DE60203746T2

DE60203746T2 - Anionenaustauscher, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung

Info

Publication number: DE60203746T2
Application number: DE60203746T
Authority: DE
Inventors: Kazuaki Shinnanyo-shi Muranaka; Teruhiko Shinnanyo-shi Tsuda
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2001-01-22
Filing date: 2002-01-22
Publication date: 2006-01-12
Also published as: DE60203746D1; DE60203746T8; EP1224975B1; EP1224975A1; JP2002210377A; US20020134729A1

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf einen Anionenaustauscher, eine aus dem Anionenaustauscher bestehende Füllung für Chromatographie und eine mit der Füllung gefüllte Säule für die Chromatographie.
Feine Teilchen, die eine Anionen austauschende Gruppe besitzen, werden auf dem Gebiet der Flüssigkeitschromatographie für die Analyse, Trennung oder Isolierung zum Beispiel von Aminosäuren, Peptiden, Proteinen, Nucleinsäuren und Sacchariden weithin verwendet.
Ein Anionenaustauscher in Gestalt feiner Teilchen wird allgemein hergestellt, indem eine Anionen austauschende Gruppe dadurch eingeführt wird, dass eine direkte Bindung der Anionen austauschenden Gruppe an eine auf der Oberfläche der feinen Teilchen vorhandene funktionelle Gruppe erfolgt. Konkreter sind Verfahren bekannt, bei denen eine funktionelle Gruppe wie eine Hydroxyl-, Epoxy- oder Halogenalkylgruppe auf die Oberfläche eines feinen Teilchens gebracht wird und dann eine direkte Reaktion einer Anionen austauschenden Stickstoffverbindung mit der funktionellen Gruppe auf der Teilchenoberfläche erfolgt, wodurch eine Anionen austauschende Gruppe in das feine Teilchen eingeführt wird. Die verwendeten feinen Teilchen sind zum Beispiel vernetzte feine Teilchen von Polysacchariden wie Cellulose, Agarose und Dextran, feine Teilchen anorganischer Materialien wie Kieselgel, Aluminiumoxid und Zeolithe sowie feine Teilchen aus organischen polymeren Materialien wie einem Acrylpolymer und einem Styrolpolymer. Die Befähigung des Anionenaustauschers zur Analyse und Trennung, d.h. das Vermögen, ein zu analysierendes oder aufzutrennendes Muster auf der Oberfläche des Anionenaustauschers zu halten, der aus feinen Teilchen besteht, auf deren Oberfläche Anionen austauschende Gruppen eingeführt worden sind, wird im Prinzip durch die Oberflächengrösse der feinen Teilchen bestimmt (im Falle feiner Teilchen mit Mikroporen ist die Befähigung zur Analyse und Trennung durch den Durchmesser der Mikroporen und deren Oberflächengrösse bestimmt). Ein solcher Anionenaustauscher ist dadurch gekennzeichnet, dass er eine hohe Adsorptions- und Desorptionsgeschwindigkeit aufweist und ein scharfes Trennungsbild ergibt, wenn er zur Adsorption eines zu analysierenden oder zu isolierenden Musters als eine Einzelschicht auf der Oberfläche der feinen Teilchen in der Flüssigkeitschromatographie verwendet wird.
In den letzten Jahren werden Anionenaustauscher mit verbessertem Vermögen für die Adsorption von Proteinen oder anderen Materialien entwickelt, um die Arbeitsgeschwindigkeit in der Auftrennung von zu adsorbierenden Proteinen oder anderen Materialmustern zu erhöhen. Versuche werden unternommen, um das Adsorptionsvermögen der Oberfläche feiner Teilchen zu erhöhen. Zum Beispiel ist im US-Patent Nr. 5 453 186 ein Verfahren zur Herstellung eines Anionenaustauschers vorgeschlagen worden, der in der Lage ist, ein Muster unter Bildung von Mehrfachschichten des Musters auf der Oberfläche feiner Teilchen zu adsorbieren, indem eine Polymerkette, die eine Anionen austauschende Gruppe besitzt, auf die Oberfläche der feinen Teilchen aufgebracht wird.
