DE60124880T2

DE60124880T2 - Stress-gekoppeltes signaltransduktionprotein und dessen verwendung in pflanzen

Info

Publication number: DE60124880T2
Application number: DE60124880T
Authority: DE
Inventors: Oswaldo da Apex COSTA E SILVA; J. Hans Champaign BOHNERT; Nocha Cary VAN THIELEN; Ruoying Apex CHEN; Manabu Cary ISHITANI
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2000-04-07
Filing date: 2001-04-06
Publication date: 2007-09-06
Anticipated expiration: 2021-04-07
Also published as: EP2175028A2; US20080189806A1; US7435875B2; EP2169069A3; US7855324B2; US20090144859A1; US20040107463A1; DE60123079D1; CA2767239A1; US7179962B2; ES2272461T3; US20040148658A1; WO2001077356A3; WO2001077161A3; ATE348181T1; EP1373530A2; AU2002243190A1; ATE475715T1; US20100325759A1; CA2767270A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft generell Nukleinsäuresequenzen kodierend Proteine, welche mit abiotischen Stressantworten und abiotischer Stresstoleranz in Pflanzen assoziiert sind. Insbesondere betrifft diese Erfindung Nukleinsäuresequenzen kodierend Proteine, welche Trockenheitstoleranz gegenüber Pflanzen bilden.
Hindergrund im Stand der Technik
Abiotischer umweltmäßiger Stress, wie zum Beispiel Trockenheitsstress, Versalzungsstress, Wärmestress und Kältestress, sind wesentliche Beschränkungsfaktoren von Pflanzenwachstum und Produktivität. Ertragspflanzenverluste und Ertragspflanzenausbeuteverluste von wesentlichen Ertragspflanzen wie zum Beispiel Reis, Mais (corn, maize) und Weizen, welche durch diesen Stress verursacht werden, repräsentieren einen signifikanten ökonomischen und politischen Faktor und tragen zu Lebensmittelknappheiten in vielen unterentwickelten Ländern bei.
Pflanzen sind während ihres Lebenszyklus' typischerweise gegenüber Bedingungen von reduziertem umweltmäßigen Wassergehalt ausgesetzt. Die meisten Pflanzen haben Strategien entwickelt, um sich gegen diese Austrocknungsbedingungen zu schützen. Wenn jedoch die Schwere und Dauer der Trockenheitsbedingungen zu groß sind, sind die Wirkungen auf Pflanzenentwicklung, Wachstum und Ausbeute der meisten Ertragspflanzen groß. Außerdem sind die meisten Ertragspflanzen sehr empfindlich gegenüber höheren Salzkonzentrationen im Boden. Kontinuierliches Exponieren gegenüber Trockenheit und hohem Salz verursacht wesentliche Veränderungen im Pflanzenmetabolismus. Diese großen Veränderungen im Metabolismus führen schließlich zu Zelltod und folglich zu Ausbeuteverlusten.
Die Entwickelung stresstoleranter Pflanzen ist eine Strategie, welche das Potential hat, wenigstens einige von diesen Problemen zu lösen oder zu vermitteln. Jedoch sind traditionelle Pflanzenzuchtstrategien zum Entwickeln neuer Linien von Pflanzen, welche Widerstand (Toleranz) gegenüber diesen Typen von Stress zeigen, relativ langsam und benötigen spezifische resistente Linien zum Kreuzen mit der gewünschten Linie. Beschränkte Protoplasma-Resourcen für Stresstoleranz und Inkompatibilität bei Kreuzungen zwischen entfernt verwandten Pflanzenspezies repräsentieren signifikante Probleme, welchen man in der konventionellen Zucht begegnet. Zusätzlich sind die zellulären Verfahren, welche zu Trockenheits-, Kälte- und Salztoleranz führen, in trocken- und/oder salztoleranten Modellpflanzen dem Wesen nach komplex und involvieren mehrere Mechanismen zellulärer Adaptation und zahlreiche metabolische Wege. Diese Multikomponentennatur von Stresstoleranz hat nicht nur Zucht nach Toleranz in hohem Maße erfolglos gemacht, sondern hat ebenso die Fähigkeit zum genetischen Konstruieren stresstoleranter Pflanzen unter Verwendung biotechnologischer Verfahren beschränkt.
Was deshalb gebraucht wird, ist die Identifizierung der Gene und Proteine, welche in diese Multikomponentenprozesse involviert sind, welche zu Stresstoleranz führen. Aufklären der Funktion von Genen exprimiert in stresstoleranten Pflanzen wird nicht nur unser Verständnis von Pflanzenadaptation und -toleranz gegenüber umweltmäßigem Stress vorwärtsbringen, sondern kann ebenso wichtige Informationen zum Entwerfen neuer Strategien für Ertragspflanzenverbesserung bereitstellen.
Expression und Funktion von abiotischen stressinduzierbaren Genen sind auf molekularer Ebene gut untersucht. Komplexe Mechanismen scheinen als Antwort auf den Stress in Genexpression und Signaltransduktion involviert zu sein. Dies schließt die sensorischen Mechanismen von abiotischem Stress, Modulation der Stresssignale zu zellulären Signalen, Transduktion zum Kern, Second Messenger, welche in die Stress-Signaltransduktion involviert sind, transkriptionelle Kontrolle von stressinduzierbaren Genen und die Funktion und Kooperation von stressinduzierbaren Genen ein.
In Tierzellen spielt die Phosphatidylinositol-spezifische Phospholipase C (PI-PLC) eine Schlüsselrolle in frühen Stadien von verschiedenen Signaltransduktionswegen. Extrazelluläre Stimuli wie zum Beispiel Hormone und Wachstumfaktoren aktivieren PI-PLCs. PI-PLC hydrolysiert Phosphatidylinositol-4, 5-biphosptate (PIP₂) und erzeugt zwei Second Messenger, Inositol-4,5-triphosphtat (IP₃) und 1,2-Diacylglycerol (DG). IP₃ induziert die Freisetzung von intrazellulärem Ca²⁺ in das Zytoplasma, welches wiederum verschiedene Antworten darin verursacht. DG und PIP₂ wirken ebenso als Second Messenger und kontrollieren verschiedene zelluläre Antworten.
Es wird vermutet, dass in Pflanzen ähnliche Systeme in einer abiotischen Stressantwort wirken. Es ist eindeutig gezeigt, dass Phospholipasen A, C oder D (PLA, PLC oder PLD) abhängig von ihrer Spaltstelle eine Rolle in den frühen Signaltransduktionsereignissen spielen, welche die Zellvolumenveränderung assoziiert mit osmotischem Stress und Osmoregulation in Pflanzen unterstützen, was für Pflanzen-Stresstoleranz wichtig ist (Wang X. et bei., 2000, Biochemical Society Transactions [Verhandlungen der Biochemischen Gesellschaft]. 28, 813–816, Chapman KD, 1998 Tre. Plant Sci. 3: 419–426). Zum Beispiel wird in Schließzellen Abscisinsäure-induzierte (ABA-induzierte) Stomataschließung durch schnelle Aktivierung von PIP2-PLC vermittelt. Dies führt zu einer Erhöhung der IP₃-Spiegel, einem Anstieg des zytosolischen Calciums und der nachfolgenden Inhibition von K+-Kanälen. Kürzlich wurde gezeigt, dass ein Gen für Phospholipase C, AtPLC, durch Trockenheit und Salzstress in Arabidopsis thaliana (Hirayama, T. et al., 1995 Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 3903–3907) schnell induziert wird.
Wie oben erwähnt, spielen Ca²⁺-Ionen eine wichtige Rolle als Second Messenger in verschiedenen Signaltransduktionswegen in Pflanzen. Eine bemerkenswerte Erhöhung der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration wurde nach Stimulierung durch Wind, Berühren, abiotischen Stress (Kälte, Trockenheit und Salzgehalt) oder Pilzinduktoren beobachtet. Mehrere Gene für Ca²⁺-Bindeproteine mit einer konservierten EF-Hand-Domäne wurden isoliert und zeigten einen erhöhten Expressionspiegel nach abiotischer Stressbehandlung (Frandsen G. et al., 1996 J Biol. Chem. 271: 343–348, Takahashi S. et al., 2000 Plant Cell Physiol. 41: 898–903).
Ebenso waren die rätselhaft bezeichneten 14-3-3-Proteine in der letzen Zeit der Gegenstand einer beträchtlichen Aufmerksamkeit, da angenommen wird, dass sie in die Regulation von verschiedenen physiologischen Prozessen in Eukaryoten von Schleimpilzen bis zu höheren Pflanzen verwickelt sind. In Pflanzen wurden viele biologische Rollen für 14-3-3-Proteine vorgeschlagen. Die wichtigsten davon schließen eine Rolle im Import von kernkodierten Chloroplastenproteinen, in der Anordnung von Transkriptionsfaktorkomplexen und in der Regulation von Enzymaktivität als Antwort auf intrazelluläre Signaltransduktionskaskaden (Chung HJ. et al., 1999 Tre. Plant Sci. 4: 367–371) ein. Die nativen 14-3-3-Proteine sind Homo- oder Heterodimere, und da jedes Monomer eine Bindungsstelle hat, kann ein Dimer möglicherweise zwei Ziele binden, was ihre Assoziation unterstützt. Alternativ können Zielproteine mehr als eine 14-3-3-Bindestelle haben.
Mehrere Funktionen wurden für die 14-3-3-Proteine bei der Beteiligung von Pflanzen-Stresstoleranz vorgeschlagen. Die 14-3-3-Proteine könnten als Regulatoren bei der Stress-Signaltransduktion wirken. Zum Beispiel werden RCI14A- und RCI14B-Gene durch Kältebehandlung in Arabidopsis induziert und sind zu den 14-3-3-Proteinen hoch homolog. Der Anstieg der RCI-Transkriptspiegel, welcher als Antwort auf Kältebehandlung beobachtet wird, läßt auf eine Rolle für die RCI-Proteine im Stress-Signaltransduktionsweg schließen (Jarillo JA et al., 1994 Plant Mol. Biol. 25: 693–704).
Aufgrund der kommerziellen Konsequenzen von Umweltschäden auf Ertragspflanzen besteht ein Interesse am Verstehen der Stressantworts-Signaltransduktionsmechanismen in Pflanzen und wie diese manipuliert werden können, um eine Pflanzenantwort auf einen Umweltschaden zu verbessern. Es besteht deshalb ein Bedarf, Gene zu identifizieren, welche in stresstoleranten Pflanzen exprimiert werden, welche die Fähigkeit haben, Stresswiderstand in ihrer Wirtspflanze und in anderen Pflanzenspezies zu bilden. Neu erzeugte stresstolerante Pflanzen haben viele Vorteile, wie zum Beispiel Erhöhen des Bereichs, in dem Ertragspflanzen kultiviert werden können, zum Beispiel durch Vermindern der Wassererfordernisse einer Pflanzenspezies.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung erfüllt teilweise den Bedarf, neue einzigartige Signaltransduktionsproteine zu identifizieren, welche zum Bilden einer Stresstoleranz gegenüber Pflanzen nach Überexpression fähig sind. Die vorliegende Erfindung stellt eine transgene Pflanzenzelle transformiert durch eine ein Stressbezogenes Signaltransduktionsprotein (Signal Transduction Stress-Related Protein STSRP) kodierende Nukleinsäure bereit, wobei Expression der Nukleinsäuresequenz in der Pflanzenzelle zu einer erhöhten Toleranz gegenüber Umweltstress verglichen mit einer Wildtypvarietät der Pflanzenzelle führt. Der Umweltstress ist Trockenheitsstress. Das STSRP ist der Transkriptionsfaktor Phospholipase C-1 (PLC-1) aus Physcomitrella patens.
Die Erfindung sieht in einigen Ausführungsformen vor, dass das STSRP und eine kodierende Nukleinsäure in Mitgliedern der Gattung Physcomitrella gefunden werden. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die Nukleinsäure und das Protein von Physcomitrella patens. Die Erfindung sieht vor, dass der Umweltstress Trockenheitsstress ist und optional Salzgehalt, Temperatur, Metall, chemischer, pathogener und oxidativer Stress oder Kombinationen davon.
Die Erfindung stellt weiterhin eine Saat hergestellt durch eine transgene Pflanze transformiert durch eine STSRP-kodierende Nukleinsäure bereit, wobei die Pflanze eine reinrassige Zucht für erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress verglichen mit einer Wildtypvarietät der Pflanze ist. Die Erfindung stellt weiterhin eine Saat hergestellt durch eine transgene Pflanze exprimierend ein STSRP bereit, wobei die Pflanze eine reinrassige Zucht für erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress verglichen mit einer Wildtypvarietät der Pflanze ist.
Die Erfindung stellt weiterhin transgene Pflanzen, Pflanzenteile oder Saaten wie unten beschrieben zur Herstellung eines landwirtschaftlichen Produktes bereit. Die Erfindung stellt weiterhin ein isoliertes STSRP wie unten beschrieben bereit. Die Erfindung stellt weiterhin eine isolierte STSRP-kodierende Nukleinsäure bereit, wobei die STSRP-kodierende Nukleinsäure für ein STSRP wie unten beschrieben kodiert.
Die Erfindung stellt weiterhin einen isolierten rekombinanten Expressionsvektor bereit umfassend eine STSRP-kodierende Nukleinsäure wie unten beschrieben, wobei Expression des Vektors in Wirtszellen zu einer erhöhten Toleranz gegenüber Umweltstress verglichen mit einer Wildtypvarietät der Wirtszelle führt. Die Erfindung stellt weiterhin eine Wirtszelle enthaltend den Vektor und eine Pflanze enthaltend die Wirtszelle bereit.
Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zum Herstellen einer transgenen Pflanze mit einer STSRP-kodierenden Nukleinsäure bereit, wobei Expression der Nukleinsäure in der Pflanze zu einer erhöhten Toleranz gegenüber Umweltstress verglichen mit einer Wildtypvarietät der Pflanze führt, umfassend: (a) Transformieren einer Pflanzenzelle mit einem Expressionsvektorumfassend eine STSRP-kodierende Nukleinsäure, und (b) Erzeugen aus der Pflanzenzelle eine transgene Pflanze mit einer erhöhten Toleranz gegenüber Umweltstress verglichen mit einer Wildtypvarietät der Pflanze. In bevorzugten Ausführungsformen sind das STSRP und die STSRP-kodierende Nukleinsäure wie unten beschrieben.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zum Identifizieren eines neuen STSRP bereit, umfassend (a) Hervorrufen einer spezifischen Antikörperantwort gegenüber einem STSRP oder Fragment davon, wie oben beschrieben, (b) Screenen von putativem STSRP-Material mit dem Antikörper, wobei ein spezifisches Binden des Antikörpers an das Material die Anwesenheit eines möglicherweise neuen STSRP anzeigt, und (c) Identifizieren eines neuen STSRP im Vergleich zu bekannten STSRP aus dem gebundenen Material. Alternativ kann eine Hybridisierung mit Nukleinsäuresonden wie unten beschrieben verwendet werden, um neue STSRP-Nukleinsäuren zu identifizieren.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenso Verfahren zum Modifizieren einer Stresstoleranz einer Pflanze bereit umfassend Modifizieren der Expression eines STSRP in der Pflanze, wobei das STSRP wie unten beschrieben ist. Die Erfindung sieht vor, dass dieses Verfahren derartig durchgeführt werden kann, dass die Stresstoleranz entweder erhöht oder vermindert wird. Vorzugsweise wird eine Stresstoleranz in einer Pflanze über Erhöhen der Expression eines STSRP erhöht.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1(A–E) zeigen die teilweisen cDNA-Sequenzen von PLC-1 (SEQ ID NO: 1), PLC-2 (SEQ ID NO: 2), 14-3-3P-1 (SEQ ID NO: 3), 14-3-3P-2 (SEQ ID NO: 4) und CBP-1 (SEQ ID NO: 5) von Physcomitrella patens.
2(A–E) zeigen die cDNA-Sequenzen über die gesamte Länge von PLC-1 (SEQ ID NO: 6), PLC-2 (SEQ ID NO: 7), 14-3-3P-1 (SEQ ID NO: 8), 14-3-3P-2 (SEQ ID NO: 9) und CBP-1 (SEQ ID NO: 10) von Physcomitrella patens.
3(A–E) zeigen die abgeleiteten Aminosäuresequenzen von PLC-1 (SEQ ID NO: 11), PLC-2 (SEQ ID NO: 12), 14-3-3P-1 (SEQ ID NO: 13), 14-3-3P-2 (SEQ ID NO: 14) und CBP-1 (SEQ ID NO: 15) von Physcomitrella patens.
4 zeigt ein Diagramm des Pflanzen-Expressionsvektors pBPSSC022 enthaltend den Superpromotor, welcher die Expression von SEQ ID NOs: 6, 7, 8, 9 und 10 ("Gewünschtes Gen") steuert. Die Bestandteile sind: NPTII-Kanamycin-Resistenzgen (Bevan M, Nucleic Acids Res. 26: 8711–21, 1984), AtAct2-i-Promotor (An YQ et al., Plant J 10: 107–121 1996), OCS3-Terminator (During K, Transgenic Res. 3: 138–140, 1994), NOSpA-Terminator (Jefferson et al., EMBO J 6: 3901–7 1987).
5 zeigt die Ergebnisse eines Trockenheitsstresstestes mit überexprimierenden PpPLC-1-transgenen Pflanzen und Wildtyp-Arabidopsis-Linien. Die transgenen Linien zeigen einen toleranten Phänotyp. Einzelne Transformantenlinien werden gezeigt.
6 zeigt die Ergebnisse eines Trockenheitsstresstestes mit überexprimierenden PpPLC-2-transgenen Pflanzen und Wildtyp-Arabidopsis-Linien. Die transgenen Linien zeigen einen toleranten Phänotyp. Einzelne Transformantenlinien werden gezeigt.
7 zeigt die Ergebnisse eines Trockenheitsstresstestes mit überexprimierenden Pp14-3-3P-1-transgenen Pflanzen und Wildtyp-Arabidopsis-Linien. Die transgenen Linien zeigen einen toleranten Phänotyp. Einzelne Transformantenlinien werden gezeigt.
8 zeigt die Ergebnisse eines Trockenheitsstresstestes mit überexprimierenden Pp14-3-3P-2-transgenen Pflanzen und Wildtyp-Arabidopsis-Linien. Die transgenen Linien zeigen einen toleranten Phänotyp. Einzelne Transformantenlinien werden gezeigt.
9 zeigt die Ergebnisse eines Trockenheitsstresstestes mit überexprimierenden PpCBP-1-transgenen Pflanzen und Wildtyp-Arabidopsis-Linien. Die transgenen Linien zeigen einen toleranten Phänotyp. Einzelne Transformantenlinien werden gezeigt.
10 zeigt die Ergebnisse eines Froststresstestes mit überexprimierenden PpPLC-2-transgenen Pflanzen und Wildtyp-Arabidopsis-Linien. Die transgenen Linien zeigen einen toleranten Phänotyp. Einzelne Transformantenlinien werden gezeigt.
11 zeigt die Ergebnisse eines Froststresstestes mit überexprimierenden Pp14-3-3P-1-transgenen Pflanzen und Wildtyp-Arabidopsis-Linien. Die transgenen Linien zeigen einen toleranten Phänotyp. Einzelne Transformantenlinien werden gezeigt.
12 zeigt die Ergebnisse eines Froststresstestes mit überexprimierenden PpCBP-1-transgenen Pflanzen und Wildtyp-Arabidopsis-Linien. Die transgenen Linien zeigen einen toleranten Phänotyp. Einzelne Transformantenlinien werden gezeigt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung kann leichter durch Referenz auf die folgende detaillierte Beschreibung der bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen und die hierin eingeschlossenen Beispiele verstanden werden. Es versteht sich ebenso, dass die hierin verwendete Terminologie nur für den Zweck der Beschreibung spezifischer Ausführungsformen da ist, und es ist nicht beabsichtigt, dass sie beschränkend sein soll. Insbesondere beschränkt die Bezeichnung der Aminosäuresequenzen als Protein "Stressbezogene Signaltransduktionsproteine" (Signal Transduction Stress-Related Proteins STSRPs) in keine Weise die Funktionalität von diesen Sequenzen.
Die vorliegende Erfindung stellt eine transgene Pflanzenzelle bereit, welche durch eine STSRP-kodierende Nukleinsäure transformiert ist, wobei Expression der Nukleinsäuresequenz in der Pflanzenzelle zu einer erhöhten Toleranz gegenüber Umweltstress verglichen mit einer Wildtypvarietät der Pflanzenzelle führt. Das STSRP ist PLC-1, und der Umweltstress ist Trockenheitsstress. Die Erfindung stellt weiterhin transgene Pflanzenteile und transgene Pflanzen bereit, welche die hierin beschriebenen Pflanzenzellen enthalten. Ebenso wird eine Pflanzensaat bereitgestellt ist, welche durch eine transgene Pflanze transformiert durch eine STSRP-kodierende Nukleinsäure bereitgestellt wird, wobei die Saat die STSRP-kodierende Nukleinsäure enthält und wobei die Pflanze eine reinrassige Zucht für erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress verglichen mit einer Wildtypvarietät der Pflanze ist. Die Erfindung stellt weiterhin eine Saat bereit hergestellt durch eine transgene Pflanze, welche ein STSRP exprimiert, wobei die Saat das STSRP enthält und wobei die Pflanze eine reinrassige Zucht für erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress verglichen mit einer Wildtypvarietät der Pflanze ist. Die Erfindung stellt ebenso unten beschriebene transgene Pflanzen, Pflanzenteile und Pflanzensaaten zur Verwendung zur Herstellung eines landwirtschaftlichen Produkts bereit.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff "Varietät" auf eine Gruppe von Pflanzen innerhalb einer Spezies, welche konstante Merkmale aufweisen, welche sie von der typischen Form und von anderen möglichen Varietäten innerhalb dieser Spezies trennen. Während eine Varietät wenigstens ein unterscheidendes Merkmal besitzt, ist sie ebenso durch eine gewisse Variation zwischen Individuen innerhalb der Varietät gekennzeichnet, welche in erster Linie auf der Mendelschen Segregation von Merkmalen unter der Nachkommenschaft von nachfolgenden Generationen basiert. Eine Varietät wird als "reinrassige Zucht" für ein bestimmtes Merkmal betrachtet, wenn es genetisch homozygot für dieses Merkmal in dem Ausmaß ist, dass, wenn die reinrassige Varietät selbstbestäubend ist, eine signifikante unabhängige Segregation des Merkmals unter der Nachkommenschaft nicht beobachtet wird. In der vorliegenden Erfindung kommt das Merkmal von der transgenen Expression von einer oder mehreren DNA-Sequenzen, welche in eine Pflanzenvarietät eingeführt werden.
