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Diese
Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Anionenaustauschers,
einen durch dieses Verfahren erhältlichen
Anionenaustauscher und eine aus dem Anionenaustauscher bestehende
Füllung
für Chromatographie.
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Feine
Teilchen, die eine Ionen austauschende Gruppe besitzen, werden weithin
als Trennmaterial auf dem Gebiet der Herstellung reinen Wassers und
der Chromatographie verwendet. Ein Anionenaustauscher, bei dem ein
Polyethylenimin als eine Ionen austauschende Gruppe eingeführt ist,
wird auf dem Gebiet der Chelatharze, Flüssigkeitschromatographie zur
Analyse oder Isolierung zum Beispiel von Aminosäuren, Peptiden, Proteinen,
Nucleinsäuren und
Sacchariden verwendet.
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Als
Beispiele des Verfahrens zur Herstellung eines Anionenaustauschers
aus feinen Teilchen, in die Polyethylenimin eingeführt worden
ist, können
erwähnt
werden ein Verfahren der Einführung
von Polyethylenimin in feine Teilchen eines Polymers, das eine halogenierte
Alkylgruppe besitzt, wie das im US-Patent Nr. 4 191 814 offenbarte
Polychromethylstyrol; ein Verfahren der Einführung von Polyethylenimin in
ein Acrylat- oder Methacrylatpolymer, das eine Epoxygruppe oder
eine halogenierte Alkylgruppe besitzt, wie im US-Patent Nr. 4 111
859 offenbart; und ein Verfahren, bei dem man Polyethylenimin an
feinen anorganischen Teilchen adsorbieren lässt und dann das adsorbierte
Polyethylenimin vernetzt, wie im US-Patent Nr. 4 245 005 offenbart.
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Die
gegenwärtigen
Erfinder haben gefunden, dass der sich ergebende Ionenaustauscher
selbst dann eine nur geringfügig
erhöhte
Austauschkapazität
aufweist, wenn Polyethylenimin von hohem Molekulargewicht in feine
Teilchen eingeführt
wird, die halogenierte Alkylgruppen oder Epoxygruppen besitzen.
Es wird angenommen, dass dies daher kommt, dass nur eine geringe
Menge an Polyethylenimin eingeführt
wird. Wenn eine grosse Menge an Polyethylenimin zusammen mit einer
grossen Menge eines Vernetzungsmittels zu einer flüssigen Dispersion
feiner Teilchen hinzugefügt
wird, um eine grosse Menge an Polyethylenimin in die feinen Teilchen
einzuführen,
erfolgt die Vernetzung des Polyethylenimins mit hoher Geschwindigkeit,
und das Reaktionssystem erleidet unerwünschte Gelbildung. Ein ähnliches
Problem tritt in dem oben erwähnten
Verfahren auf, das im US-Patent Nr. 4 245 005 beschrieben wird.
Das bedeutet, dass nur eine geringe Menge an Polyethylenimin an
den feinen Teilchen adsorbiert werden kann, and falls eine grosse
Menge an Polyethylenimin an den feinen Teilchen adsorbiert ist und
dann eine grosse Menge eines Vernetzungsmittels zu einer flüssigen Dispersion
der feinen Teilchen mit dem adsorbierten Polyethylenimin hinzugegeben
wird, neigt die flüssige
Dispersion zur Gelbildung im Vernetzungsschritt. Daher sind die
Mengen an Polyethylenimin und Vernetzungsmittel, die verwendet werden,
beschränkt.
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Im
Hinblick auf das Gesagte besteht ein Ziel der vorliegenden Erfindung
darin, ein Verfahren zur Herstellung eines Anionenaustauschers zur
Verfügung
zu stellen, der eine erhöhte
Anionen-Austauschkapazität
aufweist, wobei das Verfahren selbst dann vorteilhaft ohne eine
Neigung zur Gelbildung ausgeführt
werden kann, wenn im Vergleich zum herkömmlichen Verfahren des Einsatzes
von Polyethylenimin und Vernetzungsmittel verhältnismässig grosse Mengen an Polyethylenimin
und Vernetzungsmittel verwendet werden.
