauigkeit und eine hervorragende Antwortfähigkeit haben, und deren zu messender Gegenstand Vollblut ist.
Der Elektronenvermittler für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann aus Kaliumferricyanid einer Redoxverbindung mit Elektronentransfereigenschaft zu und von Oxidoreduktase, wie etwa Cholesterinoxidase, ausgewählt werden.
Die Oxidoreduktase ist ein Enzym, dessen Substrat ein zu messender Gegenstand ist, und Glucoseoxidase wird bei einem Sensor eingesetzt, in dem Glucose der zu messende Gegenstand ist. Für die Messung eines Cholesterinwertes in einem Serum, der als ein diagnostischer Indikator zu verwenden ist, werden Cholesterinoxidase oder Cholesterindehydrogenase, welches ein Enzym für die Katalyse einer Oxidationsreaktion von Cholesterin ist, und Cholesterinesterase, welches ein Enzym für die Katalyse des Vorgangs der Änderung von Cholesterinester zu Cholesterin ist, verwendet. Weil die Enzymreaktion der Cholesterinesterase sehr langsam voranschreitet, kann durch die Zugabe eines geeigneten oberflächenaktiven Stoffs die Aktivität der Cholesterinesterase verbessert werden, um die für die Gesamtreaktion erforderliche Zeit zu verringern.
Die Reaktionsschicht, die Reagenzien wie etwa den Elektronenvermittler und den Oxidoreduktase enthält, werden auf oder in der Nähe des Elektrodensystems in dem Sensor angeordnet. In einem Sensor, welcher ein Deckelement umfasst, das mit der Grundplatte mit dem darauf angeordneten Elektrodensystem für die Ausbildung des Probenlösungszufuhrwegs für die Zufuhr der Probenlösung zu dem Elektrodensystem zwischen der Grundplatte und dem Sensor zu kombinieren ist, kann die Reaktionsschicht in dem zu dem Probenlösungszufuhrweg hin offenen Teilbereich, dem Einlass des Probenlösungszufuhrwegs, oder ähnliches, vorgesehen werden. Die Reaktionsschicht kann nämlich entweder auf der isolierenden Grundplatte oder dem Deckelement vorgesehen werden, solange sie innerhalb des Probenlösungszufuhrwegs ist. Wo immer der Ort ist, ist es bevorzugt, dass die eingebrachte Probenlösung die Reaktionsschicht mit Leichtigkeit lösen kann und an dem Elektrodensystem ankommt. Es ist ebenfalls bevorzugt, die hydrophile Polymerschicht in Kontakt mit der oberen Fläche des Elektrodensystems auszubilden, um die Elektrode zu schützen und zu vermeiden, dass die Reaktionsschicht sich ablöst. Neben dem Elektrodensystem ist es bevorzugt, dass die hydrophile Polymerschicht ausgebildet wird als die Grundlage der Reaktionsschicht wie ausgebildet, oder dass das hydrophile Polymer in der niedrigsten Schicht enthalten ist, wenn die Reaktionsschicht durch mehrere Schichten aufgebaut wird.
Es ist bevorzugt, dass die Reaktionsschicht, die den Elektronenvermittler enthält, von dem oberflächenaktiven Stoff für die Erhöhung der Löslichkeit separiert ist. Es ist für den Zweck der Konservierungsstabilität ebenfalls bevorzugt, dass sie von dem Enzym Cholesterinoxidase und Cholesterinesterase separiert ist, welche die Oxidationsreaktion von Cholesterin katalysieren.
Hinsichtlich eines Biosensors für die Messung eines Blutzuckerspiegels gibt es ein Beispiel, wo eine Schicht einschließlich eines Lipids ausgebildet wird, um eine auf dem Elektrodensystem ausgebildete Schicht oder Ähnliches zu überdecken, um das Einführen der Probenlösung zu der Reaktionsschicht zu vereinfachen (z. B. japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. Hei 2-062952 ). In dem erfindungsgemäßen Biosensor für die Messung von Cholesterin ist es bevorzugt, einen Teil der Reaktionsschicht durch Gefriertrocknen auszubilden (z. B. japanische Patentanmeldung Nr. 2000-018834 ) oder die Oberfläche eines Deckelements so zu bearbeiten, dass sie hydrophil wird, mittels eines oberflächenaktiven Stoffs, Plasmastrahlung oder Ähnliches. Die Anwendung einer derartigen Konfiguration kann die Notwendigkeit für eine Lipidschicht eliminieren.
Beispiele des hydrophilen Polymers können zusätzlich zu wasserlöslichen Cellulosederivaten, wie etwa Ethylcellulose, Hydroxypropylcellulose und Carboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Gelatine, Agarose, Polyacrylsäure und die Salze davon, Stärke und die Derivate davon, Polymere von Maleinsäureanhydrid oder Salze davon, Polyacrylamid, Methacrylatharz und Poly-2-Hydroxymethylmethacrylat enthalten.
Die Beispiele des oberflächenaktiven Stoffs können n-Octyl-β-D-Thioglucosid, Polyethylenglykolmonododecylether, Natriumcholat, Dodecyl-β-Maltosid, Saccharosemonolaurat, Natriumdeoxycholat, Natriumtaurodeoxycholat, N,N-bis(3-D-Gluconamidpropyl)deoxycholamid und Polyoxyethylen(10)octylphenylether enthalten. Eines von ihnen kann als der oberflächenaktive Stoff in einem Bereich verwendet werden, in dem die Wirkung der vorliegenden Erfindung nicht abgeschwächt wird.
Wenn das Lipid verwendet wird, wird bevorzugt z. B. ein amphipatisches Phospholipid, wie etwa Lecithin, Phosphortidylcholin oder Phosphortidylethanolamin verwendet.
Als das Messverfahren für den Oxidationsstrom sind ein Zweielektrodensystem, bestehend nur aus einer Messelektrode und einer Gegenelektrode, und ein Dreielektrodensystem, ferner mit einer Referenzelektrode, anwendbar. Das Zweielektrodensystem ist vorteilhafter in Bezug auf die Kosten als auch die Vereinfachung der Sensorstruktur, während das Dreielektrodensystem vorteilhafter ist, wenn eine genauere Messung erforderlich ist.
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung ausführlich unter Verwendung konkreter Ausführungsformen beschrieben.
Ausführungsform 1
Ein Biosensor in Übereinstimmung mit Ausführungsform 1 der vorliegenden Erfindung umfasst: Eine isolierende Grundplatte; ein Elektrodensystem mit einer Arbeitselektrode und einer Gegenelektrode, welche auf der Grundplatte vorgesehen sind; einer Reaktionsschicht einschließlich einer Oxidoreduktase und einem Elektronenvermittler; einem Probenlösungszufuhrweg, welcher das Elektrodensystem und die Reaktionsschicht enthält und eine Luftöffnung an der Endseite hat; einen Probenlösungszufuhrweg für das Einbringen einer Probenlösung, und einen ersten Filter, welcher zwischen dem Probenlösungszufuhrweg und dem Probenlösungszufuhrteil für das Filtrieren der Probenlösung angeordnet ist, wo ein Filtrat, das mit dem ersten Filter filtriert wird, in dem Probenlösungszufuhrweg aufgrund der Kapillarwirkung absorbiert wird. Dieser Biosensor wird dadurch gekennzeichnet, dass der erste Filter nicht in den Probenlösungszufuhrweg eindringt, die Richtung, in welcher die Probenlösung durch den ersten Filter tritt ist vertikal, und weiterhin ist die Richtung, in welcher das Plasma von dem Einlass des Probenlösungszufuhrwegs in die Richtung der Luftöffnung davon geführt wird, lateral.
In dem Biosensor gemäß Ausführungsform 1 der vorliegenden Erfindung wird das vertikale Auftrennungsverfahren als das Verfahren für die Abtrennung von Hämozyten eingesetzt, in welchem Blut als die Probenlösung verwendet wird, und Plasma, welches von der Einlassseite des Probenlösungszufuhrwegs des ersten Filters abgesondert wird, fließt durch den Probenlösungszufuhrweg lateral von dem Einlass in Richtung der Luftöffnung an dem Ende davon, während schrittweise das Reagenz gelöst wird. Es ist dadurch möglich, die Sensorstruktur ohne Änderung der Position des Reagenz, separiert und getragen oberhalb und unterhalb in dem Probenlösungszufuhrweg, zu vereinfachen.
Wenn ferner der erste Filter nicht in den Probenlösungszufuhrweg hineinragt, kommt der Filter nicht in Kontakt mit einem in der Reaktionsschicht in dem Probenlösungszufuhrweg enthaltenen Reagenz, und das Reagenz wird folglich schwerlich in den Filter diffundieren. Dies verhindert die Schwankung der Reagenzkonzentration, ermöglicht die Realisierung einer stabilen Sensorgenauigkeit.
Hierin ist die 1 eine auseinander gezogene, perspektivische Ansicht des Biosensors in Übereinstimmung mit der Ausführungsform 1. Wie in der 1 angegeben, hat der erfindungsgemäße Biosensor eine isolierende Grundplatte 1, die aus einem isolierenden Harz, wie etwa Polyethylenterephthalat, hergestellt ist. In der 1 wird auf der linken oberen Fläche der Grundplatte 1 ein Palladiumteilbereich mittels Sputtern, Aufdampfen oder Ähnlichem gefolgt durch Lasertrimmen („laser trimming") ausgebildet, um ein Elektrodensystem einschließlich einer Arbeitselektrode 2 und einer Gegenelektrode 3 auszubilden. Die Fläche der Elektrode wird entsprechend einer Breite eines Schlitzes abgebildet auf einem Abstandshalter 5 bestimmt, wie später beschrieben wird.
In dem mit der Grundplatte 1 zu kombinierenden Abstandshalter 5 sind der Schlitz 8 für die Ausbildung des Probenlösungszufuhrwegs, ein Einlass 7 des Schlitzes 8 und eine Öffnung 6 für die Aufnahme des ersten Filters 4 in dem erhaltenen Biosensor. Außerdem ist in einer ausgebildeten Abdeckung 9 eine Luftöffnung 11 zusätzlich zu einem kommunizierenden Teil 10 für die Aufnahme des ersten Filters 4.
In einer ausgebildeten Filterhalteplatte 12 sind ein Raum 13 und ein herausragendes Filterhalteteil (herausragendes Teil 14) für die direkte Stütze des ersten Filters 4. Außerdem wird eine Öffnung 16, die mit der oberen Oberfläche des ersten Filters 4 kommuniziert, auf einer oberen Abdeckung 15 ausgebildet, die das Probenlösungstropfteil ausbildet. Es ist zu bemerken, dass die Filterhalteplatte 12 mehrere Elemente enthalten kann, wie in dem Beispiel 2 später beschrieben wird.
Beim Einbau der vorher erwähnten Grundplatte 1 werden der Abstandshalter 5, die Abdeckung 9, die Filterhalteplatte 12 und die obere Abdeckung 15, die Öffnung 6, die zu dem Schlitz 8 führt, die in der Abdeckung 9 ausgebildete Öffnung 10, der in der Filterplatte 12 ausgebildete Raum 13 und die in der oberen Abdeckung ausgebildete Öffnung 16 verbunden.