Viele Vorschläge für Verfahren, die Polymerkette, die eine Anionen austauschende Gruppe besitzt, auf die Oberfläche eines feinen Teilchens aufzubringen, sind gemacht worden. Zum Beispiel sind vorgeschlagen worden: 1) ein Verfahren, ein Polymer herzustellen, das mit einem Monomer mit einer vernetzenden funktionellen Gruppe copolymerisiert ist, und dann die in das Polymer eingeführte vernetzende funktionelle Gruppe mit einer auf der Oberfläche eines feinen Teilchens vorhandenen funktionellen Gruppe reagieren zu lassen und dadurch das Polymer, das eine Anionen austauschende Gruppe besitzt, auf die Oberfläche des feinen Teilchens aufzubringen; 2) ein Verfahren der Pfropfpolymerisation, d.h. Bestrahlung der Oberfläche eines feinen Teilchens, um Radikale bildende Plätze zu schaffen, oder Behandlung der Oberfläche eines feinen Teichens mit einem Cer- oder Mangansalz, um Hydroxylgruppen als Radikale bildende Plätze zu schaffen, und dann eine Polymerkette auf jedem der Radikale bildenden Plätze wachsen zu lassen; 3) ein Verfahren, eine ungesättigte Gruppe auf die Oberfläche eines feinen Teilchens aufzubringen und dann die mit dem Polymer eingeführte ungesättigte Gruppe in einer Monomerlösung zu behandeln, wodurch eine vom Monomer abgeleitete Polymerkette auf der ungesättigten Gruppe wachsen kann; und 4) ein Verfahren, eine funktionelle Gruppe in eine terminale Polymergruppe einzuführen und dann das Polymer mit einer funktionellen Gruppe reagieren zu lassen, die auf der Oberfläche eines feinen Teilchens vorhanden ist.
Unter den oben erwähnten Verfahren 1), ein Polymer herzustellen, das mit einem Monomer mit einer vernetzenden funktionellen Gruppe copolymerisiert ist, und dann die in das Polymer eingeführte vernetzende funktionelle Gruppe mit einer auf der Oberfläche eines feinen Teilchens vorhandenen funktionellen Gruppe reagieren zu lassen, ist ein Verfahren, Polyamin mit einer funktionellen Gruppe wie einer Epoxygruppe oder einer halogenierten Alkylgruppe reagieren zu lassen, die auf der Oberfläche eines feinen Teilchens vorhanden sind, weithin zur Herstellung eines Anionenaustauschers verwendet worden, weil der Anionenaustauscher dadurch leicht hergestellt werden kann, dass die Stickstoffatome im Polyamin als vernetzende Plätze und gleichzeitig als eine Anionen austauschende Gruppe wirken. Jedoch ist der Erhöhung des Adsorptionsvermögens für ein zu analysierendes, zu isolierendes oder aufzutrennendes Muster keine Beachtung geschenkt worden.
Das oben erwähnte Verfahren der Pfropfpolymerisation 2) ist dafür bekannt, dass es einen Anionenaustauscher liefern kann, der ein hohes Vermögen für die Adsorption eines Musters besitzt. Der durch das Verfahren der Pfropfpolymerisation hergestellte Anionenaustauscher besitzt jedoch geradkettige Polymere auf seiner Oberfläche, weshalb für den Durchsatz einer Flüssigkeit ein hoher Arbeitsdruck erforderlich ist, wenn er als Füllung in einer Säule für Flüssigkeitschromatographie verwendet wird. Daher müssen druckfeste Ausrüstungen und Rohre für die Organe der Flüssigkeitschromatographie von der Flüssigkeits-Speisepumpe bis hin zum Detektor und zu den diese Organe miteinander verbindenden Leitungen verwendet werden. Daher ergeben sich Probleme, indem die Gerätekosten steigen, Dichtungsmaterialien leicht verderben und Teile in kürzeren Zeitabständen ausgewechselt werden müssen, ausserdem besteht eine Neigung zu Flüssigkeitslecks. Die Eigenschaften des Flüssigkeitsdurchgangs hängen eng mit dem Teilchendurchmesser des Anionenaustauschers zusammen. Wenn der Teilchendurchmesser des Anionenaustauschers grösser gemacht wird, können die Eigenschaften des Flüssigkeitsdurchgangs verbessert werden, aber das Trennvermögen des Anionenaustauschers in der Flüssigkeitschromatographie verringert sich. Zusammenfassend kann der durch das Verfahren der Pfropfpolymerisation 2) hergestellte Anionenaustauscher nicht mit Vorteil für eine Flüssigkeitschromatographie eingesetzt werden, bei der ein hohes Adsorptionsvermögen und ein hohes Trennvermögen erforderlich sind.
Im Hinblick auf das Gesagte besteht ein Ziel der vorliegenden Erfindung darin, einen Anionenaustauscher zur Verfügung zu stellen, der ein feines poröses Teilchen mit einem an seine Oberfläche gebundenen Polyamin ist und ein erhöhtes Adsorptionsvermögen für ein zu analysierendes, aufzutrennendes oder zu isolierendes Muster aufweist.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, um einen Anionenaustauscher in Gestalt feiner poröser Teilchen herzustellen, der ein erhöhtes Adsorptionsvermögen für ein zu analysierendes, aufzutrennendes oder zu isolierendes Muster aufweist, indem ein Polyamin an eine auf der Oberfläche des feinen porösen Teilchens vorhandene Epoxygruppe, halogenierte Alkylgruppe oder Aldehydgruppe gebunden wird.
