DE60131522T2

DE60131522T2 - Gele aus hyaluronsäure, vernetzt mit bifunktionellen l-aminosäuren, l-aminosäureestern oder deren mischungen

Info

Publication number: DE60131522T2
Application number: DE60131522T
Authority: DE
Inventors: Luigi Fratini; Maurizio Meldoli
Original assignee: BIOSPHERE SpA; BIOSPHERE SpA CESENA
Current assignee: BIOSPHERE SpA; BIOSPHERE SpA CESENA
Priority date: 2000-02-08
Filing date: 2001-02-06
Publication date: 2008-10-23
Anticipated expiration: 2021-02-07
Also published as: ES2296740T3; DE60131522D1; CA2399450A1; US20030096879A1; ITFI20000020A1; JP2003522255A; EP1261646B1; IL151110A0; WO2001058961A1; ITFI20000020A0; IT1317091B1; AU4641801A; AU2001246418B2; EP1261646A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft in Wasser unlösliche Gele, bestehend aus Hyaluronsäure, die vernetzt ist mit bifunktionellen L-Aminosäuren, L-Aminoestern oder deren Mischungen, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung in pharmazeutischen, kosmetischen und medizinischen Gebieten.
Stand der Technik
Hyaluronsäure ist ein Mucopolysaccharid, bestehend aus alternierenden Einheiten von D-Glucuronsäure und N-Acetylglucosamin, aneinander gebunden durch β1-3- und β1-4-Bindungen (1).
Hyaluronsäure wird in der Natur in der Gelenkflüssigkeit von Gelenken, im Glaskörper von Augen, in der Nabelschnur und im Bindegewebe gefunden; es kann erhalten werden durch Extraktion aus tierischen Geweben wie Hahnenkämmen oder Nabelschnüren, oder kann aus der Fermentierbrühe spezifischer Streptococcen zurückgewonnen werden.
Die Entwicklung der Biotechnologie erlaubt die Optimierung und Verbesserung des letzten beschriebenen Herstellungsverfahrens von Hyaluronsäure (Zurückgewinnung aus Fermentationsbrühen) und wird heutzutage als einfachste und lohnendste angesehen.
Die wesentliche Rolle, die Hyaluronsäure im menschlichen Körper spielt, beruht auf den besonderen viskoelastischen, Schmier- und hydrophilen Eigenschaften ihrer wässrigen Lösungen.
Die Anwendungen von Hyaluronsäure in verschiedenen Gebieten, den chirurgischen, pharmakologischen oder allgemeinen biologischen, sind in der Literatur ausführlich beschrieben, siehe z. B. Balazs et al. "Hyaluronan Biomaterials: Medical Applications", Handbook of Biomaterials and Applications, Hrsg., DL Wise et al., 1995, 2719–2741; US 5,559,104 , 1996; Pape, Balazs, Ophthalmology, 87, Nr. 7, 1980; Iwata, Clin. Orthop., 289, 285–291; 1993; US 5,128,326 ; US 4,500,676 ; US 5,840,046 ; US 5,795,584 ; US 6,010,692 ; US 5,658,331 .
Außerdem beschreibt eine umfangreiche Literatur verschiedene Verbindungen, erhalten durch Vernetzen von Hyaluronsäure mit z. B. Formaldehyd (Balazs, US 4,713,448 , 1987), Divinylsulfon (Balazs, US 4,582,865 , 1986), Aziridin, Alkoholen (Della Valle, US 4,851,521 , 1989) und monofunktionellen Aminosäuren (Hamilton, US 4,937,270 , 1990).
Wie aus Obigem ersichtlich, kann Hyaluronsäure chemisch modifiziert werden, um ihre Eigenschaften zu verändern und Produkte zu erhalten, die für verschiedene Anwendungen geeignet sind.