Der erste Filter 4 hat ein Hämozyten filtrierendes Teil aus Glasfaserfilterpapier und hat die Form eines Zylinders mit einer Porengröße von 0,5 bis 5 μm, einen Durchmesser von 2 bis 5 mm und eine Höhe (Dicke) von 200 bis 1.000 μm. Es sollte bemerkt werden, dass die Porengröße des Filters sich auf eine Teilchengröße bezieht, wenn 98% der Anzahl der Teilchen in dem Filter gehalten werden. Wenn Teilchen mit einer Teilchengröße von 5 μm unter Verwendung eines Filters mit einer Porengröße von 5 μm filtriert werden, ist der Anteil der in dem Filter gehaltenen Teilchen 98%.
Für den Zusammenbau dieses Sensors wird eine Reaktionsschicht auf einem vorgeschriebenen Teilbereich der Grundplatte 1, wie im Nachfolgenden beschrieben, ausgebildet. Ferner wird auf der Grundlage der in der 1 gezeigten Positionsbeziehung ein konkaver Teilbereich (Probenlösungszufuhrweg) durch den Schlitz 8 der kombinierten Grundplatte A, die durch Kombination der Abdeckung 9 und des Abstandshalters 5 erhalten wird, eine Reaktionsschicht auf einem vorgeschriebenen Element wie später beschrieben ausgebildet. Ferner wird auf der Grundlage der in der 1 gezeigten Positionsbeziehung eine kombinierte Grundplatte B, die durch Kombination der Filterhalteplatte 12 und der oberen Abdeckung 15 erhalten wird, hergestellt. Nachfolgend werden die Grundplatte 1, die kombinierte Grundplatte A, der erste Filter 4 und die kombinierte Grundplatte B, wie durch die gepunktete Linie und die gestrichelten Linie in der 1 gezeigt, angeordnet.
Eine schematische perspektivische Ansicht des erfindungsgemäßen Biosensors, erhalten gemäß der Konfiguration der 1, wird in der 2 gezeigt. Eine Schnittansicht genommen entlang der Linie X-X der 2 wird außerdem in der 3 gezeigt. Wie in der Schnittansicht in der 3 gezeigt, wird in dem erfindungsgemäßen Biosensor der Raum 13 für das Außerkontaktbringen des ersten Filters 4 mit den anderen Elementen ausgebildet. Für die vollständige Entfernung von Hämozyten als störende Substanzen ist es notwendig, wenigstens eine Stelle zur Verfügung zu stellen, die nicht in Kontakt mit dem Filterhalteteil in dem Bereich der Öffnung 16 zu dem Einlass 7 ist, nämlich den Raum 13, der die Filteroberfläche umgibt, um die Probenlösung sicher durch den Filter zu führen.
Die Reaktionsschicht und das Elektrodensystem sind in der 2 weggelassen, während eine teilweise vergrößerte Schnittansicht entsprechend zu 3, welche die Reaktionsschicht und das Elektrodensystem darstellt, in der 4 gezeigt wird. Auf den Elektroden 2 und 3 der ausgebildeten Grundplatte 1 sind eine hydrophile Polymerschicht 17 und eine Reaktionsschicht 18a. Außerdem wird eine Reaktionsschicht 18b auf der unteren Oberfläche der Abdeckung 9 entsprechend der Decke des Probenlösungszufuhrwegs ausgebildet. Es sollte bemerkt werden, dass die anderen in der 4 gezeigten Elemente äquivalent zu denen in der 3 gezeigten sind.
Die in den 1 bis 4 gezeigte Biosensoren werden unter Verwendung des Filters 4 und von fünf Typen von Elementen (Grundplatten) produziert, um die Strukturen davon leicht verständlich zu machen. Jedoch kann die obere Abdeckung 15 und die Filterhalterplatte 12 durch ein Element ausgebildet werden, oder die Abdeckung 9 kann zusätzlich dazu zugefügt werden, sodass das Ganze als ein Element ausgebildet wird. Außerdem kann die Filterhalteplatte 12 oder das Filterhalteteil 14 in Abhängigkeit von der Dicke des ersten Filters 4 weggelassen werden.
Ausführungsform 2
Die 5 ist eine auseinander gezogene, perspektivische Ansicht eines Biosensors gemäß Ausführungsform 2, die durch weitere Verbesserungen des Biosensors gemäß der vorhergehenden Ausführungsform 1 erhalten wird. Wie in der 5 gezeigt, hat der erfindungsgemäße Biosensor eine isolierende Grundplatte 101, die aus einem isolierenden Harz, wie etwa Polyethylentherephthalat, hergestellt wird. In der 5 wird auf der linken oberen Oberfläche der Grundplatte 101 ein Palladiumteilbereich mittels Sputtern, Bedampfen oder Ähnlichem, gefolgt durch Lasertrimmen ausgebildet, um ein Elektrodensystem einschließlich einer Arbeitselektrode 102 und einer Gegenelektrode 103 zu bilden. Die Fläche der Elektrode wird entsprechend einer Breite eines Schlitzes 108, gebildet auf einem Abstandshalter 105, bestimmt, wie später beschrieben wird.
In dem mit der gebildeten Grundplatte 101 zu kombinierenden Abstandshalter 105 werden der Schlitz 108, für die Bildung des Probenlösungszufuhrwegs in dem nach Zusammenbau erhaltenen Biosensor, ein Einlass 107 des Schlitzes 108 und eine Öffnung 106, welche einen geringeren Durchmesser als der erste Filter 104 hat und den ersten Filter 104 aufnimmt. Ferner sind in der gebildeten Abdeckung 109 eine Luftöffnung 111 und eine Öffnung 110, welche einen geringeren Durchmesser als der erste Filter 104 hat, und den ersten Filter 104 aufnimmt.
Hierin, während die Filterhalteplatte 12 in der obigen Ausführungsform 1 aus einem flachen Körper besteht, umfasst eine Filterhalteplatte 112 in der Ausführungsform 2 Filterhalteplatten 112a, 112b und 112c.
In der gebildeten Filterhalteplatte 112a ist ein Raum 113a mit einem Durchmesser größer als der Durchmesser des ersten Filters 104; in der gebildeten Filterhalteplatte 112b sind ein Raum 113b mit dem gleichen Durchmesser wie der Durchmesser des Raums 113a und ein herausragendes Filterhalteteil 114 (herausragendes Teil) welches direkt den ersten Filter 104 stützt. Die Filterhalteplatte 112c ist von der gleich Form wie die Filterhalteplatte 112a und ein Raum 113c wird darin ausgebildet.
Überdies wird eine Öffnung 116, die mit der oberen Oberfläche des ersten Filters 104 kommuniziert, in einer oberen Abdeckung 115 gebildet, die das Probenlösungstropfteil bildet.
Beim Zusammenbau der vorher erwähnten Grundplatte 101, des Abstandshalters 105, der Abdeckung 109, den Filterhalteplatten 112a, 112b und 112c und der oberen Abdeckung 115, werden die Öffnung 106, die zu dem Schlitz 108 führt, die Öffnung 110, die in der Abdeckung 109 gebildet wird, der in der Filterhalteplatte 112a gebildeten Raum 113a, der in der Filterhalteplatte 112b gebildeten Raum 113b, der in der Filterhalteplatte 112c gebildeten Raum 113c und die in der oberen Abdeckung 115 gebildeten Öffnung 116 verbunden.
Der erste Filter 104 als ein Hämozyten filtrierendes Teil wird aus Glasfaserfilterpapier hergestellt und hat die Form eines Zylinders mit einer Porengröße von 0,5 bis 5 μm, ein Durchmesser von 3 mm und einer Höhe (Dicke) von 500 bis 1.000 μm. Fasern, die das Glasfaserfilterpapier bilden, werden mit Polyvinylalkohol (PVA) beschichtet.
Für den Zusammenbau dieses Sensors wird zunächst die Abdeckung 109 auf dem Abstandshalter 105 auf der Grundlage der in der 5 gezeigten Positionsbeziehung angeordnet, um eine kombinierte Grundplatte C zu erhalten. Wie später beschrieben wird, wird eine Reaktionsschicht in einem konkaven Teilbereich (Probenlösungszufuhrweg), gebildet durch den Schlitz 108, ausgebildet, wenn die Abdeckung 109 mit dem Abstandshalter 105 kombiniert wird. Ferner werden auf der Grundlage der in der 5 gezeigten Positionsbeziehung die Filterhalteplatte 112b und dann die Filterhalteplatte 112c auf der Filterhalteplatte 112a angeordnet, und die obere Abdeckung 115 wird weiterhin darauf angeordnet, um eine kombinierte Grundplatte D zu erhalten.
Die Grundplatte 101 wird mit der kombinierten Grundplatte A auf der Grundlage der in der 5 gezeigten Positionsbeziehung kombiniert, und der erste Filter 104 wird direkt auf den kommunizierenden Öffnungen 106 und 110 angeordnet. Nachfolgend werden die Grundplatte 101, die kombinierte Grundplatte C und die kombinierte Grundplatte D innerhalb einer derartigen Positionsbeziehung kombiniert, dass die rechten Enden dieser Elemente in einer Linie ausgerichtet werden.
Hierin wird eine schematische perspektivische Ansicht eines erfindungsgemäßen Biosensors, der gemäß der Konfiguration der 5 in der 6 erhalten wird, gezeigt. Eine Schnittansicht genommen entlang der Linie Y-Y der 6 wird weiterhin in der 7 gezeigt.
Die Reaktionsschicht und das Elektrodensystem werden in der 7 weggelassen, während eine teilweise vergrößerte Schnittansicht entsprechend zu der 7, welche die Reaktionsschicht und das Elektrodensystem darstellt, in der 8 gezeigt wird. Auf dem Elektrodensystem (102 und 103) der gebildeten Grundplatte 101 werden eine hydrophile Polymerschicht 117 und eine Reaktionsschicht 118a ausgebildet. Außerdem wird eine Reaktionsschicht 118b auf der unteren Oberfläche der Abdeckung 109 ausgebildet, die dem Dach des Probenlösungszufuhrwegs entspricht. Es sollte bemerkt werden, dass die anderen in der 8 gezeigten Elemente äquivalent zu denen in der 7 gezeigten sind.
Die erfindungsgemäßen, in den 5 bis 8 gezeigten Biosensoren werden unter Verwendung des ersten Filters 104 und von sieben Typen von Grundplatten hergestellt, um die Strukturen davon leicht verständlich zu machen. Jedoch kann die Abdeckung 109 und der Abstandshalter 105 aus einem Element bestehen. Ferner können die Filterhalteplatten 112a und 112b oder die Filterhalteplatten 112b und 112c weggelassen werden, in Abhängigkeit von der Dicke des ersten Filters 104. Überdies kann das Filterhalteteil 114 weggelassen werden.
