DE2833902A1

DE2833902A1 - Isocyanoderivate von polymeren und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE2833902A1
Application number: DE19782833902
Authority: DE
Inventors: Amihay Freeman; Leon Goldstein; Mordechai Sokolovsky
Original assignee: Ramot at Tel Aviv University Ltd
Current assignee: Ramot at Tel Aviv University Ltd
Priority date: 1977-08-04
Filing date: 1978-08-02
Publication date: 1979-02-15
Also published as: FR2399442A1; FR2399442B3; IL52652A0; US4303786A

Description

KRAUS & WEfSERT

PATENTANWÄLTE 4 ö J 3 9 Q £,

DR. WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER · DR.-ING. ANNEKÄTE WEISERT DIPL.-ING. FACHRICHTUNG CHEMIE IRMGARDSTRASSE 15 · D-8OOO MÜNCHEN 71 · TELEFON 089/797077-797078 ■ TELEX O5-212156 kpatd

TELEGRAMM KRAUSPATENT

Mr

1953 Wt/wa

RAMOT UNIVERSITY AUTHORITY FOR APPLIED RESEARCH AND INDUSTRIAL DEVELOPMENT LTD., TEL-AVIV/ISRAEL

Isocyanoderivate von Polymeren und Verfahren zu ihrer Herstellung

909807/0960

Beschreibung

Die Erfindung betrifft neue Isocyanidderjyate _Von Polysacchariden und von verschiedenen Polymeren, die Hydroxylgruppen enthalten, wie Polyvinylalkohol oder ähnlichen Verbindungen, wobei die Isocyanidmolekülteile an das Polymere oder das Polysaccharid über stabile Ätherbindungen gebunden sind,und sie betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen. Die so hergestellten Isocyanide sind dazu geeignet, solche Polysaccharide oder andere Polymere mit Hydroxylgruppen, mit Proteinen und anderen biologisch aktiven Molekülen zu verbinden. Geeignete Ausgangsmaterialien sind die verschiedenen Polysaccharide und verschiedene natürliche und synthetische oder modifizierte Hydroxylgruppen enthaltende Polymeren, wie Zellulose, Stärke, lineares und vernetztes Dextran, lineare und vernetzte Agarose, verschiedene andere Polysaccharide, N-2-Hydroxyäthylderivate eines Polyacyl-Polymeren, Polyvinylalkohol und andere geeignete Makromoleküle, die mit einer Vielzahl von Hydroxylgruppen substituiert sind. Das erfindungsgemässe Verfahren kann mit festen und flüssigen Makromolekülen durchgeführt werden und die Erfindung betrifft auch alle neuen Isocyanoderivate solcher Makromoleküle.

Chemisch gebundene, biologisch aktive Proteine, wie Enzyme oder ähnliche, die an geeignete polymere Grundgerüste kovalent gebunden sind, wurden in der Literatur beschrieben. Die kovalente Bindung verschiedener reaktiver Gruppen an Polymere, wie Zellulose oder modifizierte Zellulose, und die weitere Bindung der biologisch aktiven Proteine an solche modifizierten Produkte ist ebenfalls bekannt. Die Bindung erfolgt über verschiedene

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ORIGINAL INSPECTED

reaktive Gruppen, wie Gruppen, die an das polymere Grundgerüst gebunden sind, durch Umsetzung mit Bromcyan, mit Bromacetylbromid usw.

Die funktioneilen Molekülteile, die erfindungsgemäss verwendet werden, sind sehr vielseitig und es ist leicht, verschiedene gewünschte Produkte herzustellen, indem man bestimmte kontrollierte Reaktionsbedingungen einhält.

Die Erfindung betrifft neue Derivate von Polysacchariden, modifizierten Polysacchariden und anderen Polymeren, die Hydroxylgruppen enthalten und die für die kovalente Bindung biologisch aktiver Proteine, wie Enzyme, Antikörper, Antigene und ähnliche Materialien, verwendet werden können. Die neuen polymeren Substanzen enthalten Isocyanidgruppen, gebunden an ein polymeres Grundgerüst über ein Molekülteil passender Grosse und Länge, so dass cyclisierungen verhindert werden. Die neuen isocyanosubstituierten Polymere können schematisch als P-O-Q-NC-Verbindungen dargestellt werden, worin P das polymere Grundgerüst, Q die Gruppe (CEj) ~, worin η für eine ganze Zahl von 3 oder mehr steht, oder Q eine Aralkylgruppe bedeuten. Der funktioneile Molekülteil ist an das polymere Grundgerüst über eine chemisch stabile Ätherbindung gebunden. Die Isocyanidgruppe ist als sehr vielseitige Gruppe für die kovalente Bindung verschiedener Substanzen, wie Proteine und insbesondere biologisch aktiver Proteine, bei denen ein grosser Prozentgehalt ihrer Anfangsaktivität erhalten bleibt. Die Erfindung betrifft weiterhin ein neues Verfahren für die Herstellung von Isocyanidderivaten von Polysacchariden und anderen Hydroxylgruppen enthaltenden Polymeren, gemäss den die Hydroxylgruppen des Polymeren mit einer starken Base in einem nichtwässrigen polaren aprotischen Lösungsmittel ionisiert werden, das ionisierte Polysaccharid

