DE60208528T2

DE60208528T2 - Hochsulfatierte derivate von k5-polysacchariden und ihre herstellung

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Publication number: DE60208528T2
Application number: DE60208528T
Authority: DE
Inventors: Giorgio Zoppetti; Pasqua Oreste
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-02-27
Filing date: 2002-02-26
Publication date: 2006-08-17
Anticipated expiration: 2022-02-27
Also published as: ATE315049T1; DE60208528D1; WO2002068477A1; CA2439337C; EP1366082B1; CA2439337A1; AU2002236118B2; DK1366082T3; CN1916030A; EP1366082A1; US20040077848A1; ITMI20010397A1; CN1529715A; CN1284800C; JP2004529227A; CN1916030B; ES2254645T3; US20050004358A1; US20080146793A1; US6992183B2

Description

Die Aufreinigung des K5-Polysaccharides von E. coli durch Behandeln mit Isopropylalkohol und das Eliminieren der lipophilen Substanzen wird beschrieben. Das aufgereinigte Produkt kann verwendet werden, um nach N-Deacetylierung neue N,O-sulfatierte Polysaccharide mit einem hohen Sulfatierungsgrad herzustellen.
Hintergrund der Erfindung
Es ist bekannt, dass kapselförmiges K5-Polysaccharid, das aus einem E.coli-Stamm isoliert (hierin nachfolgend einfach als „K5" bezeichnet) und von W. F. Vann et al. (1981) in Eur. J. Biochem., 116, 359–364 beschrieben wird, dieselbe Sequenz zeigt wie der biosynthetische Vorläufer von Heparin und Heparansulfat (N-Acetylheparosan) und chemisch durch wiederholte Disaccharid-Einheiten erzeugt wird, die aus α 1–4 verknüpfter D-Glucuronsäure und N-Acetylglucosamin gebildet werden, während die Disaccharid-Einheiten aus d-Glucuronyl-N-acetylglucosamin β 1–4 verknüpft sind. Der einzige Unterschied zwischen dem Heparin-Vorläufer N-Acetylheparosan und K5-Polysaccharid, der für die biologischen Aktivitäten von K5 und seinen Derivaten nicht von Bedeutung ist, besteht in der Gegenwart einer Doppelbindung in Position 4(5) am nicht reduzierenden Ende einiger Ketten des Polymers, wie sie zum Beispiel in EP 489647 und EP 544592 , die hierin nachfolgend erwähnt sind, beschrieben sind.
Nach dieser ersten Veröffentlichung haben andere Artikel und Patentanmeldungen die Herstellung von E.coli K5-Polysaccharid mit einem von wenigen tausend bis zu vielen hunderttausend Dalton reichenden Molekulargewicht beschrieben. So werden z. B. EP 333243 , IT 1230785 , EP 489647 , EP 544592 , WO 92/17507, WO 01/02597 und der Artikel von M. Manzoni et al. (1996), Journal Bioactive Compatible Polymers, 11, 301–311 angeführt.
Beschreibung des Standes der Technik
Gemäß der Literatur wurde K5 aus der Fermentation von E.coli-Stämmen aufgereinigt, um beispielsweise Nukleinsäuren, Endotoxine, Pyrogene oder ganz allgemein Proteine mittels verschiedener Methodiken aufzureinigen.
So haben zum Beispiel W. F. Vann et al. (1981) das K5, das zum ersten Mal isoliert wurde, nach Ausfällung mit quaternären Ammoniumsalzen unter Verwendung von drei Ausfällungen mit 80% Ethanol aufgereinigt. In EP 333243 wird die Aufreinigung durchgeführt durch Ausfällen mit einem quaternären Ammoniumsalz, Extraktion und Isolierung des K5. in EP 489647 und EP 544598 wird das K5 aufgereinigt durch Ausfällung mit Ethanol und Ausschluss- und/oder Ionenaustauschchromatographie. Gemäß WO 92/17507 wird die Aufreinigung durchgeführt durch Ausfällung mit Ethanol, Dialyse und Gefriertrocknen der resultierenden Lösung im Anschluss an die Zentrifugation der dialysierten Lösung und Eliminierung des Feststoffs. Gemäß M. Manzoni et al. (1996) und gemäß WO 01/02597, die eine Vorgehensweise zur Herstellung von K5 mittels Fermentation in einem entfettete Sojabohnen, Salze und Glukose enthaltenden Kulturmedium beschreiben, erfolgt die Aufreinigung von K5 unter Verwendung von 1 M NaCl-Lösung, Ultrafiltration und Ionenaustauschchromatographie einer Lösung, die K5 enthält, das durch Ethanolausfällung erhalten wurde.
Darüber hinaus wurde durch Fermentation erhaltenes K5 chemisch modifiziert, um Heparin-ähnliche Produkte zu erhalten. Daher beschreiben von den oben erwähnten Dokumenten WO 92/17507, EP 489647 und EP 544592 N,O-sullfatiertes K5 mit niedrigem und hohem Molekulargewicht, das antikoagulierende und antithrombotische Wirkungen aufweist, IT 1230785 und WO 92/17507 beschreiben N-deacetylierte N,O-sulfatierte Derivate von K5 mit einer bestimmten Zahl von Glucuronsäure-Einheiten, die zu Iduronsäure-Einheiten epimerisiert sind, WO 98/09636 beschreibt N-deacetyliertes N,O-sulfatiertes K5 mit anitmetastatischer Wirkung.
Schließlich lehrt die Literatur in Bezug auf die O-Sulfatierung von K5-N-Sulfat wie die Zahl der Sulfatgruppen, die an den Hydroxygruppen der Disaccharid-Einheiten eingeführt werden können, zu modulieren sind. Insbesondere beschreiben Casu et al. (1994), Carbohydrate Research, 263, 271–284 die N-Deacetylierung von K5, die N-Sulfatierung und drei Verfahren der O-Sulfatierung, die als B, C und AC bezeichnet sind. Gemäß Verfahren C, in dem die Sulfatierung von K5-N-Sulfat unter Verwendung von 10 Moläquivalenten eines Sulfatierungsmittels bezogen auf eine freie Hydroxylgruppe bei einer Temperatur von 25–55°C für einen von 1 bis 24 Stunden reichenden Zeitraum durchgeführt wird, werden nach einer weiteren N-Sulfatierung mit einem maximalen Sulfat/Carboxyl-Verhältnis von 3,1 polysulfatierte Verbindungen erhalten, die hierin nachfolgend als N,O-übersulfatiertes K5 bezeichnet werden.
Die anderen K5-Derivate, die hierin nachfolgend beschrieben werden, werden ebenfalls wie folgt bezeichnet: das N-deacetylierte K5-Polysaccharid „N-deacetyliertes K5", das N-deacetylierte N-sulfatierte K5-Polysaccharid „K5-N-Sulfat", das N-deacetylierte N,O-sulfatierte K5-Polysaccharid „K5-N,O-Sulfat" und das N-deacetylierte N,O-sulfatierte K5-Polysaccharid mit einem hohen Sulfatierungsgrad, das zum Beispiel gemäß dem oben erwähnten, von Casu et al. (1994) beschriebenen Verfahren C erhalten wird, „N,O-übersulfatiertes K5".
Zusammenfassung der Erfindung
Bei der Durchführung der O-Sulfatierung des K5-N-Sulfat gemäß Verfahren C wurde beobachtet, dass, während es im Fall von Heparin-ähnlichen Verbindungen (d.h. bei denen ein bestimmter prozentualer Anteil der Uronsäure-Einheiten als Iduronsäure vorliegen) und im Fall von K5 möglich ist, einen hohen Sulfatierungsgrad zu erhalten, im Fall von K5-N-Sulfat das erhaltene N,O-übersulfatierte K5 einen Sulfatierungsgrad zeigte, der keine 3,2 Sulfatgruppen pro Disaccharid-Einheit erreichte. Diese Aussage erklärt das Fehlen von Literaturverweisen auf N,O-übersulfatiertes K5 mit mehr als 3,2 Sulfatgruppen pro Disaccharid-Einheit, wobei derartige Produkte auf Grund ihres hohen Grades an Anionen potentiell interessant sind.
Es wurde nun herausgefunden, dass durch die Aufreinigung des K5, das mittels Fermentation erhalten wurde, durch Behandeln mit Isopropanol in einer hochkon zentrierten Salzlösung ein reines K5-Polysaccharid erhalten wird, das praktisch frei von lipophilen Substanzen ist.
Darüber hinaus wurde herausgefunden, dass indem das derart erhaltene, von lipophilen Substanzen freie K5 einer N-Deacetylierung, einer N-Sulfatierung, einer O-Sulfatierung gemäß dem Verfahren C und optional einer weiteren N-Sulfatierung unterworfen wird, neue N,O-übersulfatierte K5-Verbindungen mit einem Sulfatierungsgrad größer als 3,2 und im Allgemeinen gleich oder größer als 3,5 erhalten werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum von K5, das aus Fermentation mit einer Reinheit von 80% erhalten wurde.
2 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum von K5, das aus Fermentation und frei von lipophilen Substanzen mit einer Reinheit von > 99% erhalten wurde.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegenden Erfindung stellt daher, entsprechend einem ihrer Aspekte ein Verfahren zur Herstellung von neuem N,O-übersulfatiertem K5 mit einem Sulfatierungsgrad größer als 3,2 her, das umfasst:

a) Behandlung eines durch Fermentation erhaltenen K5 mit Isopropanol in einer hochkonzentrierten wässrigen Salzlösung;
b) Unterwerten des derart aufgereinigten K5 einer N-Deacetylierung, mittels alkalischer Hydrolyse, gefolgt von einer N-Sulfatierung durch Behandlung mit einem N-Sulfatierungsmittel;
c) Behandlung des Ammoniumsalzes des so erhaltenen N-Sulfat-K5 mit einem O-Sulfatierungsmittel unter den Bedingungen einer O-Übersulfatierung; und
d) wenn erforderlich, Unterwerten der derart erhaltenen Verbindung einer N-Resulfatierung und Isolierung des N,O-übersulfatierten K5 als Natriumsalz, das wahlweise in ein anderes Salz überführt werden kann.

Der Ausdruck „Sulfatierungsgrad" bezeichnet die Anzahl von Sulfatgruppen pro Disaccharid-Einheit, ausgedrückt als Sulfat/Carboxyl-Verhältnis.
Der Ausdruck O-Übersulfatierung bedeutet die Übersulfatierung des K5-N-Sulfat, das beispielsweise unter Verwendung des Verfahrens C erhalten wurde.
In Schritt (a) kann es sich bei dem als Ausgangsmaterial verwendeten K5 um eines der Produkte handeln, das durch Fermentation mit Wildtyp oder geklonten K5 produzierenden Escherichia coli-Stämmen erhalten wird. Insbesondere kann das in der Literatur wie der oben zitierten beschriebene K5 verwendet werden, vorteilhafterweise das, das von M. Manzoni et al. Journal Bioactive Compatible Polymers 1996, 11, 301–311 beschrieben ist und das, das bei der nachfolgenden HERSTELLUNG 1 verdeutlichte.
Noch vorteilhafter hat das K5-Ausgangsmaterial ein niedriges Molekulargewicht, insbesondere mit einer Verteilung von etwa 1.500 bis etwa 15.000, vorzugsweise von etwa 2.000 bis etwa 9.000 mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 5.000 oder einem höheren Molekulargewicht, insbesondere mit einer Verteilung von etwa 10,000 bis etwa 50,000, vorzugsweise von etwa 20.000 bis etwa 40.000 und einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 30.000. Vorzugsweise besitzt das K5-Ausgangsmaterial eine Molekulargewichtsverteilung von etwa 1.500 bis etwa 50.000 mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 20.000–25.000.
Es ist beabsichtigt, dass das Molekulargewicht von dem hier beschriebenen K5 und seinen Derivaten berechnet wird unter Verwendungen von Fraktionen von Heparin mit bekanntem Molekulargewicht als Standards; alle Molekulargewichte in der vorliegenden Erfindung werden in Dalton ausgedrückt.
Bei dem Ausgangsmaterial kann es sich um ein zuvor aufgereinigtes K5 handeln, aus dem beispielsweise die Endotoxine, die Pyrogene oder andere Verunreinigungen mittels bekannter wissenschaftlicher Methodiken entfernt worden sind.
Wenn das am Ende von Schritt (a) erhaltene K5 für pharmazeutische Zwecke oder für die Herstellung von K5-N,O-Sulfat zur pharmazeutischen Verwendung verwendet wird, kann es in ähnlicher Weise aus Pyrogenen und Endotoxinen aufgereinigt werden.
Praktisch wird das K5-Ausgangsmaterial in einer 2–5 M Lösung, vorzugsweise aus Natriumchlorid, in einer Konzentration von 0,5 bis 10% gelöst und mit 1–3 Volumina Isopropanol bei einer Temperatur von 0–8°C behandelt und die derart erhaltene Lösung wird durch weitere Zugabe von Salz, vorzugsweise Natriumchlorid, auf 2–4 M gebracht.
Nach 1–18 Stunden bei derselben Temperatur fällt das Produkt aus Schritt (a) vollständig aus und wird durch Filtration oder Zentrifugation isoliert. Wenn die Reinheit des Produktes nicht zufriedenstellend ist, wird die Vorgehensweise aus Schritt (a) wiederholt. Das derart erhaltene feste Produkt wird wieder in Wasser gelöst und durch Ultrafiltration mit einer Membran zurückgewonnen.
Am Ende von Schritt (a) wird ein K5 erhalten, dass dieselben charakteristischen Merkmale des Ausgangsmaterials aufweist, aber im wesentlichen frei von lipophilen Substanzen ist.
Praktisch ist das von lipophilen Substanzen freie K5 erhältlich durch eine Verfahren, das umfasst (a1) das Behandeln eines durch Fermentation erhaltenen K5, das in einer 4 M Lösung von Natriumchlorid bei 4°C mit 1 Volumen Isopropanol gelöst ist, (a2) das Bringen der salzhaltigen Lösung auf eine Konzentration von 3 M durch Zugabe der berechneten Menge an gesättigter Natriumchlorid-Lösung, (a3) das Bewahren der Lösung über Nacht bei 4°C und (a4) das Isolieren des Produktes mittels Zentrifugieren und Eliminieren der Salze mittels Ultrafiltration.
Durch Aufreinigung mit Isopropanol ist es daher möglich, von lipophilen Substanzen freies K5 zu erhalten, das eine Reinheit von mehr als 99% aufweist. Dieses K5 macht es möglich, eine hohe O-Sulfatierung im nächsten Schritt (c) zu erhalten.