Für die Messung von Cholesterin in Blut unter Verwendung des in den 1 bis 4 oder 5 bis 8 gezeigten Biosensors wird z. B. Blut als die Probenlösung, das von der Fingerspitze durch Punktieren entnommen wird, zu der Öffnung 16 oder 116 der oberen Abdeckung 15 oder 115 geführt. Das zugeführte Blut infiltriert hier von der Probenlösungszufuhrteilseite in den ersten Filter, um darin filtriert zu werden. Plasma oder ein von den Hämozyten unterschiedliches Filtrat wird von der Probenlösungszufuhrwegseite des Filters abgeschieden. Das abgeschiedene Plasma füllt den gesamten Probenlösungszufuhrweg 8' oder 108', der durch den Schlitz 8 oder 108 gebildet wird und sich bis in die Nähe des Elektrodensystems und weiter in der Luftöffnung 11 oder 111 erstreckt, während eine Reaktionsschicht gelöst wird, die auf der Position getragen wird, die das Elektrodensystem und/oder die Rückoberfläche der Abdeckung 9 oder 109 bedeckt. Wenn einmal der gesamte Probenlösungszufuhrweg 8' oder 108' gefüllt ist, stoppt ebenfalls der Fluss der auf den Filter 4 oder 104 getropften Flüssigkeit.
Als der erste Filter 4 oder 104 wird bevorzugt einer mit einer diskontinuierlichen, heterogenen inneren Struktur als auch mit einer ungleichmäßigen Porengrößenverteilung verwendet. Es ist daher bevorzugt, dass die Form des Fließkanals innerhalb des ersten Filters 1 oder 104 ebenfalls unregelmäßig ist. Es sollte beachtet werden, dass die Filtration innerhalb des Filters 4 oder 104 erfolgt. Außerdem werden in der vorhergehenden Ausführungsform 2, die Fasern, die den Filter 104 bilden, mit PVA beschichtet.
Nach einem derartigen, Hämozyten filtrierenden Vorgang tritt eine chemische Reaktion der durch das Plasma gelösten Reaktionsschicht mit einem zu messenden Bestandteil (z. B. Glucose, Gesamtcholesterin, Lipoprotein mit niederer Dichte (LDL)-Cholesterin, usw.) in dem Plasma auf und ein Stromwert in der Elektrodenreaktion wird nach einem Ablauf einer bestimmten Zeitspanne gemessen, um den Bestandteil in dem Plasma zu bestimmen.
Wie auf diese Weise beschrieben, zeigen die 4 und 8 Beispiele der Anordnung der Reaktionsschicht in der Nähe des Elektrodensystems in dem Probenlösungszufuhrweg 8' oder 108'. Auf den Elektrodensystemen von 2 und 3 oder 102 und 103 der ausgebildeten Grundplatte 1 oder 101 sind die hydrophile Polymerschicht 17 oder 117 einschließlich Carboxymethylcellulose (hiernach einfach bezeichnet als "CMC"), oder Ähnliches, als auch die Reaktionsschicht 18a oder 118a einschließlich eines Reaktionsreagenz wie etwa dem Elektronenvermittler. Die Reaktionsschicht 18b oder 118b einschließlich der Oxidoreduktase wird auf der Oberfläche der Abdeckung 9 oder 109 auf der kombinierten Grundplatte A oder C, die durch Kombination der Abdeckung 9 oder 109 mit dem Abstandshalter 5 oder 105 erhalten wird, ausgebildet, die zu dem Probenlösungszufuhrweg 8' oder 108' hin offen ist.
In der vorhergehenden Ausführungsform 1 ist insbesondere die Öffnung 10 in der Filterhalterplatte 12 in einer derartigen Art und Weise gestaltet, dass sie nicht in Kontakt mit dem ersten Filter 4 ist, ausgenommen das Filterhalteteil 14, um die störende Expansion des ersten Filters 4 zu vermeiden. Dies kann die Befürchtungen hinsichtlich der Zerstörung der Hämozyten in der Probenlösung zerstreuen.
In den Biosensoren mit den in den 1 bis 4 gezeigten Strukturen ist es bevorzugt, dass der Probenlösungszufuhrweg eine Breite von nicht mehr als 1,5 mm, eine Höhe von nicht mehr als 150 μm und eine Länge von nicht mehr als 4,5 mm hat.
Das Volumen des erfindungsgemäßen Biosensors ist bevorzugt nicht weniger als 0,05 μl und nicht mehr als 1,0125 μl. Es ist weiterhin bevorzugt, dass das Elektrodensystem durch die Elektroden gebildet wird, die Edelmetall umfassen. Mit der bevorzugten Breite des Probenlösungszufuhrweges von nicht mehr als 1,5 mm wird eine Elektronenfläche einer mittels Siebdruck erhaltenen gedruckten Elektrode mit geringer Genauigkeit bestimmt. Hinsichtlich der Edelmetallelektrode kann jedoch ein Lasertrimmen durch eine 0,1 mm Breite durchgeführt werden, und die Elektrodenfläche kann auf diese Weise mit hoher Genauigkeit bestimmt werden.
Es ist zu beachten, dass insbesondere in dem Biosensor gemäß Ausführungsform 1, wenigstens ein Teil der Probenlösungszufuhrwegeinlassseite des ersten Filters 4 mit der Grundplatte 1, dem Abstandshalter 5 und der Abdeckung 9 in Kontakt sein kann, wie in der 13 gezeigt, z. B. kann die Probenlösungszufuhrwegeinlassseite des ersten Filters 4 kreuzweise geschnitten sein, um ein abgeschrägtes Teil zu ergeben, wie in der 14 gezeigt. Wie auf diese Weise beschrieben, macht es das Vorsehen des geneigten Teils in einer derartigen Form, dass es weiter in Richtung des Einlasses 7 auf der Oberfläche in Kontakt mit der Grundplatte 1 wird, es leichter, das Filtrat in den Probenlösungszufuhrweg 8' einzubringen.
Wie in der 13 gezeigt, ist es bevorzugt, dass in dem ersten Filter die Querschnittsfläche (F1) der Probenlösungszufuhrseite größer als die Querschnittsfläche (S1) des Einlasses 7 des Probenlösungszufuhrweges ist. Dies kann einen Effekt ergeben, dass das Innere des Probenlösungszufuhrwegs 8' in dem Sensor mit dem filtrierten Plasma in einer höheren Geschwindigkeit gesättigt wird.
Wie in der 15 gezeigt, ist es weiterhin bevorzugt, dass in dem ersten Filter die Querschnittsfläche (F1) der Probenlösungszufuhrteilseite größer als die Querschnittsfläche (F2) der Probenlösungszufuhrwegeinlassseite in Kontakt mit der Grundplatte 1 auf der Seite des Probenlösungszufuhrwegeinlass 7 ist. Dies kann einen Effekt erzeugen, dass das Innere des Probenlösungszufuhrweges 8' in dem im Sensor mit dem filtrierten Plasma in einer noch höheren Geschwindigkeit gesättigt wird. Es ist zu bemerken, dass andere Bestandteile als die Grundplatte 1, der erste Filter 4, der Abstandshalter 5 und die Abdeckung 9 in den 13 bis 15 weggelassen sind.
Ausführungsform 3
Ein Biosensor gemäß Ausführungsform 3 der vorliegenden Erfindung umfasst: eine isolierende Grundplatte; ein Elektrodensystem mit einer Messelektrode und einer Gegenelektrode, welche auf der Grundplatte vorgesehen sind; eine Reaktionsschicht einschließlich wenigstens einer Oxidoreduktase und eines Elektronenvermittlers; ein Probenlösungszufuhrweg, welcher die Reaktionsschicht in Kontakt mit der Grundplatte einschließt und eine Luftöffnung an einem Ende hat; ein Probenlösungstropfteil für das Einbringen einer Probenlösung; und einen ersten Filter, welcher zwischen dem Probenlösungszufuhrweg und dem Probenlösungstropfteil angeordnet wird, ohne in den Probenlösungszufuhrweg einzudringen bzw. hineinzuragen; und der die Probenlösung in der vertikalen Richtung filtriert, wo ein Filtrat in den Probenlösungszufuhrweg aufgrund der Kapillarwirkung absorbiert wird und lateral von dem Einlass des Probenlösungszufuhrwegs in Richtung der Luftöffnung davon geführt wird, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Filter durch einen Membranfilter mit einer gleichmäßigen Porengröße verformungsfrei aufgebaut ist, und der untere Teil des ersten Filters nicht mit dem Elektrodensystem in Kontakt ist.
Beispiele der Materialien für den Aufbau des Membranfilters können Polyesterpolycarbonat und Nitrocellulose enthalten. Die Verwendung eines derartigen Membranfilters erlaubt die Vereinfachung einer Struktur eines erhaltenen Biosensors, die Vermeidung eines Messfehlers verursacht durch Vermischen von Hämozyten, und weiterhin, die Verringerung der Probenmenge.
Überdies wird in dem erfindungsgemäßen Biosensor das vertikale Separationsverfahren als das Verfahren für die Auftrennung von Hämozyten eingesetzt. Da der erste Filter durch den Membranfilter mit einer kontinuierlichen, homogenen inneren Struktur, einer gleichmäßigen Porengröße und einem regulären inneren Flusskanal aufgebaut wird, wird nahezu eine 100%-ige Einschlussrate aufgewiesen. Es ist in diesem Fall bevorzugt, dass die Porengröße von 0,1 bis 10 μm und die Dicke von 5 bis 30 μm ist.
Die Verwendung von Glasfaserfilterpapier als der erste Filter erfordert eine große Menge der Probenlösung da die Probenlösung in dem Filter filtriert und in dem Filter selbst in einer beträchtlichen Menge absorbiert wird. Unter Verwendung des Membranfilters auf der anderen Seite wird die Probenlösung durch die Filteroberfläche filtriert und wird daher nicht in dem Filter selbst absorbiert, so dass die Menge der zu verwendenden Probenlösung reduziert werden kann.
Es ist ebenfalls in dem erfindungsgemäßen Biosensor bevorzugt, dass das hydrophile Verarbeitungsteil zwischen dem ersten Filter und der Grundplatte vorgesehen wird.
Wenn Vollblut als die Probenlösung verwendet wird, entwickelt sich Plasma, welches von der Probenlösungszufuhreinlassseite des ersten Filters durch die Filtration abgesondert wird, auf der Grundplatte über diese hydrophile Schicht aufgrund der Kapillarwirkung und bewegt sich weiter vorwärts, wo das Elektrodensystem vorgesehen ist.
Das Plasma dringt dann in den Probenlösungszufuhrweg von dem Einlass des Probenlösungszufuhrweges ein, um den gesamten Probenlösungszufuhrweg bis zu der Luftöffnung zu füllen. Da außerdem der erste Filter nicht in den Probenlösungszufuhrweg hineinragt, wie in der Struktur des in der japanischen Patentanmeldung Nr. 2001-180362 beschriebenen Biosensor, ist der Filter nicht in Kontakt mit dem Elektrodensystem, während er in Kontakt mit der Grundplatte ist. Es ist daher möglich, eine stabile Sensorgenauigkeit ohne Auftreten eines Messfehlers aufgrund des Kontakts zwischen dem Filter und dem Elektrodensystem zu realisieren.
Die 18 ist eine auseinander gezogene, perspektivische Ansicht des Biosensors in Übereinstimmung mit der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Außerdem ist 19 eine kombinierte perspektivische Ansicht des in der 18 gezeigten Biosensors, und die 20 ist eine vertikale Schnittansicht des Biosensors, genommen entlang der Linie X'-X' gezeigt in der 19, wobei die Reaktionsschicht und Ähnliches dabei weggelassen wurden.