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ORIGINAL INSPECTED

oder Polymer mit einer Verbindung der allgemeinen Formel X-Q-NC, worin X eine gute austretende Gruppe bedeutet und Q die zuvor angegebene Bedeutung besitzt, umgesetzt wird. Eine Verbindung der Wahl ist 3-Tosyl-1-isocyanopropan, eine neue Verbindung, die auch Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist. Das Lösungsmittel dabei ist Dimethylsulfoxid. Die Reaktion kann ebenfalls in Dimethylformamid und in anderen ähnlichen Lösungsmitteln durchgeführt werden. Die Hydroxylgruppe wird bevorzugt mit einer starken Base, wie Natrium-t-butoxid, ionisiert. Andere geeignete starke Basen, wie Isopropoxid, Methylsulfinylcarbanion (DMSO ; DMSNa) usw., können ebenfalls verwendet werden. Bevorzugt wird das Isocyanid zuerst mit einem festen Alkalimetallhydroxid, wie Natrium- oder Kaliumhydroxid, behandelt und das Isocyanid wird danach mit dem ionisierten Polymeren umgesetzt. Unter den Isocyaniden, die besonders geeignet sind, kann 3-Tosyl-isocyanopropan erwähnt werden. Verschiedene andere aliphatische oder araliphatische Isocyanide können genauso gut verwendet werden.

Das Reaktionsschema, das anhand der Verwendung von t-Butoxid als Base und 3-Tosyl-i-isocyanopropan erläutert wird, wird in der folgenden Gleichung dargestellt

Tos-(CH₂) 3-NC

DMSO; 30O > \^Γ^υ DMSO; 30°

II III

worin ΓPJ schematisch das Polymer bedeutet, das eine Vielzahl von Hydroxylgruppen enthält, wovon eine dargestellt wird.

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8339Q2

Das obige Reaktionsschema wird durch die Tatsache gestützt, dass ein Analoges von Ills CH-O-CH₂-CH₂-CH₂-NC synthetisiert und isoliert wurde und in NMR in deuterisiertem Dimethylsulfoxid wie folgt charakterisisert wurde: V = 6,75 (3H, CH..-O-) ; T=6,43 tt; J_H__H=6,2Hz, J_N__R=2,1 Hz (2H, CH_2dL/) ; V = 8,15 m.s.p. (2H CH_2ß)11 V = 6,57 t J_H__H=6,0 Hz (2H, CH₂^).

Nach diesem Verfahren können Derivate der Zellulose von vernetztem Dextran (Sephadex), vernetzter Agarose (CL-Sepharose), wie auch verschiedene lineare polyhydroxylische Materialien, die funktioneile Isocyanidgruppen enthalten, hergestellt werden und für die kovalente Bindung von Proteinen und Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht verwendet werden.

Wie oben erwähnt, besitzen die neuen erfindungsgemassen Verbindungen die allgemeine Formel P-O-Q-NC, worin Q eine -(CH₂) Gruppe, worin η für eine ganze Zahl von 3 oder mehr steht, oder eine Aralkylgruppe bedeutet. Die ganze Zahl sollte mindestens 3 betragen, da sonst unerwünschte Nebenreaktionen stattfinden. Die obere Grenze von η ist eine Frage der Zweckdienlichkeit und man kann leicht Verbindungen herstellen, worin η eine ganze Zahl zwischen 3 und 20 bedeutet. Ein bevorzugter Bereich beträgt 3 bis etwa 12. Als Grundgerüst P kann man irgendwelche Polymeren oder Makromoleküle mit einer Vielzahl von Hydroxylgruppen verwenden, wobei diese natürliche oder synthetische Makromoleküle sein können. Ein Beispiel für ein synthetisches Makromolekül ist ein 2-Hydroxyäthyl-substituiertes Polyacrylamid. Andere synthetische Polymere ähnlicher Struktur können als polymerer Träger verwendet werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

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Materialien und Verfahren

Natrium-t-butoxid wird auf frisch geschnittenem Natriummetall und redestilliertem t-Butanol und verdünnt mit Dimethylsulfoxid (1:10) bis zu einer Endkonzentration von 0,05 M hergestellt.

