DE60125245T2

DE60125245T2 - Stress-gekoppeltes protein kinase protein sowie dessen verwendung in pflanzen

Info

Publication number: DE60125245T2
Application number: DE60125245T
Authority: DE
Inventors: Oswaldo Apex DA COSTA E SILVA; J. Hans Research Triangle Park BOHNERT; Nocha Cary VAN THIELEN; Ruoying Apex CHEN; Rodrigo Morrisville SARRIA-MILLAN
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2000-04-07
Filing date: 2001-04-06
Publication date: 2007-04-19
Anticipated expiration: 2021-04-07
Also published as: EP2175028A2; US20080189806A1; US7435875B2; EP2169069A3; US7855324B2; US20090144859A1; US20040107463A1; DE60123079D1; CA2767239A1; US7179962B2; ES2272461T3; US20040148658A1; WO2001077356A3; WO2001077161A3; ATE348181T1; EP1373530A2; AU2002243190A1; ATE475715T1; US20100325759A1; CA2767270A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft im Allgemeinen Nukleinsäuresequenzen, die für Proteine kodieren, die mit abiotischen Stressantworten und einer abiotischen Stresstoleranz in Pflanzen assoziiert sind. Im Besonderen betrifft diese Erfindung Nukleinsäuresequenzen, die für Proteine kodieren, welche Pflanzen eine Trockentoleranz verleihen.
Stand der Technik
Abiotische Umweltstressoren, wie z.B. Trockenstress, Salzstress, Hitzestress und Kältestress stellen die Hauptlimitierungsfaktoren von Pflanzenwachstum und Produktivität dar. Ernteverluste und Ernteertragsverluste der Hauptanbaupflanzen wie z.B. Reis, Mais (Korn) und Weizen, die durch diese Stressoren verursacht werden, stellen einen signifikanten ökonomischen und politischen Faktor dar und tragen zur Nahrungsmittelknappheit in vielen unterentwickelten Ländern bei.
Typischerweise sind Pflanzen während ihres Lebenszyklusses den Bedingungen eines reduzierten Umweltwasserhaushaltes ausgesetzt. Die meisten Pflanzen haben Strategien entwickelt, sich selbst gegen diese Austrocknungsbedingungen zu schützen. Wird jedoch die Schwere und Dauer der Trockenbedingungen zu groß, werden die Effekte auf die Pflanzenentwicklung, das Wachstum und den Ertrag der meisten Anbaupflanzen tiefgreifend. Weiterhin sind die meisten der Anbaupflanzen sehr empfindlich gegenüber hohen Salzkonzentrationen im Boden. Die kontinuierliche Belastung durch Trockenheit und Hochsalzbedingungen verursacht bedeutende Störungen in dem Pflanzenmetabolismus. Diese bedeutenden Änderungen im Metabolismus führen letztendlich zum Zelltod und konsequenter Weise zu Ernteverlusten.
Die Entwicklung stresstoleranter Pflanzen ist eine Strategie, die das Potential besitzt, zumindest einige dieser Probleme zu lösen oder zu vermitteln. Jedoch sind traditionelle Pflanzenzüchtungsstrategien zur Entwicklung neuer Pflanzenlinien, die eine Resistenz (Toleranz) zu diesen Stresstypen besitzen, relativ langsam und benötigen spezifische Resistenzlinien zur Kreuzung mit der gewünschten Linie. Limitierte Protoplasmareserven für Stresstoleranz und Inkompatibilität in Kreuzungen zwischen entfernt verwandten Pflanzenarten repräsentieren signifikante Probleme, die in der konventionellen Züchtung angetroffen werden. Zusätzlich sind die zellulären Prozesse, die zu Trocken-, Kälte- und Salztoleranz im Modell führen in trocken- und/oder salztoleranten Pflanzen in der Natur komplex und beinhalten vielfältige Mechanismen der zellulären Anpassung und zahlreiche Stoffwechselwege. Diese Mehrkomponentennatur der Stresstoleranz führte nicht nur zu einem großen Misserfolg der Toleranzzüchtung sondern auch zu einer Limitierung der Fähigkeit, Stresstoleranzpflanzen unter Verwendung biotechnologischer Verfahren genetisch zu konstruieren.
Trocken-, Kälte- sowie Salzstressoren weisen ein für das Pflanzenwachstum bedeutendes Motiv, nämlich Wasserverfügbarkeit auf. Pflanzen sind während ihres gesamten Lebenszyklus den Bedingungen eines reduzierten Umweltwasserhaushaltes ausgesetzt. Die meisten Pflanzen haben Strategien entwickelt, um sich selbst gegen diese Austrocknungsbedingungen zu schützen. Sind jedoch die Schwere und Dauer der Trockenbedingungen zu groß, werden die Effekte auf die Pflanzenentwicklung, das Wachstum und die Erträge der meisten Anbaupflanzen zu tiefgreifend. Da ein hoher Salzgehalt in einigen Böden in einer geringeren Wasserverfügbarkeit für die Zellaufnahme resultiert, ist der Effekt des hohen Salzgehaltes ähnlich dem, der unter Trockenbedingungen beobachtet wird. Zusätzlich verlieren Pflanzenzellen unter Frosttemperaturen Wasser als ein Ergebnis der Eisbildung, die in den Apoplasten beginnt und Wasser aus den Symplasten entzieht. Glücklicherweise weisen die Mechanismen der molekularen Antwort der Pflanzen auf jede dieser Stressbedingungen Gemeinsamkeiten auf und Proteinkinasen spielen bei diesen molekularen Mechanismen eine essenzielle Rolle.
Proteinkinasen repräsentieren eine Überfamilie und die Mitglieder dieser Familie katalysieren den reversiblen Transfer einer Phosphatgruppe von ATP auf Serin-, Threonin- und Tyrosin-Aminosäureseitenketten der Zielproteine. Proteinkinasen sind Primärglieder in Signalprozessen in Pflanzen und es wurde gezeigt, dass sie entscheidende Rollen in der Wahrnehmung und Weiterleitung von Signalen spielen, die es einer Zelle (und der Pflanze) ermöglichen, auf Umweltstimulatoren zu reagieren. Insbesondere repräsentieren Rezeptorproteinkinasen (RPK's) eine Gruppe von Proteinkinasen, die eine Komplexanordung intrazellulärer Signalwege in Antwort auf die extrazelluläre Umgebung aktivieren (Van der Gear et al., 1994 Annu. Rev. Cell Biol. 10: 251–337). RPK's sind Transmembranproteine, die die Membran einmal durchziehen und die eine aminoterminale Signalsequenz, rezeptorspezifische extrazelluläre Domänen und eine zytoplasmatische Kinasedomäne enthalten. Eine Ligandenbindung induziert eine Homo- oder Heterodimerisierung der RPK und die resultierende enge Nähe der zytoplasmatischen Domänen resultiert in einer Kinaseaktivierung durch Transphosphorylierung. Obwohl Pflanzen viele Proteine aufweisen, die RPK's ähnlich sind, wurde für diese rezeptorartigen Kinasen (RLK's) kein Ligand identifiziert. Die Mehrheit der identifizierten Pflanzen RLK's gehören zur Familie der Serin/Threonin-(Ser/Thr-)Kinasen, wobei die meisten extrazelluläre Leucin-reiche Wiederholungen aufweisen (Becraft, P. W. 1998 Trends Plant Sci. 3: 384–388).
Ein anderer Proteinkinasetyp ist die Ca+-abhängige Proteinkinase (CDPK). Dieser Kinasetyp hat eine Calmodulin-artige Domäne an dem COOH Terminus, welche eine direkte Antwort auf Ca+-Signale ermöglicht, ohne das Calmodulin anwesend ist. Gegenwärtig gelten CDPK als die am weitesten verbreiteten Ser/Thr-Proteinkinasen, die in höheren Pflanzen gefunden werden. Obwohl ihre physiologischen Rollen unklar bleiben, werden sie bei Kälte, Trockenheit und Abszisinsäure (ABA) (Knight et al., 1991 Nature 352: 524; Schroeder, JI und Thuleau, P, 1991 Plant Cell 3: 555; Bush, D. S. 1995 Annu. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Biol. 46: 95; Urao, T. et al., 1994 Mol. Gen. Genet. 244: 331) induziert.
Ein anderer Typ eines Signalmechanismus beinhaltet Mitglieder der konservierten SNF 1 Serin/Threonin-Proteinkinasefamilie. Diese Kinasen spielen essenzielle Rollen in der eukaryontischen Glukose- und Stresssignalübertragung. Pflanzen SNF 1-artige Kinasen sind an der Kontrolle von metabolischen Schlüsselenzymen einschließlich HMGR, Nitratreduktase, Saccharose-Synthase und Saccharosephosphat-Synthase (SPS) beteiligt. Genetische und biochemische Daten deuten darauf hin, dass die zuckerabhängige Regulation der SNF 1 Kinasen mehrere andere Sinnes- und Signalbestandteile in Hefe, Pflanzen und Tieren umfasst.
Zusätzlich sind Mitglieder der Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) Familie in die Aktionen zahlreicher Umweltstressoren in Tieren, Hefen und Pflanzen involviert. Es wurde gezeigt, dass sowohl MAPK-artige Kinaseaktivität als auch mRNA-Pegel von Bestandteilen der MAPK-Kaskaden in Reaktion auf Umweltstress und Pflanzenhormon-Signaltransduktion ansteigen. MAP-Kinasen sind Bestandteile aufeinander folgender Kinasekaskaden, welche durch Phosphorylierung der Threonin- und Tyrosinreste durch dazwischen liegend stromaufwärts gelegene MAP-Kinasekinasen (MAPKK's) aktiviert werden. Die MAPKK's werden selbst durch Phosphorylierung an Serin- und Threoninresten durch stromaufwärts gelegene Kinasen (MAPKKK's) aktiviert. in höheren Pflanzen sind eine Vielzahl von MAP-Kinase-Genen bekannt.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung erfüllt zum Teil den Bedarf, neue, einzigartige Proteinkinasen zu identifizieren, die nach Überexpression in der Lage sind, Pflanzen eine Stresstoleranz zu verleihen. Die vorliegende Erfindung stellt eine transgene Pflanzenzelle bereit, die mit einer Nukleinsäure, die für ein Proteinkinase stressspezifisches Protein („Protein Kinase Stress-Related Protein"; PKSRP) kodiert, transformiert ist, wobei die Expression der Nukleinsäuresequenz in der Pflanzenzelle zu einer, verglichen mit einer Wildtypvarietät der Pflanzenzelle, erhöhten Toleranz gegenüber Umweltstress führt. Namentlich hierin beschrieben ist die Ser/Thr-Proteinkinase PK-6 aus Physcomitrella patens.
Die Erfindung stellt in einigen Ausführungsformen bereit, dass das PKSRP und die kodierende Nukleinsäure die sind, die in Mitgliedern der Gattung Physcomitrella gefunden wurden. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die Nukleinsäure und das Protein aus Physcomitrella patens. Die Erfindung stellt bereit, dass es sich bei dem Umweltstress um Trockenheit handelt.
Die Erfindung stellt weiterhin einen von einer transgenen Pflanze, die mit einer PKSRP kodierenden Nukleinsäure transformiert ist, produzierten Samen bereit, wobei die Pflanze sortenecht in Bezug auf eine, verglichen mit einer Wildtypvarietät der Pflanze, erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress ist. Die Erfindung stellt weiterhin einen von einer ein PKSRP exprimierenden transgenen Pflanze produzierten Samen bereit, wobei die Pflanze sortenecht in Bezug auf eine, verglichen mit einer Wildtypvarietät der Pflanze, erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress ist.
Die Erfindung stellt weiterhin ein Landwirtschaftsprodukt bereit, dass durch jedes der unten beschriebenen transgenen Pflanzen, Pflanzenteile oder Samen produziert wird. Die Erfindung stellt weiterhin ein isoliertes PKSRP wie unten beschrieben bereit. Die Erfindung stellt weiterhin eine isolierte PKSRP kodierende Nukleinsäure bereit, worin die PKSRP kodierende Nukleinsäure für ein PKSRP wie unten beschrieben kodiert.
Die Erfindung stellt weiterhin einen isolierten rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine PKSRP kodierende Nukleinsäure wie unten beschrieben bereit, worin die Expression des Vektors in einer Wirtszelle zu einer, verglichen mit einer Wildtypvarietät der Wirtszelle, erhöhten Toleranz gegenüber Umweltstress führt. Die Erfindung stellt weiterhin eine den Vektor enthaltende Wirtszelle und eine die Wirtszelle enthaltende Pflanze bereit.
Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Produktion einer transgenen Pflanze mit einer PKSRP kodierenden Nukleinsäure bereit, worin die Expression der Nukleinsäure in der Pflanze zu einer, verglichen mit einer Wildtypvarietät der Pflanze, erhöhten Toleranz gegenüber Umweltstress führt, umfassend: (a) Transformieren einer Pflanzenzelle mit einem Expressionsvektor, umfassend eine PKSRP kodierende Nukleinsäure und (b) Erzeugen einer transgenen Pflanze mit einer, verglichen mit einer Wildtypvarietät der Pflanze, erhöhten Toleranz gegenüber Umweltstress aus der Pflanzenzelle. In bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich um das unten beschriebene PKSRP und die unten beschriebene PKSRP kodierende Nukleinsäure.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zur Modifikation der Stresstoleranz einer Pflanze bereit, umfassend eine Modifikation der Expression einer PKSRP kodierenden Nukleinsäure in der Pflanze, worin es sich bei dem PKSRP um ein PKSRP wie unten beschrieben handelt. Die Erfindung stellt weiterhin bereit, dass diese Methode so ausgeführt werden kann, dass die Stresstoleranz entweder erhöht oder erniedrigt wird. Trockenstress wird in einer Pflanze durch eine Erhöhung der Expression einer PKSRP Nukleinsäure erhöht.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1(A–M) zeigen die partiellen cDNA-Sequenzen von PK-6 (SEQ ID NO: 1), PK-7 (SEQ ID NO: 2), PK-8 (SEQ ID NO: 3), PK-9 (SEQ ID NO: 4), CK-1 (SEQ ID NO: 5), CK-2 (SEQ ID NO: 6), CK-3 (SEQ ID NO: 7), MPK-2 (SEQ ID NO: 8), MPK-3 (SEQ ID NO: 9), MPK-4 (SEQ ID NO: 10), MKP-5 (SEQ ID NO: 11), CKP-1 (SEQ ID NO: 12) und CPK-2 (SEQ ID NO: 13) aus Physcomitrella patens.
2(A–M) zeigen die vollständigen cDNA Sequenzen von PK-6 (SEQ ID NO: 14), PK-7 (SEQ ID NO: 15), PK-8 (SEQ ID NO: 16), PK-9 (SEQ ID NO: 17), CK-1 (SEQ ID NO: 18), CK-2 (SEQ ID NO: 19), CK-3 (SEQ ID NO: 20), MPK-2 (SEQ ID NO: 21), MPK-3 (SEQ ID NO: 22), MPK-4 (SEQ ID NO: 23), MPK-5 (SEQ ID NO: 24), CPK-1 (SEQ ID NO: 25) und CPK-2 (SEQ ID NO: 26) aus Physcomitrella patens.
3(A–M) zeigen die abgeleiteten Aminosäuresequenzen von PK-6 (SEQ ID NO: 27), PK-7 (SEQ ID NO: 28), PK-8 (SEQ ID NO: 29), PK-9 (SEQ ID NO: 30), CK-1 (SEQ ID NO: 31), CK-2 (SEQ ID NO: 32), CK-3 (SEQ ID NO: 33), MPK-2 (SEQ ID NO: 34), MPK-3 (SEQ ID NO: 35), MPK-4 (SEQ ID NO: 36), MPK-5 (SEQ ID NO: 37), CPK-1 (SEQ ID NO: 38) und CPK-2 (SEQ ID NO: 39) aus Physcomitrella patens.
4 zeigt ein Diagramm des Pflanzenexpressionsvektors pBPSSC 022, enthaltend den Superpromotor, der die Expression der SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 und 26 („gewünschte Gene") steuert. Die Verbindungen sind: NPTII Kanamycin-Resistenzgen (Bevan M, Nucleic Acids Res. 26: 8711–21, 1984), AtAct2-i promoter (An YQ et al., Plant J 10: 107–121 1996), OCS3-Terminator (During K Transgenic Res. 3: 138–140, 1994), NOSpA-Terminator (Jefferson et al., EMBO 36: 3901–7 1987).
5 zeigt die Ergebnisse eines Trockenstresstests mit überexprimierenden PpPK-6 transgenen Pflanzen und Wildtyp Arabidopsis-Linien. Die transgenen Linien zeigen einen toleranten Phänotyp an. Es sind individuelle Transformantenlinien gezeigt.
6 zeigt die Ergebnisse eines Trockenstresstests mit überexprimierenden PPK-7 transgenen Pflanzen und Wildtyp Arabidopsis-Linien. Die transgenen Linien zeigen einen toleranten Phänotyp an. Es sind individuelle Transformantenlinien gezeigt.
7 zeigt die Ergebnisse eines Kältestresstests mit überexprimierenden PPK-7 transgenen Pflanzen und Wildtyp Arabidopsis-Linien. Die transgenen Linien zeigen einen toleranten Phänotyp an. Es sind individuelle Transformantenlinien gezeigt.
8 zeigt die Ergebnisse eines Trockenstresstests mit überexprimierenden PPK-9 transgenen Pflanzen und Wildtyp Arabidopsis-Linien. Die transgenen Linien zeigen einen toleranten Phänotyp an. Es sind individuelle Transformantenlinien gezeigt.
9 zeigt die Ergebnisse eines Kältestresstests mit überexprimierenden PPK-9 transgenen Pflanzen und Wildtyp Arabidopsis-Linien. Die transgenen Linien zeigen einen toleranten Phänotyp an. Es sind individuelle Transformantenlinien gezeigt.
10 zeigt die Ergebnisse eines Trockenstresstests mit überexprimierenden PpCK-1 transgenen Pflanzen und Wildtyp Arabidopsis-Linien. Die transgenen Linien zeigen einen toleranten Phänotyp an. Es sind individuelle Transformantenlinien gezeigt.
11 zeigt die Ergebnisse eines Kältestresstests mit überexprimierenden PpCK-1 transgenen Pflanzen und Wildtyp Arabidopsis-Linien. Die transgenen Linien zeigen einen toleranten Phänotyp an. Es sind individuelle Transformantenlinien gezeigt.
12 zeigt die Ergebnisse eines Trockenstresstests mit überexprimierenden PpCK-2 transgenen Pflanzen und Wildtyp Arabidopsis-Linien. Die transgenen Linien zeigen einen toleranten Phänotyp an. Es sind individuelle Transformantenlinien gezeigt.
13 zeigt die Ergebnisse eines Trockenstresstests mit überexprimierenden PpCK-3 transgenen Pflanzen und Wildtyp Arabidopsis-Linien. Die transgenen Linien zeigen einen toleranten Phänotyp an. Es sind individuelle Transformantenlinien gezeigt.
14 zeigt die Ergebnisse eines Trockenstresstests mit überexprimierenden PpMPK-2 transgenen Pflanzen und Wildtyp Arabidopsis-Linien. Die transgenen Linien zeigen einen toleranten Phänotyp an. Es sind individuelle Transformantenlinien gezeigt.
15 zeigt die Ergebnisse eines Kältestresstests mit überexprimierenden PpMPK-2 transgenen Pflanzen und Wildtyp Arabidopsis-Linien. Die transgenen Linien zeigen einen toleranten Phänotyp an. Es sind individuelle Transformantenlinien gezeigt.
16 zeigt die Ergebnisse eines Trockenstresstests mit überexprimierenden PpMPK-3 transgenen Pflanzen und Wildtyp Arabidopsis-Linien. Die transgenen Linien zeigen einen toleranten Phänotyp an. Es sind individuelle Transformantenlinien gezeigt.
17 zeigt die Ergebnisse eines Kältestresstests mit überexprimierenden PpMPK-3 transgenen Pflanzen und Wildtyp Arabidopsis-Linien. Die transgenen Linien zeigen einen toleranten Phänotyp an. Es sind individuelle Transformantenlinien gezeigt.
18 zeigt die Ergebnisse eines Trockenstresstests mit überexprimierenden PpMPK-4 transgenen Pflanzen und Wildtyp Arabidopsis-Linien. Die transgenen Linien zeigen einen toleranten Phänotyp an. Es sind individuelle Transformantenlinien gezeigt.
19 zeigt die Ergebnisse eines Trockenstresstests mit überexprimierenden PpMPK-5 transgenen Pflanzen und Wildtyp Arabidopsis-Linien. Die transgenen Linien zeigen einen toleranten Phänotyp an. Es sind individuelle Transformantenlinien gezeigt.
20 zeigt die Ergebnisse eines Trockenstresstests mit überexprimierenden PpCPK-1 transgenen Pflanzen und Wildtyp Arabidopsis-Linien. Die transgenen Linien zeigen einen toleranten Phänotyp an. Es sind individuelle Transformantenlinien gezeigt.
21 zeigt die Ergebnisse eines Trockenstresstests mit überexprimierenden PpCPK-2 transgenen Pflanzen und Wildtyp Arabidopsis-Linien. Die transgenen Linien zeigen einen toleranten Phänotyp an. Es sind individuelle Transformantenlinien gezeigt.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung kann unter Bezug auf die folgende ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung und der hierin enthaltenen Beispiele leichter verstanden werden. Es ist zu verstehen, dass die hierin verwendete Terminologie nur für den Zweck der Beschreibung spezifischer Ausführungsformen verwendet wird und nicht dazu gedacht ist, limitierend zu sein. Insbesondere limitiert die Bezeichnung der Aminosäuresequenzen als Protein „Proteinkinase-stressspezifische Proteine" (PKSRP's) in keiner Weise die Funktionalität dieser Sequenzen.
Die vorliegende Erfindung stellt eine mit einer PKSRP kodierenden Nukleinsäure transformierte transgene Pflanzenzelle bereit, worin die Expression der Nukleinsäuresequenz in der Pflanzenzelle zu einer, verglichen mit einer Wildtypvarietät der Pflanzenzelle, erhöhten Toleranz gegenüber Umweltstress führt.
Die Erfindung stellt weiterhin transgene Pflanzenteile und transgene Pflanzen bereit, die die hierin beschriebenen Pflanzenzellen enthalten. Auch wird ein von einer transgenen Pflanzenzelle, die mit einer PKSRP kodierenden Nukleinsäure transformiert ist, produzierter Pflanzensamen bereitgestellt, worin der Samen die PKSRP kodierende Nukleinsäure enthält und worin die Pflanze sortenecht in Bezug auf eine, verglichen mit einer Wildtypvarietät der Pflanze, erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress ist. Die Erfindung stellt weiterhin ein von einer transgenen Pflanze, die ein PKSRP exprimiert, produzierten Samen bereit, worin der Samen das PKSRP enthält und worin die Pflanze sortenecht in Bezug auf eine, verglichen mit einer Wildtypvarietät der Pflanze, erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress ist. Die Erfindung stellt auch ein von einer der unten beschriebenen transgenen Pflanzen, Pflanzenteilen und Pflanzensamen produziertes Landwirtschaftsprodukt bereit. In Bezug auf die Erfindung ist das PKSRP die Proteinkinase 6 (PK-6).
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Term „Varietät" auf eine Pflanzengruppe innerhalb einer Spezies, die gemeinsam beständige Merkmale aufweisen, die sie von der typischen Art und von anderen möglichen Varietäten innerhalb dieser Spezies unterscheiden. Solange sie mindestens ein unterscheidendes Merkmal besitzt, ist eine Varietät auch durch eine gewisse Variation zwischen den Individuen innerhalb der Varietät charakterisiert, hauptsächlich basierend auf der Mendel'schen Segregation der Merkmale innerhalb der Nachkommenschaft nachfolgender Generationen. Eine Varietät wird als „sortenecht" für ein besonderes Merkmal bezeichnet, wenn sie für dieses Merkmal in einem Ausmaß genetisch homozygot ist, dass, wenn die sortenechte Varietät selbstbefruchtend ist, eine signifikante Menge einer unabhängigen Segregation des Merkmals innerhalb der Nachkommenschaft nicht beobachtet wird. In der vorliegenden Erfindung ergibt sich das Merkmal aus der transgenen Expression einer oder mehrerer in eine Pflanzenvarietät eingeführter DNA Sequenzen.
Die vorliegende Erfindung beschreibt erstmals, dass das Physcomitrella patens PKSRP PK-6 nützlich für die Erhöhung einer Pflanzentoleranz gegenüber Umweltstress ist. Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung das isolierte PKSRP PK-6 bereit. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das PKSRP ausgewählt aus dem wie in SEQ ID NO: 27 definierten Proteinkinase-6 (PK-6) Protein. Homologe und Orthologe der Aminosäuresequenz sind wie unten definiert.
Die PKSRP's der vorliegenden Erfindung werden bevorzugt durch rekombinante DNA Techniken produziert. Zum Beispiel wird ein Nukleinsäuremolekül, das für das Protein kodiert in einen Expressionsvektor (wie unten beschrieben) kloniert, der Expressionsvektor wird in eine Wirtszelle (wie unten beschrieben) eingeführt und das PKSRP wird in der Wirtszelle exprimiert. Das PKSRP kann dann durch ein geeignetes Aufreinigungsschema unter Verwendung von Standardproteinreinigungstechniken aus den Zellen isoliert werden. Alternativ zur rekombinanten Expression kann ein PKSRP Polypeptid oder Peptid unter Verwendung von Standardpeptidsynthesetechniken chemisch synthetisiert werden. Darüber hinaus kann natives PKSRP aus Zellen (z.B. Physcomitrella patens) isoliert werden, z.B. unter Verwendung eines anti-PKSRP-Antikörpers, der unter Verwendung eines PKSRP oder eines Fragmentes davon durch Standardtechniken produziert werden kann.
Die Erfindung stellt weiterhin eine isolierte PKSRP-kodierende Nukleinsäure bereit. Die vorliegende Erfindung beinhaltet PKSRP-kodierende Nukleinsäuren, die für PKSRP's wie hierin beschrieben kodieren. In bevorzugten Ausführungsformen wird die PKSRP kodierende Nukleinsäure ausgewählt aus Proteinkinase-6(PK-6)-Nukleinsäure wie in SEQ ID NO: 14 definiert. Homologe und Orthologe der Nukleinsäuresequenzen werden unten definiert. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Nukleinsäure und das Protein aus der Pflanzengattung Physcomitrella isoliert. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die Nukleinsäure und das Protein aus einer Physcomitrella patens (P. patens) Pflanze.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Term „Umweltstress" auf jede suboptimale Wachstumsbedingung und beinhaltet, ist aber nicht beschränkt auf, suboptimale Bedingungen, die mit Salzgehalts-, Trockenheits-, Temperatur-, Metall-, chemischen, pathogenen und oxidativen Stressoren oder Kombinationen davon assoziiert sind. Die Erfindung stellt bereit, dass es sich bei dem Umweltstress um Trockenheit und speziell um einen geringen Wassergehalt handelt. Es ist auch selbstverständlich, dass „ein", wie in der Beschreibung und in den Ansprüchen verwendet, ein oder mehrere bedeuten kann, in Abhängigkeit von dem Kontext in dem es verwendet wird. Zum Beispiel kann der Bezug auf „eine Zelle" daher bedeuten, dass mindestens eine Zelle verwendet werden kann.