Noch ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Füllung für Chromatographie zur Verfügung zu stellen, die aus einem Anionenaustauscher besteht, der ein erhöhtes Adsorptionsvermögen für ein zu analysierendes, aufzutrennendes oder zu isolierendes Muster aufweist.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Säule für Chromatographie zur Verfügung zu stellen, die mit der oben erwähnten Füllung gefüllt ist.
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Anionenaustauscher zur Verfügung gestellt, der ein feines poröses Teilchen ist, an dessen Oberfläche ein Polyamin gebunden ist, das ein Zahlenmittel des Molekulargewichts von mindestens 50000, einen Teilchendurchmesser von 1 bis 100 μm und Poren mit einem durchschnittlichen Durchmesser von mindestens 150 Å besitzt. Das Polyamin ist bevorzugt Polyethylenimin und ist besonders bevorzugt über zumindest eine aus
-CH₂- und -CH= ausgewählte Gruppe an die Oberfläche des feinen porösen Teilchens gebunden.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Anionenaustauschers in Gestalt feiner poröser Teilchen zur Verfügung gestellt, das den Schritt umfasst, ein Polyamin mit einem Zahlenmittel des Molekulargewichts von mindestens 50000 an zumindest eine Gruppe zu binden, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer Epoxygruppe, einer halogenierten Alkylgruppe und einer Aldehydgruppe besteht, die auf der Oberfläche des feinen porösen Teilchens vorhanden ist, das einen Teilchendurchmesser von 1 bis 100 μm und Poren mit einem durchschnittlichen Durchmesser von mindestens 150% besitzt. Bevorzugt erfolgt die Bindung des Polyamins an die feinen porösen Teilchen, indem das Polyamin in Gegenwart einer Base mit den in einem wässrigen flüssigen Medium dispergierten feinen porösen Teilchen in Berührung gebracht wird.
In noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Füllung für die Chromatographie zur Verfügung gestellt, die aus den oben erwähnten, feinen porösen Teilchen mit gebundenem Polyamin besteht.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Säule für die Chromatographie zur Verfügung gestellt, die mit der oben erwähnten Füllung gefüllt ist.
1 veranschaulicht Chromatogramme (A), (B) und (C), die für Proteintrennung in Beispiel 1, Vergleichsbeispiel 1 bzw. Vergleichsbeispiel 3 erhalten wurden.
Der Anionenaustauscher der vorliegenden Erfindung besteht aus feinen porösen Teilchen, an deren Oberfläche ein Polyamin mit einem Zahlenmittel des Molekulargewichts von mindestens 50000 gebunden ist. Der Anionenaustauscher besitzt ein grosses Adsorptionsvermögen für ein zu analysierendes oder aufzutrennendes Muster und weist, wenn er als eine Füllung für Flüssigkeitschromatographie verwendet wird, gute Eigenschaften für den Flüssigkeitsdurchgang auf. Daher kann der Teilchendurchmesser klein gemacht werden, während das Trennvermögen für ein Muster nicht verringert ist. Folglich wird gemäss dem Anionenaustauscher der vorliegenden Erfindung das Vermögen für die Adsorption eines Musters erhöht, die Adsorptions- und Desorptionsgeschwindigkeit eines Musters wird erhöht, und ein scharfes Trennmuster wird erhalten, was einen markanten Gegensatz zur herkömmlichen Technik darstellt.
Der Durchmesser der feinen porösen Teilchen, die den Anionenaustauscher der vorliegenden Erfindung darstellen, liegt im Bereich von 1 μm bis 100 μm, um bei Verwendung in der Flüssigkeitschromatographie eine bessere Auftrennleistung zu erreichen.