Die Isocyanidgruppen werden titrimetrisch bestimmt, wie es von Freeman et al (J.Solid Phase Biochem. J_ 261, 1977) beschrieben wird.

Das gebundene Protein wird durch die Gesamtaminosäureanalyse der Säurehydrolysate als geeignetem Enzym-Polymerkonjugat bestimmt. Die Enzymaktivität von Trypsin und seinen unlöslichen Konjugaten wird bei 25° mit dem pH-stat-Verfahren (Golstein - Meth. Enzyol. 1_9 935, 1970) gemessen.

Beispiel 1

3-Tosyl-i-isocyanopropan wird aus 3-Aminopropanol-1 über das N-Formylaminopropanolderivat hergestellt, indem man das Verfahren, das von Matteson and Baily XJ. Am. Chem. Soc. (1968) 90. 3761) beschrieben wird, modifiziert. .

(a) 1ST-Formy 1 aminopr opanol: Eine äquimolare Menge von Äthylformiat (264 ml, 0,33 mol) wird tropfenweise zu stark gerührtem 3-Aminopropan-1-ol (25 ml, 0,33 mol) gegeben. Man rührt während 1 Stunde bei Zimmertemperatur. Das sich bei der Umsetzung bildende Äthanol wird durch Verdampfen bei 60 unter verringertem

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-Jr-/tO

Druck entfernt. Der Rückstand wird im Vakkum destilliert und

-2 man erhält 26,2 g (77 %) N-Formylaminopropanol (bp 115-118/ 10

iranHg) .

(b) 3-Tosyl-1-isocyanopropan: Eine Pyridinlösung (50 ml) von p-Toluolsulfonylchlorid (38,2 g, 0,2 mol) wird tropfenweise im Verlauf von 30 Minuten zu einer stark gerührten, eisgekühlten Lösung aus N-Formylaminopropanol (10,3 g, 0,1 mol) in 50 ml Pyridin gegeben. Das Reaktionsgemisch wird über Eis während 1 Stunde gerührt. 100 ml kaltes Wasser werden dazu gegeben und das Gemisch wird mit drei 50 ml-Teilen Äther-Hexan 5:1 (Vol/Vol) extrahiert. Der vereinigte Extrakt wird mit kaltem Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird durch Verdampfen bei verringertem Druck entfernt und der Rückstand in Äther-Hexan 3,5:1 (V/V) wieder gelöst. Die Lösung wird zur Induzierung der Kristallisation bei -18 stehen gelassen. Der weisse kristalline Niederschlag wird auf einem Filter abgetrennt und mit 10 ml eisgekühltem Hexan gewaschen und an der Luft getrocknet. Die Ausbeute beträgt 6 bis 7 g (25 %), Smpt. 37-38°. IR-Spektrum in CHCl : 2155 cm"¹ (-NC); 1600 cm"¹ (aromatischer Ring); 1312, 1125 cm"¹ (-S0₂~); 1455 cm"¹ (-CH₃); 2900 cm"¹ (-CH₂-).

NMR in deuteriertem Dimethylsulfoxid

T= 2,04, 2,20, 2,40, 2,55 (4H, Tos); 7,58 (3H, CH₃-ToS) 6,55 tt;

J „=6,0 Hz, J „=3,6 Hz (a-CH₉); 8,06 msp (B-CH₀); 5,8 t, J₁₁ =

n—rl W-H £. J. H—rl

6,0 HZ

Beispiel 2

- 7 909807/0960

11

Isocyanidderivate der Zellulose werden nach einem 3-stufigen Verfahren hergestellt:

(a) Vorquellen des Polymeren;

(b) Ionisierung der Polysaccharidhydroxylgruppen mit t-Butoxid; und

(c) Umsetzung mit 3-Tosyl-i-isocyanopropan.

Mikrokristallines Zellulosepulver wird unter Rühren in wasserfreiem Dimethylsulfoxid (15 ml) während 30 Minuten bei 30 suspendiert. Zu dem gequollenen Pulver wird tropfenweise unter Rühren eine 0,05 M Lösung von Natrium-t-butoxid in Dimethylsulfoxid (10 ml) zugegeben. Das Gemisch wird 15 Minuten gerührt, damit eine Gleichgewichtsionisierung der Polysaccharidhydroxylgruppen sichergestellt ist.

480 mg (2 mol) 3-Tosyl-i-isocyanopropan werden in 7 ml Dimethylsulfoxid gelöst. Die Lösung wird zu einer Suspension aus gepulvertem Kaiiumhydroxid in 5 ml des gleichen Lösungsmittels gegeben und das Gemisch wird heftig während 10 Minuten bei 30 (zur Entfernung von sauren Verunreinigungen) gerührt. Das Pulver wird abfiltriert (Glaswolle), das Filter wird mit 8 ml Dimethylsulfoxid gewaschen und das vereinigte Filtrat (insgesamt 20 ml Volumen) wird zu der ionisierten Zellulosepulversuspension gegeben.