Wie ebenfalls hierin verwendet sind die Begriffe „Nukleinsäure" und „Nukleinsäuremolekül" vorgesehen, DNA-Moleküle (z.B. cDNA oder genomische DNA) und RNA Moleküle (z.B. mRNA) und Analoge der unter Verwendung von Nukleotidanalogen erzeugten DNA oder RNA einzubeziehen. Dieser Term umfasst auch eine nicht translatierte Sequenz, die sowohl an den 3'- als auch an den 5'-Enden der kodierenden Region des Gens lokalisiert ist: mindestens etwa 1000 Nukleotide einer Sequenz stromaufwärts des 5'-Endes der kodierenden Region und mindestens etwa 200 Nukleotide einer Sequenz stromabwärts des 3'-Endes der kodierenden Region des Gens. Das Nukleinsäuremolekül kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein, bevorzugt wird jedoch doppelsträngige DNA.
Ein „isoliertes" Nukleinsäuremolekül ist eines, dass im Wesentlichen von anderen Nukleinsäuremolekülen separiert ist, die in dem natürlichen Ursprung der Nukleinsäure vorhanden sind. Bevorzugt ist eine „isolierte" Nukleinsäure frei von einigen der Sequenzen, die natürlicherweise die Nukleinsäure in der genomischen DNA des Organismus, aus dem die Nukleinsäure abgeleitet wird, flankieren (d.h. Sequenzen die an den 5'- und 3'-Enden der Nukleinsäure lokalisiert sind). Zum Beispiel kann in verschiedenen Ausführungsformen das isolierte PKSRP-Nukleinsäuremolekül weniger als etwa 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb an Nukleotidsequenzen enthalten, die natürlicherweise das Nukleinsäuremolekül in der genomischen DNA der Zelle, aus dem die Nukleinsäure abgeleitet wird (z.B. eine Physcomitrella patens Zelle), flankieren. Darüber hinaus kann ein „isoliertes" Nukleinsäuremolekül, wie z.B. ein cDNA Molekül, frei von einigen der anderen zellulären Stoffe, mit denen es natürlicherweise assoziiert ist, oder, wenn durch rekombinante Techniken produziert, frei von Kulturmedium, oder, wenn chemisch synthetisiert, frei von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien sein.
Ein Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung, z.B. ein Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 14 oder einen Anteil davon aufweist, kann unter Verwendung von Standardtechniken der Molekularbiologie und der hierin bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden. Zum Beispiel kann eine P. patens PKSRP-cDNA aus einer P. patens Bibliothek unter Verwendung der Gesamtheit oder eines Anteils einer der Sequenzen von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 und SEQ ID NO: 13 isoliert werden. Darüber hinaus kann ein Nukleinsäuremolekül, das die Gesamtheit oder einen Anteil einer der Sequenzen von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 und SEQ ID NO: 13 umfasst, durch eine Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung von Oligonukleotid-Primern, die basierend auf dieser Frequenz konstruiert wurden, isoliert werden. Zum Beispiel kann mRNA aus einer Pflanzenzelle (z.B. durch das Guanidin-Thiocyanat Extraktionsverfahren von Chirgwin et al., 1979 Biochemistry 18: 5294–5299) isoliert werden und cDNA unter Verwendung einer reversen Transkriptase (z.B. Moloney MLV reverse Transkriptase, erhältlich von Gibco/BRL, Bethesda, MD; oder AMV reverse Transkriptase, erhältlich von Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL) präpariert werden. Synthetische Oligonukleotid-Primer für die Amplifikation durch eine Polymerase-Kettenreaktion können basierend auf einer der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 und SEQ ID NO: 13 gezeigten Nukleotidsequenzen konstruiert werden. Ein Nukleinsäuremolekül der Erfindung kann unter Verwendung von cDNA oder, alternativ, genomischer DNA als Templat und geeigneten Oligonukleotid-Primern gemäß Standard PCR-Amplifikationstechniken amplifiziert werden. Das so amplifizierte Nukleinsäuremolekül kann in einen geeigneten Vektor kloniert werden und durch DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Weiterhin können Oligonukleotide, die einer PKSRP-Nukleotidsequenz entsprechen, durch Standardsynthesetechniken, z.B. unter Verwendung eines automatisierten DNA-Syntheseapparates, präpariert werden.
Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül der Erfindung umfasst die in SEQ ID NO: 14 gezeigte Nukleotidsequenz. Diese cDNA umfasst eine das PKSRP kodierende Sequenz (d.h. die „kodierende Region", angegeben in Tabelle 1) sowie eine 5'-untranslatierte Sequenz und eine 3'-untranslatierte Sequenz. Es ist zu verstehen, dass SEQ ID NO: 14 sowohl eine kodierende Region als auch eine 5'- und eine 3'-untranslatierte Region umfasst. Alternativ kann das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung nur die kodierende Region von SEQ ID NO: 14 umfassen oder es kann die gesamten, aus der genomischen DNA isolierten, genomischen Fragmente enthalten. Eine kodierende Region dieser Sequenz ist als „ORF-Position" angegeben. Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch PKSRP kodierende Nukleinsäuren, die für das PKSRP PK-6 (SEQ ID NO: 27) kodieren.
Darüber hinaus kann das Nukleinsäuremolekül nur einen Teil der kodierenden Region der Sequenz SEQ ID NO: 14 umfassen, z.B. ein Fragment, das als eine Probe oder Primer verwendet werden kann, oder ein Fragment, das für einen biologisch aktiven Teil eines PKSRP kodiert. Die durch die Klonierung der PKSRP Gene aus P. patens determinierten Nukleotidsequenzen gestatten die Generierung von Proben und Primern, die für die Verwendung in der Identifikation und/oder Klonierung von PKSRP homologen in andere Zelltypen und Organismen sowie von PKSRP Homologen aus anderen Moosen und verwandten Spezies konstruiert wurden.
Die durch die PKSRP Nukleinsäuremoleküle kodierten Anteile von Proteinen sind vorzugsweise biologisch aktive Anteile von einem der hierin beschriebenen PKSRP's. Wie hierin verwendet, wird beabsichtigt, dass der Term „biologisch aktive Anteile von" einem PKSRP einen Anteil, z.B. eine Domäne/ein Motiv eines PKSRPs, das an der Trockenstresstoleranz-Antwort in einer Pflanze beteiligt ist, der eine wie in Tabelle 1 aufgeführte Aktivität aufweist oder an der Transkription eines Proteins beteiligt ist, das in die Trockenstresstoleranzantwort in einer Pflanze involviert ist, beinhaltet. Um zu bestimmen, ob ein PKSRP oder ein biologisch aktiver Anteil davon an der Transkription eines Proteins, das in eine Stresstoleranzantwort in einer Pflanze involviert ist, beteiligt sein kann, oder ob die Repression eines PKSRPs zu einer erhöhten Stresstoleranz in einer Pflanze führt, kann eine Stressanalyse von einer Pflanze, die das PKSRP umfasst, durchgeführt werden. Solche Analysemethoden sind einem Fachmann bekannt, wie in Beispiel 7 ausführlich beschrieben. Insbesondere können Nukleinsäurefragmente, die für biologisch aktive Anteile eines PKSRPs kodieren, durch Isolation eines Proteins der Sequenz SEQ ID NO: 27, Expression des kodierten Anteiles des PKSRPs oder des Peptids (z.B. durch rekombinante Expression in vitro) und durch Feststellen der Aktivität des kodierten Anteils des PKSRPs oder des Peptids bereitgestellt werden.
Biologisch aktive Anteile eines PKSRP's werden betrachtet und beinhalten Peptide, umfassend Aminosäuresequenzen, die aus der Aminosäuresequenz eines PKSRPs, z.B. einer Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 27 abgeleitet sind oder die Aminosäuresequenz eines Proteins, das homolog zu einem PKSRP ist, welche weniger Aminosäuren als das vollständige PKSRP oder das vollständige Protein, welches homolog zu einem PKSRP ist, beinhalten und mindestens eine Aktivität eines PKSRPs aufzeigen. Typischerweise umfassen biologisch aktive Anteile (z.B. Peptide, welche beispielsweise eine Länge von 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 oder mehr Aminosäuren aufweisen) eine Domäne oder ein Motiv mit mindestens einer Aktivität eines PKSRPs. Darüber hinaus können andere biologisch aktive Anteile, in denen andere Regionen des Proteins deletiert sind, durch rekombinante Techniken bereit gestellt werden und für eine oder mehrere der hierin beschriebenen Aktivitäten bewertet werden. Vorzugsweise beinhalten die biologisch aktiven Anteile eines PKSRPs eine oder mehrere ausgewählte Domänen bzw. ein oder mehrere ausgewählte Motive oder Anteile davon, die eine biologische Aktivität aufweisen.
Die Erfindung stellt auch PKSRP-Chimäre oder Fusionsproteine bereit. Wie hierin verwendet, umfasst ein PKSRP „chimäres Protein" oder „Fusionsprotein" ein PKSRP-Polypeptid, das operativ mit einem Nicht-PKSRP-Polypeptid verknüpft ist. Ein PKSRP-Polypeptid bezeichnet ein Polypeptid, das eine einem PKSRP entsprechende Aminosäuresequenz aufweist, wohingegen ein Nicht-PKSRP-Polypeptid ein Polypeptid bezeichnet, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die einem Protein entspricht, das im Wesentlichen nicht homolog zu dem PKSRP ist, z.B. ein Protein das von dem PKSRP verschieden ist, und aus demselben oder einem anderen Organismus abgeleitet ist. Innerhalb des Fusionsproteins ist vorgesehen, dass der Term „operativ verknüpft" kennzeichnet, dass das PKSRP Polypeptid und das Nicht-PKSRP-Polypeptid miteinander fusioniert sind, so dass beide Sequenzen die beabsichtigte Funktion erfüllen, die den verwendeten Sequenzen beizulegen sind. Das Nicht-PKSRP-Polypeptid kann an den N-Terminus oder den C-Terminus des PKSRP Polypeptids fusioniert werden. Zum Beispiel ist in einer Ausführungsform das Fusionsprotein ein GST-PKSRP Fusionsprotein, in dem die PKSRP Sequenzen an den C-Terminus der GST-Sequenzen fusioniert sind. Solche Fusionsproteine können die Aufreinigung rekombinanter PKSRP's ermöglichen. In einer anderen Ausführungsform ist das Fusionsprotein ein PKSRP, das eine heterologe Signalsequenz an seinem N-Terminus enthält. In bestimmten Wirtszellen (z.B. Säuger-Wirtszellen) kann die Expression und/oder die Sekretion eines PKSRPs durch die Verwendung einer heterologen Signalsequenz erhöht werden.
Bevorzugt wird ein PKSRP-Chimär oder ein Fusionsprotein der Erfindung durch Standard-rekombinante DNA Techniken hergestellt. Zum Beispiel werden DNA Fragmente, die für die verschiedenen Polypeptidsequenzen kodieren, miteinander „in frame" entsprechend konventioneller Techniken ligiert, z.B. durch Verwendung von stumpfen Enden („blunt-ended") oder klebrigen Enden („stagger-ended") für die Ligation, Restriktionsenzym-Verdau, um die entsprechenden Enden bereitzustellen, Auffüllen kohesiver Enden wenn zweckdienlich, Alkalische Phosphatase-Behandlung, um eine unerwünschte Verknüpfung und eine enzymatische Ligation zu vermeiden. In einer anderen Ausführungsform kann das Fusionsgen durch konventionelle Techniken, die automatisierte DNA-Synthesizer enthalten, synthetisiert werden. Alternativ kann eine PCR-Amplifikation von Genfragmenten unter Verwendung von Anker-Primern, die zu komplementären Überhängen zwischen zwei konsekutiven Genfragmenten führen, welche nachfolgend aneinander gelagert und reamplifiziert werden können, um eine chimäre Gensequenz zu generieren (siehe z.B. Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992), durchgeführt werden. Darüber hinaus sind viele Expressionsvektoren kommerziell erhältlich, die bereits für einen Fusionsanteil (z.B. ein GST-Polypeptid) kodieren. Eine PKSRP kodierende Nukleinsäure kann so in solch einem Expressionsvektor kloniert werden, dass der Fusionsanteil „in frame" mit dem PKSRP verknüpft wird.
Zusätzlich zu den hierin beschriebenen PKSRP-Fusionsproteinen werden Homologe und Analoge der natürlich auftretenden PKSRP's und PKSRP kodierenden Nukleinsäuren in einer Pflanze betrachtet. „Homologe" werden hierin als zwei Nukleinsäuren oder Proteine definiert, die entsprechend ähnliche oder „homologe" Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen aufweisen. Homologe beinhalten Allel-Varianten, Orthologe, Paraloge, Agonisten und Antagonisten von PKSRP's wie hiernach definiert. Der Term „Homologes" umfasst weiterhin Nukleinsäuremoleküle, die sich von der in SEQ ID NO: 14 gezeigten Nukleotidsequenz (und Anteilen davon) auf Grund der Degeneration des genetischen Codes unterscheiden und daher für dieselben PKSRP's kodieren, welche durch die in SEQ ID NO: 14 gezeigten Nukleotidsequenz kodiert werden. Wie hierin verwendet, bezieht sich ein „natürlich auftretendes" PKSRP auf eine PKSRP Aminosäuresequenz, die in der Natur auftritt. Bevorzugt umfasst ein natürlich auftretendes PKSRP die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 27.
Ein Agonist des PKSRP kann im Wesentlichen dieselbe oder eine Teilmenge der biologischen Aktivitäten des PKSRPs beinhalten. Ein Antagonist des PKSRPs kann eine oder mehrere der Aktivitäten der natürlich auftretenden Form des PKSRP inhibieren. Zum Beispiel kann der PKSRP Antagonist kompetitiv an ein stromabwärts oder stromaufwärts gelegenes Mitglied der metabolischen Kaskade der Zellmembranbestandteile binden, die das PKSRP beinhalten oder an ein PKSRP binden, das den Transport der Verbindungen durch solche Membranen vermittelt, wodurch das Stattfinden der Translokation verhindert wird.
Nukleinsäuremoleküle, die natürlichen Varianten und Analogen, Orthologen und Paralogen einer PKSRP-cDNA entsprechen, können basierend auf ihrer Identität zu der hierin beschriebenen Physcomitrella patens PKSRP Nukleinsäure unter Verwendung von PKSRP cDNA's oder eines Anteils davon als eine Hybridisierungsprobe gemäß den Standard-Hybridisierungstechniken unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden. In einer alternativen Ausführungsform können Homologe des PKSRPs durch das Durchsuchen kombinatorischer Bibliotheken von Mutanten, z.B. Verkürzungsmutanten, des PKSRPs nach PKSRP Agonisten- oder Antagonistenaktivität identifiziert werden. In einer Ausführungsform wird eine variegate Bibliothek von PKSRP Varianten durch kombinatorische Mutagenese auf der Nukleinsäure-Ebene generiert und durch eine variegate Genbibliothek kodiert. Eine variegate Bibliothek von PKSRP Varianten kann z.B. durch enzymatische Ligation einer Mixtur von synthetischen Oligonukleotiden in Gensequenzen produziert werden, so dass ein degenerierter Satz potenzieller PKSRP Sequenzen als individuelle Polypeptide oder alternativ als ein Satz größerer Fusionsproteine (z.B. für einen Phagendisplay), der den Satz von PKSRP Sequenzen enthält, exprimierbar wird. Es gibt eine Vielzahl von Methoden, die verwendet werden können, um Bibliotheken potenzieller PKSRP Homologe aus einer degenerierten Oligonukleotid-Sequenze zu produzieren. Eine chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem automatischen DNA Syntheseapparat durchgeführt werden und das synthetische Gen wird dann mit einem geeigneten Expressionsvektor ligiert. Die Verwendung eines degenerierten Satzes von Genen in einer Mischung gestattet die Bereitstellung all der Sequenzen, die für den gewünschten Satz potenzieller PKSRP Sequenzen kodieren. Methoden zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind im Stand der Technik bekannt (siehe z.B. Narang, S.A., 1983 Tetrahedron 39: 3; Itakura et al., 1984 Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al., 1984 Science 198: 1056; Ike et al., 1983 Nucleic Acid Res. 11: 477).
Zusätzlich können Bibliotheken von Fragmenten der PKSRP kodierenden Regionen verwendet werden, um eine variegate Population von PKSRP Fragmenten für ein Durchsuchen nach und anschließendes Selektieren von Homologen eines PKSRPs zu generieren. In einer Ausführungsform kann eine Bibliothek kodierender Sequenzfragmente durch Behandlung eines doppelsträngigen PCR Fragmentes einer PKSRP kodierenden Sequenz mit einer Nuklease unter Bedingungen, worin ein Strangbruch nur etwa einmal pro Molekül auftritt, durch Denaturierung der doppelsträngigen DNA, durch Renaturierung der DNA, um eine doppelsträngige DNA zu bilden, welche Sinn/Gegensinn-Paare („sense/antisense") von unterschiedlich geschnittenen Produkten beinhalten kann, durch Entfernen einzelsträngiger Anteile von neu gebildeten Duplexen durch Behandlung mit S1-Nuklease und durch Ligation der resultierenden Fragmentbibliothek in einem Expressionsvektor generiert werden. Durch diese Methode kann eine Expressionsbibliothek abgeleitet werden, die für die N-terminalen, C-terminalen und internen Fragmente verschiedener Größen des PKSRPs kodiert.
Verschiedene Techniken für das Durchsuchen ("Screening") nach Genprodukten von kombinatorischen Bibliotheken, die durch Mutationen oder Verkürzung hergestellt werden und für das Durchsuchen von cDNA-Bibliotheken für Genprodukte, die ausgewählte Eigenschaften aufweisen, sind im Stand der Technik bekannt. Solche Techniken sind für das schnelle Durchsuchen von Genbibliotheken, die durch kombinatorische Mutagenese von PKSRP Homologen generiert wurden, anpassungsfähig. Die am häufigsten verwendeten Techniken für das Durchsuchen großer Genbibliotheken, welche für eine Hochdurchsatzanalyse zugänglich sind, beinhalten typischerweise die Klonierung der Genbibliothek in replizierbare Expressionsvektoren, die Transformation geeigneter Zellen mit der resultierenden Vektorenbibliothek und die Expression der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, in welchen eine Detektion einer gewünschten Aktivität die Isolation des Vektors ermöglicht, der das Gen, dessen Produkt detektiert wurde, kodiert. Rekursive Komplettmutagenese („Recursive Ensemble Mutagenesis", REM), eine neue Technik, die die Häufigkeit funktioneller Mutanten in den Bibliotheken erhöht, kann in Kombination mit den Durchsuchungsexperimenten verwendet werden, um PKSRP Homologe zu identifizieren (Arkin und Yourvan, 1992 PNAS 89: 7811–7815; Delgrave et al., 1993 Protein Engineering 6(3): 327–331). In einer anderen Ausführungsform können zellbasierte Versuche genutzt werden, um eine variegate PKSRP Bibliothek unter Verwendung von Methoden, die im Stand der Technik gut bekannt sind, zu analysieren. Weiterhin wird eine Methode zur Identifikation eines neuen PKSRPs bereitgestellt, umfassend (a) Hervorrufen einer spezifischen Antikörperantwort zu einem PKSRP oder einem Fragment davon wie hierin beschrieben; (b) und Durchsuchen putativen PKSRP Materials mit dem Antikörper, worin die spezifische Bindung des Antikörpers an dem Material die Anwesenheit eines potenziell neuen PKSRPs angibt; und (c) Analysieren des gebundenen Materials im Vergleich zu bekannten PKSRP's, um seine Neuheit zu bestimmen.
Um den Homologieprozentsatz zweier Aminosäuresequenzen (z.B. SEQ ID NO: 27 und einer Mutantenform davon) zu bestimmen, werden die Sequenzen für optimale Vergleichszwecke abgeglichen (z.B. können Lücken in die Sequenz eines Proteins oder einer Nukleinsäure für einen optimalen Abgleich mit dem anderen Protein oder der anderen Nukleinsäure eingeführt werden). Die Aminosäurereste an korrespondierenden Aminosäurepositionen oder Nukleotidpositionen werden dann verglichen. Wenn eine Position in einer Sequenz (z.B. die Sequenz SEQ ID NO: 27) durch denselben Aminosäurerest wie die korrespondierende Position in der anderen Sequenz (z.B. eine Mutantenform der aus dem Polypeptid von SEQ ID NO: 27 ausgewählten Sequenz) besetzt ist, dann sind die Moleküle an dieser Position homolog (d.h. wie hierin verwendet ist eine Aminosäure- oder Nukleinsäure-„Homologie" äquivalent zu Aminosäure- oder Nukleinsäure-„Identität"). Dieselbe Vergleichsart kann zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen gemacht werden.
Der Homologieprozentsatz zwischen den 2 Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl identischer Positionen geteilt durch die Sequenzen (d.h. % – Homologie = Anzahl identischer Positionen/Gesamtanzahl der Positionen × 100). Bevorzugt sind die Aminosäuresequenzen, die in die vorliegende Erfindung einbezogen sind, mindestens 70%, bevorzugt mindestens etwa 70–80%, 80–90%, 90–95% und mehr bevorzugt mindestens etwa 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr homolog zu der gesamten, in SEQ ID NO: 27 gezeigten, Aminosäuresequenz. In noch einer anderen Ausführungsform sind mindestens 70%, bevorzugt mindestens etwa 70–80%, 80–90%, 90–95% und mehr bevorzugt mindestens etwa 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr homolog zu einer gesamten Aminosäuresequenz, die durch die in SEQ ID NO: 14 gezeigte Nukleinsäuresequenz kodiert wird.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst ein isoliertes Nukleinsäuremolekül der Erfindung eine Nukleotidsequenz, die mindestens etwa 80– 90% oder 90–95% und bevorzugt mindestens etwa 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr homolog zu der in SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 oder SEQ ID NO: 26 gezeigten Nukleotidsequenzen sind. Die Länge des Sequenzvergleiches für Nukleinsäuren ist die gesamte Länge der kodierenden Region.
Es ist auch bevorzugt, dass das homologe Nukleinsäuremolekül der Erfindung für ein Protein oder einen Anteil davon kodiert, welches bzw. welcher eine Aminosäuresequenz beinhaltet, die hinreichend homolog zu der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 27 ist, so dass das Protein oder der Anteil davon dieselbe oder eine ähnliche Funktion wie die Aminosäuresequenz, mit der es bzw. er verglichen wird, beibehalten. Funktionen der PKSRP Aminosäuresequenzen beinhalten die Fähigkeit, an einer Stresstoleranzantwort in einer Pflanze teilzunehmen, oder insbesondere an der Transkription eines Proteins, das in eine Stresstoleranzantwort in einer Physcomitrella patens Pflanze involviert ist, beteiligt zu sein. Beispiele solcher Aktivitäten werden in Tabelle 1 beschrieben.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen Methoden kann eine Bestimmung des Homologieprozentsatzes zwischen zwei Sequenzen unter Verwendung eines mathematischen Algorithmus erreicht werden. Ein bevorzugtes, nicht beschränkendes Beispiel eines mathematischen Algorithmus, der für den Vergleich zweier Sequenzen verwendet wurde, ist der Algorithmus von Karlin und Altschul (1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873–5877). Solch ein Algorithmus ist in die NBLAST und XBLAST-Programme von Altschul, et al. (1990 J. Mol. Biol. 215: 403–410) eingegliedert.
BLAST Nukleinsäure-Suchen können mit dem NBLAST-Programm, Punktzahl = 100, Wortlänge = 12 durchgeführt werden, um Nukleinsäuresequenzen zu erhalten, die homolog zu den PKSRP Nukleinsäuremolekülen der Erfindung sind. Zusätzlich können BLAST Protein-Suchen mit dem XBLAST-Programm, Punktzahl = 50, Wortlänge = 3 durchgeführt werden, um Aminosäuresequenzen zu erhalten, die homolog zu den PKSRP's der vorliegenden Erfindung sind. Um Lücken-aufweisende Abgleiche für Vergleichszwecke zu erhalten, kann „Gapped BLAST", wie in Altschul et al. (1997 Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402) beschrieben, verwendet werden. Wenn BLAST und Gapped BLAST-Programme verwendet werden, können die vorgegebenen Parameter der entsprechenden Programme (z.B. XBLAST und NBLAST) verwendet werden. Ein anderes bevorzugtes, nicht-beschränkendes Beispiel eines mathematischen Algorithmus, der für den Vergleich von Sequenzen verwendet wird, ist der Algorithmus von Myers und Miller (CABIOS 1989). Solch ein Algorithmus ist in das ALIGN-Programm (Version 2.0), das Teil des GCG Sequenzabgleichsoftwarepaketes ist, eingegliedert. Wird das ALIGN-Programm für einen Vergleich von Aminosäuresequenzen verwendet, kann eine PAM120-Wichtungsresttabelle („weight residue table"), ein Lückenlängennachteil („gap length penalty") von 12 und ein Lückennachteil („gap penalty") von 4 verwendet werden, um Aminosäuresequenzen zu erhalten, die homolog zu den PKSRP's der vorliegenden Erfindung sind. Um Lücken-aufweisende Abgleiche für Vergleichszwecke zu erhalten, kann Gapped BLAST wie in Altschul et al. (1997 Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402) beschrieben, verwendet werden. Werden BLAST und Gapped BLAST-Programme verwendet, können die vorgegebenen Parameter der entsprechenden Programme (z.B. XBLAST und NBLAST) verwendet werden. Ein anderes bevorzugtes, nicht-beschränkendes Beispiel eines mathematischen Algorithmus, der für den Vergleich von Sequenzen genutzt wird, ist der Algorithmus von Myers und Miller (CABIOS 1989). Solch ein Algorithmus ist in das ALIGN-Programm (Version 2.0), das Teil des GCG Sequenzabgleichsoftwarepaketes ist, eingegliedert. Wird das ALIGN-Programm für einen Vergleich von Aminosäuresequenzen verwendet, kann eine PAM120-Wichtungsresttabelle („weight residue table"), ein Lückenlängennachteil („gap length penalty") von 12 und ein Lückennachteil („gap penalty") von 4 verwendet werden, um Aminosäuresequenzen zu erhalten, die homolog zu den PKSRP's der vorliegenden Erfindung sind.