Wie in der 18 gezeigt, wird der erfindungsgemäße Biosensor durch eine isolierende Grundplatte 201, einen Abstandshalter 205, eine Abdeckung 209, ein doppelseitiges Band 219, einen ersten Filter 204 und ein Probenlösungstropfteil 222 aufgebaut.
Die isolierende Grundplatte wird aus einem isolierenden Harz, wie etwa Polyethylenterephthalat, hergestellt. Auf der linken oberen Oberfläche der isolierenden Grundplatte 201 wird ein Palladiumteilbereich mittels Sputtern, Bedampfen oder Ähnlichem, gefolgt durch Lasertrimmen, ausgebildet, um ein Elektrodensystem einschließlich einer Arbeitselektrode 202 und einer Gegenelektrode 203 zu bilden.
Überdies wird eine Luftöffnung 211b in der isolierenden Grundplatte 201 gebildet, und die Fläche des Elektrodensystems wird durch eine Breite eines Schlitzes 208 gebildet auf dem Abstandshalter 205 bestimmt, wie später beschrieben. Außerdem wird das rechte Ende 225 der isolierenden Grundplatte 201 in Kontakt mit dem ersten Filter 204 bearbeitet, um hydrophil zu werden, wie nachfolgend beschrieben wird.
In dem mit der gebildeten isolierenden Grundplatte zu kombinierenden Abstandshalter 205 werden der Schlitz 208 für die Ausbildung des Probenlösungszufuhrweges, ein Einlass 207 des Schlitzes 208 und eine Öffnung 206 für die Aufnahme des ersten Filters 204, in dem erhaltenen Biosensor nachdem er zusammen gebaut wurde, ausgebildet.
Außerdem sind in einer gebildeten Abdeckung 209 eine Luftöffnung 211a und eine Öffnung 210 für die Aufnahme des ersten Filters 204 ausgebildet, und wenn die Abdeckung 209 und der Abstandshalter 205 und die isolierende Grundplatte 201 kombiniert werden, kommuniziert die Luftöffnung 211 mit einer Luftöffnung 211b, gebildet in der isolierenden Grundplatte 201 über den Probenlösungszufuhrweg.
Eine Öffnung 220 für die Aufnahme des ersten Filters 204 wird in dem doppelseitigen Band 219, das auf der oberen Oberfläche der Abdeckung 209 angeordnet ist, ausgebildet. Das hier verwendete doppelseitige Band kann eines sein, das das Probenlösungstropfteil 222 an die Abdeckung 209 binden kann, während der erste Filter 204 zwischen dem Band und dem Probenlösungstropfteil 222 gehalten wird. Folglich kann ein flacher Körper mit einer Bindungsschicht auf jeder Fläche davon verwendet werden, der von dem doppelseitigen Band unterschiedlich ist.
Außerdem wird eine Öffnung 223 in dem Probenlösungstropfteil 222 gebildet, die mit dem ersten Filter 204 kommuniziert.
Beim Zusammenbau der vorher erwähnten isolierenden Grundplatte werden ein Abstandshalter 205, eine Abdeckung 209 und doppelseitiges Band 219, die Öffnung 206, die zu dem Schlitz 208 führt, die Öffnung 210, die in der Abdeckung 209 gebildet wird, und die Abdeckung 220, die in dem doppelseitigen Band 219 gebildet wird, miteinander verbunden. Außerdem werden die Luftöffnung 211b, die in der isolierenden Grundplatte 201 gebildet wird, und die Luftöffnung 211a, die in der Abdeckung 209 gebildet wird, wie auf diese Weise beschrieben, miteinander verbunden.
Der erste Filter 204 für die Abtrennung von Hämozyten wird durch den Membranfilter aufgebaut und kann einen derartigen Grad der Porengröße haben, dass die Hämozyten nicht durch ihn durchtreten können (z. B. 5 μm).
Außerdem wird, obwohl der erste Filter 204 in der Form eines Kreises mit einem Durchmesser von 5 mm ist, z. B. vor dem Zusammenbau des erfindungsgemäßen Biosensors, eine Vertiefung 221 gerade vor dem Zusammenbau gebildet, und in einem zusammengebauten Filter wird der erste Filter 204 in einer derartigen Art und Weise angeordnet, dass er in einer im wesentlichen zylindrischen Form mit einer Öffnung in dem oberen Teil davon in einem kreisförmigen Umfangsteil, wie in der 20 gezeigt, ist.
Für den Zusammenbau dieses Biosensors wird gemäß dem Bedarf zunächst eine Reaktionsschicht 218a auf einen vorgeschriebenen Teilbereich der isolierenden Grundplatte 201 gebildet, wie nachfolgend beschrieben. Ferner, wie in der 18 gezeigt, werden die isolierende Grundplatte 201, die Abdeckung 209 und der Abstandshalter 205 derartig kombiniert, dass die rechten Enden dieser Elemente in einer Linie ausgerichtet werden, um eine kombinierte Grundplatte E zu erhalten; wie später beschrieben wird eine Reaktionsschicht 218b auf einem vorgeschriebenen Element in einem Probenlösungszufuhrweg 208' (siehe 20) ausgebildet, welcher ein konkaver Teilbereich gebildet durch den Schlitz 208 ist.
Nachfolgend wird die kombinierte Grundplatte E mit dem doppelseitigen Band 219 kombiniert, so dass die rechten Enden dieser Elemente in einer Linie ausgerichtet werden, um die kombinierte Grundplatte F zu erzeugen, und der erste Filter 204 wird direkt oberhalb und auf den kommunizierenden Öffnungen 206, 210 und 220 angeordnet.
Wenn der erste Filter 204 und das doppelseitige Bandteil 219 miteinander verbunden werden, wird z. B. der zentrale Bereich des ersten Filters 204 leichter unter Verwendung eines zylindrischen Stabs aus Polystyrolschaum oder Ähnlichem, welcher den Filter nicht zerkratzt, gedrückt, um die Vertiefung 221 zu bilden. Ein Umfangsteil 221' (siehe 20) der durch Drücken mit dem Stab erzeugten Öffnung wird an das doppelseitige Band 219 gebunden, und der Stab wird herausgenommen, nachdem das gesamte Umfangsteil 221' an das doppelseitige Band 219 gebunden wurde.
Schließlich wird der Probenlösungstropfteil 222 angeordnet. Die Öffnung 223 in dem Probenlösungstropfteil 222 kommuniziert mit der Vertiefung 221 in dem ersten Filter 204.
Wie in der Schnittansicht in der 20 gezeigt, erfordert in dem Fall der Verwendung von Vollblut als die Probenlösung in dem erfindungsgemäßen Biosensor für die vollständige Entfernung von Hämozyten als störende Substanzen, dass die Probenlösung sicher durch den Filter 204 tritt. Ferner erfordert die schnelle Absorption des filtrierten Plasmas und die schnelle Zufuhr davon in den Probenlösungszufuhrweg 208', dass der erste Filter in der Nähe des Einlasses 207 des Probenlösungszufuhrwegs 208' angeordnet wird, ohne in den Probenlösungszufuhrweg einzudringen.
Die Reaktionsschicht und das Elektrodensystem werden in der 19 weggelassen, während eine teilweise vergrößerte Ansicht entsprechend zu 20, welche die Reaktionsschicht und das Elektrodensystem darstellt, in der 21 gezeigt wird. Auf den Elektroden 202 und 203 der gebildeten Grundplatte 201 sind eine hydrophile Polymerschicht 224 und eine Reaktionsschicht 218a. Außerdem wird eine Reaktionsschicht 218b auf der unteren Oberfläche der Abdeckung 209, entsprechend dem Dach des Probenlösungszufuhrwegs, ausgebildet.
Es ist zu bemerken, dass obwohl der in den 18 bis 21 gezeigte Biosensor unter Verwendung von fünf Typen von Elementen hergestellt wird, um die Strukturen davon einfach verständlich zu machen, die kombinierte Grundplatte E, die durch Kombination des Abstandshalters 205 mit der Abdeckung 209 erhalten wird, auch aus einem einzelnen Element bestehen kann.
Als nächstes wird für die Messung eines Substrats (z. B. Cholesterin) im Blut unter Verwendung des in den 18 bis 21 gezeigten Biosensors Blut als die Probenlösung tropfenweise auf die Öffnung 223 des Probenlösungstropfteils 222 gegeben. Von dem aufgetropften Blut wird nur Plasma auf der oberen Oberfläche der Probenlösungszufuhrteilseite des ersten Filters 204 eingeschlossen und nur das Plasma von der Oberfläche der Probenlösungszufuhrwegeinlassseite wird abgesondert. Das abgesonderte Plasma dringt in den Probenlösungszufuhrweg 208' durch die Öffnung 207 ein und füllt den Probenlösungszufuhrweg 208,' während es eine Reaktionsschicht löst, die getragen wird auf der Position, die das Elektrodensystem und/oder die Rückoberfläche der Abdeckung 209 bedeckt.
Spezieller füllt das von dem ersten Filter 204 abgesonderte Plasma den gesamten Probenlösungszufuhrweg 208, der sich in die Nähe der Elektrode erstreckt und ferner zu dem Teilbereich der Luftöffnungen 211b und 211a. Wenn einmal der gesamte Probenlösungszufuhrweg 208' mit der Flüssigkeit gefüllt ist, wird ebenfalls der Fluss der Flüssigkeit in dem Filter 204 beendet.
Nach einem derartigen Hämozytenfiltrierungsvorgang, tritt eine chemische Reaktion der durch das Plasma gelösten Reaktionsschicht mit einem zu messenden Bestandteil (z. B. Cholesterin) in dem Plasma auf, und ein Stromwert in der Elektrodenreaktion wird nach Verstreichen einer bestimmten Zeitspanne gemessen, um den Bestandteil im Plasma zu bestimmen.
Hierin ist die 21 eine vertikale Schnittansicht, die ein Beispiel der Anordnung der Reaktionsschicht in der Nähe des Elektrodensystems in dem Probenlösungszufuhrwegs 208' und dem an der Grenzfläche zwischen dem ersten Filter 204 und der isolierenden Grundplatte 201 vorgesehenen hydrophilen Schicht zeigt.
Auf dem Elektrodensystem in der isolierenden Grundplatte 201 werden eine hydrophile Schicht 224 einschließlich eines hydrophilen Polymers, wie etwa CMC, und die Reaktionsschicht 218a, einschließlich eines Reaktionsreagenz, wie etwa dem Elektronenvermittler, ausgebildet.
Außerdem wird die Reaktionsschicht 218b einschließlich Oxidoreduktase auf der Oberfläche, die zu dem Probenlösungszufuhrweg 208' hin frei ist, der Abdeckung 209 der kombinierten Grundplatte E, die durch die Kombination der isolierenden Grundplatte 201, der Abdeckung 209 und dem Abstandshalter 205 erhalten wird, ausgebildet. Eine hydrophile Schicht 225 einschließlich eines hydrophilen Polymers, wie etwa CMC, wird am rechten Ende der isolierenden Grundplatte 201 ausgebildet, nämlich in dem Teilbereich, wo die isolierende Grundplatte 201 in Kontakt mit dem ersten Filter 204 ist.