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Ein
anderes Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen Anionenaustauscher
zur Verfügung
zu stellen, der mit dem oben erwähnten
Verfahren gewonnen werden kann und der eine erhöhte Anionen-Austauschkapazität aufweist.
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Noch
ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Füllung für Chromatographie
zur Verfügung
zu stellen, die aus dem oben erwähnten Anionenaustauscher
besteht, der eine erhöhte
Anionen-Austauschkapazität
aufweist.
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Ein
weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Säule für Chromatographie
zur Verfügung
zu stellen, die mit einer Füllung
gefüllt
ist, die aus dem oben erwähnten
Anionenaustauscher besteht, der eine erhöhte Anionen-Austauschkapazität aufweist.
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In
einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung
eines Anionenaustauschers zur Verfügung gestellt, der ein feines
Teilchen ist, das eine ausgehärtete
Oberflächenschicht besitzt,
die aus vernetztem Polyethylenimin besteht und auf der Oberfläche des
feinen Teilchens gebildet wurde, dadurch gekennzeichnet, dass es
die Schritte umfasst:
- 1) einen ersten Schritt,
feine Teilchen mit einem Teilchendurchmesser von 1 bis 100 μm und einer funktionellen
Gruppe auf der Oberfläche
der feinen Teilchen, die in der Lage ist, mit Polyethylenimin zu
reagieren, in einer wässrigen
Lösung
eines Vernetzungsmittels zu dispergieren, das in der Lage ist, Polyethylenimin
zu vernetzen, um eine wässrige
Dispersion der feinen Teilchen herzustellen; und
- 2) einen zweiten Schritt, das Polyethylenimin mit einem Zahlenmittel
des Molekulargewichts von nicht mehr als 10 000 sowie einen Katalysator
für die
Vernetzung des Polyethylenimins zur wässrigen Dispersion der feinen
Teilchen hinzuzufügen, um
eine Reaktion, in der das Polyethylenimin an die funktionelle Gruppe
auf der Oberfläche
der feinen Teilchen gebunden wird, sowie eine Reaktion, in der das
Polyethylenimin mit dem Vernetzungsmittel vernetzt wird, auszuführen.
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Das
feine Teilchen ist bevorzugt ein poröses Teilchen, das Poren mit
einem durchschnittlichen Durchmesser von mindestens 100 Å besitzt.
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Die
funktionelle Gruppe auf der Oberfläche der feinen Teilchen ist
bevorzugt zumindest ein Gruppe, die aus einer Glycidylgruppe, einer
halogenierten Alkylgruppe und einer Aldehydgruppe ausgewählt ist.
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Das
Vernetzungsmittel, das in der Lage ist, Polyethylenimin zu vernetzen,
ist bevorzugt Epichlorhydrin oder eine polyfunktionelle Epoxyverbindung, die
bevorzugt zumindest eine Verbindung ist, die aus Ethylenglykol-diglycidylether,
Polyethylenglykol-diglycidylether,
Polypropylenglykol-diglycidylether, 1,4-Butandiol-diglycidylether,
Glycerin-polyglycidylether und Sorbit-polyglycidylether ausgewählt wird
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Der
Katalysator ist bevorzugt ein Alkalimetallhydroxid.
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In
einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Anionenaustauscher
zur Verfügung
gestellt, der mit dem oben erwähnten
Verfahren gewonnen werden kann.
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In
noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Füllung für die Chromatographie
zur Verfügung
gestellt, die aus dem oben erwähnten
Anionenaustauscher besteht.
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In
einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Säule für die Chromatographie zur
Verfügung
gestellt, die mit der oben erwähnten Füllung gefüllt ist.
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1 veranschaulicht
ein Chromatogramm (A), das für
die Auftrennung von Protein unter Verwendung eines Anionenaustauschers
der vorliegenden Erfindung in Beispiel 1 erhalten wurde, sowie ein Chromatogramm
(B), das für
die Auftrennung von Protein unter Verwendung eines vergleichbaren
Anionenaustauschers im Vergleichsbeispiel 3 erhalten wurde.