Schließlich kann die Homologie zwischen Nukleinsäuresequenzen auch unter Verwendung von Hybridisierungstechniken, die einem Fachmann bekannt sind, bestimmt werden. Entsprechend umfasst ein isoliertes Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz, die mit der in SEQ ID NO: 14 gezeigten Nukleotidsequenz oder eines Anteiles davon, z.B. unter stringenten Bedingungen, hybridisiert. Insbesondere ist ein isoliertes Nukleinsäuremolekül mindestens 15 Nukleotide lang und hybridisiert unter stringenten Bedingungen mit dem Nukleinsäuremolekül, das die Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 14 umfasst. In anderen Ausführungsformen beträgt die Länge der Nukleinsäure mindestens 30, 50, 100, 250 oder mehr Nukleotide.
Wie hierin verwendet ist der Term „hybridisiert unter stringenten Bedingungen" bestimmt, um Bedingungen für das Hybridisieren und Waschen zu beschreiben, unter denen Nukleotidsequenzen, die zueinander mindestens 60% homolog sind, typischerweise miteinander hybridisiert bleiben. Bevorzugt sind die Bedingungen solche, dass die Sequenzen, die mindestens etwa 65%, bevorzugter mindestens etwa 70% und noch bevorzugter mindestens etwa 75% oder mehr homolog zueinander sind, typischerweise miteinander hybridisiert bleiben. Solche stringenten Bedingungen sind einem Fachmann bekannt und können in Current Protocols in Molecular Biology, 6.3.1–6.3.6, John Wiley & Sons, N.Y. (1989) vorgefunden werden. Ein bevorzugtes, nicht beschränkendes Beispiel stringenter Hybridisierungsbedingungen ist eine Hybridisierung in 6 × Natriumchlorid/Natriumzitrat (SSC) bei etwa 45 Grad Celsius, gefolgt von einem Waschschritt oder mehreren Waschschritten in 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 50–65°C. Bevorzugt entspricht ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das unter stringenten Bedingungen mit der Sequenz SEQ ID NO: 14 hybridisiert, einem natürlich auftretenden Nukleinsäuremolekül. Wie hierin verwendet, bezeichnet ein „natürlich auftretendes" Nukleinsäuremolekül ein RNA oder DNA-Molekül, das eine Nukleotidsequenz aufweist, die in der Natur auftritt (z.B. für ein natürliches Protein kodiert). In einer Ausführungsform kodiert die Nukleinsäure für ein natürlich auftretendes Physcomitrella patens PKSRP.
Unter Verwendung der oben beschriebenen Methoden und anderen, die einem Fachmann bekannt sind, kann ein Durchschnittsfachmann Homologe des PKSRPs, umfassend die in SEQ ID NO: 27 gezeigte Aminosäuresequenz, isolieren. Eine Teilmenge dieser Homologen sind Allelvarianten. Wie hierin verwendet bezieht sich der Term „Allelvariante" auf eine Nukleotidsequenz, die Polymorphismen enthält, die zu Änderungen in den Aminosäuresequenzen eines PKSRPs führen und die innerhalb einer natürlichen Population (z.B. einer Pflanzenspezies oder Varietät) existieren. Solche Allelvariationen können typischerweise zu einer Varianz in einer PKSRP Nukleinsäure von 1–5% führen. Allelvarianten können durch Sequenzierung der interessierenden Nukleinsäuresequenz in einer Anzahl unterschiedlicher Pflanzen identifiziert werden, was unter Verwendung von Hybridisierungsproben leicht durchgeführt werden kann, um denselben genetischen PKSRP Lokus in diesen Pflanzen zu identifizieren. Jede und alle solcher Nukleinsäurevariationen und resultierenden Aminosäure-Polymorphismen oder -Variationen in einem PKSRP, die das Resultat einer natürlichen Allelvariation sind und die die funktionelle Aktivität eines PKSRPs nicht abändern, liegen in dem Bereich der Erfindung.
Darüber hinaus werden Nukleinsäuremoleküle, die für PKSRP's aus derselben Art oder anderen Arten wie z.B. PKSRP Analoge, Orthologe und Paraloge kodieren, betrachtet. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Term „Analoge" auf zwei Nukleinsäuren, die dieselbe oder eine ähnliche Funktion aufweisen, die sich aber getrennt in nichtverwandten Organismen entwickelt haben. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Term „Orthologe" auf zwei Nukleinsäuren aus unterschiedlichen Arten, die sich jedoch aus einem gemeinsamen Ursprungsgen durch Artenbildung entwickelt haben. Normalerweise kodieren Orthologe für Proteine, die dieselben oder ähnliche Funktionen aufweisen. Wie ebenfalls hierin verwendet, bezieht sich der Term „Paraloge" auf zwei Nukleinsäuren, die sich durch Duplikation innerhalb eines Genoms entwickelt haben. Paraloge haben gewöhnlicherweise unterschiedliche Funktionen, diese Funktionen können jedoch verwandt sein (Tatusov, R. L. et al. 1997 Science 278(5338): 631–637). Analoge, Orthologe und Paraloge eines natürlich auftretenden PKSRPs können sich von den natürlicherweise auftretenden PKSRP's durch posttranslationale Modifikationen, durch Aminosäuresequenzunterschiede, oder durch beide unterscheiden. Posttranslationale Modifikationen beinhalten in vivo und in vitro chemische Derivatisierung von Polypeptiden, z.B. Acetylierung, Carboxylierung, Phosphorylierung oder Glykosylierung wobei solche Mutationen während der Polypeptidsynthese oder Prozessierung oder einer folgenden Behandlung mit isolierten modifizierenden Enzymen auftreten können. Insbesondere zeigen Orthologe der Erfindung im Allgemeinen mindestens 80–85%, bevorzugter 90% und am bevorzugtesten 95%, 96%, 97%, 98% oder sogar 99% Identität oder Homologie mit der gesamten oder eines Teils einer natürlich auftretenden PKSRP-Aminosäuresequenz und zeigen eine Funktion, die ähnlich zu einem PKSRP ist. Orthologe sind vorzugsweise auch in der Lage, an der Stressantwort in Pflanzen teilzunehmen. In einer Ausführungsform behalten die PKSRP Orthologen die Fähigkeit bei, an dem Metabolismus von Verbindungen, die für die Konstruktion zellulärer Membranen in Physcomitrella patens notwendig sind oder an dem Transport von Molekülen durch diese Membranen mitzuwirken.
Zusätzlich zu natürlich auftretenden Varianten einer PKSRP Sequenz, die in der Population existieren kann, wird ein Fachmann weiterhin erkennen, dass Änderungen, die durch Mutation in die Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 14 eingeführt werden können, zu Änderungen in der Aminosäuresequenz des kodierenden PKSRPs führen, ohne die funktionellen Fähigkeiten des PKSRPs zu verändern. Zum Beispiel können Nukleotidsubstitutionen, die zu Aminosäuresubstitutionen an „nicht-essenziellen" Aminosäureresten führen, in der Sequenz SEQ ID NO: 14 durchgeführt werden. Ein „nicht-essenzieller" Aminosäurerest ist ein Rest, der gegenüber der Wildtypsequenz eines der PKSRP's modifiziert sein kann, ohne die Aktivität des PKSRPs zu modifizieren, wo hingegen ein „essenzieller" Aminosäurerest für die PKSRP Aktivität benötigt wird. Andere Aminosäurereste (z.B. solche, die nicht konserviert sind oder nur semikonserviert in der PKSRP Aktivität-aufweisenden Domäne sind) sind bisweilen für die Aktivität jedoch nicht essenziell und daher wahrscheinlich für eine Modifikation zugänglich, ohne eine PKSRP Aktivität zu modifizieren.
Entsprechend betrifft ein anderer Aspekt der Erfindung Nukleinsäuremoleküle, die für PKSRP's kodieren, die Änderungen in Aminosäureresten enthalten, die nicht essenziell für die PKSRP Aktivität sind. Solche PKSRP's unterscheiden sich in der Aminosäuresequenz von der in SEQ ID NO: 27 enthaltenen Sequenz, obgleich sie mindestens eine der hierin beschriebenen PKSRP Aktivitäten beibehalten. In einer Ausführungsform umfasst das isolierte Nukleinsäuremolekül eine für ein Protein kodierende Nukleotidsequenz, worin das Protein eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens etwa 70% homolog zu der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 27 ist. Bevorzugt ist das durch das Nukleinsäuremolekül kodierte Protein mindestens etwa 70–80%, 80–90%, 90–95% homolog zu der Sequenz SEQ ID NO: 27 und bevorzugter mindestens etwa 96%, 97%, 98% oder 99% homolog zu der Sequenz SEQ ID NO: 27. Die bevorzugten PKSRP Homologen der vorliegenden Erfindung sind bevorzugt in der Lage, an einer Stresstoleranzantwort in einer Pflanze teilzunehmen, und insbesondere an der Transkription eines Proteins teilzunehmen, das an einer Stresstoleranzantwort in einer Physcomitrella patens Pflanze beteiligt ist oder weisen eine oder mehrere Aktivitäten, wie in Tabelle 1 aufgeführt, auf.
Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das für ein PKSRP kodiert, welches homolog zu der Proteinsequenz SEQ ID NO: 27 ist, kann durch Einführen oder mehrerer Nukleotidsubstitutionen, Additionen oder Deletionen in die Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 14 kreiert werden, so dass eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, Additionen oder Deletionen in das kodierte Protein eingeführt werden. Mutationen können in die Sequenz SEQ ID NO: 14 durch Standardtechniken wie z.B. ortsspezifische Mutagenese („site-directed mutagenesis") und PCR-vermittelte Mutagenese eingeführt werden. Bevorzugt werden konservative Aminosäuresubstitutionen an einem oder an mehreren vorhergesagten, nicht essenziellen Aminosäureresten durchgeführt. Eine „konservative Aminosäuresubstitution" ist eine, in der der Aminosäurerest durch einen Aminosäurerest, welcher eine ähnliche Seitenkette aufweist, ersetzt wird.
Familien von Aminosäuresten, die ähnliche Seitenketten aufweisen, sind im Stand der Technik definiert worden. Diese Familien beinhalten Aminosäuren mit basischen Seitenketten (z.B. Lysin, Arginin, Histidin), sauren Seitenketten (z.B. Asparaginsäure, Glutaminsäure), ungeladene polare Seitenketten (z.B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein), nicht polare Seitenketten (z.B. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan), beta-verzweigte Seitenketten (z.B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatische Seitenketten (z.B. Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin). Daher wird ein vorhergesagter, nicht essenzieller Aminosäurerest in einem PKSRP bevorzugt durch einen anderen Aminosäurerest derselben Seitenkettenfamilie ersetzt. Alternativ können Mutationen in einer anderen Ausführungsform zufällig entlang der gesamten oder eines Teils einer PKSRP kodierenden Sequenz eingeführt werden, wie z.B. durch Sättigungsmutagenese und die resultierenden Mutanten können nach einer hierin beschriebenen PKSRP Aktivität durchsucht werden, um Mutanten zu identifizieren, die eine PKSRP Aktivität beibehalten. Nach erfolgter Mutagenese der Sequenz SEQ ID NO: 14 kann das kodierte Protein rekombinant exprimiert werden und die Aktivität des Proteins kann durch Analyse der Stresstoleranz einer Pflanze bestimmt werden, die das wie in Beispiel 7 beschriebene Protein exprimiert.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen, PKSRP kodierenden, Nukleinsäuremolekülen betrifft ein anderer Aspekt isolierte Nukleinsäuremoleküle, die „antisense" dazu sind. Eine „antisense" Nukleinsäure umfasst eine Nukleotidsequenz, die komplementär zu einer „sense" Nukleinsäure ist, die für ein Protein kodiert, z.B. komplementär zu dem kodierenden Strang eines doppelsträngigen cDNA Moleküls oder komplementär zu einer mRNA Sequenz ist. Entsprechend kann eine antisense Nukleinsäure über Wasserstoffbrücken an eine sense Nukleinsäure gebunden sein. Die antisense Nukleinsäure kann komplementär zu einem gesamten PKSRP kodierenden Strang oder nur zu einem Teil davon sein. In einer Ausführungsform ist ein antisense Nukleinsäuremolekül antisense zu einer „kodierenden Region" des kodierenden Stranges einer Nukleotidsequenz, die für ein PKSRP kodiert. Der Term „kodierende Region" bezieht sich auf die Region der Nukleotidsequenz, die Codons umfasst, die in Aminosäurereste übersetzt werden (z.B. umfasst die gesamte kodierende Region von ... die Nukleotide 1 bis ...). In einer anderen Ausführungsform ist das antisense Nukleinsäuremolekül antisense zu einer „nicht kodierenden Region" des kodierenden Stranges einer Nukleotidsequenz, die für ein PKSRP kodiert. Der Term „nicht kodierende Region" bezeichnet 5'- und 3'-Sequenzen, die die kodierende Region flankieren, die nicht in Aminosäuren übersetzt werden (d.h. auch als 5'- und 3'-nicht translatierte Regionen bezeichnet).
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül ein Nukleinsäuremolekül, das ein Komplement der in SEQ ID NO: 14 gezeigten Nukleotidsequenz ist. Ein Nukleinsäuremolekül, das komplementär zu der in SEQ ID NO: 14 gezeigten Nukleotidsequenz ist, ist eines, das ausreichend komplementär zu der SEQ ID NO: 14 gezeigten Nukleotidsequenz ist, so dass es mit der in SEQ ID NO: 14 gezeigten Nukleotidsequenz hybridisieren kann, um dadurch einen stabilen Duplex zu bilden.
Angesichts der kodierenden Strangsequenzen, die für die hierin offenbarten PKSRP's kodieren (z.B. die in SEQ ID NO: 14 aufgeführte Sequenz) können antisense Nukleinsäuren gemäß den Regeln der Watson und Crick-Basenpaarung konstruiert werden. Das antisense Nukleinsäuremolekül kann komplementär zu der gesamten Region einer PKSRP mRNA sein, aber bevorzugter ist ein Oligonukleotid, das nur zu einem Teil der kodierenden oder nicht kodierenden Region einer PKSRP mRNA ist. Zum Beispiel kann das antisense Oligonukleotid komplementär zu der Region sein, die den Translations-Startpunkt einer PKSRP mRNA umgibt. Ein antisense Oligonukleotid kann z.B. eine Länge von etwa 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Nukleotiden aufweisen.
Eine antisense Nukleinsäure kann unter Verwendung einer chemischen Synthese und enzymatischen Ligationsreaktionen unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren konstruiert werden. Zum Beispiel kann eine antisense Nukleinsäure (z.B. ein antisense Oligonukleotid) unter Verwendung natürlich auftretender Nukleotide oder verschiedenartig modifizierter Nukleotide, chemisch synthetisiert werden, die zur Erhöhung der biologischen Stabilität der Moleküle oder zur Erhöhung der physikalischen Stabilität des zwischen den antisense und sense Nukleinsäuren gebildeten Duplexes konstruiert wurden, z.B. können Phosphorthioat-Derivate und Acridin-substituierte Nukleotide verwendet werden. Beispiele modifizierter Nukleotide, die verwendet werden können, um die antisense Nukleinsäure zu generieren, beinhalten 5-Flur-Uracil, 5-Brom-Uracil, 5-Chlor-Uracil, 5-Jod-Uracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetyl-Cytosin, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)-Uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-Thiouridin, 5-Carboxymethyl-Aminomethyl-Uracil, Dihydro-Uracil, beta-D-Galactosyl-Queosin, Inosin, N6-Isopentenyl-Adenin, 1-Methyl-Guanin, 1-Methyl-Inosin, 2,2-DimethylGuanin, 2-Methyl-Adenin, 2-Methyl-Guanin, 3-Methyl-Cytosie, 5-Methyl-Cytosin, N6-Adenin, 7-Methyl-Guanin, 5-Methyl-Aminomethyl-Uracil, 5-Methoxy-Aminomethyl-2-Thiouracil, beta-D-Mannosyl-Queosin, 5'-Methoxy-Carboxymethyl-Uracil, 5-Methoxy-Uracil, 2-Methyl-thio,-N6- Isopentenyl-Adenin, Uracil-5-Oxid-Essigsäure (v), Wybutoxosin, Pseudo-Uracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-Thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-Oxid-Essigsäure-Methylester Uracil-5-Oxid-Essigsäure (v), 5-Methyl-2-Thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-Carboxypropyl)-Uracil, (acp3)w, und 2,6-Diaminopurin. Alternativ kann die antisense Nukleinsäure unter Verwendung eines Expressionsvektors, in den eine Nukleinsäure in einer antisense Orientierung (d.h. RNA, die von der integrierten Nukleinsäure transkribiert wird, liegt zu einer Zielnukleinsäure von Interesse in antisense Orientierung vor, wie in dem nachfolgenden Unterabschnitt beschrieben) subkloniert worden ist, biologisch hergestellt werden.
Die antisense Nukleinsäuremoleküle werden typischerweise einer Zelle verabreicht oder in situ generiert, so dass sie mit zellulärer mRNA und/oder genomischer DNA, die für ein PKSRP kodieren, hybridisieren oder daran binden, um dadurch eine Expression des Proteins, z.B. durch Inhibierung der Transkription und/oder Translation, zu inhibieren. Die Hybridisierung kann durch konventionelle Nukleotid-Komplementarität erfolgen, um einen stabilen Duplex zu bilden, oder z.B. im Falle eines antisense Nukleinsäuremoleküls, das an DNA Duplexe bindet, durch spezifische Interaktionen in der großen Rinne der Doppelhelix erfolgen. Das antisense Molekül kann modifiziert werden, so dass es spezifisch an einen Rezeptor oder ein Antigen, der oder das auf einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiert wird, bindet, z.B. durch Verknüpfung des antisense Nukleinsäuremoleküls mit einem Peptid oder einem Antikörper, das oder der an einen Zelloberflächenrezeptor oder antigen bindet. Das Nukleinsäuremolekül kann auch unter Verwendung der hierin beschriebenen Vektoren zu den Zellen geliefert werden. Um ausreichende intrazelluläre Konzentrationen der antisense Moleküle zu erreichen, werden Vektorkonstrukte bevorzugt, in denen das antisense Nukleinsäuremolekül unter der Kontrolle eines starken prokaryontischen, viralen oder eukaryontischen (einschließlich Pflanzen) Promotors gestellt wird.
In noch einer anderen Ausführungsform ist das antisense Nukleinsäuremolekül ein alpha-anomeres Nukleinsäuremolekül. Ein alpha-anomeres Nukleinsäuremolekül bildet spezifische doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA in denen im Gegensatz zu den gewöhnlichen Beta-Einheiten die Stränge parallel zueinander verlaufen (Gaultier et al., 1987 Nucleic Acids. Res. 15: 6625–6641). Das antisense Nukleinsäuremolekül kann auch ein 2'-o-Methylribonukleotid (Inoue et al., 1987 Nucleic Acids Res. 15: 6131–6148) oder ein chimäres RNA-DNA Analogon (Inoue et al., 1987 FEBS Lett. 215: 327–330) umfassen.
In noch einer anderen Ausführungsform ist eine antisense Nukleinsäure ein Ribozym. Ribozyme sind katalytische RNA Moleküle mit Ribonuklease-Aktivität, die in der Lage sind, eine einzelsträngige Nukleinsäure, wie z.B. mRNA zu schneiden, zu denen sie eine komplementäre Region besitzen. Daher können Ribozyme (z.B. die in Haselhoff und Gerlach, 1988 Nature 334: 585–591 beschriebenen Hammerkopf-Ribozyme) verwendet werden, um PKSRP-mRNA Transkripte katalytisch zu schneiden, um dadurch eine Translation einer PKSRP mRNA zu inhibieren. Ein Ribozym, das eine Spezifität für eine PKSRP kodierende Nukleinsäure aufweist, kann auf Basis der Nukleotidsequenz einer wie hierin beschriebenen PKSRP cDNA (z.B. SEQ ID NO: 14) oder auf der Basis einer entsprechend den in dieser Erfindung gelehrten Verfahren zu isolierenden heterologen Sequenz konstruiert werden. Zum Beispiel kann ein Derivat einer Tetrahymena L-19 IVS RNA konstruiert werden, in der die Nukleotidsequenz der aktiven Seite komplementär zu der Nukleotidsequenz ist, die in einer PKSRP kodierenden mRNA zu schneiden ist (siehe z.B. Cech et al. US. Patent Nr. 4,987,071 and Cech et al. U.S. Patent Nr. 5,116,742). Alternativ kann eine PKSRP mRNA verwendet werden, um eine katalytische RNA, die eine spezifische Ribonuklease-Aktivität aufweist, aus einem Pool von RNA Molekülen zu selektieren (siehe z.B. Bartel, D. and Szostak, J. W., 1993 Science 261: 1411–1418).
Alternativ kann eine PKSRP Genexpression durch ein Ausrichten („Targeting") von Nukleotidsequenzen inhibiert werden, die komplementär zu der regulatorischen Region einer PKSRP Nukleotidsequenz sind (z.B. ein PKSRP-Promotor und/oder-Enhancer), um tripel-helikale Strukturen zu bilden, die eine Transkription eines PKSRP Gens in Zielzellen verhindert (siehe allgemein, Helene, C., 1991 Anticancer Drug Des. 6(6): 569–84; Helene, C. et al., 1992 Ann. N.Y. Acad Sci. 660: 27–36; and Maher, L. J., 1992 Bioassays 14(12): 807–15).
Zusätzlich zu den oben beschriebenen PKSRP Nukleinsäuren und Proteinen umfasst die vorliegende Erfindung diese Nukleinsäuren und Proteine, wenn diese an eine Gruppe angehängt sind. Diese Gruppen beinhalten – sind jedoch nicht beschränkt auf – Detektionsgruppen, Hybridisierungsgruppen, Aufreinigungsgruppen, Zustellungsgruppen, Reaktionsgruppen, Bindungsgruppen und dergleichen. Eine typische Gruppe von Nukleinsäuren, die angehängte Gruppen aufweisen, sind Proben und Primer. Die Proben und Primer umfassen typischerweise ein im Wesentlichen isoliertes Oligonukleotid. Das Oligonukleotid umfasst typischerweise eine Region einer Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit mindestens etwa 12, bevorzugt etwa 25, bevorzugter etwa 40, 50, oder 75 aufeinander folgenden Nukleotiden eines sense Stranges der in SEQ ID NO: 14 aufgezeigten Sequenz, einer antisense Sequenz der in SEQ ID NO: 14 aufgezeigten Sequenz oder natürlich auftretenden Mutanten davon hybridisiert. Primer, die auf der Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 14 basieren, können in PCR-Reaktionen verwendet werden, um PKSRP Homologe zu klonieren. Proben, die auf den PKSRP Nukleotidsequenzen basieren, können verwendet werden, um Transkripte oder genomische Sequenzen, die für dasselbe Protein oder homologe Proteine kodieren, zu detektieren. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Probe weiterhin eine daran angehängte Markierungsgruppe, z.B. kann die Markierungsgruppe ein Radio-Isotop, eine fluoreszierende Verbindung, ein Enzym oder ein Enzym-Cofaktor sein. Solche Proben können als ein Teil eines genomischen Marker-Testkits für das Identifizieren von PKSRP-exprimierenden Zellen in einer Zellprobe verwendet werden, in dem ein Pegel einer PKSRP kodierenden Nukleinsäure gemessen wird, z.B. durch das Detektieren von PKSRP-mRNA-Pegeln oder durch Bestimmen, ob ein genomisches PKSRP Gen mutiert, oder deletiert worden ist.
Insbesondere besteht ein zweckdienliches Verfahren zur Bestimmung des Pegels der Gentranskription (ein Indikator der mRNA Menge, die für die Translation des Genproduktes zur Verfügung steht) in der Durchführung eines Northern-Blots (für eine Referenz siehe z.B. Ausubel et al., 1988 Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York). Diese Information zeigt zumindest teilweise den Transkriptions-Grad des transformierten Gens an. Gesamtzell-RNA kann durch verschiedene Verfahren, die alle im Stand der Technik bekannt sind, wie z.B. die, die in Bormann, E. R. et al., 1992 Mol. Microbiol. 6: 317–326 beschrieben sind, aus Zellen, Geweben, oder Organen präpariert werden. Um die Anwesenheit oder die relative Menge eines Proteins festzustellen, das von dieser mRNA translatiert wird, können Standardtechniken, wie z.B. ein Western-Blot, genutzt werden. Diese Techniken sind einem Durchschnittsfachmann wohl bekannt. (Siehe z.B. Ausubel et al., 1988 Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York).
Die Erfindung stellt weiterhin einen isolierten, rekombinanten Expressionsvektor bereit, der eine wie oben beschriebene PKSRP Nukleinsäure umfasst, worin die Expression des Vektors in einer Wirtszelle zu einer, verglichen mit einer Wildtypvarietät der Wirtszelle, erhöhten Toleranz gegenüber Umweltstress führt. Wie hierin verwendet, bezeichnet der Term „Vektor" ein Nukleinsäuremolekül, welches imstande ist, eine andere Nukleinsäure zu transportieren, mit der sie verbunden worden ist. Ein Typ eines Vektors ist ein „Plasmid" welcher eine zirkuläre, doppelsträngige DNA Kette bezeichnet, in die zusätzliche DNA Segmente eingefügt („ligiert") werden können. Ein anderer Vektortyp ist ein viraler Vektor, worin zusätzliche DNA Segmente in das virale Genom eingefügt werden können. Bestimmte Vektoren sind im Stande, sich in einer Wirtszelle, in die sie eingefügt wurden (z.B. bakterielle Vektoren, die einen bakteriellen Replikationsursprung aufweisen und episomale Säugervektoren) autonom zu replizieren. Andere Vektoren (z.B. nicht episomale Säugervektoren) werden nach Einführung in eine Wirtszelle in das Genom der Wirtszelle integriert und dadurch zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert. Darüber hinaus sind bestimmte Vektoren im Stande, die Expression von Genen, mit denen sie operativ verknüpft sind, zu steuern. Solche Vektoren werden hierin als „Expressionsvektoren" bezeichnet. Im Allgemeinen liegen die in rekombinanten DNA Techniken gemeinhin verwendeten Expressionsvektoren oftmals in der Plasmidform vor. In der vorliegenden Beschreibung können „Plasmid" und „Vektor" austauschbar verwendet werden, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Vektorform ist. Jedoch ist vorgesehen, dass die vorliegende Erfindung andere Formen von Expressionsvektoren, wie z.B. virale Vektoren (z.B. Replikationsdefekte Retroviren, Adenoviren und Adeno-assoziierte Viren) beinhaltet, die äquivalente Funktionen erfüllen.
