DE69708862T2

DE69708862T2 - Derivate von k5 polysaccharid mit hoher, blutgerinnungshemmender wirkung

Info

Publication number: DE69708862T2
Application number: DE69708862T
Authority: DE
Inventors: Giovanni Cipolletti; Pasqua Oreste; Giorgio Zoppetti
Original assignee: Inalco SpA
Current assignee: Inalco SpA
Priority date: 1996-05-10
Filing date: 1997-05-09
Publication date: 2002-08-14
Anticipated expiration: 2017-05-10
Also published as: US6162797A; ITMI960956A0; EP0897393A1; IT1282994B1; DE69708862D1; ES2167748T3; DK0897393T3; AU3026597A; EP0897393B1; WO1997043317A1; ATE210154T1; CA2253833A1; ITMI960956A1; CA2253833C

Description

STAND DER TECHNIK

Es ist bekannt, daß das Produkt, das hauptsächlich in der Antikoagulans-Therapie eingesetzt wird, Heparin ist, das durch Extraktion aus Tierorganen erhalten wird.
Allerdings verwendet die Herstellung von Heparin aus Tierorganen große Mengen an Lösungsmitteln und chemischen Agenzien, was deren Beseitigung und damit Probleme einer potentiellen Umweltverschmutzung involviert. Darüber kann das Endprodukt Reste biologischer Substanzen enthalten, die normalerweise oder ausnahmesweise in Tiergeweben enthalten sind, wie z. B. Viren oder Prione.
O-Sulfatierungsverfahren, die an Derivaten des K5-Polysaccharids durchgeführt wurden (B. Casu et al., Carbohydrate Letters, 1, 107-114 (1994) sind auch bekannt.
Die Publikationen von B. Casu et al. betreffen O-Sulfatierungen, die an K5 durchgeführt wurden und die zu Produkten führen, die eine Antikoagulansstärke zeigen, die geringer ist als die des handelsüblichen Heparins.
Der Grund liegt auch in der Tatsache, daß die Gesamtheit der Uronsäuren druch Glucuronsäuren repräsentiert wird. Die Glucuronsäure gibt der Polysaccharid-Kette eine geringere Flexibilität gegenüber den Zielproteinen, z. B. dem Antithrombin III, und damit eine geringere Antikoagulans-Aktivität (B. Casu, M. Petitou, M. Provasoli und P. Sinay (1988). Conformational flexibility: an new concept for explaining binding and biological properties of iduronic acid containing glycosaminoglycans. Trends Biochem. Sci. 13, 221-225).