Die verwendeten feinen porösen Teilchen sind unter anderem feine organische poröse Teilchen und feine anorganische poröse Teilchen. Die feinen organischen porösen Teilchen sind unter anderem zum Beispiel Teilchen von Copolymeren eines monofunktionellen Vinylmonomers mit einem polyfunktionellen Vinylmonomer sowie vernetzte Polysaccharide. Als konkrete Beispiele für das monofunktionelle Vinylmonomer können Hydroxyalkylester der Acryl- und Methacrylsäure wie 2-Hydroxyethylacrylat, 2,3-Dihydroxypropylacrylat, 2-Hydroxyethylmethacrylat und 2,3-Dihydroxypropylmethacrylat; eine Epoxygruppe enthaltende Ester der Acryl- und Methacrylsäure wie Glycidylacrylat und Glycidylmethacrylat; halogenierte Alkylester der Acryl- und Methacrylsäure wie 3-Chlor-2-hydroxypropylacrylat, 3-Brompropylacrylat, 3-Chlor-2-hydroxypropylmethacrylat und 3-Brompropylmethacrylat; Acrylsäure und Methacrylsäure; Alkylacrylate und Alkylmethacrylate wie Methylacrylat, Ethylacrylat, Methylmethacrylat und Ethylmethacrylat; Styrolabkömmlinge wie Chlormethylstyrol, Vinylbenzylalkohol, Vinylbenzyl-glycidylether und Hydroxystyrol; sowie Vinylacetat erwähnt werden. Als konkrete Beispiele für das polyfunktionelle Vinylmonomer können Polyolester der Acryl- und Methacrylsäure wie Ethylenglykol-diacrylat, Glycerin-diacrylat, Ethylenglykol-dimethacrylat und Glycerin-dimethacrylat; sowie Divinylbenzol und Triallylisocyanurat erwähnt werden. Als konkrete Beispiele für die vernetzten Polysaccharide können Cellulose, Agarose, Dextran und Mannose erwähnt werden.
Als konkrete Beispiele für die feinen anorganischen porösen Teilchen können Siliciumdioxid, Zeolith, Titandioxid, Aluminiumoxid und Hydroxyapatit erwähnt werden.
Die feinen porösen Teilchen sind feine poröse Teilchen, die im Hinblick auf ein verbessertes Adsorptionsvermögen für ein zu analysierendes oder aufzutrennendes Muster Poren mit einem durchschnittlichen Durchmesser von mindestens 150 Å, stärker bevorzugt von mindestens 250 Å besitzen. Die Obergrenze des durchschnittlichen Porendurchmessers ist nicht speziell begrenzt, beträgt aber gewöhnlich 0,5 μm.
Das Polyamin mit einem Zahlenmittel des Molekulargewichts von mindestens 50000, das an die Oberfläche der oben erwähnten, feinen porösen Teilchen gebunden werden soll, schliesst Homopolymere eines Aminogruppen enthaltenden ungesättigten Monomers sowie Copolymere von zwei oder mehr solcher Monomere ein. Als konkrete Beispiele für das Polyamin können Polyethylenimin, Polyallylamin und Homopolymere sowie Copolymere erwähnt werden, die von Aminogruppen enthaltenden ungesättigen Monomeren abgeleitet sind, wie N,N-Dimethylaminopropyl-methacrylamid und N,N-Dimethylaminoethyl-methacrylat. Von diesen wird im Hinblick auf verbesserte Eigenschaften des erhaltenen Anionenaustauschers Polyethylenimin bevorzugt.
Das Polyamin ist nicht speziell begrenzt, solange es zufolge einer Viskositätsbestimmung ein Zahlenmittel des Molekulargewichts von mindestens 50000 besitzt, aber bevorzugt besitzt es ein Zahlenmittel des Molekulargewichts im Bereich von etwa 50000 bis etwa 500000. Wenn ein Polyamin mit einem Molekulargewicht in diesem Bereich auf die Oberfläche der feinen porösen Teilchen aufgebracht wird, an deren Oberfläche Poren freiliegen, dringt das Polyamin leicht in die Poren ein, und somit kann eine grosse Menge an Polyamin an die Oberfläche der feinen porösen Teilchen gebunden werden, mit dem Ergebnis, dass ein Anionenaustauscher mit einem stärker erhöhten Adsorptionsvermögen gewonnen werden kann.
Keine spezielle Beschränkung besteht für die Art und Weise, wie das Polyamin an die Oberfläche der feinen porösen Teilchen gebunden wird, solange es chemisch gebunden wird. Das Polyamin ist aber bevorzugt Polyethylenimin, und besonders bevorzugt ein Polyethylenimin, das über zumindest eine Gruppe, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus -CH₂-C(OH)H-CH₂-, -CH₂- und -CH= besteht, an die Oberfläche der feinen porösen Teilchen gebunden ist. Zum Beispiel ist das Polyethylenimin in der durch die folgenden Formeln (1) oder (2) dargestellten Form an die Teilchenoberfläche gebunden:
worin A das Anionenaustauscherteilchen bezeichnet, m eine ganze Zahl von mindestens 1 und n eine ganze Zahl von mindestens 0 ist. Es sei bemerkt, dass die Polyethyleniminkette Verzweigungen besitzen kann, die sich jeweils von einem Stickstoffatom in der Polymerkette aus erstrecken. Es ist möglich, dass einige Verzweigungen Vernetzungen zwischen benachbarten Polymerketten bilden. Wenn die Polymerkette durch eine -CH=-Gruppe gebunden ist, die von einer Aldehydgruppe abgeleitet ist, dann ist ein endständiges Stickstoffatom der Polymerkette an die -CH=-Gruppe gebunden.
