DE60207740T2

DE60207740T2 - Muteine von menschlichem mit neutrophiler Gelatinase-assoziiertem Lipocalin und damit verwandte Proteine

Info

Publication number: DE60207740T2
Application number: DE60207740T
Authority: DE
Inventors: Arne Skerra; Steffen Schlehuber
Original assignee: Pieris Proteolab AG
Current assignee: Pieris Proteolab AG
Priority date: 2001-09-27
Filing date: 2002-09-18
Publication date: 2006-08-10
Anticipated expiration: 2022-09-19
Also published as: CN1561394A; ATE311451T1; BRPI0212919B8; CA2461571A1; ES2253561T3; CN1325644C; DE60207740D1; WO2003029463A3; EP1430131A2; JP4396923B2; EP1430131B1; US7252998B2; WO2003029463A2; US20060088908A1; JP2005503829A; WO2003029462A1; AU2002337111B2; BR0212919A; CA2461571C; HK1067145A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Generierung eines Muteins des humanen neutrophilen gelatinase-assoziierten Lipocalins (hNGAL), des Ratten α₂-mikroglobulin-verwandten Proteins (A2m) oder des Maus 24p3/Uterocalins (24p3), wobei dieses Mutein eine detektierbare Affinität für ein gegebenes Target aufweist, sowie ein Mutein für jedes dieser drei Proteine, das durch dieses Verfahren erhältlich ist. Die Erfindung betrifft ferner Nukleinsäuren, die solche Muteine kodieren, eine pharmazeutischen Zusammensetzung, die ein Mutein der Erfindung umfasst, sowie verschiedene Verwendungen des Muteins des humanen neutrophilen gelatinase-assoziierten Lipocalins, des Ratten α₂-mikroglobulin-verwandten Proteins (A2m) und des Maus 24p3/Uterocalins (24p3).
Die Lipocaline (Pervaiz and Brew, FASEB J. 1 (1987), 209-214) sind eine Familie kleiner, oft monomerer sekretorischer Proteine, die aus verschiedenen Organismen isoliert wurden, und deren physiologische Rolle in der Speicherung oder im Transport verschiedener Targets liegt, zum Beispiel Retinol oder Pheromone, sowie in komplexeren biologischen Funktionen, wie zum Beispiel Geschmack und Geruch oder die Prostaglandinsynthese (Übersichtsartikel zum Beispiel von Flower, Biochem. J. 318 (1996), 1-14). Die Lipocaline zeigen eine relativ geringe wechselseitige Sequenzähnlichkeit, und ihre Verwandtschaft als strukturelle Proteinfamilie wurde zunächst mittels Röntgenstrukturanalyse aufgeklärt (Sawyer et al., Nature 327 (1987), 659).
Typische Targets von Lipocalinen sind lipophile Substanzen mit geringem Molekulargewicht, wie zum Beispiel Retinoide, Fettsäuren, Cholesterine, Prostaglandine, Biliverdine, Pheromone, Geschmacksstoffe und Geruchsstoffe (Flower, Biochem. J. 318 (1996), 1-14; siehe auch Kjeldsen, Biochimica et Biophysica Acta, 1482 (2000), 272-283). Ein typisches Tatget für Lipocaline ist Vitamin A im Falle des Retinol- Bindeproteins (Rbp) sowie β-Laktoglobulin (Papiz et al., Nature 324 (19986), 383-385).
Antikörper, i.e. Immunoglobuline, sind ein klassisches Beispiel für Proteine, die Targets über eine nicht-kovalente Interaktion selektiv binden. Diese Proteine spielen eine kritische Rolle als Reagenzien auf den Gebieten der Biotechnologie, der Medizin und der Bioanalytik sowie in den biologischen und den Lebenswissenschaften im Allgemeinen. Trotz des mannigfachen Bedarfs für Bindeproteine in Verbindung mit der Erkennung, Bindung oder Trennung von Liganden/Targets werden gegenwärtig beinage ausschließlich Immunglobuline für solche Zwecke verwendet. Die Anwendung anderer Proteine mit definierten Ligandenbindungseigenschaften, zum Beispiel die Lektine, blieb auf bestimmte Fälle beschränkt.
Vor kurzem wurden Mitglieder der Lipocalinfamilie Forschungsobjekt betreffend Proteine, die definierte Ligandenbindungseigenschaften aufweisen. Die Deutsche Offenlegungsschrift DE 197 42 706 sowie die Internationale Patentpublikation WO 99/16873 offenbaren die Klasse der Anticaline^®, Polypeptide, die ähnlich Antikörpern spezifische Bindungscharakteristika für einen gegebenen Liganden zeigen (vergleiche auch Beste et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96 (1999) 1898-1903). Anticaline^® sind ausgehend von Polypeptiden der Lipocalinfamilie erhältlich, welche an den vier Segmenten mutiert werden, die den Sequenzpositionen der linearen Polypeptidsequenz entsprechen, welche die Aminosäurepositionen 28 bis 45, 58 bis 69, 86 bis 99 und 114 bis 129 des Bilin-Bindeproteins (Bbp) umfassen.
Zusätzlich beschreiben das Deutsche Patent DE 119 26 068 , WO 00/75303 sowie Schlehuber et al., J. Mol. Biol. (2000), 1105-1120, Muteine des Bilin-Bindeproteins, wie zum Beispiel die Muteine DigA und DigA16, die spezifisch Digoxigenin binden.
Obwohl die Anticalin^® Technologie prinzipiell etabliert wurde und in den oben beschriebenen digoxigenin-bindenden Bbp-Muteinen vermutlich eine vielversprechende praktische Anwendung ergeben hat, sind weitere Verbesserungen und praktische Anwendungen wünschenswert. Im Hinblick auf die verschiedenen potentiellen Anwendungen für liganden- oder target-bindende Proteine auf dem Gebiet der Lebenswissenschaften wäre die Generierung von Anticalinen^® basierend auf alternativen Lipocalin-Gerüstproteinen (Scaffolds) allein aus dem Grund wünschenswert, um mehr Optionen für die praktische Realisierung zu haben.
Demzufolge ist es ein Ziel der Erfindung, alternative Lipocalinmuteine bereitzustellen, die Bindungsaffinität für ein gegebenes Target aufweisen.
Dieses Ziel wird durch das Verfahren und die Muteine mit den Merkmalen der vorliegenden unabhängigen Ansprüche gelöst.
Solch ein Verfahren ist ein Verfahren zum Generieren eines Muteins eines Proteins, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus den humanen neutrophilen gelatinase-assoziierten Lipocalin (hNGAL), dem Ratten α₂-mikroglobulin-verwandten Protein (A2m) und dem Maus 24p3/Uterocalin (24p3) besteht, wobei das Mutein einen detektierbare Affinität für ein gegebenes Target aufweist, das den Schritt (a) umfasst, nämlich das Protein einer Mutagenese an einer oder mehreren der Sequenzpositionen zu unterziehen, die den Sequenzpositionen 40 bis 50, 70 bis 79, 101 bis 103 und 125 bis 132 von hNGAL entsprechen, was in einem oder mehreren Mutein(en) des Proteins resultiert.
Das Verfahren umfasst vorzugsweise einen weiteren Schritt (b), nämlich mindestens eines der resultierenden Muteine mit Bindungsaffinität für ein gegebenes Target aus dem einen oder den mehreren Mutein(en) durch Selektion anzureichern und/oder das mindestens eine Mutein zu isolieren. Vorzugsweise resultiert die Mutagenese in einer Mehrzahl von Muteinen des Proteins, i.e. zwei oder mehr Muteine.
Das heißt, dass die vorliegende Erfindung auf der Entdeckung basiert, dass das humane neutrophile gelatinase-assoziierte Lipocalin (hNGAL) und dessen homologe Proteine aus der Ratte (A2m) und der Maus (24p3) geeignete Gerüstproteine zur Generierung von Proteinen bereitstellen, welche Bindungsaffinität für ein bestimmtes Target von Interesse aufweisen. hNGAL wurde als Mitglied der Lipcalinfamilie identifiziert, seine korrespondierende cDNA wurde kloniert (Bundgaard et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 202 (1994), 1468-1475), und seine dreidimensionale Struktur wurde mittels NMR (Coles et al., J. Mol. Biol. 289 (1999), 139-157) sowie mittels Röntgenkristallographie (Goetz et al., Biochemistry, 39 (2000), 1935-1941) gelöst, aber bis jetzt wurden weder seine physiologische Funktion noch sein natürliches Target zweifelsfrei identifiziert (Kjeldsen et al., supra). Demzufolge stellt die vorliegende Erfindung erstmals eine mögliche praktische Anwendung nicht nur für hNGAL, sondern auch für seine Homologe A2m und 24p3 bereit.
Die Aminosäurepositionen in den Proteinen A2m und 24p3, die in dem Verfahren gemäß der Erfindung einer Mutagenese unterzogen werden, werden aus einem Alignment der Aminosäuresequenzen von hNGAL, A2m und 24p3 erhalten. Im Protein A2m, das die gleiche Anzahl an Aminosäureresten (178) aufweist wie hNGAL, sind die für die Mutaganese verwendeten Sequenzpositionen identisch zu den in hNGAL ausgewählten Positionen, nämlich die Sequenzpositionen 40 bis 50, 70 bis 79, 101 bis 103 und 125 bis 132 von hNGAL. Für 24p3 sind die korrespondierenden Sequenzpositionen die Sequenzpositionen 40 bis 50, 70 bis 79, 103 bis 105 und 127 bis 134. Folglich sind die Aminosäurepositionen, die einer Mutagenese unterzogen werden, über die vier Sequenzsegmente verteilt, die den vier Schleifen in der dreidimensionalen Struktur von hNGAL, A2m und 24p3 entsprechen.
Die Anzahl der oben definierten Segmente (Schleifen), die für die Mutagenese verwendet werden, kann variieren. Es ist nicht notwendig, alle vier dieser Schleifen zusammen, zum Beispiel in einer konzertierten Mutagenese zu mutieren, sondern es ist ebenfalls möglich, nur zwei oder drei der Schleifen einer Mutagenese zu unterziehen, um ein Mutein mit detektierbarer Affinität für ein gegebenes Target zu generieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird das entsprechende Protein an einer oder mehreren der Sequenzpositionen einer Mutagense unterzogen, die den Sequenzpositionen 40, 42, 44, 46, 47, 49, 50, 70, 72, 73, 77, 79, 101, 102, 103, 125, 127, 128, 130, und 132 von hNGAL entsprechen.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen werden mindestens 10, noch bevorzugter mindestens 15 der Sequenzpositionen 40, 42, 44, 46, 47, 49, 50, 70, 72, 73, 77, 79, 101, 102, 103, 125, 127, 128, 130, und 132 von hNGAL oder A2m oder der korrespondierenden Positionen von 24p3 einer Mutagenese unterzogen. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform werden alle 20 dieser Sequenzpositionen verzufälligt (randomized), wobei es bevorzugt wird, den Einbau aller 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren in die Polypeptidsequenzen an diesen Positionen zu ermöglichen.
Das heißt, dass die vorliegende Erfindung auf dem Befund basiert, dass Muteine von hNGAL oder seiner Homologe A2m und 24p3, welche eine detektierbare Affinität für ein gegebenes Target aufweisen, durch Mutagenese, vorzugsweise durch Zufallsmutagenese, von insgesamt 20 Aminosäureresten erhalten werden können, nämlich den Sequenzpositionen 40, 42, 44, 46, 47, 49, 50, 70, 72, 73, 77, 79, 101, 102, 103, 125, 127, 128, 130 und 132 von hNGAL. Dieser Befund ist aus mehreren Gründen besonders überraschend.
Wie bereits angemerkt, wird in dieser bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung ein Satz von insgesamt 20 Aminosäuren verzufälligt, i.e. einer Mutagese unterzogen, während in WO 99/16873 insgesamt nur 16 Aminosäuren mutiert wurden. Wenn eine NNS oder NNK Codon-Zufallsmutagense für die vollständige Verzufälligung dieser 20 Aminosäurepositionen verwendet wird (i.e. jede der 20 natürlichen Aminosäuren ist an jeder dieser 20 ausgewählten Positionen möglich), existieren 32²⁰ mögliche Codon-Kombinationen. Falls 16 Aminosäurepositionen für die Verzufälligung verwendet werden, existieren 32¹⁶ mögliche Codon-Kombinationen. Demzufolge hat eine Erhöhung der Anzahl von Aminosäuren, die einer Zufallsmutagenese unterzogen werden, um 4 (von 16 auf 20) einen Anstieg von 32⁴ ≈ 10⁶ in der kombinatorischen Komplexität zur Folge. Die Anzahl an Mutanten, die physikalisch in der korrespondierenden DNA-basierten Bibliothek realisiert werden können, kann jedoch aufgrund experimenteller Beschränkungen nicht fortlaufend erhöht werden und ist entsprechend dem Stand der Technik (Fritzgerald, Drug Discov. Today 5 (2000), 253-258) üblicherweise auf einen Wert von etwa 1 × 10⁹ bis 1 × 10¹⁰ beschränkt. In einem Beispiel der vorliegenden Erfindung wurde eine kombinatorische DNA-basierte Bibliothek mit gerade einmal annähernd 1 × 10⁷ Sequenzvarianten (Muteinen) verwendet.
Berücksichtigt man, dass kleine zugängliche Teil des kombinatorischen Sequenzbereichs nochmals um einen Faktor von annähernd 10⁶ reduziert ist, ist es überraschend, dass es überhaupt möglich ist, aus einer kombinatorischen Bibliothek mit gerade einmal 1 × 10⁷ Sequenzvarianten solche Muteine von hNGAL (oder A2m oder 24p3) zu isolieren, die (a) sich nicht nur in lösliche Proteine falten, sondern die (b) sogar eine neue Liganden/Target-Spezifität aufweisen.
In dieser Hinsicht sollte angemerkt werden, dass der hier verwendete Ansatz im Gegensatz zu der Lehre der WO 99/16873 steht. Entsprechend dieser Referenz sollte es zweckmäßig sein, die Gesamtzahl der mutierten Aminosäurepositionen innerhalb eines einzelnen Experiments so gering wie möglich zu halten, sodass die Kollektion von Varianten, die durch Mutagenese erhalten wird, i.e. die Bibliothek, in ihrer Gesamtheit oder zumindest in einer repräsentativen Auswahl davon so vollständig wie möglich realisiert werden kann.
Schließlich sollte angemerkt werden, dass es ebenfalls überraschend ist, dass der vorliegende Ansatz erfolgreich für die Herstellung eines Muteins verwendet werden kann, das eine spezifische Bindungsaktivität gegenüber einem Proteinepitop aufweist (vergleiche zum Beispiel die Beispiele 5 und 15).
Die vorliegenden Erfindung betrifft ferner ein Mutein des humanen neutrophilen gelatinase-assoziierten Lipocalins, des Ratten α₂-mikroglobulin-verwandten Proteins (A2m) oder des Maus 24p3/Uterocalins (24p3), das detektierbare Affinität für ein gegebenes Target aufweist, und das durch Mutagenese des entsprechenden Proteins an den Sequenzpositionen erhältlich ist, welche den Sequenzpositionen 40 bis 50, 70 bis 79, 101 bis 103 und 125 bis 132 von hNGAL entsprechen.
Vorzugsweise trägt ein solches Mutein eine Aminosäuresubstitution an 5 bis 10, noch bevorzugter an 8 bis 12 oder am meisten bevorzugt an 10 bis 18 oder an 10 bis 20 der ausgewählten 20 Sequenzpositionen.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist das Mutein die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 12 auf. Diese Mutein wird auch als TlpcA bezeichnet.
Die Muteine der Erfindung sind in der Lage, das gewünschte Target mit einer detektierbaren Affinität zu binden, i.e. mit einer Affinitätskonstante von vorzugsweise mindestens 105 M^–1. Geringere Affinitäten als dieser Wert sind in Allgemeinen mit herkömmlichen Verfahren, wie zum Beispiel ELISA, nicht länger messbar, und sind daher für praktische Anwendungen von sekundärer Bedeutung. Besonders bevorzugt sind Muteine, welche das gewünschte Target mit einer Affinität von mindestens 10⁶ M^–1 binden, was einer Dissoziationskonstante für den Komplex von 1 μM entspricht. Die Bindungsaffinität eines Muteins für das gewünschte Target kann von Fachleuten durch eine Vielzahl von Verfahren gemessen werden, zum Beispiel durch Fluoreszenztitration, durch Kompetitions-ELISA oder durch die Technik der Oberflächenplasmonresonanz.
Das Target (der Ligand), das durch das Mutein gebunden wird, kann eine beliebige chemische Einheit sein, die zum Beispiel ebenfalls durch ein Immunglobulin erkannt und gebunden werden kann. Demzufolge kann das Target eine chemische Verbindung in freier oder in konjugierter Form sein, die zum Beispiel Merkmale eines Haptens, eines Hormons, wie zum Beispiel Steroidhormone, oder eines beliebiges Biopolymers oder eines Fragments davon, eines Peptids, eines Proteins oder einer Proteindomäne, eines Peptids, eines Oligodeoxynukleotids, einer Nukleinsäure, von Oligo- und Polysacchariden oder anderer Makromoleküle oder Konjugate davon zeigt. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Target ein Protein.
Die Muteine der Erfindung können außerhalb der mutierten Segmente, i.e. der Regionen der Aminosäurepositionen 40 bis 50, 70 bis 79, 101 bis 103 und 125 bis 132 im Falle von hNGAL, die natürliche Aminosäuresequenz von hNGAL, A2m oder 24p3 aufweisen. Auf der anderen Seite können die hier offenbarten Muteine auch Aminosäuremutationen außerhalb der Positionen aufweisen, die einer Mutagenese im Vergleich zum Wildtypprotein unterzogen werden, solange diese Mutationen nicht mit der Bindungsaktivität und der Faltung des Muteins interferieren. Dies schließt ein, dass zum Beispiel Mutationen, Substitutionen, Deletionen oder Insertionen von Aminosäureresten sowie N- und/oder C-terminale Additionen in die natürliche Aminosäuresequenz von hNGAL, A2m oder 24p3 eingeführt werden können.
Solche Modifikationen der Aminosäuresequenz des ausgewählten Proteins innerhalb oder außerhalb der ausgewählten Bindungsregion umfassen die direkte Mutagenese einzelner Aminosäurepositionen, zum Beispiel um die Subklonierung des mutierten Lipocalingens oder seiner Teile durch das Einführen von Schnittstellen für bestimmte Restriktionsenzyme zu vereinfachen. Beispielsweise kann die Mutation von Glu28 zu His und/oder von Thr145 zu Ala in das hNGAL-Gen eingeführt werden, um die Klonierung des mutierten Gensegments über zwei neue BstXI Restriktionsschnittstellen an diesen Positionen zu vereinfachen. Weiterhin können Mutationen innerhalb oder außerhalb der vier Peptidschleifen eingeführt werden, um bestimmte Eigenschaften des Muteins des als Gerüst ausgewählten Proteins zu verbessern, zum Beispiel seine Faltungsstabilität oder Faltungseffizienz oder seine Resistenz gegenüber Proteasen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist zum Beispiel Cys87 von hNGAL gegen Ser oder Ala ausgetauscht, wodurch sein kovalentes Crosslinking mit anderen Proteinen, wie zum Beispiel Gelatinase B, (was in in vivo Applikationen eines Muteins vorkommen kann) verhindert und seine monomere Struktur stabilisiert werden kann. In ähnlicher Weise sind Cys Reste, die als Ergebnis der Mutagenese und Selektion des Muteins der Erfindung vorkommen können, nicht immer kritisch für die Bindung des gegebenen Target und können durch Ser oder Ala substituiert werden, um die Ausbildung einer kovalenten Bindung oder die Oxydation der Thiol-Gruppe zu verhindern.
In einem bevorzugten Mutein von hNGAL ist Cys87 substituiert und/oder das Mutein trägt eine oder beide der Aminosäuresubstitutionen Glu(28) → His bzw. Thr(145) → Ala verglichen mit hNGAL. In dieser Hinsicht sollte angemerkt werden, dass die vorliegende Erfindung auch ein (rekombinantes) hNGAL betrifft, das die natürlichen Aminosäuresequenzen aufweist, in dem nur Cys87 gegen eine andere geeignete Aminosäure ausgetauscht wurde. Dieses hNGAL Polypeptid kann unter Verwendung der hier für die Erzeugung der anderen Muteine der Erfindung (siehe Beispiel 4) beschriebenen Verfahren erzeugt werden, zum Beispiel unter Verwendung des Vektors phNGAL7.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst vorzugsweise (in Schritt (b)): (i) Bereitstellen einer Verbindung als vorgegebenes Target, die aus der Gruppe ausgewählt wird, welche aus einer chemischen Verbindung in freier oder in konjugierter Form besteht, und die Merkmale eines immunologischen Haptens, eines Peptids, eines Proteins oder eines anderen Makromoleküls zeigt, (ii) Inkontaktbringen der Mehrzahl von Muteinen mit dem Target, um die Bildung von Komplexen zwischen dem Target und den Muteinen mit Bindungsaffinität für das Target zu ermöglichen, und (iii) Entfernen der Muteine, die keine oder keine wesentliche Bindungsaffinität aufweisen.
Keine oder keine wesentliche Bindungsaffinität bedeutet unter den verwendeten Bedingungen, dass zwischen dem Target und der Mehrzahl von Muteinen, die mit dem Target in Kontakt gebracht werden, kein Komplex gebildet wird. Für den Fachmann ist klar, dass die Komplexbildung von vielen Faktoren abhängig ist, wie zum Beispiel der Konzentration der Bindungspartner, der Konzentration von Verbindungen, die als Kompetitoren fungieren, der Ionenstärke der Puffer etc.. Die Selektion und Anreicherung wird im Allgemeinen unter Bedingungen durchgeführt, welche die Isolation und Anreicherung von Muteinen ermöglichen, die eine Affinitätskonstante für das Target von mindestens 105 M^–1 aufweisen. Die Wasch- und Elutionsschritte können jedoch unter variierender Stringenz durchgeführt werden. Falls zum Beispiel Muteine mit einer Affinitätskonstante von mindestens 106 M^–1 zu isolieren sind, können die Waschschritte und die Elution mit erhöhter Stringenz durchgeführt werden, i.e. unter stringenteren Bedingungen. Eine Selektion im Hinblick auf die kinetischen Charakteristika ist ebenfalls möglich. Die Selektion kann zum Beispiel unter Bedingungen durchgeführt werden, die eine Komplexbildung des Targets mit Muteinen begünstigen, welche eine langsame Dissoziation vom Target (Rezeptor) zeigen, oder in anderen Worten eine geringe k_off-Rate.
Der Begriff "Mehrzahl", wie hier verwendet, bedeutet, dass mindestens zwei Muteine vorliegen, die voneinander in ihren Aminosäuresequenzen differieren. Das obere Limit von Muteinen, die durch Mutagenese generiert werden, ist üblicherweise durch die experimentellen Bedingungen beschränkt und liegt im Allgemeinen zwischen 10⁷ und 10¹².
Der Begriff "Mutagenese", wie hier verwendet, bedeutet, dass die experimentellen Bedingungen so gewählt werden, dass die natürlich vorkommende Aminosäure an einer Sequenzposition von hNGAL, A2m oder 24p3 durch mindestens eine Aminosäure substituiert werden kann, die an dieser spezifischen Position in der entsprechenden natürliche Polypeptidsequenz nicht vorliegt. Der Begriff "Mutagenese" schließt ferner ein, die Länge von Sequenzsegmenten durch Deletion oder Insertion von einer oder mehreren Aminosäuren (zusätzlich) zu modifizieren. Das heißt, es liegt innerhalb des Umfangs der Erfindung, dass zum Beispiel eine Aminosäure an einer ausgewählten Sequenzposition durch eine Strecke von drei zufälligen Mutationen ersetzt wird, was zu einer Insertion von zwei Aminosäureresten im Vergleich zur Länge des (entsprechenden Segments) des Wildtypproteins führt. Der Begriff "Zufallsmutagenese" bedeutet, dass keine vorherbestimmte einzelne Aminosäure (Mutation) an einer bestimmten Sequenzposition vorliegt, sondern dass während der Mutagenese mit einer bestimmten Wahrscheinlichkeit mindestens zwei Aminosäuren in eine ausgewählte Sequenzposition eingebracht werden können.
Solche experimentellen Bedingungen können zum Beispiel durch den Einbau von Codons mit einer degenerierten Basenzusammensetzung in das Strukturgen, etwa für hNGAL, an die Positionen erreicht werden, die mutiert werden sollen. Beispielsweise ermöglicht die Verwendung des Codons NNK oder NNS den Einbau aller 20 Aminosäuren plus dem Amber Stop-Codon während der Mutagenese, während das Codon VVS die Anzahl möglicher eingebauter Aminosäuren auf 14 beschränkt, da es die Aminosäuren Cys, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr und Val vom Einbau an die ausgewählte Position der Polypeptidsequenz ausschließt. Die Verwendung des Codons NMS beschränkt zum Beispiel die Anzahl möglicher Aminosäuren an einer ausgewählten Sequenzposition auf 11, da es die Aminosäuren Arg, Cys, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Trp und Val vom Einbau an einer ausgewählten Sequenzposition ausschließt. In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung wird eine Zufallsmutagenese durchgeführt, bei der es ermöglicht wird, dass mindestens 4, vorzugsweise 6, noch bevorzugter 8 bis 12 oder 8 bis 15 Aminosäuren an eine ausgewählte Sequenzposition von hNGAL, A2m oder 24p3 eingebaut werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird mindestens eine Sequenzposition einer vollständigen Zufallsmutagenese unterzogen, i.e. es wird ermöglicht, dass alle 20 Aminosäuren an dieser Position während der Mutagenese eingebaut werden. Aus dem oben Gesagten wird ebenfalls klar, dass die an einer bestimmten Sequenzposition natürlicherweise vorliegende Aminosäure des entsprechenden Proteins, wie zum Beispiel hNGAL, ebenfalls im Mutein vorliegen kann, nachdem diese Position einer Mutagenese unterzogen wurde.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung ist das Target ein Protein. Für die Selektion von Muteinen kann das Protein entweder in freier oder in konjugierter Form oder als Fusionsprotein bereitgestellt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung wird eine Nukleinsäure verwendet, die für die Mehrzahl von Muteinen des entsprechenden Proteins kodiert, welches aus hNGAL, A2m und 24p3 ausgewählt wird. Diese Nukleinsäure resultiert aus der Mutagenese, und sie ist am 3'-Ende operativ mit einem Gen fusioniert, das für das Hüllprotein pIII eines filamentösen Bakteriophagen der M13 Familie oder für ein Fragment dieses Hüllprotiens kodiert, um mindestens ein Mutein zur Bindung des gegebenen Targets zu selektieren.