Die rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung umfassen eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in einer Form, die für die Expression der Nukleinsäure in einer Wirtszelle geeignet ist, was bedeutet, das die rekombinanten Expressionsvektoren eine oder mehrere regulatorische Sequenzen beinhalten, die auf der Basis der für eine Expression verwendeten Wirtszellen ausgewählt wurden, die operativ mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sind. Innerhalb eines rekombinanten Expressionsvektors ist vorgesehen, dass „operativ verknüpft" bedeutet, dass die Nukleotidsequenz von Interesse mit der regulatorischen Sequenz bzw. mit den regulatorischen Sequenzen in einer Art verknüpft ist, die die Expression der Nukleotidsequenz (z.B. in einem in vitro Transkriptions-/Translationssystem oder in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in die Wirtszelle eingeführt wird) gestattet. Der Term „regulatorische Sequenz" ist vorgesehen, Promotoren, Verstärker („Enhancers") und andere Expressionskontrollelemente (z.B. Polyadenylierungssignale) zu beinhalten. Solche regulatorischen Sequenzen werden z.B. in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) oder siehe: Gruber and Crosby, in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, eds. Glick und Thompson, Kapitel 7, 89–108, CRC Press: Boca Raton, Florida, einschließlich der Referenzen darin beschrieben. Regulatorische Sequenzen beinhalten solche, die eine konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in vielen Wirtszelltypen steuern und solche, die die Expression der Nukleotidsequenz nur in bestimmten Wirtszellen unter bestimmten Bedingungen steuern. Ein Fachmann wird einschätzen können, dass die Konstruktion des Expressionsvektors von solchen Faktoren wie der Auswahl der zu transformierenden Wirtszelle, dem gewünschten Pegel der Proteinexpression, etc. abhängen kann. Die Expressionsvektoren der Erfindung können in Wirtszellen eingeführt werden, um dadurch Proteine oder Peptide, einschließlich Fusionsproteine oder -peptide zu produzieren, die durch Nukleinsäuren wie hierin beschrieben kodiert werden (z.B. PKSRP's, Mutantenformen von PKSRP's, Fusionsproteine, etc.).
Die rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung können für eine Expression von PKSRP's in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen konstruiert werden. Zum Beispiel können PKSRP Gene in bakteriellen Zellen, wie z.B. C. glutamicum, Insektenzellen (unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren), Hefe und anderen Pilzzellen (siehe Romanos, M. A. et al., 1992 Foreign gene expression in yeast: a review, Yeast 8: 423–488; van den Hondel, C. A. M. J. J. et al., 1991 Heterologous gene expression in filamentous fungi, in: More Gene Manipulations in Fungi, J. W. Bennet & L. L. Lasure, eds., p. 396–428: Academic Press: San Diego; und van den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt, P. J., 1991, Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J. F. et al., eds., p. 1–28, Cambridge University Press: Cambridge), Algen (Falciatore et al., 1999 Marine Biotechnology 1(3): 239–251), Ciliaten des Typs: Holotrichia, Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria, Tetrahymena, Paramecium, Colpidium, Glaucoma, Platyophrya, Potomacus, Pseudocohnilembus, Euplotes, Engelmaniella, und Stylonychia, besonders der Gattung Stylonychia lemnae, die nach einem, wie in WO 98/0157 beschriebenen, Transformationsverfahren Vektoren enthalten, und multizellulären Pflanzenzellen (siehe Schmidt, R. and Willmitzer, L, 1988 High efficiency Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants, Plant Cell Rep. 583–586; Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, Kapitel 6/7, S. 71–119 (1993); F. F. White, B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. Kung und R. Wu, 128–43, Academic Press: 1993; Potrykus, 1991 Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42: 205–225 und hierin zitierte Referenzen) oder Säugerzellen exprimiert werden. Geeignete Wirtszellen werden weiterhin in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press: San Diego, CA (1990) diskutiert. Alternativ kann der rekombinante Expressionsvektor in vitro transkribiert und translatiert werden, z.B. unter Verwendung regulatorischer Sequenzen des T7-Promotors und der T7-Polymerase.
Die Expression von Proteinen in Prokaryonten wird am häufigsten mit Vektoren durchgeführt, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten, die die Expression von entweder Fusions- oder Nichtfusionsproteinen steuern. Fusionsvektoren fügen an ein darin kodiertes Protein üblicherweise an den N-Terminus des rekombinanten Proteins aber auch den C-Terminus Aminosäuren hinzu oder fusionieren diese innerhalb geeigneter Regionen in die Proteine. Solche Fusionsvektoren dienen typischerweise drei Zwecken: 1) Erhöhung der Expression eines rekombinanten Proteins; 2) Erhöhung der Löslichkeit eines rekombinanten Proteins; und 3) Unterstützung der Aufreinigung eines rekombinanten Proteins durch Wirkung als ein Ligand in einer Affinitätsreinigung. Oftmals wird in Fusions-Expressionsvektoren eine proteolytische Schnittstelle an der Verbindung zwischen dem Fusionsanteil und dem rekombinanten Protein eingefügt, um eine Trennung des rekombinanten Proteins von dem Fusionsanteil nach erfolgter Aufreinigung des Fusionsproteins zu ermöglichen. Solche Enzyme und ihre verwandten Erkennungssequenzen beinhalten Faktor-Xa, Thrombin und Enterokinase.
Typische Fusions-Expressionsvektoren schließen pGEX (Pharmacia Biotech inc; Smith, D. B. and Johnson, K. S., 1988 Gene 67: 31–40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) ein, die entsprechend Glutathion-S-Transferase (GST), Maltose-E-Bindeprotein oder Protein-A mit dem rekombinanten Zielprotein fusionieren. In einer Ausführungsform wird die kodierende Sequenz des PKSRPs in einen PGEX Expressionsvektor kloniert, um einen Vektor zu kreieren, der für ein Fusionsprotein kodiert, das in N-Terminus-zu-C-Terminus-Orientierung ein GST-Thrombinschnittstelle-X-Protein umfasst. Das Fusionsprotein kann durch Affinitätschromatographie unter Verwendung eines Glutathion-Agarosegranulates aufgereinigt werden. Rekombinantes, nicht mit GST verbundenes, PKSRP kann durch Schneiden des Fusionsproteins mit Thrombin gewonnen werden.
Beispiele für geeignete, induzierbare Nicht-Fusions-E.coli-Expressionsvektoren schließen pTrc (Amann et al., 1988 Gene 69: 301–315) und pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60–89) ein. Die Zielgen-Expression ausgehend von dem pTrc-Vektor beruht auf einer Wirts-RNA-Polymerase-Transkription, ausgehend von einem Hybrid-trp-lac-Fusionspromotor. Eine Zielgen-Expression ausgehend von dem pET 11d-Vektor beruht auf der Transkription, ausgehend von einem T7 gn10-lac-Fusionspromotor, vermittelt durch eine co-exprimierte, virale RNA-Polymerase (T7 gn1). Diese virale Polymerase wird durch die Wirtsstämme BL 21 (DE3) oder HMS 174 (DE3), ausgehend von einem residenten Lambda-Prophagen bereitgestellt, der ein T7-gn1-Gen unter der transkriptionellen Kontrolle des lacUV5-Promotors beinhaltet.
Eine Strategie, die rekombinante Proteinexpression zu maximieren ist es, das Protein in einem Wirtsbakterium mit einer beeinträchtigten Kapazität, das rekombinante Protein proteolytisch zu schneiden, zu exprimieren (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119–128). Eine andere Strategie ist, die Sequenz der in einen Expressionsvektor zu integrierenden Nukleinsäure zu verändern, so dass die individuellen Codons für jede Aminosäure diejenigen sind, die in dem für eine Expression ausgewählten Bakterium, wie z.B. C. glutamicum (Wada et al., 1992 Nucleic Acids Res. 20: 2111–2118), bevorzugt verwendet werden. Solche Modifikationen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können durch Standard-Synthesetechniken durchgeführt werden.
In einer anderen Ausführungsform ist der PKSRP Expressionsvektor ein Hefe-Expressionsvektor. Beispiele von Vektoren für eine Expression in der Hefe S. cerevisiae schließen pYepSec1 (Baldari, et al., 1987 Embo J. 6: 229–234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, 1982 Cell 30: 933–943), pJRY88 (Schultz et al., 1987 Gene 54: 113–123) und pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) ein. Vektoren und Verfahren für die Konstruktion von Vektoren, die für die Verwendung in anderen Pilzen, wie z.B. filamentösen Pilzen geeignet sind, beinhalten diejenigen, die in van den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt P. J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi", in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J. F. Peberdy, et al., eds., p. 1–28, Cambridge University Press: Cambridge, ausführlich beschrieben sind.
Alternativ können die erfindungsgemäßen PKSRP's in Insektenzellen unter Verwendung eines Baculovirus-Expressionsvektors exprimiert werden. Baculovirus-Vektoren, die für eine Expression von Proteinen in kultivierten Insektenzellen (z.B. Sf 9-Zellen) erhältlich sind, schließen die pAc-Serien (Smith et al., 1983 Mol. Cell Biol. 3: 2156–2165) und die pVL-Serien (Lucklow and Summers, 1989 Virology 170: 31–39) ein.
In noch einer weiteren Ausführungsform wird eine erfindungsgemäße PKSRP Nukleinsäure in Säugerzellen unter Verwendung eines Säuger-Expressionsvektors exprimiert. Beispiele für Säuger-Expressionsvektoren schließen pCDM8 (Seed, B., 1987 Nature 329: 840) und pMT2PC (Kaufman et al., 1987 EMBO J. 6: 187–195) ein. Bei einer Verwendung in Säugerzellen werden die Kontrollfunktionen des Expressionsvektors oftmals durch virale Regulatorelemente bereitgestellt. Zum Beispiel werden üblicherweise verwendete Promotoren aus Polyoma, Adenovirus 2, Zytomegalovirus und Simian Virus 40 abgeleitet. Für andere geeignete Expressionssysteme sowohl für prokaryontische als auch für eukaryontische Zellen sei auf die Kapitel 16 und 17 von Sambrook, 3., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 verwiesen.
In einer anderen Ausführungsform ist der rekombinante Säugerexpressions-Vektor imstande, eine Expression der Nukleinsäure bevorzugt in einem besonderen Zelltyp zu steuern (z.B. werden gewebsspezifische Regulatorelemente verwendet, um die Nukleinsäure zu exprimieren). Gewebsspezifische Regulatorelemente sind im Stand der Technik bekannt. Nicht beschränkende Beispiele geeigneter gewebsspezifischer Promotoren schließen den Albumin-Promotor (Leber-spezifisch; Pinkert et al., 1987 Genes Dev. 1: 268–277), Lymph-spezifische Promotoren (Calame and Eaton, 1988 Adv. Immunol. 43: 235–275), insbesondere Promotoren der T-Zellrezeptoren (Winoto and Baltimore, 1989 BMBO J. 8: 729–733) und Immunglobuline (Banerji et al., 1983 Cell 33: 729–740; Queen und Baltimore, 1983 Cell 33: 741–748), Neuronen-spezifische Promotoren (z.B. der Neurofilament-Promotor; Byrne and Ruddle, 1989 PNA 86: 5473–5477), Pankreas-spezifische Promotoren (Edlund et al., 1985 Science 230: 912–916) und Brustdrüsen-spezifische Promotoren (z.B. ein Milchserum-Promotor; U.S. Patent Nr. 4,873,316 und Europäische Anmeldungsveröffentlichung Nr. 264,166) ein. Entwicklungsregulierte Promotoren, wie z.B. die Maus-hox-Promotoren (Kessel and Gruss, 1990 Science 249: 374–379) und der Fetoprotein-Promotor (Campes und Tilghman, 1989 Genes Dev. 3: 537–546) werden ebenfalls umfasst.
In einer anderen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen PKSRP's in einzelligen Pflanzenzellen (wie z.B. Algen) (siehe Falciatore et al., 1999 Marine Biotechnology 1(3): 239–251 und Referenzen hierin) und in Pflanzenzellen von höheren Pflanzen (z.B. der Spermatophyten, wie z.B. Anbaupflanzen) exprimiert werden. Beispiele von Pflanzen-Expressionsvektoren schließen diejenigen ein, die in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J. und Masterson, R., 1992 New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border, Plant Mol. Biol. 20: 1195–1197; und Bevan, M. W., 1984 Binary Agrobacterium vectors for plant transformation, Nucl. Acid. Res. 12: 8711–8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Planta; in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38, ausführlich beschrieben sind.
Eine Pflanzenexpressions-Kassette enthält bevorzugt regulatorische Sequenzen, die imstande sind, eine Genexpression in Pflanzenzellen zu steuern und operativ verknüpft sind, so dass jede Sequenz seine Funktion, wie z.B. die Termination der Transkription durch Polyadenylierungssignale, erfüllen kann. Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind solche, die aus einer Agrobacterium tumefaciens t-DNA stammen, wie z.B. das als Octopin-Synthase bekannte Gen 3 des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., 1984 EMBO J. 3: 835) oder funktionellen Äquivalenten davon, jedoch sind auch alle anderen Terminatoren, die in Pflanzen funktionell sind, geeignet.
Da eine Pflanzen-Genexpression sehr oft nicht auf transkriptionellen Ebenen limitiert ist, enthält eine Pflanzenexpressions-Kassette bevorzugt andere operativ verknüpfte Sequenzen, wie translationelle Verstärker, wie z.B. die Übersteuerungs-(„overdrive-")Sequenz, die die 5'-nicht-translatierte Leader-Sequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus enthält, die das Protein:RNA-Verhältnis verbessert (Gallie et al., 1987 Nucl. Acids Research 15: 8693–8711).
Eine Pflanzengen-Expression muss operativ mit einem geeigneten Promotor verknüpft sein, um eine Genexpression in einer rechtzeitigen, zell- oder gewebsspezifischen Art zu vermitteln. Bevorzugt sind Promotoren, die eine konstitutive Genexpression vermitteln (Benfey et al., 1989 EMBO J. 8: 2195–2202), wie diese, die aus Pflanzenviren, wie dem 35S CAMV (Franck et al., 1980 Cell 21: 285–294), dem 19S CAMV (siehe auch U.S. Patent Nr. 5352605 und PCT-Anmeldung WO 8402913) abgeleitet sind oder Pflanzenpromotoren, wie diejenigen der kleinen Rubisco Untereinheit, die in U.S. Patent Nr. 4,962,028 beschrieben sind.
Andere bevorzugte Sequenzen für eine Verwendung in Pflanzengen-Expressions-Kassetten sind Zielsequenzen, die notwendig sind, um das Genprodukt in sein entsprechendes Zellkompartiment, wie z.B. die Vakuole, den Zellkern, alle Typen von Plastiden, wie Amyloplasten, Chloroplasten, Chromoplasten, den extrazellulären Raum, Mitochondrien, das Endoplasmatische Retikulum, Ölkörper, Peroxisomen und andere Kompartimente von Pflanzenzellen zu leiten (für einen Überblick siehe Kermode, 1996 Crit. Rev. Plant Sci. 15(4): 285–423).
Eine Pflanzengen-Expression kann auch durch einen induzierbaren Promotor ermöglicht werden (für einen Überblick siehe Gatz, 1997 Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 89–108). Chemisch induzierbare Promotoren sind insbesondere dann geeignet, wenn es gewünscht ist, dass die Genexpression in einer Zeitspezifischen Art erfolgen soll. Beispiele für solche Promotoren sind ein Salicylsäure-induzierbarer Promotor (PCT Anmeldung Nr. WO 95/19443), ein Tetracyclin-induzierbarer Promotor (Gatz et al., 1992 Plant J. 2: 397–404) und ein Ethanol-induzierbarer Promotor (PCT Anmeldung Nr. WO 93/21334).
Geeignete Promotoren, die auf biotische oder abiotische Stressbedingungen reagieren sind auch solche, wie z.B. der Pathogen-induzierbare PRP1-Gen-Promotor (Ward et al., 1993 Plant. Mol. Biol. 22: 361–366) der Hitze-induzierbare hsp80-Promotor aus Tomate (U.S. Patent Nr. 5187267), ein Kälte-induzierbarer Alpha-Amylase Promotor aus Kartoffel (PCT Anmeldung Nr. WO 96/12814) oder der Wunden-induzierbare pinII-Promotor (Europäisches Patent Nr. 375091). Für andere Beispiele Trockenheit-, Kälte- und Salz-induzierbarer Promotoren, wie z.B. der RD29A-Promotor siehe Yamaguchi-Shinozalei et al. (1993 Mol. Gen. Genet. 236: 331–340).
Besonders bevorzugt sind solche Promotoren, die eine Genexpression in spezifischen Geweben und Organen, wie z.B. Schutzzellen und die Wurzelhaarzellen, verleihen. Geeignete Promotoren schließen den Napin-Gen-Promotor aus Raps (U.S. Patent Nr. 5,608,152), den USP-Promotor aus Vicia faba (Bäumlein et al., 1991 Mol. Gen Genet. 225 (3): 459–67) den Oleosin-Promotor aus Arabidopsis (PCT-Anmeldung Nr. WO 98/45461), den Phaseolin-Promotor aus Phaseolus vulgaris (U.S. Patent Nr. 5,504,200), den Bce4-Promotor aus Brassica (PCT-Anmeldung Nr. WO 91/13980) oder den Legumin-B4-Promotor (LeB4; Bäumlein et al., 1992 Plant Journal 2 (2): 233–9) sowie Promotoren ein, die eine samenspezifische Expression in monokotylen Pflanzen, wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis, etc. verleihen. Geeignete Promotoren, die zu erwähnen sind, sind der Ipt2- oder der Ipt1-Gen Promotor aus Gerste (PCT-Anmeldung Nr. WO 95/15389 und PCT-Anmeldung Nr. WO 95/23230) oder diejenigen, die in der PCT-Anmeldung Nr. WO 99/16890 beschrieben sind (Promotoren aus dem Gersten-Hordein-Gen, dem Reis-Glutelin-Gen, dem Reis-Oryzin-Gen, dem Reis-Prolamin-Gen, dem Weizen-Gliadin-Gen, dem Weizen-Glutelin-Gen, Mais-Zein-Gen, dem Hafer-Glutelin-Gen, dem Sorghum-Kasirin-Gen und dem Roggen-Secalin-Gen).
Besonders geeignete Promotoren sind auch die, die eine Plastiden spezifische Genexpression verleihen, da Plastiden die Kompartimente sind, wo eine Lipid-Biosynthese stattfindet. Geeignete Promotoren sind der virale RNA-Polymerase Promotor, der in der PCT-Anmeldung Nr. WO 95/16783 und der PCT-Anmeldung Nr. WO 97/06250 beschrieben ist und der clpP-Promotor aus Arabidopsis, der in der PCT-Anmeldung Nr. WO 99/46394 beschrieben ist.
Die Erfindung stellt weiterhin einen rekombinanten Expressionsvektor bereit, der ein erfindungsgemäßes PKSRP DNA-Molekül umfasst, das in den Expressionsvektor in einer antisense-Orientierung kloniert ist. Das heißt, das DNA-Molekül ist operativ mit einer regulatorischen Sequenz in einer Art verknüpft, die eine Expression (durch Transkription des DNA-Moleküls) eines RNA-Moleküls erlaubt, die eine antisense Orientierung zu einer PKSRP-mRNA aufweist. Es können regulatorische Sequenzen ausgewählt werden, die operativ mit einem Nukleinsäuremolekül, das in der antisense Orientierung kloniert ist, verknüpft ist, welche die kontinuierliche Expression des antisense RNA-Moleküls in einer Vielzahl von Zelltypen steuern. Zum Beispiel können virale Promotoren und/oder Verstärker oder regulatorische Sequenzen ausgewählt werden, die eine konstitutive, gewebsspezifische oder Zelltyp-spezifische Expression einer antisense RNA steuern. Der antisense Expressionsvektor kann in Form eines rekombinanten Plasmids, Phagemids oder eines abgeschwächten Virus vorliegen, worin antisense Nukleinsäuren unter der Kontrolle einer hocheffizienten, regulatorischen Region produziert werden. Die Aktivität der regulatorischen Region kann durch den Zelltyp, in den der Vektor eingeführt wird, bestimmt werden. Für eine Diskussion der regulatorischen Genexpression unter Verwendung von antisense Genen siehe Weintraub, H. et al., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews – Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986 und. Mol et al., 1990 FEBS Letters 268: 427–430.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft Wirtszellen, in welche ein erfindungsgemäßer, rekombinanter Expressionsvektor eingeführt worden ist. Die Begriffe „Wirtszelle" und „rekombinante Wirtszelle" werden hierin untereinander austauschbar verwendet. Es versteht sich, dass sich solche Begriffe nicht nur auf die besondere betreffende Zelle beziehen, sondern dass sie auch auf die Nachkommen oder potenziellen Nachkommen einer solchen Zelle angewendet werden. Da bestimmte Modifikationen auf Grund von entweder Mutation oder Umgebungseinflüssen in nachfolgenden Generationen auftreten können, wären solche Nachfahren zwar nicht mehr identisch mit der Elternzelle aber sie werden dennoch von dem hierin verwendeten Begriffsumfang umfasst.
Eine Wirtszelle kann jede prokaryontische oder eukaryontische Zelle sein. Zum Beispiel kann ein PKSRP in bakteriellen Zellen C. glutamicum, Insektenzellen, Pilzzellen oder Säugerzellen (z.B. chinesische Hamster-Ovarzellen (CHO) oder COS-Zellen), Algen, Ciliaten, Pflanzenzellen, Pilzen oder anderen Mikroorganismen als C. glutamicum exprimiert werden. Andere geeignete Wirtszellen sind einem Fachmann bekannt.
Vektor-DNA kann mittels konventioneller Transformations- oder Transfektions-Techniken in prokaryontische oder eukaryontische Zellen eingeführt werden. Wie hierin verwendet, sollen die Begriffe „Transformation", „Transfektion", „Konjugation" und „Transduktion" eine Vielzahl von in dem Fachgebiet anerkannten Techniken für das Einführen einer fremden Nukleinsäure (z.B. DNA) in eine Wirtszelle, einschließlich einer Calcium-Phosphat- oder Calciumchlorid-Copräzipitation, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Lipofektion, natürlichen Kompetenz, chemisch vermitteltem Transfer und Elektroporation, bezeichnen. Geeignete Verfahren für das Transformieren oder Transfizieren von Wirtszellen, einschließlich Pflanzenzellen sind in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) und anderen Laboranleitungen wie z.B. Methods in Molecular Biology, 1995, Vol. 44, Agrobacterium protocols, ed: Gartland and Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey, beschrieben. Da es gewünscht wird, biotische und abiotische Stresstoleranz als ein generelles Merkmal in einer breiten Vielzahl von Pflanzen, wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Sojabohne, Erdnuss, Baumwolle, Raps und Canola-Raps, Maniok, Pfeffer, Sonnenblume und Tagetes, Nachtschattengewächse wie Kartoffel, Tabak, Aubergine, Tomate, Vicia-Arten, Erbse, Alfalfa, Buschpflanzen (Kaffee, Kakao, Tee), Salix-Arten, Bäume (Ölpalme, Kokosnuss), mehrjähriges Gras und Futterpflanzen zu vererben, sind diese Anbaupflanzen in einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung auch bevorzugte Zielpflanzen für die Gentechnik.
Insbesondere stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit einer PKSRP kodierenden Nukleinsäure bereit, worin das PKSRP PK-6 ist und worin die Expression der Nukleinsäure bzw. der Nukleinsäuren in der Pflanze zu einer, verglichen mit einer Wildtypvarietät der Pflanze, erhöhten Toleranz gegenüber Trockenstress führt, umfassend: (a) Transformieren einer Pflanzenzelle mit einem Expressionsvektor, der eine PKSRP Nukleinsäure umfasst und (b) Erzeugen einer transgenen Pflanze aus der Pflanzenzelle mit einer, gegenüber einer Wildtypvarietät der Pflanze, erhöhten Toleranz gegenüber Umweltstress. Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur, verglichen mit einer Wildtypvarietät der Wirtszelle, erhöhten Expression eines Gens von Interesse innerhalb einer Wirtszelle bereit, worin das Gen von Interesse als Antwort auf ein PKSRP transkribiert wird, umfassend: (a) Transformieren der Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, der eine PKSRP kodierende Nukleinsäure umfasst und (b) Exprimieren des PKSRPs innerhalb der Wirtszelle, wodurch, verglichen mit einer Wildtypvarietät der Wirtszelle, die Expression des in Anwort auf das PKSRP transkribierten Gens erhöht wird.
Für eine solche Pflanzentransformation können binäre Vektoren, wie z.B. pBinAR (Höfgen and Willmitzer, 1990 Plant Science 66: 221 230) verwendet werden. Die Konstruktion der binären Vektoren kann durch Ligation der cDNA in sense- oder antisense-Orientierung in die T-DNA erbracht werden. 5-seitig der cDNA aktiviert ein Pflanzenpromotor die Transkription der cDNA. Eine Polyadenylierungssequenz ist 3-seitig der cDNA angeordnet. Eine gewebsspezifische Expression kann unter Verwendung eines gewebsspezifischen Promotors erreicht werden. Zum Beispiel kann eine samenspezifische Expression durch Klonierung des Napin- oder des LeB4- oder des USP-Promotors 5-seitig der cDNA erreicht werden. Es kann auch jedes andere samenspezifische Promotorelement verwendet werden. Für eine konstitutive Expression innerhalb der gesamten Pflanze kann der CaMV 35S-Promotor verwendet werden. Das exprimierte Protein kann unter Verwendung eines Signalpeptids, z.B. für Plastiden, Mitochondrien oder das endoplasmatische Retikulum auf ein zelluläres Kompartiment gerichtet werden (Kermode, 1996 Crit. Rev. Plant Sci. 4(15): 285–423). Das Signalpeptid wird 5-seitig in frame an die cDNA kloniert, um eine subzelluläre Lokalisation des Fusionsproteins zu archivieren. Zusätzlich können Promotoren, die auf abiotischen Stress ansprechen, wie z.B. der Arabidopsis-Promotor RD29A, mit den hierin offenbarten Nukleinsäuresequenzen verwendet werden. Ein Fachmann wird erkennen, dass der verwendete Promotor operativ mit der Nukleinsäure verknüpft sein sollte, so dass der Promotor eine Transkription der Nukleinsäure verursacht, was zu der Synthese einer mRNA führt, die für ein Polypeptid kodiert. Alternativ kann es sich bei der RNA um eine antisense RNA handeln, die zur Beeinflussung einer nachfolgenden Expression des selben oder eines anderen Gens bzw. derselben oder anderen Gene verwendet wird.