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Der
Anionenaustauscher der vorliegenden Erfindung besteht aus feinen
Teilchen, an deren Oberfläche
ein Polyamin gebunden ist, ein Anionenaustauscher, der ein feines
Teilchen ist, das eine gehärtete
Oberflächenschicht
besitzt, das aus vernetztem Polyethylenimin besteht und auf der
Oberfläche des
feinen Teilchens gebildet wurde.
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Das
feine Teilchen kann entweder ein nichtporöses feines Teilchen sein, das
keine Poren an seiner Oberfläche
besitzt, ist aber bevorzugt ein poröses Teilchen, das freiliegende
Poren an seiner Oberfläche
besitzt. Wenn poröse
Teilchen verwendet werden, die freiliegende Poren an ihrer Oberfläche besitzen,
dringt das Polyethylenimin im Schritt der Bildung der Polyethylenimin-Oberflächenschicht
in die Poren ein, und daher wird die gehärtete Polyethylenimin-Oberflächenschicht
zusätzlich
zur Aussenseite des feinen Teilchens teilweise in den Poren gebildet. Folglich
kann eine grosse Menge an Polyethylenimin an die Oberfläche des
feinen Teilchens gebunden werden, und ein Anionenaustauscher mit
verbesserter Ionenaustauschkapazität kann erhalten werden. Im
Hinblick auf die gewonnene Ionenaustauschkapazität haben die Poren bevorzugt
einen durchschnittlichen Durchmesser von mindestens 100 Å, stärker bevorzugt
von 250 Å.
Die Obergrenze der Porengrösse
ist nicht speziell begrenzt, beträgt aber gewöhnlich etwa 0,5 μm.
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Der
Durchmesser eines feinen porösen
Teilchens, das den Anionenaustauscher der vorliegenden Erfindung
darstellt, liegt im Bereich von etwa 1 μm bis etwa 100 μm, um bei
Verwendung in der Flüssigkeitschromatographie
eine bessere Auftrennleistung zu erreichen.
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Die
verwendeten feinen Teilchen sind unter anderem feine organische
Teilchen und feine anorganische Teilchen. Die feinen organischen
Teilchen sind unter anderem zum Beispiel Teilchen von Copolymeren
eines monofunktionellen Vinylmonomers mit einem polyfunktionellen
Vinylmonomer sowie vernetzte Polysaccharide. Als konkrete Beispiele
für das monofunktionelle
Vinylmonomer können
Hydroxyalkylester der Acryl- und Methacrylsäure wie 2-Hydroxyethylacrylat,
2,3-Dihydroxypropylacrylat, 2-Hydroxyethylmethacrylat und 2,3-Dihydroxypropylmethacrylat;
eine Epoxygruppe enthaltende Ester der Acryl- und Methacrylsäure wie
Glycidylacrylat und Glycidylmethacrylat; halogenierte Alkylester
der Acryl- und Methacrylsäure
wie 3-Chlor-2-hydroxypropylacrylat, 3-Brompropylacrylat, 3-Chlor-2-hydroxypropylmethacrylat
und 3-Brompropylmethacrylat; Acrylsäure und Methacrylsäure; Alkylacrylate
und Alkylmethacrylate wie Methylacrylat, Ethylacrylat, Methylmethacrylat
und Ethylmethacrylat; Styrolabkömmlinge
wie Chlormethyl styrol, Vinylbenzylalkohol, Vinylbenzyl-glycidylether
und Hydroxystyrol; sowie Vinylacetat erwähnt werden. Als konkrete Beispiele
für das
polyfunktionelle Vinylmonomer können Polyolester
der Acryl- und Methacrylsäure
wie Ethylenglykol-diacrylat, Glycerin-diacrylat, Ethylenglykol-dimethacrylat
und Glycerin-dimethacrylat; sowie Divinylbenzol und Triallylisocyanurat
erwähnt
werden. Als konkrete Beispiele für
die vernetzten Polysaccharide können
Cellulose, Agarose, Dextran und Mannose erwähnt werden.
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Als
konkrete Beispiele für
die feinen anorganischen Teilchen können Siliciumdioxid, Zeolith,
Titandioxid, Aluminiumoxid und Hydroxyapatit erwähnt werden.