ZUSAMMENFASSUNG

Jetzt wurde ein Verfahren zur Herstellung neuer Derivate des K5-Polysaccharids gefunden, das es möglich macht, die Nachteile des Standes der Technik zu überwinden.
Das Verfahren umfaßt die folgenden Schritte:
a) das K5-Polysaccharid wird N-deacetyliert;
b) das in Schritt a) erhaltene Produkt wird N-sulfatiert;
c) das in Schritt b) erhaltene Produkt wird mindestens zu einem Iduronsäure-Gehalt von 50%, bezogen auf die Gesamturonsäuren, epimerisiert,
und ist dadurch gekennzeichnet, daß das in Schritt c) erhaltene Produkt gemäß den folgenden Schritten weiter behandelt wird:
d) das in Schritt c) erhaltene Produkt wird in Wasser gelöst und durch eine Säule, die ein Kationenaustauscherharz enthält, laufen gelassen;
e) die in Schritt d) erhaltene Lösung wird mit einer organischen Base umgesetzt;
f) die in Schritt e) erhaltene Lösung wird gefriergetrocknet und das erhaltene Produkt wird in einem organischen Lösungsmittel wieder aufgelöst und mit einem Sulfatierungsmittel unter Erreichung einer O-Sulfatierung behandelt;
g) das in Schritt f) erhaltene Produkt wird präzipitiert, in destilliertem Wasser wieder aufgelöst und gegen destilliertes Wasser dialysiert;
h) das in Schritt g) erhaltene Produkt wird, wenn notwendig, mit einem Sulfatierungsmittel behandelt, um die Resulfatierung im Fall N-desulfatierter Gruppen zu erreichen:
Gegebenenfalls wird das nach Schritt h) erhaltene Produkt durch kontrollierten Abbau mit salpetriger Säure nach einer bekannten Technik (d. h. US-Patent Nr. 5 019 649) depolymerisiert.
Die erfindungsgemäßen Produkte haben neben neuen Merkmalen eine hohe Antikoagulans-Aktivität, die größer ist als die Antikoagulans-Aktivität des Heparins, das durch Extraktion aus Tiergeweben erhalten wird.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Merkmale und die Vorzüge der Derivate des K5-Polysaccharids und das betreffende erfindungsgemäße Herstellungsverfahren werden im Verlauf der folgenden detaillierten Beschreibung erläutert. Das Ausgangsmaterial zum Erhalt dieser Derivate ist K5-Polysaccharid, das aus E. Coli erhalten wird, wie es von M. Manzoni, S. Bergomi und V. Cavazzoni (Journal of Bioactive and Compatible Polymers, Bd. VIII, Juli 1993, 251-257) beschrieben wird.
Das K5-Polysaccharid wird zuerst in den folgenden Schritten behandelt:
a) das K5-Polysaccharids wird N-deacetyliert;
b) das in Schritt a) erhaltene Produkt wird N-sulfatiert, um zu 25 bis 100% N-sulfatierte KS zu erhalten;
c) das in Schritt b) erhaltene Produkt wird mit D-Glucuronyl-Liduronyl-C5-Epimerase, die aus Rinderleber extrahiert wurde, epimerisiert, um ein Produkt mit einem L-Iduronsäure-Gehalt von 50 bis 90%, bezogen auf die Gesamtmenge Uronsäuren, zu erhalten.
Die N-Deacetylierung des Schritts a) wird durch Behandlung mit einem Gemisch aus Hydrazin und Hydrazinsulfat oder in alkalischer Umgebung mit Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid durchgeführt. Anschließend wird die N-Sulfatierung des Schritts b) durch Behandlung mit Triethylamin-Schwefeltrioxid oder mit Trimethylamin-Schwefeltrioxid durchgeführt. Die Reaktionen der N-Deacetylierung und N-Sulfatierung werden nach bekannten Techniken, z. B. nach dem Patent WO 92/17507 durchgeführt.
Das N-sulfatierte Produkt wird dann der Epimerisierungs-Reaktion in Schritt c) unterworfen, um die Glucuronsäure in Iduronsäure umzuwandeln. Die Epimerisierung wird in Gegenwart des Enzyms D-Glucuronyl-L-iduronyl-C5- epimerase (im folgenden einfach als C5-Epimerase bezeichnet), die aus Rinderleber extrahiert wird und nach dem Verfahren, das von A. Malmström in J. B. C. 255, 3878-3883 (1980) beschrieben wird, gereinigt wird, durchgeführt.