Es ist bevorzugt, dass das Elektrodensystem Edelmetallelektroden umfasst. Mit der bevorzugten Breite des Probenlösungszufuhrwegs 208' von nicht mehr als 2 mm, wird eine Elektrodenfläche einer gedruckten Elektrode, die mittels Siebdruck erhalten wird, mit geringer Genauigkeit bestimmt. Wenn Edelmetallelektroden verwendet werden, kann im Gegensatz dazu ein Lasertrimmen durch eine 0,1 mm Breite durchgeführt werden, und die Elektrodenfläche wird folglich mit hoher Genauigkeit bestimmt.
Ausführungsform 4
Ein Biosensor gemäß Ausführungsform 4 der vorliegenden Erfindung umfasst: Eine isolierende Grundplatte; ein Elektrodensystem mit einer Messelektrode und einer Gegenelektrode, welche auf der Grundplatte vorgesehen sind; eine Reaktionsschicht einschließlich wenigstens einer Oxidoreduktase und einem Elektronenvermittler; ein Probenlösungszufuhrweg einschließlich der Grundplatte und der Reaktionsschicht; eine Luftöffnung, die auf der Endseite des Probenlösungszufuhrwegs vorgesehen ist; ein Probenlösungstropfteil für das Einbringen der Probenlösung, einen ersten Filter, welcher zwischen dem Probenlösungszufuhrweg und dem Probenlösungstropfteil vorgesehen ist ohne in den Probenlösungszufuhrweg hineinzuragen und die Probenlösung in der vertikalen Richtung filtriert; und einen zweiten Filter, der auf der Seite stromabwärts des ersten Filters angeordnet ist, in dem ein Filtrat in dem Probenlösungszufuhrweg aufgrund der Kapillarwirkung absorbiert wird und lateral von dem Einlass des Probenlösungszufuhrwegs in die Richtung der Luftöffnung davon tritt, dadurch gekennzeichnet, dass die mittlere Porengröße des ersten Filters kleiner als die mittlere Porengröße des zweiten Filters ist.
Wie auf diese Weise beschrieben hat bei der herkömmlichen Technik unter Verwendung von 2 oder mehreren Typen von Blutzellseparatoren, da ein äußerster Filter für die Vorbehandlung und ein unterster Filter für die Endbehandlung verwendet wird, die Porengröße des äußersten Filters immer größer zu sein als die des untersten Filters ( US Patent Nr. 5 240 862 und WO Veröffentlichung Nr. 96/15453 ).
Im Gegensatz dazu dient in dem Biosensor der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von zwei Filtertypen, d. h. einem ersten Filter und einem zweiten Filter, der erste Filter dazu, die Hämozyten nahezu vollständig abzutrennen und folglich erreicht nur eine sehr geringe Menge der Hämozyten den zweiten Filter. Der zweite Filter dient dazu, die sehr geringe Menge des Filtrats zu absorbieren, das von der Probenlösungszufuhrwegeinlassseite herausgeht, und dieses Filtrat in den Probenlösungszufuhrweg zu führen.
Obwohl es eine Tendenz gibt, dass eine direkte Zufuhr eines Filtrats von dem ersten Filter mit einer kleinen Porengröße zu dem ausgesparten Probenlösungszufuhrweg unmöglich ist, es sei denn dass Druck angelegt wird, ermöglicht das Vorsehen des zweiten Filters zwischen dem ersten Filter und dem Probenlösungszufuhrweg nahezu eine vollständige Filtration der Hämozyten als auch eine schnelle Zufuhr nur des durch den zweiten Filter durchgetretenen Filtrats in dem Probenlösungszufuhrweg. Es ermöglicht außerdem eine vollständige Vermeidung des Ausflusses von Hämozyten in dem Probenlösungszufuhrweg, so dass das Problem eines Messfehlers eliminiert werden kann.
Außerdem ist für die schnelle Absorption des Filtrats von dem zweiten Filter in den Probenlösungszufuhrweg aufgrund der Kapillarwirkung in der vorliegenden Erfindung das Volumen des Probenlösungszufuhrwegs von Wichtigkeit, und es ist bevorzugt, nicht mehr als 2 μl. Die Kapillarwirkung bezieht sich allgemein auf ein Phänomen, dass, wenn eine Kapillare in einer Flüssigkeit aufgestellt wird, der Flüssigkeitsspiegel in der Kapillare höher (oder niedriger) als der Flüssigkeitsspiegel außerhalb der Kapillare wird. Eine Menge der in die Kapillare aufzusaugenden Flüssigkeit wird durch die Werke der Interaktion (Adhäsion) zwischen der Oberflächenspannung der Flüssigkeit und der Kapillarwand bestimmt, und es ist daher möglich, in dem Fall, wo eine dünne Kapillare verwendet wird, eine größere Menge der Flüssigkeit in eine Kapillare einzusaugen, als in dem Fall, wo eine dicke Kapillare verwendet wird. Demgemäß hat der Probenlösungszufuhrweg bevorzugt eine Struktur, die äquivalent zu einer dünnen Kapillare mit einem Volumen von nicht mehr als 2 μl ist, um schnell das Filtrat in den Probenlösungszufuhrweg zu führen.
Die 24 ist eine auseinander gezogene, perspektivische Ansicht des Biosensors gemäß der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Der in der 24 gezeigte erfindungsgemäße Biosensor hat eine isolierende Grundplatte 301, die aus einem isolierenden Harz, wie etwa Polyethylenterephthalat, hergestellt ist. In der 24 ist ein Palladiumteilbereich auf der linken oberen Fläche der isolierenden Grundplatte mittels Sputtern, Bedampfen oder ähnlichem ausgebildet, gefolgt durch Lasertrimmen, um ein Elektrodensystem einschließlich einer Arbeitselektrode 302 und einer Gegenelektrode 303 auszubilden. Die Elektrodenfläche kann durch eine Breite eines Schlitzes 308, der auf einem Abstandshalter 305 gebildet wird, wie später beschrieben wird, bestimmt werden.
In dem mit der Grundplatte 301 zu kombinierenden Abstandshalter 305 werden der Schlitz 308 für die Ausbildung des Probenlösungszufuhrwegs, ein Einlass 307 des Schlitzes (Probenlösungszufuhrweg) und eine Öffnung 306 für die Aufnahme eines zweiten Filters 326 in dem nach Zusammenbau erhaltenen Biosensor ausgebildet. Eine Luftöffnung 311a und eine Öffnung 310 für die Aufnahme des zweiten Filters 326 werden in einer Abdeckung 309 gebildet, eine Öffnung 320 wird in einem Abstandshalter 327 und eine mit dem Filter 304 kommunizierende Öffnung 323 wird in einem Probenlösungstropfteil 322 gebildet.
Beim Zusammenbau der vorher erwähnten Grundplatte 301, dem Abstandshalter 305, der Abdeckung 309 und dem Abstandshalter 327 werden die Öffnung 306, die zu dem Schlitz 308 führt, die in der Abdeckung 309 gebildete Öffnung 310 und die in dem Abstandshalter 327 ausgebildete Öffnung 320 verbunden.
Der erste Filter 304 für die Abtrennung von Hämozyten wird durch einen Membranfilter aufgebaut und die Größe der Pore (Porengröße) kann in einem derartigen Grad sein, dass Hämozyten nicht dadurch treten können (z. B. 0,1 bis 5 μm). Zum Beispiel wird der erste Filter 304 ausgeschnitten, um ein 6 mm Viereck zu sein. Die Dicke kann in der Größenordnung von 0,1 bis 40 μm sein.
Der zweite Filter 326 für die Absorption von Plasma wird durch Glasfaserfilterpapier aufgebaut und wurde ausgeschnitten, um in der Form eines Zylinders mit einem Durchmesser von 2,5 mm und einer Höhe (Dicke) von 500 bis 1.000 μm zu sein. Es ist bevorzugt, dass die Porengröße davon nicht weniger als 0,1 μm und größer als die Porengröße des ersten Filters ist.
Für den Zusammenbau dieses Biosensors wird der Probenlösungszufuhrweg 308' (siehe 24) durch den Schlitz 308 in einer konkaven Form ausgebildet, wenn die Abdeckung 309 mit dem Abstandshalter 305 kombiniert wird, eine Reaktionsschicht wird auf einem vorbestimmenden Element wie später beschrieben wird ausgebildet, und die isolierende Grundplatte 301, der Abstandshalter 305, die Abdeckung 309 und der Abstandshalter 327 werden dann in einer derartigen Art und Weise kombiniert, dass die rechten Enden dieser Elemente in einer Linie ausgerichtet sind.
Nachfolgend wird, wie durch die gepunkteten Linien in der 24 gezeigt, der zweite Filter 326 in der kommunizierenden Öffnung, gebildet durch die Öffnungen 306, 310 und 320, angeordnet. Schließlich wird der erste Filter 304 auf dem Abstandshalter 327 angeordnet, auf welche das Probenlösungstropfteil 322 weiterhin angeordnet wird. Die Öffnung 323 des Probenlösungstropfteils 322 kommuniziert mit dem ersten Filter 304.
Eine schematische perspektivische Ansicht des erfindungsgemäßen Biosensors, der gemäß der Konfiguration der 24 erhalten wird, wird in der 25 gezeigt. Eine Schnittansicht, genommen entlang der Linie X''-X'' der 25, wird weiterhin in der 26 gezeigt. Es sollte bemerkt werden, dass die Reaktionsschicht, das Elektrodensystem und ähnliche aus der 26 weggelassen sind.
Wie in der Schnittansicht in der 26 gezeigt, erfordert die vollständige Entfernung von Hämozyten als störende Substanzen aus Vollblut als die Probenlösung in dem erfindungsgemäßen Biosensor, das die Probenlösung sicher durch den ersten Filter 304 tritt. Schnelle Absorption des filtrierten Plasmas und schnelle Zuführung davon in den Probenlösungszufuhrweg 308' erfordert, dass der zweite Filter 326 in Kontakt sowohl mit dem ersten Filter 304 als auch dem Einlass 307 des Probenlösungszufuhrwegs 308' ist.
Die Reaktionsschicht und das Elektrodensystem werden in der 26 weggelassen, während eine teilweise Schnittansicht entsprechend der 26, welche die Reaktionsschicht und das Elektrodensystem darstellt, in der 27 gezeigt wird. Auf den Elektroden 302 und 303 der isolierenden Grundplatte 301 werden eine hydrophile Polymerschicht 328 und eine Reaktionsschicht 318a ausgebildet. Ferner wird eine Reaktionsschicht 318b auf der unteren Oberfläche der Abdeckung 309 gebildet, die dem Dach des Probenlösungszufuhrwegs 308' entspricht.
Der in den 24 bis 27 gezeigte Biosensor wird unter Verwendung von fünf Typen von Elementen hergestellt, um die Strukturen davon einfach verständlich zu machen. Jedoch kann der Abstandshalter 305 und die Abdeckung 309 durch ein Element G gebildet werden, welches mit den Abstandshaltern 327, 304 und 322 ergänzt werden kann, um zusammen als ein Element H ausgebildet zu sein. Oder der Abstandshalter 327 kann entfernt werden, in Abhängigkeit von der Dicke des zweiten Filters 326.