Die Umsetzung kann unter Rühren währen 4 Stunden bei 30° ablaufen. Das Pulver wird durch Zentrifugieren abgetrennt, in Methanol erneut suspendiert und auf einem Filter mit je 200 ml Methanol, kaltem Wasser, Methanoläther gewaschen und an der Luft getrocknet. Das Isocyanidderivat von Zellulose (etwa 40

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- jr- ΛΧ

Äqu. χ 10 NC pro g, bestiniint titr!metrisch, vgl. Tabelle I) wird über Silikagel bei -5° gelagert.

Unter Verwendung unterschiedlicher Mengen an Natrium-t-butoxid und 3-Tosyl-1-isocyanopropan konnten Zellulosederivate mit unterschiedlichem Isocyanidgehalt hergestellt werden, wie es in Tabelle II zusammengefasst ist.

Beispiel 3

Herstellun2_von_IsocYanidderivaten_von_vernetzten_Dextranen

Isocyanidderivate von verschiedenen Arten von vernetztem Dextran (Sephadex) werden im wesentlichen wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt, gemäss einem Vorquellen des Polymeren in Dimethylsulfoxid und der Ionisierung der Polysaccharidhydroxylgruppen mit Natrium-t-butoxid, gefolgt von der Umsetzung mit 3-Tosyl-1-isocyanopropan. Da sich die verschiedenen Arten von Sephadex in ihren Quelleigenschaften unterscheiden, müssen unterschiedliche Volumen an Dimethylsulfoxid für die Vorquellstufe verwendet werden.

Die Mengen an Isocyanid müssen daher in jedem Fall so eingestellt werden, dass man die gewünschte Endkonzentration im Reaktionsgemisch erhält. Die Versuchseinzelheiten für die verschiedenen Arten von Sephadex sind in der Tabelle III zusammengefasst.

1 g trockene Sephadexperlen werden in Dimethylsulfoxid supsendiert und über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen (vgl.

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- XT-

Tabelle III). Die gequollenen Perlen werden durch Zugabe von 500 Äquivalenten 10 Natrium-t-butoxi«
Lösung in Dimethylsulfoxid) ionisiert.

500 Äquivalenten 10 Natrium-t-butoxid (10 ml einer 0,05 M

3-Tosyl-i-isocyanopropan wird in Dimethylsulfoxid gelöst,mit gepulvertem Kaliumhydroxid behandelt und zu der Suspension aus ionisierten Sephadexperlen, wie in Beispiel 2 beschrieben,
zugegeben (zu Versuchsexnzelheiten vgl. Tabelle III). Die Reaktion kann bei 30 während 6 Stunden unter langsamem magnetischen Rühren ablaufen.

Die modifizierten Sephadexperlen werden auf einem gesinterten Glasfilter abgetrennt und je mit 200 ml Methanol, Methanol-Wasser (1:1), Methanol und Äther gewaschen und an der Luft getrocknet. Die Isocyanidderivate von Sephadex werden über Silikagel bei -5 gelagert. Der Isocyanidgehalt der verschiedenen Zubereitungen (geschätzt aus dem Leucingehalt von Sephadex-Gly-Leu-NH^-Konjugaten) wird in den Tabellen I und III angegeben.

Beispiel 4

Isocyanidderivate von vernetzter Agarose werden hergestellt, wie für vernetztes Dextran beschrieben. Die Versuchseinzelheiten und die Isocyanidgehalte der verschiedenen Derivate sind in den Tabellen I und III angegeben.

Beispiel 5

- 10 909807/0960

1 g lineares Dextran mit einem Molekulargewicht von 250 000 wird in 10 ml Dimethylsulfoxid gelöst. Natrium-t-butoxid (10 ml einer 0,05 M Lösung in Dimethylsulfoxid; 500 Äqu. χ 10~ ) wird dann tropfenweise unter Rühren zugegeben und dann rührt man weitere 15 Minuten bei 30°. 0,54 g 3-Tosyl-1-isocyanopropan werden in 5 ml Dimethylsulfoxid gelöst und zu der stark gerührten Suspension aus gepulvertem Kaliumhydroxid in Dimethylsulfoxid gegeben (etwa 1 g KOH in 5 ml). Man rührt weitere 10 Minuten. Das Kaliumhydroxidpulver wird durch Filtration durch Glaswolle entfernt, das Filter wird mit Dimethylsulfoxid (5 ml) gewaschen. Das vereinigte FiItrat (15 ml) wird zu der gerührten Lösung von ionisiertem Dextran gegeben- Die Reaktion kann unter Rühren bei 30° während 1 Stunde ablaufen. Das modifizierte Polymere wird durch Zugabe von 15 ml Methanol ausgefällt und durch Zentrifugieren abgetrennt. Die Pellets werden erneut in Dimethylsulfoxid (40 ml) suspendiert, erneut mit Methanol (20 ml) ausgefällt und "abgesponnen" (spinned down) und in 60 ml Methanol erneut suspendiert. Der Niederschlag wird dann abfiltriert , mit Äthanol und Äther gewaschen und an der Luft getrocknet. Das wasserlösliche Isocyanidderivat eines linearen Dextrans (-NC-Gehalt 50-100 Äqu. χ 10~ /g, bestimmt titrimetrisch) wird über Silikagel bei -5° aufbewahrt.