Die vorliegende Erfindung beschreibt zum ersten Mal, dass das Physcomitrella-patens-STSRP PLC-1 zum Erhöhen der Toleranz einer Pflanze gegenüber Umweltstress geeignet ist. Folglich stellt die vorliegende Erfindung isoliertes PLC-1 und Homologe davon bereit. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das STSRP ausgewählt aus einem Phospholipase-C-1-Protein (PLC-1-Protein) wie in SEQ ID NO: 11 definiert. Homologe und Orthologe der Aminosäuresequenz werden unten definiert.
Die erfindungsgemäßen STSRPs werden vorzugsweise durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt. Zum Beispiel wird ein Nukleinsäuremolekül kodierend das Protein in einen Expressionsvektor (wie oben beschrieben) kloniert, der Expressionsvektor wird in eine Wirtszelle (wie oben beschrieben) eingeführt, und das STSRP wird in der Wirtszelle exprimiert. Das STSRP kann dann aus den Zellen durch ein geeignetes Reinigungschema isoliert werden, welches Standard-Proteinreinigungstechniken verwendet. Alternativ zu einer rekombinanten Expression kann ein STSRP-Polypeptid oder Peptid chemisch synthetisiert werden, wobei Standard-Peptidsynthesetechniken verwendet werden. Überdies kann natives STSRP aus Zellen isoliert werden (z. B. Physcomitrella patens), wobei zum Beispiel ein anti-STSRP-Antikörper verwendet wird, welcher durch Standardtechniken hergestellt werden kann, wobei ein STSRP oder Fragment davon verwendet wird.
Die Erfindung stellt weiterhin eine isolierte STSRP-kodierende Nukleinsäure bereit. Die vorliegende Erfindung schließt STSRP-kodierende Nukleinsäuren ein, welche STSRPs wie hierin beschrieben kodieren. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die STSRP-kodierende Nukleinsäure ausgewählt aus einer Phospholipase-C-1-Nukleinsäure (PLC-1-Nukleinsäure) wie in SEQ ID NO: 6 definiert. Homologe und Orthologe der Nukleotidsequenzen werden unten definiert. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Nukleinsäure und das Protein aus der Pflanzengattung Physcomitrella isoliert. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die Nukleinsäure und das Protein von einer Physcomitrellapatens-Pflanze (P. patens).
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff "Umweltstress" auf einen Trockenheitsstress und optional weitere beliebige suboptimale Wachstumsbedingungen und schließt suboptimale Bedingungen assoziiert mit Salzgehalt, Temperatur, Metall, chemischem, pathogenem und oxidativem Stress oder Kombinationen davon ein, ist aber nicht darauf beschränkt. Es ist versteht sich ebenso, dass, wie in der Beschreibung und in den Ansprüchen verwendet, "ein", "einer" oder "eine" abhängig vom Kontext in welchem es verwendet wird, "ein" oder "mehrere" bedeuten kann. Daher kann zum Beispiel eine Bezugnahme auf "eine Zelle" bedeuten, dass wenigstens eine Zelle verwendet werden kann.
Wie ebenso hierin verwendet wird beabsichtigt, dass die Begriffe "Nukleinsäure" und "Nukleinsäuremolekül" DNA-Moleküle (z. B. cDNA oder genomische DNA) und RNA-Moleküle (z. B. mRNA) und Analoga der DNA oder RNA einschließen, welche unter Verwendung von Nukleotidanaloga erzeugt wurden. Dieser Begriff umfasst ebenso eine untranslatierte Sequenz angeordnet sowohl am 3'- als auch am 5'-Ende der kodierenden Region des Gens: wenigstens etwa 1000 Nukleotide einer Sequenz stromaufwärts vom 5'-Ende der kodierenden Region und wenigstens etwa 200 Nukleotide einer Sequenz stromabwärts vom 3'-Ende der kodierenden Region des Gens. Das Nukleinsäuremolekül kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein, ist aber vorzugsweise doppelsträngige DNA.
Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül ist eines, dass im wesentlichen getrennt von anderen Nukleinsäuremolekülen ist, welche in der natürliche Quelle der Nukleinsäure vorhanden sind. Vorzugsweise ist eine "isolierte" Nukleinsäure frei von einigen der Sequenzen, welche natürlicherweise die Nukleinsäure (d. h. Sequenzen angeordnet an den 5'- und 3'-Enden der Nukleinsäure) in der genomischen DNA des Organismus' flankieren, von welchem die Nukleinsäure abgeleitet ist. Zum Beispiel kann das isolierte STSRP-Nukleinsäuremolekül in verschiedenen Ausführungsformen weniger als etwa 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb von Nukleotidsequenzen enthalten, welche natürlicherweise das Nukleinsäuremolekül in der genomischen DNA der Zelle flankieren, von welcher die Nukleinsäure abgeleitet ist (z. B. eine Physcomitrella-patens-Zelle). Überdies kann ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül, wie zum Beispiel ein cDNA-Molekül, von einigen der anderen zellulären Materialien frei sein, mit welchen es natürlicherweise assoziiert ist, oder von Kulturmedium, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt ist, oder chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien, wenn es chemisch synthetisiert wird.
Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül, z. B. ein Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz mit SEQ ID NO: 6 oder ein Anteil davon, kann isoliert werden, indem molekularbiologische Standardtechniken und die hierin bereitgestellte Sequenzinformation verwendet werden. Zum Beispiel kann eine P.-patens-STSRP-cDNA aus einer P.-patens-Bibliothek isoliert werden, wobei die gesamte oder ein Anteil von der Sequenz mit SEQ ID NO: 1 verwendet wird. Überdies kann ein Nukleinsäuremolekül umfassend die gesamte oder einen Anteil von der Sequenz mit SEQ ID NO: 1 durch die Polymerase-Kettenreaktion isoliert werden, wobei Oligonukleotidprimer verwendet werden, welche basiert auf dieser Sequenz konstruiert werden. Zum Beispiel kann mRNA aus Pflanzenzellen isoliert werden (z. B. durch das Guanidiniumthiocyanat-Extraktionsverfahren von Chirgwin et al., 1979 Biochemistry [Biochemie] 18: 5294–5299), und cDNA kann hergestellt werden, indem reverse Transkriptase verwendet wird (z. B. reverse Moloney-MLV-Transkriptase verfügbar von Gibco/BRL, Bethesda, MD, oder reverse AMV-Transkriptase verfügbar von Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Synthetische Oligonukleotidprimer für eine Polymerase-Kettenreaktionsamplifizierung können basiert auf der Nukleotidsequenz gezeigt in SEQ ID NO: 1 konstruiert werden. Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül kann gemäß Standard-PCR-Amplifizierungstechniken amplifiziert werden, wobei cDNA oder alternativ genomische DNA als ein Template und geeignete Oligonukleotidprimer verwendet werden. Das so amplifizierte Nukleinsäuremolekül kann in einen geeigneten Vektor kloniert werden und durch DNA-Sequenzanalyse gekennzeichnet werden. Außerdem können Oligonukleotide korrespondierend zu einer STSRP-Nukleotidsequenz durch synthetische Standardtechniken hergestellt werden, welche z. B. einen automatisierten DNA-Synthesizer verwenden.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein isoliertes erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül die Nukleotidsequenz gezeigt in SEQ ID NO: 6. Diese cDNA umfasst eine Sequenz kodierend das PLC-1-Protein (d. h. die "kodierende Region" gezeigt in Tabelle 1), als auch die 5'-nichttranslatierte Sequenz und die 3'-nichttranslatierte Sequenz des PLC-1-Gens. Es soll verstanden werden, dass SEQ ID NO: 6 sowohl die kodierende Region als auch die 5'- und die 3'- nichttranslatierte Region umfasst. Alternativ kann das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül nur die kodierende Region von der Sequenz SEQ ID NO: 6 umfassen oder kann ganze genomische Fragmente isoliert aus genomischer DNA enthalten. Eine kodierende Region von dieser Sequenz wird als "ORF-Position" bezeichnet. Die vorliegende Erfindung schließt ebenso STSRP-kodierende Nukleinsäuren ein, welche das STSRP PLC-1 wie hierin beschrieben kodieren. Bevorzugt ist eine STSRP-kodierende Nukleinsäure, welche ein STSRP ausgewählt aus PLC-1 (SEQ ID NO: 11) kodiert.
Überdies kann das Nukleinsäuremolekül nur einen Anteil der kodierenden Region von der Sequenz in SEQ ID NO: 6 umfassen, zum Beispiel ein Fragment, welches als eine Sonde oder Primer verwendet werden kann, oder ein Fragment, welches einen biologisch aktiven Anteil eines STSRP kodiert. Die Nukleotidsequenzen, welche durch das Klonieren der STSRP-Gene von P. pafens bestimmt wurden, erlauben die Erzeugung von Sonden und Primern, welche zur Verwendung beim Identifizieren und/oder Klonieren von STSRP-Homologen in anderen Zelltypen und Organismen, als auch von STSRP-Homologen von anderen Moosen und verwandten Spezies konstruiert werden können.
Anteile von Proteinen, welche durch die STSRP-Nukleinsäuremoleküle kodiert werden, sind vorzugsweise biologisch aktive Anteile von einem der hierin beschriebenen STSRPs. Es wird beabsichtigt, dass der Begriff "biologisch aktiver Anteil von einen STSRP" wie hierin verwendet einen Anteil einschließt, z. B. eine Domäne/ein Motiv eines STSRP, welches an einer Stresstoleranzantwort in einer Pflanze teilnimmt, eine Aktivität wie in Tabelle 1 angegeben hat oder an der Transkription eines Proteins teilnimmt, welches in eine Stresstoleranzantwort in einer Pflanze involviert ist. Um zu bestimmen, ob ein STSRPs oder ein biologisch aktiver Anteil davon an der Expression eines Proteins involviert in eine Stresstoleranzantwort in einer Pflanze teilnehmen kann, oder ob Repression eines STSRP zu einer erhöhten Stresstoleranz in einer Pflanze führt, kann eine Stressanalyse einer Pflanze, welche das STSRP umfasst, durchgeführt werden. Derartige Analyseverfahren sind den Fachleuten gut bekannt, wie in Beispiel 7 detailliert angegeben ist. Insbesondere können Nukleinsäurefragmente kodierend biologisch aktive Anteile eines STSRP durch Isolieren eines Anteils von der Sequenz SEQ ID NO: 11, Exprimieren des kodierten Anteils des STSRP oder Peptids (z. B. durch rekombinante Expression in vitro) und Beurteilen der Aktivität des kodierten Anteils des STSRP oder Peptids hergestellt werden.
Biologisch aktive Anteile eines STSRP schließen Peptide umfassend Aminosäuresequenzen abgeleitet von der Aminosäuresequenz eines STSRP ein, z. B. eine Aminosäuresequenz mit SEQ ID NO: 11 oder die Aminosäuresequenz eines Proteins, welches zu einem STSRP homolog ist, welches weniger Aminosäuren einschließt als ein STSRP mit voller Länge, oder das Protein mit der gesamten Länge, welches homolog zu dem STSRP ist und wenigstens eine Aktivität eines STSRP zeigt. Typischerweise umfassen biologisch aktive Anteile (z. B. Peptide, welche zum Beispiel 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 oder mehr Aminosäuren lang sind) eine Domäne oder Motiv mit wenigstens einer Aktivität eines STSRP. Überdies können andere biologisch aktive Anteile, in welchen andere Regionen des Proteins deletiert werden, durch rekombinante Techniken hergestellt und für eine oder mehrere der hierin beschriebenen Aktivitäten evaluiert werden. Vorzugsweise schließen die biologisch aktiven Anteile eines STSRP ein oder mehrere ausgewählte Domänen/Motive oder Anteile davon ein, welche eine biologische Aktivität haben.
Chimäre STSRP-Proteine oder STSRP-Fusionsproteine können bereitgestellt werden. Wie hierin verwendet umfasst ein "chimäres STSRP Protein" oder ein "STSRP-Fusionsprotein" ein STSRP-Polypeptid operativ verbunden mit einem nicht-STSRP-Polypeptid. Ein STSRP-Polypeptid bezieht sich auf ein Polypeptid, welches eine Aminosäuresequenz korrespondierend zu einem STSRP aufweist, während ein nicht-STSRP-Polypeptid sich auf ein Polypeptid bezieht, welches eine Aminosäuresequenz korrespondierend zu einem Protein aufweist, welches nicht im wesentlichen homolog zum STSRP ist, z. B. ein Protein, welches vom STSRP verschieden ist und von demselben oder einem anderen Organismus abgeleitet ist. Innerhalb des Fusionsproteins wird beabsichtigt, dass der Begriff "operativ verbunden" anzeigt, dass das STSRP-Polypeptid und das nicht-STSRP-Polypeptid miteinander fusioniert sind, so dass beide Sequenzen die vorgeschlagene Funktion erfüllen, die der verwendeten Sequenz zugeordnet ist. Das nicht-STSRP-Polypeptid kann mit dem N-Terminus oder C-Terminus des STSRP-Polypeptids fusioniert sein. In einer Ausführungsform ist das Fusionsprotein zum Beispiel ein GST-STSRP-Fusionsprotein, in welchem die STSRP-Sequenzen mit dem C-Terminus der GST-Sequenzen fusioniert sind. Derartige Fusionsproteine können die Reinigung von rekombinanten STSRPs erleichtern. In einer anderen Ausführungsform ist das Fusionsprotein ein STSRP, welches eine heterologe Signalsequenz an ihrem N-Terminus enthält. In bestimmten Wirtszellen (z. B. Säugetier-Wirtszellen) kann die Expression und/oder Sekretion eines STSRP durch Verwendung von einer heterologen Signalsequenz erhöht werden.
Vorzugsweise wird ein chimäres STSRP-Protein oder Fusionsprotein durch rekombinante DNA-Standardtechniken hergestellt. Zum Beispiel werden DNA-Fragmente kodierend die verschiedenen Polypeptidsequenzen im Raster in Übereinstimmung mit konventionellen Techniken zusammenligiert, zum Beispiel durch Verwenden stumpfendiger oder gestaffeltendiger Termini zur Ligation, Restriktionsenzymverdau zum Bereitstellen geeigneter Termini, falls erforderlich Auffüllen von kohäsiven Enden, alkalische Phosphatasebehandlung zum Vermeiden unerwünschter Bindungen und enzymatische Ligation. In einer anderen Ausführungsform kann das Fusionsgen durch konventionelle Techniken einschließend automatisierte DNA-Synthesizer synthetisiert werden. Alternativ kann PCR-Amplifizierung von Genfragmenten ausgeführt werden, wobei Ankerprimer verwendet werden, welche komplementäre Überhänge zwischen zwei aufeinanderfolgenden Genfragmenten verursachen, welche danach zusammengelagert und zum Erzeugen einer chimären Gensequenz reamplifiziert werden können (siehe zum Beispiel Current Protocols in Molecular Biology [Aktuelle Protokolle der Molekularbiologie], Hrsg. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). Überdies sind viele Expressionsvektoren kommerziell verfügbar, welche schon eine Fusionsgruppe kodieren (z. B. ein GST-Polypeptid). Eine STSRP-kodierende Nukleinsäure könnte in einen derartigen Expressionsvektor derartig kloniert werden, dass die Fusionsgruppe im Raster mit dem STSRP verbunden wird.
Neben Fragmenten und Fusionsproteinen der hierin beschriebenen STSRPs können Homologe und Analoga von natürlicherweise auftretenden STSRPs und STSRP-kodierenden Nukleinsäuren in einer Pflanze bereitgestellt werden. "Homologe" werden hierin als zwei Nukleinsäuren oder Proteine definiert, welche ähnliche oder "homologe" Nukleotid- beziehungsweise Aminosäuresequenzen haben. Homologe schließen allelische Varianten, Orthologe, Paraloge, Agonisten und Antagonisten von STSRPs wie nachstehend definiert ein. Der Begriff "Homolog" umfasst weiter Nukleinsäuremoleküle, welche sich von der Nukleotidsequenz gezeigt in SEQ ID NO: 6 (und Anteilen davon) aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterscheiden und daher dasselbe STSRP kodieren wie dasjenige, welches durch die Nukleotidsequenz gezeigt in SEQ ID NO: 6 kodiert wird. Wie hierin verwendet bezieht sich ein "natürlicherweise auftretendes" STSRP auf eine STSRP-Aminosäuresequenz, welche in der Natur auftritt. Vorzugsweise umfasst ein natürlicherweise auftretendes STSRP die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 11.
Ein Agonist des STSRP kann im wesentlichen dieselben biologischen Aktiviäten des STSRP oder eines Anteils davon behalten. Ein Antagonist des STSRP kann eine oder mehrere der Aktivitäten der natürlicherweise auftretenden Form des STSRP inhibieren. Zum Beispiel kann der STSRP-Antagonist kompetitiv an ein stromabwärtiges oder stromaufwärtiges Mitglied der metabolischen Kaskade aus Zellmembranbestandteilen binden, welche das STSRP einschließt, oder kann an ein STSRP binden, welches den Transport von Verbindungen über derartige Membranen vermittelt, wobei es eine Translokation verhindert.
Nukleinsäuremoleküle korrespondierend zu natürlichen allelischen Varianten und Analoga, Orthologe und Paraloge einer STSRP-cDNA können basierend auf ihrer Identität zu den hierin beschriebenen Physcomitrella-patens-STSRP-Nukleinsäuren isoliert werden, wobei STSRP-cDNAs oder ein Anteil davon als eine Hybridisierungssonde gemäß Standardhybridisierungstechniken unter stringenten Hybridisierungsbedingungen verwendet werden. In einer alternativen Ausführungsform können Homologe des STSRP durch Screenen kombinatorischer Bibliotheken von Mutanten des STSRP, z. B. Trunkierungsmutanten, nach einer STSRP-Agonisten- oder Antagonistenaktivität identifiziert werden. In einer Ausführungsform wird eine variierte Bibliothek von STSRP-Varianten durch kombinatorische Mutagenese auf dem Nukleinsäureniveau erzeugt und wird durch eine variierte Genbibliothek kodiert. Eine variierte Bibliothek von STSRP-Varianten kann zum Beispiel durch enzymatisches Ligieren einer Mischung von synthetischen Oligonukleotiden in Gensequenzen derartig hergestellt werden, dass ein degenerierter Satz von möglichen STSRP-Sequenzen als einzelne Polypeptide oder alternativ als ein Satz von größeren Fusionsproteinen exprimierbar ist (z. B. für Phage Display), welcher den Satz von STSRP-Sequenzen darin enthält. Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, welche zum Herstellen von Bibliotheken von möglichen STSRP-Homologen aus einer degenerierten Oligonukleotidsequenz verwendet werden können. Eine chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem automatischen DNA-Synthesizer durchgeführt werden, und das synthetische Gen wird dann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert. Die Verwendung von einem degenerierten Satz von Genen ermöglicht die Bereitstellung von allen Sequenzen kodierend den gewünschten Satz von möglichen STSRP-Sequenzen in einer Mischung. Verfahren zum Synthetisieren degenerierter Oligonukleotide sind im Stand der Technik bekannt (siehe z. B. Narang, S. A., 1983 Tetrahedron 39: 3, Itakura et al., 1984 Annu. Rev. Biochem. 53: 323, Itakura et al., 1984 Science 198: 1056, Ike et al., 1983 Nucleic Acid Res. 11: 477).
Des Weiteren können Bibliotheken von Fragmenten der STSRP-kodierenden Regionen zum Erzeugen einer variierten Population von STSRP-Fragmenten zum Screenen und nachfolgender Selektion von Homologen eines STSRP verwendet werden. In einer Ausführungsform kann eine Bibliothek von kodierenden Sequenzfragmenten durch Behandeln eines doppelsträngigen PCR Fragments einer STSRP-kodierenden Sequenz mit einer Nuklease unter Bedingungen erzeugt werden, wobei Nicking nur etwa einmal pro Molekül auftritt, Denaturieren der doppelsträngigen DNA, Renaturieren der DNA zum Bilden doppelsträngiger DNA, welche Sense-/Antisense-Paare von verschiedenen genickten Produkten einschließen kann, Entfernen einzelsträngiger Anteile von den wiedergebildeten Duplexen durch Behandlung mit S1-Nuklease und Ligieren der resultierenden Fragmentbibliothek in einen Expressionsvektor. Durch dieses Verfahren kann eine Expressionsbibliothek abgeleitet werden, welche N-terminale, C-terminale und interne Fragmente des STSRP mit verschiedenen Größen kodiert.