Die Nukleinsäure, die aus der Mutagenese resultiert, kann unter Verwendung von PCR erhalten werden. In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung umfasst die Generierung der Nukleinsäure, die für die mutierten Segmente des entsprechenden Proteins kodiert, die folgenden beiden Schritte. Erstens, zwei Nukleinsäurefragmente, von denen ein jedes für einen Teil des mutierten Proteins kodiert, werden mittels PCR generiert, sodass diese Fragmente partiell überlappen. Diese Fragmente werden mit zwei flankierenden Primern in einem zweiten Amplifikationsschritt verwendet, um die Nukleinsäure zu erhalten, welche das vollständige mutierte Strukturgen umfasst (siehe 2 und Beispiel 1, welche dieses Zweischrittverfahren veranschaulichen). Aufgrund des überlappenden Bereichs wird das vollständige PCR-Produkt im Laufe dieser Reaktion amplifiziert, ohne dass die Zugabe einer beliebigen zusätzlichen Nukleinsäure erforderlich ist. Die beiden Fragmente können mit einem Paar oder mit Paaren geeigneter Primer in zwei separaten Amplifikationsreaktionen erhalten werden (siehe auch 2 und Beispiel 1, die zeigen, dass zwei derartige Fragmente in den PCR Reaktionen A und B generiert werden können).
Für einige Anwendungen ist es zweckmäßig, das erfindungsgemäße Mutein von hNGAL, A2m oder 24p3 in markierter Form zu verwenden. Demzufolge betrifft die Erfindung ferner ein Mutein eines jeden der drei Proteine, die hier als Gerüst verwendet werden, das mit einer Markierung konjugiert ist, die aus der Gruppe ausgewählt wird, welche aus einer Enzymmarkierung, einer radioaktiven Markierung, einer fluoreszierenden Markierung, einer chromogenen Markierung, einer lumineszierenden Markierung, einem Hapten, Biotin, Digoxigenin, Metallkomplexen, Metallen und kolloidalem Gold besteht. Das Mutein kann ferner mit einem organischen Molekül konjugiert sein. Der Begriff "organisches Molekül", wie in der vorliegenden Anwendung verwendet, bedeutet vorzugsweise ein organisches Molekül, das mindestens zwei Kohlenstoffatome umfasst, aber nicht mehr als 7 drehbare Kohlenstoffbindungen, das ein Molekulargewicht zwischen 100 und 2000 Dalton aufweist, vorzugsweise 1000 Dalton, und ein Molekül einschließlich eines oder zweier Metallatome.
Im Allgemeinen ist es möglich, das Mutein mit jeder geeigneten chemischen Substanz oder jedem Enzym zu markieren, die/das direkt oder indirekt in einer chemischen, enzymatischen oder physikalischen Reaktion eine detektierbare Verbindung oder ein Signal erzeugt, das für die Detektion verwendet werden kann. Ein Beispiel für eine physikalische Reaktion ist die Emission von Fluoreszenz nach Anregung mit Strahlung oder die Emission von Röntgenstrahlen durch eine radioaktive Markierung. Alkalische Phosphatase, Meerrettichperoxidase oder β-Galactosidase sind Beispiele für Enzymmarkierungen, welche die Bildung von chromogenen (gefärbten) Verbindungen katalysieren, die im Anschluss detektiert werden können. Im Allgemeinen können alle Markierungen, die für Antikörper verwendet werden, ausgenommen diejenigen, die ausschließlich mit dem Zuckeranteil im Fc-Teil von Immunglobulinen verwendet werden, ebenfalls für die Konjugation der Muteine der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Diese Konjugate können mit Hilfe von Verfahren hergestellt werden, die Fachleuten bekannt sind.
Eine Option, die besonders vorteilhaft für praktische Anwendungen der hier offenbarten Muteine ist, ist die Verwendung der Muteine in Form von Fusionsproteinen. In bevorzugten Ausführungsformen solch eines Fusionsproteins ist ein Enzym, ein Protein oder eine Proteindomäne, ein Peptid, zum Beispiel ein Peptid wie etwa eine Signalsequenz und/oder ein Affinitätstag, operativ an den Amino-Terminus oder den Carboxy-Terminus der Muteins fusioniert.
Der Fusionspartner kann geeignet sein, neue Eigenschaften auf das Mutein zu übertragen, zum Beispiel enzymatische Aktivität oder Affinität für andere Moleküle, wie zum Beispiel Proteine, Makromoleküle oder Targets mit geringem Molekulargewicht. Beispielsweise sind Fusionen mit Enzymen möglich, die chromogene oder fluorogene Reaktionen katalysieren (zum Beispiel alkalische Phosphatase, Meerrettichperoxidase, Gluthadion-S-Transferase) oder die zur Freisetzung cytotoxischer Agenzien dienen können. Weitere Beispiels für Fusionspartner, die in der Praxis vorteilhaft sein können, sind Bindedomänen, wie zum Beispiel die albumin-bindende Dömane von Protein G, Protein A, Antikörperfragmente, oligomerisierende Domänen, Toxine oder auch Muteine der Erfindung oder Anticaline^® mit einer unterschiedlichen oder der gleichen Targetspezifität. Ein spezifisches Beispiel für Letztere würde ein Fusionsprotein sein, das ein hNGAL Mutein der vorliegenden Erfindung und das im Deutschen Patent DE 199 26 068 offenbarte digoxigenin-bindende Mutein DigA16 umfasst. Weitere Beispiele für bevorzugte Fusionspartner sind Affinitätstags, wie zum Beispiel das Strep-Tag^® oder das Strep-Tag^® II (Schmidt et al., J. Mol. Biol. 225 (1996), 753-766) oder Oligohistidin-Tags (zum Beispiel His6-Tags), oder Proteine, wie zum Beispiel die Glutathione-S-Transferase, die zur Reinigung mittels Affinitätschromatographie und/oder zur Detektion (zum Beispiel unter Verwendung der spezifischen Affinität des Strep-Tags^® für Streptavidin) verwendet werden können. Proteine mit chromogenen oder fluoreszierenden Eigenschaften, wie zum Beispiel das Grün Fluoreszierende Protein (GFP) sind ebenfalls geeignete Fusionspartner.
Der Begriff "Fusionsprotein", wie hier verwendet, umfasst ferner die Muteine der Erfindung, zum Beispiel Muteine von hNGAL, die mit einer Signalsequenz ausgestattet sind. Signalsequenzen am N-Terminius eines Polypeptids gemäß der Erfindung können geeignet sein, das Polypeptid während der Biosynthese in ein spezifisches Zellkompartiment zu steuern, zum Beispiel in das Periplasma von E. coli oder das Lumen eukaryontischer Zelle oder in das Medium, das die Zelle umgibt. Wenn dies geschieht, wird die Signalsequenz durch eine Signalpeptidase abgespalten. Es ist ebenfalls möglich, andere Targeting- oder Signalsequenzen zu verwenden, die notwendigerweise am N-Terminus des Polypeptids lokalisiert sind, und welche dadurch die Lokalisation in spezifischen Zellkompartimenten ermöglichen. Eine bevorzugte Signalsequenz für die Sekretion in das Periplasma von E. coli ist die OmpA-Signalsequenz. Eine große Anzahl weiterer Signalsequenzen ist im Stand der Technik bekannt.
Die Erfindung betrifft ferner ein Nukleinsäuremolekül, das eine Sequenz umfasst, welche ein Mutein gemäß der Erfindung oder ein Fusionsprotein davon kodiert. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz, die das Mutein von SEQ ID NO: 12 kodiert.
Da die Degeneriertheit des genetischen Codes Substitutionen bestimmter Codons durch andere Codons erlaubt, welche die gleiche Aminosäure spezifizieren, und dadurch das gleiche Protein ergeben, ist die Erfindung nicht auf ein spezifisches Nukleinsäuremolekül beschränkt, sondern umfasst alle Nukleinsäuremoleküle, die eine Nukleotidsequenz umfassen, die ein Mutein mit der Aminosäuresequenz gemäß der vorliegenden Erfindung kodiert.
Das Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die ein Mutein von hNGAL, A2m oder 24p3 kodiert, wie hier offenbart, kann operativ mit einer regulatorischen Sequenz verknüpft sein, um die Expression des Nukleinsäuremoleküls in einer Wirtszelle (in vivo) oder seine Transkription und Translation in einem zellfreien System (in vitro) zu ermöglichen.
Ein Nukleinsäuremolekül, wie zum Beispiel eine DNA, wird als "in der Lage zur Expression eines Nukleinsäuremoleküls oder einer kodierenden Nukleotidsequenz" oder in "in der Lage, die Expression einer Nukleotidsequenz zu ermöglichen" bezeichnet, falls sie Nukleotidsequenzen enthält, die transkriptionelle und translationelle Information enthalten, und falls solche Sequenzen "operativ" mit den Nukleotidsequenzen verknüpft sind, die das Polypeptid kodieren. Eine operative Verknüpfung ist eine Verknüpfung, bei der die regulatorischen DNA-Sequenzen und die zu exprimierenden DNA-Sequenzen in einer Weise verbunden sind, dass Genexpression ermöglicht wird. Die genaue Natur der regulatorischen Regionen und Elemente, die für die Genexpression notwendig sind, kann von Organismus zu Organismus variieren, sollte jedoch im Allgemeinen eine Promotorregion umfassen, die etwa in Prokaryonten sowohl die regulatorische Promotorsequenz enthält, welche eine in einer Zelle funktionelle transkriptionelle Region umfassen kann, sowie eine in einer Zelle funktionelle transkriptionelle Terminationsregion. Die zur Transkription oder Translation verwendeten Elemente sind Promotoren, Enhancer, Leadersequenzen, Transkriptionsinitiationsstellen und Transkriptionsterminationsstellen, Polyadenylierungssignale, ribosomale Bindungsstellen, wie zum Beispiel die Shine-Dalgano-Sequenz, und dergleichen. Diese regulatorischen Sequenzen und/oder das Mutein der Erfindung können Teil eines Vektors sein. Demzufolge betrifft die Erfindung ferner einen Vektor, der eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die für ein Mutein von hNGAL, A2m oder 24p3 kodiert, wie hier offenbart.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ferner ein Verfahren zur Erzeugung eines Muteins der Erfindung oder eines Fusionsproteins davon. Bei diesem Verfahren wird das Mutein oder Fusionsprotein ausgehend von der Nukleinsäure, die das Mutein kodiert, mittels gentechnischer Verfahren in einem bakteriellen oder eukaryontischen Wirtsorganismus erzeugt und aus diesem Wirtsorganismus oder seiner Kultur isoliert. Zu diesem Zweck wird eine geeignete Wirtszelle üblicherweise zunächst mit einem Vektor transformiert, der ein Nukleinsäuremolekül umfasst, das zum Beispiel ein hNGAL Mutein der Erfindung kodiert. Die Wirtszelle, die eine beliebige prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle sein kann, wird im Anschluss unter Bedingungen kultiviert, welche die Biosynthese des Polypeptids ermöglichen. Das Polypeptid wird anschließend üblicherweise entweder aus der Zelle oder aus dem Kulturmedium gewonnen. Da sowohl das humane neutrophile gelatinase-assoziierte Lipocalin, A2m als auch 24p3 jeweils eine strukturelle Disulfidbrücke enthalten, wird es bevorzugt, das Polypeptid mittels einer geeigneten Signalsequenz in ein Zellkompartiment zu dirigieren, das ein oxidierendes Thiol/Disulfid-Redoxmilieu aufweist. Solch ein oxidierendes Milieu liegt im Periplasma von Bakterien, wie zum Beispiel E. coli, oder im Lumen des endoplasmatischen Retikulums einer eukaryontischen Zelle vor und begünstigt die korrekte Ausbildung der Disulfidbindungen. Es ist jedoch ebenfalls möglich, ein Polypeptid der Erfindung im Cytosol einer Wirtszelle, vorzugsweise E. coli, zu erzeugen. In diesem Fall kann das Polypeptid beispielsweise in Form von Einschlusskörpern (inclusion bodies) erzeugt werden, gefolgt von der Renaturierung in vitro. Eine weitere Option ist die Verwendung spezifisch mutierter Stämme, die ein oxidierendes Milieu im Cytosol aufweisen, und dadurch die Produktion des nativen Proteins im Cytosol ermöglichen.
Wie aus der obigen Offenbarung ersichtlich kann das Mutein der vorliegenden Erfindung oder eine Fusion oder ein Konjugat davon in vielen Anwendungen verwendet werden. Im Allgemeinen kann ein hier offenbartes Mutein in allen Anwendungen verwendet werden, in denen Antikörper verwendet werden, ausgenommen in denjenigen mit einem spezifischen Bezug zur Glykosylierung des Fc-Teils.
Eine bevorzugte Verwendung des Muteins ist die Detektion eines Targets durch ein Mutein der Erfindung oder ein Fusionsprotein davon, das die Schritte umfasst: Inkontaktbringen des Muteins mit einer Probe, von der vermutet wird, dass sie das vorgegebene Target enthält, unter geeigneten Bedingungen, wodurch die Bildung eines Komplexes zwischen dem Mutein und dem gegebenen Target ermöglicht wird, und Bestimmen des komplexierten Muteins durch ein geeignetes Signal. Dieses Signal kann durch eine Markierung verursacht werden, wie zum Beispiel eine fluoreszierende oder chromogene Markierung, wie oben ausgeführt. Dieses Signal kann ferner durch eine Veränderung einer physikalischen Eigenschaft verursacht werden, die durch die Bindung, i.e. die Komplexbildung selbst, hergerufen wird. Ein Beispiel für solch eine Eigenschaft ist die Oberflächenplasmonresonanz, deren Wert während der Bindung der Bindungspartner verändert wird, von denen einer auf einer Oberfläche immobilisiert ist, wie zum Beispiel einer Goldfolie.
Wie oben angemerkt, können ein hier offenbartes Mutein und seine Derivate in vielen Gebieten ähnlich wie Antikörper oder deren Fragmente verwendet werden. Ein Mutein wird vorzugsweise zur Bindung an eine feste Phase verwendet, sodass das Target des Muteins oder ein Konjugat oder ein Fusionsprotein dieses Targets immobilisiert oder abgetrennt werden kann. Weiterhin bevorzugt ist die Verwendung des Muteins zur Markierung mit einem Enzym, einem Antikörper oder einer radioaktiven Substanz oder einer anderen Gruppe mit einer biochemischen Aktivität oder mit definierten Bindungseigenschaften, sodass das Target des Muteins oder ein Konjugat oder ein Fusionsprotein dieses Targets detektiert oder in Kontakt mit diesem gebracht werden kann. Die Muteine der Erfindung können zum Beispiel zur Detektion chemischer Strukturen mit Hilfe etablierter bioanalytischer Verfahren dienen, wie zum Beispiel ELISA oder Western-Blot, in der Mikroskopie oder in der Immunsensorik. Dabei kann das Detektionssignal entweder direkt durch Verwendung eines geeigneten Muteinkonjugats oder Fusionsproteins erzeugt werden oder indirekt durch Detektion des gebundenen Muteins mit Hilfe eines Antikörpers, der gegen dieses gerichtet ist, oder beispielsweise durch Verwendung eines Affinitätstags.
Zahlreiche mögliche Anwendungen für ein Mutein von hNGAL, A2m oder 24p3 gibt es auch in der Medizin. Zusätzlich zu seiner Verwendung in der Diagnostik kann ein mutiertes Polypeptid der Erfindung hergestellt werden, das zum Beispiel gewebe- oder tumorspezifische zelluläre Oberflächenmoleküle bindet. Solch ein Mutein kann beispielsweise in konjugierter Form oder als Fusionsprotein zum "Tumor Imaging" oder direkt zur Krebstherapie verwendet werden.
Eine weitere ähnliche und bevorzugte Verwendung eines hier beschriebenen Muteins ist die Targetvalidierung, i.e. die Untersuchung, ob ein Polypeptid, dessen Beteiligung an der Entwicklung einer Krankheit oder Fehlfunktion vermutet wird, tatsächlich auf irgendeine Weise ursächlich für die Krankheit oder Fehlfunktion ist. Diese Verwendung zur Validierung des Proteins als pharmakologisches Wirkstofftarget macht sich die Fähigkeit eines Muteins der vorliegenden Erfindung zunutzte, einen Oberflächenbereich eines Proteins in seiner nativen Konformation spezifisch zu erkennen, i.e. die Fähigkeit eines hier offenbarten Muteins, ein natives Epitop zu binden. In dieser Hinsicht sollte angemerkt werden, dass über diese Fähigkeit zur Bindung eines nativen Epitops nur für eine begrenzte Anzahl rekombinanter Antikörper berichtet wurde, unabhängig davon, ob diese durch das klassische Immunisierungsprotokoll von Köhler und Milstein (Nature 256 (1975), 495-497) oder durch kombinatorische Verfahren, wie zum Beispiel Phage Display, hergestellt wurden. Die Verwendung eines Muteins zur Validierung eines Wirkstofftargets umfasst nicht nur die Detektion eines Targets, das ein Protein darstellt, sondern auch die Detektion eines Targets, das eine Proteindomäne, ein Peptid, ein Nukleinsäuremolekül, ein organisches Molekül oder einen Metallkomplex darstellt.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Mutein des humanen neutrophilen gelatinase-assoziierten Lipocalins, des Ratten α₂-mikroglobulin-verwandten Proteins (A2m) oder des Maus 24p3/Uterocalins (24p3) gemäß der Erfindung oder ein Fusionsprotein davon und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Ein Mutein, zum Beispiel ein hNGAL Mutein, von pharmazeutischem Interesse kann beispielsweise ein Mutein sein, das Bindungsaffinität für tumorspezifische zelluläre Oberflächen aufweist. Es kann ferner ein Mutein sein, das einen spezifischen Wirkstoff bindet, und das als "Sustained Release" Form dieses Wirkstoffs oder als langfristiger Speicher des Wirkstoffs im Körper eines Patienten dient. Solch ein Mutein kann über einen beliebigen therapeutisch wirksamen Weg für ein proteinhaltiges Arzneimittel verabreicht werden, zum Beispiel parenteral, intranasal, rektal, buccal oder durch Inhalation über Sprays oder Aerosole in den Respirationstrakt. Die Administration kann über Formulierungen in Dosiseinheiten erfolgen, die je nach Wunsch konventionelle nicht-toxische pharmazeutisch annehmbare Träger, Adjuvanzien und Vehikel enthalten. Der Begriff "parenteral" umfasst Abgabemechanismen, wie zum Beispiel subkutane, intravenöse, intramuskuläre, intrasternale, intraarterielle Injektions- und Infusionstechniken. Aufgrund des geringen Molekulargewichts ist die Inhalation eine bevorzugte Art der Verabreichung eines pharmazeutisch verwendbaren Muteins der Erfindung.
Demzufolge kann das Mutein der vorliegenden Erfindung sowohl unter Verwendung bekannter pharmazeutisch akzeptabler Inhaltsstoffe als auch Herstellungsverfahren in Zusammensetzungen formuliert werden. Siehe zum Beispiel Remington et al., Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Pub., Easton (1975).
Für die Inhalation können die Muteine der Erfindung zunächst in eine besonders dispergierte Form gebracht werden. Dies kann durch Herstellung eines wässrigen Aerosols oder fester Partikel erreicht werden, welche das entsprechende Polypeptid enthalten. Üblicherweise wird ein wässriges Aerosol durch Formulierung einer wässrigen Lösung oder Suspension des gewünschten Polypeptids zusammen mit herkömmlichen pharmazeutisch annehmbaren Trägern und Stabilisatoren hergestellt. Die Träger und Stabilisatoren variieren in Abhängigkeit von den Erfordernissen für jedes Polypeptid. Sie könne nicht-ionische Surfactants umfassen (wie zum Beispiel Tweens, Pluronics oder Polyethylenglycol), harmlose Proteine wie Serumalbumin, Sorbitanester, Ölsäure, Lecithin, Aminosäuren, wie zum Beispiel Glycin, Puffer, Salze, Zucker oder Zuckeralkohole. Die Formulierungen können ferner bronchodilatative Agenzien umfassen. Die Formulierungen sind steril. Aerosole werden im Allgemeinen aus isotonischen Lösungen hergestellt. Die Partikel umfassen optional normale Lungensurfactantproteine. Exemplarische Formulierungen zur Inhalation von Proteinen sind beispielsweise im U.S. Patent 6,099,517 offenbart. Die Verabreichung von Zusammensetzungen aus Trockenpuder zur Inhalation eines Muteins der Erfindung ist ebenfalls möglich. Geeignete Formulierungen aus Trockenpuder sind zum Beispiel im U.S. Patent 6,123,936 beschrieben.
Eine Option für die Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen, die zur Inhalation geeignet sind, umfasst die Ausbildung von Aerosolen aus Partikeln in einer wässrigen oder nicht-wässrigen (zum Beispiel das Treibmittel Fluorkohlenwasserstoff) Suspension. Solche Partikel umfassen Beispielsweise intramolekulare Aggregate der Polypeptide oder liposomal oder mikrokapsular eingeschlossene Polypeptide. Die Aerosole sollten frei von Lungenreizstoffen sein, i.e. Substanzen, welche eine akute Bronchokonstriktion, Husten, Lungenödem oder Gewebezerstörung hervorrufen. Agenzien, welche eine nicht reizende Absorption fördern, sind hingegen für die vorliegende Verwendung geeignet.
Geeignete Zusammensetzungen für eine parenterale Verabreichung umfassen pharmazeutisch annehmbare sterile wässrige oder nicht-wässrige Lösungen, Dispersionen, Suspensionen oder Emulsionen sowie sterile Puder für eine Rekonstitution in sterile injizierbare Lösungen oder in Dispersionen ummittelbar vor deren Verwendung. Repräsentative Beispiele geeigneter wässriger und nicht-wässriger Träger, Verdünnungsmittel, Lösungsmittel oder Vehikel umfassen Wasser, Ethanol, Polyole, wie zum Beispiel Glycerin, Propylenglycol, Polyethylenglycol, und geeignete Mischungen davon, Pflanzenöle, wie zum Beispiel Ölivenöl, und injizierbare organische Ester, wie zum Beispiel Ethyloleat. Die Fluidität kann durch verschiedene Mittel aufrechterhalten werden, einschließlich der Verwendung von Beschichtungsmaterialien, wie zum Beispiel Lecithin, der Aufrechterhaltung der erforderlichen Partikelgröße (im Falle von Dispersionen) und Surfactants.
Die Zusammensetzungen können ferner Adjuvanzien enthalten, wie zum Beispiel Konservierungsstoffe, feuchtigkeitspendende Stoffe, emulgierende Agenzien, dispergierende Agenzien, anitbakterielle und antifungale Agenzien, wie zum Beispiel Paraben, Chlorbutanol, Phenol und Sorbinsäure, isotonische Agenzien, wie zum Beispiel Zucker, Natriumchlorid, oder Agenzien, welche die Absorption verlangsamen, wie zum Beispiel Aluminiummonostearat und Gelatine. Das Mutein kann in Systeme zur langsamen oder "sustained release" oder zur gerichteten Abgabe inkorporiert werden, wie zum Beispiel Polymermatrices, Liposomen und Mikrosphären.
Injizierbare Formulierungen können auf zahlreiche Arten sterilisiert werden einschließlich der Filtration durch einen bakterien-rückhaltenden Filter oder durch Inkorporation sterilisierender Agenzien in Form steriler fester Zusammensetzungen, die in sterilem Wasser oder einem anderen sterilen injizierbaren Medium unmittelbar vor der Verwendung gelöst oder dispergiert werden können.
Die kodierende Sequenz für jedes der hier als Gerüst verwendeten Proteine kann als Ausgangspunkt für die Mutagenese der in der vorliegenden Erfindung ausgewählten Peptidsegmente dienen. Die kodierende Sequenz von hNGAL wurde von Bundgard et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 202 (1994), 1468-1475 beschrieben. Die kodierende Sequenz von A2m bzw. von 24p3 wurde zum Beispiel publiziert von Chan et al., Nucleic Acid Res. 16 (1988) 11638 und von Stoesz et al., Oncogene 11 (1995), 2233-2241. Für die Mutagenese der Aminosäuren in den vier Peptidschleifen stehen dem Fachmann die verschiedenen bekannten Verfahren zur ortsgerichteten Mutagenese oder zur Mutagenese mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion zur Verfügung. Das Mutageneseverfahren kann beispielsweise dadurch charakterisiert werden, dass Gemische synthetischer Oligodeoxynukleotide, die eine degenerierte Basenzusammensetzung an den gewünschten Positionen aufweisen, zur Einführung der Mutationen verwendet werden können. Die Verwendung von Nukleotidbausteinen mit reduzierter Basenpaarspezifität, wie zum Beispiel Inosin, ist ebenfalls eine Option für die Einführung von Mutationen in das ausgewählte Sequenzsegment oder die Aminosäurepositionen. Das Verfahren zur Mutagenese von Target-Bindungsstellen ist im Vergleich zu Antikörpern vereinfacht, da für hNGAL zu diesem Zweck nur vier anstelle von sechs Sequenzelementen – korrespondierend zu den vier oben zitierten Peptidschleifen – manipuliert werden müssen. Eine weitere Möglichkeit ist die so genannte Triplet-Mutagenese. Dieses Verfahren verwendet zum Einbau in die kodierende Sequenz Gemische verschiedner Nukleotidtriplets, von denen jedes für eine Aminsäure kodiert.
Eines der verschiedenen anwendbaren Verfahren zur Einführung von Mutationen in die Region der vier ausgewählten Peptidschleifen der hier verwendeten Gerüstproteine (i.e. im Falle von hNGAL an den Sequenzpositionen 40 bis 50, 70 bis 79, 101 bis 103 und 125 bis 132) basiert auf der Verwendung von vier Oligodeoxynukleotiden, von denen jedes partiell von einem der vier korrespondierenden zu mutierenden Sequenzsegmente abgeleitet ist. Bei der Herstellung dieser Oligodeoxynukleotide kann der Fachmann Mischungen von Nukleinsäurebausteinen zur Synthese von den Nukleotidtriplets verwenden, die den zu mutierenden Aminosäurepositionen entsprechen, sodass Codons oder Anticodons für alle Aminosäuren zufällig oder entsprechend dem genetischen Code und der Zusammensetzung dieses Gemischs für eine Selektion der gewünschten Aminosäuren an dieser Position entstehen.
Das erste Oligodeoxynukleotid entspricht zum Beispiel in seiner Sequenz abseits der mutierten Positionen mindestens partiell dem kodierenden Strang der Peptidschleife, die in der Polypeptidsequenz von hNGAL an der N-terminalsten Position lokalisiert ist. Demzufolge entspricht das zweite Oligodeoxynukleotid zumindest partiell dem nicht-kodierenden Strang für das zweite Sequenzsegment, das in der Polypeptidsequenz folgt. Das dritte Oligodeoxynukleotid entspricht wiederum mindestens partiell dem kodierenden Strang für das korrespondierende dritte Sequenzsegment. Schließlich entspricht das vierte Oligodeoxynukleotid zumindest partiell dem nicht-kodierenden Strang für das vierte Sequenzsegment. Eine Polymerasekettenreaktion kann mit dem entsprechenden ersten und zweiten Oligodeoxynukleotid und separat davon, falls benötigt, mit dem entsprechenden dritten und vierten Oligodeoxinukleotid unter Verwendung der Nukleinsäure, welche das Gerüstprotein und/oder dessen komplementären Strang kodiert, als Template durchgeführt werden.