Alternative Transfektionsverfahren schließen den direkten Transfer von DNA in sich entwickelte Blüten mittels Elektroporation oder mittels Agrobacterium-vermitteltem Gen-Transfer ein. Eine Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation kann z.B. unter Verwendung des GV3101 (pMP90) (Koncz and Schell, 1986 Mol. Gen. Genet. 204: 383–396) oder des LBA4404 (Clontech) Agrobacterium tumefaciens-Stammes durchgeführt werden. Eine Transformation kann mittels Standard-Transformations- und Regenerationstechniken durchgeführt werden (Deblaere et al., 1994 Nucl. Acids. Res. 13: 4777–4788; Gelvin, Stanton B. and Schilperoort, Robert A, Plant Molecular Biology Manual., 2^nd Ed. – Dordrecht Kluwer Academic Publ., 1995. – in Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R.; Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993. – 360 S., ISBN 0-8493-5164-2). Zum Beispiel kann Raps mittels Kotyledonen- oder Hypokotyltransformation transformiert werden (Moloney et al., 1989 Plant Cell Report 8: 238–242; De Block et al., 1989 Plant Physiol. 91: 694–701). Die Verwendung von Antibiotika für die Agrobacterium- und Pflanzenselektion hängt von dem für die Transformation verwendeten Vektor und dem Agrobacterium-Stamm ab. Eine Rapsselektion wird normalerweise unter Verwendung von Kanamycin als ein selektierbarer Pflanzenmarker durchgeführt. Ein Agrobacterium vermittelter Gentransfer bei Flachs kann z.B. unter Verwendung einer Technik durchgeführt werden, die von Mlynarova et al., 1994 Plant Cell Report 13: 282–285, beschrieben wird. Zusätzlich kann eine Transformation von Sojabohne z.B. unter Verwendung einer Technik durchgeführt werden, die in dem Europäischen Patent Nr. 0424 047, in dem U.S. Patent Nr. 5,322,783, in dem Europäischen Patent Nr. 0397 687, in dem U.S. Patent Nr. 5,376,543 oder dem U.S. Patent Nr. 5,169,770 beschrieben ist. Eine Transformation von Mais kann durch einen Partikelbeschuss, eine Polyäthylenglykol vermittelte DNA-Aufnahme oder durch die Silizium-Carbid-Fasertechnik erreicht werden (siehe z.B. Freeling und Walbot "The maize handbook" Springer Verlag: New York (1993) ISBN 3-540-97826-7). Ein spezielles Beispiel einer Maistransformation ist in dem U.S. Patent Nr. 5,990,387 zu finden. Ein spezifisches Beispiel einer Weizentransformation kann in der PCT-Anmeldung Nr. WO 93/07256 gefunden werden.
Bei einer stabilen Transfektion von Säugerzellen ist bekannt, dass in Abhängigkeit des verwendeten Expressionsvektors und der Transfektionstechnik nur eine kleine Fraktion von Zellen die fremde DNA in ihr Genom integrieren kann. Um diese Integranten zu identifizieren und zu selektieren, wird im Allgemeinen ein Gen, das für einen selektierbaren Marker kodiert (z.B. Resistenz gegenüber Antibiotika) in die Wirtszelle gemeinsam mit dem Gen von Interesse eingeführt. Bevorzugte selektierbare Marker schließen diejenigen ein, welche eine Resistenz gegenüber Pharmazeutika, wie z.B. G418, Hygromycin und Methotrexat verleihen, oder die in Pflanzen eine Resistenz gegenüber einem Herbizid wie z.B. Glyphosat oder Glufosinat verleihen. Nukleinsäuremoleküle, die für einen selektierbaren Marker kodieren, können auf demselben Vektor, wie der, der für ein PKSRP kodiert, oder auf einem seperaten Vektor in eine Wirtszelle eingeführt werden. Stabil mit dem eingeführten Nukleinsäuremolekül transfizierte Zellen können z.B. durch Pharmazeutika-Selektion identifiziert werden (z.B. werden Zellen, die ein selektierbares Marker-Gen aufgenommen haben, überleben, während die anderen Zellen sterben).
Um einen homologen rekombinanten Mikroorganismus zu erzeugen, wird ein Vektor bereitgestellt, der mindestens einen Anteil eines PKSRP Gens enthält, in welches eine Deletion, Addition oder Substitution eingeführt worden ist, wodurch das PKSRP Gen verändert, z.B. funktionell disrumpiert ist. Bevorzugt ist das PKSRP Gen ein Physcomitrella patens PKSRP Gen, es kann jedoch ein Homologes aus einer verwandten Pflanze oder sogar aus einer Säuger-, Hefe- oder Insektenquelle sein. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Vektor so konstruiert, dass das endogene PKSRP Gen nach homologer Rekombination funktionell disrumpiert wird (d.h., dass es nicht länger für ein funktionelles Protein kodiert; auch als ein „knock-out"-Vektor bezeichnet). Alternativ kann der Vektor so konstruiert werden, dass das endogene PKSRP Gen nach homologer Rekombination mutiert oder anderweitig verändert wird, aber noch für ein funktionelles Protein kodiert (z.B. kann die stromaufwärts gelegene Regulatorregion verändert werden, wodurch sich die Expression des endogenen PKSRP Gens verändert). Um mittels homologer Rekombination eine Punktmutation zu kreieren, können DNA-RNA-Hybride in einer als chimären Plastik bekannten Technik verwendet werden (Cole-Strauss et al., 1999 Nucleic Acids Research 27(5): 1323–1330 und Kmiec, 1999 Gene therapy American Scientist. 87(3): 240–247). Homologe Rekombinationsmethoden in Physcomitrella patens sind im Stand der Technik wohl bekannt und sind hierin für eine Verwendung vorgesehen.
Dahingegen wird in dem homologen rekombinanten Vektor der veränderte Anteil des PKSRP Gens an seinen 5'- und 3'-Enden durch ein zusätzliches Nukleinsäuremolekül des PKSRP Gens flankiert, um eine homologe Rekombination in einem Mikroorganismus oder einer Pflanze zu gestatten, die zwischen dem exogenen PKSRP Gen, das durch den Vektor übertragen wird und einem endogenen PKSRP Gen erfolgen soll. Das zusätzliche flankierende PKSRP- Nukleinsäuremolekül weist für eine erfolgreiche homologe Rekombination mit dem endogenen Gen eine hinreichende Länge auf. Typischerweise werden mehrere 100 Basenpaare bis zu Kilobasen einer flankierenden DNA (sowohl an den 5'- als auch an den 3'-Enden) in den Vektor eingefügt (siehe z.B. Thomas, K. R., and Capecchi, M. R., 1987 Cell 51: 503 für eine Beschreibung homologer Rekombinatinsvektoren oder Strepp et al., 1998 PNAS, 95 (8): 4368–4373 für eine cDNA basierte Rekombination in Physcomitrella patens). Der Vektor wird in einen Mikroorganismus oder eine Pflanzenzelle eingeführt (z.B. mittels Plyäthylenglykol-vermittelter DNA) und Zellen, in denen das eingeführte PKSRP Gen mit dem endogenen PKSRP Gen homolog rekombiniert hat, werden unter Verwendung von Techniken, die in dem Fachgebiet bekannt sind, selektiert.
In einer anderen Ausführungsform können rekombinante Mikroorganismen produziert werden, die ausgewählte Systeme enthalten, die eine regulierte Expression des eingefügten Gens gestatten. Zum Beispiel ermöglicht der Einschluss eines PKSRP Gens, das unter die Kontrolle des lac-Operons gestellt wird, in einen Vektor eine Expression des PKSRP Gens nur in Anwesenheit von IPTG. Solche regulatorischen Systeme sind in dem Fachgebiet wohl bekannt.
Eine erfindungsgemäße Wirtszelle, wie z.B. eine prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle in einer Kultur kann verwendet werden, um ein PKSRP zu produzieren (d.h. exprimieren). Entsprechend stellt die Erfindung weiterhin Verfahren zur Produktion von PKSRP's unter Verwendung der erfindungsgemäßen Wirtszellen bereit. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren das Kultivieren der erfindungsgemäßen Wirtszelle (in welche ein rekombinanter Expressionsvektor, der für ein PKSRP kodiert, eingeführt worden ist oder in deren Genom ein für ein Wildtyp oder verändertes PKSRP kodierendes Gen eingeführt worden ist) in einem geeigneten Medium, bis das PKSRP produziert wird. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Verfahren weiterhin das Isolieren der PKSRP's aus dem Medium oder der Wirtszelle.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft isolierte PKSRP's und biologisch aktive Anteile davon. Ein „isoliertes bzw. isolierter" oder „aufgereinigtes oder aufgereinigter" Protein oder biologisch aktiver Bestandteil davon ist frei von irgendwelchem zellulärem Material, wenn es bzw. er durch rekombinante DNA-Techniken produziert wird oder frei von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien wenn es bzw. er chemisch sythetisiert wird. Die Formulierung „im Wesentlichen frei von zellulärem Material" schließt PKSRP-Präparationen ein, in denen das Protein von jedweden Zellbestandteilen der Zelle, in der es natürlich oder rekombinant produziert wird, separiert wird. In einer Ausführungsform schließt „im Wesentlichen frei von zellulärem Material" Präparationen eines PKSRPs ein, die weniger als etwa 30% (nach Trockengewicht) an Nicht-PKSRP-Material (hierin auch als „kontaminierendes Protein" bezeichnet), mehr bevorzugt weniger als etwa 20% an Nicht-PKSRP-Material, noch mehr bevorzugt weniger als etwa 10% an Nicht-PKSRP-Material und am meisten bevorzugt weniger als 5% Nicht-PKSRP-Material aufweisen.
Wenn das PKSRP oder ein biologisch aktiver Anteil davon rekombinant produziert wird, ist es bzw. ist er vorzugsweise im Wesentlichen frei von Kulturmedium, d.h. Kulturmedium repräsentiert weniger als etwa 20%, mehr bevorzugt weniger als etwa 10% und am meisten bevorzugt weniger als etwa 5% des Volumes der Proteinpräparation. Die Formulierung „im Wesentlichen frei von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien" schließt PKSRP Präparationen ein, in denen das Protein von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien, die in die Synthese des Proteins involviert sind, abgetrennt ist. In einer Ausführungsform schließt die Formulierung „im Wesentlichen frei von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien" Präparationen eines PKSRPs ein, die weniger als etwa 30% (nach Trockengewicht) an chemischen Vorläufern oder Nicht-PKSRP-Chemikalien, mehr bevorzugt weniger als etwa 20% chemischer Vorläufer oder Nicht-PKSRP-Chemikalien, noch mehr bevorzugt weniger als etwa 10% chemischer Vorläufer oder Nicht-PKSRP-Chemikalien und am meisten bevorzugt weniger als etwa 5% chemischer Vorläufer oder Nicht-PKSRP-Chemikalien aufweisen. In bevorzugten Ausführungsformen fehlen den isolierten Proteinen oder biologisch aktiven Anteilen davon kontaminierende Proteine aus demselben Organismus, von dem das PKSRP abgeleitet ist. Typischerweise werden solche Proteine durch rekombinante Expression z.B. eines Physcomitrella patens-PKSRP's in anderen Pflanzen als Physcomitrella patens oder Mikroorganismen, wie z.B. C. glutamicum, Ciliaten, Algen oder Pilzen produziert.
Die hierin beschriebenen Nukleinsäuremoleküle, Proteine, Proteinhomologe, Fusionsproteine, Primer, Vektoren und Wirtszellen können in einem oder mehreren der folgenden Verfahren verwendet werden: Identifikation von Physcomitrella patens und verwandten Organismen, Kartierung von Genomen von Organismen, die zu Physcomitrella patens verwandt sind; Identifikation und Lokalisierung von Physcomitrella patens-Sequenzen von Interesse; evolutionäre Studien; Bestimmung von PKSRP-Regionen, die für eine Funktion benötigt werden; Modulation einer PKSRP-Aktivität; Modulation des Metabolismus einer oder mehrerer Zellfunktionen; Modulation des Transmembran-Transportes einer oder mehrerer Verbindungen und Modulation der Stressresistenz.
Das Moos Physcomitrella patens repräsentiert ein Mitglied der Moose. Es ist zu anderen Moosen wie z.B. Ceratodon purpureus, das in der Lage ist in Abwesenheit von Licht zu wachsen, verwandt. Moose wie Ceratodon und Physcomitrella weisen einen hohen Homologiegrad auf der DNA-Sequenz- und Polypeptid-Ebene auf, was die Verwendung eines heterologen Durchsuchens nach DNA-Molekülen mit Proben gestattet, die von anderen Moosen oder Organismen entwickelt wurden, wodurch das Ableiten einer Konsenses-Sequenz ermöglicht wird, die für ein heterologes Durchsuchen oder eine funktionelle Erläuterung und Vorhersage von Genfunktionen in dritten Arten geeignet ist. Die Fähigkeit, solche Funktionen zu identifizieren, kann daher eine signifikante Relevanz, z.B. für die Vorhersage einer Substratspezifität eines Enzyms haben. Weiterhin können diese Nukleinsäuremoleküle als Referenzpunkte für die Kartierung von Moos-Genomen oder von Genomen verwandter Organismen dienen.
Die erfindungsgemäßen PKSRP-Nukleinsäuremoleküle weisen eine Vielzahl an Verwendungen auf. Die Wichtigste ist, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen verwendet werden können, um Pflanzen zu transformieren, um dadurch eine Toleranz gegenüber Trockenheit zu induzieren. Die vorliegende Erfindung stellt daher eine transgene Pflanze bereit, die mit einer PKSRP Nukleinsäure transformiert ist, worin die Expression der Nukleinsäuresequenz in der Pflanze zu einer, verglichen mit einer Wildtypvarietät der Pflanze, erhöhten Toleranz gegenüber Trockenheit führt. Die transgene Pflanze kann eine Monokotyledone oder eine Dikotyledone sein. Die Erfindung sieht weiterhin vor, dass die transgene Pflanze z.B. aus Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Sojabohne, Erdnuss, Baumwolle, Raps, Canola-Raps, Maniok, Pfeffer, Sonnenblume, Tagetes, Nachtschattengewächsen, Kartoffel, Tabak, Aubergine, Tomate, Vicia-Arten, Erbse, Alfalfa, Kaffee, Kakao, Tee, Salix-Arten, Ölpalme, Kokosnuss, mehrjährigem Gras und Futterpflanzen ausgewählt werden kann.
Insbesondere beschreibt die vorliegende Erfindung die Expression von PK-6 von Physcomitrella patens, um trockentolerante Pflanzen zu konstruieren. Diese Strategie ist hierin für Arabidopsis thaliana, Raps/Canola-Raps, Sojabohnen, Getreide und Weizen dargestellt wobei ihre Verwendung auf diese Pflanzen nicht beschränkt ist. Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die das PKSRP PK-6 (SEQ ID NO: 27) enthält, worin der Umweltstress Trockenheit ist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zur Modifikation der Stresstoleranz einer Pflanze bereit, die ein Modifizieren in der Expression eines PKSRPs in der Pflanze umfassen. Die Erfindung sieht vor, dass dieses Verfahren so durchgeführt werden kann, dass die Stresstoleranz entweder erhöht oder erniedrigt wird. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze bereit, die eine, verglichen mit einer Wildtypvarietät der Pflanze, erhöhte Toleranz gegenüber Trockenstress aufweist, wobei das Verfahren eine Erhöhung der Expression eines PKSRPs in einer Pflanze umfasst.
Die Verfahren zur Erhöhung der Expression von PKSRPs können verwendet werden, worin die Pflanze entweder transgen oder nicht-transgen ist. In Fällen, in denen die Pflanze transgen ist, kann die Pflanze mit einem Vektor transformiert sein, der jegliche der oben beschriebenen PKSRP kodierenden Nukleinsäuren enthält, oder die Pflanze kann z.B. mit einem Promotor transformiert sein, der die Expression eines nativen PKSRPs in der Pflanze steuert. Die Erfindung sieht vor, dass ein solcher Promotor gewebsspezifisch sein kann. Weiterhin kann ein solcher Promotor entwicklungsreguliert sein. Alternativ können nicht-transgene Pflanzen eine native PKSRP Expression aufweisen, die durch Induzieren eines nativen Promotors modifiziert ist.
Die Expression von PK-6 (SEQ ID NO: 14) in Zielpflanzen kann durch eines der folgenden, nicht limitierenden Beispiele erreicht werden: (a) konstitutiver Promotor, (b) stressinduzierbarer Promotor, (c) chemisch induzierter Promotor und (d) technisierte Promotor-Überexpression, z.B. mit Zinkfinger abgeleiteten Transkriptionsfaktoren (Greisman und Pabo, 1997 Science 275: 657). Der letzte Fall beinhaltet die Identifikation des PK-6 (SEQ ID NO: 27) Homologen in der Zielpflanze sowie seines Promotors. Zinkfinger enthaltende rekombinante Transkriptionsfaktoren werden konstruiert, um spezifisch mit dem PK-6 (SEQ ID NO: 27) Homologen zu interagieren, wodurch eine Transkription des korrespondierenden Gens aktiviert wird.
Zusätzlich zu dem Einführen der PKSRP-Nukleinsäuresequenzen in transgene Pflanzen können diese Sequenzen auch verwendet werden, um einen Organismus als Physcomitrella patens oder einen engen Verwandten davon zu identifizieren. Auch können sie dazu verwendet werden, um die Anwesenheit von Physcomitrella patens oder eines Verwandten davon in einer gemischten Population von Mikroorganismen zu identifizieren. Die Nukleinsäuresequenzen mehrerer Physcomitrella patens Gene werden durch Beproben der extrahierten genomischen DNA einer Kultur einer einzelnen oder gemischten Population von Mikroorganismen unter stringenten Bedingungen mit einer Probe, die eine Region eines Physcomitrella patens Gens umspannt, welches einzigartig für diesen Organismus ist, bereitgestellt, so dass man bestimmen kann, ob dieser Organismus vorhanden ist.
Weiterhin können die Nukleinsäure- und Proteinmoleküle der Erfindung als Marker für spezifische Regionen des Genoms dienen. Dies hat nicht nur einen Nutzen bei der Kartierung des Genoms sondern auch bei funktionellen Studien von Physcomitrella patens Proteinen. Um z.B. die Region des Genoms zu identifizieren, an die ein besonderes Physcomitrella patens DNA Bindeprotein bindet, könnte das Physcomitrella patens Genom verdaut werden und die Fragmente mit dem DNA-Bindeprotein inkubiert werden. Diese Fragmente, die das Protein binden, können zusätzlich, bevorzugt mit leicht detektierbaren Markierungen, mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen beprobt werden. Das Binden eines solchen Nukleinsäuremoleküls an das Genom-Fragment ermöglicht die Lokalisierung des Fragmentes auf der Genomkarte von Physcomitrella patens und ermöglicht, wenn mehrere Male mit unterschiedlichen Enzymen durchgeführt, eine schnelle Bestimmung der Nukleinsäuresequenz, an welche das Protein bindet. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle hinreichend homolog zu den Sequenzen verwandter Arten sein, so dass diese Nukleinsäuremoleküle als Marker für die Konstruktion einer genomischen Karte in verwandten Moosen dienen können.
Die erfindungsgemäßen PKSRP Nukleinsäuremoleküle sind auch für evolutionäre- und Proteinstrukturstudien verwendbar. Die metabolischen- und Transportprozesse, an denen die erfindungsgemäßen Moleküle beteiligt sind, werden von einer Vielzahl prokaryontischer und eukaryontischer Zellen genutzt. So kann durch Vergleichen der Sequenzen der Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung mit denen, die für ähnliche Enzyme aus anderen Organismen kodieren, die evolutionäre Verwandtschaft der Organismen beurteilt werden. Ebenso gestattet ein solcher Vergleich eine Beurteilung, welche Regionen der Sequenz konserviert sind und welche nicht und welche bei der Bestimmung derjenigen Regionen des Proteins, die für das Funktionieren des Enzyms essenziell sind, helfen können. Diese Art der Bestimmung ist für Proteinkonstruktionsstudien von Wert und kann einen Hinweis darauf geben, was das Protein im Hinblick auf eine Mutagenese ohne Funktionsverlust tolerieren kann.
Die Manipulation der erfindungsgemäßen PKSRP Nukleinsäuremoleküle kann zur Herstellung von PKSRP's führen, die funktionelle Unterschiede gegenüber den Wildtyp-PKSRP's aufweisen. Diese Proteine können eine verbesserte Wirksamkeit oder Aktivität aufweisen, können in größerer Anzahl als gewöhnlich in der Zelle vorhanden sein oder können in ihrer Wirksamkeit oder Aktivität herabgesetzt sein. Es gibt eine Reihe von Mechanismen, bei denen die Veränderung eines erfindungsgemäßen PKSRPs eine Stressantwort und/oder Stresstoleranz direkt beeinflussen kann. Im Falle von Pflanzen, die PKSRP's exprimieren, kann ein erhöhter Transport zu einer verbesserten Salz- und/oder gelöster Stoffaufteilung innerhalb der Pflanzengewebe und Organe führen. Entweder durch die Erhöhung der Anzahl oder der Aktivität der Transportermoleküle, welche ionische Moleküle aus der Zelle exportieren, kann es möglich sein, die Salztoleranz der Zelle zu beeinflussen.
Die Auswirkung der genetischen Modifikation in Pflanzen, C. glutamicum, Pilzen, Algen oder Ciliaten auf die Stresstoleranz kann durch das Wachsen der modifizierten Mikroorganismen oder Pflanzen unter weniger geeigneten Bedingungen und anschließendes Analysieren der Wachstumscharakteristika und/oder des Pflanzenmetabolismus beurteilt werden. Solche Analysetechniken sind einem Fachmann wohl bekannt und beinhalten das Trockengewicht, das Nassgewicht, die Proteinsynthese, die Kohlenhydratsynthese, die Lipid-Synthese, das Evapotranspirationsniveaus, allgemeine Pflanzen- und/oder Anbauerträge, Blütenbildung, Reproduktion, Samenbildung, Wurzelwachstum, Respirationsniveaus, Photosynthese-Niveaus, etc. (Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17; Rehm et al., 1993 Biotechnology, vol. 3, Chapter III: Product recovery and purification, page 469–714, VCH: Weinheim; Belter, P. A. et al., 1988 Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J. F. und Cabral., J. M. S., 1992 Recovery processes for biological materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J. A. und Henry, J. D., 1988 Biochemical separations, in: Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. B3, Chapter 11, page 1–27, VCH: Weinheim; und Dechow, F. J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).
Zum Beispiel können Hefe-Expressionsvektoren, die die hierin offenbarten Nukleinsäuren oder Fragmente davon umfassen, unter Verwendung von Standardprotokollen konstruiert und in Saccharomyces cerevisiae transformiert werden. Die resultierenden transgenen Zellen können dann hinsichtlich eines Ausfalles oder einer Veränderung ihrer Toleranz gegenüber Trockenheit-, Salz- und Temperaturstress untersucht werden. Ebenso können Pflanzenexpressionsvektoren, die die hierin offenbarten Nukleinsäuren oder Fragmente davon umfassen, unter Verwendung von Standardprotokollen konstruiert und in eine geeignete Pflanzenzelle, wie z.B. Arabidopsis, Soja, Raps, Mais, Weizen, Medicago truncatula, etc. transformiert werden. Die resultierenden transgenen Zellen und/oder davon abgeleiteten Pflanzen können dann hinsichtlich eines Ausfalles oder einer Veränderung ihrer Toleranz gegenüber Trocken-, Salz- und Temperaturstress untersucht werden.
Die Konstruktion eines oder mehrerer erfindungsgemäßer PKSRP Gene kann auch zu PKSRP's führen, die veränderte Aktivitäten aufweisen, welche die Stressantwort und/oder Stresstoleranz von Algen, Pflanzen, Ciliaten oder Pilzen oder anderen Mikroorganismen wie C. glutamicum indirekt beeinflussen. Zum Beispiel führen die normalen biochemischen Prozesse des Metabolismus zur Herstellung einer Vielzahl von Produkten (z.B. Wasserstoffperoxid und andere reaktive Sauerstoffspezies), welche aktiv mit denselben metabolischen Prozessen interferieren können (z.B. ist bekannt, dass Peroxinitrit Tyrosin-Seitenketten nitriert, wodurch einige Enzyme inaktiviert werden, die Tyrosin an der aktiven Stelle aufweisen (Groves, J. T., 1999 Curr. Opin. Chem. Biol. 3(2): 226–235)). Während diese Produkte typischerweise ausgeschieden werden, können Zellen genetisch verändert werden, um mehr Produkte zu transportieren als es für eine Wildtypzelle typisch ist. Durch Optimieren der Aktivität eines oder mehrerer erfindungsgemäßer PKSRP's, die in den Export spezifischer Moleküle, wie z.B. Salzmoleküle involviert sind, kann es möglich sein, die Stresstoleranz der Zelle zu verbessern.
Zusätzlich können die hierin offenbarten Sequenzen oder Fragmente davon verwendet werden, um Knockout-Mutationen in den Genomen verschiedener Organismen, wie z.B. Bakterien, Säugerzellen, Hefezellen und Pflanzenzellen zu generieren (Girke, T., 1998 The Plant Journal 15: 39–48). Die resultierenden Knockout-Zellen können dann hinsichtlich ihrer Fähigkeit oder Kapazität, verschiedene Stressbedingungen zu tolerieren, hinsichtlich ihrer Antwort auf verschiedene Stressbedingungen und hinsichtlich der Auswirkung der Mutation auf dem Phänotyp und/oder Genotyp bewertet werden. Für andere Verfahren der Gen-Inaktivierung siehe U.S. Patent Nr. 6004804 "Non-Chimeric Mutational Vectors" und Puttaraju et al., 1999 Spliceosome-mediated RNA trans-splicing as a tool for gene therapy Nature Biotechnology 17: 246–252.
Die oben genannten Mutagenese-Strategien für PKSRP's, die zu einer erhöhten Stressresistenz führen, sind nicht als limitierend zu erachten. So sind Variationen dieser Strategien für einen Fachmann leicht offensichtlich. Unter Verwendung solcher Strategien können die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Proteinmoleküle unter Einbeziehung der hierin offenbarten Mechanismen dazu genutzt werden, um Algen, Ciliaten, Pflanzen, Pilze und andere Mikroorganismen wie C. glutamicum zu generieren, die mutierte PKSRP-Nukleinsäure- und Proteinmoleküle exprimieren, so dass die Stresstoleranz verbessert wird.
Antikörper, die spezifisch an ein PKSRP oder an einen Anteil davon binden, die bzw. der von einer hierin beschriebenen Nukleinsäure kodiert wird, können auch bereitgestellt werden. Antikörper können durch viele, wohlbekannte Verfahren erzeugt werden (siehe z.B. Harlow and Lane, "Antibodies; A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1988)). Aufgereinigte Antigene können beispielsweise in ein Tier, in einer Menge und in Intervallen, die hinreichend sind, um eine Immunantwort auszulösen, injiziert werden. Antikörper können entweder direkt aufgereinigt werden, oder es können Milzzellen aus dem Tier erhalten werden. Die Zellen können dann mit einer unsterblichen Zelllinie fusioniert und auf eine Antikörpersekretion hin untersucht werden. Die Antikörper können verwendet werden, um Nukleinsäure- bzw. Klonbibliotheken nach Zellen zu durchsuchen, die das Antigen sekretieren. Diese positiven Klone können dann sequenziert werden (siehe z.B. Kelly et al., 1992 Bio/Technology 10: 163–167; Bebbington et al., 1992 Bio/Technology 10: 169–175).