Verschiedene Techniken sind im Stand der Technik zum Screenen von Genprodukten von kombinatorischen Bibliotheken bekannt, welche durch Punktmutationen oder Trunkierung gemacht wurden, und zum Screenen von cDNA-Bibliotheken nach Genprodukten, welche eine ausgewählte Eigenschaft haben. Derartige Techniken sind für ein schnelles Screenen der Genbibliotheken adaptierbar, welche durch die kombinatorische Mutagenese von STSRP-Homologen erzeugt wurden. Die am weitesten verbreiteten Techniken zum Screenen großer Genbibliotheken, welche für eine Hochdurchsatz-Analyse zugänglich sind, schließen typischerweise Klonieren der Genbibliothek in replizierbare Expressionsvektoren ein, Transformieren geeigneter Zellen mit der resultierenden Bibliothek von Vektoren und Exprimieren der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, unter welchen die Detektion einer gewünschten Aktivität die Isolierung des Vektors erleichtert, welcher das Gen kodiert, dessen Produkt detektiert wurde. Rekursive Gesamtmutagenese (Recursive Ensembe Mutagenesis REM), eine neue Technik, welche die Häufigkeit von funktionellen Mutanten in den Bibliotheken erhöht, kann in Kombination mit den Screeningtests zum Identifizieren von STSRP-Homologen verwendet werden (Arkin und Yourvan, 1992 PNAS 89: 78117815, Delgrave et al., 1993 Proteine Engineering [Proteinkonstruktion] 6 (3): 327–331). In einer anderen Ausführungsform können zellbasierte Tests zum Analysieren einer variierten STSRP-Bibliothek ausgenutzt werden, wobei Verfahren verwendet werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind. Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zum Identifizieren eines neuen STSRPs bereit, umfassend (a) Hervorrufen einer spezifischen Antikörperantwort gegenüber einem STSRP oder einem Fragment davon wie oben beschrieben, (b) Screenen von putativen STSRP-Materialien mit dem Antikörper, wobei ein spezifisches Binden des Antikörpers zum Material die Anwesenheit eines möglicherweise neuen STSRPs anzeigt, und (c) Analysieren des gebundenen Materials im Vergleich zu bekannten STSRP zum Bestimmen seiner Neuheit.
Um die Homologie-Prozentwerte von zwei Aminosäuresequenzen (z. B. einer der Sequenzen mit SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 und SEQ ID NO: 15 und einer Mutantenform davon) zu bestimmen, werden die Sequenzen für optimale Vergleichszwecke abgeglichen (z. B. können Lücken in die Sequenz von einem Protein oder einer Nukleinsäure für einen optimalen Abgleich mit dem anderen Protein oder der anderen Nukleinsäure eingeführt werden). Die Aminosäurereste an korrespondierenden Aminosäurepositionen werden dann verglichen. Wenn eine Position in einer Sequenz (z. B. eine der Sequenzen mit SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 und SEQ ID NO: 15) durch denselben Aminosäurerest wie die korrespondierende Position in der anderen Sequenz besetzt wird (z. B. eine Mutantenform der Sequenz ausgewählt aus dem Polypeptid mit SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 und SEQ ID NO: 15), dann sind die Moleküle an dieser Position homolog (d. h. wie hierin verwendet sind Aminosäure- oder Nukleinsäure-"Homologie" mit Aminosäure- oder Nukleinsäure-"Identität" äquivalent). Derselbe Typ von Vergleich kann zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen gemacht werden.
Der Homologie-Prozentwert zwischen den beiden Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl von identischen Positionen, welche den Sequenzen gemeinsam sind (d. h. % Homologie = Anzahlen von identischen Positionen/Gesamtzahlen von Positionen × 100). Die Aminosäuresequenzen, welche in die vorliegende Erfindung eingeschlossen sind, sind zu wenigstens 80%, stärker bevorzugt wenigstens 80–90%, 90–95% und am stärksten bevorzugt wenigstens etwa 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr zu der vollständigen Aminosäuresequenz gezeigt in SEQ ID NO: 11 homolog. In noch einer anderen Ausführungsform beträgt die Homologie wenigstens 80%, stärker bevorzugt wenigstens 80–90%, 90–95% und am stärksten bevorzugt wenigstens etwa 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr zu einer vollständigen Aminosäuresequenz kodiert durch die Nukleinsäuresequenz gezeigt in SEQ ID NO: 6.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst ein isoliertes erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz, welche wenigstens 60%, vorzugsweise wenigstens etwa 60–70%, stärker bevorzugt wenigstens etwa 70–80%, 80–90% oder 90–95% und noch stärker bevorzugt wenigstens etwa 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr zu der Nukleotidsequenz gezeigt in SEQ ID NO: 6 homolog ist. Die Länge des Sequenzvergleichs für Nukleinsäuren ist die vollständige Länge der kodierenden Region.
Es ist ebenso bevorzugt, dass das homologe Nukleinsäuremolekül ein Protein oder einen Anteil davon kodiert, welcher eine Aminosäuresequenz einschließt, welche hinreichend homolog zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID NO: 11 ist, derartig, dass das Protein oder der Anteil davon dieselbe oder eine ähnliche Funktion wie die Aminosäuresequenz aufrecht hält, mit welcher es verglichen wird. Funktionen der erfindungsgemäßen STSRP-Aminosäuresequenzen schließen die Fähigkeit zur Teilnahme an einer Trockenheitsstresstoleranzantwort in einer Pflanze ein oder insbesondere zur Teilnahme an der Transkription eines Proteins, welches in eine Trockenheitsstresstoleranzantwort in einer Physcomitrella-patens-Pflanze involviert ist. Beispiele von derartigen Aktivitäten werden in Tabelle 1 beschrieben.
Neben den oben beschriebenen Verfahren kann eine Bestimmung der Homologie-Prozentwerte zwischen zwei Sequenzen ausgeführt werden, indem ein mathematischer Algorithmus verwendet wird. Ein bevorzugtes nichtbeschränkendes Beispiel eines mathematischen Algorithmus, welcher für den Vergleich von zwei Sequenzen verwendet wird, ist der Algorithmus von Karlin und Altschul (1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873–5877). Ein derartiger Algorithmus ist in die NBLAST- und XBLAST-Programme von Altschul et al. (1990 J. Mol. Biol. 215: 403–410) eingeschlossen.
BLAST-Nukleinsäuresuchen können mit dem NBLAST-Programm, Score=100, Wortlänge=12, durchgeführt werden, um Nukleinsäuresequenzen homolog zu den erfindungsgemäßen STSRP-Nukleinsäuremolekülen zu erhalten.
Zusätzlich kann eine BLAST-Proteinsuche mit dem XBLAST-Programm, Score=50, Wortlänge=3 durchgeführt werden, um Aminosäuresequenzen homolog zu erfindungsgemäßen STSRPs zu erhalten. Um Abgleiche mit Lücken für Vergleichszwecke zu erhalten, kann Gapped-BLAST wie in Altschul et al. (1997 Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402) beschrieben verwendet werden. Wenn BLAST und Gapped-BLAST-Programme verwendet werden, können die Voreinstellungsparameter der jeweiligen Programme (z. B. XBLAST und NBLAST) verwendet werden. Ein anderes bevorzugtes nichtbeschränkendes Beispiel eines mathematischen Algorithmus, welcher für den Vergleich von Sequenzen verwendet wird, ist der Algorithmus von Myers und Miller (CABIOS 1989). Ein derartiger Algorithmus ist in das ALIGN-Programm (Version 2.0) eingeschlossen, das Teil des GCG-Sequenzabgleichs-Softwarepackets ist. Wenn das ALIGN-Programm zum Vergleich von Aminosäuresequenzen verwendet wird, kann eine PAM120-Tabelle für die Gewichtung der Reste, eine Strafe für die Lückenlänge (gap length penalty) von 12 und eine Strafe für Lücken (gap penalty) von 4 verwendet werden, um Aminosäuresequenzen homolog zu den erfindungsgemäßen STSRPs zu erhalten. Um Abgleiche mit Lücken für Vergleichszwecke zu erhalten, kann Gapped-BLAST wie in Altschul et al. (1997 Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402) beschrieben verwendet werden. Wenn BLAST- und Gapped-BLAST-Programme verwendet werden, können die Voreinstellungsparameter der jeweiligen Programme (z. B. XBLAST und NBLAST) verwendet werden. Ein anderes bevorzugtes nichtbeschränkendes Beispiel eines mathematischen Algorithmus, welcher für den Vergleich von Sequenzen verwendet wird, ist der Algorithmus von Myers und Miller (CABIOS 1989). Ein derartiger Algorithmus ist in das ALIGN-Programm (Version 2.0) eingeschlossen, das Teil des GCG-Sequenzabgleichs-Softwarepackets ist. Wenn das ALIGN-Programm zum Vergleich von Aminosäuresequenzen verwendet wird, kann eine PAM120-Tabelle für die Gewichtung der Reste, eine Strafe für die Lückenlänge (gap length penalty) von 12 und eine Strafe für Lücken (gap penalty) von 4 verwendet werden.
Schließlich kann ebenso Homologie zwischen Nukleinsäuresequenzen bestimmt werden, indem Hybridisierungstechniken verwendet werden, die den Fachleuten bekannt sind. Folglich umfasst ein isoliertes Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz, welche mit der Nukleotidsequenzen gezeigt in SEQ ID NO: 6 oder einem Anteil davon hybridisiert, z. B. unter stringenten Bedingungen. Insbesondere hat ein isoliertes Nukleinsäuremolekül die Länge von wenigstens 15 Nukleotiden und hybridisiert unter stringenten Bedingungen mit dem Nukleinsäuremolekül umfassend eine Nukleotidsequenz mit SEQ ID NO: 6. In anderen Ausführungsformen hat die Nukleinsäure die Länge von wenigstens 30, 50, 100, 250 oder mehr Nukleotiden.
Wie hierin verwendet, ist beabsichtigt, dass der Begriff "hybridisiert unter stringenten Bedingungen" Bedingungen für eine Hybridisierung und Waschen beschreibt, unter welchen Nukleotidsequenzen, welche wenigstens 60% homolog zu einander sind, typischerweise miteinander hybridisiert bleiben. Vorzugsweise sind die Bedingungen derartig, dass Sequenzen, welche wenigstens etwa 65%, stärker bevorzugt wenigstens etwa 70% und noch stärker bevorzugt wenigstens etwa 75% oder mehr homolog zu einander sind, typischerweise miteinander hybridisiert bleiben. Derartige stringente Bedingungen sind den Fachleuten bekannt und können in Current Protocols in Molecular Biology (Aktuelle Protokolle der Molekularbiologie], 6.3.1–6.3.6, John Wiley & Sons, N. Y. (1989) gefunden werden. Ein bevorzugtes nichtbeschränkendes Beispiel von stringenten Hybridisierungsbedingungen ist Hybridisierung in 6 × Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC) bei etwa 45°C, gefolgt von einer oder mehreren Waschungen in 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 50–65°C. Vorzugsweise entspricht ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das unter stringenten Bedingungen mit der Sequenz mit SEQ ID NO: 6 hybridisiert, einem natürlicherweise auftretenden Nukleinsäuremolekül. Wie hierin verwendet bezieht sich ein "natürlicherweise auftretendes" Nukleinsäuremolekül auf ein RNA- oder DNA-Molekül mit einer Nukleotidsequenz, welches in der Natur auftritt (kodiert z. B. ein natürliches Protein). In einer Ausführungsform kodiert die Nukleinsäure ein natürlicherweise auftretendes Physcomitrella-patens-STSRP.
Wenn die oben beschriebenen und andere den Fachleuten bekannte Verfahren verwendet werden, kann ein Fachmann Homologe des STSRP umfassend Aminosäuresequenzen gezeigt in SEQ ID NO: 11 isolieren. Eine Teilmenge von diesen Homologen sind allelische Varianten. Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff "allelische Variante" auf eine Nukleotidsequenz enthaltend Polymorphismen, welche zu Veränderungen in den Aminosäuresequenzen eines STSRP führen und welche innerhalb einer natürlichen Population existieren (z. B. einer Pflanzenspezies oder Varietät). Derartige natürliche allelische Variationen können typischerweise zu 1–5% Varianz in einer STSRP-Nukleinsäure führen. Allelische Varianten können durch Sequenzieren der interessierenden Nukleinsäuresequenz in einer Anzahl von verschiedenen Pflanzen identifiziert werden, was leicht durch Verwenden von Hybridisierungssonden zum Identifizieren desselben STSRP-Genlocus in diesen Pflanzen ausgeführt werden kann. Es ist beabsichtigt, dass beliebige derartige Nukleinsäurevariationen und resultierende Aminosäure-Polymorphismen oder Variationen in einem STSRP, welche das Ergebniss von einer natürlichen allelischen Variation sind und welche die funktionelle Aktivität eines STSRP nicht verändern, innerhalb des erfindungsgemäßen Umfangs liegen.
Überdies werden Nukleinsäuremoleküle kodierend STSRPs von derselben oder einer anderen Spezies wie zum Beispiel STSRP-Analoga, Orthologe und Paraloge vorgesehen. Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff "Analoga" auf zwei Nukleinsäuren, welche dieselbe oder eine ähnliche Funktion haben, aber welche sich getrennt in nicht verwandten Organismen entwickelt haben. Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff "Orthologe" auf zwei Nukleinsäuren von verschiedenen Spezies, aber welche sich aus einem gemeinsamen Vorläufer-Gen durch Spezialisierung entwickelt haben. Normalerweise kodieren Orthologe solche Proteine, welche dieselben oder ähnliche Funktionen haben. Wie hierin ebenso verwendet bezieht sich der Begriff "Paraloge" auf zwei Nukleinsäuren, welche durch Duplikation innerhalb eines Genoms verwandt sind. Paraloge haben normalerweise verschiedene Funktionen, aber diese Funktionen können verwandt sein (Tatusov, R. L. et al. 1997 Science 278 (5338): 631–637). Analoga, Orthologe und Paraloge eines natürlicherweise auftretenden STSRP können sich vom natürlicherweise auftretendenen STSRP durch post-translationale Modifikationen, durch Aminosäuresequenzunterschiede oder durch beides unterscheiden. Posttranslationale Modifikationen schließen chemische Derivatisierung von Polypeptiden in vivo und in vitro ein, z. B. können Acetylierung, Carboxylierung, Phosphorylierung oder Glykosylierung und derartige Modifikationen während der Polypeptidsynthese oder dem Verarbeiten oder der nachfolgenden Behandlung mit isolierten modifizierenden Enzymen auftreten. Insbesondere zeigen Orthologe generell wenigstens 80–85%, stärker bevorzugt 90% und am stärksten bevorzugt 95%, 96%, 97%, 98% oder sogar 99% Identität oder Homologie mit dem gesamten oder einem Teil einer natürlicherweise auftretenden STSRP-Aminosäuresequenz und zeigt eine Funktion ähnlich zu derjenigen eines STSRP. Orthologe sind ebenso vorzugsweise zur Teilnahme an der Stressantwort in Pflanzen fähig. In einer Ausführungsform behalten die STSRP-Orthologe die Fähigkeit zur Teilnahme am Metabolismus von Verbindungen, welche für die Konstruktion von zellulären Membranen in Physcomitrella patens oder beim Transport von Molekülen über diese Membranen notwendig sind.
Neben natürlich auftretenden Varianten von einer STSRP-Sequenz, welche in der Population vorhanden sein können, wird der Fachmann weiter berücksichtigen, dass Veränderungen durch Mutation in die Nukleotidsequenz mit SEQ ID NO: 6 eingeführt werden können, was hierdurch zu Veränderungen in der Aminosäuresequenz des kodierten STSRPs führt, ohne die funktionellen Fähigkeiten vom STSRP zu verändern. Zum Beispiel können Nukleotidsubstitutionen, welche zu Aminosäuresubstitutionen bei "nichtessentiellen" Aminosäureresten führen, in der Sequenz mit SEQ ID NO: 6 gemacht werden. Ein "nichtessentieller" Aminosäurerest ist ein Rest, welcher in der Wildtyp-Sequenz von einem der STSRPs ohne Verändern der Aktivität vom STSRP verändert werden kann, während ein "essentieller" Aminosäurerest für eine STSRP-Aktivität benötigt wird. Andere Aminosäurereste jedoch (z. B. diejenigen, welche in der Domäne, welche STSRP-Aktivität hat, nicht konserviert oder nur halbkonserviert sind) brauchen nicht für eine Aktivität essentiell sein und können daher wahrscheinlich verändert werden, ohne die STSRP-Aktivität zu verändern.
Folglich betrifft ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt Nukleinsäuremoleküle kodierend STSRPs, welche Veränderungen in Aminosäureresten enthalten, welche nicht essentiell für eine STSRP-Aktivität sind. Derartige STSRPs unterscheiden sich in der Aminosäuresequenz von einer Sequenz enthalten in SEQ ID NO: 11, aber behalten wenigstens eine von den hierin beschriebenen STSRP-Aktivitäten. In einer Ausführungsform umfasst das isolierte Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz kodierend ein Protein, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz umfasst, welche wenigstens etwa 80% homolog zu der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 11 ist. Vorzugsweise ist das Protein, welches durch das Nukleinsäuremolekül kodiert ist, wenigstens etwa 80% homolog zu der Sequenz mit SEQ ID NO: 11, noch stärker bevorzugt wenigstens etwa 80%, 80–90%, 90–95% homolog zu der Sequenz mit SEQ ID NO: 11 und am stärksten bevorzugt wenigstens etwa 96%, 97%, 98% oder 99% homolog zu der Sequenz SEQ ID NO: 11. Die bevorzugten erfindungsgemäßen STSRP-Homologe sind vorzugsweise zur Teilnahme an der Trockenheitsstresstoleranzantwort in einer Pflanze oder insbesondere zur Teilnahme an der Expression von einem Protein fähig, welches an einer Trockenheitsstresstoleranzantwort in einer Physcomitrella-patens-Pflanze beteiligt ist oder ein oder mehrere Aktivitäten hat, welche in Tabelle 1 angegeben sind.
Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül kodierend ein STSRP, welches zu der Proteinsequenz mit SEQ ID NO: 11 homolog ist, kann durch Einführen einer oder mehrerer Nukleotidsubstitutionen, Hinzufügungen oder Deletionen in die Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 6 geschaffen werden, derartig, dass eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, Hinzufügungen oder Deletionen in das kodierte Protein eingeführt werden. Mutationen können in die Sequenz SEQ ID NO: 6 durch Standardtechniken eingeführt werden, wie zum Beispiel ortsgerichtete Mutagenese und PCR-vermittelte Mutagenese. Vorzugsweise werden konservative Aminosäuresubstitutionen bei einer oder mehreren vorhergesagten nichtessentiellen Aminosäureresten gemacht. Eine "konservative Aminosäuresubstitution" ist eine Aminosäure, in welcher der Aminosäurerest mit einem Aminosäurerest ersetzt wird, welcher eine ähnliche Seitenkette hat.
Familien von Aminosäureresten, welche ähnliche Seitenketten haben, wurden im Stand der Technik definiert. Diese Familien schließen Aminosäuren mit basischen Seitenketten (z. B. Lysin, Arginin, Histidin), sauren Seitenketten (z. B. Asparaginsäure, Glutaminsäure), ungeladenen polaren Seitenketten (z. B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein), nichtpolaren Seitenketten (z. B. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan), beta-verzweigten Seitenketten (z. B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatischen Seitenketten (z. B. Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin) ein. Daher wird ein vorhergesagter nichtessentieller Aminosäurerest in einem STSRP vorzugsweise mit einem anderen Aminosäurerest von derselben Seitenkettenfamilie ersetzt. Alternativ können in einer anderen Ausführungsform Mutationen zufällig entlang aller oder eines Teils von einer STSRP-kodierenden Sequenz eingeführt werden, wie zum Beispiel durch Sättigungsmutagenese, und die resultierenden Mutanten können nach einer hierin beschrieben STSRP-Aktivität gescreent werden, um Mutanten zu identifizieren, welche eine STSRP-Aktivität behalten. Nach Mutagenese von der Sequenz SEQ ID NO: 6 kann das kodierte Protein rekombinant exprimiert werden, und die Aktivität vom Protein kann durch Analysieren der Stresstoleranz von einer Pflanze bestimmt werden, welche das Protein wie in Beispiel 7 beschrieben exprimiert.
Neben den Nukleinsäuremolekülen, welche die oben beschriebenen STSRPs kodieren, betrifft ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt isolierte Nukleinsäuremoleküle, welche eine Antisense-Orientierung dazu aufweisen. Eine "Antisense"-Nukleinsäure umfasst eine Nukleotidsequenz, welche komplementär zu einer "Sense"-Nukleinsäure ist, welche ein Protein kodiert, z. B. komplementär zum kodierenden Strang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls oder komplementär zu einer mRNA-Sequenz ist. Folglich kann eine Antisense-Nukleinsäure zu einer Sense-Nukleinsäure über eine Wasserstoffbrückenbindung gebunden sein. Die Antisense-Nukleinsäure kann zu einem vollständigen STSRP-kodierenden Strang oder nur zu einem Anteil davon komplementär sein. In einer Ausführungsform ist ein Antisense-Nukleinsäuremolekül in Antisense-Orientierung zu einer "kodierenden Region" des kodierenden Strangs von einer Nukleotidsequenz, welche ein STSRP kodiert. Der Begriff "kodierende Region" bezieht sich auf die Region von der Nukleotidsequenz umfassend Codons, welche in Aminosäurereste translatiert werden (z. B. der vollständigen kodierenden Region von " ", umfassend Nukleotide 1 bis...). In einer anderen Ausführungsform ist das Antisense-Nukleinsäuremolekül in Antisense-Orientierung zu einer "nichtkodierenden Region" des kodierenden Strangs von einer Nukleotidsequenz, welche ein STSRP kodiert. Der Begriff "nichtkodierende Region" bezieht sich auf 5'- und 3'-Sequenzen, welche die kodierende Region flankieren und welche nicht in Aminosäuren translatiert werden (d. h. worauf ebenso als 5'- und 3'-nichttranslatierte Regionen bezuggenommen wird).