Die Amplifikationsprodukte dieser beiden Reaktionen können mit Hilfe verschiedener bekannter Verfahren in einer Nukleinsäure kombiniert werden, welche die Sequenz vom ersten bis zum vierten Sequenzsegment umfasst, und welche die Mutationen an den ausgewählten Aminosäurepositionen trägt. Zu diesem Zweck können beide Produkte beispielsweise einer neuen Polymerasekettenreaktion unter Verwendung flankierender Oligodeoxynukleotide als Primer sowie von einem oder mehr Nukleinsäuremediatormolekülen unterzogen werden, welche die Sequenz zwischen dem zweiten und dem dritten Sequenzsegment beisteuern. Dieses Verfahren ist schematisch in 1 dargestellt. In der Auswahl der Anzahl an Oligodeoxinukleotiden, die für die Mutagenese verwendet werden, sowie ihrer Anordnung innerhalb der Gensequenz des verwendeten Proteins stehen dem Fachmann weiterhin zahlreiche Alternativen zur Verfügung.
Die Nukleinsäuremoleküle, die für die Sequenzregion kodieren, welche die vier Peptidschleifen des verwendeten Proteins umfasst, und die Mutationen an den ausgewählten oben definierten Positionen enthalten, können durch Ligation mit den fehlenden 5'- und 3'-Sequenzen einer Nukleinsäure, welche zum Beispiel für hNGAL kodiert, und/oder dem Vektor verknüpft und in einen geeigneten Wirtsorganismus kloniert werden. Für die Ligation und die Klonierung steht eine Vielzahl von Verfahren zur Verfügung. Beispielsweise können im Rahmen einer Amplifikation synthetische Nukleinsäuremoleküle mit Erkennungssequenzen für Restriktionsendonukleasen, die ebenfalls an den korrespondierenden Positionen in der Nukleinsäuresequenz von hNGAL vorliegen, an beiden Enden der zu klonierenden Nukleinsäure angeheftet werden, sodass eine Ligation nach Hydrolyse mit dem entsprechendem Restriktionsenzym möglich wird. Die fehlenden 5'- und 3'-Sequenzen einer Nukleinsäure, die für das entsprechende Lipocalin kodiert, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, können ebenfalls über PCR an das Nukleinsäuremolekül angeheftet werden, das die mutierten Sequenzpositionen umfasst.
Längere Sequenzsegmente innerhalb des Gens, das für das zur Mutagenese ausgewählte Protein kodiert, können ferner mit Hilfe bekannter Verfahren einer Zufallsmutagenese unterzogen werden, zum Beispiel durch Verwendung einer Polymerasekettenreaktion unter Bedingungen einer erhöhten Fehlerrate, durch chemische Mutagenese oder durch die Verwendung bakterieller Mutatorstämme (Low et al., J. Mol. Biol. 260 (1996), 359-368). Solche Verfahren können ferner für die weitere Optimierung der Targetaffinität oder der Targetspezifität eines Muteins verwendet werden, das bereits hergestellt wurde. Mutationen, die möglicherweise außerhalb der Segmente der Sequenzpositionen 40 bis 50, 70 bis 79, 101 bis 103 und 125 bis 132 von hNGAL erfolgen, können zum Beispiel oft toleriert werden oder sich sogar als vorteilhaft herausstellen, zum Beispiel wenn sie zu einer verbesserten Faltungseffizienz oder Faltungsstabilität des Muteins beitragen.
Nachdem die kodierenden Nukleinsäuresequenzen, die einer Mutagenese unterzogen wurden, zur Expression gebracht wurden, können die Klone, welche die genetische Information für die Mehrzahl entsprechender Muteine tragen, die ein gegebenes Target binden, aus der erhaltenen Bibliothek selektiert werden. Bekannte Expressions- und Selektionsstrategien können für die Selektion dieser Klone verwendet werden. Verfahren dieser Art wurden im Zusammenhang mit der Produktion oder dem "Engineering" rekombinanter Antikörperfragmente beschrieben, wie zum Beispiel die "Phage Display"-Technik (Hoess, Curr. Opin. Struct. Biol. 3 (1993), 572-579; Wells and Lowman, Curr. Opin. Struct. Biol. 2 (1992), 597-604) oder das "Colony Screening"-Verfahren (Skerra et al., Anal. Biochem. 196 (1991), 151-155) oder das "Ribosome Display" (Roberts, Curr. Opin. Chem. Biol. 3 (1999) 268-273).
Eine Ausführungsform der "Phage Display"-Technik (Hoess, supra; Wells and Lowman, supra; Kay et al., Phage Display of Peptides and Proteins – A Laboratory Manual (1996), Academic Press) wird hier als Beispiel eines Selektionsverfahrens gemäß der Erfindung für Muteine mit gewünschten Bindungseigenschaften angegeben. Für das exemplarische Selektionsverfahren werden Phasmide erzeugt, welche die Expression des mutierten hNGAL Strukturgens als Fusionsprotein mit einer Signalsequenz am N-Terminus, vorzugsweise der OmpA-Signalsequenz, bewirken sowie mit dem Hüllprotein pIII des Phagen M13 (Model and Russel, in "The Bacteriophages", Vol. 2 (1988), Plenum Press, New York, 375-456) oder mit Fragmenten dieses Hüllproteins, welche in die Phagenhülle inkorporiert werden, am C-Terminus. Das C-terminale Fragment ΔpIII des Phagenhüllproteins, das nur die Aminosäuren 217 bis 406 des natürlichen Hüllproteins pIII enthält, wird vorzugsweise zur Erzeugung der Fusionsproteine verwendet. Insbesondere bevorzugt ist ein C-terminales Fragment von pIII, in dem der Cystein-Rest an Position 201 fehlt oder durch eine andere Aminosäure ersetzt wird.
Das Fusionsprotein kann andere Komponenten enthalten, wie zum Beispiel ein Affinitätstag oder eine Epitopsequenz für einen Antikörper, der die Immobilisierung oder spätere Reinigung des Fusionsproteins oder seiner Teile ermöglicht. Weiterhin kann ein Stop-Codon zwischen der für hNGAL oder dessen Mutein kodierenden Region und dem Gensegment für das Hüllprotein oder dessen Fragment lokalisiert sein, wobei das Stop-Codon, vorzugsweise ein Amber Stop-Codon, zumindest partiell während der Translation in einem geeigneten Surpressor-Stamm in eine Aminosäure translatiert wird.
Phasmide bezeichnen hier Plasmide, welche die intergene Region eines filamentösen bakteriellen Phagen tragen, wie zum Beispiel M13 oder f1 (Beck and Zink, Gene 16 (1981), 35-58), oder einen funktionellen Teil davon, sodass während der Superinfektion der bakteriellen Zellen mit einem Helferphagen, zum Beispiel M13K07, VCS-M13 oder R408, ein Strang der zirkulären Phasmid-DNA mit den Hüllproteinen verpackt und als so genanntes Phagemid in das Medium exportiert wird. Auf der einen Seite trägt dieses Phagemid das hNGAL Mutein, das durch das entsprechende Phasmid kodiert wird, und das als Fusion mit dem Hüllprotein pIII oder dessen Fragment in seine Oberfläche eingebaut ist, wobei die Signalsequenz des Fusionsproteins normalerweise abgespalten wird. Auf der anderen Seite trägt es eine oder mehr Kopien des nativen Hüllproteins pIII aus dem Helferphagen und ist dadurch in der Lage, einen Rezipienten zu infizieren, im Allgemeinen einen bakteriellen Stamm, der ein F- oder F'-Plasmid enthält. Auf diese Weise wird eine physikalische Kopplung zwischen der verpackten Nukleinsäure, welche die genetische Information für das entsprechende hNGAL Mutein enthält, und dem kodierten Protein sichergestellt, das zumindest partiell in funktioneller Form auf der Oberfläche des Phagemids vorliegt.
Der Vektor phNGAL5 (1) kann zum Beispiel zur Konstruktion des Phasmids mit den Sequenzen verwendet werden, welche für die hNGAL Mutiene kodieren. Die für die Peptidschleifen kodierende Nukleinsäure kann zum Beispiel über die beiden BstXI Restriktionsstellen in den Vektor phNGAL5 inseriert werden. Rekombinante Phasmide werden mittels Transformation in den E. coli Stamm eingebracht, zum Beispiel XL1-Blue (Bullock et al., BioTechniques 5 (1987), 376-379) oder TG1. Auf diese Weise werden Klone hergestellt, die viele verschiedene hNGAL Muteine als Fusionsproteine erzeugen können.
Diese Bibliothek, i.e. die Kollektion der erhaltenen Klone, wird im Anschluss mit einem M13-Helferphagen in Flüssigkultur gemäß bekannter Verfahren superinfiziert. Nach dieser Infektion kann die Inkubationstemperatur der Kultur zur Produktion der Phagemide reduziert werden. Bevorzugte Inkubationstemperaturen sind diejenigen, bei denen die optimale Faltung des hNGAL Muteins als Komponente des Fusionsproteins mit dem Phagenhüllprotein oder dessen Fragment erwartet wird. Während oder nach der Inkubationsphase kann die Expression des Gens für das Fusionsprotein mit dem hNGAL Mutein in den bakteriellen Zellen induziert werden, zum Beispiel durch Zugabe von Anhydrotetracyclin. Die Induktionsbedingungen werden so gewählt, dass eine wesentliche Fraktion der erzeugten Phagemide mindestens ein hNGAL Mutein präsentiert. Die Phagemide werden nach einer Inkubationsphase der Kultur von beispielsweise 6 bis 8 Stunden isoliert. Für die Isolation der Phagemide sind verschiedene Verfahren bekannt, wie zum Beispiel die Präzipitation mit Polyethylenglycol.
Die isolierten Phasmide können einer Selektion durch Inkubation mit dem gewünschten Target unterzogen werden, wobei das Target in einer Form vorliegt, die eine zumindest temporäre Immobilisierung derjenigen Phagemide ermöglicht, welche Muteine mit der gewünschten Bindungsaktivität als Fusionsprotein in ihren Hüllen tragen. Unter den verschiedenen, den Fachleuten bekannten Ausführungsformen kann das Target beispielsweise mit einem Carrierprotein konjugiert werden, wie zum Beipspiel Serumalbumin, und kann über dieses Carrierprotein an eine Proteinbindungsoberfläche gebunden werden, zum Beispiel Polystyren. Mikrotiterplatten, die für ELISA Techniken geeignet sind, oder so genannte "Immuno- Sticks" können vorzugsweise für diese Immobilisierung des Targets verwendet werden. Alternativ können Konjugate des Targets auch mit anderen Bindungsgruppen erzeugt werden, wie zum Beispiel Biotin. Das Target kann im Anschluss auf Oberflächen immobilisiert werden, welche diese Gruppe selektiv binden, wie zum Beispiel Mikrotiterplatten oder paramagnetische Partikel, die mit Streptavidin oder Avidin beschichtet sind.
Verbliebene Protein- oder Phagemid-Bindungsstellen, die auf den mit Targets beladenen Oberflächen vorliegen, können mit Blockierungslösungen, die für ELISA Verfahren bekannt sind, abgesättigt werden. Die Phagemide werden zum Beispiel im Anschluss in einem physiologischen Puffer in Kontakt mit dem auf der Oberfläche immobilisierten Target gebracht. Ungebundene Phagemide werden durch multiple Waschschritte entfernt. Die auf der Oberfläche verbliebenen Phagemidpartikel werden anschließend eluiert. Zur Elution kann das freie Target als Lösung zugegeben werden. Die Phagemide können aber auch durch Zugabe von Proteasen oder beispielsweise in der Gegenwart von Säuren, Basen, Detergenzien oder chaotropen Salzen oder unter moderat denaturierenden Bedingungen eluiert werden. Ein bevorzugtes Verfahren ist die Elution unter Verwendung von Puffern mit einem pH von 2.2, wobei das Eluat im Anschluss neutralisiert wird.
Anschließend werden die E. coli Zellen mit den eluierten Phagemiden unter Verwendung allgemein bekannter Verfahren infiziert. Die Nukleinsäuren können ferner aus den eluierten Phagemiden extrahiert und auf andere Weise in die Zellen eingebracht werden. Ausgehend von den auf diese Weise erhaltenen E. coli Klonen werden die Phagemide wiederum durch Superinfektion mit M13-Helferphagen gemäß dem oben beschriebenen Verfahren erzeugt, und die auf diese Weise propagierten Phagemide werden wiederum einer Selektion mit dem auf einer Oberfläche immobilisierten Target unterzogen. Oftmals sind multiple Selektionscyclen erforderlich, um die Phagemide mit den Muteinen der Erfindung in angereicherter Form zu erhalten. Die Anzahl an Selektionszyklen wird vorzugsweise so gewählt, dass in der anschließenden funktionellen Analyse mindestens 0.1 % der untersuchten Klone Muteine mit einer detektierbaren Affinität für das gegebene Target erzeugen. Abhängig von der Größe, i.e. der Komplexität, der verwendeten Bibliothek sind typischerweise 2 bis 8 Zyklen zu diesem Zweck erforderlich.
Für die funktionelle Analyse der selektierten Muteine wird ein E. coli Stamm mit den aus den Selektionszyklen erhaltenen Phagemiden infiziert, und die korrespondierende doppelsträngige Phasmid-DNA wird isoliert. Ausgehend von dieser Phasmid-DNA oder auch von der einzelsträngigen DNA, die aus den Phagemiden extrahiert wurde, können die Nukleinsäuresequenzen der selektierten Muteine der Erfindung durch zu diesem Zweck übliche Verfahren bestimmt werden, und die Aminosäuresequenz kann daraus abgeleitet werden. Die mutierte Region oder die Sequenz des gesamten hNGAL Muteins kann in einen anderen Expressionsvektor subkloniert und in einem geeigneten Wirtsorganismus exprimiert werden. phNGAL7 kann zum Beispiel als Expressionsvektor verwendet werden (vergleiche 3), und die Expression mit phNGAL7-Derivaten kann in E.coli Stämmen durchgeführt werden, zum Beispiel in E. coli TG1. Die gentechnologisch hergestellten Muteine von hNGAL können mit Hilfe verschiedener proteinchemischer Verfahren gereinigt werden. Die mit phNGAL7 erzeugten hNGAL Muteine tragen zum Beispiel das Affinitätspeptid Strep-Tag^® II (Schmidt et al., supra) an ihrem C-Terminus und können daher vorzugsweise mittels Strepavidin-Affinitätschromatographie gereinigt werden.
Die Selektion kann ferner mit Hilfe anderer Verfahren durchgeführt werden. Viele verschiedene Ausführungsformen sind Fachleuten bekannt oder werden in der Literatur beschrieben. Eine Kombination von Verfahren kann ebenfalls angewandt werden. Mittels "Phage Display" selektierte oder zumindest angereicherte Klone können zum Beispiel zusätzlich einem "Colony Screening" unterzogen werden. Dieses Verfahren hat den Vorteil, dass einzelne Klone direkt im Hinblick auf die Produktion eines hNGAL Muteins mit detektierbarer Bindungsaffinität für ein Target isoliert werden können.
Zusätzlich zur Verwendung von E. coli als Wirtsorganismus in der "Phage Display"-Technik oder dem "Colony Screening"-Verfahren können zum Beispiel andere bakterielle Stämme, Hefe oder auch Insektenzellen oder Säugetierzellen zu diesem Zweck verwendet werden. Zusätzlich zur Selektion eines hNGAL Muteins aus einer primären Bibliothek, die ausgehend von einer kodierenden Nukleinsäuresequenz für ein Mutein erzeugt wurde, können auch vergleichbare Verfahren angewandt werden, um ein Mutein im Hinblick auf die Affinität oder Spezifität für das gewünschte Target durch wiederholte, optional limitierte Mutagenese seiner kodierenden Nukleinsäuresequenz zu optimieren.
Es ist überraschend, dass durch die Verwendung des Verfahrens der Erfindung hNGAL Muteine isoliert werden können, die eine detektierbare Affinität für ein gegebenes Target zeigen (vergleiche Beispiele 4 und 5).
Es ist ferner möglich, die erzeugten Muteine einer weiteren, optional partiellen Zufallsmutagenese zu unterziehen, um Varianten mit noch höherer Affinität aus der neuen, dadurch erhaltenen Bibliothek zu selektieren. Ein entsprechendes Verfahren wurde im Fall von digoxigenin-bindenden Muteinen des Bilin-Bindeproteins zum Zweck einer "Affinitätsmaturierung" bereits beschrieben ( DE 199 26 068 , WO 00/75303, Schlehuber et al., supra) und kann in einer entsprechenden Art und Weise von Fachleuten auch auf das hier offenbarte Mutein angewandt werden.
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden nicht-einschränkenden Beispiele und die beigefügten Zeichnungen weiter veranschaulicht:
1 zeigt schematisch den Phasmidvektor pHNHAL5.
2 zeigt schematisch die Herstellung der Bibliothek von Lipocalinmuteinen auf dem Nukleinsäureniveau.
3 zeigt schematisch den Expressionsvektor phNGAL7
4 zeigt schematisch den Expressionsvektor pTLpc3.
5 zeigt die Bindung des Muteins TlpcA an Tränenlipocalin und ein korrespondierendes Kontrollexperiment mit hNGAL mittels eines ELISA.
6 zeigt schematisch den Phasmidvektor phNGAL 12.
7 zeigt schematisch den Expressionsvektor phNGAL15.
8 zeigt die Bindung der Muteine RFY-B, RFY-C und RFY-E – zusammen mit hNGAL als Kontrolle – an ein Thrombospondinpeptid (SEQ ID NR: 18) in einem ELISA.
9 zeigt die Bindung der Muteine RFY-B, RFY-C und RFY-E – zusammen mit hNGAL als Kontrolle – an ein Thrombospondinpeptid (SEQ ID NR: 18) mittels Oberflächenplasmonresonanzspektroskopie (SPR).
10 zeigt die Bindung des hNGAL Muteins N4 an Interleukin-8 in einem ELISA.
11 zeigt schematisch den Expressionsvektor pTNFα.
12 zeigt die Bindung von TNFα an die hNGAL Muteine TNF-V1 und TNF-V2 – zusammen mit hNGAL als Kontrolle – in einem Colony Spot-Assay.
1 zeigt eine schematische Zeichnung von phNGAL5. Dieser Vektor kodiert für ein Fusionsprotein aus der OmpA-Signalsequenz, einem modifizierten hNGAL mit den drei Aminosäuresubstitutionen Gln28 zu His, Leu137 zu Ile sowie Thr145 zu Ala, dem Strep-Tag^® II Affinitätstag und einer verkürzten Form des M13 Hüllproteins pIII, das die Aminosäuren 217 bis 406 umfasst (pIII). Das gesamte Strukturgen ist Gegenstand der transkriptionellen Kontrolle des Tetracylcinpromotors/-operators (tet^p/o) und endet mit dem Lipoprotein-Transkriptionsterminator (t_lpp). Weitere Bestandteile des Vektor sind der Replikationsursprung (Ori), die intergene Region des filamentösen Bakteriophagen f1 (f1-IG), das Ampicillin-Resistenzgen (bla), das für die β-Lactamase kodiert, und das Tetracyclin-Repressorgen (tetR). Ein Amber Stop-Codon, das in einem SupE Amber Suppressor-Wirtsstamm partiell in Gln translatiert wird, liegt zwischen der kodierenden Region für hNGAL mit der OmpA-Signalsequenz und dem Strep-Tag^® II sowie der kodierenden Region für das trunkierte Phagenhüllprotein pIII. Sowohl die beiden BstXI Restriktionsschnittstellen, die zur Klonierung der mutierten Genkassette verwendet werden, als auch die das Strukturgen flankierenden Restriktionsschnittstellen sind markiert. Ein relevantes Segment der Nukleinsäuresequenz von phNGAL5 ist zusammen mit der kodierten Aminosäuresequenz in der Sequenzliste als SEQ ID NO: 7 wiedergegeben. Das Segment beginnt mit einer XbaI Restriktionsschnittstelle und endet mit der HindIII Restriktionsschnittstelle. Die Vektorelemente außerhalb dieser Region sind identisch mit denen des Vektors pASK75, dessen vollständige Nukleotidsequenz in der Deutschen Patentschrift DE 44 17 598 A1 dargestellt ist.
2 zeigt schematisch eine Strategie für die konzertierte Mutagenese von 20 ausgewählten Aminosäurepositionen in hNGAL durch wiederholte Anwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR). Für jede der vier Peptidschleifen, in denen Aminosäuren mutiert werden sollen, wurde ein Oligodeoxynukleotid synthetisiert (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4), wobei die in der Sequenzliste angegebenen entsprechenden Nukleotidmischungen an den Mutationsstellen verwendet wurden. Aufgrund der gewählten Zusammensetzung wurde von den insgesamt drei möglichen Stop-Codons nur das Amber Stop-Codon TAG in den mutierten Codons zugelassen, das in den zur Genexpression verwendeten E. coli SubE-Stämmen XL1-Blue (Bullock et al., BioTechniques 5 (1987), 3376-378) oder TG1 (Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Press) in Glutamin translatiert wird. Für bestimmte Anwendungen, zum Beispiel zur Genexpression in anderen bakteriellen Stämmen oder Organismen, kann solch ein Nonsense-Codon, wenn es im Strukturgen für ein selektiertes hNGAL Mutein vorkommt, von einem Fachmann durch ein Glutamin kodierendes Codon ersetzt werden, zum Beispiel über ortsgerichtete Mutagenese. Mit den Primern SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 wurde unter Verwendung der phNGAL3 Plasmid-DNA (SEQ ID NO: 8), welche die klonierte hNGAL cDNA enthält, als Template ein Nukleinsäurefragment mit 168 Basenpaaren amplifiziert (1. PCR, PCR A). In einer weiteren PCR wurde mit den Primern SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4, ebenfalls unter Verwendung von phNGAL3 als Template, ein Nukleinsäurefragment mit 179 Basenpaaren amplifiziert (1. PCR, PCR B). phNGAL3 unterscheidet sich von phNGAL5 nur durch zwei fehlende BstXI Restriktionsschnittstellen an den Positionen 283 und 630 sowie eine weitere BstXI Restriktionsschnittstelle an Position 675 und zeigt hier die hNGAL Wildtyp-Sequenzen. Das Gemisch der beiden PCR-Produkte, die einander partiell überlappen, diente als Template in einer weiteren Amplifikation (2. PCR) mit den beiden flankierenden PCR-Primern SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6, wobei ein Genfragment mit 386 Basenpaaren erhalten wurde. Dieses Fragment enthielt das Gemisch aller 20 mutierten Codons und wurde im Anschluss unter Verwendung der beiden BstXI Restriktionsschnittstellen in den Vektor phNGAL5 kloniert. Die Verwendung dieser beiden Restriktionsschnittstellen, deren spezielle Anordnung zu zwei nicht kompatiblen überhängenden DNA-Enden während des Restriktionsverdaus führte, ermöglichte eine besonders effiziente Ligation. Die Substitution der Aminosäuren Gln28 zu His und Thr145 zu Ala in Bezug auf die ursprüngliche Sequenz sowie eine stille Mutation im Codon für Ser156 wurden zuvor während der Konstruktion von phNGAL5 bewerkstelligt, um die beiden BstXI Restriktionsschnittstellen in das hNGAL Strukturgen einzuführen.
3 zeigt eine Zeichnung von phNGAL7. phNGAL7 kodiert für ein Fusionsprotein aus der OmpA-Signalsequenz, einem modifizierten hNGAL gemäß 1, dem Strep-Tag^® II Affinitätstag und einer albumin-bindenden Domäne (abd) des Proteins G aus Streptococcus (Kraulis et al., FEBS Lett. 378 (1996), 190-194). Alle weiteren genetischen Elemente sind identisch zu phNGAL5. Ein relevantes Segment der Nukleinsäuresequenz von phNGAL7 ist zusammen mit der kodierten Aminosäuresequenz in der Sequenzliste als SEQ ID NO: 9 wiedergegeben. Das Segment beginnt mit der XbaI Restriktionsschnittstelle und endet mit der HindIII Restriktionsschnittstelle. Die Vektorelemente außerhalb dieser Region sind identisch mit dem Vektor pASK75, dessen vollständige Nukleotidsequenz in der Deutschen Patentschrift DE 44 17 598 A1 dargestellt ist.
4 zeigt eine Zeichnung von pTLpc3. pTLpc3 kodiert für ein Fusionsprotein aus der OmpA-Signalsequenz, einem modifizierten humanen Tränenlipocalin mit der Aminosäuresubstitution Cys97 zu Ser und dem Strep-Tag^® II Affinitätstag. Alle weiteren genetischen Elemente sind identisch zu phNGAL5. Ein relevantes Segment der Nukleinsäuresequenz von pTLpc3 ist zusammen mit der kodierten Aminosäuresequenz in der Sequenzliste als SEQ ID NO: 9 wiedergegeben. Das Segment beginnt mit der XbaI Restriktionsschnittstelle und endet mit der HindIII Restriktionsschnittstelle. Die Vektorelemente außerhalb dieser Region sind identisch mit dem Vektor pASK75, dessen vollständige Nukleotidsequenz in der Deutschen Patentschrift DE 44 17 598 A1 dargestellt ist.
5 zeigt eine graphische Darstellung der Ergebnisse aus Beispiel 5, in dem Bindungsmessungen mit dem hNGAL Mutein TlpcA mit Hilfe eines enzym-gekoppelten Immunosorbentassays (ELISA) durchgeführt wurden. Die Bindung von TlpcA und Tränenlipocalin (Quadrate) wurde mit der Interaktion von hNGAL und Tränenlipocalin (offene Kreise) verglichen. TlpcA bindet Tränenlipocalin in konzentrationsabhängiger Weise. hNGAL zeigt kein signifikantes Bindungssignal.
6 zeigt eine schematische Zeichnung von phNGAL12. Dieser Vektor kodiert für ein Fusionsprotein aus der OmpA-Signalsequenz, einem modifizierten hNGAL mit den vier Aminosäuresubstitutionen Gln28 zu His, Cys87 zu Ser, Leu137 zu Ile sowie Thr145 zu Ala, dem Strep-Tag^® II Affinitätstag und einer verkürzten Form des M13 Hüllproteins pIII, welche die Aminosäuren 217 bis 406 umfasst (pIII). Zusätzlich trägt phNGAL12 zwei stille Mutationen innerhalb der kodierenden Region der OmpA-Singnalsequenz, um eine EcoK12 Restriktionsschnittstelle zu entfernen. Das gesamte Strukturgen ist Gegenstand der transkriptionellen Kontrolle durch den Tetracyclinpromotor/-operator (tet^p/o) und endet mit dem Lipoprotein-Transkriptionsterminator (t_lpp). Weitere Elemente des Vektors umfassen den Replikationsursprung (Ori), die intergene Region des filamentösen Bakteriophagen f1 (f1-IG), das Ampicillin-Resistenzgen (bla), das für β-Lactamase kodiert, und das Teteracyclin-Repressorgen (tetR). Ein Amber Stop-Codon, das in SupE Amber Suppressor-Wirtsstämmen partiell in Gln translatiert wird, liegt zwischen der kodierenden Region für hNGAL, fusioniert mit der OmpA-Signalsequenz und den Strep-Tag^® II, und der kodierenden Region für das trunkierte pIII Phagenhüllprotein. Die beiden BstXI Restriktionsschnittstellen, die zur Klonierung der mutierten Genkassette verwendet werden, und die das Strukturgen flankierenden Restriktionsschnittstellen sind markiert. Ein relevantes Segment der Nukleinsäuresequenz von phNGAL12 ist zusammen mit der kodierten Aminosäuresequenz in der Sequenzliste als SEQ ID NO: 19 wiedergegeben. Das Segment beginnt mit der XbaI Restriktionsschnittstelle und endet mit der HindIII Restriktionsschnittstelle. Die Vektorelemente außerhalb dieser Region sind identisch mit dem Vektor pASK75, dessen vollständige Nukleotidsequenz in der Deutschen Patentschrift DE 44 17 598 A1 dargestellt ist.