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Das
in der vorliegenden Erfindung verwendete feine Teilchen hat eine
funktionelle Gruppe auf der Oberfläche des feinen Teilchens, die
in der Lage ist, mit Polyethylenimin zu reagieren, wobei diese Gruppe
ein Platz sein kann, an dem Polyethylenimin gebunden wird. Die funktionelle
Gruppe ist nicht besonders begrenzt, aber wird bevorzugt aus einer
Glycidylgruppe, einer halogenierten Alkylgruppe und einer Aldehydgruppe
ausgewählt,
weil das Polyethylenimin wirksam in eine Epoxygruppe, eine halogenierte
Alkylgruppe oder eine Aldehydgruppe eingeführt werden kann, indem ein
feines Teilchen, das diese Gruppen besitzt, mit einer wässrigen
Dispersion von Polyethylenimin in Berührung gebracht wird. Die halogenierte
Alkylgruppe ist bevorzugt eine chlorierte, bromierte oder iodierte
Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen. Die funktionelle Gruppe
auf der Oberfläche
des feinen Teilchens kann entweder eine einzige Art von Gruppe oder
eine Kombination von zwei oder mehr Arten von Gruppen sein.
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Das
feine Teilchen, das auf seiner Oberfläche eine funktionelle Gruppe
wie eine Epoxygruppe, eine halogenierte Alkylgruppe oder eine Aldehydgruppe
besitzt, die in der Lage ist, mit Polyethylenimin zu reagieren,
ist bekannt und kann mit einer herkömmlichen Prozedur hergestellt
werden. Eine Epoxygruppe, eine halogenierte Alkylgruppe und eine
Aldehydgruppe können
auf die Oberfläche
des feinen Teilchens aufgebracht werden, indem das feine Teilchen
zum Beispiel mit Epichlorhydrin, Ethylenglykol-diglycidylether und
Butandiol-diglycidylether für eine
Epoxygruppe; mit Epichlorhydrin und 1,3-Brombutan für eine halogenierte
Alkylgrupe; und mit Glutaraldehyd für eine Aldehydgruppe behandelt wird.
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Die
feinen Teilchen, die eine ausgehärtete Oberflächenschicht
besitzen, die aus vernetztem Polyethylenimin besteht und auf der
Oberfläche
der feinen Teilchen gebildet wurde, werden durch ein Verfahren hergestellt,
das die folgenden zwei Schritte umfasst:
- 1)
In einem ersten Schritt werden feine Teilchen mit einem Teilchendurchmesser
von 1 bis 100 μm und
einer funktionellen Gruppe auf der Oberfläche der feinen Teilchen, die
in der Lage ist, mit Polyethylenimin zu reagieren, in einer wässrigen
Lösung
eines Vernetzungsmittels dispergiert, das in der Lage ist, Polyethylenimin
zu vernetzen, um eine wässrige
Dispersion der feinen Teilchen herzustellen; und
- 2) in einem zweiten Schritt werden das Polyethylenimin mit einem
Zahlenmittel des Molekulargewichts von nicht mehr als 10 000 sowie
ein Katalysator für
die Vernetzung des Polyethylenimins zur wässrigen Dispersion der feinen
Teilchen hinzugefügt,
und eine Reaktion, in der das Polyethylenimin an die funktionelle
Gruppe auf der Oberfläche
der feinen Teilchen gebunden wird, sowie eine Reaktion, in der das
Polyethylenimin mit dem Vernetzungsmittel vernetzt wird, werden
ausgeführt.
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Das
Polyethylenimin hat, mit der Siedepunktmethode gemessen, ein Zahlenmittel
des Molekulargewichts von nicht mehr als 10 000, stärker bevorzugt
von nicht mehr als 1000. Das in der vorliegenden Erfindung verwendete
Polyethylenimin mit dem niedrigsten Molekulargewicht ist gewöhnlich ein
Trimer von Ethylenimin. Die Menge an Polyethylenimin in der wässrigen
Dispersion liegt bevorzugt im Bereich von 0,3 bis 0,5 Gewichtsteilen
je Gewichtsteil der feinen Teilchen. Durch Einsatz einer kontrollierten
Menge des Polyethylenimins mit dem oben genannten, niedrigen Molekulargewicht
kann die unerwünschte
Gelbildung im Schritt der Vernetzung des Polyethylenimins vermieden
werden, und die gehärtete
Oberflächenschicht
aus einem vernetzten Polyethylenimin kann vorteilhaft gebildet werden.