Das Reaktionsmedium ist z. B. eine Pufferlösung mit pH 7,4, das aus 0,04 M Hepes oder 0,05 M Tris, Kaliumchlorid, EDTA und TRITON X-100 besteht und mit einem oder mehreren Additiven, die aus der Gruppe bestehend aus Glycol, Glycerin, Polyvinylpyrrolidon, insbesondere Polyvinylpyrrolidon mit einem Molekulargewicht von 15 000 bis 90 000 Glycol und Lecithin ausgewählt sind, in einer solchen Menge versetzt ist, daß die Viskosität der Pufferlösung auf Werte im Bereich von 1, 1 bis 3 Centistoke erhöht wird. Das Reaktionsmedium wird insbesondere ausgehend von einer geeigneten Pufferlösung mit einem pH von 7,4, z. B. 0,04 M HEPES, 0,4 M KCl und 0,06 M EDTA hergestellt und zu 25 ml dieser Lösung werden 100 bis 1000 ul TRITON-X-100, 0,5 ml bis 60 ml Additiv und destilliertes Wasser bis 100 ml gegeben. Das Polysaccharid, das einer Epimerisierung unterzogen werden soll, wird in Mengen von 5 bis 1000 mg pro 100 ml zu diesem Reaktionsmedium gegeben, wobei die Lösung A erhalten wird. Die C-5-Epimerase wird getrennt in demselben Reaktionsmedium, wie oben beschrieben, gelöst, und zwar in Mengen von 21 bis 2000 ug pro 100 ml, wodurch die Lösung B erhalten wird. Die Lösung B wird in einem solchen Verhältnis zu der Lösung A gegeben, daß ein C-5-Epimerase-Gehalt von 1,5 bis 15 000 ug pro 100 ml Gemisch erhalten wird, das einer Epimerisierung unterworfen wird.
Das Gemisch wird durch Rühren homogenisiert und auf eine Temperatur zwischen 30 und 40ºC in einer Kammer mit konstanter Temperatur über einen Zeitraum, der von 90 Minuten bis 15 Stunden reicht, erwärmt.
Die Reaktion wird gestoppt, indem das Gemisch 5 Minutenn lang auf 100ºC erwärmt wird. Das Produkt wird durch eine DEAE-Sephacel-Säule gereinigt, wobei 0,05 M (NH&sub4;)HCO&sub3; oder 0,05 M NaCl als Puffer verwendet werden, und das Produkt mit (NH&sub4;)HCO&sub3;-Puffer oder 2 M NaCl eluiert wird.
Die gesammelten Fraktionen werden durch eine Sephadex G-15-Säule ensalzt, die Fraktion, die das Produkt enthält, wird gefriergetrocknet und das Produkt wird durch ¹H-NMR analysiert. Aus dem ¹H-NMR-Spektrum wird der Gehalt an D-Glucuronsäure und L-Iduronsäure mit einem Computer bestimmt.
Das erhaltene Produkt kann erneut in der Lösung A gelöst werden und erneut mit der Lösung B behandelt werden, um mit einer weiteren Epimerisierungsbehandlung eine Erhöhung des L-Induronsäure-Gehalts zu erreichen.
Das Produkt, das aus dem Schritt c), wie er oben beschrieben wird, erhalten wird, wird weiter behandelt, wie es in den folgenden Schritten beschrieben wird und wie es die vorliegende Erfindung charakterisiert:
d) das in Schritt c) erhaltene Produkt wird in Wasser gelöst und durch eine Säule, die ein Kationenaustauscherharz, z. B. Amberlite IR 120 H&spplus; (Rohm und Haas) enthält, laufen gelassen, die dann anschließend mit Wasser gewaschen wird.
Der pH der erhaltenen Lösung liegt zwischen 0,5 und 1,5;
e) die in Schritt d) erhaltene Lösung wird mit einer organischen Base behandelt, die vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus Trimethylamin, Triethylamin und Tributylamin ausgewählt ist und die in einem organischen Lösungsmittel wie z. B. Alkohol gelöst ist. Die zugesetzte Menge der organischen Base ist so, daß ein Lösungs-pH im Bereich von 6,5 bis 7,0 erreicht wird. Der Überschuß an organischer Base wird durch Behandlung mit Diethylether entfernt;
f) die in Schritt e) erhaltene Lösung wird gefriergetrocknet und das erhaltene Produkt wird bei Raumtemperatur wieder in einem organischen Lösungsmittel gelöst und mit einem Sulfatierungsagens bei einer Temperatur im Bereich von -5 bis 60ºC über einen Zeitraum zwischen 10 und 24 Stunden behandelt, um die O-Sulfatierung zu erreichen.