In Schritt (b) wird die N-Deacetylierung gemäß den bekannten Verfahren der alkalischen Hydrolyse durchgeführt, zum Beispiel mit Hydrazinsulfat in Hydrazin oder mit einer Base wie einem alkalischen Hydroxid, zum Beispiel Natrium- oder Kaliumhydroxid, in Wasser. Vorzugsweise wird die Reaktion in einer wässrigen Lösung von Natriumhydroxid bei einer Temperatur von 40–80°C durchgeführt, indem der Verlauf der Reaktion kontrolliert wird. Im Allgemeinen ist die N-Deacetylierung nach höchstens 30 Stunden, praktisch aber nach 12–24 Stunden abgeschlossen und die Alkalinität der Mediums wird durch Behandeln mit einer Säure, vorzugsweise Salzsäure, neutralisiert.
Die Lösung, die das K5 und die Salze enthält, wird anschließend mit einem N-Sulfatierungsmittel wie dem Addukt einer tertiären organischen Base mit Schwefelsäureanhydrid (Schwefeltrioxid), wie Pyridin·Schwefeltrioxid (C₅H₅N·SO₃), oder einem Trialkylamin·Schwefeltrioxid wie Trimethylamin·Schwefeltrioxid, in der Gegenwart eines alkalischen Carbonates wie Natriumcarbonat behandelt. Die Reaktion kann bei Raumtemperatur (20–30°C) durchgeführt werden, es ist jedoch auch möglich, bei höheren Temperaturen zu arbeiten (bis zu etwa 65°C), um die Reaktionszeit zu verkürzen. Die Zugabe des alkalischen Carbonates und des Sulfatierungsmittels kann gleichzeitig erfolgen oder das alkalische Carbonat kann in seiner Hauptmenge eingebracht werden und das Sulfatierungsmittel wird später, schrittweise, in einem Zeitraum zugegeben, der von 5 Minuten bis 12 Stunden dauern kann. Am Ende der Reaktion wird die Mischung bei Raumtemperatur mittels einer Säure, vorzugsweise Salzsäure, auf pH 7,5–8 gebracht und die Salze werden zum Beispiel mittels Diafiltration eliminiert. Die so erhaltene Lösung, die das K5-N-Sulfat als ein alkalisches Salz enthält, kann den nachfolgenden Schritt (c) durchlaufen oder sie kann aufkonzentriert werden und das K5-N-Sulfat kann mittels herkömmlicher Verfahren als Natriumsalz isoliert werden. Das so erhaltene K5-N-Sulfat ist zu 90–100% sulfatiert.
In Schritt (c) wird eine Lösung, die das in Schritt (b) erhaltene alkalische K5-N-Sulfat enthält, neutralisiert, zum Beispiel indem es durch ein kationisches Austauschharz, wie IR 120 H⁺, geleitet wird bis zu einem sauren pH. Die so erhaltene saure Lösung wird mit einer tertiären oder quartären organischen Base, zum Beispiel mit einem Trialkylamin wie Tributylamin, oder mit dem Hydroxid eines Tetraalkylammoniums, vorzugsweise Tetrabutylammoniumhydroxid, bis zum minimalen Volumen eingeengt und gefriergetrocknet. Das derart isolierte Ammoniumsalz des K5-N-Sulfates wird in einem polaren aprotischen Lösungsmittel wie Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid suspendiert und mit einem O-Sulfatierungsmittel, zum Beispiel mit dem Addukt C₅H₅N·SO₃, behandelt. Das Addukt C₅H₅N·SO₃ kann entweder im festen Zustand oder in Lösung in demselben polaren aprotischen Lösungsmittel verwendet werden. Die Sulfatierung wird für einen Zeitraum von 2 bis 24 Stunden bei einer Temperatur, die von Raumtemperatur (20–30°C) bis 70°C, vorzugsweise von 40 bis 60°C, variieren kann, durchgeführt.
Am Ende der Reaktion wird die Lösung bei Raumtemperatur mit mit Natriumchlorid gesättigtem Aceton behandelt, bis zur vollständigen Ausfällung. Der Niederschlag wird mittels Filtration vom Lösungsmittel abgetrennt, in der minimalen Menge an entionisiertem Wasser, zum Beispiel 100 ml, gelöst und Natriumchlorid wird zu der Lösung zugegeben bis eine 0,2 M Konzentration erreicht ist. Die Lösung wird mit 2 N Natriumhydroxid auf pH 7,5–8 gebracht und bis zur vollständigen Ausfällung mit Aceton behandelt. Nach der Filtration wird der Feststoff in 100 ml entionisiertem Wasser gelöst und von den übrigen Salzen mittels Ultrafiltration wie in Schritt (b) beschrieben gereinigt.
Wenn bei einer lyophilisierten Probe des derart erhaltenen Produktes anhand der Analyse mittels ¹³C-NMR eine teilweise N-Desulfatierung während der Übersulfatierung auftrat, wurde das Produkt Schritt (d) unterworfen.
In Schritt (d) wird das am Ende von Schritt (c) erhaltene Produkt mit einem N-Sulfatierungsmittel behandelt, indem bis zur vollständigen N-Sulfatierung unter den Bedingungen von Schritt (b) gearbeitet wird, wobei die Vorgehensweise wiederholt wird, wenn die N-Sulfatierung nicht vollständig ist.
Das so erhaltene N,O-übersulfatierte K5 wird als Natriumsalz isoliert, das unter Verwendung bekannter Verfahren, zum Beispiel mittels lonenaustausch mit einem geeigneten Harz, mittels Ausfällung mit Lösungsmitteln oder mittels Ultrafiltration mit Membranen in ein anderes Salz, wie Kalium-, Calcium-, Magnesium-, Aluminium-, Zink- oder Komplexsalze, überführt werden kann.
Die Reinheit kann mittels eines ¹H-NMR-Spektrums, mittels eines UV-Spektrums, mittels Carbazolreaktion oder mittels eines Kits zur Proteinbestimmung untersucht werden. Mittels dieser Untersuchungen wurde gezeigt, dass das am Ende von Schritt (a) erhaltene K5 als charakteristisches Merkmal ein ¹H-NMR-Spektrum aufweist, in dem keine Signale im Bereich unterhalb von 1,5 ppm vorliegen. Darüber hinaus sind keine Nukleinsäuren nachweisbar (dekadische Extinktion von 0 bei 260 nm mit einem Standard UV-Spektrometer) und die Proteine liegen nicht höher als 0,5%, vorteilhafterweise unter 0,25%, noch vorteilhafter unterhalb von 0,1%, vorzugsweise unterhalb von 0,03% gemäß dem BioRad-Kit.