Eine bevorzugte Ausführungsform umfasst ein Nukleinsäuremolekül, welches ein Komplement von der Nukleotidsequenz gezeigt in SEQ ID NO: 6 oder ein Anteil davon ist. Ein Nukleinsäuremolekül, welches komplementär zu der Nukleotidsequenz gezeigt in SEQ ID NO: 6 ist, ist eines, welches hinreichend komplementär zu der Nukleotidsequenz gezeigt in SEQ ID NO: 6 ist, derartig, dass es mit der Nukleotidsequenz gezeigt in SEQ ID NO: 6 hybridisieren kann, wodurch eine stabile Duplex gebildet wird.
Wenn die Sequenzen des kodierenden Strangs kodierend die hierin offenbarten STSRPs (z. B. die Sequenz angeben in SEQ ID NO: 6) gegeben sind, können Antisense-Nukleinsäuren gemäß den Regeln der Watson-und-Crick-Basenpaarung konstruiert werden. Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann zur vollständigen kodierenden Region von STSRP-mRNA komplementär sein, ist aber stärker bevorzugt ein Oligonukleotid, welches nur zu einem Anteil der kodierenden oder nichtkodierenden Region von STSRP-mRNA in Antisense-Orientierung vorliegt. Zum Beispiel kann das Antisense-Oligonukleotid zur Region komplementär sein, welche die Translationsstartstelle von STSRP-mRNA umgibt. Ein Antisense-Oligonukleotid kann zum Beispiel eine Länge von etwa 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Nukleotiden haben.
Eine Antisense-Nukleinsäure kann konstruiert werden, indem chemische Synthesereaktionen und enzymatische Ligationsreaktionen verwendet werden, wobei Verfahren verwendet werden, die im Stand der Technik bekannt sind. Zum Beispiel kann eine Antisense-Nukleinsäure (z. B. ein Antisense-Oligonukleotid) chemisch synthetisiert werden, wobei natürlicherweise auftretende Nukleotide oder verschiedene modifizierte Nukleotide verwendet werden, welche konstruiert werden, um die biologische Stabilität der Moleküle zu erhöhen oder um die physikalische Stabilität von der Duplex zu erhöhen, welche zwischen den Antisense- und Sense-Nukleinsäuren gebildet wird, z. B. können Phosophorthioatderivate und Acridinsubstituierte Nukleotide verwendet werden. Beispiele von modifizierten Nukleotiden, welche zum Erzeugen der Antisense-Nukleinsäure verwendet werden können, schließen 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxymethyl)-uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, beta-D-galactosylqueosin, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, beta-D-Mannosylqueosin, 5'-Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-Isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure (v), Wybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure (v), 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)-uracil, (acp3)w und 2,6-Diaminopurin ein. Alternativ kann die Antisense-Nukleinsäure biologisch hergestellt werden, wobei ein Expressionsvektor verwendet wird, in welchen eine Nukleinsäure in einer Antisense-Orientierung subkloniert wurde (d. h. RNA, welche von der inserierten Nukleinsäure transkribiert wird, hat eine Antisense-Orientierung zu einer interessierenden Ziel-Nukleinsäure, wie weiter in der folgenden Unterabteilung beschrieben ist).
Die Antisense-Nukleinsäuremoleküle werden typischerweise an eine Zelle verabreicht oder in situ derartig erzeugt, dass sie mit zellulärer mRNA und/oder genomischer DNA hybridisieren oder an zelluläre mRNA und/oder genomische DNA binden, welche ein STSRP kodieren, um hierdurch eine Expression vom Protein zu inhibieren, z. B. durch Inhibieren der Transkription und/oder Translation. Die Hybridisierung kann durch konventionelle Nukleotid-Komplementarität stattfinden, um eine stabile Duplex zu bilden, oder zum Beispiel im Falle eines Antisense- Nukleinsäuremoleküls, welches an DNA-Duplexe bindet, durch spezifische Interaktionen in der Hauptfurche der Doppelthelix. Das Antisense-Molekül kann derartig modifiziert sein, dass es spezifisch an einen Rezeptor bindet oder an ein Antigen, welches auf einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiert wird, z. B. durch Binden des Antisense-Nukleinsäuremoleküls an ein Peptid oder einen Antikörper, welcher an einen Zelleoberflächenrezeptor oder ein Antigen bindet. Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann ebenso an Zellen verabreicht werden, wobei die hierin beschriebenen Vektoren verwendet werden. Zum Erzielen von hinreichenden intrazellulären Konzentrationen der Antisense-Moleküle werden Vektorkonstrukte bevorzugt, in welchen das Antisense-Nukleinsäuremolekül unter die Kontrolle eines starken prokaryotischen, viralen oder eukaryotischen (einschließlich Pflanzen) Promotor gebracht wird.
In noch einer anderen Ausführungsform ist das Antisense-Nukleinsäuremolekül ein α-anomeres Nukleinsäuremolekül. EIn α-anomeres Nukleinsäuremolekül bildet spezifische doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, in welcher die Stränge entgegengesetzt zu den gewöhnlichen β-Einheiten zu allen anderen parallel laufen (Gaultier et al., 1987 Nucleic Acids. Res. 15: 6625–6641). Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann ebenso ein 2'-o-Methylribonukleotid (Inoue et al., 1987 Nucleic Acids Res. 15: 6131–6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analogon (Inoue et al., 1987 FEBS Lett. 215: 327–330) umfassen.
In noch einer anderen Ausführungsform ist eine erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäure ein Ribozym. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonukleaseaktivität, welche zum Spalten einer einzelsträngigen Nukleinsäure wie zum Beispiel einer mRNA fähig sind, zu welcher sie eine komplementäre Region haben. Daher können Ribozyme (z. B. Hammerhead-Ribozyme beschrieben in Haselhoff und Gerlach, 1988 Nature 334: 585–591) verwendet werden, um STSRP-mRNA-Transkripte katalytisch zu spalten, um hierdurch eine Translation von STSRP-mRNA zu inhibieren. Ein Ribozym, welches eine Spezifität für eine STSRP-codierende Nukleinsäure hat, kann basierend auf der Nukleotidsequenz von der STSRP-cDNA offenbart in SEQ ID NO: 6 konstruiert werden oder auf Basis einer heterologen Sequenz, welche gemäß Verfahren isoliert werden soll, welche in dieser Erfindung gelehrt werden. Zum Beispiel kann ein Derivat einer Tetrahymena-L-19-IVS-RNA konstruiert werden, in welchem die Nukleotidsequenz von der aktiven Stelle komplementär zur Nukleotidsequenz ist, welche in einer STSRP-kodierenden mRNA gespalten werden soll. Siehe z. B. Cech et al. US-Patent Nr. 4,987,071 und Cech et al. US-Patent Nr. 5,116,742. Alternativ kann STSRP-mRNA zum Selektieren einer katalytischen RNA, welche eine spezifische Ribonukleaseaktivität hat, aus einem Pool von RNA-Molekülen verwendet werden. Siehe z. B. Bartel, D. und Szostak, J. W., 1993 Science 261: 1411–1418.
Alternativ kann eine STSRP-Genexpression durch zielende Nukleotidsequenzen inhibiert werden, welche zur regulatorischen Region von einer STSRP-Nukleotidsequenz (z. B. einem STSRP-Promotor und/oder -Enhancer) komplementär sind, um tripelhelikale Strukturen zu bilden, welche eine Transkription von einem STSRP-Gen in Zielzellen verhindern. Siehe generell Helene, C., 1991 Anticancer Drug Des. 6 (6): 569–84, Helene, C. et al., 1992 Ann. N. Y. Acad. Sci. 660: 27–36, und Maher, L. J., 1992 Bioassays 14 (12): 807–15.
Neben den STSRP-Nukleinsäuren und oben beschriebenen Proteinen umfasst die vorliegende Erfindung diese Nukleinsäuren und Proteine an eine Gruppe gebunden. Diese Gruppen schließen Detektionsgruppen, Hybridisierungsgruppen, Reinigungsgruppen, Verabreichungsgruppen, Reaktionsgruppen, bindende Gruppen und das entsprechende ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Eine typische Gruppe von Nukleinsäuren, welche an eine Gruppe gebunden sind, schließt Sonden und Primer ein. Die Sonden und Primer umfassen eine Region einer Nukleotidsequenz, welche unter stringenten Bedingungen mit wenigstens etwa 12, vorzugsweise etwa 25, stärker bevorzugt etwa 40, 50 oder 75 aufeinanderfolgenden Nukleotiden von einem Sense-Strang der Sequenz angegeben in SEQ ID NO: 6, einer Antisense-Sequenz der Sequenz angegeben in SEQ ID NO: 6 oder natürlicherweise auftretenden Mutanten davon hybridisiert. Primer basierend auf der Nukleotidsequenz mit SEQ ID NO: 6 können in PCR-Reaktionen verwendet werden, um STSRP-Homologe zu klonieren. Sonden basierend auf den STSRP- Nukleotidsequenzen können zum Detektieren von Transkripten oder genomischen Sequenzen verwendet werden, welche dieselben oder homologe Proteine kodieren. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Sonde weiterhin eine daran gebundene Markierungsgruppe, z. B. kann die Markierungsgruppe ein Radioisotop, eine fluoreszierende Verbindung, ein Enzym oder ein Enzymkofaktor sein. Derartige Sonden können als ein Teil von einem genomischen Markertestkit zum Identifizieren von Zellen verwendet werden, welche ein STSRP exprimieren, wie zum Beispiel durch Messen eines Spiegels einer STSRP-kodierenden Nukleinsäure in einer Probe von Zellen, z. B. Detektieren eines STSRP-mRNA-Spiegels oder Bestimmen, ob ein genomischen STSRP-Gens mutiert oder deletiert wurde.
Insbesondere ist ein geeignetes Verfahren zum Ermitteln des Transkriptionsspiegels des Gens (ein Indikator der mRNA-Menge, welche für eine Translation zum Genprodukt verfügbar ist) die Durchführung eines Northernblots (als Zitat siehe zum Beispiel Ausubel et al., 1988 Current Protocols in Molecular Biology [Aktuelle Protokolle der Molekularbiologie], Wiley: New York). Diese Information demonstriert wenigstens teilweise den Grad der Transkription des transformierten Gens. Zelluläre Gesamt-RNA kann aus Zellen, Geweben oder Organen durch mehrere Verfahren hergestellt werden, welche alle im Stand der Technik wohlbekannt sind, wie zum Beispiel dasjenige, welches in Bormann, E. R. et al., 1992 Mol. Microbiol. 6: 317–326 beschrieben ist. Zum Beurteilen der Anwesenheit oder relativen Menge von Protein, welches von dieser mRNA translatiert wird, können Standardtechniken wie zum Beispiel ein Westernblot verwendet werden. Diese Techniken sind einem Fachmann gut bekannt. (Siehe zum Beispiel Ausubel et al., 1988 Current Protocols in Molecular Biology [Aktuelle Protokolle der Molekularbiologie], Wiley: New York).
Die Erfindung stellt weiterhin einen isolierten rekombinanten Expressionsvektor bereit, welcher eine STSRP-Nukleinsäure wie oben beschrieben umfasst, wobei Expression vom Vektor in einer Wirtszelle zu einer erhöhten Toleranz gegenüber Trockenheitsstress verglichen mit einer Wildtypvarietät der Wirtszelle führt. Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff "Vektor" auf ein Nukleinsäuremolekül, welches eine andere Nukleinsäure transportieren kann, mit welcher es verbunden wurde. Ein Vektortyp ist ein "Plasmid", welches sich auf eine zirkuläre doppelsträngige DNA-Schleife bezieht, in welche zusätzliche DNA-Segmente ligiert sein können. Ein anderer Vektortyp ist ein viraler Vektor, wobei zusätzliche DNA-Segmente in das virale Genom ligiert sein können. Bestimmte Vektoren sind zu einer autonomen Replikation in einer Wirtszelle fähig, in welche sie eingeführt werden (z. B. bakterielle Vektoren, welche einen bakteriellen Replikationsursprung haben, und episomale Säugetiervektoren). Andere Vektoren (z. B. nichtepisomale Säugetiervektoren) werden in das Genom von einer Wirtszelle nach Einführung in die Wirtszelle integriert und werden hierdurch zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert. Überdies sind bestimmte Vektoren dazu fähig, die Expression von Genen zu steuern, mit welchen sie operativ verbunden sind. Auf derartige Vektoren wird hierin als "Expressionsvektoren" bezuggenommen. Im Allgemeinen liegen Expressionsvektoren, welche in rekombinanten DNA-Techniken verwendbar sind, oft in Form von Plasmiden vor. In der vorliegenden Beschreibung können "Plasmid" und "Vektor" austauschbar verwendet werden, da das Plasmid die am weitverbreitetsten verwendete Form von Vektoren ist. Die Erfindung beabsichtigt jedoch, dass derartige andere Formen von Expressionsvektoren eingeschlossen sind, wie zum Beispiel virale Vektoren (z. B. replikationsdefiziente Retroviren, Adenoviren und adeno-assoziierte Viren), welche äquivalenten Funktionen dienen.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren umfassen eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in einer Form, welche für eine Expression der Nukleinsäure in einer Wirtszelle geeignet ist, was bedeutet, dass die rekombinanten Expressionsvektoren ein oder mehrere regulatorische Sequenzen ausgewählt auf Basis der Wirtszellen einschließen, welche für eine Expression verwendet werden sollen, wobei die Sequenz operativ mit der Nukleinsäuresequenz, welche exprimiert werden soll, verbunden wird. Es ist beabsichtigt, dass "operativ verbunden" innerhalb eines rekombinanten Expressionsvektors bedeutet, dass die interessierende Nukleotidsequenz zur regulatorischen Sequenz (zu den regulatorischen Sequenzen) in einer Weise verbunden wird, welche eine Expression von der Nukleotidsequenz ermöglicht (z. B. in ein in-vitro-Transkriptions-/Translationsystem oder in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in die Wirtszelle eingeführt wird). Es ist beabsichtigt, dass der Begriff "regulatorische Sequenz" Promotoren, Enhancer und andere Expressionskontrollelemente (z. B. Polyadenylierungssignale) einschließt. Derartige regulatorische Sequenzen werden zum Beispiel in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology [Genexpressionstechnologie: Verfahren der Enzymologie] 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), beschrieben, oder siehe: Gruber und Crosby, in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology [Verfahren der Molekularbiologie und Biotechnologie der Pflanzen], Hrsg. Glick und Thompson, Kapitel 7, 89–108, CRC Press: Boca Raton, Florida, einschließlich der darin enthaltenen Referenzen. Regulatorische Sequenzen schließen diejenigen ein, welche eine konstitutive Expression von einer Nukleotidsequenz in vielen Typen von Wirtszellen steuern und diejenigen, welche die Expression von der Nukleotidsequenz nur in bestimmten Wirtszellen oder unter bestimmten Bedingungen steuern. Fachleute werden berücksichtigen, dass die Konstruktion vom Expressionsvektor von solchen Faktoren wie der Wahl von der Wirtszelle, welche transformiert werden soll, dem gewünschten Expressionsspiegel des Proteins etc. abhängt. Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren können in Wirtszellen eingeführt werden, um hierdurch Proteine oder Peptide einschließend Fusionsproteine oder Peptide kodiert durch Nukleinsäuren wie hierin beschrieben (z. B. STSRPs, Mutantenformen von STSRPs, Fusionsproteine etc.) herzustellen.
Die rekombinanten erfindungsgemäßen Expressionsvektoren können für eine Expression von STSRPs in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen konstruiert werden. Zum Beispiel können STSRP-Gene in bakteriellen Zellen exprimiert werden, wie zum Beispiel C. glutamicum, Insektenzellen (wobei Baculovirus-Expressionsvektoren verwendet werden), Hefe und anderen Pilzzellen (siehe Romanos, M. A. et al., 1992 Foreign gene expression in yeast: a review [Fremdgenexpression in Hefe: eine Übersichtsarbeit], Yeast 8: 423–488, van den Hondel, C. A. M. J. J. et al., 1991 Heterologous gene expression in filamentous fungi, in: More Gene Manipulations in Fungi [Heterologe Genexpression in filamentösen Pilzen, in: Mehr Genmanipulationen in Pilzen], J. W. Bennet & L. L. Lasure, Hrsg., S. 396–428: Academic Press: San Diego, und van den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt, P. J., 1991 Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi [Gentransfersysteme und Vektorentwicklung für filamentöse Pilze, in: Angewandte Molekulargenetik von Pilzen], Peberdy, J. F. et al., Hrsg., S. 1–28, Cambridge University Press: Cambridge), Algen (Falciatore et al., 1999 Marine Biotechnology [Marine Biotechnologie] 1 (3): 239–251), Ciliaten der Typen: Holotrichia, Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria, Tetrahymena, Paramecium, Colpidium, Glaucoma, Platyophrya, Potomacus, Pseudocohnilembus, Euplotes, Engelmaniella und Stylonychia, insbesondere der Gattung Stylonychia lemnae, mit Vektoren, wobei einem Transformationsverfahren wie beschrieben in WO 98/01572 gefolgt wird, und multizellulären Pflanzenzellen (siehe Schmidt, R. und Willmitzer, L., 1988 High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants [Hocheffiziente Agrobacterium-tumefaciens-vermittelte Transformation von Blatt- und Kotyledonenexplantaten von Arabidopsis thaliana], Plant Cell Rep. 583–586), Plant Molecular Biology and Biotechnology [Molekularbiologie und Biotechnologie der Pflanze], C Press, Boca Raton, Florida, Kapitel 6/7, S. 71–119 (1993), F. F. White, B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants [Techniken für Gentransfer, in: Transgene Pflanzen], Band 1, Engineering and Utilization [Konstruktion und Verwendung], Hrsg. Kung und R. Wu, 128–43, Academic Press: 1993, Potrykus, 1991 Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42: 205–225 und darin zitierte Referenzen) oder Säugerzellen. Geeignete Wirtszellen werden weiter in Goeddel, Gene Expression Technology : Methods in Enzymology [Genexpressionstechnologie Verfahren der Enzymology] 185, Academic Press: San Diego, CA (1990) diskutiert. Alternativ kann der rekombinante Expressionsvektor in vitro transkribiert und translatiert werden, wobei zum Beispiel regulatorische T7-Promotorsequenzen und T7-Polymerase verwendet werden.
Eine Expression von Proteinen in Prokaryoten wird am häufigsten mit Vektoren ausgeführt, welche konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten, welche die Expression entweder von Fusions- oder Nichtfusions-Proteinen steuern. Fusionsvektoren fügen eine Anzahl von Aminosäuren zu einem davon kodierten Protein hinzu, normalerweise zum Aminoterminus vom rekombinanten Protein, aber ebenso zum C-Terminus oder fusioniert innerhalb geeigneter Regionen in den Proteinen. Derartige Fusionsvektoren dienen typischerweise drei Zwecken: 1) zum Erhöhen der Expression von einem rekombinanten Protein, 2) zum Erhöhen der Löslichkeit von einem rekombinanten Protein, und 3) zur Hilfe bei der Reinigung von einem rekombinanten Protein durch Wirkung als Ligand in einer Affinitätsreinigung. Oft wird in Fusionsexpressionsvektoren eine proteolytische Spaltstelle bei der Verbindung von der Fusionsgruppe und dem rekombinanten Protein eingeführt, um eine Trennung vom rekombinanten Protein von der Fusionsgruppe nach der Reinigung vom Fusionsprotein zu ermöglichen. Derartige Enzyme und ihre verwandten Erkennungssequenzen schließen Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase ein.
Typische Fusionsexpressionsvektoren schließen pGEX (Pharmacia Biotech Inc, Smith, D. B. und Johnson, K. S., 1988 Gene 67: 31–40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) ein, welche Glutathion-S-transferase (GST), Maltose-E-Bindeprotein beziehungsweise Protein A mit dem rekombinanten Zielprotein fusionieren. In einer Ausführungsform wird die kodierende Sequenz vom STSRP in einen pGEX-Expressionsvektor kloniert, um einen Vektor kodierend ein Fusionsprotein zu schaffen, welches vom N-Terminus zum C-Terminus GST, Thrombin-Spaltstelle, X-Protein umfasst. Das Fusionsprotein kann durch Affinitätschromatographie gereinigt werden, wobei Glutathion-Agaroseharz verwendet wird. Rekombinantes STSRP, welches mit GST unfusioniert ist, kann durch Spaltung vom Fusionsprotein mit Thrombin gewonnen werden.