Die Ausdrücke „bindet selektiv" und „bindet spezifisch" mit dem Polypeptid bezeichnen eine Bindungsreaktion, die bestimmend für die Anwesenheit des Proteins in einer heterogenen Population von Proteinen und anderen biologischen Präparaten ist. So binden die spezifizierten Antikörper, die an ein bestimmtes Protein gebunden sind, unter bestimmten Immuntest-Bedingungen nicht in einer signifikanten Menge an andere, in der Probe vorhandene Proteine. Eine selektive Bindung eines Antikörpers unter solchen Bedingungen kann einen Antikörper erfordern, der nach seiner Spezifität für ein bestimmtes Protein ausgewählt wird. Eine Vielzahl von Immuntest-Formaten kann verwendet werden, um Antikörper zu selektieren, die selektiv an ein bestimmtes Protein binden. Zum Beispiel werden Festphasen-ELISA-Immuntests routinemäßig verwendet, um Antikörper, die gegenüber einem Protein selektiv immunoreaktiv sind, zu selektieren. Für eine Beschreibung von Immunotest-Formaten und Bedingungen, die verwendet werden können, um eine selektive Bindung zu bestimmen, sei auf Harlow and Lane, "Antibodies; A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1988) verwiesen.
In einige Fällen ist es gewünscht, monoklonale Antikörper aus verschiedenen Wirten zu präparieren. Eine Beschreibung von Techniken für das Präparieren solcher monoklonalen Antikörper kann in Stites et al., editors, "Basic and Clinical Immunology," (Lange Medical Publications, Los Altos, Calif, Fourth Edition) und in den hierin zitierten Referenzen und in Harlow and Lane ("Antibodies, A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Publications, New York. 1988) gefunden werden.
In dieser Anmeldung wird auf verschiedene Publikationen Bezug genommen.
Die Erfindung wird weiterhin durch die folgenden Beispiele illustriert, welche nicht auf irgend eine Weise auszulegen sind, als das sie dem Umfang der Erfindung Beschränkungen auferlegen.
BEISPIELE
Beispiel 1
Wachstum von Physcomitrella patens-Kulturen
Für diese Studien wurden Pflanzen der Art Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. aus der Sammlung der Fachgruppe für genetische Studien der Universität Hamburg verwendet. Sie stammen aus dem von H.L.K. Whitehouse in Gransden Wood, Huntingdonshire (England) gesammeltem Stamm16/14, der ausgehend von einer Spore durch Engel (1968, Am. J. Bot. 55, 438–446) subkultiviert wurde. Eine Proliferation der Pflanzen wurde mittels Sporen und mittels Regeneration der Gametophyten durchgeführt. Das Protonema, an welchem sich nach etwa 12 Tagen Knospen bildeten, entwickelte sich aus der haploiden Spore zu einem chloroplastenreichen Chloronema und einem chloroplastenarmen Caulonema. Diese wuchsen, um Gametophoren hervorzubringen, welche Antheridien und Archegonien tragen. Nach der Befruchtung entwickelten sich die diploide Sporophyte mit einer kurzen Seta und die Sporenkapsel, in welchen die Mejosporen reiften.
Die Kultivierung wurde in einer klimatisierten Kammer bei einer Temperatur von 25°C und einer Lichtintensität von 55 Mikromolen^–Im2 (Weisslicht; Philips TL 65 W/25 Fluoreszenzröhre) und einem Licht/Dunkelwechsel von 16/8 Stunden durchgeführt. Das Moos wurde entweder in einer Flüssigkultur unter Verwendung von Knop-Medium gemäß Reski und Abel (1985, Planta 165: 354–358) modifiziert oder auf festem Knop-Medium unter Verwendung von 1% Oxoid-Agar (Unipath, Basingstoke, England) kultiviert. Die für die RNA- und DNA-Isolation verwendeten Protonemata wurden in belüfteten Flüssigkulturen kultiviert. Die Protonemata wurden alle 9 Tage geteilt und in frisches Kulturmedium transferiert.
Beispiel 2
Gesamt-DNA-Isolation aus Pflanzen
Die Details für die Isolation von Gesamt-DNA beziehen sich auf die Verarbeitung von 1 g Frischgewicht des Pflanzenmaterials. Die verwendeten Materialien beinhalten die folgenden Puffer: CTAB-Puffer: 2% (Gewicht/Volumen) N-cethyl-N,N,N-trimethylammonium bromid (CTAB); 100 mM Tris HCl pH 8.0; 1.4 M NaCl; 20 mM EDTA N-Laurylsarcosin-Puffer; 10% (Gewicht/Volumen) N-Laurylsarcosin; 100 mM Tris HCl pH 8,0; 20 mM EDTA.
Das Pflanzenmaterial wurde unter flüssigem Stickstoff mit einem Mörser zerrieben, um ein feines Pulver zu erhalten und in 2 ml Eppendorfgefäße transferiert. Das gefrorene Pflanzenmaterial wurde dann mit einer Schicht aus 1 ml Aufschlusspuffer (1 ml CTAB-Puffer 100 μl N-laurylsarcosin-Puffer, 20 μl β-mercaptoethanol und 10 μl Proteinase K Lösung, 10 mg/ml) bedeckt und bei 60°C für 1 Stunde unter kontinuierlichem Schütteln inkubiert. Das erhaltene Homogenat wurde auf 2 Eppendorfgefäße (2 ml) verteilt und unter Schütteln mit demselben Volumen an Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) 2 mal extrahiert. Für eine Phasentrennung wurde jeweils eine Zentrifugation bei 8000 × g und Raumtemperatur für 15 Minuten durchgeführt. Die DNA wurde dann bei –70°C für 30 Minuten unter Verwendung von eisgekühltem Isopropanol präzipitiert. Die präzipitierte DNA wurde bei 4°C und 10.000 g für 30 Minuten sedimentiert und in 180 μl TE-Puffer (Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) resuspendiert. Für eine weitere Aufreinigung wurde die DNA mit NaCl (1,2 M Endkonzentration) behandelt und abermals bei –70°C für 30 Minuten unter Verwendung des 2-fachen Volumens an absolutem Ethanol präzipitiert. Nach einem Waschschritt mit 70% Ethanol wurde die DNA getrocknet und nachfolgend in 50 μl H₂O + RNAse (50 mg/ml Endkonzentration) aufgenommen. Die DNA wurde über Nacht bei 4°C aufgelöst und nachfolgend wurde der RNAse-Verdau bei 37°C für 1 Stunde durchgeführt. Die Lagerung der DNA erfolgte bei 4°C.
Beispiel 3
Isolation von Gesamt-RNA und poly-(A)+ RNA und Herstellung einer cDNA-Bibliothek aus Physcomitrella patens
Für die Untersuchung von Transkripten wurden sowohl Gesamt-RNA als auch poly-(A)+ RNA isoliert. Die Gesamt-RNA wurde aus 9 Tage alten Wildtyp-Protonemata gemäß der GTC-Methode (Reski et al. 1994, Mol. Gen. Genet., 244: 352–359) erhalten. Die Poly(A)+ RNA wurde unter Verwendung von Dyna Beads^® (Dynal, Oslo, Norwegen) gemäß den Anleitungen des Herstellerprotokolls isoliert. Nach Bestimmung der Konzentration der RNA oder der poly(A)+ RNA wurde die RNA durch Zusatz von 1/10 Volumen 3 M Natrium-Acetat pH 4,6 und 2 Volumen Ethanol präzipitiert und bei –70°C gelagert.
Für die Konstruktion einer cDNA-Bibliothek wurde eine Erststrang-Synthese unter Verwendung einer Murines-Leukemia-Virus-reversen Transkriptase (Roche, Mannheim, Deutschland) und Oligo-d(T)-Primern und eine Zweistrang-Synthese durch Inkubation mit DNA-Polymerase I, Klenow-Enzym und RNAseH-Verdau bei 12°C (2 Stunden), 16°C (1 Stunde) und 22°C (1 Stunde) erreicht. Die Reaktion wurde durch Inkubation bei 65°C (10 Minuten) gestoppt und nachfolgend auf Eis transferiert. Doppelsträngige DNA-Moleküle wurden durch T4-DNA-Polymerase (Roche, Mannheim) bei 37°C (30 Minuten) stumpfendig gemacht. Nukleotide wurden durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Sephadex G50 Zentrifugationssäulen entfernt. EcoRI-Adaptoren (Pharmacia, Freiburg, Deutschland) wurden mit den cDNA-Enden durch T4-DNA-Ligase (Roche, 12°C, über Nacht) ligiert und durch Inkubation mit Polynukleotidkinase (Roche, 37°C, 30 Minuten) phosphoryliert. Die Mischung wurde einer Separation auf einem niedrig schmelzenden Agarose-Gel unterzogen. DNA-Moleküle, die größer als 300 Basenpaare sind, wurden aus dem Gel eluiert, Phenol-extrahiert, auf Elutip-D-Säulen (Schleicher und Schuell, Dassel, Deutschland) konzentriert und mit Vektorarmen ligiert und in Lambda-ZAP II-Phagen oder Lambda-ZAP-Expressphagen unter Verwendung des Gigapack Gold Kits (Stratagene, Amsterdam, Niederlande) unter Verwendung des Materials gemäß den Herstellerangaben verpackt.
Beispiel 4
Sequenzierung und Funktionserläuterung von Physcomitrella patens-ESTs
cDNA-Bibliotheken, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurden für eine DNA-Sequenzierung gemäß den Standardverfahren und insbesondere durch die Kettenterminationsmethode unter Verwendung des ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kits (Perkin-Elmer, Weiterstadt, Deutschland) verwendet. Ein Sequenzieren nach dem Zufallsprinzip („Random Sequencing") wurde im Anschluß an eine präparative Plasmid-Isolation aus cDNA-Bibliotheken mittels eines in vivo Massenausschlusses, Retransformation und nachfolgender Plattierung von DH10B auf Agar-Platten (Material und Protokoll-Details von Stratagene, Amsterdam, Niederlande) durchgeführt. Plasmid-DNA wurde von E. coli-Kulturen, die über Nacht in Luria-Broth-Medium, welches Ampicillin enthält (siehe Sambrook et al. 1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) gewachsen sind, in einem Qiagen-DNA-Präparationsroboter (Qiagen, Hilden) entsprechend den Herstellerprotokollen präpariert. Es wurden Sequenzierprimer mit den folgenden Nukleotidsequenzen verwendet:
Sequenzen wurden unter Verwendung des Software-Paketes EST-MAX, das kommerziell durch Bio-MAX (München, Deutschland) vertrieben wird, verarbeitet und kommentiert. Das Programm beinhaltet praktisch alte bioinformatischen Verfahren, die für eine funktionelle und strukturelle Charakterisierung von Proteinsequenzen von Bedeutung sind. Für eine Referenz wird auf die Web-Seite pedant.mips.biochem.mpg.de verwiesen. Die wichtigsten Algorithmen, die in EST-MAX integriert sind, sind: FASTA: Sehr sensitive Sequenz-Datenbanksuchen mit Abschätzungen von statistischer Signifikanz. Pearson W.R. (1990) Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA. Methods Enzymol. 183: 63–98; BLAST: Sehr sensitive Sequenz-Datenbanksuchen mit Abschätzungen von statistischer Signifikanz. Altschul S. F., Gish W., Miller W., Myers B. W. und Lipman D. J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology 215: 403–10; PREDATOR: Hoch-genaue Sekundärstruktur-Vorhersage von einzelnen und multiplen Sequenzen. Frishman, D. and Argos, P. (1997) 75% accuracy in protein secondary structure prediction. Proteins, 27: 329–335; CLUSTALW: Multipler Sequenzabgleich. Thompson, J. D., Higgins, D. G. and Gibson, T. J. (1994); CLUSTAL W: Verbessern der Sensitivität eines progressiven multiplen Sequenzabgleiches durch Sequenzwichtung, Positions-spezifische Lückennachteile („gap penalties"): und Gewichtsmatrix-Auswahl. Nucleic Acids Research, 22: 4673–4680; TMAP: Transmembranregion-Vorhersage aus vielfach abgeglichenen Sequenzen. Persson, B. und Argos, P. (1994) Prediction of transmembrane segments in proteins utilizing multiple sequence alignments. J. Mol. Biol. 237: 182–192; ALOM2: Transmembranregion-Vorhersage aus einzelnen Sequenzen. Klein, P., Kanehisa, M., and DeLisi, C.. Prediction of protein function from sequence properties: A discriminate analysis of a database. Biochim. Biophys. Acta 787: 221–226 (1984). Version 2 by Dr. K. Nakai; PROSEARCH: Detektion von PROSITE Proteinsequenzmustern. Kolakowski L. F. Jr., Leunissen J. A. M., Smith J. E. (1992) ProSearch: fast searching of protein sequences with regular expression patterns related to protein structure and function. Biotechniques 13, 919–921; BLIMPS: Ähnlichkeitssuchen gegen eine Datenbank lückenloser Blöcke. J. C. Wallace and Henikoff S., (1992); PATMAT: Eine Suche- und Extraktionsprogramm für Sequenz, Muster- und Blockabfragen und Datenbanken, CABIOS 8: 249–254. Geschrieben von Bill Alford.
Beispiel 5
Identifikation von Physcomitrella patens-ORF's, entsprechend PK-6, PK-7, PK-8, PK-9, CK-1, CK-2, CK-3, MPK-2, MPK-3, MPK-4, MPK-5, CPK-1 und CPK-2.
Die unten in Tabelle 1 gezeigten partiellen Physcomitrella patens cDNAs (ESTs) wurden in dem Physcomitrella patens EST-Sequenzprogramm unter Verwendung des Programmes EST-MAX durch BLAST-Analyse identifiziert. Die Sequenzidentifikations-Nummern, die diesen ESTs entsprechen, sind wie folgt: PK-6 (SEQ ID NO: 1), PK-7 (SEQ ID NO: 2), PK-8 (SEQ ID NO: 3), PK-9 (SEQ ID NO: 4), CK-1 (SEQ ID NO: 5), CK-2 (SEQ ID NO: 6), CK-3 (SEQ ID NO: 7), MPK-2 (SEQ ID NO: 8), MPK-3 (SEQ ID NO: 9), MPK-4 (SEQ ID NO: 10), MPK-5 (SEQ ID NO: 11), CPK-1 (SEQ ID NO: 12) und CPK-2 (SEQ ID NO: 13). Tabelle 1

* vergleichende Beispiele

Tabelle 2
Der Grad der Aminosäure-Identität und -Ähnlichkeit von PpPK-6 und anderen homologen Proteinen wurde unter Verwendung des GCG-Lückenprogrammes bestimmt: Lückennachteil („gap penalty"): 10; Lückenerweiterungsnachteil („gap extension penalty"): 0,1; Punktematrix: blosum 62
Tabelle 3
Der Grad der Aminosäure-Identität und -Ähnlichkeit von PpPK-7 und anderen homologen Proteinen wurde unter Verwendung des GCG-Lückenprogrammes bestimmt: Lückennachteil („gap penalty"): 10; Lückenerweiterungsnachteil („gap extension penalty"): 0,1; Punktematrix: blosum 62
Tabelle 4
Der Grad der Aminosäure-Identität und -Ähnlichkeit von PpPK-8 und anderen homologen Proteinen wurde unter Verwendung des GCG-Lückenprogrammes bestimmt: Lückennachteil („gap penalty"): 10; Lückenerweiterungsnachteil („gap extension penalty"): 0,1; Punktematrix: blosum 62
Tabelle 5
Der Grad der Aminosäure-Identität und -Ähnlichkeit von PpPK-9 und anderen homologen Proteinen wurde unter Verwendung des GCG-Lückenprogrammes bestimmt: Lückennachteil („gap penalty"): 10; Lückenerweiterungsnachteil („gap extension penalty"): 0,1; Punktematrix: blosum 62
Tabelle 6
Der Grad der Aminosäure-Identität und -Ähnlichkeit von PpCK-1 und anderen homologen Proteinen wurde unter Verwendung des GCG-Lückenprogrammes bestimmt: Lückennachteil („gap penalty"): 10; Lückenerweiterungsnachteil („gap extension penalty"): 0,1; Punktematrix: blosum 62
Tabelle 7
Der Grad der Aminosäure-Identität und -Ähnlichkeit von PpCK-2 und anderen homologen Proteinen wurde unter Verwendung des GCG-Lückenprogrammes bestimmt: Lückennachteil („gap penalty"): 10; Lückenerweiterungsnachteil („gap extension penalty"): 0,1; Punktematrix: blosum 62
Tabelle 8
Der Grad der Aminosäure-Identität und -Ähnlichkeit von PpCK-3 und anderen homologen Proteinen wurde unter Verwendung des GCG-Lückenprogrammes bestimmt: Lückennachteil („gap penalty"): 10; Lückenerweiterungsnachteil („gap extension penalty"): 0,1; Punktematrix: blosum 62
Tabelle 9
Der Grad der Aminosäure-Identität und -Ähnlichkeit von PpMPK-2 und anderen homologen Proteinen wurde unter Verwendung des GCG-Lückenprogrammes bestimmt: Lückennachteil („gap penalty"): 10; Lückenerweiterungsnachteil („gap extension penalty"): 0,1; Punktematrix: blosum 62
Tabelle 10
Der Grad der Aminosäure-Identität und -Ähnlichkeit von PpMPK-3 und anderen homologen Proteinen wurde unter Verwendung des GCG-Lückenprogrammes bestimmt: Lückennachteil („gap penalty"): 10; Lückenerweiterungsnachteil („gap extension penalty"): 0,1; Punktematrix: blosum 62
Tabelle 11
Der Grad der Aminosäure-Identität und -Ähnlichkeit von PpMPK-4 und anderen homologen Proteinen wurde unter Verwendung des GCG-Lückenprogrammes bestimmt: Lückennachteil („gap penalty"): 10; Lückenerweiterungsnachteil („gap extension penalty"): 0,1; Punktematrix: blosum 62
Tabelle 12
Der Grad der Aminosäure-Identität und -Ähnlichkeit von PpMPK-5 und anderen homologen Proteinen wurde unter Verwendung des GCG-Lückenprogrammes bestimmt: Lückennachteil („gap penalty"): 10; Lückenerweiterungsnachteil („gap extension penalty"): 0,1; Punktematrix: blosum 62
Tabelle 13
Der Grad der Aminosäure-Identität und -Ähnlichkeit von PpCPK-1 und anderen homologen Proteinen wurde unter Verwendung des GCG- Lückenprogrammes bestimmt: Lückennachteil („gap penalty"): 10; Lückenerweiterungsnachteil („gap extension penalty"): 0,1; Punktematrix: blosum 62
Tabelle 14
Der Grad der Aminosäure-Identität und -Ähnlichkeit von PpCPK-2 und anderen homologen Proteinen wurde unter Verwendung des GCG-Lückenprogrammes bestimmt: Lückennachteil („gap penalty"): 10; Lückenerweiterungsnachteil („gap extension penalty"): 0,1; Punktematrix: blosum 62
Beispiel 6
Klonierung der vollständigen Physcomitrella patens cDNA, die für PK-6, PK-7, PK-8, PK-9, CK-1, CK-2, CK-3, MPK-2, MPK-3, MPK-4, MPK-5, CPK-1 und CPK-2 kodiert.
Um die für PK-6 (SEQ ID NO: 14), PK-7 (SEQ ID NO: 15), PK-8 (SEQ-ID NO: 16), PK-9 (SEQ ID NO: 17), CK-1 (SEQ ID NO: 18), CK-2 (SEQ ID NO: 19), CK-3 (SEQ ID NO: 20), MPK-2 (SEQ ID NO: 21), MPK-3 (SEQ ID NO: 22), MPK-4 (SEQ ID NO: 23), MPK 5 (SEQ ID NO: 24), CPK-1 (SEQ ID NO: 25) und CPK-2 (SEQ ID NO: 26) kodierenden Klone aus Physcomitrella patens zu isolieren, wurden cDNA-Bibliotheken mit dem SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech Laboratories) gemäß den Herstellerangaben erstellt. Gesamt-RNA, die wie in Beispiel 3 beschrieben, isoliert wurde, wurde als das Templat verwendet. Die Kulturen wurden vor der RNA-Isolation wie folgt behandelt: Salzstress: 2, 6, 12, 24, 48 Stunden mit 1 M NaCl-supplementiertem Medium; Kältestress: 4°C für dieselben Zeitpunkte wie für Salz; Trockenstress: Kulturen wurden auf einem Trockenfilterpapier für dieselben Zeitpunkte wie für Salz inkubiert.
5' RACE-Protokoll
Die aus der wie in Beispiel 4 beschriebenen Datenbanksuche identifizierten EST-Sequenzen PK-6 (SEQ ID NO: 1), PK-7 (SEQ ID NO: 2), PK-8 (SEQ ID NO: 3), PK-9 (SEQ ID NO: 4), CK-1 (SEQ ID NO: 5), CK-2 (SEQ ID NO: 6), CK-3 (SE ID NO: 7), MPK-2 (SEQ ID NO: 8), MPK-3 (SEQ ID NO: 9), MPK-4 (SEQ ID NO: 10), MPK-5 (SEQ ID NO: 11), CPK-1 (SEQ ID NO: 12), und CPK-2 (SEQ ID NO: 13) wurden verwendet, um Oligomere für RACE zu konstruieren (siehe Tabelle 15). Die erweiterten Sequenzen für diese Gene wurden mittels Durchführen einer „Rapid Amplification of cDNA Ends"-Polymerase-Kettenreaktion (RACE-PCR) unter Verwendung des Advantage 2 PCR Kits (Clontech Laboratories) und des SMART RACE cDNA Amplifikationskits (Clontech Laboratories) unter Verwendung eines Biometra T3 Thermocyclers gemäß den Herstellerangaben erhalten. Die Sequenzen, die aus den RACE-Reaktionen erhalten wurden, entsprachen den vollständig kodierenden Regionen von CC-2 und CC-3 und wurden verwendet, um Oligomere für eine vollständige Klonierung des zugehörigen Gens zu konstruieren (für eine vollständige Amplifikation siehe unten).
Vollständige Amplifikation
Vollständige Klone, die PK-6 (SEQ ID NO: 14), PK-7 (SEQ ID NO: 15), PK-8 (SEQ ID NO: 16), PK-9 (SEQ ID NO: 17), CK-1 (SEQ ID NO: 18), CK-2 (SEQ ID NO: 19), CK-3 (SEQ ID NO: 20), MPK-2 (SEQ ID NO: 21), MPK-3 (SEQ ID NO: 22), MPK-4 (SEQ ID NO: 23), MPK-5 (SEQ ID NO: 24), CPK-1 (SEQ ID NO: 25) und CPK-2 (SEQ ID NO: 26) entsprechen, wurden mittels Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit Gen-spezifischen Primern (siehe Tabelle 15) und dem Original-EST als das Templat erhalten. Die Bedingungen für die Reaktion waren Standardbedingungen mit PWO-DNA-Polymerase (Roche). Die PCR wurde gemäß den Standardbedingungen und den Herstellerprotokollen (Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y., Biometra T3 Thermocycler) durchgeführt. Die Parameter für die Reaktion waren: 5 Minuten bei 94°C, gefolgt von 5 Zyklen für 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 50°C und 1,5 Minuten bei 72°C. Hiernach folgten 25 Zyklen für 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 65°C und 1,5 Minuten bei 72°C.
Die amplifizierten Fragmente wurden ans dem Agarose-Gel mit einem QIAquick-Gel-Extraktions-Kit (Qiagen) extrahiert und in den TOPOpCR 2.1 Vektor (Invitrogen) gemäß den Herstellerangaben ligiert. Rekombinante Vektoren wurden in Top10-Zellen (Invitrogen) unter Verwendung von Standardbedingungen transformiert (Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y.). Transformierte Zellen wurden auf ein Wachstum über Nacht bei 37°C auf LB-Agar, welcher 100 μg/ml Carbenicillin, 0,8 mg X-gal (5-Brom-4-Chlor-3-Indoyl-β-D-Galaktosid) und 0,8 mg IPTG (Isopropylthio-β-D-Galaktosid) enthält, selektiert. Weiße Kolonien wurden ausgewählt und zur Inokulation von 3 ml flüssigem LB, welches 100 μg/ml. Ampicillin enthält, verwendet und über Nacht bei 37°C kultiviert. Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des OIAprep Spin Miniprep Kits (Qiagen) gemäß den Herstellerangaben extrahiert. Eine Analyse nachfolgender Klone und eine Restriktionskartierung wurde gemäß den molekularbiologischen Standardtechniken durchgeführt (Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y.).
Tabelle 15
Programm und Primer, das bzw. die für die Klonierung von vollständigen Klonen verwendet wurde bzw. wurden.
Beispiel 7
Konstruktion stresstoleranter Arabidopsis-Pflanzen durch Überexpression der Gene PK-6, PK-7, PK-8, PK-9, CK-1, CK-2, CK-3, MPK-2, MPK-3, MPK-4, MPK-5, CPK-1 und CPK-2.
Binäre Vektorkonstruktion: Kanamycin
Das Plasmid-Konstrukt pACGH101 wurde mit PstI (Roche) und FseI (NEB) entsprechend den Herstellerangaben verdaut. Das Fragment wurde mittels eines Agarose-Gels aufgereinigt und mittels des Qiaex II DNA-Extraktions-Kits (Qiagen) extrahiert. Dies führte zu einem Vektor-Fragment mit dem Arabidopsis-Actin2-Promotor, mit internem Intron und dem OCS3-Terminator. Primer für die PCR-Amplifikation des NPTII-Gens wurden wie folgt konstruiert:
5'NPT-Pst:
3'NPT-Fse:
Das 0,9 Kilobasen NPTII-Gen wurde mittels PCR aus pCambia 2301 Plasmid-DNA amplifiziert [94°C 60 Sekunden, {94°C 60 Sekunden, 61°C (–0,1°C pro Zyklus) 60 Sekunden, 72°C 2 Minuten} × 25 Zyklen, 72°C 10 Minuten in einer Biometra T-Gradientenmaschine] und mittels des QIAquick-PCR-Extraktions-Kits gemäß den Herstellerangaben aufgereinigt. Die PCR-DNA wurde dann in den pCR-BluntII-TOPO-Vektor (Invitrogen) gemäß den Herstellerangaben (NPT-Topo-Konstrukt) subkloniert. Diese Ligationen wurden in Top10-Zellen (Invitrogen) transformiert und die Zellen wurden auf LB-Platten mit 50 μg/ml Kanamycin-Sulfat über Nacht bei 37°C kultiviert. Kolonien wurden dann zur Inokulation von 2 ml LB-Medium mit 50 μ/ml Kanamycin-Sulfat verwendet und bei 37°C über Nacht kultiviert. Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des Qiaprep Spin Miniprep Kits (Qiagen) isoliert und sowohl in den 5'- als auch den 3'-Richtungen unter Verwendung von Standardbedingungen sequenziert. Eine nachfolgende Analyse der Sequenzdaten unter Verwendung der Vector NTI-Software offenbarte keine, in der NPTII-Gensequenz vorhandenen PCR-Fehler.