Tatsächlich ist das am Ende von Schritt (a) erhaltene reine K5 frei von lipophilen Substanzen und Nukleinsäuren. Die Verwendung von „im wesentlichen" in Bezug auf das Fehlen lipophiler Substanzen und von „nicht nachweisbar" in Bezug auf die Nukleinsäuren berücksichtigt die Empfindlichkeit der verwendeten Instrumente, die die Gegenwart der oben erwähnten Verunreinigungen nicht angezeigt haben.
Es wurde daher nachgewiesen, dass dem ¹H-NMR-Spektrum des auf diese Weise erhaltenen reinen K5-Polysaccharides die Signale < 1,5 ppm fehlen, die charakteristisch für die Methylgruppe der lipophilen Substanzen sind.
Die neuen derart aufgereinigten K5-Verbidnungen, die die Herstellung von N,O-übersulfatiertem K5 mit einem hohen Sulfatierungsgrad möglich machen, haben vorzugsweise ein niedriges Molekulargewicht, insbesondere mit einer Verteilung von etwa 1.500 bis etwa 15.000, vorzugsweise von etwa 2.000 bis etwa 9.000 mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 5.000, oder ein höheres Molekulargewicht, insbesondere mit einer Verteilung von etwa 10.000 bis etwa 50.000, vorzugsweise von etwa 20.000 bis etwa 40.000 mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 30.000. Vorzugsweise weist das K5-Ausgangsmaterial eine Molekulargewichtsverteilung von etwa 1.500 bis etwa 50.000 mit einem mittleren Molekulargewicht von 20.000–25.000 auf.
Daher stellt die vorliegende Erfindung gemäß einem ihrer weiteren Aspekte neue N,O-übersulfatierte K5-Verbindungen mit einem Sulfatierungsgrad von mehr als 3,2 und ihre Salze bereit. Vorteilhafterweise besitzen die neuen N,O-übersulfatierten K5-Polysaccharide einen Sulfatierungsgrad von 3,2 bis 4, noch vorteilhafter von 3,5 bis 4, vorzugsweise von 3,7 bis 4 auf. Es ist bevorzugt, dass die Salze des neuen N,O-übersulfatierten K5 pharmazeutisch akzeptabel sind.
Vorteilhafterweise besitzt das genannte N,O-übersulfatierte K5 ein niedriges Molekulargewicht, insbesondere mit einer Verteilung von etwa 2.000 bis etwa 16.000, vorzugsweise von etwa 2.500 bis etwa 10.000 mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 6.500, oder einem Molekulargewicht, das ein bisschen höher ist, insbesondere mit einer Verteilung von etwa 13.000 bis etwa 65.000, vorzugsweise von etwa 25.000 bis etwa 50.000, mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 40.000. Vorzugsweise besitzt das N,O-übersulfatierte K5 der vorliegenden Erfindung eine Molekulargewichtsverteilung von etwa 2.000 bis etwa 65.000 mit einem mittleren Molekulargewicht von 25.000–30.000. Zudem stellen N,O-übersulfatierte K5-Verbindungen mit einem sehr niedrigen mittleren Molekulargewicht, zum Beispiel von etwa 2.000 bis 5.000, die durch Depolymerisierung erhalten werden, sehr interessante Produkte dar.
Die Depolymerisierung, die die Herstellung von N,O-übersulfatiertem K5 mit mittlerem Molekulargewicht von 2.000 bis 5.000 möglich macht, kann am Ende eines der Schritte (b)–(d) des oben veranschaulichten Verfahrens, vorzugsweise am Ende von Schritt (b) oder beim endgültigen N,O-übersulfatierten K5 durchgeführt werden.
Die Depolymerisierung kann gemäß einem der bekannten Verfahren zur Depolymerisierung von Heparin, zum Beispiel mittels Salpetersäure und nachfolgender Reduktion mit Natriumborhydrid ( EP 37319 ), mittels Periodat ( EP 287477 ), mittels freier Radikale ( EP 121067 ) oder durch β-Eliminierung ( EP 40144 ) durchgeführt werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die Depolymerisierung an einem K5-N-Sulfat durchgeführt, das am Ende von Schritt (b) mit Salpetersäure und nachfolgender Reduktion mit Natriumborhydrid, wie im Detail in EP 544592 beschrieben, erhalten wurde. Am Ende der Depolymerisierung und der Reduktion wird das derart erhaltene Produkt niederen Molekulargewichts den Schritten (c) und, optional, (d) unterworfen und das N,O-übersulfatierte K5 wird isoliert.
Alternativ kann derselbe Prozess der Depolymerisierung und Reduktion bei einem N,O-übersulfatierten K5 mit hohem Molekulargewicht angewandt werden und das entsprechende Produkt mit niedrigem Molekulargewicht wird glatt erhalten.
Unter den Salzen der oben erwähnten N,O-übersulfatierten K5-Verbindungen sind Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesium-, Aluminium- und Zinksalze bevorzugt.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung neue N,O-übersulfatierte K5-Polysaccharide mit einem Sulfatierungsgrad von mehr als 3,2, insbesondere von 3,2 bis 4, vorteilhafterweise von 3,5 bis 4, vorzugsweise von 3,7 bis 4 bereit, die durch ein Verfahren erhältlich sind, das umfasst