7 zeigt eine schematische Zeichnung von phNGAL15. phNGAL15 kodiert für ein Fusionsprotein aus der OmpA-Signalsequenz mit einem modifizierten hNGAL gemäß 6 und dem Strep-Tag^® II Affinitätstag. pHNGAL15 trägt die gleichen stillen Mutationen innerhalb der kodierenden Region der OmpA-Signalsequenz wie phNGAL12. Ein relevantes Segment der Nukleinsäuresequenz von phNGAL15 ist zusammen mit der kodierten Aminosäuresequenz in der Sequenzliste als SEQ ID NO: 21 wiedergegeben. Das Segment beginnt mit der XbaI Restriktionsschnittstelle und endet mit der HindIII Restriktionsschnittstelle. Die Vektorelememte außerhalb dieser Region sind identisch mit dem Vektor pASK75, dessen vollständige Nukleotidsequenz in der Deutschen Patentschrift DE 44 17 598 A1 dargestellt ist.
8 zeigt eine graphische Darstellung der Ergebnisse aus Beispiel 10, in dem Bindungsmessungen mit den hNGAL Muteinen und einem Thrombospondinpeptid mit Hilfe eines enzym-gekoppelten Immunosorbentassays (ELISA) durchgeführt wurden. Die Bindung der hNGAL Muteine RFY-B (Kreise), RFY-C (Quadrate) und RFY-E (Rauten) an das Thrombospondinpeptid wurde mit der Interaktion von hNGAL (Dreiecke) und dem Thrombospondinpeptid verglichen. Das Thrombospondinpeptid wurde über eine an seinen C-Terminus angeheftete Biotin-Gruppe auf einer avidin-beschichteten Mikrotiterplatte immobilisiert. Die hNGAL Muteine binden das Thrombospondinpeptid in konzentrationsabhängiger Weise, während hNGAL kein signifikantes Bindungssignal hervorruft. In Abwesenheit des Peptids (offene Symbole) wurde eine geringe Kreuzreaktivität zwischen den hNGAL Muteinen und dem Avidin beobachtet.
9 zeigt eine graphische Darstellung der Ergebnisse aus Beispiel 11, in dem Bindungsmessungen mit den hNGAL Muteinen und einem Thrombospondinpeptid mit Hilfe der Oberflächenplasmonresonanzspektroskopie (SPR) durchgeführt wurde. Die molekularen Interaktionen zwischen den hNGAL Muteinen RFY-B (Kreise), RFY-C (Quadrate) bzw. RFY-E (Rauten) mit dem Thrombospondinpeptid wurden mit der Interaktion zwischen hNGAL (Dreiecke) und dem Thrombospondinpeptid verglichen. Die hNGAL Muteine binden das Thrombospondinpeptid in konzentrationsabhängiger Weise, während hNGAL kein signifikantes Bindungssignal hervorruft. Es wurde keine Kreuzreaktivität der hNGAL Muteine mit dem Sensor-Chip SA detektiert (nicht gezeigt).
10 zeigt eine graphische Darstellung der Ergebnisse aus Beispiel 15, in dem Bindungsmessungen mit dem hNGAL Mutein N4 mit Hilfe eines enzym-gekoppelten Immunosorbentassays (ELISA) durchgeführt wurden. Interleukin-8 wurde über Biotin-Gruppen, die an seine Lysin-Reste angeheftet wurden, auf einer avidin-beschichteten Mikrotiterplatte immobilisiert. Die Bindung des hNGAL Muteins N4 an Interleukin-8 (geschlossene Kreise) wurde mit der Interaktion des hNGAL Muteins N4 mit Avidin alleine (offene Kreise) verglichen. Das hNGAL Mutein N4 bindet Interleukin-8 in konzentrationsabhängiger Weise, während es mit Avidin alleine kein signifikantes Bindungssignal zeigt.
11 zeigt eine schematische Zeichnung des Plasmids pTNFα. pTNFα kodiert für ein Fusionsprotein aus der maturen Form des Tumornekrosefaktors α (TNFα) sowie einem Hexahistidin-Tag an seinem N-Terminus. Alle weiteren genetischen Elemente sind identisch mit dem Plasmid pRSET (Schoepfer, Gene 124 (1993), 82-85). Ein relevantes Segment der Nukleinsäuresequenz von pTNFα ist zusammen mit der kodierten Aminosäuresequenz in der Sequenzliste als SEQ ID NO: 31 wiedergegeben. Das Segment beginnt mit der NdeI Restriktionsschnittstelle und endet mit der HindIII Restriktionsschnittstelle. Die Vektorelemente außerhalb dieser Region sind identisch mit dem Vektor pRSET5a, dessen vollständige Nukleotidsequenz unter der EMBL Hinterlegungsnummer X54202 angegeben ist.
12 (A) zeigt die Ergebnisse des Colony Spot Assays aus Beispiel 18, in dem die Bindung des trimären TNFα an immobilisierte Muteine von hNGAL untersucht wurde. E. coli TG1-F^– Zellen, welche die nachfolgenden ABD-Fusionsproteine exprimieren, wurden entsprechend (B) entweder vier- oder fünfmal auf eine hydrophile Membran aufgebracht ("gespotted"). (B): hNGAL, das Bilin-Bindeprotein (BBP) zwei nicht verwandte Muteine aus der in Beispiel 6 beschriebenen Bibliothek, 9 aus dem in Beispiel 17 beschriebenen Colony Screening Assay isolierte Klone und, als Kontrolle kein Protein. Die Muteine, die von den entsprechenden Kolonien sekretiert wurden, wurden auf einer mit HSA beschichteten hydrophoben Membran immobilisiert, wie in Beispiel 18 dargestellt. Die Bindung des digoxigenierten TNFα wurde unter Verwendung eines anti-Digoxigenin FAB/Alkalische Phosphatase-Konjugat visualisiert. (B) zeigt die Positionen, an denen die jeweiligen Klone auf die Membran aufgebracht wurden.
BEISPIELE
Beispiel 1: Herstellung einer Bibliothek für hNGAL Muteine
Sofern nicht anders angegeben wurden Fachleuten bekannte gentechnologische Verfahren verwendet, wie zum Beispiel in Sambrook et al. (supra) beschrieben.
Für die konzertierte Mutagenese der insgesamt 20 ausgewählten Aminosäurepositionen in den vier Peptidschleifen von hNGAL wurde eine PCR in mehreren Schritten gemäß 2 durchgeführt. Die PCR-Reaktionen wurden in den beiden ersten Amplifikationsschritten in einem Volumen von 100 μl durchgeführt, wobei 20 ng phNGAL3 Plasmid DNA als Template zusammen mit jeweils 50 pmol der entsprechenden Primer (SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 bzw. SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4) verwendet wurden, welche gemäß dem herkömmlichen Phosphoramiditverfahren synthetisiert wurden. Zusätzlich enthielt das Reaktionsgemisch 10 μl 10 × Taq-Puffer (100 mM Tris/HCl pH 9.0, 500 mM KCl, 15 mM MgCl₂, 1 % v/v Triton X-100), 10 μl dNTP-Mix (2 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP). Nachdem das Volumen mit Wasser eingestellt wurde, wurden 5 U Taq DNA-Polymerase (5 U/μl, Promega) zugegeben, und es wurden 20 Temperaturzyklen von 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 60°C und 1.5 Minuten bei 72°C in einem Thermocycler mit einem beheizbaren Deckel (Eppendorf) durchgeführt, gefolgt von einer Inkubation für 5 Minuten bei 60°C. Die gewünschten Amplifikationsprodukte wurden mit Hilfe präpativer Agarosegelelektrophorese aus Low Melting Point Agarose (Roche Diagnostis) unter Verwendung des Jetsorb DNA Extraktionskits (Genomed) isoliert.
Der nachfolgende Amplifikationsschritt wurde ebenfalls in einem 100 µl Gemisch durchgeführt, wobei in der Gegenwart von jeweils 50 pmol der Primer SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6 ungefähr 6 ng dieser beiden entsprechenden Fragmente als Templates verwendet wurden. Die übrigen Bestandteile des PCR-Gemisches wurden in den gleichen Mengen wie in den vorangegangenen Amplifikationsschritten dazugegeben. Die PCR wurde mit 20 Temperaturzyklen von 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 55°C und 1.5 Minuten bei 72°C durchgeführt, gefolgt von einer anschließenden Inkubation für 5 Minuten bei 60°C. Das PCR Produkt wurde mit Hilfe des E.Z.N.A. Cycle-Pure Kits (PeqLab) gereinigt.
Für die Klonierung dieses Fragments, das die Bibliothek der hNGAL Muteine in Nukleinsäureform repräsentiert, wurde es zunächst mit dem Restriktionsenzym BstXI (New England Biolabs) entsprechend den Instruktionen des Herstellers geschnitten und mit Hilfe des E.Z.N.A. Cycle-Pure Kits gereinigt. Nach einem zweiten Restriktionsverdau mit BstXI wurde das Nukleinsäurefragment mittel präparativer Agarosegelelektrophorese gereinigt, was in einem doppelsträngigen DNA-Fragment mit einer Größe von 347 Nukleotiden resultierte. Die DNA des Vektors phNGAL5 wurde auf dieselbe Weise mit BstXI geschnitten, und das größere der beiden resultierenden Fragmente (3971 bp) wurde isoliert.
Für die Ligation wurden 2.75 µg (12 pmol) des PCR-Fragments und 31.45 µg (12 pmol) des Vektorfragments in der Gegenwart von 180 Weiss Units T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) in einem Gesamtvolumen von 600 µl (50 mM Tris/HCl pH 7.8, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 50 µg/ml BSA) für vier Tage bei 16°C inkubiert. Die DNA wurde anschließend durch Zugabe von 50 µg tRNA aus Hefe (Boehringer Mannheim), 125 µl 5 M Ammoniumacetat und 500 µl Ethanol pro 120 µl des Ligationsgemischs präzipitiert. Nach einer Inkubation bei –20°C für drei Tage folgte eine Zentrifugation (30 Minuten, 16000 g, 4°C). Jedes Präzipitat wurde mit 750 µl Ethanol (70 % v/v, –20°C) gewaschen, zentrifugiert (5 Minuten, 16000 g, 4°C) und unter Vakuum getrocknet (2 Minuten). Die DNA wurde schließlich in 200 µl TE/10 (1 mM Tris/HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA pH 8.0) gelöst und mit Wasser auf ein Endvolumen von 260 µl eingestellt.
Die Herstellung von elektrokompetenten Zellen des E. coli K12 Stamms XL1-Blue (Bullock et al., supra) wurde gemäß der Verfahren durchgeführt, die von Tung und Chow (Trends Genet. 11 (1995), 128-129) und von Hengen (Trends Biochem. Sci. 21 (1996), 75-76) beschrieben wurden. 1 l LB-Medium wurde durch Zugabe einer stationären XL1-Blue Übernachtkultur auf eine optische Dichte bei 600 nm von OD₆₀₀ = 0.08 eingestellt und bei 200 rpm und 26°C in einem 2 l Erlenmeyerkolben inkubiert. Nach Erreichen einer OD₆₀₀ = 0.6 wurde die Kultur für 30 Minuten auf Eis abgekühlt und anschließend für 15 Minuten bei 4000 g und 4°C zentrifugiert. Das Zellsediment wurde zweimal jeweils mit 500 ml eiskaltem 10 % w/v Glyzerin gewaschen und wurde schließlich in 2 ml eiskaltem GYT-Medium (10 % w/v Glyzerin, 0.125 % w/v Hefeextrakt, 0.25 % w/v Trypton) resuspendiert.
Das Micro Pulser System (Biorad) wurde mit den Küvetten desselben Herstellers (Elektrodenabstand 2 mm) für die Elektroporation verwendet. Alle Schritte wurden im Kühlraum bei 4°C durchgeführt. Jeweils 5 µl der oben erwähnten DNA-Lösung wurden mit 40 µl der Zellsuspension gemischt, 1 Minute auf Eis inkubiert und schließlich in die Küvette transferiert. Nach der Elektroporation wurde die Suspension sofort in 2 ml eiskaltem SOC-Medium (2 % w/v Trypton, 0.5 % w/v Hefeextrakt, 10 ml NaCl, 10 mM MgSO₄, 10 mM MgCl₂) verdünnt und 60 Minuten bei 37°C und 200 rpm geschüttelt. Die Kultur wurde in 2 Liter 2 × YT-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin (2YT/Amp) verdünnt und kultiviert, bis die von den replizierenden Zellen hervorgerufene OD₅₅₀ 0.64 erreichte. Durch die Verwendung von insgesamt 34.2 µg der ligierten DNA wurden auf diese Weise mit 49 Elektroporationsversuchen 7 × 10⁷ Transformanden erhalten. Die Transformanten wurden in der Folge entsprechend Beispiel 2 verwendet.
Beispiel 2: Phagemidpräsentation und Selektion von hNGAL Muteinen gegen humanes Tränenlipocalin
200 ml der Kultur, welche die Zellen enthält, die mit den zu phNGAL5 ähnlichen Phasmidvektoren transformiert wurden, welche die Bibliothek der Lipocalinmuteine als Fusionsproteine kodieren, wurden in einen sterilen Erlenmeyerkolben transferiert. Nach Infektion mit dem VCS-M13 Helferphagen (Stratagene) in einer Infektionsmultiplizität (multiplicity of infection) von annähernd 10 wurde die Kultur für weitere 30 Minuten bei 37°C und 160 rpm geschüttelt. Anschließend wurde Kanamycin (70 µg/ml) zugegeben, die Inkubatortemperatur wurde auf 30°C vermindert und nach 10 Minuten wurde Anhydrotetracyclin (ACROS Organics) in einer Konzentration von 100 µg/l (200 µl einer 100 µg/ml Stammlösung in Dimethylformamid, DMF) zugegeben, um die Genexpression zu induzieren. Die Inkubation wurde weitere 5 Stunden bei 30°C und 160 rpm fortgesetzt.
50 ml dieser Kultur wurden entnommen, und die Zellen wurden mittels Zentrifugation (15 Minuten, 12000 g, 4°C) sedimentiert. Der Überstand mit den Phagemidpartikeln wurde sterilfiltriert (0.45 µm), mit 1/4 Volumen (12.5 ml) 20 % w/v PEG 8000, 15 % w/v NaCl gemischt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach einer Zentrifugation (20 Minuten, 18000 g, 4°C) wurden die präzipitierten Phagemidpartikel in 2 ml kaltem PBS (4 mM KH₂PO₄, 16 mM Na₂HPO₄, 115 mM NaCl, pH 7.4). Die Lösung wurde auf Eis für 30 Minuten inkubiert und auf zwei 1.5 ml Reaktionsgefäße verteilt. Nach Zentrifugation der unlöslichen Bestandteile (5 Minuten, 18500 g, 4°C) wurde jeder Überstand in ein neues Reaktionsgefäß transferiert.
Ein Vermischen mit 1/4 Volumen 20 % w/v PEG 8000, 15 % w/v NaCl und eine Inkubation für 30 bis 60 Minuten auf Eis diente der Repräzipitation der Phagemidpartikel. Nach einer Zentrifugation (20 Minuten, 18500 g, 4°C) wurde der Überstand entfernt, und die präzipitierten Phagemidpartikel wurden gelöst und in einem Gesamtvolumen von 400 µl PBS vereinigt. Nach Inkubation für 30 Minuten auf Eis wurde die Lösung zentrifugiert (5 Minuten, 18500 g, 4°C), um die verbliebenen Aggregate zu entfernen, und der Überstand wurde direkt für die Affinitätsanreicherung verwendet.
Immuno-Sticks (NUNC) wurden für die Affinitätsanreicherung der rekombinanten Phagemide verwendet, welche die hNGAL Muteinfusionsproteine enthalten. Diese wurden Übernacht mit 800 µl humanem Tränenlipocalin (Tlpc) (450 µg/ml) in PBS beschichtet.
Für die Herstellung des rekombinanten Tlpc wurden Zellen von E. coli JM83 (Yanisch-Perron et al., Gene 33 (1985), 103-119) mit dem Expressionsplasmid pTLpc3 transformiert, das die cDNA von Tlpc enthält (für die cDNA von Tlpc siehe Holzfeind and Redl, Gene 139 (1994), 177-183) und für die Proteinproduktion und Reinigung gemäß Beispiel 3 verwendet. Die Proteinausbeute lag bei etwa 2.2 mg pro 1 l Kulturvolumen.
Nicht besetzte Bindungsstellen auf der Oberfläche des Immuno-Sticks wurden durch Inkubation mit 1.2 ml 2 % w/v BSA in PBST (PBS mit 0.1 % v/v Tween 20) für 2 Stunden bei RT abgesättigt. Anschließend wurde der Immuno-Stick mit einem Gemisch aus 250 µl Phagemidlösung und 500 µl Blockierungspuffer (3 % w/v BSA in PBST) für eine Stunde bei RT inkubiert.
Zur Entfernung ungebundener Phagemide wurden acht Waschschritte durchgeführt, jedes Mal mit 950 µl PBST für 2 Minuten. Absorbierte Phagemide wurden schließlich durch eine zehnminütige Behandlung des Immuno-Sticks mit 950 µl 0.1 M Glycin/HCl pH 2.2 eluiert, gefolgt von der sofortigen Neutralisation des pH der Elutionsfraktion durch Mischen derselben mit 150 µl 0.5 M Tris.
Für die Amplifikation wurde diese Phagemidlösung (1.1 ml, die abhängig vom Selektionszyklus zwischen 106 und 108 kolonie-bildende Einheiten (colony forming units) enthalten) kurz auf 37°C erwärmt, mit 3 ml einer exponentiell wachsenden Kultur von E. coli XL1-Blue (OD₅₅₀ = 0.5) gemischt und 30 Minuten bei 37°C und 200 rpm inkubiert. Die mit den Phagemiden infizierten Zellen wurden anschließend sedimentiert (2 Minuten, 4420 g, 4°C), in 600 µl Kulturmedium resuspendiert und auf drei Agarplatten mit LB-Medium, das 100 µg/ml Amicillin enthält (LB/Amp; 140 mm Durchmesser) ausplattiert.
Nach einer Inkubation für 14 Stunden bei 32°C wurden die Zellen von den Agarplatten gekratzt, jeweils durch Zugabe von 10 ml 2 × YT/Amp-Medium, in einen sterilen Erlenmeyerkolben transferiert und 20 Minuten bei 37°C und 200 rpm zur vollständigen Suspendierung geschüttelt. 200 ml auf 37°C vorgewärmtes 2 × YT/Amp-Medium wurden mit einem geeigneten Volumen dieser Suspension in einer OD₅₅₀ = 0.08 inokuliert.
Für die wiederholte Produktion und Affinitätsanreicherung der Phagemidpartikel wurde das am Beginn dieses Beispiels beschriebene Verfahren verwendet. In diesen Fällen wurden 50 ml 2 × YT/Amp-Medium mit 0.2 bis 1 ml der Suspension aus den auf den Agarplatten angezogenen Zellen inokuliert, und die Phagemide wurden während einer Periode von 7 anstelle von 5 Stunden bei 30°C erzeugt. Vier weitere Selektionszyklen mit dem Tlpc wurden auf diese Weise durchgeführt.
Beispiel 3: Identifikation von hNGAL Muteinen, die humanes Tränenlipocalin binden, mit Hilfe des "Colony Screening-Verfahrens"
Für die analytische Herstellung der hNGAl Muteine als Fusionsproteine mit dem Strep-Tag^® II sowie der Albumin-Bindedomäne und ihre Charakterisierung durch Colony Screening wurde die Genkassette zwischen den beiden BstXI Schnittstellen aus dem Vektor phNGAL5 in phNGAL7 subkloniert.
Zu diesem Zweck wurde mit Hilfe des Perfectprep Plasmid Midi Kits (Eppendorf) die Phasmid-DNA aus dem Gemisch von E. coli Klonen isoliert, die durch Infektion mit den Phagemiden aus Beispiel 2 erhalten wurden, welche als Ergebnis des letzten Selektionszyklus eluiert wurden. Die DNA wurde mit dem Restriktionsenzym BstXI geschnitten, und das kleinere der beiden Fragmente (347 bp) wurde mittels präparativer Agarosegelelektrophorese gereinigt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die DNA des Vektors phNGAL7 wurde mit BstXI geschnitten, und das größere der beiden Fragmente (3971 bp) wurde auf die gleiche Weise isoliert.
Für die Ligation wurden jeweils 100 fmol der beiden DNA-Fragmente mit 1.5 Weiss Units T4 DNA-Ligase (Promega) in einem Gesamtvolumen von 20 µl (30 mM Tris/HCl pH 7.8, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 1 mM ATP) gemischt, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei 16°C. E. coli TG1-F^– (E. coli K12 TG1, der sein Episom durch wiederholtes Kultivieren unter nicht-selektiven Bedingungen verloren hat) wurde mit 2 µl dieses Ligationsgemischs gemäß dem CaCl₂-Verfahren (Sambrook et al., supra) transformiert.
Eine hydrophile PVDF Membran (Millipore, Typ GVWP, Porengröße 0.22 µm), an einer Stelle markiert und zurechtgeschnitten, wurde auf eine LB/Amp Agarplatte gelegt. 150 µl der Zellsuspension aus dem Transformationsansatz, der zentrifugiert (5000 g, 2 min, 4°C) und in 500 µl Kulturmedium resuspendiert wurde, wurden gleichmäßig auf diese Membran plattiert. Die Agarplatte wurde 7.5 Stunden bei 37°C inkubiert, bis die Kolonien eine Größe von etwa 0.5 mm erreicht hatten.
In der Zwischenzeit wurde eine hydrophobe Membran (Millipore, Immobilon P, Porengröße 0.45 µm) ebenfalls zurechtgeschnitten, mit PBS entsprechend den Anweisungen des Herstellers benetzt. Anschließend wurde sie 4 Stunden bei Raumtemperatur in einer Lösung aus 10 mg/ml humanem Serumalbumin (HSA, Sigma) in PBS geschüttelt. Die verbliebenen Bindungsstellen auf der Membran wurden durch Inkubation mit 3 % w/v BSA, 0.5 % v/v Tween 20 in PBS für 2 Stunden bei RT abgesättigt. Die Membran wurde zweimal 10 Minuten mit jeweils 20 ml PBS gewaschen und anschließend 10 Minuten in 10 ml LB/Amp-Medium geschüttelt, zu dem 200 µg/l Anhydrotetracyclin gegeben wurden. Anschließend wurde sie an einer Stelle markiert und auf eine Kulturplatte mit LB/Amp-Agar gelegt, der zusätzlich 200 µg/l Anhydrotetracyclin enthielt. Die hydrophole Membran, auf der die Kolonien angezogen wurden, wurde so auf die hydrophobe Membran gelegt, dass die beiden Markierungen übereinander lagen. Die Kulturplatte wurde mit beiden Membranen bei 22°C für 15 Stunden inkubiert. Während dieser Phase wurden die entsprechenden hNGAL Muteine von den Kolonien sekretiert und über die albumin-bindende Domäne auf dem HSA auf der unteren Membran immobilisiert.
Anschließend wurde die obere Membran mit den Kolonien auf eine frische LB/Amp-Agarplatte transferiert und bei 4°C gelagert. Die hydrophobe Membran wurde entfernt, dreimal für 5 Minuten mit jeweils 20 ml PBST gewaschen und anschließend eine Stunde in 10 ml einer Lösung eines Konjugats (10 µg/ml) aus Tränenlipocalin und Biotin in PBST inkubiert. Für die Herstellung des Konjugats wurde eine Lösung aus 0.285 mg D-Biotinoyl-ε-amidocapronsäure-N-hydroxysuccinimidester (Roche) in 9 µl DMSO langsam zu 2.5 ml 450 µg/ml Tlpc in 5 % w/v NaHCO₃ (pH 8.2) gegeben. Nach einstündigem Rühren bei RT wurde der überschüssige Reaktant mit Hilfe einer PD-10 Gelfiltrationssäule (Pharmacia) und PBS als Laufpuffer entfernt.
Nach der Inkubation mit dem Konjugat wurde die Membran dreimal mit PBST gewaschen, gefolgt von einer Inkubation für eine Stunde mit 10 ml Avidin/Alkalische Phosphatase-Konjugat (Sigma, Verdünnung 1:40000 in PBST). Die Membran wurde anschließend jeweils 5 Minuten zweimal mit PBST und einmal mit PBS gewaschen und 10 Minuten in AP-Puffer (0.1 M Tris/HCl pH 8.8, 0.1 M NaCl, 5 mM MgCl₂) geschüttelt. Für die Farbreaktion wurde die Membran in 10 ml AP-Puffer inkubiert, zu dem 30 µl 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat-4-toluidinsalz (Roth, 50 µg/ml in Dimethylformamid) und 5 μl Nitroblau-Tetrazolium (Roth, 75 µg/ml in 70 % v/v Dimethylformamid) gegeben wurden, bis distinkte Farbsignale an den Positionen einiger der Kolonien erkannt werden konnten. Auf diese Weise wurde die Bindungsaktivität für den Proteinliganden, i.e. Tlpc, der durch diese Kolonien erzeugten hNGAL Muteine detektiert.
Zwölf Kolonien, die gefärbte Spots ergaben, wurden von dieser ersten Membran kultiviert. Ihre Plasmid-DNA wurde isoliert und die hNGAL Genkassette wurde unter Verwendung des Oligodeoxynukleotids SEQ ID NO: 11 als Primer einer Sequenzanalyse mit Hilfe des Genetic Analyzer 310 Systems (Applied Biosystems) entsprechend den Instruktionen des Herstellers unterzogen. Die zwölf sequenzierten Klone zeigten nur acht verschiedene Sequenzen, die als TlpcA, TlpcB, TlpcC, TlpcD, TlpcE, TlpcF, TlpcG und TlpcH bezeichnet wurden. Der Klon TlpcA wurde fünfmal gefunden. Die Nukleotidsequenzen der Klone wurden in die Aminosäuresequenzen übersetzt, und diejenigen Aminosäuren, die von hNGAL abgeleitet sind, sind in Tabelle 1 angegeben. Die Aminosäuresequenz und die Nukleotidsequenz des Muteins TlpcA sind weiterhin als SEQ ID NO: 12 bzw. SEQ ID NO: 13 angegeben. Die Sequenzierung offenbarte Amber Stop-Codons an verschiedenen Positionen in allen selektierten Varianten, die in den verwendeten E. coli Stämmen supprimiert waren.
Beispiel 4: Erzeugung der hNGAL Muteine
Für die präparative Produktion von hNGAL und seiner Muteine wurden eine selektierte Kolonie sowie das ursprünglich auf phNGAL7 kodierte hNGAL als Kontrolle in dem E. coli Stamm TG1-F^– erzeugt.
Zu diesem Zweck wurden 100 ml LB/Amp-Medium mit einer Einzelkolonie des TG1-F^– Transformanten inokuliert, der das entsprechende Plasmid trägt, und über Nacht bei 30°C und 200 rpm inkubiert. 2 l LB/Amp-Medium in einem 5 l Erlenmeyerkolben wurden im Anschluss mit jeweils 40 ml dieser Vorkultur inkubiert und bei 22°C und 200 rpm bis zu einer OD⁵⁵⁰ = 0.5 geschüttelt. Die Induktion wurde durch Zugabe von 200 µl/l Anhydrotetracyclin durchgeführt (200 µl einer 2 mg/ml Stammlösung in DMF), gefolgt von einem weiteren dreistündigen Schütteln bei 22°C und 200 rpm.
Die Zellen aus einem Kolben wurden zentrifugiert (15 Minuten, 4420 g, 4°C) und nach dem Abgießen des Überstands in 20 ml eines Puffers zur periplasmatischen Freisetzung (100 mM Tris/HCl pH 8.0, 500 mM Sucrose, 1 mM EDTA) unter dreißigminütigem Abkühlen auf Eis resuspendiert. Anschließend wurden die Sphäroplasten in zwei aufeinander folgenden Zentrifugationsschritten (15 Minuten, 4420 g, 4°C und 15 Minuten, 30000 g, 4°C) entfernt. Der Überstand, der den periplasmatischen Proteinextrakt umfasst, wurde gegen CP-Puffer (100 mM Tris/HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA) dialysiert, sterilfiltriert und diente für die chromatographische Reinigung.
Die Reinigung erfolgt mit Hilfe des Strep-Tag^® II Affinitätstags (Schmidt et al., supra), das zwischen der hHNGAL Variante und der albumin-bindenden Domäne lokalisiert war. Im vorliegenden Fall wurde das Streptavidinmutein "1" verwendet (Deutsches Patent 196 41 876.3, Voss und Skerra, Protein Eng. 10 (1997), 975-982), das an NHS-aktivierte Sepharose (Pharmacia) gekoppelt war, was relativ zum Bettvolumen der Matrix 5 mg/ml immobilisiertes Streptavidin erbrachte.
Eine mit diesem Material gefüllt Chromatographiesäule mit einem Bettvolumen von 4 ml wurde mit 20 ml CP-Puffer bei 4°C und einer Flussrate von 40 ml/Stunde äquilibriert. Die Chromatographie wurde durch Messen der Absorption des Eluats bei 280 nm in einem Durchflussphotometer überwacht. Nach der Applikation des periplasmatischen Proteinextrakts wurde die Säule mit CP-Puffer gewaschen, bis die Basislinie erreicht war, und das gebundene hNGAL Mutein wurde im Anschluss mit 10 ml einer Lösung aus 2.5 mM D-Desthiobiotin (Sigma) in CP-Puffer eluiert. Die Fraktionen mit dem gereinigten hNGAL Mutein wurden mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (Fling und Gregerson, Anal. Biochem. 155 (1986), 83-88) überprüft und vereinigt. Die Proteinausbeuten lagen zwischen 30 µg und 70 µg pro 1 l Kultur. Tabelle 1: Sequenzcharakteristika selektierter hNGAL Muteine