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Das
zur Vernetzung des Polyethylenimins verwendete Vernetzungsmittel
ist nicht besonders begrenzt, aber gewöhnlich wird ein wasserlösliches Vernetzungsmittel
und bevorzugt Epichlorhydrin oder eine wasserlösliche polyfunktionelle Epoxyverbindung
verwendet. Als konkrete Beispiele der wasserlöslichen polyfunktionellen Epoxyverbindungen
können
Ethylenglykol-diglycidylether, Polyethylenglykol-diglycidylether,
Polypropylenglykol-diglycidylether, 1,4-Butandiol-diglycidylether,
Glycerin-polyglycidylether oder Sorbit-polyglycidylether genannt
werden. Diese Vernetzungsmittel können entweder allein oder als
eine Kombination von mindestens deren zwei verwendet werden. Die
Menge an Vernetzungsmittel ist nicht besonders begrenzt, aber liegt
bevorzugt im Bereich von 0,3 bis 0,5 Gewichtsteilen je Gewichtsteil
der feinen Teilchen.
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Die
Menge an Wasser, das als ein flüssiges Medium
verwendet wird, in dem die feinen Teilchen dispergiert werden, ist
nicht besonders begrenzt, aber wird bevorzugt so gewählt, dass
das Gewichtsverhältnis
von Wasser zu feinen Teilchen im Bereich von 90 zu 10 bis 40 zu
60, stärker
bevorzugt von 70 zu 30 bis 45 zu 55 liegt.
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Als
Katalysator zur Beförderung
der Vernetzungsreaktion wird bevorzugt ein Alkalimetallhydroxid
wie Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid verwendet. Die Menge des
Katalysators liegt bevorzugt im Bereich von 0,1 bis 0,2 Gewichtsteilen
je Gewichtsteil der feinen Teilchen.
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Im
zweiten Schritt werden Polyethylenimin und der Katalysator bevorzugt
als eine wässrige
Lösung
zu der wässrigen
Dispersion hinzugefügt,
die die feinen Teilchen und das Vernetzungsmittel enthält. Der
Katalysator und das Polyethylenimin können entweder als eine einzige
Lösung,
in der der Katalysator und das Polyethylenimin aufgelöst worden sind,
oder als getrennte wässrige
Lösungen
hinzugefügt
werden. Bevorzugt wird die Zugabe des Katalysators und des Polyethylenimins
nicht in einer Charge, sondern in kleinen Portionen über eine
Zeitdauer von 30 Minuten bis zwei Stunden ausgeführt, und zwar bei Zimmertemperatur
und unter gelindem Rühren,
um eine rasche Vernetzung zu vermeiden.
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Die
Reaktion der Bindung des Polyethylenimins an die funktionelle Gruppe
auf der Oberfläche der
feinen Teilchen und die Reaktion der Vernetzung des Polyethylenimins
mit dem Vernetzungsmittel verlaufen gleichzeitig. Diese Reaktionen
sollten bevorzugt unter milden Bedingungen ausgeführt werden, d.h.
bei einer Temperatur im Bereich von Zimmertemperatur bis 50°C und über eine
Zeitdauer von 10 Minuten bis zwei Stunden, um Gelbildung während der Vernetzungsreaktion
zu vermeiden.
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Schliesslich
werden die feinen Teilchen, die eine gehärtete Oberflächenschicht
aus einem vernetzten Polyethylenimin besitzen, aus dem wässrigen
Reaktionsgemisch wiedergewonnen und durch Waschen mit einer wässrigen
Chlorwasserstoffsäurelösung und/oder
Wasser mit der herkömmlichen Prozedur
gereinigt.
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Der
Anionenaustauscher der vorliegenden Erfindung ist als eine Füllung für die Chromatographie
nützlich.