Beispiele von geeigneten induzierbaren Nichtfusions-E.-coli-Expressionsvektoren schließen pTrc (Amann et al., 1988 Gene 69: 301–315) und pET-11 d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology [Genexpressionstechnologie: Verfahren der Enzymology] 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 6089) ein. Eine Zielgen-Expression vom pTrc Vektor basiert auf der Wirts-RNA-Polymerasetranskription von einem hybriden trp-lac Fusionspromotor. Eine Zielgen-Expression vom pET-11d-Vektor basiert auf der Transkription von einem T7-gn10-lac-Fusionspromotor vermittelt durch eine koexprimierte virale RNA-Polymerase (T7 gn1). Diese virale Polymerase wird durch die Wirtsstämme BL21 (DE3) oder HMS174 (DE3) von einem residenten λ-Prophagen bereitgestellt, welcher ein T7-gn1-Gen unter der transkriptionellen Kontrolle des lacUV-5-Promotors enthält.
Eine Strategie zum Maximieren der rekombinanten Proteinexpression ist die Expression des Proteins in Wirtsbakterien mit einer beeinträchtigten Kapazität zur proteolytischen Spaltung das rekombinante Protein (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology [Genexpressionstechnologie: Verfahren der Enzymology] 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119–128). Eine andere Strategie ist die Veränderung der Sequenz von der Nukleinsäure, welche in einen Expressionsvektor inseriert werden soll, so dass die einzelnen Codons für jede Aminosäure diejenigen sind, welche vorzugsweise im Bakterium verwendet werden, welches für die Expression gewählt wird, wie zum Beispiel C. glutamicum (Wada et al., 1992 Nucleic Acids Res. 20: 2111–2118). Eine derartige Veränderung von erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen kann durch Standard-DNA-Synthesetechniken ausgeführt werden.
In einer anderen Ausführungsform ist der STSRP-Expressionsvektor ein Hefe-Expressionsvektor. Beispiele von Vektoren für eine Expression in Hefe S. cerevisiae schließen pYepSec1 (Baldari et al., 1987 EMBO J. 6: 229–234), pMFa (Kurjan und Herskowitz, 1982 Cell 30: 933–943), pJRY88 (Schultz et al., 1987 Gene 54: 113–123) und pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) ein. Vektoren und Verfahren zur Konstruktion von Vektoren, welche zur Verwendung in anderen Pilzen geeignet sind, wie zum Beispiel den filamentösen Pilzen, schließen diejenigen ein, welche in: van den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt, P. J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi", in: Applied Molecular Genetics of Fungi ["Gentransfersysteme und Vektorentwicklung für filamentöse Pilze", in: Angewandte Molekulargenetik von Pilzen], J. F. Peberdy et al., Hrsg, S. 1–28, Cambridge University Press: Cambridge detailliert beschrieben sind.
Alternativ können die erfindungsgemäßen STSRPs in Insektenzellen exprimiert werden, wobei Baculovirus-Expressionsvektoren verwendet werden. Baculovirusvektoren, welche für eine Expression von Proteinen in kultivierten Insektenzellen (z. B. Sf9-Zellen) verfügbar sind, schließen die pAc-Serie (Smith et al., 1983 Mol. Cell Biol. 3: 2156–2165) und die pVL-Serie (Lucklo und Summers, 1989 Virology 170: 31–39) ein.
In noch einer anderen Ausführungsform wird eine erfindungsgemäße STSRP-Nukleinsäure in Säugerzellen exprimiert, wobei ein Säugetier-Expressionsvektor verwendet wird. Beispiele von Säugetier-Expressionsvektoren schließen pCDM8 (Seed, B., 1987 Nature 329: 840) und pMT2PC (Kaufman et al., 1987 EMBO J. 6: 187–195) ein. Wenn Säugerzellen verwendet werden, werden die Kontrollfunktionen des Expressionsvektors oft durch virale regulatorische Elemente bereitgestellt. Zum Beispiel werden allgemein verwendete Promotoren von Polyoma, Adenovirus 2, Cytomegalovirus und Simian Virus 40 abgeleitet. Für andere geeignete Expressionssysteme sowohl für prokaryotische als auch eukaryotische Zellen siehe Kapitel 16 und 17 von Sambrook, J., Fritsh, E. F. und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Molekulares Klonen: Ein Laborhandbuch]. 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Habor, NY, 1989.
In einer anderen Ausführungsform kann der rekombinante Säugetier-Expressionsvektor die Expression von der Nukleinsäure vorzugsweise in einem bestimmten Zelltyp steuern (z. B. werden gewebespezifische regulatorische Elemente zur Expression der Nukleinsäure verwendet). Gewebespezifische regulatorische Elemente sind im Stand der Technik bekannt. Nichtbeschränkende Beispiele von geeigneten gewebespezifischen Promotoren schließen den Albumin-Promotor (leberspezifisch, Pinkert et al., 1987 Genes Dev. 1: 268–277), lymphoidspezifische Promotoren (Calame und Eaton, 1988 Adv. Immunol. 43: 235–275), insbesondere Promotoren von T-Zellrezeptoren (Winoto und Baltimore, 1989 EMBO J. 8: 729–733) und Immunglobulinen (Banerji et al., 1983 Cell 33: 729–740, Queen und Baltimore, 1983 Cell 33: 741–748), neuronenspezifische Promotoren (z. B. den Neurofilament-Promotor, Byrne und Ruddle, 1989 PNAS 86: 5473–5477), pankreasspezifische Promotoren (Edlund et al., 1985 Science 230: 912–916) und milchdrüsenspezifische Promotoren (z. B. Milk-Whey-Promotor, US-Patent Nr. 4,873,316 und Europäische Veröffentlichungsnr. 264,166) ein. Entwicklungsgesteuerte Promotoren sind ebenso umfasst, zum Beispiel die hox-Promotoren der Maus (Kessel und Gruss, 1990 Science 249: 374–379) und der Fetoprotein-Promotor (Campes und Tilghman, 1989 Genes Dev. 3: 537–546).
In einer anderen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen STSRPs in unizellulären Pflanzenzellen (wie zum Beispiel Algen) (siehe Falciatore et al., 1999 Marine Biotechnology [Marine Biotechnologie] 1 (3): 239–251 und Referenzen darin) und Pflanzenzellen von höheren Pflanzen (z. B. der Spermatophyten wie zum Beispiel Ertragspflanzen) exprimiert werden. Beispiele von Pflanzen-Expressionsvektoren schließen diejenigen ein, welche in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J. und Masterson, R., 1992 New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border [Neue Pflanzen-Binärvektoren mit selektierbaren Markern, welche proximal zur linken Grenze angeordnet sind], Plant Mol. Biol. 20: 1195–1197, und Bevan, M. W., 1984 Binary Agrobacterium vectors for plant transformation [Binäre Agrobacterium-Vektoren zur Pflanzentransformation], Nucl. Acid. Res. 12: 8711–8721, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants, in: Transgenic Plants [Vektoren für Gentransfer in Höheren Pflanzen, in: Transgene Pflanzen], Band 1, Engineering and Utilization [Konstruktion und Verwendung], Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38 detailliert beschrieben werden.
Eine Pflanzen-Expressionskassette enthält vorzugsweise regulatorische Sequenzen, welche die Genexpression in Pflanzenzellen steuern können und operativ verbunden sind, so dass jede Sequenz ihre Funktion erfüllen kann, zum Beispiel die Termination der Transkription durch Polyadenylierungssignale. Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind diejenigen, welche von Agrobacterium-tumefaciens-t-DNA stammen, wie zum Beispiel das Gen 3, welches als Octopinsynthase des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., 1984 EMBO J. 3: 835) bekannt ist, oder funktionelle Äquivalente davon, aber alle anderen Terminatoren sind ebenso geeignet, welche in Pflanzen funktionell aktiv sind.
Da eine Pflanzengenexpression sehr oft nicht auf transkriptionelle Spiegel beschränkt ist, enthält eine Pflanzen-Expressionskassette vorzugsweise andere operativ verbundene Sequenzen wie translationale Enhancer wie zum Beispiel die "Overdrive"-Sequenz, welche die 5'-untranslatierte Leadersequenz von Tabakmosaikvirus enthält, welche das Protein-zu-RNA-Verhältnis (Gallie et al., 1987 Nucl. Acids Research 15: 8693–8711) erhöht.
Eine Pflanzen-Genexpression muss mit einem geeigneten Promotor operativ verbunden sein, welcher eine Genexpression in einer rechtzeitigen zell- oder gewebespezifischen Weise vermittelt. Bevorzugt sind Promotoren, welche eine konstitutive Expression steuern (Benfey et al., 1989 EMBOJ. 8: 2195–2202), wie diejenigen, welche von Pflanzenviren abgeleitet sind, wie der 35S-CAMV (Franck et al., 1980 Cell 21: 285–294), der 19S-CaMV (siehe ebenso US-Patent Nr. 5352605 und PCT-Anmeldenr. WO 8402913) oder Pflanzenpromotoren, wie diejenigen von der kleinen Rubisco-Untereinheit, welche in US-Patent Nr. 4,962,028 beschrieben sind.
Andere bevorzugte Sequenzen zur Verwendung in Pflanzen-Genexpressionskassetten sind Zielsequenzen, welche notwendig sind, um das Genprodukt in sein geeignetes Zellkompartiment zu steuern (als Übersichtsarbeit siehe Kermode, 1996. Crit. Rev. Plant Sci. 15 (4): 285–423 und darin zitierte Referenzen) wie zum Beispiel die Vakuole, den Kern, alle Typen von Plastiden wie Amyloplasten, Chloroplasten, Chromoplasten, den extrazellulären Raum, Mitochondrien, das endoplasmatische Retikulum, Ölkörper, Peroxisomen und andere Kompartimente von Pflanzenzellen.
Eine Pflanzengenexpression kann ebenso über einen induzierbaren Promotor (als Übersichtsarbeit siehe Gatz, 1997 Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 89–108) erleichtert werden. Chemisch induzierbare Promotoren sind insbesondere geeignet, wenn erwünscht ist, dass eine Genexpression auf eine zeitspezifische Weise auftritt. Beispiele von derartigen Promotoren sind ein Salicylsäure-induzierbarer Promotor (PCT-Anmeldenr. WO 95/19443), ein Tetracyclin-induzierbarer Promotor (Gatz et al., 1992 Plant J. 2: 397–404) und ein Ethanol-induzierbarer Promotor (PCT-Anmeldenr. WO 93/21334).
Geeignete Promotoren, welche auf biotische oder abiotische Stressbedingungen antworten, sind ebenso solche wie zum Beispiel der Pathogen-induzierbare PRP1-Genpromotor (Ward et al., 1993 Plant. Mol. Biol. 22: 361–366), der wärmeinduzierbare hsp80-Promotor der Tomate (US-Patent Nr. 5187267), ein kälteinduzierbarer alpha-Amylasepromotor der Kartoffel (PCT-Anmeldenr. WO 96/12814) oder der wundinduzierbare pinII-Promotor (Europäische Patentnr. 375091). Für andere Beispiele von trockenheits-, kälte- und salzinduzierbaren Promotoren wie zum Beispiel den RD29A-Promotor siehe Yamaguchi-Shinozalei et al. (1993 Mol. Gen. Genet. 236: 331–340).
Insbesondere sind diejenigen Promotoren bevorzugt, welche eine Genexpression in spezifischen Geweben und Organen vermitteln, wie zum Beispiel Schließzellen und den Wurzelhaarzellen. Geeignete Promotoren schließen den Napin-Genpromotor von Raps (US-Patent Nr. 5,608,152), den USP-Promotor von Vicia faba (Baeumlein et al., 1991 Mol Gen Genet. 225 (3): 459–67), der Oleosin-Promotor von Arabidopsis (PCT-Anmeldenr. WO 98/45461), den Phaseolin-Promotor von Phaseolus vulgaris (US-Patent Nr. 5,504,200), den Bce4-Promotor von Brassica (PCT-Anmeldenr. WO 91/13980) oder den Legumin-B4-Promotor (LeB4, Baeumlein et al., 1992 Plant Journal, 2 (2): 233–9) als auch Promotoren ein, welche eine saatspezifische Expression in Monocotyledonenpflanzen wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis etc. vermitteln. Geeignete Promotoren, welche zu nennen sind, sind der Ipt2- oder Ipt1-Genpromotor von Gerste (PCT-Anmeldenr. WO 95/15389 und PCT-Anmeldenr. WO 95/23230) oder diejenigen, welche in PCT-Anmeldung Nr. WO 99/16890 (Promotoren von dem Hordein-Gen der Gerste, dem Glutelin-Gen von Reis, dem Oryzin-Gen von Reis, dem Prolamin-Gen von Reis, dem Gliadin-Gen von Weizen, dem Glutelin-Gen von Weizen, dem Zein-Gen von Mais, dem Glutelin-Gen von Hafer, dem Kasirin-Gen von Sorghum und dem Secalin-Gen von Roggen) beschrieben sind.
Ebenso sind insbesonders Promotoren geeignet, welche eine plastidspezifischen Genexpression vermitteln, da Plastiden das Kompartiment sind, worin Lipidbiosynthese stattfindet. Geeignete Promotoren sind der virale RNA-Polymerasepromotor, welcher in PCT-Anmeldenr. WO 95/16783 und PCT-Anmeldenr. WO 97/06250 beschrieben ist, und der clpP-Promotor von Arabidopsis, welcher in PCT-Anmeldenr. WO 99/46394 beschrieben ist.
Die Erfindung stellt weiterhin einen rekombinanten Expressionsvektor bereit, welcher ein erfindungsgemäßes STSRP-DNA-Molekül umfasst, welches in den Expressionsvektor in einer Antisense-Orientierung kloniert ist. Dies bedeutet, dass das DNA-Molekül operativ mit einer regulatorischen Sequenz in einer Weise verbunden wird, welche eine Expression (durch Transkription von dem DNA-Molekül) von einem RNA-Molekül ermöglicht, welche in Antisense-Orientiernung zu einer STSRP-mRNA vorliegt. Regulatorische Sequenzen können gewählt werden, welche mit einem Nukleinsäuremolekül operativ verbunden sind, welches in Antisense-Orientierung kloniert ist, wobei die regulatorischen Sequenzen die kontinuierliche Expression des Antisense-RNA-Moleküls in einer Vielzahl von Zelltypen steuern. Zum Beispiel können virale Promotoren und/oder Enhancer oder regulatorische Sequenzen gewählt werden, welche eine konstitutive, gewebespezifische oder Zelltyp-spezifische Expression von Antisense-RNA steuern. Der Antisense-Expressionsvektor kann in Form von einem rekombinanten Plasmid, einem Phagemid oder einem attenuierten Virus vorliegen, wobei Antisense-Nukleinsäuren unter der Kontrolle von einer regulatorischen Region mit einer hohen Effizienz hergestellt werden. Die Aktivität von der regulatorischen Region kann durch den Zelltyp bestimmt werden, in welchen der Vektor eingeführt wird. Siehe für eine Diskussion der Regulation der Genexpression, welche Antisense-Gene verwenden, Weintraub, H. et al., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis [Antisense-RNA als ein molekulares Werkzeug für die genetische Analyse] – Reviews – Trends in Genetics, Band. 1 (1) 1986 und Mol et al., 1990 FEBS Letters 268: 427–430.
Ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt betrifft Wirtszellen, in welche ein rekombinanter erfindungsgemäßer Expressionsvektor eingeführt wurde. Die Begriffe "Wirtszelle" und "rekombinante Wirtszelle" werden hierin als austauschbar verwendet. Es versteht sich, dass derartige Begriffe sich nicht auf die bestimmte gegenständliche Zelle beziehen, sondern sie sind ebenso auf die Nachkommenschaft oder mögliche Nachkommenschaften von einer derartigen Zelle anwendbar. Weil bestimmte Modifikationen in folgenden Generationen entweder aufgrund einer Mutation oder von umweltmäßigen Einflüssen auftreten können, braucht eine derartige Nachkommenschaft tatsächlich nicht mit der Elternzelle identisch zu sein, ist aber noch innerhalb des Umfangs des Begriffs wie hierin verwendet eingeschlossen.
Eine Wirtszelle kann eine beliebige prokaryotische oder eukaryotische Zelle sein. Zum Beispiel kann ein STSRP in bakteriellen Zellen exprimiert werden, wie zum Beispiel C. glutamicum, Insektenzellen, Pilzzellen oder Säugerzellen (wie zum Beispiel Ovarienzellen vom Chinesischen Hamster (CHO) oder COS Zellen), Algen, Ciliaten, Pflanzenzellen, Pilzen oder andere Mikroorganismen wie C. glutamicum. Andere geeignete Wirtszellen sind den Fachleuten bekannt.
Vektor-DNA kann in prokaryotische oder eukaryotische Zellen über konventionelle Transformations- oder Transfektionstechniken eingeführt werden. Es wird beabsichtigt, dass sich die Begriffe "Transformation", "Transfektion", "Konjugation" und "Transduktion" wie hierin verwendet auf eine Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Techniken zum Einführen einer fremden Nukleinsäure (z. B. DNA) in eine Wirtszelle beziehen, einschließend Calciumphosphat- oder Calciumchlorid-Kopräzipitation, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Lipofektion, natürliche Kompetenz, chemikalienvermittelten Transfer und Elektroporation. Geeignete Verfahren zum Transformieren oder Transfizieren von Wirtszellen einschließend Pflanzenzellen können in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual [Molekulares Klonen: Ein Laborhandbuch]. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) und anderen Laborhandbüchern wie zum Beispiel Methods in Molecular Biology [Verfahren in der Molekularbiologie], 1995, Band 44, Agrobacterium protocols [Agrobacterium-Protokolle], Hrsg: Gartland und Davey, Humana Press, Totowa, Neu Jersey gefunden werden. Da eine biotische und abiotische Stresstoleranz ein allgemeines gewünschtes Merkmal ist, welches in einer großen Vielfalt von Pflanzen wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Sojabohne, Erdnuss, Baumwolle, Raps und Canola, Yucca, Pfeffer, Sonnenblume und Tagetes, Nachtschattengewächsen wie Kartoffel, Tabak, Aubergine und Tomate, Vicia-Arten, Erbse, Luzerne, buschigen Pflanzen (Kaffee, Kakao, Tee), Salix-Spezies, Bäumen (Ölpalme, Kokosnuss), perennierenden Gräsern und Futterpflanzen vererbt werden soll, sind diese Ertragspflanzen als eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform ebenso bevorzugte Zielpflanzen für die Gentechnik.
Insbesondere stellt die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen einer transgenen Pflanze mit einer STSRP-kodierenden Nukleinsäure bereit, wobei das STSRP PLC-1 ist und wobei Expression von der Nukleinsäure (den Nukleinsäuren) in der Pflanze zu einer erhöhten Toleranz gegenüber Trockenheitsstress verglichen mit einer Wildtypvarietät von der Pflanze führt, umfassend: (a) Transformieren einer Pflanzenzelle mit einem Expressionsvektor umfassend eine STSRP-Nukleinsäure und (b) Erzeugen einer transgenen Pflanze aus der Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress verglichen mit einer Wildtypvarietät von der Pflanze hat. Die Erfindung stellt ebenso ein Verfahren zum Erhöhen der Expression von einem interessierenden Gen innerhalb einer Wirtszelle verglichen mit einer Wildtypvarietät von der Wirtszelle bereit, wobei das interessierende Gen als Antwort auf ein STSRP transkribiert wird, umfassend: (a) Transformieren der Wirtszelle mit einem Expressionsvektor umfassend eine STSRP-kodierende Nukleinsäure und (b) Exprimieren des STSRP innerhalb der Wirtszelle, wodurch verglichen mit einer Wildtypvarietät von der Wirtszelle die Expression vom Gen erhöht wird, welches als Antwort auf das STSRP transkribiert wird.
Für eine derartige Pflanzentransformation können Binärvektoren wie zum Beispiel pBinAR verwendet werden (Höfgen und Willmitzer, 1990 Plant Science 66: 221–230). Eine Konstruktion der Binärvektoren kann durch Ligation von der cDNA in Sense- oder Antisense-Orientierung in die T-DNA durchgeführt werden. 5' zur cDNA aktiviert ein Pflanzenpromotor eine Transkription von der cDNA. Eine Polyadenylierungssequenz wird 3' zur cDNA angeordnet. Eine gewebespezifische Expression kann durch Verwenden eines gewebespezifischen Promotors erzielt werden. Zum Beispiel kann eine saatspezifische Expression durch Klonieren des Napin- oder des LeB4- oder des USP-Promotors 5' zur cDNA erzielt werden. Ebenso kann ein beliebiges anderes saatspezifisches Promotorelement verwendet werden. Für eine konstitutive Expression innerhalb der ganzen Pflanze kann der CaMV-35S-Promotor verwendet werden. Das exprimierte Protein kann zu einem zellulären Kompartiment gezielt werden, wobei ein Signalpeptid, zum Beispiel für Plastiden, Mitochondrien oder endoplasmatisches Retikulum verwendet wird (Kermode, 1996 Crit. Rev. Plant Sci. 4 (15): 285–423). Das Signalpeptid wird 5' im Raster zur cDNA kloniert, um eine subzelluläre Lokalisierung vom Fusionsprotein zu erzielen. Zusätzlich können Promotoren mit den hierin offenbarten Nukleinsäuresequenzen verwendet werden, welche auf abiotischen Stress responsiv sind, zum Beispiel der Arabidopsis-Promotor RD29A. Ein Fachmann wird erkennen, dass der Promotor derartig operativ verbunden mit der Nukleinsäure verwendet werden sollte, dass der Promotor eine Transkription von der Nukleinsäure verursacht, welche zur Synthese von einer mRNA führt, welche ein Polypeptid kodiert. Alternativ kann die RNA eine Antisense-RNA zur Verwendung zum Beeinflussen der nachfolgenden Expression desselben oder eines anderen Gens oder anderer Gene sein.