Für die Messung von Cholesterin im Blut unter Verwendung des in den 24 bis 27 gezeigten Biosensors wird Blut als die Probenlösung tropfenweise auf die Öffnung 323 des Probenlösungstropfteils 322 gegeben. Mit dem hier aufgetropften Vollblut wird nur Plasma auf der oberen Oberfläche der Probenlösungszufuhrteilseite des ersten Filters 304 eingeschlossen und nur Plasma wird von der Oberfläche der Probenlösungszufuhrwegseite des ersten Filters abgesondert. Das abgesonderte Plasma füllt den gesamten zweiten Filter 326. Wenn das Innere des Filters mit dem Plasma gesättigt wird, dringt das Plasma in den Probenlösungszufuhrweg 308' durch den Einlass 307 ein und füllt das Innere des Probenlösungszufuhrwegs 308', während eine Reaktionsschicht, die auf der Position getragen wird, die das Elektrodensystem und/oder die rückwärtige Oberfläche der Abdeckung 309 bedeckt, gelöst wird. Spezieller füllt das von dem zweiten Filter 326 abgesonderte Plasma den gesamten Probenlösungszufuhrweg 308', der sich bis in die Nähe der Elektrode und weiter zu dem Teilbereich der Luftöffnung 311a erstreckt. Wenn einmal der gesamte Probenlösungszufuhrweg 308' mit der Flüssigkeit gefüllt ist, stoppt ebenfalls der Fluss der Flüssigkeiten in den zweiten Filter 326 und in den ersten Filter 304.
Nach einem derartigen Hämozyten filtrierenden Vorgang tritt eine chemische Reaktion der Reaktionsschicht, die durch das Plasma gelöst wurde, mit einem zu messenden Bestandteil (z. B. Cholesterin in dem Fall eines Cholesterinsensors) in dem Plasma auf, und ein Stromwert in der Elektrodenreaktion wird nach dem Verstreichen einer bestimmten Zeitspanne gemessen, um den Bestandteil im Plasma zu bestimmen.
Wie auf diese Weise beschrieben, zeigt die 27 ein Beispiel der Anordnung der Reaktionsschicht in der Nähe des Elektrodensystems in dem Probenlösungszufuhrweg 308'. Auf dem Elektrodensystem der gebildeten Grundplatte 301 sind eine Schicht 328 eines hydrophilen Polymers, wie etwa CMC, und die Reaktionsschicht 318a einschließlich eines Reaktionsreagenz, wie etwa des Elektronenvermittlers. Ferner wird die Reaktionsschicht 318b einschließlich einer Oxidoreduktase auf der Oberfläche ausgebildet, die zum Probenlösungszufuhrweg hin frei ist, innerhalb der rückwärtigen Oberfläche eines Abdeckungselements, das durch Kombination der Abdeckung 309 mit dem Abstandshalter 305 erhalten wird.
Es ist bevorzugt, dass das Elektrodensystem Edelmetallelektroden umfasst. Mit der bevorzugten Breite des Probenlösungszufuhrwegs 308' von nicht mehr als 2 mm, wird eine Elektrodenfläche einer durch Siebdruck erhaltenen gedruckten Elektrode mit geringer Genauigkeit bestimmt. Wenn die Edelmetallelektroden verwendet werden, kann im Gegensatz dazu ein Lasertrimmen durch eine 0,1 mm Breite durchgeführt werden, und die Elektrodenfläche wird folglich mit hoher Genauigkeit bestimmt.
Im Folgenden werden Beispiele der vorliegenden Erfindung beschrieben; jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt.
Beispiel 1
Ein Biosensor wurde hergestellt, welcher die Strukturen in Übereinstimmung mit der Ausführungsform 1, gezeigt in den 1 bis 4, hat, dessen zu messender Gegenstand Gesamtcholesterin war, und in welchem die Reaktionsschicht 18a den Elektronenvermittler enthielt, und die Reaktionsschicht 18b enthielt Cholesterinoxidase, Cholesterinesterase und einen oberflächenaktiven Stoff.
Zunächst wurden 5 μl einer wässrigen Lösung, die 0,5 Gew.-% CMC enthält, auf das Elektrodensystem der Grundplatte 1 getropft und in einer Trockenvorrichtung mit einem warmen Luftstrahl bei 50°C für 10 Minuten getrocknet, um die hydrophile Polymerschicht 17 zu bilden. Als nächstes wurden 4 μl einer wässrigen Kaliumferricyanidlösung (entsprechend zu 70 mM Kaliumferricyanid) auf die hydrophile Polymerschicht 17 getropft und in der Trockenvorrichtung mit einem warmen Luftstrahl bei 50°C für 10 Minuten getrocknet, um die Reaktionsschicht 18a einschließlich Kaliumferricyanid auszubilden.
Polyethylen(10)octylphenylether, gezeigt als TritonX-100, als der oberflächenaktive Stoff wurde zu einer wässrigen Lösung mit darin gelöster Cholesterinoxidase (EC1.1.3.6: ChOD) die aus Nocardia stammt, und darin gelöster Cholesterinesterase (EC.3.1.1.13: ChE), die aus Pseudomonas stammt, zugegeben. 0,4 μl dieser gemischten Lösung wurde auf das konkave Teil (ein Teil entsprechend der oberen Seite des Probenlösungszufuhrwegs 8' der Abdeckung 9) gebildet durch Zusammenbau der Abdeckung 9 mit dem Abstandshalter 5 aufgetropft, vorgefroren mit flüssigem Stickstoff bei –196°C, und in einem Gefiertrockengerät für zwei Stunden getrocknet, um die Reaktionsschicht 18b (4) einschließlich 450 U/ml der Cholesterinoxidase, 1125 U/ml der Cholesterinesterase und 2 Gew.-% des oberflächenaktiven Stoffs auszubilden.
Es ist zu bemerken, dass wenn ein Biosensor erhalten wird, dessen zu messender Gegenstand LDL-Cholesterin ist, ein oberflächenaktiver Stoff verwendet werden kann, der in der Lage ist LDL selektiv zu solubilisieren. Dies bringt LDL-Cholesterin in das Reaktionssystem ein, um die Messung davon zu ermöglichen. Da Enzymreaktionen mit andren Lipoproteinen als LDL (Chylomicron, hoch dichtes Lipoprotein (high density lipoprotein; HDL), Lipoprotein mit sehr geringer Dichte (very low density lipoprotein; VLDL)) durch diesen oberflächenaktiven Stoff gehemmt werden, werden diese Lipoproteine nicht in das Reaktionssystem für Cholesterin eingebracht und verbleiben in der Reaktionslösung in der Form von Lipoproteinen.
Hinsichtlich der Größe des Sensors ist es bevorzugt, dass die Schlitzbreite 0,8 mm ist, die Schlitzlänge (die Länge zwischen dem Einlass und der Luftöffnung des Probenlösungszufuhrwegs) ist 4,5 mm, die Dicke des Abstandshalters (der Abstand zwischen der Grundplatte 1 und der Abdeckung 9) ist 100 μm.
Der erste Filter 4 wurde durch Ausstanzen von Glasfaserfilterpapier mit einer Dicke von etwa 700 μm in der Form eines Kreises mit einem Durchmesser von 2,5 mm hergestellt, um in zylindrischer Form zu sein. Die Grundplatte 1, der Abstandshalter 5, die Abdeckung 9 und die Filterhalteplatte 12 werden kombiniert, um einen Raum zu ergeben, der die Öffnung 6 die Öffnung 10 und den Raum 12 umfasst, welcher mit dem ersten Filter 4 versehen wurde.
Nachfolgend wurde die obere Abdeckung 14 auf dem oberen Teil der Filterhalteplatte 12 angeordnet, um einen Biosensor mit dem in den 1 bis 4 gezeigten Strukturen herzustellen.
10 μl Vollblut oder eines Standardserums als die Probenlösung wurden auf die Öffnung 16 des erhaltenen Biosensors getropft, 180 Sekunden später wurde eine Impulsspannung von +0,2 V an die Arbeitselektrode in Richtung der Anode relativ zu der Gegenelektrode angelegt, und 5 Sekunden später wurde ein Wert eines Stroms, der zwischen der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode fließt, gemessen. Die resultieren Antworteigenschaft wird in der 16 gezeigt.
Wie es aus der 16 ersichtlich ist, kann mit dem erfindungsgemäßen Biosensor eine günstige Linearität zwischen der Gesamtcholesterinkonstellation und dem Antwortstromwert erhalten werden.
Beispiel 2
Ein Biosensor wurde hergestellt, welcher die Strukturen gemäß Ausführungsform 2, gezeigt in den 5 bis 8, hat, dessen zu messender Gegenstand Gesamtcholesterin war, und in welchem die Reaktionsschicht 118a den Elektronenvermittler enthält, und die Reaktionsschicht 118b Cholesterinoxidase, Cholesterinesterase und einen oberflächenaktiven Stoff enthält.
Zunächst wurden 5 μl einer wässrigen Lösung, die 0,5 Gew.-% CMC enthält, auf das Elektrodensystem der Grundplatte 101 getropft und in einer Trockenvorrichtung mit einem warmen Luftstrahl bei 50°C für 10 Minuten getrocknet, um die hydrophile Polymerschicht 117 auszubilden. Als nächstes wurden 4 μl einer wässrigen Kaliumferricyanidlösung (entsprechend zu 70 mM Kaliumferricyanid) auf die hydrophile Polymerschicht 117 getropft und in der Trockenvorrichtung mit einem warmen Luftstrahl bei 50°C für 10 Minuten getrocknet, um die Reaktionsschicht 118a auszubilden, die Kaliumferricyanid enthält.
Polyoxyethylen(10)octylphenylether, gezeigt als TritonX-100, als der oberflächenaktive Stoff wurden zu einer wässrigen Lösung mit darin gelöster Cholesterinoxidase (EC1.1.3.6: ChOD), die aus Nocardia stammt, und darin gelöster Cholesterinesterase (EC.3.1.1.13: ChE), die aus Pseudomonas stammt, hinzugegeben. 0,4 μl dieser gemischten Lösung wurde auf das konkave Teil (ein Teil entsprechend der oberen Seite des Probenlösungszufuhrwegs 108' der Abdeckung 109) gebildet durch Zusammenbau der Abdeckung 109 mit dem Abstandshalter 105, getropft, mit flüssigem Stickstoff bei –196°C vorgefroren, und in einem Gefriertrockengerät für 2 Stunden getrocknet, um die Reaktionsschicht 118b (8) einschließlich 450 U/ml der Cholesterinoxidase, 1125 U/ml Cholesterinesterase und 2 Gew.-% des oberflächenaktiven Stoffs auszubilden.
Es ist zu bemerken, dass wenn ein Biosensor erhalten wird, dessen zu messender Gegenstand LDL-Cholesterin ist, ein oberflächenaktiver Stoff für die selektive Solubilisierung nur von LDL verwendet werden kann. Dieser bringt LDL-Cholesterin in das Reaktionssystem, um die Messung davon zu ermöglichen. Da Enzymreaktionen mit anderen Lipoproteinen als LDL (Chylomicron, HDL, VLDL) durch diesen oberflächenaktiven Stoff gehemmt werden, werden diese Lipoproteine nicht in das Reaktionssystem des Cholesterins eingebracht und verbleiben in der Reaktionslösung in der Form von Lipoproteinen.
Der erste Filter 104 wurde durch Ausstanzen von Glasfaserfilterpapier beschichtet mit PVA in der Form eines Kreises mit einem Durchmesser von 2,5 mm hergestellt.