Konkreter wird der Anionenaustauscher in eine aus Glas oder einem
Metall bestehende Säule
gefüllt,
und die gefüllte
Säule wird
in der Chromatographie für
die Analyse, Auftrennung oder Isolierung anionischer Proteine oder
anderer Materialien verwendet.
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Die
Erfindung wird nun durch die folgenden Arbeitsbeispiele beschrieben,
die in keiner Weise den Umfang der Erfindung einschränken.
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Beispiel 1
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(Herstellung des Anionenaustauschers)
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Ein
500-ml-Dreihalskolben wird mit 50 g poröser hydrophiler Acrylatpolymerteilchen,
die einen durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 10 μm und Poren
mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 1000 Å besitzen,
sowie mit 50 g reinen Wassers und 50 g Epichlorhydrin beschickt.
Der Kolben wird mit einem Rührer
ausgerüstet
und in ein bei 40°C
gehaltenes Ölbad
getaucht, der Inhalt wurde gelinde gerührt. Die oben erwähnten, verwendeten porösen hydrophilen
Acrylatpolymerteilchen wurden aus einer handelsüblichen Säule genommen (Handelsbezeichnung „TSK-Gel
G5000 PWXL", erhältlich von
Tosoh Corporation).
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Separat
wurde ein 200-ml-Kolben mit 40 g Natriumhydroxid und 60 g reinen
Wassers beschickt, um eine wässrige
Natriumhydroxidlösung
herzustellen. Die wässrige
Natriumhydroxidlösung
wurde über eine
Zeitdauer von einer Stunde mit einer Perista-Pumpe tropfenweise zu dem oben erwähnten Inhalt
des 500-ml-Kolbens hinzugefügt,
während
gerührt
wurde. Nach dem Ende der tropfenweisen Zugabe des Natriumhydroxids
wurde das Gemisch während
einer Stunde weiter gerührt,
um die Epoxidierung der Oberfläche
der Acrylatpolymerteilchen auszuführen. Nach beendeter Epoxidierung
wurden die feinen Teilchen mit einem Glasfilter abgetrennt und mit
reinem Wasser gewaschen.
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Ein
300-ml-Dreihalskolben wurde mit 50 g der epoxidierten feinen Teilchen
beschickt, dann wurden 20 g Ethylenglykol-diglycidylether und 50
g reinen Wassers hinzugefügt.
Der Kolben wurde in ein bei 40°C
gehaltenes Ölbad
getaucht, und das Gemisch wurde gerührt, um eine Dispersion herzustellen,
die die epoxidierten feinen Teilchen und ein Vernetzungsmittel enthielt.
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Separat
wurde ein 200-ml-Kolben mit 50 ml einer 4 N wässrigen Natriumhydroxidlösung und
20 g Polyethylenimin mit einem Zahlenmittel des Molekulargewichts
von 600 (erhältlich
von Wako Pure Chemical Ind. Ltd.) beschickt, um eine Polyethyleniminlösung herzustellen.
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Die
Polyethyleniminlösung
wurde zu der oben erwähnten
Dispersion der epoxidierten feinen Teilchen und des Vernetzungsmittels
hinzugefügt, und
das Gemisch wurde während
zwei Stunden gerührt,
wobei eine gehärtete
Schicht aus vernetztem Poly ethylenimin auf der Oberfläche der
feinen Teilchen gebildet wurde. Nach beendeter Reaktion wurde der
so erhaltene Anionenaustauscher mit einem Glasfilter abgetrennt
und mit einer wässrigen
0,5 N Chlorwasserstoffsäurelösung, dann
mit reinem Wasser gewaschen. Der Anionenaustauscher hatte eine Ionenaustauschkapazität von 0,12
meq/ml Gel.
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(Bewertung der adsorptiven
Trennleistung des Anionenaustauschers für Protein)
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Der
Anionenaustauscher wurde in eine Säule gefüllt, die Abmessungen von 4,6
mm Innendurchmesser und 5 mm Länge
besass. Das Adsorptionsvermögen
für Protein
wurde mit einer Durchbruchmethode gemessen. Die eingesetzten Messbedingungen
und -geräte
waren wie folgt:
Pumpe: Handelsbezeichnung „CCPM-II", erhältlich von Tosoh Corporation.