Das organische Lösungsmittel ist vorzugsweise wasserfreies Dimethylformamid, und das Sulfatierungsmittel wird vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus Pyridin-Schwefeltrioxid, Trimethylamin-Schwefeltrioxid, Triethylamin-Schwefeltrioxid, Tripropylamin-Schwefeltrioxid und Tributylamin-Schwefeltrioxid ausgewählt;
g) die in Schritt f) erhaltene Lösung wird mit dem gleichen Volumen Wasser verdünnt, es wird eine 4%ige NaOH-Lösung zugesetzt, bis ein pH von 9 erreicht wird, dann wird das Produkt von Zusatz von 4 Volumina Alkohol, der mit Natriumacetat gesättigt ist, und Aufrechterhalten einer Temperatur von 3 bis 5ºC für 10 bis 15 Stunden ausgefällt. Der erhaltene Niederschlag wird in destilliertem Wasser gelöst und gegen destilliertes Wasser mit einer 1000-Cut-off-Dialysemembran 3 Tage lang bei täglichem zusätzlichen Dialysewechsel dialysiert;
h) wenn es notwendig ist, wird die in Schritt g) erhaltene Lösung mit Natriumbicarbonat bis zu einem pH von 9 versetzt, auf eine Temperatur im Bereich von 50 bis 60ºC erwärmt und es wird ein Sulfatierungsmittel, das aus der in Schritt f) aufgeführten Gruppe ausgewählt ist, zugesetzt, um die N-Resulfatierung der Gruppen zu erreichen, falls sie während der Behandlung desulfatiert wurden. Diese Reaktion wird unter Rühren über einen Zeitraum, der von 5 bis 10 Stunden reicht, bei einer Temperatur von 50 bis 60ºC durchgeführt.
Am Ende wird die Lösung durch eine 3500 D-Dialyse gegen abnehmende NaCl-Lösungen für 5 Tage entsalzt, das Produkt wird gefriergetrocknet. Gegebenenfalls wird das Produkt, das nach Schritt h) erhalten wird, durch kontrollierten Abbau mit salpetriger Säure nach bekannter Technik (d. h. Patent Nr. 5019649) entpolymerisiert.
Durch das beschriebene Verfahren werden K5-Polysaccharid-Derivate, die neue Charakteristika und eine Antikoagulans-Aktivität, die größer als die von Heparin ist, welches durch die Extraktion aus Tiergeweben erhalten wird, haben, erhalten. Die erfindungsgemäßen Derivate enthalten 40 bis 100% Ketten mit Affinität für das Antithrombin III, was nach dem Verfahren, das von M. Hook et al. (FEBS letters, 66, 1976, 90-93) beschrieben ist, per Computer bestimmt wird, während Heparin nur 30% Ketten mit Affinität für Antithrombin III enthält; dies erklärt die größere Antikoagulans-Aktivität. In der folgenden Tabelle 1 sind die Werte der chemischen Analyse und die chemischen in vitro-Antikoagulans-Aktivität der erfindungsgemäßen Derivate (A) im Vergleich zum handelsüblichen Heparin (B) angegeben. TABELLE 1
Das Sulfat/Carboxyl-Verhältnis wurde durch das konduktometrische Verfahren nach B. Casu et al. (Carbohyd. Res. 39.168 (1975)) bestimmt, während die Sulfatverteilung durch kernmagnetische Resonanz nach B. Casu et al. (Arzneim. Forsch./Drug Res. 33(I), 1, 135-142-1893) bestimmt wurde.
Der Gehalt an 3-O-Sulfaten wurde nach dem Verfahren bestimmt, das von B. Casu et al. (Biochem J. 197, 1981, 599-609) beschrieben wird.
Die Antikoagulans-Aktivität wurde als APTT nach L. Andersson et al. (Thrombosis Res. 9, 575-1976) und als Anti-Xa nach D. P. Thomas et al. (Thrombosis and Haemostasis 45, 214-1981) bestimmt.
Dank ihrer Charakteristika können die erfindungsgemäßen Derivate zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen verwendet werden, die für die Antikoagulans-Behandlung in der humanen Therapie geeignet sind.
Diese Zusammensetzungen enthalten wirksame Mengen der Derivate in Kombination mit pharmakologisch annehmbaren Arzneimittelträgersubstanzen oder Verdünnungsmitteln. Die Dosierung für die humane Therapie ist. 30 bis 200 mg pro Tag.
Die erfindungsgemäßen Derivate zeigen gegenüber Heparin den großen Vorteil, daß sie frei von Viren und Prionen sind, und das Herstellungsverfahren hat den Vorteil, daß es keine verschmutzenden Ausflüsse liefert.