Der Anionenaustauscher der vorliegenden Erfindung wird bevorzugt mit einem Verfahren hergestellt, bei dem man ein Polyamin mit einem Molekulargewicht von mindestens 50000 mit einer funktionellen Gruppe wie einer Epoxygruppe, einer halogenierten Alkylgruppe oder einer Aldehydgruppe reagieren lässt, die auf der Oberfläche eines feinen porösen Teilchens vorhanden und in der Lage ist, mit einer tertiären oder niedrigeren Aminogruppe zu reagieren.
Als bevorzugte Beispiele der funktionellen Gruppen, die in der Lage sind, mit einer tertiären oder niedrigeren Aminogruppe zu reagieren, können eine Epoxygruppe, eine halogenierte Alkylgruppe und eine Aldehydgruppe erwähnt werden, die bevorzugt werden, weil das Polyamin wirksam auf eine Epoxygruppe, eine halogenierte Alkylgruppe oder eine Aldehydgruppe aufgebracht werden kann, indem ein feines poröses Teilchen, das diese Gruppen besitzt, in einem geeigneten flüssigen Medium mit dem Polyamin in Berührung gebracht wird. Die halogenierte Alkylgruppe ist bevorzugt eine chlorierte, bromierte oder iodierte Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.
Das feine poröse Teilchen, das auf seiner Oberfläche eine funktionelle Gruppe wie eine Epoxygruppe, eine halogenierte Alkylgruppe oder eine Aldehydgruppe besitzt, die in der Lage ist, mit einer tertiären oder niedrigeren Aminogruppe zu reagieren, ist bekannt und kann mit einer herkömmlichen Prozedur hergestellt werden. Eine Epoxygruppe, eine halogenierte Alkylgruppe und eine Aldehydgruppe können auf die Oberfläche des feinen porösen Teilchens aufgebracht werden, indem das feine poröse Teilchen zum Beispiel mit Epichlorhydrin, Ethylenglykol-diglycidylether und Butandiol-diglycidylether für eine Epoxygruppe; mit Epichlorhydrin und 1,3-Brombutan für eine halogenierte Alkylgruppe; und mit Glutaraldehyd für eine Aldehydgruppe behandelt wird.
Als funktionelle Gruppe kann eine einzelne funktionelle Gruppe oder eine Kombination von zwei oder mehr funktionellen Gruppen auf der Oberfläche des feinen porösen Teilchens vorhanden sein.
Die Reaktion des Polyamins mit einer auf der Oberfläche des feinen porösen Teilchens vorhandenen Epoxygruppe, halogenierten Alkylgruppe oder Aldehydgruppe wird bevorzugt ausgeführt, indem das Polyamin unter basischen Bedingungen mit den feinen porösen Teilchen in einer wässrigen Dispersion in Berührung gebracht wird. Diese Prozedur lässt sich leicht ausführen, und die Produktivität der Herstellung des Anionenaustauschers der vorliegenden Erfindung ist hoch.
Die Prozedur, mit der das Polyamin mit den feinen porösen Teilchen in einer wässrigen Dispersion in Berührung gebracht wird, wird jetzt konkreter beschrieben. Zuerst werden die feinen porösen Teilchen in einem wässrigen Medium dispergiert. Das wässrige Medium ist nicht besonders beschränkt, solange es in der Lage ist, das Polyamin aufzulösen, und solange die feinen porösen Teilchen im wässrigen Medium dispergiert werden können. Dann wird das Polyamin unter basischen Bedingungen zum wässrigen Medium hinzugefügt, während das wässrige Medium gerührt wird. Die basischen Bedingungen können geschaffen werden, indem eine Base wie kaustisches Alkali oder eine quaternäre Ammoniumverbindung wie Tetramethylammoniumhydroxid in einer solchen Menge zugesetzt werden, dass ein pH-Wert von mindestens 9 erreicht wird. Die Reaktion des Polyamins mit einer Epoxygruppe, einer halogenierten Alkylgruppe oder einer Aldehydgruppe erfolgt sogar bei Zimmertemperatur, aber wird bevorzugt unter Erwärmen ausgeführt. Diese Reaktion kann zum Beispiel im erwünschten Ausmass bewerkstelligt werden, indem eine Temperatur von etwa 40°C für etwa zwei Stunden aufrecht erhalten wird. Schliesslich werden die feinen porösen Teilchen aus dem wässrigen Medium herausgenommen und dann gewaschen, um nicht reagiertes Polyamin zu entfernen. Eine wässrige Chlorwasserstoffsäurelösung wird bevorzugt zum Waschen verwendet.