Autosampler:
Handelsbezeichnung „AS-8020", erhältlich von
Tosoh Corporation.
Detektor: Handelsbezeichnung „UV-8020", erhältlich von
Tosoh Corporation.
Muster: 10 mg/ml, „BSA", erhältlich von Sigma Co.
Mustermenge
eingespritzt: 5 ml.
Wellenlänge
für die
Messung: UV 280 nm.
Elutionslösung: 20 mM Tris-HCl-Puffer
(pH: 8,0).
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Das
Adsorptionsvermögen
für Protein
(BSA) betrug 150 mg BSA/ml Gel, berechnet mit einem Durchbruchpunkt
von 10% der durch Proteinelution verursachten Extinktionsänderung.
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Der
oben erwähnte
Anionenaustauscher wurde in eine Säule gefüllt, die Abmessungen von 5,0
mm Innendurchmesser und 50 mm Länge
besass. Die Auftrennung des Proteins wurde unter den folgenden Bedingungen
durchgeführt.
Die verwendeten Geräte
waren die gleichen wie oben erwähnt.
Elutionslösung: A
= 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH: 8,0);
B = Elutionslösung A +
1,0 M wässriges
Natriumchlorid.
Gradient: linearer Gradient, Übergang
von 100% Elutionslösung
A zu 100% Elutionslösung
B über
einen Zeitraum von 15 min.
Durchflussgeschwindigkeit: 1,0 ml/min.
Muster:
Ovalbumin (2 mg/ml),
Trypsininhibitor (2 mg/ml).
Mustermenge
injiziert: 20 μl.
Wellenlänge für die Messung:
UV 280 nm.
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Die
Testergebnisse sind als Chromatogramm (A) in 1 aufgezeichnet.
Die Abszisse zeigt die Zeit (in Minuten), die seit dem Einspritzen des
Musters in ein Messgerät
vergangen ist. Aus dem Chromatogramm (A) ist ersichtlich, dass der
im Beispiel 1 hergestellte Anionenaustauscher ein grosses Adsorptionsvermögen für Protein
und eine hohe Trennleistung besass. Der Druck für die Flüssigkeitszufuhr in den Strömungswegen
betrug 1,0 MPa, somit hatte der Anionenaustauscher eine gute Durchlässigkeit
für Flüssigkeit.
Das bedeutet, dass ein grosses Adsorptionsvermögen und eine hohe Trennleistung
bei einem niedrigen Arbeitsdruck erhalten werden können.
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Beispiel 2
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Ein
Anionenaustauscher wurde hergestellt und sein Adsorptionsvermögen für Protein
bewertet unter Verwendung der gleichen Prozeduren wie im Beispiel
1 beschrieben, ausser dass 1,4-Butandiol-diglycidylether als ein
Vernetzungsmittel verwendet wurde, während alle anderen Bedingungen
gleich blieben.
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Der
Anionenaustauscher hatte eine Ionenaustauschkapazität von 0,11
meq/ml Gel und ein Adsorptionsvermögen für Protein von 135 mg BSA/ml Gel.
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Vergleichsbeispiel 1
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Ein
Anionenaustauscher wurde hergestellt und sein Adsorptionsvermögen für Protein
bewertet unter Verwendung der gleichen Prozeduren wie im Beispiel
1 beschrieben, ausser dass das Vernetzungsmittel und die 4 N wässrige Natriumhydroxidlösung nicht
verwendet wurden, während
alle anderen Bedingungen gleich blieben. Das bedeutet, dass bei dem
Anionenaustauscher Polyethylenimin auf die Oberfläche epoxidierter
feiner Teilchen aufgebracht worden war, aber er besass keine gehärtete Schicht aus
vernetztem Polyethylenimin.
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Der
Anionenaustauscher hatte eine Ionenaustauschkapazität von 0,04
meq/ml Gel und ein Adsorptionsvermögen für Protein von 42 mg BSA/ml Gel.