BEISPIEL 1

10 mg zu 100% N-sulfatiertes und zu 70% epimerisiertes (d. h. enthält 70% Iduronsäure, bezogen auf die gesamten Uronsäuren) K5 wurde in 2 ml Wasser gelöst und bei Raumtemperatur in eine Amberlite IR 120H&spplus;-Säule gegeben. Die Säule wurde mit 10 ml Wasser gewaschen. Das Eluat plus Waschflüssigkeit hatte einen pH von 1,5. Die Lösung wurde dann mit Tributylamin bis pH 5,5 versetzt, wobei eine 10%ige Tributylamin-Lösung in Ethanol verwendet wurde. Der Tributylamin-Überschuß, der nicht an das Polysaccharid gebunden war, wurde durch Behandlung mit Diethylether entfernt. Die Lösung wurde schließlich gefriergetrocknet.
Dann wurde das Produkt in 3,2 ml wasserfreiem Dimethylformamid bei Raumtemperatur wieder aufgelöst und es wurden 3 ml wasserfreies Dimethylformamid, enthaltend 0,153 g Pyridin-Schwefeltrioxid, zugesetzt. Die erhaltene Lösung wurde 6 Stunden lang bei Raumtemperatur gehalten und dann mit dem gleichen Volumen Wasser verdünnt. Der pH wurde endgültig mit 4% NaOH auf 9 eingestellt und das Produkt wurde mit 4 Volumina Ethanol, das mit Natriumacetat gesättigt war, ausgefällt, wobei die Lösung über Nacht bei 4ºC gehalten wurde. Der erhaltene Niederschlag wurde in 10 ml destilliertem Wasser gelöst und mit einer 1000 Cut-off-Dialysemembran bei einem täglichen zusätzlichen Dialysewechsel dialysiert.
Die erhaltene Probe wurde der N-Resulfatierung unterworfen. Der pH wurde unter Zusatz von festem Natriumbicarbonat auf 9 eingestellt, die Temperatur wurde auf 55ºC erhöht und unter Rühren wurden 6,5 ml Trimethylamin-Schwefeltrioxid zugesetzt. Die Lösung wurde für eine Stunde bei 55ºC gehalten, es wurden weitere 6,5 ml Trimethylamin-Schwefeltrioxid zugesetzt und die Reaktion wurde weitere 5 Stunden durchgeführt. Die Probe wurde durch eine 3500 D-Dialyse gegen Lösungen mit abnehmender NaCl-Konzentration über 5 Tage entsalzt (0,5 M am ersten Tag, 0,2 M am zweiten Tag, 0,1 M am dritten Tag und Wasser am vierten und fünften Tag). Das Produkt wurde am Schluß gefriergetrocknet.
Das erhaltene Produkt weist ein Sulfat/Carboxyl-Verhältnis von 2,5, einen Gehalt an N-Sulfaten von 100%, einen Gehalt 6-O-Sulfaten von 80% und einen Gehalt an 2-O-Sulfaten von 60%, einen Gehalt an 3-O-Sulfaten von 10% und eine Fraktion mit Affinität zu AT III von 100% sowie die folgende in vitro-Antikoagulans-Aktivität auf:
Anti-Xa 600 E/mg
APTT 310 E/mg

BETSPIEL 2

10 mg zu 90% N-sulfatiertes und zu 60% epimerisiertes K5 wurden wie in Beispiel 1 behahdelt, mit dem Unterschied, daß das Produkt nach der N-Resulfatierung bei einer Temperatur von 40ºC mit 10 ml wasserfreiem Dimethylformamid, das 0,51 g Pyridin-Schwefeltrioxid, das unter Rühren zugesetzt worden war, enthielt, behandelt wurde.
Nach 2 Stunden wurden 10 ml wasserfreies Dimethylformamid, das 0,51 g Pyridin-Schwefeltroxid enthielt, zugesetzt, und die Reaktion wurde für weitere 10 Stunden fortgesetzt.
Das Produkt wurde wie in Beispiel 1 entsalzt.
Das erhaltene Produkt weist ein Sulfat/Carboxyl-Verhältnis von 2,4 auf, einen Gehalt an N-Sulfaten von 90%, einen Gehalt an 6-O-Sulfaten von 100'%, einen Gehalt an 2-O-Sulfaten von 40%, einen Gehalt an 3-O-Sulfaten von 7% und eine Fraktionsaffinität zu AT III von 85% sowie die folgenden in vitro-Antikoagulans-Aktivitäten:
Anti-Xa 550 E/mg
APTT 290 E/mg