Die Wichtigkeit zur Bereitstellung neuer Verbindungen, die die Verwendung von Hyaluronsäure in bekannten oder neuen Gebieten erweitern oder verbessern können, ist deshalb offensichtlich.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft in Wasser unlösliche Gele, hergestellt durch Vernetzen von Hyaluronsäure mit bifunktionellen Aminosäuren oder L-Aminoestern oder ihren Mischungen.
Die Einführung von kleinen biokompatiblen Molekülen wie den α-L-Aminosäuren in die Hyaluronsäureketten, unter besonderen Reaktionsbedingungen, erlaubte die Herstellung von Gelen mit einem charakteristischen farblosen und transparenten Erscheinungsbild und hochbiokompatiblen und viskoelastischen Eigenschaften.
Die Produkte gemäß der vorliegenden Erfindung können in einem organischen Lösungsmittel hergestellt werden, wie Dimethylformamid (DMF) und Dimethylsulfoxid (DMSO) oder in Wasser in der Gegenwart von Carbodiimid gemäß einem bekannten Verfahren (siehe z. B. Tomihata, J. Biomed. Mater. Res., 1997, 37 (2), 243–251; Danishefsky, Carbohydrate Res., 1971, 16, 199–205).
Diese Reaktion wird in zwei aufeinander folgenden Schritten durchgeführt: Der erste Schritt betrifft die Aktivierung von Hyaluronsäure und der zweite die Bildung von Bindungen zwischen Hyaluronsäure und dem Vernetzungsmittel.
Während dem Aktivierungsschritt reagieren die Carbonsäuren von Hyaluronsäurenatriumsalz mit der Aktivierungsverbindung, wodurch ein neues chemisches Produkt gebildet wird mit einem erhöhten elektrophilen Charakter der Carbonsäuregruppen.
Im folgenden Schritt wird ein Vernetzungsmittel zugegeben, wobei dieses Mittel zwei nukleophile Funktionen umfasst, die die aktivierten Carbonsäuregruppen binden können, wodurch Vernetzungen, d. h. Brückenbindungen zwischen den Hyaluronsäuremolekülen, erzeugt werden. Außerdem begünstigen die guten anregenden Eigenschaften des Aktivierungsmittels die Reaktion.
Die Aktivierungsmittel sind die in der Literatur für diesen Zweck üblicherweise verwendeten, und insbesondere die wasserlöslichen Carbodiimide; gemäß der vorliegenden Erfindung ist N-3-Dimethylaminopropylethylcarbodiimidhydrochlorid besonders bevorzugt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung sind die Vernetzungsmittel bifunktionelle α-L-Aminosäuren, d. h. sie weisen eine zweite funktionelle Gruppe neben der Aminosäuregruppe auf, oder L-Aminoester oder Mischungen davon. Besonders bevorzugt sind L-Lysin, L-Serin, L-Lysinethylesterdihydrochlorid und L-Serinmethylesterhydrochlorid oder Mischungen davon.
Die Verwendung von Aminoestern anstelle von Aminosäuren erlaubt das Schützen der Carbonsäurefunktionen von Aminosäuren, bezogen auf eine mögliche Aktivierung und Beteiligung in sekundären Reaktionen.
Das gesamte Herstellungsverfahren wird wie nachstehend beschrieben ausgeführt.
Die Reaktion wird durch Verwenden eines Glasreaktors, versehen mit einem Rührsystem und einem Temperaturregler, durchgeführt. Das kommerziell erhältliche Hyaluronsäurenatriumsalz wird gemäß den Eigenschaften des Endprodukts in Wasser in einer Konzentration zwischen 0,5 und 2,5% (G/G) gelöst. Zum Beispiel werden, um kompakte und dicke Gele zu erhalten, hohe Konzentrationen benötigt, z. B. Konzentrationen von 2 bis 2,5%; wohingegen bei Konzentrationen zwischen 0,5 und 1% fluide Gele erhältlich sind.
Die Temperatur ist eine wesentliche Bedingung zum Erhalt der erfindungsgemäßen Produkte, und sie muss sich zwischen 0°C und 25°C und vorzugsweise zwischen 0°C und 10°C befinden.