* Diese Glutaminreste wurden von Amber Stop-Codons kodiert.
° Diese Aminosäuresubstitutionen entstanden durch Zufallsmutationen.

Beispiel 5: Messung der Affinität der hNGAL Muteine für Tränenlipocalin
Für die Detektion einer Bindung in einem ELISA (enzym-gekoppelter Immunosorbentassay) wurden die Wells einer Mikrotiterplatte (Micro Test III Flexible Assay Plate, Falcon) jeweils mit 100 µl einer 20 mg/ml Lösung HSA in PBST befüllt und eine Stunde bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBST wurden 50 µl einer 1 µM Lösung des gereinigten Fusionsproteins des hNGAL Muteins TlpcA und von hNGAL aus Beispiel 3 in die Wells gegeben, sodass das Protein durch Komplexbildung zwischen der ABD und HSA immobilisiert wurde. Nach einer Stunde wurde die Lösung entfernt und dreimal mit PBST gewaschen. Anschließend wurde eine Verdünnungsreihe in PBST eines Konjugats aus Tränenlipocalin und Biotin in PBST, ausgehend von 140 µg/ml, (Beispiel 3) hergestellt, gefolgt von einer einstündigen Inkubation bei RT. Nach dreimaligem Waschen mit PBST wurde ein Avidin/Alkalische Phosphatase-Konjugat (Sigma), verdünnt 1:10000 mit PBST, in die Wells gegeben. Die Inkubation wurde eine Stunde bei RT durchgeführt, gefolgt von zweimaligem Waschen mit PBST und zweimal mit PBS. Die Detektion des an die immobilisierten hNGAL Muteine gebundenen Tränenlipocalins wurde im Anschluss über die durch die alkalische Phosphatase katalysierte Hydrolyse von P-Nitrophenylphosphat erreicht. Zu diesem Zweck wurden 100 μl einer Lösung aus 0.5 mg/ml P-Nitrophenylphosphat (Amresco) in AP-Puffer (100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 100 mM Tris/HCl pH 8.8) in die Wells gegeben, und die Produktbildung wurde durch Messung der Absorption bei 405 nm in einem SpectraMax 250 Photometer (Molecular Devices) überwacht.
Beispiel 6: Herstellung einer Bibliothek mit mehr als 10 Milliarden unabhängigen hNGAL Muteinen
Eine Zufallsbibliothek von hNGAL mit erhöhter Diversität wurde durch konzertierte Mutagenese von insgesamt 20 ausgewählten Aminosäurepositionen in den vier Peptidschleifen unter Verwendung von PCR in multiplen Schritten gemäß 2 hergestellt. Die PCR-Reaktionen in den beiden ersten Amplifikationsschritten wurden in einem Volumen von 100 µl durchgeführt, wobei 10 ng phNGAL5 Plasmid-DNA (1) als Template verwendet wurden, zusammen mit 50 pmol eines jeden Primerpaares (SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 bzw. SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4), die gemäß dem herkömmlichen Phosphoramiditverfahren synthetisiert wurden. Zusätzlich enthielt das Reaktionsgemisch 10 µl 10 × Taq-Puffer (100 mM Tris/HCl pH 9.0, 500 mM KCl, 15 mM MgCl₂, 1 % v/v Triton X-100) und 10 µl dNTP-Mix (2 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP). Nach einstellen des Volumens mit Wasser wurden 5 U Taq DNA-Polymerase (5 U/µl, Promega) zugegeben, und es wurden 20 Temperaturzyklen mit einer Minute bei 94°C, einer Minute bei 60°C und 1.5 Minuten bei 72°C in einem Thermocycler mit einem beheizbaren Deckel (Eppendorf) durchgeführt, gefolgt von einer abschließenden Inkubation für 5 Minuten bei 60°C. Das gewünschte Amplifikationsprodukt wurde in jedem Fall mittels präparativer Agarosegelelektrophorese aus GTQ Agarose (Roth) unter Verwendung des Jetsorb DNA Extraktionskits (Genomed) isoliert.
Der anschließende Amplifikationsschritt wurde ebenfalls in einem 100 µl Gemisch durchgeführt, wobei in der Gegenwart von jeweils 50 pmol der Primer SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6 etwa 6 ng der beiden DNA-Fragmente als Template verwendet wurde. Beide Primer trugen eine Biotin-Gruppe an ihren 5'-Enden, im Gegensatz zu Beispiel 1. Die übrigen Komponenten des PCR-Gemisches wurden in den gleichen Mengen wie in den vorangegangenen Amplifikationsschritten zugegeben. Die PCR wurde mit 20 Temperaturzyklen von 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 60°C und 1.5 Minuten bei 72°C durchgeführt, gefolgt von einer abschließenden Inkubation für 5 Minuten bei 60°C. Das PCR-Produkt wurde mit Hilfe des E.Z.N.A. Cycle-Pure Kits (PeqLab) gereinigt.
Für die Klonierung des DNA-Fragments, das die Bibliothek der hNGAL Muteine in Nukleinsäureform repräsentiert, wurde das 5'-biotinylierte PCR-Produkt mit dem Restriktionsenzym BstXI (Promega) gemäß den Anweisungen des Herstellers geschnitten, und das resultierende Fragment mit einer Größe von 347 Nukleotiden wurde mittels präparativer Agarosegelelektophorese gereinigt, wie oben beschrieben. Verbliebene DNA-Fragmente, die nicht oder nur unvollständig verdaut wurden, wurden über ihre 5'-Biotintags durch Inkubation mit streptavidin-beschichteten paramagnetischen Kügelchen (beads; Dynal) entfernt, wodurch das doppelt geschnittene DNA-Fragment erhalten wurde, das für die nachfolgende Ligationsreaktion geeignet ist.
Zu diesem Zweck wurden 100 µl einer kommerziell verfügbaren Suspension paramagnetischer Partikel in einer Konzentration von 10 mg/ml dreimal mit 100 µl TE-Puffer gewaschen. Die paramagnetischen Partikel wurden im Anschluss getrocknet und mit 11 bis 22 pmol des DNA-Fragments in 100 µl TE-Puffer 15 Minuten bei Raumtemperatur gemischt. Die paramagnetischen Partikel wurden mit Hilfe eines Magneten an der Wand eines Eppendorfgefäßes gesammelt, und der Überstand mit dem gereinigten DNA-Fragment wurde für die weitere Verwendung in der anschließenden Ligationsreaktion entfernt.
Die DNA des Vektors phNGAL12 (6) wurde mit BstXI geschnitten, wie oben beschrieben, und das größere der beiden resultierenden Fragmente (3971 bp) wurde mittels präparativer Agarosegelelektrophorese isoliert. Für die Ligation wurden 6.85 µg (30 pmol) des PCR-Fragments und 78.65 µg (30 pmol) des Vektorfragments in der Gegenwart von 855 Weiss Units T4 DNA-Ligase (Promega) in einem Gesamtvolumen von 8550 µl (50 mM Tris/HCl pH 7.8, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 50 µg/ml BSA) für 4 Tage bei 16°C inkubiert. Die DNA wurde im Anschluss durch Zugabe von 110 µg tRNA aus Hefe (Boehringer Mannheim), 350 µl 5 M Ammoniumacetat und 1300 µl Ethanol pro 350 µl Ligationsgemisch präzipitiert. Nach einer Inkubation bei –20°C für 2 Tage erfolgte eine Zentrifugation (30 Minuten, 16000 g, 4°C). Jedes Präzipitat wurde mit 750 µl Ethanol (70 % v/v, –20°C) gewaschen, zentrifugiert (5 Minuten, 16000 g, 4°C) und unter Vakuum getrocknet (2 Minuten). Abschließend wurde die DNA in einem Gesamtvolumen von 427.5 µl Wasser gelöst, um eine Endkonzentration von 200 µg/ml zu ergeben.
Die Herstellung elektrokompetenter Zellen des E. coli K12 Stamms XL1-Blue (Bullock et al., supra) wurde entsprechend der Verfahren durchgeführt, die unter Beispiel 1 beschrieben sind.
Das Micro Pulser System (BioRad) wurde in Verbindung mit den Küvetten desselben Herstellers (Elektrodenabstand 2 mm) für die Elektroporation verwendet. Alle Schritte wurden im Kühlraum bei 4°C durchgeführt. Jeweils 10 µl der obigen DNA-Lösung (2 µg) wurde mit 100 µl Zellsuspension gemischt, 1 Minute auf Eis inkubiert und in die vorgekühlte Küvette transferiert. Im Anschluss wurde die Elektroporation durchgeführt (5 ms, 12.5 kV/cm), und die Suspension wurde sofort in 2 ml eiskaltem SOC-Medium verdünnt, gefolgt von einem sechzigminütigem Schütteln bei 37°C und 200 rpm. Die Kultur wurde in 1.5 l 2 × YT-Medium, das 100 µg/ml Ampicillin enthielt (2YT/Amp), auf eine OD₅₅₀ von 0.5 verdünnt und bei 37°C kultiviert, bis die durch die replizierenden Zellen verursachte OD₅₅₀ auf 0.7 angestiegen war. Durch Verwenden von insgesamt 85.5 µg der ligierten DNA wurden auf diese Weise mit insgesamt 43 Elektroporationsexperimenten 1.8 × 10¹⁰ Transformanten erhalten. Die Transformanten wurden in der Folge entsprechend Beispiel 7 verwendet.
Beispiel 7: Phagemidpräsentation und Selektion von hNGAL Muteinen gegen ein Acht-Aminosäure-Peptid aus der zell-bindenden Domäne des humanen Thrombospondin 1 ("Thrombospondinpeptid")
Die 1500 ml Kultur mit den Zellen, die mit den Phasmidvektoren transformiert wurden, welche phNGAL12 entsprechen, aber für die Bibliothek der Lipocalinmuteine als Fusionsproteine kodieren, wurden mit dem VCS-M13 Helferphagen (Stratagene) in einer Infektionsmultiplizität von ungefähr 10 infiziert. Die Kultur wurde für weitere 30 Minuten bei 37°C und 160 rpm geschüttelt. Im Anschluss wurde die Inkubatortemperatur auf 26°C gesenkt, und Kanamycin (70 µg/ml) wurde zugegeben. Nach 10 Minuten wurde Anhydrotetracyclin in einer Konzentration von 25 µg/l zugegeben (1875 µl einer 20 µg/ml Stammlösung in DMF), um die Genexpression zuinduzieren. Die Inkubation wurde für weitere 15 Stunden bei 26°C und 160 rpm fortgesetzt.
Die Zellen wurden mittels Zentrifugation (60 Minuten, 12500 g, 4°C) sedimentiert. Der Überstand mit den Phagemidpartikeln wurde sterilfiltriert (0.45 µm), mit 1/4 Volumen (375 ml) eiskaltem 20 % w/v PEG 8000, 15 % w/v NaCl gemischt und eine Stunde bei 4°C inkubiert. Nach einer Zentrifugation (30 Minuten, 18500 g, 4°C) wurden die präzipitierten Phagemidpartikel in 60 ml kaltem PBS gelöst. Die Lösung wurde 60 Minuten auf Eis inkubiert und auf zwei SS34 Zentrifugenröhrchen verteilt. Nach Zentrifugation der ungelösten Bestandteile (5 Minuten, 18500 g, 4°C) wurde jeder Überstand in ein neues Zentrifugenröhrchen transferiert.
Die Phagemidpartikel wurden durch Mischen mit 1/4 Volumen 20 w/v PEG 8000, 15 % w/v NaCl repräzipitiert, gefolgt von einer sechzigminütigen Inkubation auf Eis. Die Phagemide wurden aliquotiert (2 ml), und es wurden 1 mM EDTA und 50 mM Benzamidin (Sigma) für die langfristige Lagerung bei –20°C zugegeben.
Das biotinylierte synthetische Thrombospondinpeptid, das aus der zell-bindenden Domäne von humanen Thrombospondin 1 abgeleitet ist (Tulasne et al., Blood 98 (2001), 3346-3352; H₂N-Arg-Phe-Tyr-Val-Val-Met-Trp-Lys-Aca-Aca-Lys-Biotin-COOH, SEQ ID NO: 18, Aca: Aminocapronsäure) wurde zusammen mit streptavidin-beschichteten paramagnetischen Partikeln (Dynal) als Target für die AffinitätsaNOeicherung aus der Bibliothek der die hNGAL Muteine repräsentierenden Phagemide verwendet.
Zu diesem Zweck wurde ein 2 ml Aliquot der präzipitierten Phagemide von oben zentrifugiert (20 Minuten, 18500 g, 4°C), der Überstand wurden entfernt, und die sedimentierten Phagimidpartikel wurden in 1 ml PBS gelöst. Nach einer dreißigminütigen Inkubation auf Eis wurde die Lösung zentrifugiert (5 Minuten, 18500 g, 4°C), um verbliebene Aggregate zu entfernen, und der Überstand wurde direkt für die Affinitätsanreicherung verwendet.
Um peptid-bindende Phagemide anzureichern, wurden 40 µl einer 825 nM Lösung (33 pmol) des biotinylierten Thrombospondinpeptids in PBS (hergestellt durch Mischen von 100 µl einer 10 µM Lösung des synthetischen Peptids in DMF mit 1112 µl PBS) mit 260 µl einer Lösung aus frisch hergestellten Phagemiden (zwischen 2 × 10¹² und 5 × 10¹² kolonie-bildende Einheiten, cfu) gemischt und eine Stunde bei RT inkubiert, sodass eine Komplexbildung zwischen dem Peptid und den von den Phagemiden präsentierten Muteinen ermöglicht wurde. Im Anschluss wurden 100 µl einer Lösung aus 8 % v/w BSA, 0.4 v/v Tween 20 in PBS zugegeben.
Parallel dazu wurden 100 µl einer kommerziell verfügbaren Suspension steptavidin-paramagnetischer Partikel (Dynal) dreimal mit 100 µl PBS gewaschen. Darin wurden die Partikel durch Rotieren des 1.5 ml Eppendorfgefäßes 1 Minute in Suspension gehalten und im Anschluss mit Hilfe eines Magneten an der Wand des Gefäßes gesammelt, und der Überstand wurde entfernt. Um unspezifische Bindungsstellen abzusättigen, wurden die paramagnetischen Partikel mit 100 µl 2 % w/v BSA in PBST eine Stunde bei RT inkubiert.
Nach Entfernen des Überstands wurde das Gemisch aus dem biotinylierten Thrombospondinpeptid und den Phagemiden zu den paramagnetischen Partikeln gegeben, und die Partikel wurden resuspendiert und 10 Minuten bei RT inkubiert. Schließlich wurden freie Biotin-Bindestellen von Streptavidin durch Zugabe von 10 µl einer 4 mM D-Desthiobiotin (Sigma)-Lösung in PBS zu dem Gemisch abgesättigt, und das Gemisch wurde 5 Minuten bei RT inkubiert. Dieser Schritt diente dazu, die Bildung eines Komplexes des Strep-Tag^® II – als Teil des Fusionsproteins der Muteine und des Fragments des Phagenhüllproteins pIII – mit Streptavidin zu verhindern.
Ungebundene Phagemide wurden durch achtmaliges Waschen der paramagnetischen Partikel mit 1 ml frischem PBST mit 1 mM D-Desthiobiotin entfernt. Jedes Mal wurden die Partikel mit Hilfe des Magneten gesammelt, und der Überstand wurde verworfen. Schließlich wurden die gebundenen Phagemide durch Resuspendieren der Partikel in 950 µl 0.1 M Glycin/HCl pH 2.2 und fünfzehnminütige Inkubation eluiert. Nach dem Sammeln der Partikel mit Hilfe des Magneten wurde der Überstand entnommen und sofort durch Zugabe von 150 µl 0.5 M Tris neutralisiert.
Für die Amplifikation wurde diese Phagemidlösung (1.1 ml, die abhängig vom Selektionszyklus zwischen 10⁷ und 10¹⁰ cfu enthalten) kurz auf 37°C erwärmt, mit 3 ml einer exponentiell wachsenden Kultur, von E. coli XL1-Blue (OD₅₅₀ = 0.5 bei 37°C) gemischt und 30 Minuten bei 37°C und 200 rpm inkubiert. Die mit den Phagemiden infizierten Zellen wurden im Anschluss sedimentiert (2 Minuten, 4420 g, 4°C), in 600 µl Kulturmedium resuspendiert und auf drei Agarplatten mit LB-Medium, das 100 µg/ml Ampicillin enthält (LB/Amp; 140 mm Durchmesser), ausplattiert.
Nach einer Inkubation von 14 Stunden bei 32°C wurden die Zellen von den Agarplatten gekratzt, jeweils durch Zugabe von 10 ml 2 × YT/Amp-Medium, in einen sterilen Erlenmeyerkolben transferiert und 20 Minuten bei 37°C und 200 rpm für eine vollständige Resuspendierung geschüttelt.
Für einen weiteren Zyklus zur Herstellung und Affinitätsanreicherung der Phagemidpartikel wurden 50 ml 2 × YT/Amp-Medium auf 37°C vorgewärmt und mit 0.2 bis 1 ml der Suspension inokuliert, sodass die Zelldichte OD₅₅₀ = 0.08 betrug. Diese Kultur wurde bei 37°C und 160 rpm bis zu einer Zelldichte von OD₅₅₀ = 0.5 inkubiert. Im Anschluss wurde die Kultur mit dem VCS-M13 Helferphagen (Stratagene) in einer Infektionsmultiplizität von ungefähr 10 infiziert, und die Kultur wurde für weiter 30 Minuten bei 37°C und 160 rpm geschüttelt. Kanamycin (70 µg/ml) wurde anschließend zugegeben, die Inkubatortemperatur wurde auf 26°C gesenkt, und nach 10 Minuten wurde Anhydrotetracyclin in einer Konzentration von 25 µg/l zugegeben, um die Genexpression zu induzieren. Die Inkubation wurde weitere 15 Stunden bei 26°C und 160 rpm fortgesetzt.
Die Zellen wurden mittels Zentrifugation (15 Minuten, 12000 g, 4°C) sedimentiert. Der Überstand mit den Phagemidpartikeln wurde sterilfiltriert (0.45 µm), mit 1/4 Volumen (12.5 ml) 20 % w/v PEG 8000, 15 % w/v NaCl gemischt und 1 Stunde auf Eis inkubiert. Nach einer Zentrifugation (20 Minuten 18000 g, 4°C) wurden die präzipitierten Phagemidpartikel in 2 ml kaltem PBS gelöst. Die Lösung wurde auf Eis für 30 Minuten inkubiert und auf zwei 1.5 ml Reaktionsgefäße verteilt. Nach Zentrifugation der ungelösten Bestandteile (5 Minuten, 18500 g, 4°C) wurde jeder Überstand in ein neues Reaktionsgefäß transferiert.
Die Phagemidpartikel wurden durch Mischen mit 1/4 Volumen 20 w/v PEG 8000, 15 % w/v NaCl repräzipitiert, gefolgt von einer sechzigminütigen Inkubation auf Eis. Nach einer Zentrifugation (20 Minuten, 18500 g, 4°C) wurde der Überstand entfernt, und die präzipitierten Phagemidpartikel wurden in 1 ml PBS gelöst. Nach einer dreißigminütigen Inkubation auf Eis wurde die Lösung zentrifugiert (5 Minuten, 18500 g, 4°C), und der Überstand wurde direkt für die Affinitätsanreicherung verwendet. Fünf weitere Selektionszyklen mit dem Thrombospondinpeptid wurden auf diese Art und Weise durchgeführt.
Beispiel 8: Identifikation von thrombospondinpeptid-bindenden hNGAL Muteinen mit Hilfe des "Colony Screening-Verfahrens"
Für die analytische Herstellung der hNGAL Muteine als Fusionsproteine mit dem Step-Tag^® II und der albumin-bindenden Domäne wurde die Genkassette zwischen den beiden BstXI Schnittstellen aus dem Vektor phNGAL12 in phNGAL7 subkloniert.
Zu diesem Zweck wurde unter Verwendung des Plasmid Midi Kit (Qiagen) die Phasmid-DNA aus dem Gemisch der E. coli Klone isoliert, die durch Infektion mit den Phagimiden aus Beispiel 7 erhalten wurden, welche als Ergebnis des vierten und des fünften Selektionszyklus eluiert wurden. Die DNA beider Präparationen wurde mit dem Restriktionsenzym BstXI geschnitten, und in jedem Fall wurde das kleinere der beiden Fragmente (347 bp) mittels präparativer Agerosegelelektrophorese gereinigt, wie in Beispiel 6 beschrieben. Die DNA des Vektors phNGAL7 wurde mit BstXI geschnitten, und das größere der beiden Fragmente (3971 bp) wurde auf dieselbe Weise isoliert.
Für die Ligation wurden jeweils 100 fmol der isolierten kleinen DNA-Fragmente mit 100 fmol des großen DNA-Fragments und mit 1.5 Weiss Units T4 DNA-Ligase (Promega) in einem Gesamtvolumen von 20 µl (30 mM Tris/HCl pH 7.8, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 1 mM ATP) gemischt, gefolgt von einer Inkubation bei 16°C über Nacht. E. coli TG1-F^– (E. coli K12 TG1, der sein Episom durch wiederholtes Kultivieren unter nicht-selektiven Bedingungen verloren hat) wurde mit jeweils 2 µl dieser Ligationsgemische entsprechend dem CaCl₂-Verfahren (Sambrook et al., supra) transformiert, wodurch 2.0 ml einer Zellsuspension erhalten wurden. 100 µl dieser Suspension wurden auf einer Agarplatte mit LB/Amp-Medium ausplattiert und bei 37°C für 14 Stunden inkubiert.
Zwei hydrophile PVDF Membranen (Millipore, Typ GVWP, Porengröße 0.22 µm), an einer Stelle markiert und zurechtgeschnitten, wurden auf LB/Amb-Agarplatten gelegt. 150 µl der Zellsuspension aus den Transformationsansätzen, die zentrifugiert (5000 g, 2 Minuten, 4°C) und in 500 µl Kulturmedium resuspendiert wurden, wurden gleichmäßig auf diese Membranen plattiert. Die Agarplatten wurden 7.5 Stunden bei 37°C inkubiert, bis die Kolonien eine Größe von etwa 0.5 mm erreicht hatten.
In der Zwischenzeit wurden zwei hydrophobe Membranen (Millipore, Immobilon P, Porengröße 0.45 µm), ebenfalls zurechtgeschnitten, mit PBS gemäß den Anweisungen des Herstellers benetzt. Diese wurden im Anschluss jeweils für 4 Stunden bei Raumtemperatur in 10 ml einer Lösung aus 10 mg/ml humanem Serumalbumin (HSA, Sigma) in PBS geschüttelt. Verbliebene Bindungsstellen auf den Membranen wurden durch Inkubation mit 20 ml 3 % w/v BSA, 0.5 % v/v TWEEN 20 in PBS für 2 Stunden bei RT abgesättigt. Die Membranen wurden zweimal 10 Minuten jeweils mit 20 ml PBS gewaschen und anschließend 10 Minuten in 10 ml LB/Amp-Medium inkubiert, zu dem 200 µg/l Anhydrotetracyclin gegeben wurden.
Schließlich wurden sie an einer Stelle markiert und auf Kulturplatten mit LD/Amp-Agar gelegt, der zusätzlich 200 µg/l Anhydrotetracyclin enthielt. Die hydrophilen Membranen von oben, auf denen die Kolonien angezogen wurden, wurden so auf die hydrophoben Membranen gelegt, dass die beiden Markierungen übereinander lagen. Die Kulturplatten wurden jeweils mit dem Stapel aus beiden Membranen bei 22°C für 15 Stunden inkubiert. Während dieser Phase wurden die entsprechenden hNGAL Muteine von den Kolonien auf den oberen Membranen sekretiert und über ihre albumin-bindende Domäne an das HSA auf den unteren Membranen immobilisiert.
Anschließend wurden die oberen Membranen mit den Kolonien auf frische LB/Amp-Agarplatten transferiert und bei 4°C gelagert. Die hydrophoben Membranen wurden entfernt und dreimal für 5 Minuten mit jeweils 20 ml PBST gewaschen.
Für die Analyse der Bindungsaktivität der immobilisierten hNGAL Muteine wurden die Membranen im Anschluss 1 Stunde in 10 ml einer 10 µg/ml Lösung des biotinylierten Thrombospondinpeptids in PBST (eine 1 mM Stammlösung des biotinylierten Peptids in DMF wurde dazu 1:100 in PBST verdünnt) inkubiert. Die Membranen wurden dreimal mit PBST gewaschen, gefolgt von einer einstündigen Inkubation mit 10 ml Avidin/Alkalische Phosphatase-Konjugat (Sigma, Verdünnung 1:40000 in PBST) zur Detektion der gebunden Peptide über ihre Biotin-Gruppen. Die Membranen wurden jeweils für 5 Minuten zweimal mit PBST und einmal mit PBS gewaschen und 10 Minuten in AP-Puffer (0.1 M Tris/HCl pH 8.8, 0.1 M NaCl, 5 mM MgCl₂) geschüttelt. Für die Farbreaktion wurden die Membranen in 10 ml AP-Puffer inkubiert, zu dem 30 µl 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat-4-toluidinsalz (Roth, gelöst in einer Konzentration von 50 µg/ml in Dimethylformamid) und 5 µl Nitroblau-Tetrazolium (Roth, 75 µg/ml in 70 % v/v Dimethylformamid) gegeben wurden, bis distinkte Farbsignale an den Positionen einiger der Kolonien erkannt werden konnten.
19 Kolonien (9 isoliert aus Selektionszyklus 4 und 10 aus Selektionszyklus 5) ergaben intensiv gefärbte Spots auf den hydrophoben Membranen und wurden von den entsprechenden hydrophilen Membranen kultiviert. Ihre Plasmid-DNA wurde isoliert, und die hNGAL Genkassette wurde mit Hilfe des Oligodeoxynukleotids SEQ ID NO: 11 als Primer unter Verwendung des Genetic Analyzer 310 Systems mit dem Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) gemäß den Anweisungen des Herstellers einer Sequenzanalyse unterzogen.
Die 19 sequenzierten Klone zeigten nur 12 verschiedene Sequenzen, die als RFY-A, RFY-B, RFY-C, RFY-D, RFY-E, RFY-F, RFY-G, RFY-H, RFY-I, RFY-J, RFY-K und RFY-L bezeichnet wurden. Der Klon RFY-B wurde zwölfmal und der Klon RFY-C sechsmal gefunden. Der RFY-J zeigte eine Deletion von drei Nukleotiden, die in der Deletion einer Aminosäure resultiert, welche in der Peptidschleife Nummer 4 an Position 125 lokalisiert war. In Klon RFY-L wurde ein Amber Stop-Codon identifiziert, das in einem supE Suppressorstamm in die Aminosäure Glutamin translatiert wurde.
Die Nukleotidsequenzen der Klone wurden in die Aminosäuresequenzen translatiert, und diejenigen Aminosäuren, die vom ursprünglichen hNGAL Protein abgeleitet sind, sind in den Tabellen 2a und 2b angegeben. Die Nukleotidsequenzen der Muteine RFY-B, RFY-C bzw. RFY-E sind in der Sequenzliste ferner als SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 bzw. SEQ ID NO: 27 wiedergegeben. Die Aminosäuresequenzen dieser Muteine sind in der Sequenzliste als SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26 bzw. SEQ ID NO: 28 angegeben.
Die Muteine RFY-D und RFY-C, die zweimal bzw. sechsmal gefunden wurden, wurden für eine detaillierte Charakterisierung ihrer Bindungsaktivität ausgewählt. Zusätzlich wurde das Mutein RFY-E ausgewählt, da seine Aminosäurezusammensetzung in den verzufälligten Regionen weitgehend einzigartig zu sein schien. Tabelle 2a: Sequenzcharakteristika selektierter hNGAL Muteine
Tabelle 2b: Sequenzcharakteristika selektierter hNGAL Muteine