Nachfolgend wird der erste Filter 104 auf der kombinierten Grundplatte C, welcher auf der Grundplatte 101 ist, gebildet, gefolgt durch Bindung der kombinierten Grundplatte B erhalten durch Zusammenbau der Filterhalteplatten 112a, 112b und 112c mit der oberen Abdeckung 115, auf dem ersten Filter 104, um einen Biosensor mit den in den 5 bis 8 gezeigten Strukturen herzustellen.
10 μl Vollblut als die Probenlösung wurde auf die Öffnung 116 des erhaltenen Biosensors getropft, 180 Sekunden später wurde eine Impulsspannung von +0,2 V an die Messelektrode in die Richtung der Anode relativ zu der Gegenelektrode angelegt, und 5 Sekunden später wurde ein Wert eines Stromflusses zwischen der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode gemessen. Der resultierende Antwortkennwert wird in der 17 gezeigt.
Wie aus der 17 ersichtlich, kann mit dem erfindungsgemäßen Biosensor eine günstige Linearität zwischen der Cholesterinkonzentration und dem Antwortstromwert erhalten werden.
Beispiel 3
Ein Biosensor wurde hergestellt, welcher die Strukturen gemäß Ausführungsform 3 gezeigt in den 18 bis 21 hat, und dessen zu messender Gegenstand Gesamtcholesterin und LDL-Cholesterin ist. Zu der Reaktionsschicht 218a wurde der Elektronenvermittler gegeben, und zu der Reaktionsschicht 218b wurden Cholesterinoxidase, Cholesterinesterase und ein oberflächenaktiver Stoff gegeben.
Zuerst wurde eine wässrige Lösung, die 0,5 Gew.-% CMC enthält, auf das Elektrodensystem der isolierenden Grundplatte als auch die Fläche davon, die in Kontakt mit dem ersten Filter ist, getropft, und dann in einer Trockenvorrichtung mit einem warmen Luftstrom bei 50°C für zehn Minuten getrocknet, um die CMC-Schicht 224 und die hydrophile Schicht 225 auszubilden.
Als nächstes wurden 4 μl einer wässrigen Kaliumferricyanidlösung (entsprechend zu 70 mM Kaliumferricyanid) auf die CMC-Schicht 224 getropft und in der Trockenvorrichtung mit einem warmen Luftstrahl bei 50°C für zehn Minuten getrocknet, um die Reaktionsschicht 218a einschließlich Kaliumferricyanid auszubilden.
Polyoxyethylen(10)octylphenylether, gezeigt als TritonX-100, als der oberflächenaktive Stoff wurde zu einer wässrigen Lösung mit darin gelöster Cholesterinoxidase (EC1.1.3.6: ChOD), die aus Nocardia stammt, und darin gelöster Cholesterinesterase (EC.3.1.1.13: ChE), die aus Pseudomona stammt, zugegeben. 0,4 μl der erhaltenen gemischten Lösung wurde auf den Teilbereich der Abdeckung 209 getropft, der zu dem Probenlösungszufuhrweg 208' hin offen ist, mit flüssigem Stickstoff bei –196°C vorgefroren und in einem Gefriertrockengerät für etwa zwei Stunden getrocknet, um die Reaktionsschicht 218b (Biosensor, dessen zu messender Gegenstand Gesamtcholesterin war) einschließlich 450 U/ml Cholesterinoxidase, 1125 U/ml Cholesterinesterase und 2 Gew.-% des oberflächenaktiven Stoffs (z. B. Emulgen B66, hergestellt durch Kao Corporation oder ein kationischer oberflächenaktiver Stoff mit einem HLB-Wert von 13 bis 15) auszubilden.
Der erste hier verwendete Filter 204 war einer, der durch Ausstanzen erhalten wurde, in der Form eines Kreises mit einem Durchmesser von 5 mm, Cyclopore Membran (Porengröße 5,0 μm, Dicke 7,0 bis 23 μm), hergestellt durch Whatman Plc., Hema-fil-Membran (Porengröße 5,0 μm, Dicke 11 μm), hergestellt durch Corning Incorporated oder Isopore Membran (Porengröße 5,0 μm, Dicke 10 μm), hergestellt durch Millipore Corporation. Diese Membran war ein kontinuierlich homogener Filter mit einer gleichmäßigen Porengröße und einem regulären inneren Flußkanal und hatte eine Porengröße von etwa 5 μm.
Danach wurden die kombinierte Grundplatte E und die kombinierte Grundplatte F durch Ausrichten der rechten Enden dieser Elemente auf der Grundlage der in der 18 gezeigten Positionsbeziehung kombiniert, auf welchen der erste Filter 204 weiter gebunden wurde, um einen Biosensor mit den in den 18 bis 21 gezeigten Strukturen herzustellen.
[Bewertung]
In dem erhaltenen Biosensor wurde 5 μl Vollblut als die Probenlösung zu der Öffnung 223 gegeben, um als ein Probenlösung zuführenders Teil zu dienen, 150 Sekunden später wurde eine Impulsspannung von +0,2 V an die Messelektrode in die Richtung der Anode relativ zu der Gegenelektrode angelegt und fünf Sekunden später wurde ein Wert eines Stroms, der zwischen der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode fließt, gemessen. Die Ergebnisse werden in der 22 gezeigt. Die 22 ist eine graphische Darstellung, die die Beziehung zwischen der Gesamtcholesterinkonzentration in der Probenlösung und dem Antwortwert des Stroms zeigt.
Wie aus dieser graphischen Darstellung ersichtlich, kann mit dem erfindungsgemäßen Biosensor eine günstige Linearität zwischen der Gesamtcholesterinkonzentration und dem Antwortstromwert erhalten werden.
Beispiel 4
In dem vorliegenden Beispiel wurde ein Biosensor hergestellt, welcher die Strukturen gemäß Ausführungsform 3, gezeigt in den 18 bis 21, hat, und dessen zu messender Gegenstand Glucose ist. Ferner enthielt die Reaktionsschicht 218a den Elektronenvermittler und Glucoseoxidase. Es ist zu bemerken, dass die Reaktionsschicht 218b im Fall eines Glucosesensors nicht ausgebildet wurde.
Zuerst wurden die CMC-Schicht 224 und die hydrophile Schicht 225 in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 3 ausgebildet. Ferner wurden 4 μl einer wässrigen Lösung einschließlich 50 mM Kaliumferricyanid und 250 U/ml Glucoseoxidase auf die CMC-Schicht 224 getropft, welche dann in einer Trockenvorrichtung mit einem warmen Luftstrahl bei 50°C für zehn Minuten getrocknet wurde, um die Reaktionsschicht 218a auszubilden.
Danach wurde ein erfindungsgemäßer Biosensor, dessen zu messender Gegenstand Glucose war, in der gleichen Art und Weise in Beispiel 3 hergestellt.
[Bewertung]
Bei dem erhaltenen Biosensor wurde 5 μl Vollblut als die Probenlösung zu der Öffnung 232 gegeben, die als ein Probenlösungszufuhrteil dient, 25 Sekunden später wurde eine Impulsspannung von +0,2 V an die Messelektrode in Richtung der Anode relativ zu der Gegenelektrode angelegt, und 5 Sekunden später wurde ein Wert eines Stroms, der zwischen der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode fließt, gemessen. Die Ergebnisse werden in der 23 gezeigt. Die 23 ist eine graphische Darstellung, die die Beziehung zwischen der Glucosekonzentration in der Probenlösung und dem Antwortwert des Stroms zeigt.
Wie aus der 23 ersichtlich, kann mit dem erfindungsgemäßen Biosensor eine günstige Linearität zwischen der Glucosekonzentration und dem Antwortstromwert erhalten werden.
Beispiel 5
In dem vorliegenden Beispiel wurde ein Biosensor für die Messung von Gesamtcholesterin mit den Strukturen gemäß Ausführungsform 4 gezeigt in den 24 bis 27 hergestellt. Zu der Reaktionsschicht 318a wurde der Elektronenvermittler und zu der Reaktionsschicht 318b wurde Cholesterinoxidase, Cholesterinesterase und ein oberflächenaktiver Stoff hinzugegeben.
Zuerst wurden 5 μl einer wässrigen Lösung, die 0,5 Gew.-% CMC enthält, auf das Elektrodensystem der isolierenden Grundplatte 301 getropft und in einer Trockenvorrichtung mit einem warmen Luftstrahl bei 50°C für zehn Minuten getrocknet, um die hydrophile Polymerschicht 324 einschließlich CMC auszubilden.
Als nächstes wurden 4 μl einer wässrigen Kaliumferricyanidlösung (entsprechend zu 70 mM Kaliumferricyanid) auf die CMC-Schicht 324 getropft und in der Trockenvorrichtung mit einem warmen Luftstrahl bei 50°C für zehn Minuten getrocknet, um die Reaktionsschicht 318a einschließlich Kaliumferricyanid auszubilden.
Polyoxiethylen(10)octylphenylether, gezeigt als TritonX-100, als der oberflächenaktive Stoff wurde zu einer wässrigen Lösung mit darin gelöster Cholesterinoxidase (EC1.1.3.6: ChOD), die aus Nocardia stammt, und darin gelöster Cholesterinesterase (EC.3.1.1.13: ChE), die aus Pseudomona stammt, hinzugegeben. 0,4 μl dieser gemischten Lösung wurde auf den konkaven Teil (Schlitz 308, nämlich dem Probenlösungszufuhrweg 308') des Elements P erhalten durch Zusammenbau der Abdeckung 309 mit dem Abstandshalter 305 getropft, mit flüssigem Stickstoff bei –196°C vorgefroren und in einem Gefriertrockengerät für zwei Stunden getrocknet. Dadurch wurde die Reaktionsschicht 318b einschließlich 450 U/ml Cholesterinoxidase, 1125 U/ml Cholesterinesterase und 2 Gew.-% des oberflächenaktiven Stoffs ausgebildet.
Der erste Filter wurde durch Ausschneiden von Cyclopore Membran (Porengröße 5,0 μm, Dicke 8 bis 23 μm, hergestellt durch Whatman Plc.) in einer viereckigen Form hergestellt. Ferner wurde der zweite Film durch Ausschneiden von Rapid 24 (maximale Porengröße 22 mm, Dicke etwa 340 μm, hergestellt durch Whatman Plc.) in einer Kreisform hergestellt.
Danach wurde ein Element, das durch Zusammenbau zum Kombinieren der isolierenden Grundplatte 301, des kombinierten Elements G und des zweiten Filterelements 326 erhalten wurde, an ein Element H gebunden, das durch Zusammenbau erhalten wurde, um den Abstandshalter 327, den ersten Filter 304 und den Probenlösungstropfteil 322 zu kombinieren, um einen Cholesterinsensor mit den in den 24 bis 27 gezeigten Strukturen herzustellen.