Die Reaktionsmischung wird dann angesäuert durch Zugabe einer verdünnten Säure, wie Salzsäure 0,5–1 M, bis ein pH-Wert zwischen 3 und 6, vorzugsweise 5, erreicht wird. Ein Aktivierungsmittel, das die Carbonsäuregruppen von Hyaluronsäure für das Vernetzen aktivieren kann, wird dann zugegeben. Das Aktivierungsmittel wird vorzugsweise in einer Menge zwischen 0,2 und 2 Äquivalenten pro Äquivalent Monomereinheit der Ausgangs-Hyaluronsäure zugegeben.
Anschließend wird das Vernetzungsmittel in einer Menge vorzugsweise zwischen 0,1 und 2 Äquivalenten pro Äquivalent Monomereinheit der Ausgangs-Hyaluronsäure zugegeben.
Nach obigen Zugaben wird die Reaktionsmischung für eine Zeit zwischen 5 Minuten und 48 Stunden und vorzugsweise zwischen 15 Minuten und 5 Stunden gerührt.
Nach Vervollständigung der Reaktion wird ein Volumen einer 1 M NaCl-Lösung zugegeben, die Mischung einige Minuten gerührt, dann wird eine Reinigung gemäß bekannten Verfahren durchgeführt, wie Dialyse und/oder Ausfällen mit organischem Lösungsmittel und/oder unter Vakuumverdampfen und/oder Gefriertrocknen.
Die Reaktion kann in einem organischen Lösungsmittel, wie DMSO oder DMF, oder einer Mischung von Wasser/organischem Lösungsmittel in verschiedenen Verhältnissen durchgeführt werden; die Verwendung von Wasser als Reaktionsmittel ist zweifellos bevorzugt, aber manchmal ist es notwendig, organische Lösungsmittel für spezifische Anwendungen der vorliegenden Produkte zu verwenden.
Somit wird die Reaktion durch anschließende Zugabe einer Lösung des Aktivierungsmittels in einem organischen Lösungsmittel durchgeführt, vorzugsweise 2-Chlor-1-methylpyridiniodid, und eine Suspension der Vernetzungsaminosäure, zu einer Lösung des Hyaluronsäuresalzes von Tetrabutylammonium im organischen Lösungsmittel oder in einer Mischung des organischen Lösungsmittels und Wassers, in der Gegenwart von Triethylamin und unter Rühren, wobei die Temperatur auf unter 5°C gehalten wird.
Die so erhaltene Mischung wird zwischen 5 Minuten und 48 Stunden, und vorzugsweise zwischen 15 Minuten und 5 Stunden gerührt. Das Produkt wird dann zurückgewonnen und gereinigt gemäß oben genannten Verfahren. Das feste Produkt kann wieder in Wasser oder in einer physiologischen Lösung, in unterschiedlichen Konzentrationen zum Erhalt von viskosen Lösungen, Gelen, dünnen Filmen usw., gelöst werden.
In den folgenden Beispielen werden beide Herstellungsverfahren veranschaulicht.
Die Verhältnisse von Hyaluronsäure-/Aktivierungsmittel/Vernetzungsmittel, ausgewählt für die Synthese, hängen von dem gewünschten Vernetzungsgrad und den viskoelastischen Eigenschaften ab.
Die Eigenschaften des Endprodukts werden durch die Art der Ausgangs-Hyaluronsäure beeinflusst. Als eine Tatsache ist es offensichtlich, dass unter den gleichen Bedingungen eine Hyaluronsäure mit höherem Molekulargewicht ein viskoseres und kompakteres Gel erzeugt, bezogen auf das Gel, erhältlich ausgehend von Hyaluronsäure mit einem niedrigeren Molekulargewicht.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht zwischen 100.000 und 2.000.000 verwendet, und die erhaltenen Endprodukte weisen ein Molekulargewicht zwischen 200.000 und 2.500.000 auf.