* Dieser Glutaminrest wurde von einem Amber Stop-Codon kodiert.
° Diese Aminosäuresubstitutionen entstanden durch Zufallsmutationen außerhalb der verzufälligten Positionen.
Δ Diese Aminosäuredeletion entstand durch eine Zufallsmutation außerhalb der verzufälligten Positionen.

Beispiel 9: Herstellung von hNGAL Muteinen
Für die präparativer Herstellung der hNGAL Muteine RFY-B, RFY-C und RFY-E, die in Beispiel 8 erhalten wurden, wurde die mutagenisierte kodierende Region zwischen den beiden BstXI Schnittstellen aus dem Vektor phNGAL7 in das Expressionsplasmid phNGAL15 (7) subkloniert. Das so erhaltene Plasmid kodierte ein Fusionsprotein des Muteins mit der OmpA-Signalsequenz am Amino-Terminus und dem Strep-Tag^® II Affinitätstag am Carboxy-Terminus.
Für die Subklonierung wurde die für das relevante Mutein kodierende Plasmid-DNA mit dem Restriktionsenzym BstXI geschnitten, und das kleinere der beiden Fragmente (347 bp) wurde mittels präparativer Agarosegelelektophorese gereinigt, wie in Beispiel 6 beschrieben. Auf die gleiche Weise wurde die phNGAL14 Vektor-DNA mit BstXI geschnitten, und das größere der beiden Fragmente (3398 bp) wurde isoliert.
1.5 Weiss Units T4 DNA-Ligase (Promega) wurden zu jeweils 50 fmol der beiden DNA-Fragmente in einem Gesamtvolumen von 20 µl (30 mM Tris/HCl pH 7.8, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 1 mM ATP) gegeben, und das Gemisch wurde zur Ligation 16 Stunden bei 16°C inkubiert. 5 µl des Ligationsgemischs wurden im Anschluss verwendet, um E. coli JM83 (Yanisch-Perron et al., Gene 33 (1985), 103-119) gemäß dem CaCl₂-Verfahren zu transformieren, wodurch 2.0 ml einer Zellsuspension erhalten wurden. 100 µl dieser Suspension wurden auf einer Agarplatte mit LB/Amp-Medium ausplattiert und bei 37°C für 14 Stunden inkubiert.
Eine einzelne Kolonie der E. coli JM83 Transformanten wurde zum Inokulieren von 100 ml LB/Amb-Medium verwendet, gefolgt von einer Inkubation bei 30 °C und 200 rpm über Nacht. 2 l LB/Amp-Medium in einem 5 l Erlenmeyerkolben wurden im Anschluss mit 40 ml dieser Vorkultur inokuliert und bei 22°C und 200 rpm bis zu einer OD₅₅₀ = 0.5 geschüttelt. Die Induktion wurde durch die Zugabe von 200 µg/l Anhydrotetracyclin (200 µl einer 2 mg/ml Stammlösung in DMF) durchgeführt, gefolgt von einem weiteren dreistündigen Schütteln bei 22°C und 200 rpm.
Die Zellen eines Kolbens wurden zentrifugiert (15 Minuten, 4420 g, 4°C) und nach Entfernen des Überstands in 20 ml eines vorgekühlten Puffers zur periplasmatischen Freisetzung (100 mM Tris/HCl pH 8.0, 500 mM Sucrose, 1 mM EDTA) resuspendiert und 30 Minuten auf Eis inkubiert. Die Sphäroplasten wurden im Anschluss in zwei aufeinander folgenden Zentrifugationsschritten (15 Minuten, 4420 g, 4°C und 15 Minuten, 30000 g, 4°C) entfernt. Der Überstand mit dem periplasmatischen Proteinextrakt wurde gegen CP-Puffer (100 mM Tris/HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA) dialysiert, sterilfiltriert und für die chromatorgraphische Reinigung des hNGAL Muteins verwendet.
Das Reinigungsverfahren basierte auf den C-terminalen Strep-Tag^® II Affinitätstag (Schmidt et al., supra). Im vorliegenden Fall wurde das Streptavidinmutein "1" verwendet (Deutsches Patent 196 41 876.3, Voss und Skerra, supra) das an NHS-aktivierte Sepharose (Pharmacia) gekoppelt war, was 5 mg/ml immobilisiertes Streptavidin pro 1 ml Bettvolumen der Matrix ergab.
Eine mit diesem Material gefüllte Chromatographiesäule mit einem Bettvolumen von 4 ml wurde mit 20 ml CP-Puffer bei 4°C und einer Flussrate von 40 ml/Stunde äquilibriert. Die Chromatographie wurde durch Messen der Absorption des Eluats bei 280 nm in einem Durchflussphotometer überwacht. Nach der Applikation des periplasmatischen Proteinextrakts wurde die Säule mit CP-Puffer gewaschen, bis die Basislinie erreicht war, und das gebundene hNGAL Mutein wurde anschließend mit 10 ml einer Lösung aus 2.5 mM D-Desthiobitin (Sigma) in CP-Puffer eluiert. Die Fraktionen mit dem gereinigten hNGRL Mutein wurden mittel SDS-Ployacrylgelelektrophorese (Fling und Gregerson, supra) überprüft und vereinigt. Um geeignete Proteinkonzentrationen und Pufferbedingungen für weitere Anwendungen zu erhalten, wurden die vereinigten Muteinfraktionen unter Verwendung von Centriconröhrchen JM 10 (MW Cutoff 1000, Millipore) für die Ultrafiltration und anschließende Dialyse gegen HBS-Puffer (150 mM NaCl, 10 mM HEPES pH 7.4, 3 mM EDTA) auf ein Endvolumen von 500 µl konzentriert. Die Proteinausbeuten für RFY-B, RFY-C bzw. RFY-E betrugen 70 µg, 60 µg bzw. 200 µg pro 1 l Kultur. Auf diese Weise wurden sowohl das ursprüngliche hNGAL als auch seine Muteine RFY-B, RFY-C und RFY-E hergestellt.
Beispiel 10: Messung der Affinität der hNGAL Muteine für das Thrombospondinpeptid in einem ELISA
Für die Detektion der Bindung in einem ELISA (enzym-gekoppelter Immunosorbentassay) wurden die Wells einer Mikrotiterplatte (Maxisorb, Nunc) mit jeweils 50 µl einer 50 µg/ml Lösung aus Avidin (Fluka) in PBS befüllt und über Nacht bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBST wurden 50 µl einer 1 µM Lösung des biotinylierten Thrombospondinpeptids SEQ ID NO: 18 in PBST in die Wells gegeben, und das Peptid wurde durch Komplexbildung zwischen Biotin und dem präabsorbierten Avidin immobilisiert. Nach einer einstündigen Inkubation wurde die Lösung entfernt, und die Wells der Mikrotiterplatte wurden dreimal mit PBST gewaschen. Um unspezifische Bindungsstellen abzusättigen, wurden die Wells mit 100 µl 4 % w/v BSA in PBST befüllt und eine Stunde bei RT inkubiert, gefolgt von dreimaligem Waschen mit PBST.
Im Anschluss wurde eine Verdünnungsreihe der Muteine aus Beispiel 9 hergestellt, ausgehend von einer 100 nM Konzentration, und eine Stunde bei RT inkubiert. Als Kontrolle für die unspezifische Bindung an Avidin wurde eine ähnliche Verdünnungsreihe von hNGAL und seinen Muteinen zu den Wells gegeben, bei denen das Thrombospondinpeptid weggelassen wurde. Nach dreimaligem Waschen mit PBST wurde ein anti-Strep II Antikörper/HRP-Konjugat (IBA), verdünnt 1:8000 mit PBST, zu den Wells gegeben. Es wurde eine Inkubation für eine Stunde bei RT durchgeführt und anschießend wurde dreimal mit PBST und zweimal mit PBS gewaschen.
Die Detektion gebundener hNGAL Muteine wurde unter Verwendung von 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin und H₂O₂ als Substrate für Meerrettichperoxidase durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden 200 µl einer gebrauchsfertigen HRP-Substratlösung (Biochem Immunosystems) zu den Wells gegeben, und die Farbentwicklung wurde nach wenigen Minuten durch Zugabe von 100 µl 0.3 M Schwefelsäure gestoppt. Die Bildung des Produkts wurde am Endpunkt durch Messung der Absoption bei 450 nm in einem SpektraMax 250 Photometer (Molecular Devices) gemessen.
Die Kurve wurde mittels einer "non-linear least squares regression" mit Hilfe des Computerprogramms Kaleidagraph (Synergy Software) entsprechend der Gleichung [P·L] = ([P]_t [L]_t)/(K_D + [P]_t) angepasst. Dabei entspricht [P]_t der Gesamtkonzentration an immobilisiertem Thrombospondinpeptid (in A₄₅₀ Einheiten), [L]_t der Konzentration des applizierten Muteins bzw. von hNGAL, [P·L] der Konzentration des gebildeten Komplexes (in A₄₅₀ Einheiten) und K_D der apparenten Dissoziationskonstanten.
Die resultierenden Bindungskurven sind in 8 dargestellt.
Die für die apparenten Dissoziationskonstanten der Komplexe aus den hNGAL Muteinen und den Thrombosspondinpeptid erhaltenen Werte sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengefasst:

hNGAL Variante K_D[nM]

hNGAL: –

RFY-B: 4.3 ± 0.2

RFY-C: 4.6 ± 0.6

RFY-E: 8.2 ± 0.8
Beispiel 11: Messung der Affinität von hNGAL Muteinen für das Thrombospondinpeptid mittels SPR
Die Bindungsaffinität der hNGAL Muteine für das Thrombospondinpeptid SEQ ID NO: 18 wurde mittels Oberflächenplasmonresonanz (SPR) unter Verwendung des BIAcore X Systems (BIACORE) bestimmt. Zunächst wurden 35 µl des biotinylierten Thrombospondinpeptids in einer Konzentration von 1 µg/ml (hergestellt durch Mischen von 1 µl einer 200 µg/ml Peptidlösung in DMF mit 199 µl HBS-Puffer, der 150 mM NaCl, 10 mM HEPES pH 7.4, 3 mM EDTA enthält) auf der Oberfläche eines Durchflusskanals (flow channels) eines streptavidin-beschichteten Sensor-Chips SA (BIACORE) entsprechend den Anweisungen des Herstellers immobilisiert, was in einer Menge von ca. 400 Response Units (RU) resultiert. Die Bindungskurven für die hNGAL Muteine wurden im Anschluss gemessen, in dem 35 µl eines jeden gereinigten Muteins aus Beispiel 9 in HBS-Puffer in Konzentrationen zwischen 500 nM und 25 nM unter Verwendung von HBS-EP (HBS, das 0.005 Surfactant P20 enthält) als Laufpuffer und einer kontinuierlichen Flussrate von 5 µl/Minute appliziert wurden.
Am Ende der Injektionsphase wurden für den Kanal mit dem immobilisierten Thrombospondinpeptid für jede Proteinkonzentration die Gleichgewichtsresonanzwerte gemessen. Im zweiten Kanal des Sensor-Chips, der als Kontrolle diente, wurden nur vernachlässigbare Puffereffekte detektiert. Diese Werte wurden direkt gegen die Konzentration des hNGAL Muteins aufgetragen.
Die Kurve wurde mittels einer "non-linear least squares regression" mit Hilfe des Computerprogramms Kaleidagraph (Synergy Software) entsprechend der Gleichung [P·L] = ([P]_t [L]_t)/(K_D + [P]_t) angepasst. Dabei entspricht [P]_t der Gesamtkonzentration an immobilisiertem Thrombospondinpeptid (in RU), [L]_t der Konzentration des applizierten Muteins bzw. von hNGAL, [P·L] der Konzentration des gebildeten Komplexes (in RU) und K_D der Dissoziationskonstanten unter Gleichgewichtsbedingungen.
Die resultierenden Bindungskurven sind in 9 dargestellt. Die aus den SPR Messungen für die Dissoziationskonstanten der Komplexe aus den hNGAL Muteinen und dem Thrombospondinpeptid erhaltenen Werte werden in der nachfolgenden Tabelle zusammengefasst:

hNGAL Variante K_D [nM]