10 μl Vollblut als die Probenlösung wurde zu dem Probenlösungstropfteil des auf diese Weise hergestellten Biosensors gegeben, 180 Sekunden später wurde eine Impulsspannung von +0,2 V an die Messelektrode in Richtung der Anode relativ zu der Gegenelektrode angelegt, und 5 Sekunden später wurde ein Strom, der zwischen der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode fließt gemessen. Die Ergebnisse werden in der 28 gezeigt. Die 28 ist eine graphische Darstellung, die die Beziehung zwischen dem Antwortwert des Gesamtcholesterinmesssensors und der Gesamtcholesterinkonzentration zeigt. Der Messwert (Gesamtcholesterinkonzentration) durch Fuji Dry Chem. wird als Abszisse und der Antwortstrom wird in dem vorliegenden Beispiels als Ordinate aufgetragen.
Es wurde aus diesen Ergebnissen gefunden, dass die Konzentrationsmessung durch das Elektrodensystem durch Auftropfen der Probenlösung auf den Biosensor ohne Vorbehandlung davon möglicht ist, und eine günstige Linearität zwischen der Cholesterinkonzentration und dem Antwortwert kann erhalten werden.
Beispiel 6
In dem vorliegenden Beispiel wurde ein Biosensor hergestellt, welcher die Strukturen nach Ausführungsform 4, gezeigt in den 24 bis 27 hat, und dessen zu messender Gegenstand LDL-Cholesterin war. Die Reaktionsschicht 318a enthielt den Elektronenvermittler und die Reaktionsschicht 318b enthielt Cholesterinoxidase, Cholesterinesterase und einen oberflächenaktiven Stoff. Mit der Ausnahme, dass der zweite Filter 326 eine Substanz enthielt, die Lipoprotein ausgenommen LDL, insbesondere HDL, kondensieren kann, wurde ein Biosensor hergestellt, und die Messungen erfolgten in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 5.
Die Substanz für die Kondensierung oder Absorbierung von HDL kann beispielsweise poröses Siliziumoxid und ein Antikörper gegen HDL sein.
Hierin wurde eine wässrige Lösung des Antikörpers gegen HDL und bovines Serumalbumin auf den zweiten Filter 326 getropft, mit flüssigem Stickstoff bei –196°C vorgefroren und einem Gefriertrockengerät für zwei Stunden getrocknet. Wie in der 24 gezeigt, wurde dann ein Biosensor hergestellt, welcher darin den zweiten Filter enthielt, der Lipoprotein mit Ausnahme LDL, insbesondere HDL, in Plasma einfangen kann.
Beispiel 7
In dem vorliegenden Beispiel wurde ein Biosensor hergestellt, welcher die Strukturen gemäß Ausführungsform 4, gezeigt in den 24 bis 27, hatte, und dessen zu messender Gegenstand HDL-Cholesterin war, und die Reaktionsschicht 318a enthält den Elektronenvermittler und die Reaktionsschicht 318b enthält Cholesterinoxidase, Cholesterinesterase und einen oberflächenaktiven Stoff. Ferner enthält der zweite Filter 326 eine Substanz, die Lipoprotein ausgenommen HDL kondensieren kann.
In dem vorliegenden Beispiel wurde, ausgenommen, dass der zweite Filter 326 eine Substanz trägt, die Lipoproteine außer HDL kondensieren kann, ein Biosensor in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 1 hergestellt. Speziell wurden 2 mM Magnesiumchlorid und 50 mM Phosphorwolframsäure als Substanzen, die Lipoprotein außer HDL kondensieren können, auf den zweiten Filter 326 getropft, mit flüssigem Stickstoff bei –196°C vorgefroren und in einem Gefriertrockengerät für zwei Stunden getrocknet. Wie in der 24 wurde dann ein Biosensor hergestellt, welcher darin den zweiten Filter 326 enthielt, der Lipoprotein außer HDL einschließen kann.
Industrielle Anwendbarkeit
Bei dem erfindungsgemäßen Biosensor erfolgt die Filtration in einer vertikalen Richtung durch Nutzung der Schwerkraft und danach wird eine Probenlösung zu einem Messteil, wie etwa einer Elektrode, durch Nutzung der Kapillarwirkung bewegt. Zu diesem Zweck kann die Probenlösung schnell ohne Anlegen von Druck oder Ähnlichem vorgesehen werden, was eine schnelle Messung ermöglicht. Da nicht befürchtet wird, dass Blasen in dem Probenlösungszufuhrweg erzeugt werden, ist eine hochgenaue Messung möglich. Ferner, selbst in dem Fall der Realisierung einer Konfiguration in welche ein Messreagenz in einer Position abseits der Elektrode getragen wird, kann der Filter und das Messereagenz separat in den Biosensor der vorliegenden Erfindung aufgenommen werden, und der Biosensor mit einer derartigen Konfiguration kann relativ einfach in dem Herstellungsverfahren hergestellt werden.
Da ferner der erste Filter einen Raum hat, der nicht in Kontakt mit dem Filterhalteteil ist, werden zu filtrierende Hämozyten im Blut nicht durch den Teil in Kontakt mit dem Filterhalteteil gehen und folglich werden sie nicht zu dem Probenlösungszufuhrweg geführt, wodurch ein Biosensor mit einer geringen Schwankung erhalten werden kann.
Überdies ist in dem ersten Filter die Querschnittsfläche (F1) der Probenlösungszufuhrteilseite größer als die Querschnittsfläche (F1) der Probenlösungszufuhrwegseite, so dass ein Effekt, dass Plasma schnell in dem Biosensor vorgesehen wird, erhalten werden kann. Ferner ist die Querschnittsfläche (F1) der Probenlösungszufuhrteilseite des ersten Filters größer als die Querschnittsfläche (F2) des Teilbereichs, des ersten Filters, welcher in Kontakt mit der Grundplatte ist, so dass ein Effekt, dass Plasma schnell in dem Biosensor zugeführt wird erhalten werden kann.
Zusätzlich kann mit der Verwendung eines Membranfilters, welcher sich nicht wesentlich expandieren wird, für den Biosensor der vorliegenden Erfindung die Hämozytenbestandteile im Blut ausreichend filtriert werden, um das Gesamtcholesterin in einer hochgenauen Art und Weise zu messen. Wenn ferner die Reduktion in der Probenmenge erforderlich ist, ist die Verwendung des Membranfilters wirkungsvoll, weil es keine wesentliche Expansion davon gibt. Da über dies die Bereitstellung der hydrophilen Schicht zwischen dem ersten Filter und der Grundplatte die rasche Zufuhr der Probenlösung ermöglicht, die durch den ersten Filter des Probenlösungszufuhrwegs durchgetreten ist, kann ein Versuch unternommen werden die Messzeit zu verkürzen.
Da ferner die Bereitstellung des zweiten Filters zwischen dem ersten Filter und dem Probenlösungszufuhrweg immer eine rasche Zufuhr der Probenlösung ermöglicht, die durch den ersten Filter durchgetreten ist, zu dem Probenlösungszufuhrweg, kann ein Versuch zur Verkürzung der Messzeit unternommen werden.

Claims

Biosensor mit: einer isolierenden Grundplatte (1, 101, 201, 301); einem Elektrodensystem mit einer Arbeitselektrode (2, 102, 202, 302) und einer Gegenelektrode (3, 103, 203, 303), welche auf der Grundplatte (1, 101, 201, 301) vorgesehen sind; einer Reaktionsschicht (18a, 18b, 118a, 118b, 218a, 218b, 318a, 318b) einschließlich wenigstens einer Oxidoreduktase und einem Elektronenvermittler; einem Probenlösungszufuhrweg (8', 108', 208', 308'), welcher das Elektrodensystem und die Reaktionsschicht (18a, 18b, 118a, 118b, 218a, 218b, 318a, 318b) enthält und einen Einlass (7, 107, 207, 307) und eine Luftöffnung (11, 111, 211a, 211b, 311a, 311b) hat; einem Probenlösungszufuhrteil für das Einbringen einer Probenlösung, welches in einer Position abseits von dem Probenlösungszufuhrweg (8', 108', 208', 308') ist; und einem ersten Filter (4, 104, 204, 304), welcher zwischen dem Probenlösungszufuhrweg (8', 108', 208', 308') und dem Probenlösungszufuhrteil zum Filtrieren der Probenlösung angeordnet ist, wo ein mit dem ersten Filter (4, 104, 204, 304) filtriertes Filtrat in den Probenlösungszufuhrweg (8', 108', 208', 308') aufgrund der Kapillarwirkung zugeführt wird, wobei die Richtung, in welcher die Probenlösung durch den ersten Filter (4, 104, 204, 304) tritt und die Richtung, in welcher das Filtrat durch den Probenlösungszufuhrweg (8', 108', 208', 308') tritt, sich im rechten Winkel überschneiden, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Filter (4, 104, 204, 304) nicht in den Probenlösungszufuhrweg (8', 108', 208', 308') eindringt.
Biosensor nach Anspruch 1, wobei der erste Filter (4, 104, 204, 304) entweder aus einer Glasfaser oder einer Cellulosefaser aufgebaut ist.
Biosensor nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei der erste Filter (4, 104, 204, 304) nicht in Kontakt mit dem Elektrodensystem ist.
Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei wenigstens ein Teil des ersten Filters (4, 104, 204, 304) in Kontakt mit der isolierenden Grundplatte (1, 101, 201, 301) ist.
Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der erste Filter (4, 104, 204, 304) mit einem Polyvinylalkohol, Ethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Carboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Gelatine, Agarose, Polyacrylsäure und den Salzen davon, Stärke und den Derivaten davon, Polymere von Maleinsäureanhydrid und den Salzen davon, Polyacrylamid, Methacrylatharz, oder Poly-2-hydroxyethylmethacrylat beschichtet ist.
Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Reaktionsschicht (18a, 18b, 118a, 118b, 218a, 218b, 318a, 318b) ein Reagenziensystem für den Nachweis des Gesamtcholesterins enthält.
Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der erste Filter (4, 104, 204, 304) aus einem Membranfilter mit einer gleichmäßigen Porengröße in der Form einer Membran aufgebaut ist.
Biosensor nach Anspruch 7, wobei eine hydrophile Schicht zwischen dem ersten Filter (4, 104, 204, 304) und der Grundplatte vorgesehen ist.
Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 8, der ferner einen zweiten Filter (326) zwischen dem ersten Filter (4, 104, 204, 304) und dem Probenlösungszufuhrweg umfasst.
Biosensor nach Anspruch 9, wobei die mittlere Porengröße des ersten Filters (4, 104, 204, 304) kleiner als die mittlere Porengröße des zweiten Filters ist.
Biosensor nach Anspruch 9 oder 10, wobei der zweite Filter (326) ein Tiefenfilter ist.
Biosensor nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei der erste Filter (4, 104, 204, 304) in Kontakt mit dem zweiten Filter ist.
Biosensor nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei der zweite Filter (326) in Kontakt mit dem Einlass (7, 107, 207, 307) des Probenlösungszufuhrweges ist.
Biosensor nach einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei der zweite Filter (326) nicht in Kontakt mit dem Elektrodensystem ist.
Biosensor nach einem der Ansprüche 9 bis 14, wobei der erste Filter (4, 104, 204, 304) und/oder der zweite Filter (326) ein Reagenz enthält für die Unterdrückung einer Reaktion zwischen der Oxidoreduktase und dem Cholesterin, das in einem Lipoprotein mit hoher Dichte, Lipoprotein mit geringer Dichte und Lipoprotein mit sehr geringer Dichte in der Probenlösung enthalten ist.