Der Anionenaustauscher der vorliegenden Erfindung ist als eine Füllung für die Chromatographie nützlich. Konkreter wird der Anionenaustauscher in eine aus Glas oder einem Metall bestehende Säule gefüllt, und die gefüllte Säule wird in der Chromatographie für die Analyse, Auftrennung oder Isolierung anionischer Proteine oder anderer Materialien verwendet.
Die Erfindung wird nun durch die folgenden Arbeitsbeispiele beschrieben, die in keiner Weise den Umfang der Erfindung einschränken.
Beispiel 1
Ein 500-ml-Dreihalskolben wird mit 50 g poröser hydrophiler Acrylatpolymerteilchen, die einen durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 10 μm und Poren mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 1000 Å besitzen, sowie mit 50 g reinen Wassers und 50 g Epichlorhydrin beschickt. Der Kolben wird mit einem Rührer ausgerüstet und in ein bei 40°C gehaltenes Ölbad getaucht, der Inhalt wird gelinde gerührt. Die oben erwähnten, verwendeten porösen hydrophilen Acrylatpolymerteilchen wurden aus einer handelsüblichen Säule genommen (Handelsbezeichnung „TSK-Gel G5000 PWXL", erhältlich von Tosoh Corporation).
Separat wurde ein 200-ml-Kolben mit 40 g Natriumhydroxid und 60 g reinen Wassers beschickt, um eine wässrige Natriumhydroxidlösung herzustellen. Die wässrige Natriumhydroxidlösung wurde über eine Zeitdauer von einer Stunde mit einer Perista-Pumpe tropfenweise zu dem oben erwähnten Inhalt des 500-ml-Kolbens hinzugefügt, während gerührt wurde. Nach dem Ende der tropfenweisen Zugabe des Natriumhydroxids wurde das Gemisch während einer Stunde weiter gerührt, um die Epoxidierung der Oberfläche der Acrylatpolymerteilchen auszuführen. Nach beendeter Epoxidierung wurden die feinen Teilchen mit einem Glasfilter abgetrennt und mit reinem Wasser gewaschen.
Ein 300-ml-Dreihalskolben wurde mit 50 g der epoxidierten feinen Teilchen beschickt, dann wurden 100 g reinen Wassers hinzugefügt und das Gemisch bei Zimmertemperatur gerührt. Zum Kolben wurden 15 g einer 30-%igen Lösung von Polyethylenimin (Handelsbezeichnung „P-70", erhältlich von Wako Pure Chemical Ind. Ltd.; Zahlenmittel des Molekulargewichts: 70000), und das Gemisch wurde gerührt. Der pH-Wert des Gemischs mit hinzugefügtem Polyethylenimin war zufolge einer Messung mit pH-Prüfpapier höher als 11.
Der Kolben wurde in ein bei 40°C gehaltenes Ölbad getaucht, und der Inhalt wurde während zwei Stunden gerührt, wodurch das Polyethylenimin an die Oberfläche der feinen Teilchen gebunden wurde. Nach beendeter Reaktion wurden die feinen Teilchen mit einem Glasfilter abgetrennt und mit einer wässrigen 0,5 N Chlorwasserstoffsäurelösung, dann mit reinem Wasser gewaschen, um einen Anionenaustauscher zu erhalten.
Der Anionenaustauscher wurde in eine Säule gefüllt, die Abmessungen von 4,6 mm Innendurchmesser und 5 mm Länge besass. Das Adsorptionsvermögen für Protein wurde mit einer Durchbruchmethode gemessen. Die eingesetzten Messbedingungen und -geräte waren wie folgt:
Pumpe: Handelsbezeichnung „CCPM-II", erhältlich von Tosoh Corporation.
Autosampler: Handelsbezeichnung „AS-8020", erhältlich von Tosoh Corporation.
Detektor: Handelsbezeichnung „UV-8020", erhältlich von Tosoh Corporation.
Muster: 10 mg/ml, „BSA", erhältlich von Sigma Co.
Mustermenge eingespritzt: 5 ml.
Wellenlänge für die Messung: UV 280 nm.
Elutionslösung: 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH: 8,0).
Das Adsorptionsvermögen für Protein (BSA) betrug 80 mg BSA/ml Gel, berechnet mit einem Durchbruchpunkt von 10% der durch Proteinelution verursachten Extinktionsänderung.
Der oben erwähnte Anionenaustauscher wurde in eine Säule gefüllt, die Abmessungen von 7,5 mm Innendurchmesser und 75 mm Länge besass. Die Auftrennung des Proteins wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt. Die verwendeten Geräte waren die gleichen wie oben erwähnt.
Elutionslösung: A = 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH: 8,0);
B = Elutionslösung A + 1,0 M wässriges Natriumchlorid.