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Vergleichsbeispiel 2
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Die
Herstellung eines Anionenaustauschers wurde mit den gleichen Prozeduren
versucht, wie im Beispiel 1 beschrieben, wobei die 4 N wässrige Natriumhydroxidlösung nicht
verwendet wurde, während alle
anderen Bedingungen gleich blieben. Das Reaktionsgemisch härtete in
dem Schritt der Bildung einer gehärteten Schicht aus vernetztem Polyethylenimin aus,
und daher konnten die feinen Teilchen nicht aus dem Kolben herausgenommen
werden.
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Vergleichsbeispiel 3
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Von
den epoxidierten feinen Teilchen, die in Beispiel 1 hergestellt
worden waren, wurden 50 g in einen 300-ml-Dreihalskolben gegeben,
und 10 ml einer 28-%igen wässrigen
Triethylaminlösung
(erhältlich
von Tokyo Kasei Shiyaku K.K.) sowie 50 g reinen Wasssers wurden
hinzugefügt.
Dann wurde der Kolben in ein Ölbad
getaucht, das bei 40°C
gehalten wurde, und der Inhalt des Kolbens wurde während zwei
Stunden gerührt.
Die so behandelten feinen Teilchen wurden mit einem Glasfilter abgetrennt
und mit einer 0,5 N wässrigen
Chlorwasserstoffsäurelösung, dann
mit reinem Wasser gewaschen, um einen Anionenaustauscher herzustellen.
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Der
Anionenaustauscher hatte eine Ionenaustauschkapazität von 0,03
meq/ml Gel. Das Adsorptionsvermögen
des Anionenaustauschers für Protein
betrug 35 mg BSA/ml Gel.
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Der
Anionenaustauscher wurde in eine Säule gefüllt und die Protein-Trennleistung
mit den gleichen Prozeduren geprüft
wie in Beispiel 1 beschrieben, ausser dass die Gradientenzeit zu
30 min verändert
wurde, während
alle anderen Bedingungen gleich blieben. Die Prüfergebnisse werden als Chromatogramm
(B) in 1 gezeigt. Es ist aus 1 ersichtlich,
dass die Protein-Trennwirkung im Vergleich zu der im Beispiel 1
erhaltenen (Chromatogramm (A)) schwach war.
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Aus 1 ist
ersichtlich, dass der Anionenaustauscher der vorliegenden Erfindung
eine hohe Ionenaustauschkapazität
und ein hohes Adsorptionsvermögen
für Protein
besitzt, während
Nachteile wie eine Verbreiterung jedes Protein-Elutionspeaks und ein
höherer
Zufuhrdruck nicht entstehen.
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Vorteile
des Anionenaustauschers der vorliegenden Erfindung lassen sich wie
folgt zusammenfassen. Durch das Aufbringen von Polyethylenimin auf
die Oberfläche
der feinen Teilchen weist der Anionenaustauscher eine erhöhte Ionenaustauschkapazität sowie
ein erhöhtes
Adsorptionsvermögen
für Protein
und andere Zielmuster auf, obwohl der Anionenaustauscher aus feinen
Teilchen besteht. Daher ist der Anionenaustauscher für Chelatharze
und Füllungen
für die
Chromatographie nützlich.
Insbesondere dann, wenn der Anionenaustauscher als eine Füllung für Flüssigkeitschromatographie
verwendet wird, weist er ein hohes Adsorptionsvermögen, eine grosse
Retention und eine hohe Auflösung bei
der Trennung bei niedrigem Betriebsdruck auf. Der Anionenaustauscher
ist für
die Auftrennung eines Zielmusters wie auch für die Spurenanalyse eines Musters,
das eine grosse Menge begleitender Inhaltsstoffe enthält, besonders
gut geeignet.
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Der
Anionenaustauscher besteht aus feinen Teilchen und weist daher eine
gute Durchlässigkeit für Flüssigkeit
sowie eine hohe Auflösung
auf, des Weiteren kann bei einem verminderten Arbeitsdruck gearbeitet
werden. Daher kann, wenn Protein oder andere Materialien unter Verwendung
einer mit dem Anionenaustauscher der vorliegenden Erfindung gefüllten Säule analysiert
werden, eine grosse Menge des Musters ohne erhöhten Betriebsdruck in einer Charge
behandelt werden.