hNGAL: –

RFY-B: 105.4 ± 6.5

RFY-C: 106.1 ± 15.7

RFY-E: 107.2 ± 11.4
Beispiel 12: Selektion von hNGAL Muteinen gegen humanes Interleukin-8 (IL-8)
Das rekombinante humane Cytokin Interleukin-8 (Baggiolini and Clark-Lewis, FEBS Lett. 397, (1992), 97-101, H₂N-AVLPRSAKELRCQCIKTYSKPFHPKFIKELRVIESGPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAE NS-COOH; SEQ ID NO: 29) wurde mit Biotin-Gruppen konjugiert und in der Gegenwart von strepavidin-beschichteten paramagnetischen Partikeln (Dynal) als Target für die Affinitätsanreicherung aus der Bibliothek der die hNGAL Muteine repräsentierenden Phagemide verwendet.
Das Konjugat wurde hergestellt durch Mischen von 5.6 nmol (12.5 µg) Sulfosuccinimidyl-2-(biotinamido)ethyl-1,3-dithiopropionat (NHS-SS-Biotin, Pierce), gelöst in 3.4 µl H₂O, mit 1.4 nmol (12.5 µg) humanem rekombinanten IL-8 (Promocell), gelöst in 50 µl H₂O, mit 36.6 µl H₂O und mit 10 µl 10 × konzentriertem PBS/NaOH pH 8.5. Das Gemisch wurde unter Rühren für eine Stunde bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Im Anschluss wurde überschüssiges Reagenz aus dem IL-8 Konjugat mit Hilfe einer PD-10 Gelfiltrationssäule (Pharmacia) entsprechend den Angaben des Herstellers und unter Verwendung von PBS/NaOH pH 8.5 als Laufpuffer entfernt. Das von der PD-10 Säule eluierte biotinylierte IL-8 wurde mit dem gleichen Puffer auf eine Endkonzentration von 1 µM eingestellt, was ein Gesamtvolumen von 1.42 ml ergab. Markiertes IL-8 wurde in Aliquots bei –80°C gelagert und unmittelbar vor der Verwendung aufgetaut.
Für die Isolation von Phagemiden, die ein Mutein mit Affinität für IL-8 präsentieren, wurde ein Aliquot der präzipitierten Phagemide aufgetaut, die in Beispiel 7 erhalten wurden, und die zur langfristigen Lagerung bei –20°C aufbewahrt wurden, und die Phagemide wurden pelletiert (20 Minuten, 18500 g, 4°C). Nach Entfernen des Überstands wurden die sedimentierten Phagemidpartikel in 270 µl PBS gelöst, 30 Minuten auf Eis inkubiert und abschließend zentrifugiert (5 Minuten, 18500 g, 4°C), um verbliebene Aggregate zu entfernen.
Um IL-8-bindende Phagemide anzureichern, wurden 30 µl einer 1 µM Lösung (30 pmol) des biotinylierten Interleukin-8 mit 270 µl der Phagemide in PBS (etwa 1013 cfu) gemischt, und eine Stunde bei RT inkubiert, sodass eine Komplexbildung zwischen dem Cytokin und den von den Phagemiden präsentierten Muteinen ermöglicht wurde. Im Anschluss wurden 100 µl einer Lösung aus 8 % w/v BSA, 0.4 % v/v TWEEN 20 in PBS zugegeben.
Parallel dazu wurden 100 µl der kommerziell verfügbaren Suspension aus streptavidin-paramagnetischen Partikeln (Dynal) dreimal mit 1 ml PBS gewaschen. Darin wurden die Partikel durch Rotieren des 1.5 ml Eppendorfgefäßes 1 Minute in Suspension gehalten und im Anschluss mit Hilfe eines Magneten an der Wand des Gefäßes gesammelt, und der Überstand wurde abpipettiert. Um unspezifische Bindungsstellen abzusättigen, wurden die paramagnetischen Partikel mit 1 ml 2 % (w/v) BSA in PBST 1 Stunde bei RT inkubiert.
Nachdem der Überstand wie oben beschrieben entfernt wurde, wurde das Gemisch aus dem biotinylierten IL-8 und den Phagemiden zu den paramagnetischen Partikeln gegeben, die Partikel wurden resuspendiert und 10 Minuten bei RT inkubiert. Schließlich wurden die freien Biotin-Bindestellen von Streptavidin durch Zugabe von 10 µl einer 4 mM D-Desthiobiotion (Sigma)-Lösung in PBS zu dem Gemisch und Inkubieren des Gemischs für 5 Minuten bei Raumtemperatur abgesättigt. Dieser Schritt diente dazu, die Bildung eines Komplexes von Strep-Tag^® II – als Teil des Fusionsproteins der Muteine und des Fragments des Phagenhüllproteins pIII – mit Streptavidin zu verhindern.
Ungebundene Phagemide wurden entfernt, indem die paramagnetischen Partikel achtmal für eine Minute mit jeweils 1 ml frischem PBST mit 1 mM D-Desthiobiotin gewaschen wurden. Jedes Mal wurden die Partikel mit Hilfe des Magneten gesammelt, und der Überstand wurde abpipettiert. Schließlich wurden die gebunden Phagemide unter reduzierenden Bedingungen durch Resuspendieren der Partikel in 1 ml PBST eluiert, das 1 mM Desthiobiotin und 100 mM DTT enthielt. Die Lösung wurde bei 37°C eine Stunde inkubiert, um die in dem Linkermolekül zwischen Interleukin-8 und Biotin enthaltene Disulfidbindung zu reduzieren, wodurch die spezifisch an Il-8 gebundenen Phagemide von den Partikeln freigesetzt wurden.
Für die Amplifikation wurde die eluierte Phagemidlösung (1.0 ml, die abhängig von Selektionszyklus zwischen 10⁷ und 10⁸ cfu enthielten) kurz auf 37°C gebracht, mit 3 ml einer exponentiell wachsenden Kultur von E. coli XL1-Blue (OD₅₅₀ 0.5 bei 37°C) gemischt und bei 200 rpm und 37 °C für 30 Minuten geschüttelt. Die infizierten Zellen wurden sedimentiert (2 Minuten, 4420 g, 4°C), in 600 µl Kulturmedium resuspendiert und auf drei Agarplatten mit LB-Medium, das 100 µg/ml Ampicillin enthält (LB/Amp; 140 mm Durchmesser), ausplattiert.
Nach Inkubation für 14 Stunden bei 32°C wurden die Kolonien von den Agarplatten gekratzt, jeweils durch Zugabe von 10 ml 2 × YT/Amp-Medium. Die Suspension wurde in einen sterilen Erlenmeyerkolben transferiert und 20 Minuten bei 37°C und 200 rpm geschüttelt.
Für einen weiteren Zyklus zur Produktion und Affinitätsanreicherung der Phagemidpartikel wurden 50 ml 2 × YT/Amp-Medium auf 37°C vorgewärmt und mit 0.2 bis 1 ml der Suspension inokuliert, sodass die Zelldichte OD₅₅₀ = 0.08 betrug. Diese Kultur wurde bei 37°C und 160 rpm inkubiert, bis eine Zelldichte von OD₅₅₀ = 0.5 erreicht wurde. Im Anschluss wurde die Kultur mit dem VCS-M13 Helferphagen (Statagene) in einer Infektionsmultiplizität von ungefähr 10 infiziert, und die Kultur wurde weitere 30 Minuten bei 37°C und 160 rpm geschüttelt. Im Anschluss wurde Kanamycin (70 µg/ml) zugegeben, die Inkubatortemperatur wurde auf 26°C gesenkt, und nach 10 Minuten wurde Anhydrotetracyclin in einer Konzentration von 25 µg/l zugegeben, um die Genexpression zu induzieren. Die Inkubation wurde für weitere 15 Stunden bei 26°C und 160 rpm fortgesetzt.
Die Zellen wurden mittels Zentrifugation (15 Minuten, 12000 g, 4°C) sedimentiert. Der Überstand mit den Phagemidpartikeln wurde sterilfiltriert (0.45 µm), mit 1/4 Volumen (12.5 ml) 20 % w/v PEG 8000, 15 % w/v NaCl gemischt und eine Stunde auf Eis inkubiert. Nach einer Zentrifugation (20 Minuten, 18000 g, 4°C) wurden die präzipitierten Phagemidpartikel in 2 ml kaltem PBS gelöst. Die Lösung wurde für 30 Minuten auf Eis inkubiert und auf zwei 1.5 ml Reaktionsgefäße verteilt. Nach Zentrifugation der ungelösten Bestandteile (5 Minuten, 18500 g, 4°C) wurde jeder Überstand in ein neues Reaktionsgefäß transferiert.
Die Phagemidpartikel wurden durch Mischen mit 1/4 Volumen 20 % w/v PEG 8000, 15 % w/v NaCl repräzipitiert, gefolgt von einer sechzigminütigen Inkubation auf Eis. Nach einer Zentrifugation (20 Minuten, 18500 g, 4°C) wurde der Überstand entfernt, und die präzipitierten Phagemidpartikel wurden in 270 µl PBS gelöst. Nach einer Inkubation für 30 Minuten auf Eis wurde die Lösung zentrifugiert (5 Minuten, 18500 g, 4°C), und der Überstand wurde direkt für die Affinitätsanreicherung verwendet. Vier weitere Selektionszyklen mit IL-8 wurden auf die gleiche Weise durchgeführt.
Beispiel 13: Identifikation von hNGAL Muteinen, die Interleukin-8 binden, unter Verwendung des "Colony Screening-Verfahrens"
Für die analytische Herstellung der hNGAL Muterine als Fusionsproteine mit dem Step-Tag^® II und der albumin-bindenden Domäne, wie im Beispiel 3 beschreiben, wurde die Genkassette zwischen den beiden BstXI Schnittstellen aus dem Vektor phNGAL12 in phNGAL7 subkloniert.
Zu diesem Zweck wurde unter Verwendung des Plasmid Midi Kits (Qiagen) die Phasmid-DNA aus dem Gemisch der E. coli Klone isoliert, die durch Infektion mit den Phagemiden aus Beispiel 12 erhalten wurden, welche nach dem fünften Selektionszyklus eluiert wurden. Die DNA wurde mit dem Restriktionsenzym BstXI geschnitten, und das kleinere der beiden Fragmente (347 bp) wurde mittels präparativer Agarosegelelektrophorese gereinigt, wie in Beispiel 6 beschrieben. Die DNA des Vektors phNGAL7 wurde mit BstXI geschnitten, und das größere der beiden Fragmente (3971 bp) wurde auf die gleiche Weise isoliert.
Für die Ligation wurden 100 fmol des isolierten kleinen DNA-Fragments mit 100 fmol des großen DNA-Fragments gemischt und mit 1.5 Weiss Units T4 DNA-Ligase (Promega) in einem Gesamtvolumen von 20 µl (30 mM Tris/HCl pH 7.8, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 1 mM ATP) gemischt, gefolgt von eine Inkubation über Nacht bei 16°C. E. coli TG1-F^– (E. coli K12 TG1, der sein Episom durch wiederholtes Kultivieren unter nicht-selektvien Bedingungen verloren hat) wurde mit 4 µl dieses Ligationsgemisches entsprechend dem CaCl₂-Verfahren (Sambrook et al., supra) transformiert, wodurch 2.0 ml einer Zellsuspension erhalten wurden. Die Zellesuspension wurde zentrifugiert (5000 g, 2 min, 4°C), in 100 µl Kulturmedium resuspendiert, auf einer Agarplatte mit LB/Amp-Medium plattiert und bei 37°C für 14 Stunden inkubiert, um die Transformationseffizienz zu bestimmen.
Eine hydrophile PVDF Membran (Millipore, Typ GVWP, Porengröße 0.22 µm), an einer Stelle markiert und zurechtgeschnitten, wurde auf eine LB/Amp-Agarplatte gelegt. Die Zellsuspension eines frischen Transformationsansatzes, der mit 5-10 µl des oben beschriebenen Ligationsgemisches transformiert wurde, wurde zentrifugiert (5000 g, 2 min, 4°C), in 100 µl Kulturmedium resuspendiert und gleichmäßig auf diese Membran plattiert, um 400 bis 500 Kolonien zu erhalten. Agarplatte wurde 7.5 Stunden bei 37°C inkubiert, bis die Kolonien eine Größe von etwa 0.5 mm erreicht hatten.
In der Zwischenzeit wurde eine hydrophobe Membran (Millipore, Immobilon P, Porengröße 0.45 µm), ebenfalls zurechtgeschnitten, mit PBS gemäß den Anweisungen des Herstellers benetzt. Eine Beschichtung mit HSA wurde durch Schütteln in 10 ml einer Lösung aus 10 mg/ml HSA (Sigma) in PBS für 4 Stunden bei RT erreicht. Verbliebene Bindungsstellen auf der Membran wurden durch Inkubation mit 20 ml 3 % (w/v) BSA, 0.1 % (v/v) Tween-20 in PBS für 2 Stunden bei RT abgesättigt. Die Membran wurde zweimal 10 Minuten mit jeweils 20 ml PBS gewaschen und anschließend 10 Minuten in 10 ml LB/Amp-Medium inkubiert, zu dem 200 µg/ml Anhydrotetracyclin gegeben wurden.
Schließlich wurde sie an einer Stelle markiert und auf die Kulturplatte mit LB/Amp-Agar gelegt, die zusätzlich 200 µg/l Anhydrotetracyclin enthielt. Die hydrophile Membran von oben, auf der die Kolonien angezogen wurden, wurde so auf die hydrophobe Membran gelegt, dass die beiden Markierungen übereinander lagen. Die Kulturplatte wurde mit dem Stapel aus den beiden Membranen bei 22°C für 15 Stunden inkubiert. Während dieser Phase wurden die entsprechenden hNGAL Muteine aus den Kolonien auf der oberen Membran sekretiert und über ihre albumin-bindende Domäne an das HSA auf der unteren Membran immobilisiert.
Anschließend wurde die obere Membran mit den Kolonien auf eine frische LB/Amp-Agarplatte transferiert und bei 4°C gelagert. Die hydrophobe Membran wurde entfernt und dreimal 5 Minuten mit jeweils 20 ml PBST gewaschen.
Für die Analyse der Bindungsaktivität der immobilisierten hNGAL Muteine wurde die Membran 1 Stunde in 3.5 ml einer Lösung aus 200 nM digoxigeniertem IL-8 in PBS inkubiert.
Das Konjugat wurde hergestellt durch Mischen von 14 nmol (9.2 µg) Digoxigenin-3-O-methylcarbonyl-ε-aminocarponsäure-N-hydroxysuccinimidester (DIG-NHS, Roche), gelöst in 2.3 µl DMSO, mit 1.4 nmol (12.5 µg) humanem rekombinanten IL-8 (Promocell), gelöst in 50 µl H₂O, mit 37.7 µl H₂O und mit 10 µl 10 × konzentriertem PBS/NaOH pH 8.5. Das Gemisch wurde unter Rühren eine Stunde bei RT inkubiert. Überschüssiges Reagenz wurde aus dem IL-8-Konjugat mit Hilfe einer PD-10 Gelfiltrationssäule (Pharmacia) entsprechend den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung von PBS/NaOH pH 8.5 als Laufpuffer entfernt. Das von der PD-10 Säule eluierte digoxigenierte IL-8 wurde mit dem gleichen Puffer auf eine Endkonzentration von 1 µM eingestellt, was ein Gesamtvolumen von 1.56 ml ergab. Markiertes IL-8 wurde in Aliquots bei –80°C gelagert und unmittelbar vor der Verwendung aufgetaut.
Die Membran wurde dreimal mit PBST gewaschen, gefolgt von einer einstündigen Inkubation mit 10 ml anti-Digoxigenin Fab/Alkalische Phosphatase-Konjugat, verdünnt 1:1000 in PBST, zur Detektion des gebundenen IL-8 über dessen Digoxigenin-Gruppen. Die Membran wurde zweimal mit PBST und einmal mit PBS gewaschen, jeweils für 5 Minuten, und 10 Minuten in AP-Puffer geschüttelt. Für die Farbreaktion wurde die Membran in 10 ml AP-Puffer inkubiert, zu dem 30 µl 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat-4-toluidinsalz (Roth, gelöst in einer Konzentration von 50 µg/ml in Dimethylformamid) und 5 µl Nitroblau-Tetrazolium (Roth, 75 µg/ml in 60 % v/v Dimethylformamid) gegeben wurden, bis distinkte Farbsignale an den Positionen einiger der Kolonien erkannt werden konnten.
Von den 200 Kolonien auf der Membran ergaben 9 einen intensiven Farbspot auf der hydrophoben Membran und wurden von der korrespondierenden hydrophilen Membran ausgehend kultiviert. Ihre Plasmid-DNA wurde isoliert, und die hNGAL Genkassette wurde unter Verwendung des Oligodeoxynukleotids SEQ ID NO: 5 als Primer mit Hilfe des Genetic Analyzer 310 Systems mit dem Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) gemäß den Anweisungen des Herstellers einer Sequenzanalyse unterzogen.
Alle 9 Klone zeigten dieselbe Sequenz, was anzeigt, dass während des Selektionsverfahrens vorzugsweise ein einzelnes Mutein angereichert wurde. Dieses Mutein wurde als Variante N4 bezeichnet.
Die Nukleotidsequenz des Klons N4 wurde in seine Aminosäuresequenz übersetzt, und diejenigen Aminosäurereste, die vom ursprünglichen hNGAL Protein abgeleitet sind, sind in Tabelle 3 angegeben. Die Nukleotidsequenz bzw. die vollständige Aminosäuresequenz des Muteins N4 sind ferner als SEQ ID NO: 30 bzw. SEQ ID NO: 34 wiedergegeben.
Tabelle 3: Sequenzcharakteristika des hNGAL Muteins N4
Beispiel 14: Herstellung des hNGAL Muteins N4
Für die Präparative Herstellung des hNGAL Muteins N4, das in Beispiel 13 erhalten wurde, wurde die BstXI Kassette aus der Variante in phNGAL7 isoliert und in das Expressionsplasmid phNGAL15 (7) subkloniert. Das resultierende Plasmid kodiert ein Fusionsprotein des Muteins N4 mit der OmpA-Signalsequenz am Amino-Terminus und dem Strep-Tag^® II Affinitätstag am Carboxy-Terminus.
Für die Subklonierung wurde die für das relevante Mutein kodierende phNGAL7 Plasmid-DNA mit dem Restriktionsenzym BstXI geschnitten, und das kleinere der beiden Fragmente (347 bp) wurde mittels präparativer Agarosegelelektrophorese gereinigt, wie in Beispiel 6 beschrieben. Auf dieselbe Weise wurde die Vektor-DNA von phNGAL15 mit BstXI geschnitten, und das größere der beiden Fragmente (3398 bp) wurde isoliert.
1.5 Weiss Units T4 DNA-Ligase (Promega) wurden zu jeweils 50 fmol der beiden DNA-Fragmente in einem Gesamtvolumen von 20 µl (30 mM Tris/HCl pH 7.8, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 1 mM ATP) gerieben, und das Gemisch wurde für die Ligation 16 Stunden bei 16°C, inkubiert. 5 µl des Ligationsgemisches wurden im Anschluss verwendet, um E. coli JM83 (Yanisch-Perron et al., supra) entsprechend dem CaCl₂-Verfahren zu transformieren, wodurch 2.0 ml einer Zellsuspension erhalten wurden. 100 µl dieser Suspension wurden auf Agar ausplattiert, der LB/Amp-Medium enthielt, und bei 37°C für 14 Stunden inkubiert.
Eine Einzelkolonie der E. coli JM83 Transformanten wurde verwendet, um 100 ml LB/Amp-Medium zu inokulieren, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei 30°C und 200 rpm. 2 l LB/Amp-Medium in einem 5 l Erlenmeyer Kolben wurden im Anschluss mit 40 ml dieser Vorkultur inokuliert und bei 22°C und 200 rpm geschüttelt, bis eine OD₅₅₀ = 0.5 erreicht war. Die Expression des Muteins N4 wurde durch Zugabe von 200 µg/l Anhydrotetracyclin (200 µl einer 2 mg/ml Stammlösung in DMF) induziert, und die Inkubation wurde weitere 3 Stunden fortgesetzt.
Die Zellen eines Kolbens wurden zentrifugiert (15 Minuten, 5571 g, 4°C) und nach dem Entfernen des Überstands in 20 ml eines vorgekühlten Puffers zur periplasmatischen Freisetzung (100 mM Tris/HCl pH 8.0, 500 mM Sucrose, 1 mM EDTA) resuspendiert auf 30 Minuten auf Eis inkubiert. Die Sphäroplasten wurden im Anschluss in zwei aufeinander folgenden Zentrifugationsschritten (15 Minuten, 2988 g, 4°C und 15 Minuten, 25000 g, 4°C) entfernt. Der Überstand mit dem periplasmatischen Proteinextrakt wurde gegen CP-Puffer (100 mM Tris/HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA) dialysiert, sterilfiltriert und für die chromatographische Reinigung des hNGAL Muteins verwendet.
Das Reinigungsverfahren basierte auf dem C-terminalen Strep-Tag^® II Affinitätstag (Schmidt et al., supra) unter Verwendung R des Strep-Tactin^® Superflow Materials (IBA). Eine mit diesem Material gefüllte Chromatographiesäule mit einem Bettvolumen von 4 ml wurde mit 20 ml CP-Puffer bei 4°C und mit einer Flussrate von 2 ml/min äquilibriert. Die Chromatographie wurde durch Messen der Absorption bei 280 nm in einem Durchflussphotometer überwacht. Nach Applikation des periplasmatischen Proteinextrakts (Flussrate 0.8 ml/min.) wurde die Säule mit CP-Puffer mit einer Flussrate von 2 ml/min gewaschen, bis die Basislinie erreicht war. Das gebundene hNGAl Mutein wurde mit einer Lösung aus 2.5 mM D-Desthiobiotin (Sigma) in CP-Puffer mit einer Flussrate von 1 ml/min eluiert. Die Fraktionen (jeweils 2.5 ml) mit dem gereinigten hNGAL Mutein wurden vereinigt, mittels YM 10 Centricon-Röhrchen (MW Cutoff 10 kDa, Millipore) auf ein Endvolumen von ungefähr 500 µl konzentriert und auf einem 15 % SDS-Polyacrylamidgel analysiert (Fling und Gregerson, supra). Schließlich wurde das Material mittels Filtration (0.22 µm) sterilisiert und bei 4°C gelagert.
Beispiel 15: Messung der Affinität des hNGAL Muteins N4 für IL-8 in einem ELISA Essay
Für die Detektion einer Bindung in einem ELISA Experiment wurden zwei Reihen (jeweils 12 Wells) einer 96 Well-Mikrotiterplatte (Maxisorb, Nunc) mit 50 µl einer 50 µg/ml Lösung aus Avidin (Fluka) in PBS über Nacht bei 4°C beschichtet. Nach dreimaligen Waschen mit PBST wurde eine Reihe pro Well mit 50 µl einer 1 µM Lösung aus biotinylierten IL-8 in PBST behandelt, während die zweite Reihe mit PBST als Kontrolle inkubiert wurde. Nach einer Stunde bei RT wurden alle Wells dreimal mit PBST gewaschen, und unspezifische Bindungsstellen wurden mit 100 µl 4 % w/v Magermilchpulver in PBST für eine Stunde bei RT abgesättigt.
Um den K_D Wert des Muteins N4 für IL-8 zu bestimmen, wurde eine Verdünnungsreihe des N4 Proteins aus Beispiel 14 in PBST hergestellt, ausgehend von einer Konzentration von 1 µM. Als Kontrolle für die unspezifische Bindung an Avidin wurde eine ähnliche Verdünnungsreihe des Muteins N4 zu den Wells gegeben, bei denen das IL-8 weggelassen wurde. Die Komplexbildung wurde eine Stunde bei RT ermöglicht, gefolgt von 3 Waschschritten mit PBST und einer Inkubation bei RT für eine Stunde mit dem anti-Strep II Antikörper/HRP-Kojugat (IBA), verdünnt 1:8000 in PBST.
Die Detektion des gebundenen Muteins N4 wurde durch die Verwendung von 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin und H₂O₂ als Substrate für die Meerrettichperoxidase bewerkstelligt. Zu diesem Zweck wurden alle Wells mit 100 µl einer gebrauchsfertigen HRP-Substratlösung (Biochem Immunosystems) befüllt. Die Farbentwicklung wurde nach wenigen Minuten durch Zugabe von 100 µl 0.3 M Schwefelsäure gestoppt. Die Bildung des Produkts wurde am Endpunkt durch Messung der Absorption bei 450 nm in einem SpectraMax 250 Photometer (Molecular Devices) gemessen.
Die Kurve wurde mittels "non-linear least squares regression" mit Hilfe des Computerprogramms Kaleidagraph (Synergy software) gemäß Beispiel 10 angepasst. Die resultierenden Bindungskurven sind in 10 dargestellt. Der für die apparente Dissoziationskonstante des Komplexes aus dem hNGAl Mutein N4 und IL-8 erhaltene Wert beträgt 300 ± 34 nM.
Beispiel 16: Selektion von hNGAL Muteinen gegen biotinyliertes TNFα
Rekombinanter humaner Tumornekrosefaktor α (TNFα, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 35) wurde mit Biotin-Gruppen konjugiert und in der Gegenwart streptavidin-beschichteter paramagnetischer Partikel (Dynal) als Target für eine Affinitätsanreicherung aus der Bibliothek der die hNGAL Muteine repräsentierenden Phagemide verwendet, die wie in Beispiel 7 beschrieben erhalten wurden.
Für die Herstellung von rekombinantem TNFα wurden Zellen von E. coli BL21 [DE3] mit dem Expressionsplasmid pTNFα transformiert, welches das Cytokin TNFα (Wang et al., Science 228 (1985), 149-154) mit einem N-terminalen Arg-Gly-Ser-His(6)-Gly(3)-Tag kodiert. Die Expression von TNFα wurde wie von Schmidt und Skerra beschrieben durchgeführt (Schmidt and Skerra, J Chromatogr. 676 (1994), 103-119), ausgenommen dass die Herstellung des rekombinanten Cytokins bei 30°C für 4 Stunden induziert wurde. Unter diesen Bedingungen akkumuliert TNFα als lösliches Protein im Cytoplasma und kann durch anschließendes Einfrieren und Auftauen des Zellpellets aus 1 l Kulturmedium in 30 ml Lysepuffer (50 mM NaH₂PO₄/NaOH pH 8.0, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol) freigesetzt werden. Aus dieser Lösung wurde TNFα in seiner trimeren Form (Lohrengel et al., Cytokine 12 (1999), 573, 577) durch aufeinander folgende immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC; Porath et al., Nature 258, (1975) 598-599) und Größenauschlusschromatographie gereinigt. Die Proteinausbeute lag bei etwa 1.5 mg pro 1 l Kulturvolumen.
Das Konjugat wurde hergestellt, indem 40 nmol (24.3 µg) NHS-SS-Biotin (Pierce), gelöst in 25 µl H₂O, mit 10 nmol (187.7 µg) humanem rekombinanten TNFα, gelöst in 235 µl PBS/NaOH pH 8.5 in einem Gesamtvolumen von 1 ml PBS/NaOH 8.5 umgesetzt wurden. Das Gemisch wurde unter Rühren eine Stunde bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Überschüssiges Reagenz wurde im Anschluss aus dem TNFα-Konjugat mit Hilfe einer PD-10 Gelfiltrationssäule (Pharmacia) gemäß den Anweisungen des Herstellers mit PBS als Laufpuffer entfernt.
Für die Isolation von Phagemiden, die ein Mutein mit Affinität für TNFα präsentieren, wurde ein Aliquot der präzipitierten Phagemide aufgetaut, die in Beispiel 7 erhalten wurden, und die zur langfristigen Lagerung bei –20°C aufbewahrt wurden, und die Phagemide wurden pelletiert (20 Minuten, 18500 g, 4°C). Nach dem Entfernen des Überstands wurden die sedimentierten Phagemidpartikel in 270 µl PBS gelöst, für 30 Minuten auf Eis inkubiert und schließlich zentrifugiert (5 Minuten, 18500 g, 4°C), um verbliebene Aggregate zu entfernen.
30 µl einer 1 µM Lösung (30 pmol) aus biotinyliertem TNFα (hergestellt durch Mischen von 200 µl einer 2.5 µM Lösung des biotinylierten Cytokins in PBS mit 300 µl PBS) wurden mit 270 µl Phagemiden PBS (ca. 1013 cfu) gemischt und eine Stunde bei RT inkubiert, sodass eine Komplexbildung zwischen dem Cytokin und den von den Phagimiden präsentierten Muteinen ermöglicht wurde. Anschließend wurden 100 µl einer Lösung aus 8 % w/v BSA, 0.4 % v/v Tween-20 in PBS zugegeben.
Parallel dazu wurden 100 µl der kommerziell verfügbaren Suspension aus straptavidin-paramagnetischen Partikeln (Dynal) dreimal mit je 1 ml PBS gewaschen. Darin wurden die Partikel durch Rotieren des 1.5 ml Eppendorfgefäßes eine Minute in Suspension gehalten und anschließend mit Hilfe eines Magneten an der Wand des Gefäßes gesammelt, und der Überstand wurde abpippetiert. Um unspezifische Bindungsstellen abzusättigen, wurden die paramagnetischen Partikel mit 1 ml 2 % (w/v) BSA in PBST eine Stunde bei RT inkubiert.
Nach dem Entfernen des Überstands, wie oben beschrieben, wurde das Gemisch aus dem biotinylierten TNFα und den Phagemiden zu den paramagnetischen Partikeln gegeben, und die Partikel wurden resuspendiert und 10 Minuten bei RT inkubiert. Schließlich wurden die freien Biotin-Bindestellen von Streptavidin durch Zugabe von 10 µl einer 4 mM D-Desthiobiotin (Sigma)-Lösung in PBS zu dem Gemisch und Inkubieren des Gemischs bei RT für 5 Minuten abgesättigt: Dieser Schritt diente dazu, eine Komplexbildung des Strep-Tag^® II – als Teil des Fusionsproteins aus den Muteinen und dem Fragment des Phagenhüllproteins pIII – mit Streptavidin zu verhindern.
Ungebundene Phagemde wurden entfernt, indem die paramagnetischen Partikel achtmal jeweils 1 Minute mit 1 ml frischem PBST gewaschen wurden, das 1 mM D-Desthiobiotin enthielt. Jedes Mal wurden die Partikel mit Hilfe des Magneten gesammelt, und der Überstand wurde abpippetiert. Schließlich wurden die gebundenen Phagemide unter reduzierenden Bedingungen durch Resuspendieren der Partikel in 1 ml PBST, das 1 mM Desthiobiotin enthielt, und 100 mM DTT eluiert. Die Lösung wurde bei 37°C für 1 Stunde inkubiert, um die in dem Linkermolekül zwischen TNFα und Biotin enthaltene Disulfidbindung zu reduzieren, wodurch die spezifisch an TNFα gebundenen Phagemide von den Partikeln freigesetzt wurden.
Für die Amplifikation wurde die eluierte Phagemidlösung (1.0 ml, die abhängig vom Selektionszyklus zwischen 10⁷ und 10⁹ cfu enthielten) kurz auf 37°C gebracht, mit 3 ml einer exponentiell wachsenden Kultur von E. coli XL1-Blue (OD₅₅₀ 0.5 bei 37°C) gemischt und bei 200 rpm und 37°C für 30 Minuten geschüttelt. Die infizierten Zellen wurden sedimentiert (2 Minuten, 4420 g, 4°C), in 600 µl Kulturmedium resuspendiert und auf drei Agarplatten mit LB-Medium ausplattiert, das 100 µg/ml Ampicillin enthielt (LB/Amp; 140 mm Durchmesser).
Nach Inkubation für 14 Stunden bei 32°C wurden die Kolonien von den Agarplatten abgekratzt, jeweils durch Zugabe von 10 ml 2 × YT/Amp-Medium. Die Suspension wurde in einen sterilen Erlenmeyerkolben transferiert und 20 Minuten bei 37°C und 200 rpm geschüttelt.
Für einen weiteren Zyklus aus Produktion und Affinitätsanreicherung der Phagemidpartikel wurden 50 ml 2 × YT/Amp-Medium auf 37°C vorgewärmt und mit 0.2 bis 1 ml der Suspension inokuliert, sodass die Zelldichte OD₅₅₀ = 0.08 betrug. Diese Kultur wurde bei 37°C und 160 rpm inkubiert, bis eine Zelldichte von OD₅₅₀ = 0.5 erreicht wurde. Im Anschluss wurde die Kultur mit dem VCS-M13 Helferphagen (Stratagene) in einer Infektionsmultiplizität von ungefähr 10 infiziert, und die Kultur wurde für weitere 30 Minuten bei 37°C und 160 rpm geschüttelt. Im Anschluss wurde Kanamycin (70 µg/ml) zugegeben, die Inkubatortemperatur wurde auf 26°C gesenkt, und nach 10 Minuten wurde Anhydrotetracyclin in einer Konzentration von 25 µg/l zugegeben, um die Genexpression zu induzieren. Die Inkubation wurde weitere 15 Stunden bei 26°C und 160 rpm fortgesetzt.
Die Zellen wurden mittels Zentrifugation (15 min, 12000 g, 4°C) sedimentiert. Der Überstand mit den Phagemidpartikeln wurde sterilfiltriert (0.45 µm), mit 1/4 Volumen (12.5 ml) 20 % w/v PEG 8000, 15 % w/v NaCl gemischt und eine Stunde auf Eis inkubiert. Nach einer Zentrifugation (20 min, 18000 g, 4°C) wurden die präzipitierten Phagemidpartikel in 2 ml kaltem PBS gelöst. Die Lösung wurde 30 Minuten auf Eis inkubiert und auf zwei 1.5 ml Reaktionsgefäße verteilt. Nach Zentrifugation der ungelösten Bestandteile (5 min, 18500 g, 4°C) wurde jeder Überstand in ein neues Reaktionsgefäß transferiert.
Die Phagemidpartikel wurden durch Mischen mit einem 1/4 Volumen 20 % w/v PEG 8000, 15 % w/v NaCl repräzipitiert, gefolgt von einer Inkubation für 60 Minuten auf Eis. Nach einer Zentrifugation (20 min, 18500 g, 4°C) wurde der Überstand entfernt, und die präzipitierten Phagemidpartikel wurden in 270 µl PBS gelöst. Nach 30 Minuten Inkubation auf Eis wurde die Lösung zentrifugiert (5 min, 18500 g, 4°C), und der Überstand wurde direkt für die Affinitätsanreicherung verwendet. Vier weitere Selektionszyklen mit dem TNFα Peptid wurden auf diese Weise durchgeführt.
Beispiel 17: Identifikation von hNGAL Muteinen, die TNFα binden, mit Hilfe des "Colony Screening-Verfahrens"
Für die analytische Herstellung der hNGAL Muteine als Fusionsproteine mit dem Strep-Tag^® II und der albumin-bindenden Domäne, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde die Genkassette zwischen den beiden BstXI Schnittstellen aus dem Vektor phNGAL12 in phNGAL7 subkloniert.
Zu diesem Zweck wurde unter Verwendung des Plasmid Midi Kit (Qiagen) die Phasmid-DNA aus dem Gemisch der E. coli Klone isoliert, die durch Infektion mit den Phagemiden aus Beispiel 16 erhalten wurden, welche nach dem fünften Selektionszyklus eluiert wurden. Die DNA wurde mit dem Restriktionsenzym BstXI geschnitten, und das kleinere der beiden Fragmente (347 bp) wurde mittels präparativer Agarosegelelektrophorese gereinigt, wie in Beispiel 6 beschrieben. Die DNA des Vektors phNGAL7 wurde mit BstXI geschnitten, und das größere der beiden Fragmente (3971 bp) wurde auf die gleiche Weise isoliert.
Für die Ligation wurden 100 fmol des isolierten kleinen DNA-Fragments mit 100 fmol des großen DNA-Fragments gemischt und mit 1.5 Weiss Units T4 DNA-Ligase (Promega) in einem Gesamtvolumen von 20 µl (30 mM Tris/HCl pH 7.8, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 1 mM ATP) inkubiert, gefolgt von einer Inkubation bei 16°C über Nacht. E. coli TG1-F^– (E. coli K12 TG1, der sein Episom durch wiederholtes Kultivieren unter nicht-selektiven Bedingungen verloren hat) wurde mit 4 µl dieses Ligationsgemisch gemäß der CaCl₂-Methode (Sambrokk et al., supra) transformiert, wodurch 2.0 ml einer Zellsuspension erhalten wurden. Die Zellsuspension wurde zentrifugiert (5000 g, 2 min, 4°C) in 100 µl Kulturmedium resuspendiert, auf einer Agarplatte mit LB/Amp-Medium ausplattiert und bei 37°C für 14 Stunden inkubiert, um die Transformationseffizienz zu bestimmen.
Eine hydrophile PVDF Membran (Millipore, Typ GVWP, Porengröße 0.22 µm), an einer Stelle markiert und zurechtgeschnitten, wurde auf eine LB/Amp-Agarplatte gelegt. Die Zellsuspension aus einem frischen Transformationsansatz der mit 3-6 µl der oben beschriebenen Ligationsmischung transformiert wurde, wurde zentrifugiert (5000 g, 2 min, 4°C), in 100 µl Kulturmedium resuspendiert und gleichmäßig auf dieser Membran ausplattiert, um 400 bis 500 Kolonien zu erhalten. Die Agarplatte wurde für 7.5 Stunden bei 37°C inkubiert, bis die Kolonien eine Größe von ungefähr 0.5 mm erreicht hatten.
In der Zwischenzeit wurde eine hydrophobe Membran (Millipore, Immobilon P, Porengröße 0.45 µm), ebenfalls zurechtgeschnitten, mit PBS entsprechend den Anweisungen des Herstellers benetzt. Eine Beschichtung mit HSA wurde durch Schütteln für 4 Stunden bei RT in 10 ml einer Lösung aus 10 mg/ml HSA (Sigma) in PBS bewerkstelligt. Verbliebene Bindungsstellen auf der Membran wurden durch Inkubation mit 20 ml 4 % (w/v) Magermilchpulver, 0.1 % (v/v) Tween-20 in PBS für 2 Stunden bei RT abgesättigt. Die Membran wurde zweimal 10 Minuten mit jeweils 20 ml PBS gewaschen und anschließend 10 Minuten in 10 ml LB/Amp-Medium inkubiert, zu dem 200 µg/l Anhydrotetracyclin gegeben wurden.
Schließlich wurde sie an einer Stelle markiert und auf eine Kulturplatte mit LB/Amp-Agar gelegt, die zusätzlich 200 µg/l von oben, auf der die Kolonien angezogen wurden, wurde so auf die hydrophobe Membran gelegt, dass die beiden Markierungen übereinander lagen. Die Kulturplatte wurde mit dem Stapel aus beiden Membranen bei 22°C für 15 Stunden inkubiert. Während dieser Phase wurden die entsprechenden hNGAL Muteine von den Kolonien auf der oberen Membran sekretiert und über ihre albumin-bindende Domäne via HSA auf der unteren Membran immobilisiert.
Anschließend wurde die obere Membran mit den Kolonien auf eine frische LB/Amp-Agarplatte transferiert und bei 4°C gelagert. Die hydrophobe Membran wurde entfernt und dreimal 5 Minuten mit jeweils 20 ml PBST gewaschen.
Für die Analyse der Bindungsaktivität der immobilisierten hNGAl Muteine wurde die Membran im Anschluss eine Stunde in 3.5 ml einer Lösung aus 100 nM digoxigeniertem TNFα in PBST mit 0.5 % w/v Magermilchpulver inkubiert.
Das Konjugat wurde hergestellt, indem 40 nM (27.5 µg) DIG-NHS (Roche), gelöst in 27 µl DMSO, mit 10 nmol (187.7 µg) TNFα, gelöst in 235 µl PBS/NaOH pH 8.5, in einem Gesamtvolumen von einem 1 ml PBS/NaOH pH 8.5 umgesetzt wurden. Das Gemisch wurde unter Rühren bei Raumtemperatur (RT) für 1 Stunde inkubiert. Überschüssiges Reagenz wurde anschließend aus dem TNFα- Konjugat mittels einer PD-10 Gelfiltrationssäule (Pharmacia) gemäß den Anweisungen des Herstellers mit PBS als Laufpuffer entfernt.
Die Membran wurde dreimal mit PBST gewaschen, gefolgt von einer einstündigen Inkubation mit 10 ml anti-Digoxigenin Fab/Alkalische Phosphatase-Konjugat, verdünnt 1:1000 in PBST, für die Detektion des gebundenen TNFα über seine Digoxigenin-Gruppen. Die Membran wurde zweimal mit PBST und einmal mit PBS gewaschen, jeweils für 5 Minuten, und 10 Minuten in AP-Puffer geschüttelt. Für die Farbreaktion wurde die Membran in 10 ml AP-Puffer inkubiert, zu dem 30 µl 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat-4-toluidinsalz (Roth, gelöst in einer Konzentration von 50 µg/ml in Dimethylformamid) und 5 µl Nitroblau-Tetrazolium (Roth, 75 µg/ml in 70 % v/v Dimethylformamid) gegeben wurden, bis distinkte Farbsignale an den Positionen einiger der Kolonien entdeckt werden konnten.
Von 1800 Kolonien auf den Membranen multipler Colony Screening Experimente ergaben 14 intensive Farbspots auf der hydrophoben Membran und wurden von der korrespondierenden hydrophilen Membran ausgehend kultiviert. Ihre Plasmid-DNA wurde isoliert, und die hNGAL Genkassette wurde unter Verwendung des Oligodeoxynukleotids SEQ ID NO: 5 als Primer unter Verwendung des Genetic Analyzer 310 Systems mit dem Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) entsprechend den Instruktionen des Herstellers einer Sequenzanalyse unterzogen.
Von diesen 14 Muteinen zeigten 13 dieselbe Sequenz, die als TNF-V1 bezeichnet wurde, während die 14. Sequenz verschieden war und als TNF-V2 bezeichnet wurde.
Die Nukleotidsequenzen der Klone TNF-V1 und TNF-V2 wurden in ihre Aminosäuresequenzen translatiert, und diejenigen Aminosäurereste, die aus dem ursprünglichen hNGAL Protein abgeleitet sind, sind in Tabelle 4 angegeben. Die Nukleotidsequenzen der Muteine TNF-V1 und TNF-V2 sind ferner als SEQ ID NO: 32 bzw. SEQ ID NO: 33 wiedergegeben. Die vollständigen Aminosäuresequenzen dieser beiden Muteine sind als SEQ ID NO: 36 bzw. SEQ ID NO: 37 wiedergegeben. Tabelle 4: Sequenzcharakteristika der hNGAL Muteine TNF-V1 und TNF-V2