Alternative Verfahren zur Transfektion schließen den direkten Transfer von DNA in der Pflanzenentwickelung über Elektroporation oder Agrobacterium-vermittelten Gentransfer ein. Eine Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation kann durchgeführt werden, indem zum Beispiel der GV3101-Stamm (pMP90) (Koncz und Schell, 1986 Mol. Gen. Genet. 204: 383–396) oder der LBA4404-Stamm (Clontech) von Agrobacterium tumefaciens verwendet wird. Eine Transformation kann durch eine Standardtransformation und Regenerationstechniken durchgeführt werden (Deblaere et al., 1994 Nucl. Acids. Res. 13: 4777–4788, Gelvin, Stanton B. und Schilperoort, Robert A, Plant Molecular Biology Manual [Handbuch der Molekularbiologie der Pflanze], 2. Aufl. -Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995. – in Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4, Glick, Bernard R., Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology [Verfahren in der Molekularbiologie und Biotechnologie der Pflanze], Boca Raton: CRC Press, 1993.-360 S., ISBN 0-8493-5164-2). Zum Beispiel kann Raps über Kotyledonen- oder Hypocotyl-Transformation transformiert werden (Moloney et al., 1989 Plant cell Report 8: 238–242, De Block et al., 1989 Plant Physiol. 91: 694–701). Eine Verwendung von Antibiotika für eine Agrobacterium- und Pflanzenselektion hängt vom Binärvektor und dem Agrobacterium-Stamm ab, welcher für die Transformation verwendet wird. Eine Raps-Selektion wird normalerweise durchgeführt, indem Kanamycin als selektierbarer Pflanzenmarker verwendet wird. Agrobacterium-vermittelter Gentransfer auf Flachs kann durchgeführt werden, indem zum Beispiel eine Technik beschrieben von Mlynarova et al., 1994 Plant Cell Report 13: 282–285 verwendet wird. Zusätzlich kann eine Transformation von Sojabohnen durchgeführt werden, indem zum Beispiel eine Technik beschrieben in dem Europäischen Patent Nr. 0424 047, dem US-Patent Nr. 5,322,783, dem Europäischen Patent Nr. 0397 687, dem US-Patent Nr. 5,376,543 oder dem US-Patent Nr. 5,169,770 verwendet wird. Eine Transformation von Mais kann durch Partikelbeschuss, Polyethylenglykol-vermittelte DNA-Aufnahme oder über die Siliziumcarbidfasertechnik erzielt werden. (Siehe zum Beispiel Freeling und Walbot "The maize handbook [Das Mais-Handbuch]" Springer Verlag: New York (1993) ISBN 3-540-97826-7). Ein spezifisches Beispiel von einer Mais-Transformation wird in US-Patent Nr. 5,990,387 gefunden, und ein spezifisches Beispiel von einer Weizentransformation kann in PCT-Anmeldenr. WO 93/07256 gefunden werden.
Für eine stabile Transfektion von Säugerzellen ist bekannt, dass abhängig vom verwendeten Expressionsvektor und der verwendeten Transfektionstechnik nur eine kleine Fraktion von Zellen die fremde DNA in ihr Genom integrieren kann. Um diese Integranten zu identifizieren und zu selektieren, wird ein Gen, welches einen selektierbaren Marker kodiert (z. B. Widerstand gegenüber Antibiotika) generell in die Wirtszellen zusammen mit dem interessierenden Gen eingeführt. Bevorzugte selektierbare Marker schließen solche ein, welche Widerstand gegenüber Wirkstoffen bilden, wie zum Beispiel G418, Hygromycin und Methotrexat oder in Pflanzen, welche auf ein Herbizid gerichteten Widerstand wie zum Beispiel Glyphosat oder Glufosinat bilden. Nukleinsäuremoleküle, welche einen selektierbaren Marker kodieren, können in eine Wirtszelle auf demselben Vektor eingeführt werden, wie solche, welche ein STSRP kodieren oder welche auf einem getrennten Vektor eingeführt werden können. Stabil mit dem eingeführten Nukleinsäuremolekül transfizierte Zellen können zum Beispiel durch Wirkstoffselektion (z. B. Zellen, welche das selektierbare Markergen eingeschlossen haben, werden überleben, während die anderen Zellen sterben) identifiziert werden.
Um einen homologen rekombinanten Mikroorganismus zu schaffen, wird ein Vektor hergestellt, welcher wenigstens einen Anteil von einem STSRP-Gen enthält, in welchem eine Deletion, Hinzufügung oder Substitution eingeführt wurde, um hierdurch das STSRP-Gen zu verändern, z. B. funktionell zu zerstören. Vorzugsweise ist das STSRP-Gen ein Physcomitrella-patens-STSRP-Gen, wobei STSRP Phosholipase C-1 ist, aber es kann ein Homolog von einer verwandten Pflanze oder sogar von einer Säugetier-, Hefe- oder Insektenquelle sein. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Vektor derartig konstruiert, dass nach homologer Rekombination das endogene STSRP-Gen funktionell zertört wird (d. h. kein funktionelles Protein mehr kodiert, worauf ebenso als ein Knockoutvektor bezuggenommen wird). Alternativ kann der Vektor derartig konstruiert werden, dass das endogene STSRP-Gen nach homologer Rekombination mutiert oder anderweitig verändert wird, aber noch ein funktionelles Protein kodiert (z. B. kann die stromaufwärtige regulatorische Region verändert werden, um hierdurch die Expression von dem endogen STSRP zu verändern). Zum Schaffen einer Punktmutation über homologe Rekombination können DNA-RNA-Hybride in einer Technik verwendet werden, welche als Chimeraplastie bekannt ist (Cole-Strauss et al., 1999 Nucleic Acids Research 27 (5): 1323–1330 und Kmiec, 1999 Gene therapy American Scientist. 87 (3): 240–247). Homologe Rekombinationverfahren in Physcomitrella patens sind im Stand der Technik ebenso gut bekannt und werden für die Verwendung hierin vorgesehen.
Während im homologen Rekombinationsvektor der veränderte Anteil vom STSRP-Gen an seinen 5'- und 3'-Enden durch ein zusätzliches Nukleinsäuremolekül vom STSRP-Gen flankiert wird, um eine homologe Rekombination zwischen dem exogenen STSRP-Gen, welches vom Vektor getragen wurde, und einem endogenes STSRP-Gen in einem Mikroorganismus oder einer Pflanze zu ermöglichen. Das zusätzliche flankierende STSRP-Nukleinsäuremolekül ist von hinreichender Länge für eine erfolgreiche homologe Rekombination mit dem endogenen Gen. Typischerweise werden mehrere hundert Basenpaaren bis zu Kilobasen von der flankierenden DNA (wowohl am 5'- als auch 3'-Ende) im Vektor eingeschlossen (siehe z. B. Thomas, K. R. und Capecchi, M. R., 1987 Cell 51: 503 für eine Beschreibung von homologen Rekombinationsvektoren oder Strepp et al., 1998 PNAS, 95 (8): 4368–4373 für cDNA-basierte Rekombination in Physcomitrella patens). Der Vektor wird in einen Mikroorganismus oder eine Pflanzenzelle (z. B. über Polyethylenglykol-vermittelte DNA) eingeführt, und Zellen, in welchen das eingeführte STSRP-Gen homolog mit dem endogenen STSRP-Gen rekombiniert hat, werden selektiert, wobei im Stand der Technik bekannte Techniken verwendet werden.
In einer anderen Ausführungsform können rekombinante Mikroorganismen hergestellt werden, welche ausgewählte Systeme enthalten, welche eine regulierte Expression des eingeführten Gens erlauben. Zum Beispiel erlaubt der Einschluß von einem STSRP-Gen in einen Vektor unter Kontrolle des lac-Operons die Expression vom STSRP-Gen nur in der Anwesenheit von IPTG. Derartige regulatorische Systeme sind im Stand der Technik gut bekannt.
Eine erfindungsgemäße Wirtszelle wie zum Beispiel eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle in Kultur kann zum Herstellen (d. h. Exprimieren) eines STSRP verwendet werden. Folglich stellt die Erfindung weiterhin Verfahren zum Herstellen eines STSRP bereit, welche die erfindungsgemäßen Wirtszellen verwenden. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren Kultivieren der erfindungsgemäßen Wirtszelle (in welche ein rekombinanter Expressionsvektor kodierend ein STSRP eingeführt wurde oder in dessen Genom ein Gen kodierend ein Wildtyp-STSRP oder verändertes STSRP eingeführt wurde) in einem geeigneten Medium, bis das STSRP gebildet wird. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Verfahren weiterhin Isolieren des STSRP aus dem Medium oder der Wirtszelle.
Ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt betrifft die Isolierung von STSRPs und biologisch aktiven Anteilen davon. Ein "isoliertes" oder "gereinigtes" Protein oder biologisch aktiver Anteil davon ist frei von einigen der zellulären Materialien, wenn es durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt wird, oder durch chemische Vorläufer oder andere Chemikalien, wenn es chemisch synthetisiert wird. Die Formulierung "im wesentlichen frei von zellulärem Material" schließt Präparationen von STSRP ein, in welchen das Protein von einigen der zellulären Bestandteilen der Zellen getrennt wird, in welchen es natürlicherweise vorhanden ist oder rekombinant hergestellt wird. In einer Ausführungsform schließt die Formulierung "im wesentlichen frei von zellulärem Material" Präparationen von einem STSRP ein, welches weniger als etwa 30% (Trockengewicht) von nicht-STSRP-Material (worauf hierin ebenso als ein "kontaminiertes Protein" bezuggenommen wird) aufweist, stärker bevorzugt weniger als etwa 20% von nicht-STSRP-Material, noch stärker bevorzugt weniger als etwa 10% von nicht-STSRP-Material und am stärksten bevorzugt weniger als etwa 5% nicht-STSRP-Material.
Wenn das STSRP oder ein biologisch aktiver Anteil davon rekombinant hergestellt wird, ist es ebenso vorzugsweise im wesentlichen frei von Kulturmedium, d. h. Kulturmedium stellt weniger als etwa 20%, stärker bevorzugt weniger als etwa 10% und am stärksten bevorzugt weniger als etwa 5% vom Volumen von der Proteinpräparation dar. Die Formulierung "im wesentlichen frei von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien" schließt Präparationen von STSRP ein, in welchen das Protein von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien getrennt wird, welche in die Synthese vom Protein involviert sind. In einer Ausführungsform schließt die Formulierung "im wesentlichen frei von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien" Präparationen von einem STSRP ein, welches weniger als etwa 30% (Trockengewicht) von chemischen Vorläufern oder nicht-STSRP-Chemikalien, stärker bevorzugt weniger als etwa 20% chemische Vorläufer oder nicht-STSRP-Chemikalien, noch stärker bevorzugt weniger als etwa 10% chemische Vorläufer oder nicht-STSRP-Chemikalien und am stärksten bevorzugt weniger als etwa 5% chemische Vorläufer oder nicht-STSRP-Chemikalien aufweist. In bevorzugten Ausführungsformen fehlen isolierten Proteinen oder biologisch aktiven Anteilen davon die kontaminierenden Proteine von demjenigen Organismus, von welchem das STSRP abgeleitet wird. Typischerweise werden derartige Proteine durch rekombinante Expression zum Beispiel von einem Physcomitrella-patens-STSRP in Pflanzen hergestellt, welche von Physcomitrella patens verschieden sind, oder in Mikroorganismen, wie zum Beispiel C. glutamicum, Ciliaten, Algen oder Pilzen.
Die Nukleinsäuremoleküle, Proteine, Protein-Homologe, Fusionsproteine, Primer, Vektoren und hierin beschriebene Wirtszellen können in einem oder mehren der folgenden Verfahren verwendet werden: Identifizierung von Physcomitrella patens und verwandten Organismen, Kartieren von Genomen von Organismen, welche mit Physcomitrella patens verwandt sind, Identifizierung und Lokalisierung von interessierenden Physcomitrella-patens-Sequenzen, evolutionären Studien, Bestimmung von STSRP-Regionen, welche für die Funktion benötigt werden, Modulation von einer STSRP-Aktivität, Modulation vom Metabolismus von einer oder mehreren Zellfunktionen, Modulation des Transmembran-Transports von einer oder mehreren Verbindungen und Modulation von Stresswiderstand.
Das Moos Physcomitrella patens stellt ein Mitglied der Moose dar. Es ist mit anderen Moose wie zum Beispiel Ceratodon purpureus verwandt, welches fähig ist, in Abwesenheit von Licht zu wachsen. Moose wie Ceratodon und Physcomitrella teilen einen hohen Grad von Homologie auf der Ebene der DNA-Sequenz und des Polypeptids, welcher die Verwendung von heterologem Screenen von DNA-Molekülen mit Sonden aus anderen Moosen oder Organismen erlaubt, was daher die Ableitung einer Konsensussequenz ermöglicht, welche für ein heterologes Screenen oder eine funktionelle Annotierung und Vorhersage von Genfunktionen in dritten Spezies geeignet ist. Die Fähigkeit zum Identifizieren derartiger Funktionen kann deshalb eine signifikante Relevanz haben, z. B. für die Vorhersage einer Substratspezifität von Enzymen. Weiterhin können diese Nukleinsäuremoleküle als Referenzpunkte für das Kartieren von Moosgenomen oder von Genomen von verwandten Organismen dienen.
Die erfindungsgemäßen STSRP-Nukleinsäuremoleküle haben eine Vielzahl von Verwendungen. Am wichtigsten ist es, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen zum Transformieren von Pflanzen verwendet werden können, wodurch Toleranz gegenüber Stress wie zum Beispiel Trockenheit, hohem Salzgehalt und Kälte induziert wird. Die vorliegende Erfindung stellt deshalb eine transgene Pflanze bereit, welche durch eine STSRP-Nukleinsäure transformiert ist, wobei eine Expression von der Nukleinsäuresequenz in der Pflanze zu einer erhöhten Toleranz gegenüber Umweltstress verglichen mit einer Wildtypvarietät von der Pflanze führt. Die transgene Pflanze kann eine Monocotyledone oder eine Dicotyledone sein. Die Erfindung sieht weiterhin vor, dass die transgene Pflanze zum Beispiel aus Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Sojabohne, Erdnuss, Baumwolle, Raps, Canola, Yucca, Pfeffer, Sonnenblume, Tagetes, Nachtschattengewächsen, Kartoffel, Tabak, Aubergine, Tomate, Vicia-Arten, Erbse, Luzerne, Kaffee, Kakao, Tee, Salix-Spezies, Ölpalme, Kokosnuss, perennierendem Gras und Futterpflanzen ausgewählt werden kann.
Insbesondere beschreibt die vorliegende Erfindung die Verwendung der Expression von PLC-1 von Physcomitrella patens zum Konstruieren trockenheitstoleranter Pflanzen. Diese Strategie wurde hierin für Arabidopsis thaliana, Raps/Canola, Sojabohnen, Mais und Weizen demonstriert, aber ihre Anwendung ist nicht auf diese Pflanzen beschränkt. Folglich stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, welche das STSRP PLC-1 (SEQ ID NO: 11) enthält, wobei der Umweltstress Trockenheit ist.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenso Verfahren zum Modifizieren einer Stresstoleranz von einer Pflanze bereit, umfassend Modifizieren der Expression von einem STSRP in der Pflanze. Die Erfindung sieht vor, dass dieses Verfahren derartig durchgeführt werden kann, dass die Stresstoleranz entweder erhöht oder vermindert wird. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Herstellen einer transgenen Pflanze bereit, welche eine erhöhte Toleranz gegenüber Trockenheitssstress verglichen mit einer Wildtypvarietät von der Pflanze aufweist, umfassend Erhöhen der Expression von einem PLC-1-Protein in einer Pflanze.
Die Verfahren zum Erhöhen der Expression von STSRPs können verwendet werden, wobei die Pflanze entweder transgen oder nicht transgen ist. Falls die Pflanze transgen ist, kann die Pflanze mit einem Vektor transformiert werden, welcher eine beliebige von den oben beschriebenen STSRP-kodierenden Nukleinsäuren enthält, oder die Pflanze kann mit einem Promotor transformiert werden, welcher zum Beispiel die Expression von nativem STSRP in der Pflanze steuert. Die Erfindung sieht vor, dass ein derartiger Promotor gewebespezifisch sein kann. Außerdem kann ein derartiger Promotor entwicklungsgesteuert sein. Alternativ können nichttransgene Pflanzen eine native STSRP-Expression modifiziert durch Induzieren eines nativen Promotors aufweisen.
Die Expression von PLC-1 (SEQ ID NO: 11) kann in Zielpflanzen durch eines der folgenden Beispiele ausgeführt werden: (a) konstitutiver Promotor, (b) stressinduzierbarer Promotor, (c) chemikalieninduzierter Promotor und (d) konstruierte Promotor-Überexpression zum Beispiel mit Zinkfinger-abgeleiteten Transkriptionsfaktoren (Greisman und Pabo, 1997 Science 275: 657), ist aber ist nicht darauf beschränkt. Der letztere Fall involviert Identifizierung der Homologe von PLC-1 (SEQ ID NO: 11) in der Zielpflanze als auch von seinem Promotor. Zinkfinger-enthaltende rekombinante Transkriptionsfaktoren werden konstruiert, um spezifisch mit dem Homolog von PLC-1 (SEQ ID NO: 11) zu interagieren, und eine Transkription des korrespondierenden Gens wird aktiviert.
Neben Einführen der STSRP-Nukleinsäuresequenzen in transgene Pflanzen können diese Sequenzen ebenso zum Identifizieren eines Organismus' verwendet werden, Physcomitrella patens oder ein naher Verwandter davon zu sein. Ebenso können sie zum Identifizieren der Anwesenheit von Physcomitrella patens oder eines Verwandten davon in einer gemischten Population von Mikroorganismen verwendet werden. Die Erfindung stellt die Nukleinsäuresequenzen von einer Anzahl von Physcomitrella-patens-Genen bereit; man kann durch Sondieren der extrahierten genomischen DNA aus einer Kultur einer einheitlichen oder gemischten Population von Mikroorganismen unter stringenten Bedingungen mit einer Sonde, welche über eine Region von einem Physcomitrella-patens-Gen spannt, welches in diesem Organismus einzigartig ist, ermitteln, ob dieser Organismus vorliegt.
Weiterhin können die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Proteinmoleküle als Marker für spezifische Regionen vom Genom dienen. Dies ist nicht nur beim Kartieren vom Genom nützlich, sondern ebenso in funktionellen Studien von Physcomitrella-patens-Proteinen. Um zum Beispiel die Region vom Genom zu identifizieren, an welche ein bestimmtes DNA-bindendes Protein von Physcomitrella patens bindet, könnte das Physcomitrella-patens-Genom verdaut und die Fragmente mit dem DNA-bindenden Protein inkubiert werden. Diejenigen Fragmente, welche das Protein binden, können zusätzlich mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen gesondet werden, vorzugsweise mit leicht detektierbaren Markierungen. Binden von einem derartigen Nukleinsäuremolekül an das Genomfragment ermöglicht die Lokalisierung vom Fragment in der Genomkarte von Physcomitrella patens und, wenn es mehrmals mit verschiedenen Enzymen durchgeführt wird, erleichtert eine schnelle Bestimmung von der Nukleinsäuresequenz, an welche das Protein bindet. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle hinreichend homolog zu den Sequenzen von verwandten Spezies sein, derartig, dass diese Nukleinsäuremoleküle als Marker für die Konstruktion von einer genomischen Karte in verwandten Moosen dienen kann.
Die erfindungsgemäßen STSRP-Nukleinsäuremoleküle sind ebenso für evolutionäre und proteinstrukturelle Studien geeignet. Die metabolischen Prozesse und Transportprozesse, an welchen die erfindungsgemäßen Moleküle teilnehmen, werden von einer große Vielfalt von prokaryotischen und eukaryotischen Zellen verwendet; die evolutionäre Verwandtschaft von Organismen kann durch Vergleichen der Sequenzen von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen mit denjenigen, welche ähnliche Enzyme von anderen Organismen kodieren, beurteilt werden. Auf ähnliche Weise erlaubt ein derartiger Vergleich eine Beurteilung davon, welche Regionen der Sequenz konserviert sind und welche nicht, welche beim Bestimmen derjenigen Regionen vom Protein helfen können, welche für die Funktion vom Enzym essentiell sind. Dieser Bestimmungstyp ist für Proteinkonstruktionsstudien wertvoll und kann einen Hinweis geben, was das Protein in Form von Mutagenese tolerieren kann, ohne die Funktion zu verlieren.
Eine Manipulation der erfindungsgemäßen STSRP-Nukleinsäuremoleküle kann zur Produktion von STSRPs führen, welche funktionelle Unterschiede zu dem Wildtyp-STSRP PLC-1 haben. Diese Proteine können in der Effizienz oder Aktivität verbessert sein, können in größeren Anzahlen in der Zelle als üblich vorliegen oder können in der Effizienz oder Aktivität vermindert sein.
Es gibt eine Anzahl von Mechanismen, durch welche die Veränderung eines erfindungsgemäßen STSRPs direkt eine Stressantwort und/oder Stresstoleranz beeinflussen kann. Im Falle von Pflanzen, welche STSRPs exprimieren, kann ein erhöhter Transport zu einer verbesserten Partitionierung von Salzen und/oder löslichen Stoffen innerhalb des Pflanzengewebes und der Organe führen. Entweder durch Erhöhen der Anzahl oder der Aktivität von Transportermolekülen, welche ionische Moleküle aus der Zelle exportieren, könnte es möglich sein, die Salztoleranz der Zelle zu beeinflussen.