a) Behandlung eines durch Fermentation erhaltenen K5 mit Isopropanol in einer hochkonzentrierten Salzlösung;
b) Unterwerten des derart erhaltenen K5 einer N-Deacetylierung mittels alkalischer Hydrolyse und einer nachfolgenden N-Sulfatierung durch Behandlung mit einem N-Sulfatierungsmittel;
c) Behandlung eines Ammoniumsalzes des so erhaltenen K5-N-Sulfates mit einem O-Sulfatierungsmittel unter den Bedingungen einer O-Übersulfatierung;
d) wenn erforderlich, Unterwerfen des derart erhaltenen Produktes einer N-Sulfatierung und Isolierung des N,O-übersulfatierten K5 als Natriumsalz, welches, wenn erforderlich, in ein anderes Salz überführt wird.

Das N,O-übersulfatierte K5, das durch das oben erwähnte Verfahren erhältlich ist, hat einen Sulfatierungsgrad von 3,2 bis 4, vorteilhafterweise von 3,5 bis 4, vorzugsweise von 3,7 bis 4. Die neuen N,O-übersulfatierten K5-Verbindungen, die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten werden, insbesondere als Salze derselben, stellen in hohem Maße anionische Produkte dar, die in der kosmetischen Industrie nützlich sind als Co-Hilfsmittel gegen Haarverlust und in der pharmazeutischen Industrie als Produkte, die in der Lage sind, freie Radikale zu fangen.
Besagte N,O-übersulfatierte K5-Verbindungen sind in den Positionen 6-O- und 2-NH- der Glucosamin-Einheiten vollständig sulfatiert, wohingegen sie in den Glucuron-Einheiten 2,3-O-disulfatiert oder (2-O- oder 3-O)monosulfatiert sind, wobei der prozentuale Anteil der Sulfatgruppen in den Glucuron-Einheiten vom Sulfatierungsgrad abhängt.
Daher besteht ein weiterer Gegenstand der Erfindung in der Bereitstellung eines neuen N,O-übersulfatierten K5, das durch eine Mischung von Ketten gebildet wird, in der mindestens 90% der besagten Ketten durch die folgende Formel (I) dargestellt werden
worin n 3 bis 100 ist und R und R' Wasserstoff oder eine SO₃ ^– Gruppe darstellen, wobei mindestens einer von R und R' von Wasserstoff verscheiden ist, unter der Maßgabe, dass

– in 60 bis 100% der n Einheiten sowohl R als auch R' SO₃ ^– darstellen;
– in 0 bis 40% der n Einheiten einer von R und R' Wasserstoff darstellt und der andere SO₃ ^– ist; wobei der Sulfatierungsgrad von 3,2 bis 4 reicht, und

In diesem Zusammenhang bezieht sich der Ausdruck „chemisch akzeptabel" auf ein Kation, das nützlich für mögliche weitere Synthesen ist, wie ein Ammoniumoder ein (C₁-C₄)Trialkylammonium-Ion, oder das nützlich bei der Aufreinigung des Produktes ist, wobei bevorzugte Kationen die oben erwähnten Natrium-, Kalium-, Magnesium-, Aluminium- und Zinkionen darstellen. In den verbleibenden bis zu 10% der Ketten in besagter Mischung von Ketten kann bei einem gegebenen Sulfatierungsgrad eine bestimmte Menge von SO₃ ^–-Gruppen der Glucosamin-Einheiten von der 2-Position abgespalten und auf die 3-OH-Gruppe der besagten Glucosamin-Einheiten übertragen worden sein.
Ihr hoher Anionengehalt verleiht den N,O-übersulfatierten K5-Polysacchariden der vorliegenden Erfindung eine gute Aktivität gegen freie Radikale. Auf Grund ihrer niedrigen Toxizität handelt es sich bei ihnen um nützliche Bestandteile bei der Herstellung von pharmazeutischen und kosmetischen Zusammensetzungen.
Daher stellt die vorliegende Erfindung ebenfalls pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die eine pharmakologisch aktive Menge des N,O-übersulfatierten K5 mit einem Sulfatationsgrad von mehr als 3,5, vorteilhafterweise von 3,2 bis 4, noch vorteilhafter von 3,5 bis 4, vorzugsweise von 3,7 bis 4 oder eines seiner pharmazeutisch akzeptablen Salze in Mischung mit einem pharmazeutischen Arzneimittelträger als aktiven Bestandteil enthalten.
Bei den pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zur oralen, subkutanen, intravenösen, intramuskulären, transdermalen oder topischen Verabreichung werden die aktiven Bestandteile vorzugsweise in Dosierungseinheiten verabreicht, in Beimischung zu den klassischen pharmazeutischen Trägern oder Vehikeln.
Die Dosierung kann im Hinblick auf das Alter, das Gewicht und den Gesundheitszustand des Patienten variieren. Diese Dosierung schließt die Verabreichung einer Dosis von 1 bis 1.000 mg, vorteilhafterweise von 10 bis 750 mg, vorzugsweise von 250 bis 500 mg, einem bis zu dreimal pro Tag mittels intravenösem, subkutanem, oralem, intramuskulärem, transdermalem oder topischem Verabreichungsweg ein.
Entsprechend einem ihrer weiteren Aspekte betrifft die vorliegende Erfindung eine kosmetische Zusammensetzung, die als einen ihrer aktiven Bestandteile, ein N,O-übersulfatiertes K5 mit einem Sulfatierungsgrad von mehr als 3,2, vorteilhafterweise von 3,2 bis 4, noch vorteilhafter von 3,5 bis 4, vorzugsweise von 3,7 bis 4, oder eines seiner pharmazeutisch akzeptablen Salze, in Beimischung zu einer kosmetischen Trägersubstanz enthält.
Ein Salz, das aus der Gruppe bestehend aus Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesium-, Aluminium- und Zinksalzen ausgewählt ist, bildet einen zulässigen aktiven Bestandteil der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung.
Schließlich stellt die vorliegende Erfindung gemäß einem weiteren Aspekt ebenfalls pharmazeutische und kosmetische Zusammensetzungen bereit, die das neue aufgereinigte K5 der Erfindung als einen aktiven Bestandteil enthalten.
HERSTELLUNG I
Herstellung des K5-Polysaccharides aus Eschericia coli
Zuerst wird eine Fermentation im Kolben unter Verwendung des folgenden Mediums durchgeführt:

Entfettete Sojabohne 2 g/l

K₂HPO₄ 9,7 g/l

KH₂PO₄ 2 g/l

MgCl₂ 0,11 g/l

Natriumcitrat 0,5 g/l

Ammoniumsulfat 1 g/l

Glucose 2 g/l

Wasser 1.000 ml

pH = 7,3
Das Medium wird bei 120°C für 20 Minuten sterilisiert. Die Glucose wird separat als eine Lösung hergestellt, die bei 120°C für 30 Minuten sterilisiert und unter sterilen Bedingungen dem Medium zugegeben wird. Der Kolben wird mit einer Sus pension aus E. coli-Zellen Bi 8337/41 (O10:K5:H4) aus einer Schrägagarkultur, die in Tryptischem Sojabohnenagar aufrecht erhalten wird, beimpft und bei 37°C für 24 Stunden unter kontrolliertem Rühren (160 U/Min, 6 cm des Laufs) inkubiert. Das Bakterienwachstum wird gemessen durch Zählen der Zellen mittels eines Mikroskops. In einem weiteren Schritt wird ein Chemap-Braun-Fermenter mit einem Volumen von 14 Litern, der dasselbe Medium wie oben enthält, mit 0,1% der obigen Kolbenkultur geimpft und die Fermentation wird mit 1vvm Belüftung (vvm = Luftvolumen pro Flüssigkeitsvolumen pro Minute), Rühren bei 400 U/Min und bei einer Temperatur von 37°C für 18 Stunden durchgeführt. Während der Fermentation werden der pH, Sauerstoff, verbleibende Glucose, erzeugtes K5-Polysaccharid und bakterielles Wachstum gemessen. Am Ende der Fermentation wird die Temperatur für 10 Minuten auf 80°C angehoben. Die Zellen werden mittels Zentrifugation bei 10.000 U/Min vom Medium getrennt und die überstehende Flüssigkeit wird durch ein SS316 (MST) Modul, das mit PES-Membranen mit einem nominalen Rückhaltevermögen von 800 und 10.000 D ausgestattet ist, ultrafiltriert, um das Volumen auf 1/5 zu reduzieren. Anschließend wird das K5-Polysaccharid durch Zugabe von 4 Volumina Aceton bei 4°C ausgefällt und für eine Nacht bei 4°C gehalten, um zu sedimentieren, und anschließend bei 10.000 U/Min für 20 Minuten zentrifugiert oder filtriert. Anschließend wird für 90 Minuten bei 37°C eine Deprotonierung unter Verwendung einer Protease vom Typ II des Aspergillus orizae in 0,1 M NaCl und 0,15 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) bei pH 8, die 0,5% Natriumdodecylsulfat (SDS) (10 mg/l Filtrat) enthält, durchgeführt. Die Lösung wird auf einem SS 316 Modul mit einer Membran mit einem nominalen Rückhaltevermögen von 10.000 D mit 2 Extraktionen mit 1 M NaCl ultrafiltriert und mit Wasser gewaschen bis die dekadische Extinktion beim Ultrafiltrat verschwindet. Das K5-Polysaccharid wird anschließend mit Aceton ausgefällt und es wird eine Ausbeute von 850 mg/l des Fermenters erhalten. Die Reinheit des Polysaccharides wird mittels der Uronsäurebestimmung (Carbazol-Verfahren), Protonen- und Kohlenstoff-NMR, UV und dem Proteingehalt gemessen. Die Reinheit ist größer als 80%. Das so erhaltene Polysaccharid ist aus zwei Fraktionen mit unterschiedlichem Molekulargewicht, 30.000 bzw. 5.000 D, entsprechend der HPLC-Bestimmung unter Verwendung einer 75 HR Pharmacia-Säule erhalten, und einer einzelnen Fraktion mit einer Retentionszeit von etwa 9 Minuten unter Verwendung von zwei Säulen Bio-sil SEC 250 in Reihe (BioRad) und Na₂SO₄ als mobiler Phase bei Raumtemperatur und mit einer Durchflussmenge von 0,5 ml/Minute zusammengesetzt. Die Bestimmung erfolgt gegen eine Kurve, die mit Heparin-Fraktionen mit bekanntem Molekulargewicht erhalten wurde.
Das ¹H-NMR des derart erhaltenen aufgereinigten K5 ist in 1 gezeigt.
Wie festgestellt werden kann liegen im Bereich unterhalb 1,5 ppm viele Signale vor, die den Methylen der lipophilen Substanzen zugeordnet werden können.
Beispiel 1
K5-Aufreinigung
In 100 ml einer wässrigen Lösung, die 4 M Natriumchlorid enthält, und deren Temperatur automatisch auf 4°C eingestellt ist, werden 5 g des am Ende der HERSTELLUNG I erhaltenen K5 gelöst und 1 Volumen kaltes Isopropanol wird zu der so erhaltenen Lösung zugegeben. Die Salzkonzentration der Lösung wird durch Zugabe einer berechneten Menge einer gesättigten Natriumchloridlösung auf 3 M gebracht und die abgekühlte Lösung wird über Nacht bei einer kalten Temperatur (etwa 4°C) aufbewahrt. Der gebildete Niederschlag wird mittels Zentrifugation für 20 Min bei 10.000 U/Min abgetrennt und die Reinheit des Produktes wird mittels Dialyse für eine Nacht und anschließender ¹H-NMR-Analyse, bei der keine Signale im Bereich kleiner 1,5 ppm vorliegen dürfen, kontrolliert. Falls erforderlich wird die Vorgehensweise des Lösens in Wasser, das 4 M NaCl enthält, und Ausfällen mit Isopropanol wiederholt. Der Niederschlag wird in Wasser gelöst und mit einer Miniplate Millipore-Membran mit einem Rückhaltevermögen von 10.000 D ultrafiltriert bis keine Salze mehr erscheinen. Es wird ein K5 erhalten mit einer Reinheit von mindestens 99% und dessen ¹H-NMR-Spektrum in 2 gezeigt ist.