* Dem Mutein TNF-V1 fehlt der Isoleucinrest an Position 80 aufgrund einer Deletion der Nukleotide 238 bis 240.

Beispiel 18: Bestätigung der Bindungsaktivität selektierter hNGAL Muteine für TNFα unter Verwendung des "Colony Spot Assays"
Der Colony Spot-Assey wurde auf ähnliche Weise durchgeführt wie der Colony Screening-Assay, der in Beispiel 17 dargestellt ist, abgesehen davon, dass einzelne Kolonien von E. coli, welche die entsprechenden Expressionsplasmide enthalten, von einer Master-Platte auf die hydrophile Membran, die mit einem Gitternetzwerk markiert ist, fleckförmig aufgebracht ("gespottet") wurden, anstatt eine Suspension transformierter Zellen auszuplattieren. Jeder entsprechende Klon wurde mit einem sterilen Zahnstocher entweder viermal oder fünfmal auf einer hydrophilen Membran (Millipore, Typ GVWP, Porengröße 0.22 µm) aufgebracht, welche auf einer Kulturplatte mit LB/Amp-Agar platziert wurde. Die Zellen wurden bei 37°C für 5 Stunden angezogen.
In der Zwischenzeit wurde eine hydrophobe Membran (Millipore, Immobilon P, Porengröße 0.45 µm) mit PBS entsprechend den Anweisungen des Herstellers benetzt. Eine Beschichtung mit HSA wurde durch Schütteln für 4 Stunden bei RT in 10 ml einer Lösung aus 10 mg/ml HSA (Sigma) in PBS bewerkstelligt. Verbliebene Bindungsstellen auf der Membran wurden durch Inkubation mit 20 ml 3 % (w/v) BSA, 0.1 % (v/v) Tween-20 in PBS für 2 Stunden bei RT abgesättigt. Die Membran wurde zweimal 10 Minuten mit jeweils 20 ml PBS gewaschen und anschließend 10 Minuten in 10 ml LB/Amp-Medium inkubiert, zu dem 200 µg/l Anhydrotetracyclin gegeben wurden.
Schließlich wurde sie an einer Stelle markiert und auf eine Kulturplatte mit LB/Amp-Agar gelegt, die zusätzlich 200 µg/ml Anhydrotetracycline enthielt. Die hydrophile Membran, auf der die Kolonien angezogen wurden, wurde so auf die hydrophobe Membran gelegt, dass die beiden Markierungen übereinander lagen. Die Kulturplatte wurde mit dem Stapel aus beiden Membranen bei 22°C für 15 Stunden inkubiert. Während dieser Phase wurden die entsprechenden hNGAL-Muteine von den Kolonien auf der oberen Membran sekretiert und über ihre albumin-bindende Domäne an das HSA auf der unteren Membran immobilisiert.
Anschließend wurde die obere Membran mit den Kolonien auf eine frische LB/Amp-Agarplatte transferiert und bei 4°C gelagert. Die hydrophobe Membran wurde entfernt und dreimal 5 Minuten mit jeweils 20 ml PBST gewaschen.
Um die Bindungsaktivität der "gespotteten" Muteine gegenüber TNFα zu bestätigen, wurde die Membran im Anschluss eine Stunde in 3.5 ml einer Lösung aus 100 nM digoxigeniertem TNFα in PBST mit 0.5 % w/v Magermilchpulver (eine 1.5 µM Stammlösung des digoxigenierten TNFα in PBS wurde dazu 1:15 in PBST mit Magermilchpulver verdünnt) inkubiert.
Die Membran wurde dreimal mit PBST gewaschen, gefolgt von einer einstündigen Inkubation mit 10 ml anti-Digoxogenin Fab/Alkalische Phosphatase-Konjugat, verdünnt 1:1000 in PBST, zur Detektion des gebundenen TNFα über seine Digoxinenin-Gruppen. Die Membran wurde zweimal mit PBST und einmal mit PBS gewaschen, jeweils für 5 Minuten, und 10 Minuten in AP-Puffer geschüttelt. Für die Farbreaktion wurden die Membranen in 10 ml AP-Puffer inkubiert, zu dem 30 µl 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat-4-toluidinsalz (Roth, gelöst in einer Konzentration von 50 µg/ml in Dimethylformamid) und 5 µl Nitroblau-Tetrazolium (Roth, 75 µg/ml in 70 % v/v Dimethylformamid) zugegeben wurden. Distinkte Farbsignale konnten an den Positionen erkannt werden, an denen die Muteine TNF-V1 und TNF-V2 "gespottet" wurden, während kein Bindungssignal für den hNGAL Wildtyp (kodiert von pHNGAL7), das Bilin-Bindeprotein (kodiert vom Vektor pBBP22, Schlehuber et al., J. Mol. Biol. 297 (2000), 1105-1120), zwei nicht verwandte Muteine aus der Bibliothek von hNGAL Muteinen, die in Beispiel 6 beschrieben ist (beide subkloniert in pHNGAL 7), sowie für den Klon beobachtet werden konnten, der kein Protein exprimiert (und der pBluescript (Stratagene) als Plasmid enthält), wodurch die Bindungsaktivität von TNF-V1 und TNF-V2 für TNFα bestätigt wurde (12). SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Erzeugung eines Muteins eines Proteins, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus humanem neutrophilen gelatinase-assoziierten Lipocalin (hNGAL), Ratten α₂-mikroglobulin-verwandtem Protein (A2m) und Maus 24p3/Uterocalin (24p3) besteht, wobei das Mutein eine detektierbare Affinität für ein gegebenes Target aufweist, das den Schritt (a) umfasst: das Protein einer Mutagenese an einer oder mehreren Sequenzpositionen zu unterziehen, die den Sequenzpositionen 40 bis 50, 70 bis 79, 101 bis 103 und 125 bis 132 von hNGAL entsprechen, was in einem oder mehreren Mutein(en) des Proteins resultiert.
Verfahren gemäß Anspruch 1, das zusätzlich den Schritt (b) umfasst: mindestens ein resultierendes Mutein mit Bindungsaffinität für ein gegebenes Target aus dem einen oder den mehreren Muteinen durch Selektion und/oder Isolierung des mindestens einen Muteins anzureichern.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Mutagenese in Schritt (a) in einer Mehrzahl an Muteinen des Proteins resultiert.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Protein einer Mutagenese an einer oder mehreren Sequenzpositionen unterzogen wird, die den Sequenzpositionen 40, 42, 44, 46, 47, 49, 50, 70, 72, 73, 77, 79, 101, 102, 103, 125, 127, 128, 130 und 132 von hNGAL entsprechen.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei eine Nukleinsäure, die für das eine oder die mehreren Mutein(e) des Proteins kodiert, wobei die Nukleinsäure aus der Mutagenese resultiert, operativ mit dem 3'-Ende eines Gens fusioniert ist, das für das Hüllprotein pIII eines filamentösen Bakteriophagen der M13-Familie oder für ein Fragment dieses Hüllproteins kodiert, um mindestens ein Mutein für die Bindung an das gegebene Target zu selektieren.
Mutein, das von humanem neutrophilen gelatinase-assoziierten Lipocalin (hNGAL), Ratten α₂-mikroglobulin-verwandtem Protein (A2m) oder Maus 24p3/Uterocalin (24p3) abgeleitet ist, wobei das Mutein eine Mutation an einer oder mehreren Sequenzpositionen umfasst, die den Sequenzpositionen 40 bis 50, 70 bis 79, 101 bis 103 und 125 bis 132 von hNGAL entsprechen, und wobei das Mutein eine detektierbare Bindungsaffinität für ein gegebenes Target aufweist.
Mutein gemäß Anspruch 6, wobei das Mutein eine Mutation an einer oder mehreren der Sequenzpositionen umfasst, die den Sequenzpositionen 40, 42, 44, 46, 47, 49, 50, 70, 72, 73, 77, 79, 101, 102, 103, 125, 127, 128, 130 und 132 von hNGAL entsprechen.
Mutein von hNGAL gemäß Anspruch 6 oder 7, wobei Cys87 substituiert ist, und/oder wobei das Mutein eine oder mehrere der Aminosäuresubstitutionen Glu28 → His, Thr145 → Ala im Vergleich zu hNGAL aufweist.
Mutein von hNGAL gemäß Anspruch 6 oder 7, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26 oder SEQ ID NO: 28 aufweist.
Mutein gemäß einem der Ansprüche 6 bis 9, das an eine Markierung konjugiert ist, die aus der Gruppe ausgewählt wird, welche aus einem organischen Molekül, einer Enzymmarkierung, radioaktiven Markierung, fluoreszierenden Markierung, chromogenen Markierung, lumineszierenden Markierung, einem Hapten, Digoxigenin, Biotin, Metallkomplexen, Metallen und kolloidalem Gold besteht.
Fusionsprotein, das ein Mutein von hNGAL, A2m oder 24p3 gemäß einem der Ansprüche 6 bis 10 umfasst, wobei ein Enzym, ein Protein oder eine Proteindomäne, ein Peptid, eine Signalsequenz und/oder ein Affinitätstag operativ an den Aminoterminus oder den Carboxyterminus des Muteins fusioniert ist.
Nukleinsäuremolekül, das eine Sequenz umfasst, welche ein Mutein von hNGAL, A2m oder 24p3 oder ein Fusionsprotein davon gemäß einem der Ansprüche 6 bis 11 kodiert.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Mutein von hNGAL, A2m oder 24p3 oder ein Fusionsprotein davon gemäß einem der Ansprüche 6 bis 11 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines Muteins von hNGAL, A2m oder 24p3 oder eines Fusionsproteins davon gemäß einem der Ansprüche 6 bis 11, wobei das Mutein oder das Fusionsprotein davon ausgehend von der Nukleinsäure, die für das Mutein kodiert, mit Hilfe gentechnologischer Verfahren in einem bakteriellen oder eukaryotischen Wirtsorganismus erzeugt und aus diesem Wirtsorganismus oder seiner Kultur isoliert wird.
Verwendung eines Muteins von hNGAL, A2m oder 24p3 oder eines Fusionsprotein davon gemäß einem der Ansprüche 6 bis 11 zur Detektion eines gegebenen Targets, welche die Schritte umfasst: Inkontaktbringen des Muteins unter geeigneten Bedingungen mit einer Probe, von der vermutet wird, dass sie das gegebene Target enthält, wodurch die Bildung eines Komplexes zwischen dem Mutein und dem gegebenen Target ermöglicht wird, und Bestimmen des komplexierten Muteins durch ein geeignetes Signal.
Verwendung gemäß Anspruch 15, wobei das gegebene Target ein Protein oder eine Proteindomäne, ein Peptid, ein Nukleinsäuremolekül, ein organisches Molekül oder ein Metallkomplex ist, und die Detektion zur Validierung des Targets als pharmakologisches Wirkstofftarget durchgeführt wird.