Die Wirkung der genetischen Modifikation in Pflanzen, C. glutamicum, Pilzen, Algen oder Ciliaten auf Stresstoleranz kann durch Wachsenlassen des modifizierten Mikroorganismus' oder der Pflanze unter weniger geeigneten Bedingungen und dann Analysieren der Wachstumskennzeichen und/oder des Metabolismus der Pflanze beurteilt werden. Derartige Analysetechniken sind dem Fachmann gut bekannt und schließen Trockengewicht, Feuchtgewicht, Proteinsynthese, Kohlenhydratsynthese, Lipidsynthese, Evapotranspirationsraten, allgemeinen Pflanzen- und/oder Ertragspflanzenertrag, Blühen, Reproduktion, Saatansatz, Wurzelwachstum, Respirationsraten, Photosyntheseraten etc. ein (Anwendungen von HPLC in der Biochemie in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology [Labortechniken in der Biochemie und der Molekularbiologie], Band 17, Rehm et al., 1993 Biotechnology [Biotechnologie], Band 3, Kapitel III: Product recovery and purification [Produktausbeute und Reinigung], Seiten 469–714, VCH: Weinheim, Belter, P. A. et al., 1988 Bioseparations: downstream processing for biotechnology [Bioseparationen: Stromabwärts-Verarbeitung für die Biotechnologie], John Wiley and Sons, Kennedy, J. F. und Cabral, J. M. S., 1992 Recovery processes for biological materials [Gewinnungsverfahren für biologische Materialien], John Wiley and Sons, Shaeiwitz, J. A. und Henry, J. D., 1988 Biochemical separations, in: Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry [Biochemische Trennungen, in: Ulmanns Enzyclopädie der industriellen Chemie], Band B3, Kapitel 11, Seiten 1–27, VCH: Weinheim, und Dechow, F. J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, [Trennung und Reinigungstechniken in der Biotechnologie], Noyes Publications).
Zum Beispiel können Hefe-Expressionsvektoren umfassend die hierin offenbarten Nukleinsäuren oder Fragmente davon konstruiert werden und in Saccharomyces cerevisiae transformiert werden, wobei Standardprotokolle verwendet werden. Die resultierenden transgenen Zellen können dann auf Fehlen oder Veränderung von ihrer Toleranz gegenüber Trockenheits-, Salz- und Temperaturstress getestet werden. Auf ähnliche Weise können Pflanzen-Expressionsvektoren umfassend die hierin offenbarten Nukleinsäuren oder Fragmente davon konstruiert werden und in eine geeignete Pflanzenzelle transformiert werden, wie zum Beispiel Arabidopsis, Soja, Raps, Mais, Weizen, Medicago truncatula etc., wobei Standardprotokolle verwendet werden. Die resultierenden transgenen Zellen und/oder davon abgeleitete Pflanzen können dann auf Fehlen oder Veränderung von ihrer Toleranz gegenüber Trockenheits-, Salz- und Temperaturstress getestet werden.
Das Konstruieren von einem oder mehreren erfindungsgemäßen STSRP-Genen kann ebenso zu STSRPs führen, welche veränderte Aktivitäten haben, welche indirekt die Stressantwort und/oder Stresstoleranz von Algen, Pflanzen, Ciliaten oder Pilzen oder anderen Mikroorganismen wie C. glutamicum beeinflussen. Zum Beispiel führen die normalen biochemischen Metabolismusprozesse zur Produktion einer Vielzahl von Produkten (z. B. Wasserstoffperoxid und anderen reaktiven Sauerstoffspezies), welche mit diesen selben metabolischen Prozessen aktiv interferieren können (zum Beispiel kann Peroxinitrid Tyrosinseitenketten nitrieren, wobei es einige Enzyme inaktiviert, welche Tyrosin an der aktiven Stelle haben (Groves, J. T., 1999 Curr. Opin. Chem. Biol. 3 (2): 226–235). Während diese Produkte typischerweise ausgeschieden werden, können Zellen genetisch verändert werden, um mehr Produkte zu transportieren als es für eine Wildtypzelle typisch ist. Durch Optimieren der Aktivität von einem oder mehreren erfindungsgemäßen STSRPs, welche in den Export von spezifischen Molekülen wie zum Beispiel Salzmolekülen involviert sind, kann es möglich sein, die Stresstoleranz der Zelle zu verbessern.
Zusätzlich können die hierin offenbarten Sequenzen oder Fragmente davon zum Erzeugen von Knockout-Mutationen in den Genomen von verschiedenen Organismen, wie zum Beispiel Bakterien, Säugerzellen, Hefezellen und Pflanzenzellen (Girke, T., 1998 The Plant Journal 15: 39–48) verwendet werden. Die resultierenden Knockout-Zellen können dann auf ihre Fähigkeit oder Kapazität zum Tolerieren verschiedener Stressbedingungen, ihre Antwort auf verschiedene Stressbedingungen und die Wirkung auf dem Phänotypen und/oder Genotyp der Mutation untersucht werden. Siehe für andere Verfahren zur Geninaktivierung US-Patent Nr. 6004804 "Non-Chimeric Mutational Vectors [Nicht-chimäre Mutationsvektoren]" und Puttaraju et al., 1999 Spliceosome-mediated RNA trans-splicing as a tool for gene therapy [Spleißeosome-vermitteltes RNA-trans-Spleißen als ein Werkzeug für die Gentherapie] Nature Biotechnology 17: 246–252.
Die obengenannten Mutagenesestrategien für STSRPs, welche zum erhöhten Stresswiderstand führen, sind nicht als beschränkend gemeint, Variationen dieser Strategien sind für den Fachmann leicht erkennbar. Indem derartige Strategien verwendet werden und indem die hierin offenbarten Mechanismen eingeschlossen werden, können die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Proteinmoleküle verwendet werden, um Algen, Ciliaten, Pflanzen, Pilze oder andere Mikroorganismen wie C. glutamicum zu erzeugen, welche eine mutierte STSRP-Nukleinsäure und Proteinmoleküle derartig exprimieren, dass die Stresstoleranz verbessert wird.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenso Antikörper bereit, welche spezifisch an ein STSRP oder einen Anteil davon binden, wie es/er durch eine hierin beschriebene Nukleinsäure kodiert wird. Antikörper können durch viele wohlbekannte Verfahren gemacht werden (Siehe z. B. Harlow und Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual [Antikörper: ein Laborhandbuch]" Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1988)). Kurz gesagt kann ein gereinigtes Antigen in ein Tier in einer Menge und in Intervallen hinreichend zum Hervorrufen einer Immunantwort injiziert werden. Antikörper können entweder direkt gereinigt werden, oder Milzzellen können vom Tier erhalten werden. Die Zellen können dann mit einer immortalen Zelllinie fusioniert und nach Antikörpersekretion gescreent werden. Die Antikörper können zum Screenen von Nukleinsäure-Klonbibliotheken für Zellen verwendet werden, welche das Antigen sekretieren. Die positive Klone können dann sequenziert werden. (Siehe zum Beispiel Kelly et al., 1992 Bio/Technology 10: 163–167, Bebbington et al., 1992 Bio/Technology 10: 169–175).
Die Ausdrücke "bindet selektiv" und "bindet spezifisch" mit dem Polypeptid beziehen sich auf eine bindende Reaktion, welche die Anwesenheit des Proteins in einer heterogenen Population von Proteinen und anderer Biologie bestimmt. Daher binden unter den bezeichneten Immuntestbedingungen die spezifizierten Antikörper, welche an ein bestimmtes Protein gebunden sind, nicht in einer signifikanten Menge an andere Proteine, welche in der Probe sind. Eine selektive Bindung eines Antikörpers kann unter derartigen Bedingungen einen Antikörper benötigen, welcher aufgrund seiner Spezifität für ein bestimmtes Protein selektiert wird. Eine Vielzahl von Immuntestformaten kann zum Selektiern von Antikörpern verwendet werden, welche selektiv mit einem bestimmten Protein binden. Zum Beispiel werden Festphasen-ELISA-Immuntests routinemäßig zum Selektieren von Antikörpern verwendet, welche für ein Protein selektiv immunreaktiv sind. Siehe Harlow und Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual [Antikörper: ein Laborhandbuch]" Cold Spring Harbor Publications, New York, (1988) für eine Beschreibung von Immuntestformaten und Bedingungen, welche zum Bestimmen einer selektiven Bindung verwendet werden könnten.
In einigen Fällen ist es erwünscht, monoklonale Antikörper von verschiedenen Wirten herzustellen. Eine Beschreibung von Techniken zum Herstellen derartiger monoklonaler Antikörper kann in Stites et al., Herausgeber, "Basic and Clinical Immunology [Grundlegende und Klinische Immunology]" (Lange Medical Publications, Los Altos, Calif., Vierte Auflage) und darin zitierten Referenzen und in Harlow und Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual [Antikörper: ein Laborhandbuch]" Cold Spring Harbor Publications, New York, 1988) gefunden werden.
Es sollte ebenso verstanden werden, dass das Vorangehende bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsformen betrifft. Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele erläutert, welche nicht ausgelegt werden sollen, dass sie den Umfang der Erfindung in irgend einer Weise beschränken.
BEISPIELE
Beispiel 1
Wachstum von Physcomitrella-patens-Kulturen
Für die Studie wurden Pflanzen der Spezies Physcomitrella patens (Hedw.) B. S. G. aus der Sammlung der Abteilung für genetische Studien der Universität Hamburg verwendet. Sie stammen von dem Stamm 16/14, welcher von H. L. K. Whitehouse in Gransden Wood, Huntingdonshire (England) gesammelt wurde, welcher durch Engel (1968, Am J Bot 55, 438–446) aus einer Spore subkultiviert wurde. Proliferation der Pflanzen wurde mittels Sporen und mittels Regeneration der Gametophyten durchgeführt. Das Protonema entwickelte sich aus der haploiden Spore als ein chloroplastenreiches Chloronema und chloroplastenarmes Caulonema, auf welchem sich nach annähernd 12 Tagen Knospen bildeten. Diese wuchsen, um Gametophoren zu ergeben, welche Antheridien und Archegonien enthielten. Nach Fertilisation entstand der diploide Sporophyt mit einer kurzen Seta und der Sporenkapsel, in welcher die Meiosporen reiften.
Kultivieren wurde in einer klimatischen Kammer bei einer Lufttemperatur von 25°C und einer Lichtintensität von 55 mikromol s^–1m2 (weißes Licht, Leuchtstoffröhre Philips TL 65W/25) und einem Licht/Dunkelwechsel von 16/8 Stunden durchgeführt. Das Moos wurde entweder in Flüssigkultur modifiziert, wobei Knop-Medium gemäß Reski und Abel (1985, Planta 165, 354–358) verwendet wurde, oder wurde auf festem Knop-Medium kultiviert, wobei 1 % Oxoid-Agar (Unipath, Basingstoke, England) verwendet wurde. Die Protonemen, welche zur RNA- und DNA-Isolierung verwendet wurden, wurden in belüfteten Flüssigkulturen kultiviert. Die Protonemen wurden alle 9 Tage zerkleinert und auf frisches Kulturmedium übertragen.
Beispiel 2
Gesamt-DNA-Isolierung aus Pflanzen
Die Details für die Isolierung von Gesamt-DNA beziehen sich auf die Aufarbeitung von einem Gramm Frischgewicht von Pflanzenmaterial. Die verwendeten Materialien schließen die folgenden Puffer ein: CTAB-Puffer: 2% (w/v) N-Cethyl-N,N,N-trimethylammoniumbromid (CTAB), 100 mM Tris HCl pH 8,0, 1,4 M NaCl, 20 mM EDTA, N-Laurylsarcosinpuffer: 10% (w/v) N-Laurylsarcosin, 100 mM Tris HCl pH 8,0, 20 mM EDTA.
Das Pflanzenmaterial wurde unter flüssigem Stickstoff in einem Mörser trituriert, um ein feines Pulver zu ergeben, und wurde in 2-ml-Eppendorfgefäße übertragen. Das gefrorene Pflanzenmaterial wurde dann mit einer Schicht von 1 ml von Lysepuffer abgedeckt (1 ml CTAB Puffer, 100 μl N-Laurylsarcosinpuffer, 20 μl (β-Mercaptoethanol und 10 μl Proteinase-K-Lösung, 10 mg/ml) und bei 60°C für eine Stunde bei kontinuierlichem Schütteln inkubiert. Das erhaltene Homogenat wurde in zwei Eppendorfgefäße (2 ml) verteilt und zweimal durch Schütteln mit demselben Volumen von Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) extrahiert. Zur Phasentrennung wurde jeweils eine Zentrifugation bei 8000 × g und Raumtemperatur für 15 Minuten ausgeführt. Die DNA wurde dann bei –70°C für 30 Minuten präzipitiert, wobei eiskaltes Isopropanol verwendet wurde. Die präzipitierte DNA wurde bei 4°C und 10.000 g für 30 Minuten sedimentiert und in 180 μl TE-Puffer resuspendiert (Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6). Für eine weitere Reinigung wurde die DNA mit NaCl (1,2 M Endkonzentration) behandelt und wieder bei –70°C für 30 Minuten präzipitiert, wobei das zweifache Volumen von absolutem Ethanol verwendet wurde. Nach einem Waschschritt mit 70% Ethanol wurde die DNA getrocknet und nacheinander in 50 μl von H₂O + RNAse (50 mg/ml Endkonzentration) aufgenommen. Die DNA wurde über Nacht bei 4°C gelöst, und der RNAse-Verdau wurde danach bei 37°C für 1 Stunde ausgeführt. Die DNA wurde bei 4°C gelagert.
Beispiel 3
Isolierung von Gesamt-RNA und Poly-(A)+RNA und Konstruktion einer cDNA-Bibliothek aus Physcomitrella patens
Für die Untersuchung von Transkripten wurde sowohl Gesamt-RNA als auch Poly-(A)+RNA isoliert. Die Gesamt-RNA wurde von 9 Tage alten Wildtyp-Protonemen erhalten, wobei dem GTC-Verfahren gefolgt wurde (Reski et al. 1994, Mol. Gen. Genet., 244: 352–359). Die Poly(A)+RNA wurde isoliert, wobei Dyna-Beads^R (Dynal, Oslo, Norway) verwendet wurden, wobei den Instruktionen des Protokoll des Herstellers gefolgt wurde. Nach Bestimmung der Konzentration der RNA oder der Poly (A)+RNA wurde die RNA durch Hinzufügen von 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat pH 4,6 und 2 Volumen Ethanol präzipitiert und bei –70°C gelagert.
Für die Konstruktion einer cDNA-Bibliothek wurde eine erste Strangsynthese unter Verwendung einer reversen Transkriptase des murinen Leukämievirus (Roche, Mannheim, Deutschland) und oligo-d(T)-Primern durchgeführt, und eine zweite Strangsynthese durch Inkubierung mit DNA-Polymerase I, Klenow-Enzym und RNAseH-Verdau bei 12°C (2h), 16°C (1 h) und 22°C (1 h). Die Reaktion wurde durch Inkubieren bei 65°C (10 min) und nachfolgendes Übertragen auf Eis gestoppt. Doppelsträngige DNA-Moleküle wurden durch T4-DNA-Polymerase (Roche, Mannheim) bei 37°C (30 min) abgestumpft. Nukleotide wurden durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Sephadex-G50-Spinsäulen entfernt. EcoRI-Adapter (Pharmacia, Freiburg, Deutschland) wurden mit den cDNA-Enden durch T4-DNA-Ligase (Roche, 12°C, über Nacht) ligiert und durch Inkubierung mit Polynukleotidkinase (Roche, 37°C, 30 min) phosphoryliert. Diese Mischung wurde auf einem niedrigschmelzenden Agarosegel getrennt. DNA-Moleküle größer als 300 Basenpaare wurden von dem Gel eluiert, phenolextrahiert, auf Elutip-D-Säulen (Schleicher und Schuell, Dassel, Deutschland) konzentriert und wurden mit Vektorarmen ligiert und in Lambda-ZAPII-Phagen oder Lambda-ZAP-Express-Phagen gepackt, wobei der Gigapack-Goldkit (Stratagene, Amsterdam, Niederlande) verwendet wurde, wobei Material des Herstellers verwendet wurde und den Instruktionen des Herstellers gefolgt wurde.
Beispiel 4
Sequenzieren und Funktionsannotierung von Physcomitrella-patens-ESTs
cDNA-Bibliotheken wie in Beispiel 3 beschrieben wurden zum DNA-Sequenzieren durch Standardverfahren verwendet, insbesondere durch das Kettenterminationsverfahren, welches den ABI-PRISM-Big-Dye-Terminatorzyklus-Sequenzierungs-Fertigreaktionskit (Perkin Elmer, Weiterstadt, Deutschland) verwendet. Zufallssequenzieren wurde ausgeführt nach einer präperativen Plasmidgewinnung aus cDNA-Bibliotheken über in-vivo-Massenschnitt, Retransformation und nachfolgendes Platieren von DH10B auf Agarplatten (Material- und Protokolldetails von Stratagene, Amsterdam, Niederlande. Plasmid-DNA wurde aus über Nacht gewachsen E.-coli-Kulturen, welche in Luria-Nährlösungsmedium (LB-Medium) enthaltend Ampicillin (siehe Sambrook et al. 1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) gewachsen waren, auf einem Qiagene-DNA-Präparationsroboter (Qiagen, Hilden) gemäß den Protokollen des Herstellers hergestellt. Sequenzierprimer mit den folgenden Nukleotidsequenzen wurden verwendet:
5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3' SEQ ID NO: 16
5'-CTAAAGGGAACAAAAGCTG-3 SEQ ID NO: 17
5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3' SEQ ID NO: 18
Sequenzen wurden unter Verwendung des Softwarepackets EST-MAX verarbeitet und annotiert, welches kommerziell durch Bio-Max (München, Deutschland) bereitgestellt wurde. Das Programm inkorporiert praktisch alle bioinformatischen Verfahren, welches für funktionelle und strukturelle Charakterisierung von Proteinsequenzen wichtig sind. Siehe http://pedant.mips.biochem.mpg.de für eine Referenz. Die wichtigsten Algorithmen, welche in EST-MAX eingeschlossen sind, sind: FASTA: Sehr empfindliche Sequenzdatenbanksuchen mit Schätzungen einer statistischen Signifikanz, Pearson W. R. (1990) Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA [Schneller und empfindlicher Sequenzvergleich mit FASTP und FASTA]. Methods Enzymol. 183: 63–98, BLAST: Sehr empfindliche Sequenzdatenbanksuchen mit Schätzungen einer statistischen Signifikanz. Altschul S. F., Gish W., Miller W., Myers E. W. und Lipman D. J. Basic local alignment search tool [Grundlegendes Suchwerkzeug zum lokalen Abgleich]. Journal of Molecular Biology 215: 403–10, PREDATOR: sekundäre Strukturvorhersage von einzelnen und mehrfachen Sequenzen mit hoher Genauigkeit. Frishman, D. und Argos, P. (1997) 75 % accuracy in protein secondary structure prediction [75% Genauigkeit in sekundärer Proteinstrukturvorhersage]. Proteins [Proteine], 27: 329–335, CLUSTALW: Mehrfacher Sequenzabgleich. Thompson, J. D., Higgins, D. G. und Gibson, T. J. (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice [CLUSTAL W: Verbessern der Empflindlichkeit von progressiven mehrfachen Sequenzabgleichen durch Sequenzgewichten, positionsspezifischen Strafen für Lücken (gap penalties) und Wahl der Gewichtungsmatrix]. Nucleic Acids Research, 22: 4673–4680, TMAP: Transmembran-Regionsvorhersage von mehrfach abgeglichenen Sequenzen. Persson, B. und Argos, P. (1994) Prediction of transmembrane segments in proteins utilising multiple sequence alignments [Vorhersage von Transmembransegmenten in Proteinen unter Verwendung von mehrfachen Sequenzabgleichen]. J. Mol. Biol. 237: 182–192, ALOM2: Transmembran-Regionsvorhersage von einzelnen Sequenzen. Klein, P., Kanehisa, M. und DeLisi, C. Prediction of protein function from sequence properties: A discriminate analysis of a database. [Vorhersage einer Proteinfunktion aus Sequenzeigenschaften: Eine Diskriminantenanalyse einer Datenbank]. Biochim. Biophys. Acta 787: 221–226 (1984). Version 2 von Dr. K. Nakai, PROSEARCH: Detektion von PROSITE-Proteinsequenzmustern. Kolakowski L. F. Jr., Leunissen J. A. M., Smith J. E. (1992) ProSearch: fast searching of protein sequences with regular expression patterns related to protein structure and function [ProSearch: Schnelles Suchen von Proteinsequenzen mit regulären Expressionmustern in Bezug auf Proteinstruktur und Funktion]. Biotechniques 13, 919–921, BLIMPS: Ähnlichkeitssuchen gegen eine Datenbank aus Blöcken ohne Lücke. J. C. Wallace und Henikoff S., (1992), PATMAT: Ein Such- und Extraktionsprogramm für Sequenz-, Muster- und Blockanfragen und Datenbanken, CABIOS 8: 249–254. Geschrieben von Bill Alford.