Beispiel 6

Isocyanidderivate von linearer Agarose werden,wie für lineares Dextran beschrieben, hergestellt (-NC-Gehalt etwa 100 Äqu. χ 10" /g, bestimmt titrimetrisch)„

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Beispiel 7

Isocyanidderivate von linearem Polyvinylalkohol werden wie beschrieben aus linearem Dextran hergestellt (-NC-Gehalt etwa 50 Äqu. χ 10 /g, bestimmt titrimetrisch) -.

Beispiel 8

Ein lineares, in Wasser lösliches hochmolekulares (etwa 10 ) Isocyanoderivat von N-2-Hydroxyäthyl-substituiertem Polyacrylamid wird wie folgt hergestellt:

(a) Polymerisation von Methylacrylat unter Bildung eines Polymethylacrylats mit hohem Molekulargewicht,

(b) Umsetzung des Polymethylacrylats mit Aminoäthanol zur Umwandlung der Estergruppe in 2-Hydroxyäthylamidgruppen,

(c) Einführung von Isocyanidgruppen nach dem Verfahren, wie es in den Beispielen 5 bis 7 beschrieben wurde.

(a) Herstellung eines Polymethylacrylats mit hohem Molekulargewi cht

In einen 500 ml Rundkolben, der mit einem Kühler und einem magnetischen Rührer ausgerüstet ist, gibt man 160 ml Wasser, 1 g Natriumlaurylsulfat, 20 ml frisch destilliertes Methylacrylat,

- 12 -

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- writ

20 ml einer Vorratslösung aus Ν,Ν,Ν'-N'-Tetramethyläthylendiamin (TEMED, 0,46 ml/100 ml) und 280 mg Ammoniumpersulfat, gelöst in 4 ml Wasser. Das Gemisch wird magnetisch in einem Wasserbad bei 80° während 2 Stunden gerührt. Die Emulsion wird dann in eisgekühltes Wasser (400 ml) gegossen und kalte 2N HCl (400 ml) wird zugegeben. Der weisse flockenartige Niederschlag wird mit kaltem Wasser gewaschen, getrocknet und in Aceton (750 ml) wieder gelöst. Die viskose Lösung wird tropfenweise in Methan (4 1) gegeben, die Flüssigkeit wird verworfen und der Niederschlag wird erneut in Methanol (250 ml) suspendiert. Die Flüssigkeit wird abdekantiert und der Niederschlag erneut in Äther suspendiert, abgetrennt und an der Luft getrocknet. Ausbeute 18 g (94 %) · Das mittlere Molekulargewicht des Polymeren (bestimmt viskosimetrisch in Benzol) beträgt 1,0 χ 10⁶.

(b) Herstellung von Poly(N-2-hydroxyäthyl)acrylamid

4 g Polymethylacrylat werden in kleine Stücke geschnitten und zu 100 ml frisch destilliertem ß-Aminoäthanol gegeben. Das · Gemisch wird magnetisch bei 110⁰C während 24 Stunden gerührt. Die heisse viskose Lösung wird tropfenweise zu 750 ml Propan-2-ol gegeben. Der Niederschlag wird erneut in Propan-2-ol suspendiert. Die Flüssigkeit wird verworfen und das Polymer wird in kaltem 0,05 M Phosphatpuffer pH 6 (100 ml) gelöst. Der pH-Wert der Lösung wird mit konzentrierter HCl auf 7,0 eingestellt und die Lösung wird gegenüber Wasser bei 4 C dialysiert und gefriergetrocknet. Die Stickstoffanalyse gemäss dem Dumas-Verbrennungsverfahren (N/theoretisch/= 12,1 %, N/gefunden/= 11,1 %) zeigt an, dass der Umwandlungsgrad der Estergruppen 92 ξ beträgt.