Das NPT-Topo-Konstrukt wurde dann mit PstI (Roche) und FseI (NEB) gemäß den Herstellerangaben verdaut. Das 0,9 Kilobasen-Fragment wurde in einem Agarose-Gel aufgereinigt und mittels des Qiaex II DNA-Extraktions-Kits (Qiagen) extrahiert. Das Pst/Fse-Insert-Fragment aus NPT-Topo und das Pst/Fse-Vektor-Fragment aus pACGH101 wurden dann unter Verwendung der T4-DNA-Ligase (Roche) gemäß den Herstellerangaben miteinander ligiert. Die Ligation wurde dann in Top10-Zellen (Invitrogen) unter Standardbedingungen transformiert, wobei das Konstrukt pBPFfc019 kreiert wurde. Kolonien wurden auf LB-Platten mit 50 μg/ml Kanamycin-Sulfat selektiert und über Nacht bei 37°C kultiviert. Diese Kolonien wurden dann zur Inokulation von 2 ml LB-Medium mit 50 μg/ml Kanamycin-Sulfat verwendet und über Nacht bei 37°C kultiviert. Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des Qiaprep Spin Miniprep Kits (Qiagen) gemäß den Herstellerangaben isoliert.
Das pBPSSC019-Konstrukt wurde mit KpnI und BsaI (Roche) gemäß den Herstellerangaben verdaut. Das Fragment wurde mittels Agarose-Gel aufgereinigt und dann mittels des Qiaex II-DNA-Extraktions-Kits (Qiagen) gemäß den Angaben extrahiert, was zu einer 3-Kilobasen-Act-NPT-Kassette führte, welche den Arabidopsis-Actin2-Promotor mit internem Intron, das NPTII-Gen und den OCS3-Terminator beinhaltet.
Der pBPSJH001-Vektor wurde mit SpeI und ApaI (Roche) verdaut und stumpfe Enden wurden durch Auffüllen mit Klenow-Enzym und 0,1 mM dNTP (Roche) gemäß den Herstellerangaben erzeugt. Dies führte zu einem 10,1 Kilobasen-Vektorfragment Minus der Gentamycin-Kassette, das durch Selbstligation mit T4-DNA-Ligase (Roche) rezirkularisiert wurde und in TOP10-Zellen (Invitrogen) unter Standardbedingungen transformiert wurde. Transformierte Zellen wurden auf ein Wachstum über Nacht bei 37°C auf LB-Agar, welcher 50 μg/ml Kanamycin-Sulfat enthielt, selektiert. Kolonien wurden dann zur Inokulation von 2 ml flüssigem LB, welches 50 μg/ml Kanamycin-Sulfat enthielt, verwendet und über Nacht bei 37°C kultiviert. Plasmid wurde unter Verwendung des Qiaprep Spin Miniprep Kits (Qiagen) gemäß den Herstellerangaben extrahiert. Das rezirkularisierte Plasmid wurde dann mit KpnI (Roche) verdaut und aus dem Agarose-Gel mittels des Qiaex II DNA-Extraktions-Kits (Qiagen) gemäß den Herstellerangaben extrahiert.
Das Kpn-geschnittene Act-NPT-Insert und der Kpn-geschnittene, rezirkularisierte pBPSJH001-Vektor wurden dann unter Verwendung der T4-DNA-Ligase (Roche) miteinander ligiert und in TOP10-Zellen (Invitrogen) gemäß den Herstellerangaben transformiert. Das resultierende Konstrukt pBPSsc022 enthielt nun den Super-Promotor, das GUS-Gen, den NOS-Terminator und die Act-NPT- Kassette. Transformierte Zellen wurden auf das Wachstum bei 37°C auf LB-Agar, welcher 50 μg/ml Kanamycin-Sulfat enthält, selektiert. Kolonien wurden dann zur Inokulation von 2 ml flüssigem LB, welches 50 μg/ml Kanamycin-Sulfat enthält, verwendet und über Nacht bei 37°C kultiviert. Plasmid-DNA wurde unter Verwendung von Qiaprep Spin Miniprep Kits (Qiagen) gemäß den Herstellerangaben extrahiert. Nach dem Nachweis des Ligationserfolges mittels Restriktionsverdau wurde pBPSsc022-Plasmid-DNA weiterhin vermehrt und unter Verwendung des Plasmid Midiprep Kits (Qiagen) gemäß den Herstellerangaben isoliert.
Subklonierung von PK-6, PK-7, PK-8, PK-9, CK-1, CK-2, CK-3, MPK-2, MPK-3, MPK-4, MPK-5, CPK-1 und CPK-2 in den binären Vektor.
Die Fragmente, die die unterschiedlichen Physcomitrella patens Protein-Kinasen enthielten, wurden aus den rekombinanten PCR2.1 TOPO-Vektoren mittels Doppelverdau mit den Restriktionsenzymen (siehe Tabelle 16) gemäß den Herstellerangaben subkloniert. Das nachfolgende Fragment wurde aus dem Agarose-Gel mit einem QIAquick Gelextraktionskit (Qiagen) gemäß den Herstellerangaben entfernt und in die binären Vektoren pGMSG ligiert, die zuvor mit XmaI und Ecl136II geschnitten und dephosphoryliert wurden. Der resultierende rekombinante pGMSG enthielt den entsprechenden Transkriptionsfaktor in der sense-Orientierung unter Kontrolle des konstitutiven Superpromotors.
Tabelle 16
Aufgelistet sind die Namen der verschiedenen Konstrukte der Physcomitrella patens-Transkriptionsfaktoren, die für die Pflanzentransformation verwendet wurden.
Agrobacterium-Transformation
Die rekombinanten Vektoren wurden gemäß den Standardbedingungen (Hoefgen and Willmitzer; 1990) in Agrobacterium tumefaciens C58C1 und PMP90 transformiert.
Pflanzentransformation
Der Arabidopsis thaliana-Ökotyp C24 wurde gemäß den Standardbedingungen (Bechtold 1993, Acad. Sci, Paris. 316: 1194–1199; Bent et al. 1994, Science 265: 1856–1860) kultiviert und transformiert.
Screening transformierter Pflanzen
T1-Samen wurden gemäß den Standardprotokollen (Xiong et al. 1999, Plant Molecular Biology Reporter 17: 159–170) sterilisiert. Samen wurden auf ½ Murashige und Skoog Medium (MS) (Sigma-Aldrich) pH 5.7 mit KOH, 0.6% Agar ausplattiert und mit 1% Saccharose, 0.5 g/L 2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure (MES) (Sigma-Aldrich), 50 μg/ml Kanamycin (Sigma-Aldrich), 500 μg/ml Carbenicillan (Sigma-Aldrich) und 2 μg/ml Benomyl (Sigma-Aldrich) supplementiert. Die Samen wurden auf Platten für 4 Tage bei 4°C vernalisiert. Die Samen wurden in einer klimatisierten Kammer bei einer Lufttemperatur von 22°C und einer Lichtintensität von 40 Mikromolen^–Im2 (Weißlicht; Philips TL 65 W/25 Fluoreszenzröhre) und einem 16 Stunden Licht- und 8 Stunden Dunkelheit-Taglängenzyklus ausgekeimt. Transformierte Keimlinge wurden nach 14 Tagen selektiert und auf ½ MS Medium pH 5.7 mit KOH, 0.6% Agarplatten, die mit 0.6% Agar 1% Saccharose, 0.5 g/L MES (Sigma-Aldrich), supplementiert wurden und 2 μg/ml Benomyl (Sigma-Aldrich) transferiert, um sich für 5 bis 7 Tage erholen zu können.
Trockentoleranz-Screening
T1-Keimlinge wurden auf trockenes, steriles Filterpapier in eine Petrischale transferiert, um für 2 Stunden bei 80% RF (relative Luftfeuchte) in einer a Percieval Growth Cabinet MLR-35011, Mikromolen^–Im2 (Weißlicht; Philips TL 65 W/25 Fluoreszenzröhre) austrocknen zu können. Die RF wurde dann auf 60% verringert und die Keimlinge wurden für weitere 8 Stunden ausgetrocknet. Die Keimlinge wurden dann entfernt und auf ½ MS 0.6% Agarplatten, die mit 2 μg/ml Benomyl (Sigma-Aldrich) und 0.5 g/L MES (Sigma-Aldrich) supplementiert wurden, gesetzt und nach 5 Tagen ausgewertet.
Unter Trockenstressbedingungen zeigten PpPK-6 überexprimierende Arabidopsis thaliana-Pflanzen bei dem Stressscreening eine 95% Überlebenrate (20 Überlebende aus 21 gestressten Pflanzen); PpPK-8, 40% (2 Überlebende aus 5 gestressten Pflanzen), PpPK-9, 78% (38 Überlebende aus 49 gestressten Pflanzen), PpCK-1, 50% (5 Überlebende aus 10 gestressten Pflanzen), PpCK-2, 52% (16 Überlebende aus 31 gestressten Pflanzen), PpCK-3, 60% (3 Überlebende aus 5 gestressten Pflanzen), PpMPK-2, 100%, (52 Überlebende aus 52 gestressten Pflanzen), PpMPK-3, 98% (44 Überlebende aua 45 gestressten Pflanzen), PpMPK-4, 92% (11 Überlebende aus 12 gestressten Pflanzen), PpMPK-5, 100% (9 Überlebende aus 9 gestressten Pflanzen), PpCPK-1, 60% (12 Überlebende aus 20 gestressten Pflanzen), PpCPK-2, 89% (17 Überlebende aus 19 gestressten Pflanzen), wohingegen die untransformierte Kontrolle nur eine 11% Überlebensrate (1 Überlebende aus 9 gestressten Pflanzen) zeigte. Es ist erwähnenswert, dass die Analysen dieser transgenen Linien mit T1-Pflanzen durchgeführt wurden, weshalb bessere Ergebnisse erreicht werden, wenn eine homozygote, stärker exprimierende Pflanze verwendet wird.
Tabelle 17 Zusammenfassung der Trockenstress-Tests
Kältetoleranz-Screening
Keimlinge wurden auf Petrischalen, die ½ MS 0.6% Agar enthielten, der mit 2% Saccharose und 2 μg/ml Benomyl supplementiert wurde, überführt. Nach 4 Tagen wurden die Keimlinge bei 4°C für 1 Stunde inkubiert und dann mit gehobeltem Eis bedeckt. Die Keimlinge wurden dann in eine Environmental Specialist ES2000 Umweltkammer plaziert und für 3,5 Stunden beginnend bei –1,0°C bei einer Abnahme von –1°C je Stunde inkubiert. Die Keimlinge wurden dann bei –5°C für 24 Stunden inkubiert und es wurde ihnen dann ermöglicht, bei 5°C für 12 Stunden aufzutauen. Das Wasser wurde abgegossen und die Keimlinge wurden nach 5 Tagen ausgewertet.
Unter Kältestressbedingungen zeigten PpPK-7 überexprimierende Arabidopsis thaliana-Pflanzen bei dem Stressscreening eine 73% Überlebensrate (8 Überlebende aus 12 gestressten Pflanzen); PpPK-9, 100% (45 Überlebende aus 45 gestressten Pflanzen), PpCK-1, 100% (14 Überlebende aus 14 gestressten Pflanzen), PpMPK-2, 68% (36 Überlebende aus 53 gestressten Pflanzen), PpMPK-3, 92% (24 Überlebende aus 26 gestressten Pflanzen), PpCPK-2, 64% (7 Überlebende aus 11 gestressten Pflanzen), wohingegen die untransformierte Kontrolle nur eine Überlebensraten von 2% (1 Überlebende aus 48 gestressten Pflanzen) zeigte. Es ist erwähnenswert, dass die Analysen dieser transgenen Linien mit T1-Pflanzen durchgeführt wurden, weshalb bessere Ergebnisse erreicht werden, wenn eine homozygote, stärker exprimierende Pflanze verwendet wird.
Tabelle 18 Zusammenfassung der Kältestresstests
Salztoleranz-Screening
Keimlinge wurden in der Nacht vor dem Salztoleranzscreening auf Filterpapier, welches mit ½ MS 0.6% Agar getränkt war, transferiert und auf ½ MS 0.6% Agar, der mit 2 μg/ml Benomyl supplementiert wurde, platziert. Für das Solztoleranz-Screening wurde das Filterpapier mit den Keimlingen auf Stacks von sterilem Filterpapier, welche mit 50 mM NaCl getränkt waren, in eine Petrischale überführt. Nach 2 Stunden wurde das Filterpapier mit den Keimlingen auf Stacks von sterilem Filterpapier, die mit 200 mM NaCl getränkt waren, in eine Petrischale überführt. Nach 2 Stunden wurde das Filterpapier mit den Keimlingen auf Stacks von sterilem Papier, das mit 600 mM NaCl getränkt war, in eine Petrischale überführt. Nach 10 Stunden wurden die Keimlinge in Petrischalen überführt, die ½ MS 0.6% Agar, der mit 2 μg/ml Benomyl supplementiert wurde, enthielten. Die Keimlinge wurden nach 5 Tagen ausgewertet.
Die transgenen Pflanzen werden hinsichtlich ihrer verbesserten Salztoleranz durchsucht, was zeigt, das die transgene Expression eine Salztoleranz verleiht.
Beispiel 8
Detektion der PK-6, PK-7, PK-8, PK-9, Ck-1, CK-2, CK-3, MPK-2, MPK-3, MPK-4, MPK-5, CPK-1 und CPK-2 Transgene in den transgenen Arabidopsis-Linien.
Ein Blatt einer Wildtyp- und einer transgenen Arabidopsis-Pflanze wurde in 250 μl Hexadecyltrimethyl-Ammoniumbromid (CTAB) Puffer (2% CTAB, 1.4 M NaCl, 8 mM EDTA und 20 mM Tris pH 8,0) und 1 μl β-Mercaptoethanol homogenisiert. Die Proben wurden bei 60–65°C für 30 Minuten inkubiert und anschließend wurden 250 μl Chloroform zu jeder Probe zugesetzt. Die Proben wurden für 3 Minuten gevortext und für 5 Minuten bei 18000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde von jeder Probe abgenommen und 150 μl Isopropanol wurde zugesetzt. Die Proben wurden bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubiert und für 10 Minuten bei 18000 × g zentrifugiert. Jedes Pellet wurde mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in 20 μl TE resuspendiert. 4 μl aus obiger Suspension wurde in einer 20 μl PCR-Reaktion unter Verwendung der Taq DNA-Polymerase (Roche Molecular Biochemicals) gemäß den Herstellerangaben verwendet.
Das binäre Vektor-Plasmid mit dem jeweils einklonierten Gen wurde als Positivkontrolle verwendet und die Wildtyp-C24-genomische DNA wurde in den PCR-Reaktionen als Negativkontrolle verwendet. 10 μl der PCR-Reaktion wurden auf einem 0,8% Agarose-Ethidiumbromidgel analysiert.
PpPk-6: Die in den Reaktionen verwendeten Primer sind:
Das PCR-Programm war wie folgt: 30 Zyklen 1 Minuten bei 94°C, 1 Minute bei 62°C und 4 Minuten bei 72°C, gefolgt von 10 Minuten bei 72°C. Ein 2,8 kb Fragment wurde aus der Positivkontrolle und den transgenen Pflanzen produziert.
PpPk-7: Die in den Reaktionen verwendeten Primer sind:
Die Primer wurden in der ersten Runde der Reaktionen mit dem folgenden Programm verwendet: 30 Zyklen 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 62°C und 4 Minuten bei 72°C, gefolgt von 10 Minuten bei 72°C. Ein 1,1 kb Fragment wurde aus der Positivkontrolle und den T1-transgenen Pflanzen generiert.
PpPK-8: Die in den Reaktionen verwendeten Primer waren:
Das PCR-Programm war wie folgt: 30 Zyklen 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 62°C und 4 Minuten bei 72°C, gefolgt von 10 Minuten bei 72°C. Ein 1,6 kb Fragment wurde aus der Positivkontrolle und den transgenen Pflanzen produziert.
PpPK-9: Die in den Reaktionen verwendeten Primer sind:
Das PCR-Programm war wie folgt: 30 Zyklen 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 62°C und 4 Minuten bei 72°C, gefolgt von 10 Minuten bei 72°C. Ein 1,4 kb Fragment wurde aus der Positivkontrolle und den transgenen Pflanzen produziert.
PpCK-1: Die in den Reaktionen verwendeten Primer sind:
Das PCR-Programm war wie folgt: 30 Zyklen 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 62°C und 4 Minuten bei 72°C, gefolgt von 10 Minuten bei 72°C. Ein 1,7 kb Fragment wurde aus der Positivkontrolle und den transgenen Pflanzen produziert.
PpCK-2. Die in den Reaktionen verwendeten Primer sind:
Das PCR-Programm war wie folgt: 30 Zyklen 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 62°C und 4 Minuten bei 72°C, gefolgt von 10 Minuten bei 72°C. Ein 1,9 kb Fragment wurde aus der Positivkontrolle und den transgenen Pflanzen produziert.
PpCK-3: Die in den Reaktionen verwendeten Primer sind:
Das PCR-Programm war wie folgt: 30 Zyklen 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 62°C und 4 Minuten bei 72°C, gefolgt von 10 Minuten bei 72°C. Ein 1,2 kb Fragment wurde aus der Positivkontrolle und den transgenen Pflanzen produziert.
PpMPK-2: Die in den Reaktionen verwendeten Primer sind:
Das PCR-Programm war wie folgt: 30 Zyklen 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 62°C und 4 Minuten bei 72°C, gefolgt von 10 Minuten bei 72°C. Ein 1,7 kb Fragment wurde aus der Positivkontrolle und den transgenen Pflanzen produziert.
PpMPK-3: Die in den Reaktionen verwendeten Primer sind:
Das PCR-Programm war wie folgt: 30 Zyklen 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 62°C und 4 Minuten bei 72°C, gefolgt von 10 Minuten bei 72°C. Ein 2,2 kb Fragment wurde aus der Positivkontrolle und den transgenen Pflanzen produziert.
PpMPK-4: Die in den Reaktionen verwendeten Primer sind:
Das PCR-Programm war wie folgt: 30 Zyklen 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 62°C und 4 Minuten bei 72°C, gefolgt von 10 Minuten bei 72°C. Ein 1,7 kb Fragment wurde aus der Positivkontrolle und den transgenen Pflanzen produziert.
PpMPK-5: Die in den Reaktionen verwendeten Primer sind:
Das PCR-Programm war wie folgt: 30 Zyklen 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 62°C und 4 Minuten bei 72°C, gefolgt von 10 Minuten bei 72°C. Ein 1,4 kb Fragment wurde aus der Positivkontrolle und den transgenen Pflanzen produziert.
PpCPK1: Die in den Reaktionen verwendeten Primer sind:
Das PCR-Programm war wie folgt: 30 Zyklen 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 62°C und 4 Minuten bei 72°C, gefolgt von 10 Minuten bei 72°C. Ein 2,3 kb Fragment wurde aus der Positivkontrolle und den transgenen Pflanzen produziert.
PpCPK-2: Die in den Reaktionen verwendeten Primer sind:
Das PCR-Programm war wie folgt: 30 Zyklen 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 62°C und 4 Minuten bei 72°C, gefolgt von 10 Minuten bei 72°C. Ein 2,2 kb Fragment wurde aus der Positivkontrolle und den transgenen Pflanzen produziert.
Die Transgene wurden erfolgreich aus den T1-transgenen Linien amplifiziert, jedoch nicht aus dem Wildtyp C24. Diese Ergebnisse zeigen, dass die T1-transgenen Pflanzen mindestens eine Kopie der Transgene enthalten. In der untransformierten Arabidopsis thaliana-Kontrolle gab es keinen Hinweis auf die Existenz von entweder identischen oder sehr ähnlichen Genen, welche durch dieses Verfahren amplifiziert werden konnten.
Beispiel 9
Detektion der PK-6, PK-7, PK-8, PK-9, CK-1, CK-2, CK-3, MPK-2, MPK-3, MPK-4, MPK-5, CPK-1 und der CPK-2 transgenen mRNA in transgenen Arabidopsis-Linien.
Die transgene Expression wurde unter Verwendung der RT-PCR detektiert. Gesamt-RNA wurde aus stressbehandelten Pflanzen unter Verwendung eines aus (Verwoerd et al., 1989 NAR 17: 2362) angepassten Verfahrens isoliert. Blattproben (50–100 mg) wurden gesammelt und in flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver zerrieben. Zerriebenes Gewebe wurde in 500 μl einer 80°C warmen 1:1 Mischung aus Phenol und Extraktionspuffer (100 mM LiCl, 100 mM Tris pH 8,10 mM EDTA, 1% SDS) resuspendiert und anschließend durch kurzes Vortexen gemischt. Nach der Zugabe von 250 μl Chloroform, wurde jede Probe kurz gevortext. Die Proben wurden dann für 5 Minuten bei 12000 × g zentrifugiert. Die obere wässrige Phase wurde abgenommen und in ein frisches Eppendorfgefäß überführt. RNA wurde durch Zusatz von 1/10 Volumen 3 M Natrium-Acetat und 2 Volumen 95% Ethanol präzipitiert. Die Proben wurden durch Drehen gemischt und für 30 Minuten auf Eis gesetzt. RNA wurde durch Zentrifugation bei 12000 × g für 10 Minuten pelletiert. Der Überstand wurde entfernt und die Pellets wurden kurz luftgetrocknet. Die RNA-Proben Pellets wurden in 10 μl DEPC-behandeltem Wasser resuspendiert. Um kontaminierende DNA aus den Proben zu entfernen, wurde jede Probe mit RNase-freier DNase (Roche) gemäß den Herstellerangaben behandelt. cDNA wurde aus Gesamt-RNA unter Verwendung des Erststrang-cDNA-Synthesekits (Boehringer, Mannheim) gemäß den Herstellerangaben synthetisiert.
Die PCR-Amplifikation eines Gen-spezifischen Fragments aus der synthetisierten cDNA wurde unter Verwendung der Taq-DNA-Polymerase (Roche) und Gen-spezifischer Primer (für Primer siehe Tabelle 15) in der folgenden Reaktion durchgeführt: 1 × PCR-Puffer, 1,5 mM MgCl₂, 0,2 μM eines jeden Primers, 0,2 μM dNTPs, 1 Einheit Polymerase, 5 μl cDNA aus der Synthesereaktion. Die Amplifikation wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Denaturierung, 95°C, 1 Minute; Annealing, 62°C, 30 Sekunden; Extension, 72°C, 1 Minute, 35 Zyklen; Extension, 72°C, 5 Minuten; Verweilzeit, 4°C, unendlich. PCR-Produkte wurden auf einem 1% Agarose-Gel, welches mit Ethidiumbromid gefärbt war, aufgetrennt und unter UV-Licht unter Verwendung des Quantity-One Gel-Dokumentationssystems (Bio-Rad) visualisiert.
In den T1-transgenen Linien wurde die Expression der Transgene detektiert. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Transgene in den transgenen Linien exprimiert werden und einen starken Hinweis darauf liefern, dass ihr Genprodukt die Pflanzenstresstoleranz in den transgenen Linien verbessert. Auf der anderen Seite konnte mit diesem Verfahren keine Expression identischer oder sehr ähnlicher endogener Gene detektiert werden. Diese Ergebnisse stimmen mit den Daten aus Beispiel 7 überein. Dies bestätigt in großem Maße unsere Aussage, dass die beobachtete Stresstoleranz von dem eingeführten Transgen herrührt.
PpPK-6
PpPK-7
PpPK-8
PpPK-9
PpCK-1
PpCK-2.
PpCK-3
PpMPK-2
PpMPK-3
PpMPK-4
PpMPK-5
PpCPK-1
PpCPK-2
Die Amplifikation wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Denaturierung, 95°C, 1 Minute; Annealing, 62°C, 30 Sekunden; Extension, 72°C, 1 Minute, 35 Zyklen; Extension, 72°C, 5 Minuten; Verweilzeit, 4°C, unendlich. Die PCR-Produkte wurden in einem 1% Agarose-Gel, das mit Ethidiumbromid gefärbt war, aufgetrennt und unter UV-Licht unter Verwendung des Quantity-One Gel-Dokumentationssystems (Bio-Rad) visualisiert.
In den T1-transgenen Linien wurde die Expression der Transgene detektiert. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Transgene in den transgenen Linien exprimiert werden und und weisen sehr stark daraufhin, dass ihr Gen-Produkt die Pflanzenstresstoleranz in den transgenen Linien verbessert. In Übereinstimmung mit der vorhergehenden Darstellung konnte durch dieses Verfahren keine Expression identischer oder sehr ähnlicher endogener Gene detektiert werden. Diese Ergebnisse stimmen mit den Daten aus Beispiel 7 überein.
Beispiel 10
Konstruktion stresstoleranter Sojabohnen-Pflanzen durch Überexpression der PK-6, PK-7, PK-8, PK-9, CK-1, CK-2, CK-3, MPK-2, MPK-3, MPK-4, MPK-5, CPK-1 und des CPK-2 Gens.
Die Konstrukte pBPSJyw022, pBPSJyw012, pBPSJYW030, PBPSERG010, pBPSSY012, pBPSJyw034, pBPSSY011, pBPSSY016, pBPSJyw014, pBPSJyw025, PBPSERG009, PBPSERG019 und pBPSJyw008 wurden verwendet, um Sojabohne wie unten beschrieben zu transformieren
Samen der Sojabohne wurden mit 70% Ethanol für 4 Minuten bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Schütteln, gefolgt von 20% (Volumen/Volumen) Clorox, das mit 0,05% (Volumen/Volumen) Tween für 20 Minuten unter kontinuierlichem Schütteln oberflächensterilisiert. Die Samen wurden dann 4 mal mit destiliertem Wasser gespült und auf ein angefeuchtetes Filterpapier in eine Petrischale bei Raumtemperatur für 6 bis 39 Stunden gesetzt. Die Samenhüllen wurden abgezogen und die Kotyledonen wurden von der Embryo-Stengel abgelöst. Die Embryo-Achse wurde untersucht, um sicher zu stellen, dass die meristematische Region nicht beschädigt ist. Die exzidierten Embryo-Stengel wurden in einer halb offenen, sterilen Petrischale gesammelt und bis auf einen Feuchtigkeitsgehalt von weniger als 20% (Frischgewicht) in einer versiegelten Petrischale bis zur weiteren Verwendung luftgetrocknet.