Die Endprodukte zeigen einen Vernetzungsgrad zwischen 10 und 40% und eine intrinsische Viskosität zwischen 300 und 1.500 mg/l.
Das Aktivierungsmittel ist vorzugsweise ein in Wasser lösliches Carbodiimid, insbesondere N-3-Dimethylaminopropylethylcarbodiimidhydrochlorid.
Das Vernetzungsmittel ist vorzugsweise L-Lysin oder L-Serin oder Ester davon, vorzugsweise Ethyl- oder Methylester.
Die Erfindung wird angesichts folgender Beispiele besser verstanden werden.
Beispiel 1
1 g Hyaluronsäurenatriumsalz (2,5 mmol) werden in 80 ml vollentsalztem Wasser gelöst. Die Temperatur wird durch ein thermostatisches Bad auf 20°C gehalten, und der pH-Wert wird durch Zugabe von HCl 0,75 M auf 5 gebracht.
0,58 g (1,2 Äq) N-3-Dimethylaminopropylethylcarbodiimidhydrochlorid und 0,44 g (1,2 Äq) L-Lysin werden zugegeben.
Nach 2 Stunden werden 80 ml NaCl-Lösung 1 M zugegeben, und die Lösung mit destilliertem Wasser dialysiert; das Produkt wird mit Aceton ausgefällt, wieder in Wasser gelöst und schließlich gefriergetrocknet.
Beispiel 2
1 g Hyaluronsäurenatriumsalz (2,5 mmol) werden in 80 ml vollentsalztem Wasser gelöst. Die Temperatur wird durch ein thermostatisches Bad auf 20°C gehalten, und der pH-Wert wird durch Zugabe von HCl 0,75 M auf 5 gebracht.
0,58 g (1,2 Äq) N-3-Dimethylaminopropylethylcarbodiimidhydrochlorid und 0,74 g (1,2 Äq) L-Lysinethylesterdihydrochlorid werden zugegeben.
Nach 1 Stunde werden 80 ml NaCl-Lösung 1 M zugegeben und die Lösung 3 Mal dialysiert und schließlich gefriergetrocknet.
Beispiel 3
1 g Hyaluronsäurenatriumsalz (2,5 mmol) werden in 80 ml vollentsalztem Wasser gelöst. Die Temperatur wird durch ein thermostatisches Bad auf 4°C gehalten, und der pH-Wert wird durch Zugabe von HCl 0,75 M auf 5 gebracht.
0,48 g (1,0 Äq) N-3-Dimethylaminopropylethylcarbodiimidhydrochlorid und 0,62 g (1,2 Äq) L-Lysinethylesterdihydrochlorid werden zugegeben.
Nach 3 Stunden werden 80 ml NaCl-Lösung 1 M zugegeben und die Lösung 3 Mal dialysiert und schließlich gefriergetrocknet.
Die ¹H-NMR-Analyse des so erhaltenen Produkts zeigte die folgenden charakteristischen Signale (Lösungsmittel D₂O):
1,2 ppm (t, 3H, J = 10,6 Hz, CH₃-CH₂CH₂O-Lys)
1,4 ppm (m, 2H, CH₂ δ Lys)
1,6 ppm (m, 2H, CH ₂ γ Lys)
1,7–1,9 ppm (m, 2H, CH ₂ β Lys)
1,9–2,0 ppm (m, 3H, CH ₃-CONH Hyaluronsäure)
2,9 ppm (t, 2H, J = 11,2 Hz, CH ₂ ε Lys)
3,0–3,9 ppm (m, CHOH Hyaluronsäure)
4,0 ppm (t, 1H, J = 9,6 Hz, CH α Lys)
4,2 ppm (q, 2H, J = 10,6 Hz, CH₃-CH₂O-Lys)
Beispiel 4
1,0 g Hyaluronsäurenatriumsalz (2,5 mmol) werden in 80 ml vollentsalztem Wasser gelöst. Die Temperatur wird durch ein thermostatisches Bad auf 4°C gehalten, und der pH-Wert wird durch Zugabe von HCl 0,75 M auf 5 gebracht.