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(c) Herstellung von dem Isocyanidderivat von Poly(N-2-hydroxyäthyl)acrylamid

1 g Poly(N-2-hydroxyäthyl)acrylamid wird in DMSO (90 ml) gelöst. Zu dieser Lösung gibt man 10 ml einer 0,05 Lösung von Natrium-t-butoxid in DMSO, gefolgt von 1,56 g 1-Tosyl-3-isocyanopropan in 30 ml DMSO, das mit gepulverter KOH (Endkonzentration von Tos (CH-)-.NC = 0,05 M) vorbehandelt worden war. Die Reaktion kann bei 30° während 1 Stunde ablaufen, Propan-2-ol (130 ml) wird dann tropfenweise unter Rühren zugegeben und anschliessend gibt man 250 ml Äther hinzu. Der feine gequollene Niederschlag wird auf einem gesinterten Glasfilter abfiltriert, erneut in DMSO (90 ml) gelöst und mit Propan-2-ol und Äther wieder ausgefällt. Das Polymer wird erneut mit Äther gewaschen, im Vakuum über P9O5 getrocknet und in einer geschlossenen Ampulle über Silikagel bei -15°C gelagert. Isocyanidgehalt: 61 iamol/g (bestimmt durch Bindung von Gly-Leu-NH-).

Beispiel 9

Ku2Eeln^eines_Enzy^s_an_Isoc^anidderivate_von_Zellulose

Ein Isocyanidderivat der Zellulose (50 mg Pulver) wird in 2 ml kalter Trypsinlösung (IO mg Protein) in 0,1 M Natriumphosphat, 0,5 M Natriumacetat pH 8, suspendiert. 0,1 ml kalter Acetaldehyd wird dann zugegeben und die Umsetzung kann über Nacht unter Rühren bei 4° ablaufen. Das unlösliche Enzymderivat wird abfiltriert, mit Wasser, 1 M KCl und erneut mit Wasser gewaschen, wieder in 4 ml Wasser suspendiert und bei 4 gerührt.

Der Proteingehalt des Zellulose-Trypsin-Konjugats beträgt 11,6 mg/g Träger (vgl. Tabelle I).

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Beispiel 10

Ein Isocyanidderivate der Zellulose (30 mg Pulver) wird in 2 ml einer0,1 M Lösung von Glycyl-leucinamid in 0,1 M Phosphat, 0,5 M Acetat, enthaltend 0,1 ml Acetaldehyd bei pH 8,0, suspendiert. Die Reaktion kann über Nacht unter Rühren bei 4° ablaufen.

Das unlösliche Zellulose-Gly-Leu-NH₂-Konjugat wird durch Filtration abgetrennt, mit 500 ml Wasser, Methanol und Äther gewaschen und an der Luft getrocknet. Die Menge an gebundenem Peptid (25 bis 30 mol χ 10 g) wird durch Aminosäureanalyse der Säurehydrolysate des Zellulosederivats bestimmt.

Beispiel 11

Getrocknete Perlen von Isocyanidderivat der gewünschten Art von Sephadex (70 mg) werden durch Suspendierung in einer geeigneten Menge an Dimethylsulfoxid (3 ml für G-75; 8 ml für G-150 und 10 ml für G-200) vorgequollen und 1 Stunde bei 30° gerührt. 30 ml eisgekühltes Wasser werden zu der gerührten Suspension zugegeben und dann rührt man weitere 5 Minuten (um ein gutes Mischen sicherzustellen). Das gequollene Polymere wird abzentrifugiert, erneut in kaltem Wasser (35 ml) suspendiert, 5 Minuten gerührt, abspinnen gelassen, wieder in kaltem 0,1 M Phosphat 0,5 M Acetat-Puffer pH 8,0 (35 ml) suspendiert und erneut abspinnen gelassen. Der gequollene Niederschlag wird in 0,1 M Phosphat 0,5 M Acetat pH 8 bis zu einem Gesamtvolumen von 4 ml

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für G-75 und 8 ml für G-150 und G-200 suspendiert. Eine abgewogene Menge an Trypsin (um die Endkonzentration auf 5 mg/ml einzustellen) wird zugegeben, anschliessend wird Acetaldehyd zugefügt (50 ml/ml). Die Reaktion kann über Nacht unter Rühren bei 4° ablaufen. Das Enzym-Sephadex-Konjugat wird auf einem gesinterten Glasfilter abgetrennt, in Wasser, 1 M KCl und erneut mit Wasser gewaschen und unter Wasser bei 4 gelagert. Die Eigenschaften der verschiedenen Sephadex-Trypsin-Konjugate sind in . Tabelle I zusammengefasst.

Beispiel 12

Das Kuppeln von GIy-LeU-NH₂ an Sephadex erfolgt im wesentlichen wie es für das Kuppeln des Proteins unter Verwendung einer 0,1 M Lösung des Peptids im Reaktionsgemisch beschrieben wird. Die
Mengen an gebundenem Peptid.sind in den Tabellen I und III zusam mengefasst.