Eine Agrobacterium tumefaciens Kultur wurde ausgehend von einer Einzelkolonie auf festem LB-Medium plus geeigneter Antibiotka (z.B. 100 mg/l Streptomycin, 50 mg/l Kanamycin) und dem Wachstum der Einzelkolonie in flüssigem LB-Medium zu einer optischen Dichte bei 600 nm von 0,8 erzeugt. Anschließend wurde die Bakterienkultur bei 7000 rpm für 7 Minuten bei Raumtemperatur pelletiert und in MS-Medium (Murashige uns Skoog, 1962), das mit 100 μM Azetosyringon supplementiert war, resuspendiert. In diesem Präinduktions-Medium wurden die Bakterienkulturen für 2 Stunden bei Raumtemperatur vor der Verwendung inkubiert. Die Stengel der zygotischen Samenembryonen der Sojabohne wurden bei einem ungefähren Feuchtigkeitsgehalt von 15% mit der präinduzierten Agrobacterium-Suspentionskultur für 2 Stunden bei Raumtemperatur getränkt. Die Embryonen wurden aus der Imbibitionskultur entfernt und auf Petrischalen, die festes MS-Medium enthielten, das mit 2% Saccharose supplementiert war, transferiert und für 2 Tage in der Dunkelheit bei Raumtemperatur inkubiert. Alternativ wurden die Embryonen oben auf angefeuchtetes (flüssiges MS- Medium), steriles Filterpapier in eine Petrischale gesetzt und unter denselben Bedingungen wie oben beschrieben inkubiert. Nach diesem Zeitraum wurden die Embryonen entweder auf festes oder flüssiges MS-Medium, das mit 500 mg/L Carbenicillin oder 300 mg/L Cefotaxin supplementiert war, transferiert, um die Agrobakterien abzutöten. Das flüssiges Medium wurde verwendet, um das sterile Filterpapier anzufeuchten. Die Embryonen wurden im Verlauf von 4 Wochen bei 25°C unter 150 μmolm^–2sec^–1 und einer 12-Stunden Fotoperiode inkubiert. Nachdem die Keimlinge Wurzeln produzierten, wurden sie auf sterile Metromix-Erde transferiert. Das Medium der in vitro Pflanzen wurde ausgewaschen, bevor die Pflanzen auf die Erde transferiert wurden. Die Pflanzen wurden unter einer Plastikabdeckung für eine Woche aufbewahrt, um den Aklimatisierungsprozess zu begünstigen. Anschließend wurden die Pflanzen in einen Wachstumsraum transferiert, wo sie bei 25°C unter 150 μmol m^–2sec^–1 Lichtintensität und einer 12-Stunden Fotoperiode für etwa 80 Tage inkubiert wurden.
Die transgenen Pflanzen wurden dann hinsichtlich ihrer verbesserten Trocken-, Salz- und/oder Kältetoleranz gemäß dem in Beispiel 7 beschriebenen Screening-Verfahren überprüft, das zeigt, dass die transgene Expression Stresstoleranz verleiht.
Beispiel 11
Konstruktion stresstoleranter Raps-/Canola-Rapspflanzen durch Überexpression der PK-6, PK-7, PK-8, PK-9, CK-1, CK-2, CK-3, MPK-2, MPK-3, MPK-4, MPK-5, CPK-1 und CPK-2 Gene.
Die Kunstrukte pBPSJyw022, pBPSJyw012, pBPSJYW030, PBPSERG010, pBPSSY012, pBPSJyw034, pBPSSY011, pBPSSY016, pBPSJyw014, pBPSJyw025, PBPSERG009, PBPSERG019 und pBPSJyw008 wurden verwendet, um Raps/Canola-Raps wie unten beschrieben zu transformieren.
Das hierin beschriebene Verfahren zur Pflanzentransformation ist auch auf Brassica und andere Anbaupflanzen anwendbar. Samen von Canola-Raps wurden mit 70% Ethanol für 4 Minuten bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Schütteln, gefolgt von 20% (Volumen/Volumen) Chlorox, das mit 0,05% (Volumen/Volumen) Tween supplementiert war, für 20 Minuten bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Schütteln oberflächensterilisiert. Die Samen wurden anschließend 4 mal mit destilliertem Wasser gewaschen und auf angefeuchtetes Filterpapier in eine Petrischale bei Raumtemperatur für 18 Stunden gesetzt. Die Samenhüllen wurden anschließend entfernt und die Samen wurden über Nacht in einer halb offenen, sterilen Petrischale luftgetrocknet. Während dieser Zeit verloren die Samen etwa 85% ihres Wassergehaltes. Die Samen wurden dann bei Raumtemperatur in einer versiegelten Petrischale bis zur weiteren Verwendung gelagert. Die DNA-Konstrukte und die Embryo-Imbibition sind wie in Beispiel 10 beschrieben. Proben der primären transgenen Pflanzen (T0) werden mittels PCR analysiert, um die Anwesenheit von T-DNA zu bestätigen. Diese Ergebnisse werden durch Southern-Hybridisierung bestätigt, in welcher die DNA in einer Elektrophorese auf einem 1% Agarose-Gel aufgetrennt wird und auf eine positiv geladene Nylon-Membran (Roche Diagnostics) transferiert wird. Der PCR DIG-Proben-Synthesekit (Roche Diagnostics) wird gemäß den Herstellerangaben verwendet, um eine Digoxygenin markierte Probe mittels PCR zu erzeugen.
Die transgenen Pflanzen werden dann hinsichtlich ihrer verbesserten Stresstoleranz gemäß dem in Beispiel 7 beschriebenen Screening-Verfahren untersucht, das zeigt, dass die transgene Expression Trockentoleranz verleiht.
Beispiel 12
Konstruktion stresstoleranter Getreidepflanzen durch Überexpression der PK-1, PK-2, PK-3, PK-4, PK-5, PK-6, PK-7, PK-8, PK-9, CK-1, CK-2, CK-3, MPK-2, MPK-3, MPK-4, MPK-5, CPK-1 und CPK-2 Gene.
Die Konstrukte pBPSJyw022, pBPSJyw012, pBPSJYW030, PBPSERG010, pBPSSY012, pBPSJyw034, pBPSSY011, pBPSSY016, pBPSJyw014, pBPSJyw025, PBPSERG009, PBPSERG019 und pBPSJyw008 wurden verwendet, um Getreide wie unten beschrieben, zu transformieren.
Transformation von Mais (Zea Mays L.) wird mittels den von Ishida et al. 1996. Nature Biotch 14745–50, beschriebenen Verfahren durchgeführt. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, das „superbinäre" Vektoren trägt, cokultiviert und transgene Pflanzen werden durch Organogenese isoliert. Dieses Verfahren stellt eine Transformationseffizienz zwischen 2,5% und 20% bereit. Die transgenen Pflanzen werden dann hinsichtlich ihrer verbesserten Trocken-, Salz- und/oder Kältetoleranz gemäß dem in Beispiel 7 beschriebenen Screening-Verfahren untersucht, das zeigt, dass die transgene Expression eine Stresstoleranz verleiht.
Beispiel 13
Konstruktion stresstoleranter Weizenpflanzen durch Überexpression der PK-1, PK-2, PK-3, PK-4, PK-5, PK-6, PK-7, PK-8, PK-9, CK-1, CK-2, CK-3, MPK-2, MPK-3, MPK-4, MPK-5, CPK-1, und CPK-2 Gene
Die Konstrukte pBPSJyw022, pBPSJyw012, pBPSJYW030, PBPSERG010, pBPSSY012, pBPSJyw034, pBPSSY011, pBPSSY016, pBPSJyw014, pBPSJyw025, PBPSERG009, PBPSERG019 und pBPSJyw008 wurden verwendet, um Weizen, wie unten beschrieben zu transformieren.
Die Transformation von Weizen wird mittels des von Ishida et al. 1996 Nature Biotch. 14745–50, beschriebenen Verfahrens durchgeführt. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, das „superbinäre" Vektoren trägt, cokultiviert und transgene Pflanzen werden durch Organogenese isoliert. Dieses Verfahren stellt eine Transformationseffizienz zwischen 2,5% und 20% bereit. Die transgenen Pflanzen werden dann hinsichtlich ihrer verbesserten Trocken-, Salz- und/oder Kältetoleranz gemäß dem in Beispiel 7 beschriebenen Screening-Verfahren untersucht, das zeigt, dass die transgene Expression eine Stresstoleranz verleiht.
Beispiel 14
Identifikation homologer und heterologer Gene
Gensequenzen können verwendet werden, um homologe oder heterologe Gene aus cDNA oder genomischen Bibliotheken zu identifizieren. Homologe Gene (z.B. vollständige cDNA-Klone) können mittels Nukleinsäure-Hybridisierung z.B. unter Verwendung von cDNA-Bibliotheken isoliert werden. In Abhängigkeit von der Menge des Gens von Interesse werden 100.000 bis 1000.000 rekombinante Bakteriophagen ausplattiert und auf Nylonmembranen transferiert. Nach Denaturierung mit Alkali wird die DNA auf der Membran z.B. durch UV-Quervernetzung imobilisiert. Die Hybridisierung wird unter hoch stringenten Bedingungen durchgeführt. In wässriger Lösung wird die Hybridisierung und das Waschen bei einer Ionenstärke von 1 M NaCl und einer Temperatur von 68°C durchgeführt. Hybridisierungsproben werden z.B. durch radioaktive ³²P-„nick"-Transkriptionsmarkierung (High Prime, Roche, Mannheim, Deutschland) generiert. Signale werden mittels Autoradiographie detektiert.
Partiell homologe oder heterologe Gene, die verwandt, aber nicht identisch sind, können in einer Weise identifiziert werden, die analog zu dem oben beschriebenen Verfahren unter Verwendung niedrig stringenter Hybridisierungs- und Waschbedingungen ist. Für die wässrige Hybridisierung wird die Ionenstärke normalerweise bei 1 M NaCl gehalten, während die Temperatur stufenweise von 68 auf 42°C erniedrigt wird.
Die Isolation von Gensequenzen, die Homologien (oder Sequenzidentitäten/-Ähnlichkeiten) in nur einer distinkten Domäne (von z.B. 10–20 Aminosäuren) aufweisen, kann unter Verwendung synthetischer, radioaktiv markierter Oligonukleotidproben durchgeführt werden. Radioaktiv markierte Oligonukleotide werden durch Phosphorylierung des 5-seitigen Endes zweier komplementärer Oligonukleotide mit T4-Polynukleotidkinase erzeugt. Die komplementären Oligonukleotide werden aneinander gelagert und ligiert, um Concatemere zu bilden. Die doppelsträngigen Concatemere werden dann z.B. durch „nick"-Transkription radioaktiv markiert. Die Hybridisierung wird normalerweise unter niedrig stringenten Bedingungen unter Verwendung hoher Oligonukleotidkonzentrationen durchgeführt.
Oligonukleotid-Hybridisierungslösung:

6 × SSC
0.01 M Natriumphosphat
1 mM EDTA (pH 8)
0.5% SDS
100 μg/ml denaturierte Heringssperma-DNA
0.1% fettfreie Trockenmilch

Während der Hybridisierung wird die Temperatur schrittweise auf 5–10°C unter die berechnete Oligonukleotid-Tm oder auf Raumtemperatur erniedrigt, gefolgt von Waschschritten und der Autoradiographie. Das Waschen wird unter niedrig stringenten Bedingungen, wie z.B. 3 Waschschritte unter Verwendung von 4 × SSC durchgeführt. Weitere Details werden in Sambrook, J. et al., (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press oder Ausubel, F. M; et al., (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, beschrieben.
Beispiel 15
Identifikation homologer Gene mittels Durchsuchen von Expressionsbibliotheken mit Antikörpern
cDNA-Klone können verwendet werden, um rekombinante Proteine z.B. in E. coli zu produzieren (z.B. Qiagen QIAexpress pQE-System). Rekombinante Proteine werden dann normalerweise mittels einer Ni-NTA-Affinitätschromatographie (Qiagen) gereinigt. Rekombinante Proteine werden dann verwendet, um spezifische Antikörper z.B. unter Verwendung von Standardtechniken für die Kaninchen-Immunisierung zu produzieren. Antikörper werden unter Verwendung einer Ni-NTA Säule, die mit dem rekombinanten Antigen gesättigt ist, affinitätsgereinigt, wie von Gu et al., 1994 BioTechniques 17: 257–262, beschrieben. Die Antikörper können dann verwendet werden, um Expression-cDNA Bibliotheken zu durchsuchen, um homologe oder heterologe Gene mittels eines immunologischen Screenings zu identifizieren (Sambrook, J. et al., (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press oder Ausubel, F. M; et al., (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons).
Beispiel 16
In vivo Mutagenese
Eine In vivo Mutagenese von Mikroorganismen kann durch das Passagieren von Plasmid-DNA (oder ein anderer Vektor) durch E. coli oder andere Mikroorganismen (z.B. Bacillus spp. oder Hefen wie z.B. Saccharomyces cerevisiae), die in ihren Fähigkeiten, die Integrität ihrer genetischen Information aufrecht zu erhalten, beeinträchtigt sind, durchgeführt werden. Typische Mutator-Stämme weisen Mutationen in den Genen für das DNA-Reparatursystem auf (z.B. mutHLS, mutD, mutT, etc.; für eine Referenz siehe Rupp,. W. D. (1996) DNA repair mechanisms, in: Escherichia coli and Salmonella, p. 2277–2294, ASM: Washington). Solche Stämme sind einem Fachmann wohl bekannt. Die Verwendung solcher Stämme wird z.B. in Greener, A. and Callahan, M. (1994) Strategies 7: 32–34, illustriert. Der Transfer mutierter DNA-Moleküle in Pflanzen wird bevorzugt nach Selektion und Testung in Mikroorganismen durchgeführt. Transgene Pflanzen werden gemäß den verschiedenen Beispielen innerhalb der Erläuterung dieses Dokumentes generiert.
Beispiel 17
In vitro Analyse der Funktion der Physcomitrella patens Gene in transgenen Organismen
Die Bestimmung der Enzymaktivitäten und der kinetischen Parameter der Enzyme ist im Stand der Technik gut etabliert. Experimente zur Bestimmung der Aktivität eines gegebenen veränderten Enzyms müssen auf die spezifische Aktivität des Wildtyp-Enzyms maßgeschneidert sein, was einem Fachmann leicht möglich ist. Überblicke über Enzyme im Allgemeinen sowie spezifische Details, betreffend Struktur, Kinetik, Gesetzmäßigkeiten, Methoden, Anwendungen und Beispiele für die Bestimmung vieler Enzymaktivitäten sind zum Beispiel in den folgenden Referenzen zu finden: Dixon, M. And Webb, E. C., (1979) Enzymes. Longmans: London; Fersht, (1985) Enzyme Structure and Mechanism. Freeman: New York; Walsh, (1979) Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman: San Francisco; Price, MC., Stevens, L. (1982) Fundamentals of Enzymology. Oxford Univ. Press: Oxford; Boyer, P. D., ed. (1983) The Enzymes, 3^rd ed. Academic Press: New York; Bisswanger, H., (1994) Enzymkinetik, 2^nd ed. VCH: Weinheim (ISBN 3527300325); Bergmeyer, H. U., Bergmeyer, J., Graßl, M., eds. (1983–1986) Methods of Enzymatic Analysis, 3^rd ed., vol. I–XII, Verlag Chemie: Weinheim; und Ullmann's Encyclopedia of industrial Chemistry (1987) vol. A9, Enzymes. VCH: Weinheim, p. 352–363
Die Aktivität von Proteinen, die an DNA binden, kann mittels verschiedener gut-etablierter Verfahren, wie zum Beispiel DNA-Band-shift-Untersuchungen (auch Gel-Retardationsuntersuchungen genannt) gemessen werden. Der Effekt solcher Proteine auf die Expression anderer Moleküle kann unter Verwendung von Reportergen-Untersuchungen (wie zum Beispiel die, die in Kolmar, H. et al. (1995) EMBO J. 14: 3895–3904 und den hierin zitierten Referenzen beschrieben sind) gemessen werden. Reportergen-Testsysteme unter Verwendung von Enzymen, wie zum Beispiel β-Galaktosidase, dem grün fluoreszierenden Protein und verschiedenen anderen sind wohl bekannt und für Applikationen sowohl in pro- als auch in eukaryontischen Zellen etabliert.
Die Bestimmung der Aktivität von Membrantransport-Proteinen kann entsprechend den Techniken, wie zum Beispiel diejenigen, die in Gennis, R. B. Pores, Channels and Transporters, in Biomembranes, Molecular Structure and Function, pp. 85–137, 199–234 and 270–322, Springer: Heidelberg (1989) beschrieben sind, durchgeführt werden.
Beispiel 18
Aufreinigung des gewünschten Produktes aus transformierten Organismen
Die Gewinnung des gewünschten Produktes aus Pflanzenmaterial (d.h. Physcomitrella patens oder Arabidopsis thaliana), Pilzen, Algen, Ciliaten, C. glutamicum Zellen oder anderen bakteriellen Zellen, die mit den hierin beschriebenen Nukleinsäuresequenzen transformiert sind oder aus dem Überstand der oben beschriebenen Kulturen kann durch verschiedene, im Stand der Technik wohl bekannte Verfahren durchgeführt werden. Wird das gewünschte Produkt nicht von den Zellen sekretiert, kann es durch Zentrifugation der Kultur bei niedriger Geschwindigkeit und Lyse der Zellen durch Standardtechniken, wie zum Beispiel mittels mechanischer Einwirkung oder durch Ultraschall aus der Kultur erhalten werden. Pflanzenorgane können von anderen Geweben oder Organen mechanisch separiert werden. Im Anschluss an die Homogenisierung werden die Zelltrümmer durch Zentrifugation entfernt und die Überstandsfraktion, die die löslichen Proteine enthält, wird für eine weitere Aufreinigung der gewünschten Verbindung zurückgehalten. Wird das Produkt aus den gewünschten Zellen sekretiert, dann werden die Zellen aus der Kultur durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit entfernt und die Überstandsfraktion wird für eine weitere Aufreinigung zurückgehalten.
Die Überstandsfraktion aus einem der Aufreinigungsverfahren wird einer Chromatographie mit einer geeignten Säule unterworfen, in der das gewünschte Molekül entweder auf einem Chromatographie-Granulat im Gegensatz zu vielen Verunreinigungen zurückgehalten wird, oder wo die Verunreinigungen im Gegensatz zu der Probe durch das Granulat zurückgehalten werden. Solche Chromatographie-Schritte können, falls notwendig, unter Verwendung der selben oder verschiedener Chromatographie-Granulate wiederholt werden. Ein Fachmann würde in der Auswahl geeignter Chromatographie-Granulate und hinsichtlich ihrer wirksamsten Anwendung für ein speziell aufzureinigendes Molekül erfahren sein. Das aufgereinigte Produkt kann durch Filtration oder Ultrafiltration konzentriert werden und bei einer Temperatur, bei der die Stabilität des Produktes maximiert wird, gelagert werden.
Im Stand der Technik gibt es eine große Anzahl bekannter Aufreinigungsverfahren, weshalb das vorhergehende Verfahren zur Aufreinigung nicht limitierend sein soll. Solche Aufreinigungstechniken werden zum Beispiel in Bailey, J. E. & Ollis, D. F. Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill: New York (1986) beschrieben. Zusätzlich kann die Identität und Reinheit der isolierten Verbindungen durch Techniken, die in dem Fachgebiet Standard sind, bewertet werden. Diese schließen die Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC), spektroskopische Verfahren, Färbeverfahren, Dünnschichtchromatographie, NIRS, eine enzymatische oder mikrobiologische Untersuchung ein. Ein Überblick über solche Analyseverfahren wird in Patek et al., 1994 Appl. Environ. Microbiol. 60: 133–440; Malakhova et al., 1996 Biotekhnologiya 11: 27–32; und Schmidt et al., 1998 Bioprocess Engineer. 19: 67–70. Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, (1996) vol. A27, VCH: Weinheim, p. 89–90, p. 521–540, p. 540–547, p. 559–566, 575–581 and p. 581–587; Michal., G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. et al., (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17, gegeben.
SEQUENZ Protokoll

Claims

Eine mit einer Proteinkinase-stressspezifisches-Protein(PKSRP)-kodierenden Nukleinsäure transformierte transgene Pflanzenzelle, worin das PKSRP aus der Gruppe, bestehend aus einem, wie in SEQ ID NO: 27 definierten Polypeptid und einem Polypeptid, das mindestens 70% Sequenzidentität zu einem Polypeptid der SEQ ID NO: 27 über seine gesamte Länge aufweist, ausgewählt wird und worin die Expression der Nukleinsäure in der Pflanzenzelle zu einer, verglichen mit einer Wildtypvarietät der Pflanzenzelle, erhöhten Toleranz der Pflanzenzelle gegenüber Trockenstress führt.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 1, worin das PKSRP in SEQ ID NO: 27 definiert ist.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 1, worin die PKSRP-kodierende Nukleinsäure in SEQ ID NO: 14 definiert ist.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 1, worin die PKSRP-kodierende Nukleinsäure eine mindestens 80–90%ige Sequenzidentität zu der Polynukleotidsequenz von SEQ ID NO: 14 über ihre gesamte kodierende Region aufweist.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 1, worin die Pflanze eine Monokotyledone ist.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 1, worin die Pflanze eine Dikotyledone ist.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 1, worin die Pflanze aus der Gruppe, bestehend aus Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Sojabohne, Erdnuss, Baumwolle, Raps, Canola-Raps, Maniok, Pfeffer, Sonnenblume, Tagetes, Nachtschattengewächse, Kartoffel, Tabak, Aubergine, Tomate, Vicia-Arten, Erbse, Alfalfa, Kaffee, Kakao, Tee, Salix-Arten, Ölpalme, Kokosnuss, mehrjähriges Gras und Futterpflanzen ausgewählt ist.
Transgene Pflanze, umfassend eine Pflanzenzelle gemäß einem der Ansprüche 1–7.
Ein von einer transgenen Pflanze, die eine Pflanzenzelle gemäß einem der Ansprüche 1–7 umfasst, produzierter Samen, worin der Samen in Bezug auf eine, verglichen mit einer Wildtypvarietät der Pflanzenzelle, erhöhte Toleranz gegenüber Trockenstress sortenecht ist.
Verwendung einer transgenen Pflanze gemäß Anspruch 8 oder eines Samen gemäß Anspruch 9 zur Herstellung eines Landwirtschaftsprodukts.
Isoliertes Proteinkinase-stressspezifisches-Protein (PKSRP), worin das PKSRP aus der Gruppe, bestehend aus Proteinkinase-6 (PK-6) wie in SEQ ID NO: 27 definiert und einem Polypeptid, das mindestens 70% Sequenzidentität zu dem Polypeptid der SEQ ID NO: 27 über seine gesamte Länge aufweist, ausgewählt ist und worin die Expression der Nukleinsäure in der Pflanze zu einer, verglichen mit einer Wildtypvarietät der Pflanze erhöhten Toleranz der Pflanze gegenüber Trockenstress führt.
Isoliertes PKSRP nach Anspruch 11, worin das PKSRP in SEQ ID NO: 27 definiert ist.
Isolierte Proteinkinase-stressspezifisches-Protein(PKSRP)-kodierende Nukleinsäure worin die PKSRP-kodierende Nukleinsäure aus der Gruppe, bestehend aus PK-6 wie in SEQ ID NO: 14 definiert und einer Sequenz, die mindestens eine 80–90%ige. Sequenzidentität zu der Polynukleotidsequenz von SEQ ID NO: 14 über ihre gesamte kodierende Region aufweist ausgewählt ist.
Isolierte PKSRP-kodierende Nukleinsäure nach Anspruch 13, worin die PKSRP-kodierende Nukleinsäure in SEQ ID NO: 14 definiert wird.
Isolierter rekombinanter Expressionsvektor, umfassend eine Nukleinsäure nach Anspruch 13 oder 14, worin the Expression der Nukleinsäure in einer Wirtszelle zu einer, verglichen mit einer Wildtypvarietät der Wirtszelle, erhöhten Toleranz der Wirtszelle gegenüber Trockenstress führt.
Verfahren zur Produktion einer transgenen Pflanze, die eine Proteinkinase-stressspezifisches-Protein(PKSRP)-kodierende Nukleinsäure enthält, worin die Expression der Nukleinsäure in der Pflanze zu einer, verglichen mit einer Wildtypvarietät der Pflanze, erhöhten Toleranz der Pflanze gegenüber Trockenstress führt, umfassend a. Transformieren einer Pflanzenzelle mit einem, die Nukleinsäure umfassenden Expressionsvektor und b. Erzeugen einer transgenen Pflanze mit einer, verglichen mit einer Wildtypvarietät der Pflanze, erhöhten Toleranz gegenüber Trockenstress aus der Pflanzenzelle, worin das PKSRP aus der Gruppe, bestehend aus Proteinkinase-6 (PK-6) wie in SEQ ID NO: 27 definiert und einem Polypeptid, das mindestens 70% Sequenzidentität zu dem Polypeptid der SEQ ID NO: 27 über seine gesamte Länge aufweist, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 16, worin das PKSRP in SEQ ID NO: 27 definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 16, worin die PKSRP-kodierende Nukleinsäure in SEQ ID NO: 14 definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 16, worin die PKSRP-kodierende Nukleinsäure eine mindestens 80–90%ige Sequenzidentität zu der Polynukleotidsequenz von SEQ ID NO: 14 über ihre gesamte kodierende Region aufweist.
Verfahren zur Stresstoleranz-Modifikation einer Pflanze, umfassend Modifikation der Expression eines Proteinkinase-stressspezifischen-Proteins (PKSRPs) in der Pflanze worin das PKSRP aus der Gruppe, bestehend aus Proteinkinase-6 (PK-6) wie in SEQ ID NO: 27 definiert und einem Polypeptid, das mindestens 70% Sequenzidentität zu dem Polypeptid der SEQ ID NO: 27 über seine gesamte Länge aufweist, ausgewählt ist und worin die Modifikation der Expression der PKSRP-Nukleinsäure in der Pflanze zu einer, verglichen mit einer Wildtypvarietät der Pflanze, modifizierten Toleranz der Pflanze gegenüber Trockenstress führt.
Verfahren nach Anspruch 20, worin das PKSRP in SEQ ID NO: 27 definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 20, worin die PKSRP-kodierende Nukleinsäure in SEQ ID NO: 14 definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 20, worin die PKSRP-kodierende Nukleinsäure eine mindestens 80–90%ige Sequenzidentität zu der Polynukleotidsequenz von SEQ ID NO: 14 über ihre gesamte kodierende Region aufweist.
Verfahren nach Anspruch 20, worin die Stresstoleranz verringert ist.
Verfahren nach Anspruch 20, worin die Pflanze nicht transgen ist.
Verfahren nach Anspruch 20, worin die Pflanze transgen ist.
Verfahren nach Anspruch 26, worin die Pflanze mit einem Promotor, der die Expression der PKSRP regelt, transformiert wird.
Verfahren nach Anspruch 27, worin der Promotor gewebsspezifisch ist.
Verfahren nach Anspruch 27, worin der Promotor entwicklungsreguliert ist.