Wie festzustellen ist, gibt es im Bereich unterhalb von 1,5 ppm keine Spuren lipophiler Verunreinigungen.
Der Proteingehalt, der unter Verwendung eines BioRad-Kits berechnet wird, beträgt 0,02% und die Nukleinsäuren sind nicht nachweisbar (dekadische Extinktion von 0 bei 260 nm).
Beispiel 2
Herstellung eines N,O-übersulfatierten K5
(i) N-Deacetylierung
Zehn Gramm reines K5-Polysaccharid, das wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wird, werden mit 1.000 ml 2 N Natriumhydroxid gelöst und die derart hergestellte Lösung wird für 24 Stunden bei 60°C aufbewahrt. Die Lösung wird auf Raumtemperatur gebracht und anschließend mit 6 N Salzsäure auf einen neutralen pH gebracht.
(ii) N-Sulfatierung
Zu der Lösung, die das deacetylierte K5 enthält, und die bei 40°C gehalten wird, werden 16 g Natriumcarbonat und später, in 4 Stunden, 16 g Pyridin·Schwefeltrioxid zugegeben. Am Ende der Reaktion, nach 24 Stunden, wird die Lösung auf Raumtemperatur und anschließend mit einer 5% Salzsäurelösung auf pH 7,5–8 gebracht. Das Produkt wird mittels Diafiltration unter Verwendung einer Spiralmembran mit 1.000 D (Prepscale Cartridge-Millipore) von den Salzen gereinigt. Der Prozess ist abgeschlossen wenn die Leitfähigkeit des Permeats unter 1.000 μS, vorzugsweise unter 100 μS liegt. Die Intradialyse wird unter Verwendung desselben Dialysesystems in konzentrierter Form bis zu einer Polysaccharid-Konzentration von 10% verringert. Die konzentrierte Lösung wird gefriergetrocknet. Die ¹³C-NMR-Analyse zeigt keine verbleibenden N-Acetyl- oder NH₂-Gruppen.
(iii) O-Übersulfatierung
Das am Ende von Schritt (ii) erhaltene gefriergetrocknete Produkt wird in 100 ml entionisiertem Wasser gelöst und die Lösung wird mit einem Kühlbad auf 10°C gebracht und anschließend auf ein Kationenaustauschharz IR120H⁺ (100 ml) gegeben. Sowohl die Säule als auch der Vorratsbehälter werden bei 10°C gehalten. Nach dem Durchlaufen der Lösung, die die Probe enthält, wird das Harz mit entionisiertem Wasser gewaschen bis der pH des Permeats größer als 6 ist (etwa 3 Volumina entionisiertes Wasser).
Die saure Lösung wird mit Tetrabutylammoniumhydroxid (15%ige wässrige Lösung) neutralisiert (pH 7), anschließend auf das minimale Volumen verringert und gefriergetrocknet. Das Tetrabutylammoniumsalz wird in 400 ml Dimethylformamid gelöst und mit 35 g C₅H₅N·SO₃ in fester Form versetzt. Die Lösung wird für 24 Stunden bei 50°C gehalten. Am Ende der Reaktion wird die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 3 Volumina mit Natriumchlorid gesättigtes Aceton versetzt, und bis zur vollständigen Ausfällung auf 4°C gekühlt (12 Stunden). Der Niederschlag wird mittels Filtration vom Lösungsmittel abgetrennt, mit der minimalen Menge an entionisiertem Wasser (etwa 100 ml) solubilisiert und die Lösung wird mit Natriumchlorid versetzt bis eine 0,2 M Konzentration erreicht ist.
Die Lösung wird mit 2 N Natriumhydroxid auf pH 7,5–8 gebracht und mit 2 Volumina Aceton behandelt, bis eine vollständige Ausfällung erfolgt ist. Der Niederschlag wird mittels Filtration vom Lösungsmittel abgetrennt. Der erhaltene Feststoff wird mit 100 ml entionisiertem Wasser solubilisiert und von den verbleibenden Salzen mittels Ultrafiltration wie in Schritt (ii) beschrieben unter Verwendung einer Spiralmembran mit 1.000 D (Prepscale Cartridge Millipore) gereinigt.
(iv) N-Sulfatierung
Die derart erhaltene Lösung, die das O-sulfatierte Produkt enthält, wird wie zuvor in Schritt (ii) für die N-Sulfatierung beschrieben behandelt. Das Produkt weist ein mittleres Molekulargewicht von 15.000 D und ein Sulfat/Carboxyl-Verhältnis von 3,84 auf. Die Verteilung der Sulfatgruppen, die mittels ¹³C-NMR bestimmt wurde, ist wie folgt:
die Glucosamin-Einheit des konstitutiven Disaccharides ist zu 100% N-sulfatiert und 6-O-sulfatiert, wohingegen in Bezug auf die Glucuronsäure-Einheiten 30% monosulfatiert und 70% disulfatiert sind.
Beispiel 3
Herstellung eines N,O-übersulfatierten K5
Als Ausgangsmaterial wird ein K5 verwendet, das wie von M. Manzoni et al. (1996) beschrieben erhalten und charakterisiert wurde. Das derart hergestellte K5 wird wie in Beispiel 1 beschrieben aufgereinigt und es wird ein reines K5, bei dem keine Signale unterhalb von 1,5 ppm vorliegen, das frei von Nukleinsäuren ist und einen Proteingehalt von 0,5% aufweist, erhalten. Indem wie in Beispiel 2 beschrieben vorgegangen wird, wird ein N,O-übersulfatiertes K5 mit einem mittleren Molekulargewicht von 13.000 und einem Verhältnis von Sulfat zu Carboxyl von 3,54 erhalten.