BEISPIEL 3

10 mg zu 80% N-sulfatiertes und zu 55% epimerisiertes K5 wurden wie in Beispiel 1 behandelt, mit der Ausnahme, daß das Produkt nach der N-Resulfatierung bei einer Temperatur von 65ºC mit 10 ml wasserfreiem Dimethylformamid, das 0,51 g Pyridin-Schwefeltrioxid, welches unter Rühren zugesetzt worden war, enthielt, behandelt wurde.
Nach 2 Stunden wurden weitere 10 ml wasserfreies Dimethylformamid, das 0,51 g Pyridin-Schwefeltrioxid enthielt, zugesetzt und die Reaktion wurde für weitere 5 Stunden fortgesetzt.
Das. Produkt wurde wie in Beispiel 1 entsalzt.
Das erhaltene Produkt weist ein Sulfat/Carboxyl-Verhältnis von 2,5 auf, hat einen Gehalt an N-Sulfaten von 80%, einen Gehalt von 6-O-Sulfaten von 100%, einen Gehalt von 2-O-Sulfaten von 65%, einen Gehalt an 3-O- Sulfaten von 5%, eine Fraktionsaffinität zu AT III von 70% und die folgenden in vitro-Antikoagulans-Aktivitäten:
Anti-Xa 450 E/mg
APTT 270 E/mg
In Tabelle 2 wurden die Daten bezüglich der Charakteristika der Produkte der Beispiele zusammengefaßt; daraus läßt sich insbesondere entnehmen, daß die Antikoagulans-Aktivität mit Abnahme des Iduronsäure- Gehaltes abnimmt.

BEISPIEL 4

10 mg des Produktes, das in Beispiel 3 erhalten wurde, werden in 10 ml destilliertem Wasser gelöst und mit 0,34 mg Natriumnitrid versetzt. Der pH wird unverzüglich mit 0,01 N Salzsäure auf 2,5 begracht. Nach 40 Minuten wird die Lösung mit Natriumhydroxid neutralisiert und die Verbindung wird durch Ausfällung mit 3 Volumina Ethanol isoliert und dann im Vakuumofen getrocknet.
Die erhaltene Verbindung zeigt ein Sulfat/Carboxy-Verhältnis von 2,2, einen N-Sulfat-Gehalt von 70%, einen 6-O-Sulfat-Gehalt von 65%, einen 2-O-Sulfat-Gehalt von 60%, einen 3-O-Sulfat-Gehalt von 4%, eine Fraktion mit hoher Aktivität für ATIII von 40% und die folgenden in vitro-Antikoagulans-Aktivitäten:
Anti-Xa 200 E/mg
APTT 70 E/mg TABELLE 2
In den Fig. 2, 3 und 4 werden die Daten, die die Affinität für Antithrombin III betreffen, für die Produkte der Beispiele 1, 2 und 3 angegeben, während in Fig. 1 zum Vergleich dieselben Daten für Heparin angegeben sind.
In den Figuren bedeutet:
- mAbs 530 nm Milliextinktion, bestimmt bei 530 nm;
- LA eine Fraktion mit geringer Affinität für das Antithrombin III;
- HA eine Fraktion mit hoher Affinität für das Antithrombin III.
Diese Daten bestätigen, was als Kommentar zur Tabelle 2 angegeben ist.

Claims

1. Derivate des K5-Polysaccharids, die N-deacetyliert, N-sulfatiert, mindestens zu 50% zu Iduronsäure, bezogen auf die gesamten Uronsäuren, epimerisiert sind und aufweisen:

Sulfat/Carboxyl-Verhältnis 2,2 bis 2,5

Gehalt an N-Sulfaten 70 bis 100%

Gehalt an 6-O-Sulfaten 70 bis 90%

Gehalt an 2-O-Sulfaten 50 bis 60%

Gehalt an 3-O-Sulfaten 5 bis 10%

Ketten mit Affinität zu Antithrombin III

nach M. Hook et al.,

FEBS letters 66, 1976, 90-9340 bis 100%

Anti-Xa 500 bis 600

APTT 250 bis 320

2. Verfahren zur Herstellung der Derivate nach Anspruch 1, umfassend die folgenden Schritte:

a) das K5-Polysaccharid wird N-deacetyliert;

b) das in Schritt a) erhaltene Produkt wird N-sulfatiert;

c) das in Schritt b) erhaltene Produkt wird mindestens zu einem Iduronsäure-Gehalt von 50%, bezogen auf die Gesamturonsäuren, epimerisiert, dadurch gekennzeichnet, daß das in Schritt c) erhaltene Produkt gemäß den folgenden Schritten weiter behandelt wird:

d) das in Schritt c) erhaltene Produkt wird in Wasser gelöst und durch eine Säule, die ein Kationenaustauscherharz enthält, laufen gelassen;

e) die in Schritt d) erhaltene Lösung wird mit einer organischen Base umgesetzt;

f) die in Schritt e) erhaltene Lösung wird gefriergetrocknet und das erhaltene Produkt wird in einem organischen Lösungsmittel wieder aufgelöst und mit einem Sulfatierungsmittel unter Erreichung der O-Sulfatierung behandelt;

g) das in Schritt f) erhaltene Produkt wird präzipitiert, in destilliertem Wasser wieder aufgelöst und gegen destilliertes Wasser dialysiert;

h) das in Schritt g) erhaltene Produkt wird, wenn notwendig, mit einem Sulfatierungsmittel behandelt, um die N-Resulfatierung im Fall N-desulfatierter Gruppen zu erreichen und gegebenenfalls wird das erhaltene Produkt durch kontrollierten Abbau mit salpetriger Säure depolymerisiert.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die in Schritt d) erhaltene Lösung einen pH im Bereich von 0,5 bis 1,5 hat.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die in Schritt e) verwendete organische Base aus der Gruppe bestehend aus Trimethylamin, Triethylamin und Tributylamin ausgewählt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge an organischer Base, die in Schritt e) verwendet wird, so ist, daß ein Lösungs-pH im Bereich von 6,5 bis 7,0 erhalten wird;

6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das in Schritt f) verwendete organische Lösungsmittel aus wasserfreiem Dimethylformamid besteht.

7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Sulfatierungsmittel, das in Schritt f) verwendet wird, aus der Gruppe bestehend Pyridin-Schwefeltrioxid, Trimethylamin-Schwefeltrioxid, Triethylamin-Schwefeltrioxid, Tripropylamin-Schwefeltrioxid und Tributylamin-Schwefeltrioxid ausgewählt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung mit einem Sulfatierungsmittel der Stufe f) bei einer Temperatur im Bereich von -5 bis 60ºC über einen Zeitraum im Bereich von 10 bis 24 h durchgeführt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Präzipitation des Schrittes g) durchgeführt wird, indem die in Schritt f) erhaltene Lösung mit einem gleichen Wasservolumen verdünnt wird, der pH auf 9 eingestellt wird, 4 Volumina Alkohol, der mit Natriumacetat gesättigt ist, zugesetzt werden, und die Temperatur für einen Zeitraum im Bereich von 10 bis 15 h zwischen 3 und 5ºC gehalten wird.

10. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Sulfatierungsmittel, das in Schritt h) verwendet wird, aus der Gruppe bestehend aus Pyridin-Schwefeltrioxid, Trimethylamin-Schwefeltrioxid, Triethylamin-Schwefeltrioxid, Tripropylamin-Schwefelttrioxid und Tributylamin-Schwefeltrioxid ausgewählt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die N- Resulfatierungsreaktion des Schrittes h) bei pH 9, bei einer Temperatur im Bereich von 50 bis 60ºC über einen Zeitraum, der von 5 bis 10 h reicht, durchgeführt wird.

12. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die für die Antikoagulans- Behandlung in der Humantherapie geeignet sind und aus wirksamen Mengen der Derivate des K5-Polysaccharids, wie sie in Anspruch 1 beansprucht werden, in Kombination mit pharmakologisch annehmbaren Arzneimittelträgersubstanzen oder Verdünnungsmitteln bestehen.