0,24 g (0,5 Äq) N-3-Dimethylaminopropylethylcarbodiimidhydrochlorid und 0,62 g (1,0 Äq) L-Lysinethylesterdihydrochlorid werden zugegeben.
Nach 3 Stunden werden 80 ml NaCl-Lösung 1 M zugegeben und die Lösung 3 Mal dialysiert und schließlich gefriergetrocknet.
Beispiel 5
1,0 g Hyaluronsäurenatriumsalz (2,5 mmol) werden in 80 ml vollentsalztem Wasser gelöst. Die Temperatur wird durch ein thermostatisches Bad auf 4°C gehalten, und der pH-Wert wird durch Zugabe von HCl 0,75 M auf 5 gebracht.
0,24 g (0,5 Äq) N-3-Dimethylaminopropylethylcarbodiimidhydrochlorid und 0,62 g (1,0 Äq) L-Lysinethylesterdihydrochlorid werden zugegeben.
Nach 20 Minuten werden 80 ml NaCl-Lösung 1 M zugegeben und die Lösung 3 Mal dialysiert und schließlich gefriergetrocknet.
Beispiel 6
1,0 g Hyaluronsäurenatriumsalz (2,5 mmol) werden in 80 ml vollentsalztem Wasser gelöst. Die Temperatur wird durch ein thermostatisches Bad auf 20°C gehalten, und der pH-Wert wird durch Zugabe von HCl 0,75 M auf 5 gebracht.
0,58 g (1,2 Äq) N-3-Dimethylaminopropylethylcarbodiimidhydrochlorid und 0,47 g (1,2 Äq) L-Serinmethylesterhydrochlorid werden zugegeben.
Nach 3 Stunden werden 80 ml NaCl-Lösung 1 M zugegeben, und die Lösung mit destilliertem Wasser dialysiert; das Produkt wird mit Aceton ausgefällt, wieder in Wasser gelöst und schließlich gefriergetrocknet.
Beispiel 7
1,0 g Hyaluronsäurenatriumsalz (2,5 mmol) werden in 80 ml vollentsalztem Wasser gelöst. Die Temperatur wird durch ein thermostatisches Bad auf 5°C gehalten, und der pH-Wert wird durch Zugabe von HCl 0,75 M auf 5 gebracht.
0,47 g (1,0 Äq) N-3-Dimethylaminopropylethylcarbodiimidhydrochlorid und 0,19 g (0,5 Äq) L-Serinmethylesterhydrochlorid werden zugegeben.
Nach 3 Stunden werden 80 ml NaCl-Lösung 1 M zugegeben und die Lösung 3 Mal dialysiert und schließlich gefriergetrocknet.
Beispiel 8
1,0 g Hyaluronsäurenatriumsalz (2,5 mmol) werden in 80 ml vollentsalztem Wasser gelöst. Die Temperatur wird durch ein thermostatisches Bad auf 0°C gehalten, und der pH-Wert wird durch Zugabe von HCl 0,75 M auf 5 gebracht.
0,24 g (0,5 Äq) N-3-Dimethylaminopropylethylcarbodiimidhydrochlorid und 0,19 g (0,5 Äq) L-Serinmethylesterdihydrochlorid werden zugegeben.
Nach 15 Minuten werden 80 ml NaCl-Lösung 1 M zugegeben und die Lösung 3 Mal dialysiert und schließlich gefriergetrocknet.
Beispiel 9
0,5 g Hyaluronsäuretetrabutylammoniumsalz werden in 45 ml DMF unter Rühren und bei einer Temperatur von 5°C gelöst.
Sobald das Salz sich vollständig gelöst hat, werden 200 μl Triethylamin, 0,20 g 2-Chlor-1-methylpyridiniodid und 0,5 g L-Lysin zugegeben.
Das resultierende Gel wird filtriert, mit Wasser gewaschen und gefriergetrocknet.