Claims

Verfahren zur Herstellung von N,O-übersulfatiertem K5 mit einem Sulfatierungsgrad von mehr als 3,2, das umfasst e) Behandlung eines durch Fermentation erhaltenen K5 mit Isopropanol in einer hochkonzentrierten wässrigen Salzlösung; f) Unterwerfen des derart aufgereinigten K5 einer N-Deacetylierung, gefolgt von einer N-Sulfatierung durch Behandlung mit einem N-Sulfatierungsmittel; g) Behandlung eines Ammoniumsalzes des so erhaltenen K5 N-Sulfates mit einem O-Sulfatierungsmittel unter Bedingungen einer O-Übersulfatierung; und h) wenn erforderlich, Unterwerfen des derart erhaltenen Produktes einer N-Sulfatierung und Isolierung des N,O-übersulfatierten K5.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Ausgangs-K5 ein Molekulargewicht mit einer Verteilung von etwa 1.500 bis etwa 15.000 aufweist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Molekulargewichtsverteilung von etwa 2.000 bis etwa 9.000 reicht, mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 5.000.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Ausgangs-K5 ein Molekulargewicht mit einer Verteilung von etwa 10.000 bis etwa 50.000 aufweist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Molekulargewichtsverteilung von etwa 20.000 bis etwa 40.000 reicht, mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 30.000.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Ausgangs-K5 ein Molekulargewicht mit einer Verteilung von etwa 2.000 bis etwa 50.000 aufweist, mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 20.000 – 25.000.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, wobei in Schritt b) die alkalische Hydrolyse mit Natriumhydroxid durchgeführt wird.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, wobei ein Pyridin-Schwefeltrioxid-Addukt oder ein Trimethylamin-Schwefeltrioxid-Addukt als N-Sulfatierungsmittel verwendet werden.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, wobei in Schritt c) das Tetrabutylammonium-Salz als Ammoniumsalz verwendet wird.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, wobei in Schritt c) das Pyridin-Schwefeltrioxid-Addukt als Sulfatierungsmittel verwendet wird.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das N,O-übersulfatierte K5 als Natriumsalz isoliert wird.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Natriumsalz in ein anderes Salz überführt wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das andere Salz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Kalium-, Calcium-, Magnesium-, Aluminium- und Zink-Salzen.
K5-Polysaccharid, das im wesentlichen frei von lipophilen Substanzen ist, und das gemäß einem Verfahren erhältlich ist, in dem (a1) ein durch Fermentation erhaltenes K5, gelöst in 4 M Natriumchlorid-Lösung bei 4°C, mit 1 Volumen Isopropanol behandelt wird; (a2) die Salzlösung durch Zugabe der berechneten Menge an Natriumchlorid auf eine 3 M Konzentration gebracht wird; (a3) die Lösung über Nacht bei 4°C aufbewahrt wird; und (a4) das Produkt mittels Zentrifugation isoliert und die Salze mittels Ultrafiltration eliminiert werden.
N,O-übersulfatiertes K5-Polysaccharid mit einem Sulfatierungsgrad von mehr als 3,2, das erhältlich ist gemäß dem Verfahren, das besteht aus a) dem Behandeln eines durch Fermentation erhaltenen K5 mit Isopropanol in einer hochkonzentrierten wässrigen Salzlösung; b) dem Unterwerten des derart aufgereinigten K5 einer N-Deacetylierung, gefolgt von einer N-Sulfatierung durch Behandlung mit einem N-Sulfatierungsmittel; c) dem Behandeln eines Ammoniumsalzes des derart erhaltenen K5 N-Sulfates mit einem O-Sulfatierungsmittel unter Bedingungen einer O-Übersulfatierung d) falls erforderlich, dem Unterwerten des derart erhaltenen Produktes einer N-Sulfatierung und der Isolierung des N,O-übersulfatierten K5 in Form seines Natriumsalzes, das, wenn erforderlich, in ein anderes Salz überführt wird.
N,O-Übersulfatiertes K5-Polysaccharid mit einem Sulfatierungsgrad von mehr als 3,2 oder ein Salz desselben.
N,O-Übersulfatiertes K5-Polysaccharid nach Anspruch 16 mit einem Sulfatierungsgrad von 3,5 bis 4.
N,O-Übersulfatiertes K5-Polysaccharid nach Anspruch 17 mit einem Sulfatierungsgrad von 3,7 bis 4.
N,O-Übersulfatiertes K5-Polysaccharid nach irgendeinem der Ansprüche 16 bis 18 mit einem Molekulargewicht mit einer Verteilung von etwa 2.000 bis etwa 16.000.
N,O-Übersulfatiertes K5-Polysaccharid nach Anspruch 19, wobei die Molekulargewichtsverteilung von etwa 2.500 bis etwa 10.000 reicht, mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 6.500.
N,O-Übersulfatiertes K5-Polysaccharid nach irgendeinem der Ansprüche 16 bis 18 mit einem Molekulargewicht mit einer Verteilung von etwa 13.000 bis etwa 65.000.
N,O-Übersulfatiertes K5-Polysaccharid nach Anspruch 21, wobei die Molekulargewichtsverteilung von etwa 25.000 bis etwa 50.000 reicht, mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 40.000.
N,O-Übersulfatiertes K5 nach irgendeinem der Ansprüche 16 bis 18 mit einem Molekulargewicht mit einer Verteilung von etwa 2.000 bis etwa 65.000, mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 25.000 – 30.000.
N,O-Übersulfatiertes K5 nach irgendeinem der Ansprüche 16 bis 18, das durch Depolymerisation erhältlich ist und ein durchschnittliches Molekulargewicht von 2.000 bis 5.000 aufweist.
Pharmazeutisch akzeptables Salz des N,O-übersulfatierten K5 der Ansprüche 16–24.
Salz nach Anspruch 25, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesium-, Aluminium- und Zink-Salzen.
N,O-Übersulfatiertes K5, das durch eine Mischung von Ketten gebildet ist, in der mindestens 90% der Ketten die Formel
aufweisen, wobei n von 3 bis 100 reicht und R und R' Wasserstoff oder eine SO₃ ^–-Gruppe darstellen, mindestens einer von R und R' von Wasserstoff verschieden ist, unter der Bedingung, dass R und R' in 60 bis 100% der n-Einheiten beide SO₃ ^– darstellen, in 0 bis 40% der n-Einheiten einer von R und R' Wasserstoff und der andere SO₃ ^– darstellt; der Sulfatierunsgrad von 3,2 bis 4 reicht und es sich bei dem entsprechenden Kation um ein chemisch oder pharmazeutisch akzeptables handelt.
N,O-Übersulfatiertes K5 nach Anspruch 27, wobei das Kation ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesium-, Aluminium- und Zink-Ionen.
Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine pharmakologisch aktive Menge eines N,O-übersulfatierten K5 gemäß irgendeinem der Ansprüche 16–28 als einen aktiven Bestandteil derselben, zusammengemischt mit einem pharmazeutischen Träger oder Vehikel.
Kosmetische Zusammensetzung, umfassend eine kosmetisch wirksame Menge eines N,O-übersulfatierten K5 gemäß irgendeinem der Ansprüche 16–28 als einen aktiven Bestandteil derselben, zusammengemischt mit einem kosmetischen Träger oder Vehikel.