Gradient: linearer Gradient, Übergang von 100% Elutionslösung A zu 100% Elutoinslösung B über einen Zeitraum von 30 min.
Durchflussgeschwindigkeit: 1,0 ml/min.
Muster: Ovalbumin (2 mg/ml),
Trypsininhibitor (2 mg/ml).
Mustermenge injiziert: 20 μl.
Wellenlänge für die Messung: UV 280 nm.
Die Testergebnisse sind als Chromatogramm (A) in 1 aufgezeichnet. Aus dem Chromatogramm (A) ist ersichtlich, dass der im Beispiel 1 hergestellte Anionenaustauscher ein grosses Adsorptionsvermögen für Protein und eine hohe Trennleistung besass. Der Druck für die Flüssigkeitszufuhr in den Strömungswegen betrug 1,2 MPa, somit hatte der Anionenaustauscher eine gute Durchlässigkeit für Flüssigkeit. Das bedeutet, dass ein grosses Adsorptionsvermögen und eine hohe Trennleistung bei einem niedrigen Druck der Flüssigkeitszufuhr erhalten werden können.
Beispiel 2
Ein Anionenaustauscher wurde hergestellt und sein Adsorptionsvermögen für Protein bewertet unter Verwendung der gleichen Prozeduren wie im Beispiel 1 beschrieben, ausser dass Polyallylamin-hydrochlorid mit einem Zahlenmittel des Molekulargewichts von etwa 100000 (erhältlich von Nittobo K. K.) statt des Polyethylenimins P-70 verwendet wurde, und dass nach Bindung des Polyallylamin-hydrochlorids an die feinen Teilchen eine wässrige 1 N Natriumhydroxidlösung verwendet wurde, um den pH-Wert auf 11 einzustellen. Alle anderen Bedingungen blieben gleich. Das Adsorptionsvermögen des Anionenaustauschers für Protein betrug 40 mg BSA/ml Gel.
Vergleichsbeispiel 1
Unter Verwendung der gleichen Prozeduren, wie im Beispiel 1 beschrieben, wurden drei Anionenaustauscher hergestellt und ihr Adsorptionsvermögen für Protein bewertet, indem drei Sorten von Polyethylenimin mit Zahlenmitteln des Molekulargewichts von 600, 1800 und 10000 (erhältlich von Wako Pure Chemical Ind. Ltd.) separat in einer Menge von je 5 g verwendet wurden, während alle anderen Bedingungen gleich blieben. Das Adsorptionsvermögen der drei Anionenaustauscher für Protein war wie folgt:

Molekulargewicht des Polyethylenimins Adsorptionsvermögen für Protein (mg BSA/ml Gel)

600 42

1800 40

10000 43
Aus den obigen Ergebnissen ist ersichtlich, dass das Adsorptionsvermögen für Protein klein ist, wenn ein Polyethylenimin mit einem Molekulargewicht von 10000 oder darunter verwendet wird. Bei Molekulargewichten des Polyethylenimins von 10000 und weniger bestehen ohne Rücksicht auf die Grösse des Molekulargewichts keine grossen Unterschiede im Adsorptionsvermögen für Protein.
Der mit Polyethylenimin mit einem Zahlenmittel des Molekulargewichts von 600 hergestellte Anionenaustauscher wurde in eine Säule gefüllt, und die Auftrennung von Protein wurde mit den gleichen Prozeduren geprüft, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Die Testergebnisse sind als Chromatogramm (B) in 1 aufgezeichnet. Es ist aus 1 ersichtlich, dass die Protein-Trennwirkung im Vergleich zu der im Beispiel 1 erhaltenen (Chromatogramm (A)) schwach war.
Vergleichsbeispiel 2
Ein Anionenaustauscher wurde hergestellt und sein Adsorptionsvermögen für Protein bewertet unter Verwendung der gleichen Prozeduren wie im Beispiel 2 beschrieben, ausser dass Polyallylamin mit einem Zahlenmittel des Molekulargewichts von 30000 (erhältlich von Nittobo K. K.) statt des Polyallylamin-hydrochlorids verwendet wurde, während alle anderen Bedingungen gleich blieben. Das Adsorptionsvermögen des Anionenaustauschers für Protein war 33 mg BSA/ml Gel.
Vergleichsbeispiel 3
Ein Anionenaustauscher wurde hergestellt und sein Adsorptionsvermögen für Protein bewertet unter Verwendung der gleichen Prozeduren wie im Beispiel 1 beschrieben, ausser dass Trimethylamin (erhältlich von Tokyo Kasei K. K.) statt des Polyethylenimins P-70 verwendet wurde, während alle anderen Bedingungen gleich blieben. Das Adsorptionsvermögen des Anionenaustauschers für Protein war 35 mg BSA/ml Gel.