Beispiel 10
0,3 g Hyaluronsäuretetrabutylammoniumsalz werden in 30 ml DMF unter Rühren und bei einer Temperatur von 5°C gelöst.
Sobald das Salz sich vollständig gelöst hat, werden 120 ml Triethylamin, 0,12 g 2-Chlor-1-methylpyridiniodid und 0,21 g L-Serin zugegeben.
Das resultierende Gel wird filtriert, mit Wasser gewaschen und gefriergetrocknet.
Analog werden Gele von Hyaluronsäure hergestellt unter Verwendung der Vernetzungsmittelmischungen von L-Lysin und L-Serin, L-Lysinethylesterdihydrochlorid und L-Serinmethylesterhydrochlorid oder Mischungen von Aminosäure/veresterte Aminosäure, wodurch dann Produkte mit Eigenschaften, die zu den oben beschriebenen Produkten analog sind, erhalten werden.

Claims

Wasserlösliches Gel bestehend aus Hyaluronsäure, die vernetzt ist mit bifunktionellen Vernetzungsmitteln, worin die bifunktionellen Vernetzungsmittel L-Aminosäuren, L-Aminoester oder Mischungen davon sind.
Gel gemäß Anspruch 1, worin die bifunkionellen Vernetzungsmittel L-Lysin, L-Serin, L-Lysinethylesterdihydrochlorid, L-Serinmethylester-hydrochlorid oder Mischungen davon sind.
Gel gemäß Ansprüchen 1 bis 2, worin die Hyaluronsäure ein Molekulargewicht zwischen 100.000 und 2.500.000 und eine intrinsische Viskosität zwischen 300 und 1.500 ml/g aufweist.
Verfahren zur Herstellung des Gels wie beschrieben in Anspruch 1, worin: a) das Hyaluronsäurenatriumsalz in Wasser unter Rühren gelöst wird und die Reaktionsmischung dann durch Zugabe einer verdünnten Säure angesäuert wird, bis ein pH-Wert zwischen 3 und 6 erreicht wird; b) ein Aktivierungsmittel und dann ein Vernetzungsmittel zur Lösung unter Rühren gegeben werden; c) sobald die Reaktion beendet ist, zur resultierenden Mischung eine Lösung von NaCl 1 M unter Rühren gegeben wird, dann das Trennungs- und Reinigungsverfahren des so erhaltenen Produkts durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 4, worin die Temperatur zwischen 0 und 25°C ist.
Verfahren gemäß Anspruch 5, worin die Temperatur zwischen 0 und 10°C ist.
Verfahren gemäß Ansprüchen 4 bis 6, worin das Aktivierungsmittel ein in Wasser lösliches Carbodiimid ist.
Verfahren gemäß Anspruch 7, worin das Aktivierungsmittel N-3-Dimethylamino-propylethylcarbodiimid-hydrochlorid ist.
Verfahren gemäß Ansprüchen 4 bis 8, worin das Vernetzungsmittel eine Aminosäure gemäß Ansprüchen 1 und 2 ist.
Verfahren gemäß Ansprüchen 4 bis 9, worin die Hyaluronsäurelösung in Wasser eine Konzentration zwischen 0,5 und 2,5% (G/G) aufweist, das Aktivierungsmittel in einer Menge zwischen 0,2 und 2 Äquivalenten pro Äquivalent monomerer Einheit von Hyaluronsäure zugegeben wird und das Vernetzungsmittel in einer Menge zwischen 0,1 und 2 Äquivalenten pro Äquivalent monomerer Einheit von Hyaluronsäure zugegeben wird.
Verfahren gemäß Anspruch 10, worin die Reaktionszeit zwischen 5 Minuten und 48 Stunden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 11, worin die Reaktionszeit zwischen 15 Minuten und 5 Stunden ist.
Verwendung des Gels wie in Ansprüchen 1 bis 3 beschrieben in der Chirurgie, im pharmakologischen Gebiet oder allgemein im biomedizinischen Gebiet.