Beispiel 13

Trypsin wird an die Isocyanidderivate von CL-Sepharose4B, wie
in Beispiel 11 für Sephadex G-75 beschrieben (vgl. Tabelle I)₇ gekuppelt.

- 16 -

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-WT-

2ο

Beispiel 14

Glycyl-leucinamid wird an die Isocyanidderivate von CL-Sepharose, wie in Beispiel 12 für Sephadex G-75 beschrieben, gekuppelt (vgl. Tabellen I und III).

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Tabelle I: CHARAKTERISIERUNG DER ISONITRILDERIVATE DER POLYSACCHARIDE

Polysaccharid	gebundenes Peptid ^e) (umol/g)	gebundenes Enzym	aktiv ^h) (mg/g Kon- jugat	% vom Gesamten
Zellulosepulver (230-270 mesh; 56-63 um Durch messer) .	31 ^b)	insges. ^ (g/mg Kon- jugat)	6,4	55
Vernetztes Dextran (Sephadex) G-75	19 b) 30 ^C)	11 ,6	8,8 10,5	100 70
G-150	12 ^b) 33 ^C)	8,8 15,1	8,8 11 ,0	70 66
G-200	12 ^b) 25 ^C)	12,7 16,5	12,3 11,6	78 75
Vernetzte Agarose ' (Sepharose-CL) 4B	68 ^b) 91 ^C)	15,7 15,4	24,3 28,5	40 30
Lineares Dextran ' (Molekulargew. 250 000)	88 ^b)	61 ,6 91,3	186	70
Polyacrylamid ^lj	61	264	172	86
200

a) Polysaccharid, ionisiert durch Zugabe von Natrium-t-butoxid (500 umol/g Polymer), gefolgt von einer 1-Tosyl-3-isocyanopropan-Lösung der angegebenen Konzentration (vgl. Fussnoten b) und c)).

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Fortsetzung Tabelle I

b) Ionisiertes Polysaccharid, behandelt mit 0,05 M 1-Tosyl-3-isocyanopropan.

c) Ionisiertes Polysaccharid, behandelt mit 0,10 M 1-Tosyl-3-isocyanopropan.

d) Lineares Dextran, gelöst in Dimethylsulfoxid, ionisiert mit Natrium-t-butoxid und behandelt mit 1-Tosyl-3-isocyanopropan

(0,05 M).

e) Geschätzt aus dem Leucingehalt der Polysaccharid-Gly-Leu-NH^ Konjugate.

f) Trypsin (EC. 3.4.21.4).

g) Bestimmt durch Aminosäureanalyse der Säurehydrolysate des geeigneten Polysaccharid-Trypsin-Konjugats.

h) Bestimmt durch Geschwindigkeitsanalyse bzw. Geschwindigkeitsassay (spezifische Aktivität von nativem Trypsin 33 esterase Einheit/mg).

i) Beispiel 8.

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- MT -

283390?

Tabelle II:

HERSTELLUNG UNTERSCHIEDLICHER ISONITRILDERIVATE VON ZELLULOSE ^a'

Natriuin-t-butoxid	Tos (CH₂)₃-NC ^C)	Isonitrilgehalt ^d)
nmol/g	(M)	umol/g
	0,05	—
125	0,05	9,2
183	0,05	14,2
250	0,05	17,6
437	0,05	32,4
500	0,05	35,1
500	—	—
500	0,015	4,5
500	0,023	8,0
500	0,030	13,5
500	0,038	' 15,0
500	0,045	20,0
500	0,059	23,0
500	0,074	32,0

a) Reaktionsgemisch: 1 g mikrokristalline Zellulose (56-63 um Durchmesser) in wasserfreiem Dimethylsulfoxid und die geeigneten Mengen an Natrium-t-butoxid und i-Tosyl-3-isocyanopropan in einem Gesamtvolumen von 45 ml.

b) Zugegeben in Form einer 0,05 M Lösung in Dimethylsulfoxid.

c) Zugegeben in Form'einer 0,1 M Lösung in Dimethylsulfoxid (für Einzelheiten vgl. den Versuchsteil).

d) Titrimetrisch bestimmt.