Der hergestellte Anionenaustauscher wurde in eine Säule gefüllt und die Protein-Trennleistung mit den gleichen Prozeduren geprüft wie in Beispiel 1 beschrieben, ausser dass die Gradientenzeit zu 60 min verändert wurde, während alle anderen Bedingungen die gleichen blieben. Die Prüfergebnisse werden als Chromatogramm (C) in 1 gezeigt. Es ist aus 1 ersichtlich, dass die Protein-Trennwirkung im Vergleich zu der im Beispiel 1 erhaltenen (Chromatogramm (A)) schwach war.
Aus 1 ist ersichtlich, dass der Anionenaustauscher der vorliegenden Erfindung, an dessen Oberfläche Polyamin mit einem hohen Molekulargewicht gebunden ist, ein hohes Adsorptionsvermögen besitzt, während Nachteile wie eine Verbreiterung jedes Protein-Elutionspeaks und ein höherer Zufuhrdruck nicht entstehen. Dies steht in markantem Gegensatz zu herkömmlichen Ionenaustauschern aus feinen Teilchen, auf deren Oberfläche eine Ionenaustausch-Polymerkette aufgebracht wurde und die die Nachteile aufweisen, dass die Adsorptions- und Desorptionsgeschwindigkeit eines Zielmusters in der Flüssigkeitschromatographie niedrig, der Elutionspeak eines Zielmusters verbreitert und der Druck für die Flüssigkeitszufuhr erhöht sind.
Vorteile des Anionenaustauschers der vorliegenden Erfindung lassen sich wie folgt zusammenfassen. Durch die Einführung von Polyamin mit einem Zahlenmittel des Molekulargewichts von mindestens 50000 weist der Anionenaustauscher ein erhöhtes Adsorptionsvermögen für Protein und andere Zielmuster auf, obwohl der Anionenaustauscher aus feinen porösen Teilchen besteht. Wenn der Anionenaustauscher als eine Füllung für Flüssigkeitschromatographie verwendet wird, weist er eine gute Durchlässigkeit für Flüssigkeit und eine hohe Leistung auf. Auf Grund der guten Durchlässigkeit für Flüssigkeit kann die Arbeit bei einem verringerten Druck der Flüssigkeitszufuhr ausgeführt werden.
Das bedeutet, dass eine grosse Mustermenge ohne Erhöhung des Arbeitsdrucks, d.h. des Drucks für die Flüssigkeitszufuhr, in einer Charge behandelt werden kann, wenn Protein oder andere Materialien unter Verwendung einer Säule analysiert werden, die mit dem Anionenaustauscher der vorliegenden Erfindung gefüllt ist. Daher können eine Spurenanalyse in einem grossen Materialmuster ebenso wie präparative Chromatographie vorteilhaft ausgeführt werden.

Claims

Anionenaustauscher, der ein feines poröses Teilchen ist, dadurch gekennzeichnet, dass ein Polyamin mit einem Zahlenmittel des Molekulargewichts von mindestens 50000 an die Oberfläche des Teilchens gebunden ist und dass das Teilchen einen Teilchendurchmesser von 1 bis 100 μm und Poren mit einem durchschnittlichen Durchmesser von mindestens 150% besitzt.
Anionenaustauscher nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyamin Polyethylenimin ist.
Anionenaustauscher nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyethylenimin über zumindest eine Gruppe, die aus der Gruppe von
-CH₂- und -CH= ausgewählt ist, an die Oberfläche des feinen porösen Teilchens gebunden ist.
Verfahren zur Herstellung eines Anionenaustauschers in Gestalt eines feinen porösen Teilchens, gekennzeichnet durch Bindung eines Polyamins mit einem Zahlenmittel des Molekulargewichts von mindestens 50000 an zumindest eine von einer Epoxygruppe, einer halogenierten Alkylgruppe und einer Aldehydgruppe ausgewählte Gruppe, die auf der Oberfläche eines feinen porösen Teilchens vorhanden ist, das einen Teilchendurchmesser von 1 bis 100 μm und Poren mit einem durchschnittlichen Durchmesser von mindestens 150 Å besitzt.
Verfahren zur Herstellung eines Anionenaustauschers nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindung des Polyamins an das feine poröse Teilchen ausgeführt wird, indem das Polyamin in Gegenwart einer Base mit dem feinen porösen Teilchen in Berührung gebracht wird, das in einem wässrigen flüssigen Medium dispergiert ist.
Füllung für Chromatographie, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus dem feinen porösen Teilchen mit gebundenem Polyamin besteht, wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht.
Säule für Chromatographie, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit der Füllung gefüllt ist, wie in Anspruch 6 beansprucht.