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Tabelle III: HERSTELLUNG VON ISONITRILDERIVATEN VON POLYSACCHARIDEN

a)

CO CO O

O CD CO O

Polysaccharide	Vorquel len in Dimethyl- sulfoxid /.(ml).	Natrium- t-but- oxid t>) . .(.umol) , .	. .1 -T.os.y.1-3-isocyanopro.pan	.gelöst in Dimethyl- sulfoxid , . (ml), .	Endkon zentra tion	Gesamt volumen des Reak tionsge misches (ml) , .	Isocyanidge- halt des mo difizierten Polysaccha ride c) ( umol/g)
Zellulosepulver 230-270 mesh (56-63 um Durch messer.)	15	500	9	20	0,05	45	31
Vernetztes Dextran (Sephadex) G-75	40 , . .40	500 500 , ,	0,48	15 , ,1 5.	0,05 0,.1O. . ,	65 65	19 30
G-150	80 , . 8.0	500 500 . ,	0,78 .1,56 .	25 40	0,05 0,10 ,	115 . .130	12 33
G-200	120 120	500 , 500	1 ,38 .3,,1.2,	30 50, , ,	0,05 0,10	160 1,80	12 15
Vernetzte Agarose (Sepharose-CL), 2B	70	500	1 ,92 4,32	20	0,05	100	64
4B	70 70	500 500 .	1,20	20 , 25	0,05 0,10	100 105	63 91
Lineares Dextran (Mol.-Gew.. 250. 000)	20 ^d)	500	1,20 2,51	15	0,05	45	88 < I
0,54

a) Alle Mengen werden für 1 g Polysaccharid angegeben, für Einzelheiten vgl. den Versuchstei]£O

b) Zugegeben in Form einer 0,05 M Dimethylsulfoxidlösung (10 ml). CD

c) Geschätzt aus dem Leucingehalt der Polysaccharid-Gly-Leu-NH₂-Konjugate. ^iNJ

d) Lineares Dextran gelöst in Dimethylsulfoxid.

Claims

PATENTANWÄLTE

DR. WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER · DR.-ING. ANNEKÄTE WEISERT DIPL.-ING. FACHRICHTUNG CHEMIE IRMGARDSTRASSE 15 · D-8OOO MÜNCHEN 71 · TELEFON 089/797077-797078 ■ TELEX 05-212156 kpatd

TELEGRAMM KRAUSPATENT

PATENTANSPRÜCHE

Ein Isocyanoderivat eines linearen oder eines vernetzten natürlichen oder synthetischen Polymeren mit einer Vielzahl von Hydroxylgruppen, wobei das Derivat die allgemeine Formel

P-O-Q-N = C

besitzt, worin P das polymere Grundgerüst bedeutet, das Sauerstoffatom ein Teil der Hydroxylgruppe des Ausgangsmaterials ist, Q eine Gruppe der Formel -(CH„) -, worin η für eine ganze Zahl von mindestens 3 und bis zu etwa 20 steht, bedeutet, oder worin Q einen Aralkylrest bedeutet.
2. Isocyanoderivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer ausgewählt wird unter Zellulose, Zellulosederivaten, Stärke, Stärkederivaten, linearem Dextran, vernetztem Dextran, linearer Agarose, vernetzter Agarose, Polyvinylalkohol, modifizierten Polysacchariden und N-2-Hydroxyäthylderivaten von Polyacryl-Polymeren.
3. Isocyanoderivat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , dass der Molekülteil Q eine (CH₉) Gruppe mit 3 bis 12 Kohlenstoffatomen bedeutet.

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4. Verfahren zur Herstellung von Isocyanoderivaten von vernetzten oder linearen natürlichen oder synthetischen Polymeren, die eine Vielzahl von Hydroxylgruppen aufweisen, dadurch gekennzeichnet , dass man das Makromolekül mit einer starken Base in einem nichtwässrigen,polaren,aprotischen Lösungsmittel so behandelt, dass die Hydroxylgruppen ionisieren, das ionisierte Produkt mit einer Verbindung der Formel X-Q-NC

worin X eine gute austretende Gruppe bedeutet, Q eine -(CH₂) -Gruppe, worin η für eine ganze Zahl von 3 bis etwa 20 steht, oder eine Aralkylgruppe bedeutet, unter Herstellung eines Produktes P-O-Q-NC, worin P das makromolekulare Grundgerüst bedeutet, umsetzt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , dass man als Lösungsmittel Dimethylsulfoxid verwendet.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet , dass man als Base für die Ionisierung t-Butoxid verwendet.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass man als Isocyanid 3-Tosyl-1-isocyanopropan verwendet.-
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das isocyanosubstituiertes Makromolekül für das Kuppeln eines biologisch aktiven Proteins verwendet wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , dass man als Protein ein Enzym verwendet.

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10. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 9, dadurch gekennzeichnet , dass man als makromolekularen Träger Zellulose, lineares Dextran, vernetztes Dextran, lineare Agarose, vernetzte Agarose, Stärke, Stärkederivate, Polyvinylalkohol, ein Polysaccharid oder ein N-2-Hydroxyäthylderivat von Polyacryl-Polymeren verwendet.

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