Beispiel 5
Identifizierung von Physcomitrella-patens-ORFs, welche zu PLC-1, PLC-2, 14-3-3P-1, 14-3-3P-2 und CBP-1 korrespondieren
Die teilweisen Physcomitrella-patens-cDNAs (ESTs), welche unten in Tabelle 1 gezeigt werden, wurden im Physcomitrella-patens-EST-Sequenzierprogramm durch BLAST-Analyse identifiziert, wobei das Programm EST-MAX verwendet wurde. Die Sequenzbezeichner, welche zu diesen ESTs korrespondieren, sind wie folgt: PLC-1 (SEQ ID NO: 1), PLC-2 (SEQ ID NO: 2), 14-3-3P-1 (SEQ ID NO: 3), 14-3-3P-2 (SEQ ID NO: 4) und CBP-1 (SEQ ID NO: 5). Tabelle 1

* Vergleichsbeispiele

Tabelle 2

Grad der Aminosäure-Identität und Ähnlichkeit von PpPLC-1 und anderen homologen Proteinen (es wurde ein paarweises Vergleichsprogramm verwendet: Strafe für Lücken (gap penalty): 10, Strafe für erweiterte Lücken (gap extension penalty): 0,1, Score-Matrix: blosum62)

Tabelle 3

Grad der Aminosäure-Identität und Ähnlichkeit von PpPLC-2 und anderen homologen Proteinen (es wurde ein paarweises Vergleichsprogramm verwendet: Strafe für Lücken (gap penalty): 10, Strafe für erweiterte Lücken (gap extension penalty): 0,1, Score-Matrix: blosum62)

Tabelle 4
Grad der Aminosäure-Identität und Ähnlichkeit von Pp14-3-3P-1 und anderen homologen Proteinen (es wurde ein paarweises Vergleichsprogramm verwendet: Strafe für Lücken (gap penalty): 10, Strafe für erweiterte Lücken (gap extension penalty): 0,1, Score-Matrix: blosum62)
Tabelle 5

Grad der Aminosäure-Identität und Ähnlichkeit von Pp14-3-3P-2 und anderen homologen Proteinen (es wurde ein paarweises Vergleichsprogramm verwendet: Strafe für Lücken (gap penalty): 10, Strafe für erweiterte Lücken (gap extension penalty): 0,1, Score-Matrix: blosum62)

Tabelle 6

Grad der Aminosäure-Identität und Ähnlichkeit von PpCBP-1 und anderen homologen Proteinen (es wurde ein paarweises Vergleichsprogramm verwendet: Strafe für Lücken (gap penalty): 10, Strafe für erweiterte Lücken (gap extension penalty): 0,1, Score-Matrix: blosum62)

Beispiel 6
Klonieren der Physcomitrella-patens-cDNA über die gesamte Länge kodierend für PLC-1, PLC-2, 14-3-3P-1, 14-3-3P-2 und CBP-1
Um die Klone kodierend PLC-1, PLC-2, 14-3-3P-2 und CBP-1 aus Physcomitrella patens zu isolieren, wurden cDNA-Bibliotheken mit einem SMART-RACE-DNA-Amplifizierungskit (Clontech Laboratories) geschaffen, wobei den Instruktionen des Herstellers gefolgt wurde. Gesamt-RNA, welche wie in Beispiel 3 beschrieben isoliert wurde, wurde als Template verwendet. Die Kulturen wurden vor RNA-Isolierung wie folgt behandelt: Salzstress: 2, 6, 12, 24, 48 Stunden mit 1-M-NaCl-supplementiertem Medium, Kältestress: 4°C an denselben Zeitpunkten wie für Salz, Trockenheitsstress: Kulturen wurden auf trockenem Filterpapier zu denselben Zeitpunkten wie für Salzinkubation.
5'-RACE-Protokoll
Die EST-Sequenzen PLC-1 (SEQ ID NO: 1), PLC-2 (SEQ ID NO: 2), 14-3-3P2 (SEQ ID NO: 4) und CBP-1 (SEQ ID NO: 5), welche in der Datenbanksuche wie in Beispiel 5 beschrieben identifiziert wurden, wurden zur Konstruktion von Oligos für RACE (siehe Tabelle 7) verwendet. Die ausgedehnten Sequenzen für das Gen wurden durch Durchführen einer schnellen Amplifizierung von cDNA-Enden-Polymerase-Kettenreaktion (RACE PCR) erhalten, wobei der Advantage-2-PCR-Kit (Clontech Laboratories) und der SMART-RACE-cDNA-Amplifizierungskit (Clontech Laboratories) verwendet wurde und ein Biometra T3-Thermocycler verwendet wurde, wobei den Instruktionen des Herstellers gefolgt wurde. Die Sequenzen, welche durch die RACE-Reaktionen erhalten wurden, entsprachen den kodierenden Regionen von PLC-1, PLC-2, 14-3-3P-2 und CBP-1 über die gesamte Länge und wurden zur Konstruktion von Oligos zum Klonieren über die gesamte Länge der jeweiligen Gene verwendet (siehe unten Amplifizierung über die gesamte Länge).
Amplifizierung über die gesamte Länge
Klone über die gesamte Länge, welche zu PLC-1 (SEQ ID NO: 1), PLC-2 (SEQ ID NO: 2), 14-3-3P-1 (SEQ ID NO: 3), 14-3-3P-2 (SEQ ID NO: 4) und CBP-1 (SEQ ID NO: 5) korrespondieren, wurden durch Durchführen einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit genspezifischen Primern (siehe Tabelle 7) und dem ursprünglichen EST als Template erhalten. Die Bedingungen für die Reaktion waren Standardbedingungen mit PWO-DNA-Polymerase (Roche). PCR wurde gemäß Standardbedingungen und gemäß den Protokollen des Herstellers durchgeführt (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual [Molekulares Klonen, ein Laborhandbuch). 2. Auflage. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N. Y., Biometra T3 Thermocycler). Die Parameter für die Reaktion waren: fünf Minuten bei 94°C gefolgt von fünf Zyklen von einer Minute bei 94°C, eine Minute bei 50°C und 1,5 Minuten bei 72°C. Diesem folgten fünfundzwanzig Zyklen von einer Minute 94°C, einer Minute 65°C und 1,5 Minuten 72°C.
Die amplifizierten Fragmente wurden aus Agarosegel mit einem QIAquick Gelextraktionskit (Qiagen) extrahiert und in den TOPO-pCR-2.1-Vektor (Invitrogen) ligiert, wobei den Instruktionen des Herstellers gefolgt wird. Rekombinante Vektoren wurden in Top10-Zellen (Invitrogen) transformiert, wobei Standardbedingungen verwendet wurden (Sambrook et al. 1989. Molecular Cloning, A Laboratory Manual [Molekulares Klonen, ein Laborhandbuch. 2. Auflage. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY). Transformierte Zellen wurden auf LB-Agar enthaltend 100 μg/ml Carbenicillin, 0,8 mg X-gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid) und 0,8 mg IPTG (Isopropylthio-β-D-galactosid) selektiert, welche über Nacht bei 37°C wachsen gelassen wurden. Weiße Kolonien wurden selektiert und verwendet, um 3 ml flüssiges LB enthaltend 100 μg/ml Ampicillin zu inokulieren, und wurden über Nacht bei 37°C wachsen gelassen. Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des QIAprep-Spin-Miniprep-Kits extrahiert (Qiagen), wobei den Instruktionen des Herstellers gefolgt wurde. Analysen nachfolgender Klone und Restriktionskartierungen wurde gemäß molekularbiologischen Standardtechniken durchgeführt (Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual [Molekulares Klonen, ein Laborhandbuch. 2. Auflage. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY)).
Tabelle 7
Beispiel 7
Konstruieren von stresstoleranten Arabidopsis-Pflanzen durch Überexprimieren der Gene PLC-1, PLC-2, 14-3-3P-1, 14-3-3P-2 und CBP-1
Binärvektorkonstruktion: pACGH101
Das Plasmidkonstrukt pACGH101 wurde mit PstI (Roche) und FseI (NEB) gemäß den Instruktionen des Herstellers verdaut. Das Fragment wurde durch Agarosegel gereinigt und über das Qiaex-II-DNA-Extraktionskit (Qiagen) extrahiert. Dies führt zu einem Vektorfragment mit dem Arabidopsis-Actin2-Promotor mit internem Intron und dem OCS3-Terminator. Primer für eine PCR-Amplifizierung des NPTII-Gens wurden wie folgt konstruiert:
5'NPT-Pst:
GCG-CTG-CAG-ATT-TCA-TTT-GGA-GAG-GAC-ACG (SEQ ID NO: 33)
3'NPT-Fse:
CGC-GGC-CGG-CCT-CAG-AAG-AAC-TCG-TCA-AGA-AGG-CG (SEQ ID NO: 34).
Das 0,9-Kilobasen-NPTII-Gen wurde über PCR von pCambia-2301 Plasmid-DNA amplifiziert [94°C 60 sek, {94°C 60 sek, 61°C (–0,1°C pro Zyklus) 60 sek, 72°C 2min} × 25 Zyklen, 72°C 10 min auf einer Biometra-T-Gradientenmaschine] und über dem Qiaquick-PCR-Extraktionskit (Qiagen) gemäß den Instruktionen des Herstellers gereinigt. Die PCR-DNA wurde dann in den pCR-BluntII-TOPO-Vektor (Invitrogen) gemäß den Instruktionen des Herstellers subkloniert (NPT-Topo-Konstrukt). Diese Ligationen wurden in Top10-Zellen (Invitrogen) transformiert und auf LB-Platten mit 50 ug/ml Kanamycin-Sulfat über Nacht bei 37°C wachsen gelassen. Kolonien wurden dann zum Inokulieren von 2 ml LB-Medien mit 50 ug/ml Kanamycin-Sulfat verwendet und über Nacht bei 37°C wachsen gelassen. Plasmid-DNA wurde gewonnen, wobei der Qiaprep-Spin-Miniprep-Kit (Qiagen) verwendet wurde, und sowohl in der 5'- und der 3'-Richtung sequenziert, wobei Standardbedingungen verwendet wurden. Eine nachfolgende Analyse der Sequenzdaten unter Verwendung der VectorNTI-Software zeigte, dass keine PCR-Fehler in der NPTII-Gensequenz vorhanden waren.
Das NPT-Topo-Konstrukt wurde dann mit PstI (Roche) und FseI (NEB) gemäß den Instruktionen des Herstellers verdaut. Das 0,9-Kilobasen-Fragment wurde auf Agarosegel gereinigt und durch ein Qiaex-II-DNA-Extraktionskit (Qiagen) extrahiert. Das Pst/Fse-Insertfragment von NPT-Topo und das Pst/Fse-Vektorfragment von pACGH101 wurden dann zusammenligiert, wobei T4-DNA-Ligase (Roche) verwendet wurde, wobei den Instruktionen des Herstellers gefolgt wurde. Die Ligation wurde dann in Top10-Zellen (Invitrogen) unter Standardbedingungen transformiert, wobei das pBPSsc019-Konstrukt gebildet wurde. Kolonien wurden auf LB-Platten mit 50 ug/ml Kanamycin-Sulfat selektiert und über Nacht bei 37°C wachsen gelassen. Diesen Kolonien wurden dann zum Inokulieren von 2 ml LB-Medien mit 50 ug/ml Kanamycin-Sulfat verwendet und über Nacht bei 37°C wachsen gelassen. Plasmid-DNA wurde gewonnen, wobei der Qiaprep-Spin-Miniprep-Kit (Qiagen) verwendet wird, wobei den Instruktionen des Herstellers gefolgt wurde.
Das pBPSSC019-Konstrukt wurde mit KpnI und BsaI (Roche) gemäß den Instruktionen des Herstellers verdaut. Das Fragment wurde über Agarosegel gereinigt und dann über dem Qiaex-II-DNA-Extraktionskit (Qiagen) nach seinen Instruktionen extrahiert, was zu einer 3-Kilobasen-Act-NPT-Kassette führte, welche den Arabidopsis-Actin2-Promotor mit internem Intron, das NPTH-Gen und den OCS3-Terminator einschloss.
Der pBPSJH001 Vektor wurde mit SpeI und ApaI (Roche) verdaut, und das stumpfe Ende wurde mit Klenow-Enzym und 0,1 mM dNTPs (Roche) gemäß den Instruktionen des Herstellers gefüllt. Dies bildete ein 10,1-Kilobasen-Vektorfragment minus der Gentamycin-Kassette, welche durch Selbstligieren mit T4-DNA-Ligase (Roche) rezirkularisiert wurde und in Top10-Zellen (Invitrogen) unter Standardbedingungen transformiert wurde. Transformierte Zellen wurden auf LB-Agar selektiert, welcher 50 μg/ml Kanamycin-Sulfat enthielt, und über Nacht bei 37°C wachsen gelassen. Kolonien wurden dann zum Inokulieren von 2 ml flüssigem LB enthaltend 50 μg/ml Kanamycin-Sulfat verwendet und über Nacht bei 37°C wachsen gelassen. Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des QIAprep-Spin-Miniprep-Kits extrahiert (Qiagen), wobei den Instruktionen des Herstellers gefolgt wurde. Das rezirkularisierte Plasmid wurde dann mit KpnI (Roche) verdaut und aus Agarosegel über das Qiaex-II-DNA-Extraktionskit (Qiagen) gemäß den Instruktionen des Herstellers extrahiert.
Das Kpn-geschnittene Act-NPT-Insert und der Kpn-geschnittene rezirkularisierte pBPSJH001-Vektor wurden dann zusammenligiert, wobei T4-DNA-Ligase (Roche) verwendet wurde, und in Top10-Zellen (Invitrogen) gemäß den Instruktionen des Herstellers transformiert. Das resultierende Konstrukt pBPSsc022 enthielt nun den Superpromotor, das GUS-Gen, den NOS-Terminator und die Act-NPT-Kassette. Transformierte Zellen wurden auf LB-Agar selektiert, welcher 50 μg/ml Kanamycin-Sulfat enthielt, und über Nacht bei 37°C wachsen gelassen. Kolonien wurden dann zum Inokulieren von 2 ml flüssigem LB enthaltend 50 μg/ml Kanamycin-Sulfat verwendet und über Nacht bei 37°C wachsen gelassen. Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des QIAprep-Spin-Miniprep-Kits extrahiert (Qiagen), wobei den Instruktionen des Herstellers gefolgt wurde. Nach Bestätigung des Ligationserfolgs durch Restriktionsverdau wurde pBPSsc022-Plasmid-DNA weiter vermehrt und gewonnen, wobei das Plasmid-Midiprep-Kit (Qiagen) verwendet wurde, wobei den Instruktionen des Herstellers gefolgt wurde.
Subklonieren von PLC-1, PLC-2, 14-3-3P-1, 14-3-3P-2 und CBP-1 in den Binärvektor
Die Fragmente, welche die verschiedenen Physcomitrella-patens-Signaltransduktionsfaktoren enthielten, wurden von den rekombinanten PCR2.1-TOPO-Vektoren durch doppelten Verdau mit Restriktionsenzymen (siehe Tabelle 8) gemäß den Instruktionen des Herstellers subkloniert. Das Teilsequenzfragment wurde aus Agarosegel mit einem QIAquick-Gelextraktionskit (QIAgen) gemäß den Instruktionen des Herstellers ausgeschnitten und in den Binärvektor pBPSsc022 ligiert, mit geeigneten Enzymen gespalten (siehe Tabelle 8) und vor der Ligation dephosphoryliert. Der resultierende rekombinante pBPSsc022-Vektor enthielt den korrespondierenden Transkriptionsfaktor in der Sense-Orientierung unter der Kontrolle des konstitutiven Superpromotors.
Tabelle 8
Aufgelistet sind die Namen der verschiedenen Konstrukte der Physcomitrella-patens-Transkriptionsfaktoren, welche zur Pflanzentransformation verwendet wurden
Agrobacterium-Transformation
Die rekombinanten Vektoren wurden in Agrobacterium tumefaciens C58C1 und PMP90 gemäß Standardbedingungen transformiert (Hoefgen und Willmitzer, 1990).
Pflanzentransformation
Arabidopsis-thaliana-Ökotyp C24 wurden wachsen gelassen und gemäß Standardbedingungen transformiert (Bechtold 1993, Acad. Sci. Paris. 316: 1194–1199, Bent et al. 1994, Science 265: 1856–1860).
Screenen von transformierten Pflanzen
T1-Saaten wurden gemäß Standardprotokollen sterilisiert (Xiong et al. 1999, Plant Molecular Biology Reporter 17: 159–170). Saaten wurden auf 1/2 Murashige- und Skoog-Medien (MS) (Sigma-Aldrich) pH 5,7 mit KOH, 0,8% Agar und supplementiert mit 1% Saccharose, 0,5 g/L 2-[N-Morpholino]-ethansulfonsäure (MES) (Sigma-Aldrich), 50 μg/ml Kanamycin (Sigma-Aldrich), 500 μg/ml Carbenicillan (Sigma-Aldrich) und 2 μg/ml Benomyl (Sigma-Aldrich) platiert. Saaten auf Platten wurden für vier Tage bei 4°C vernalisiert. Die Saaten wurden in einer Klimakammer bei einer Lufttemperatur von 22°C und Lichtintensität von 40 mikromol^–1m2 (weißes Licht, Leuchtstoffröhre Philips TL 65W/25) und einem Tageslängenzyklus mit 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkelheit gekeimt. Transformierte Sämlinge wurden nach 14 Tagen selektiert und auf 1/2 MS-Medien pH 5,7 mit KOH 0,6% Agarplatten supplementiert mit 0,6% Agar, 1 % Saccharose, 0,5 g/L MES (Sigma-Aldrich) und 2 μg/ml Benomyl (Sigma-Aldrich) übertragen, und man ließ sie für fünf-sieben Tage erholen.
Trockenheitstoleranzscreenen
T1-Sämlinge wurden auf trockenes, steriles Filterpapier in einer Petrischale übertragen und erlaubt für zwei Stunden bei 80% RF (relative Feuchtigkeit) in einem Percieval-Wachstumskabinet MLR-350H, mikromol^–1m2 (weißes Licht, Leuchtstoffröhre Philips TL 65W/25) zu trocknen. Die RF wurde dann auf 60% vermindert, und die Sämlinge wurden für weitere acht Stunden getrocknet. Die Sämlinge wurden dann herausgenommen und in 1/2-MS 0,6% Agarplatten supplementiert mit 2 μg/ml Benomyl (Sigma-Aldrich) und 0,5 g/L MES (Sigma-Aldrich) gebracht und nach fünf Tagen bewertet.
Unter Trockenheitsstressbedingungen zeigten PpPLC-1-überexprimierende Arabidopsis-thaliana-Pflanzen eine 70%ige (7 Überlebende von 10 gestressten Pflanzen) Überlebensrate beim Stressscreenen, PpPLC-2 98% (50 Überlebende von 51 gestressten Pflanzen), Pp14-3-3P-1 80% (12 Überlebende von 15 gestressten Pflanzen), Pp14-3-3P-2 100% (22 Überlebende von 22 gestressten Pflanzen), und PpCBP-1 100% (52 Überlebende von 52 gestressten Pflanzen), während die untransformierte Kontrolle nur eine 28%ige Überlebensrate zeigte. Es ist bemerkenswert, dass die Analysen von diesen transgenen Linien mit T1-Pflanzen durchgeführt wurden, und deshalb werden die Ergebnisse besser sein, wenn ein homozygoter starker Exprimierer gefunden wird.
Tabelle 9 Zusammenfassung der Trockenheitsstresstests
Frosttoleranzscreenen
Sämlinge wurden in Petrischalen enthaltend 1/2 MS 0,6% Agar supplementiert mit 2% Saccharose und 2 ug/ml Benomyl gebracht. Nach vier Tagen wurden die Sämlinge bei 4°C für 1 Stunde inkubiert und dann mit geschabtem Eis bedeckt. Die Sämlinge wurden dann in eine Environmental-Specialist-ES2000-Umweltkammer gebracht und für 3,5 Stunden beginnend bei –1,0°C inkubiert, wobei um –1°C pro Stunde gesenkt wurde. Die Sämlinge wurden dann bei –5,0°C für 24 Stunden inkubiert, und dann ließ man die Sämlinge bei 5°C für 12 Stunden tauen. Das Wasser wurde abgegossen, und die Sämlinge wurden nach 5 Tagen bewertet.
Unter Froststressbedingungen zeigten PpPLC-2-überexprimierende Arabidopsis-thaliana-Pflanzen einer 78%ige (18 Überlebende von 23 gestressten Pflanzen) Überlebensrate, Pp14-3-3P-1 100% (6 Überlebende von 6 gestressten Pflanzen), während die untransformierte Kontrolle nur eine 2%ige (1 Überlebende bei 48 getesteten Pflanzen) Überlebensrate zeigte. Es ist bemerkenswert, dass die Analysen von diesen transgenen Linien mit T1-Pflanzen durchgeführt wurden, und deshalb werden die Ergebnisse besser sein, wenn ein homozygoter starker Exprimierer gefunden wird.
Tabelle 10 Zusammenfassung der Froststresstests
Salztoleranzscreenen
Sämlinge wurden auf Filterpapier durchtränkt in 1/2 MS übertragen und auf 1/2 MS 0,6% Agar supplementiert mit 2 μg/ml Benomyl am Tag vor dem Stressscreenen gebracht. Für das Salztoleranzscreenen wurde das Filterpapier mit den Sämlingen auf Stapel von sterilem Filterpapier durchtränkt mit 50 mM NaCl in einer Petrischale gebracht. Nach zwei Stunden wurde das Filterpapier mit den Sämlingen auf Stapel von sterilem Filterpapier durchtränkt mit 200 mM NaCl in einer Petrischale gebracht. Nach zwei Stunden wurde das Filterpapier mit den Sämlingen auf Stapel von sterilem Filterpapier durchtränkt mit 600 mM NaCl in einer Petrischale gebracht. Nach 10 Stunden wurden die Sämlinge in Petrischalen enthaltend 1/2 MS 0,6% Agar supplementiert mit 2 μg/ml Benomyl gebracht. Die Sämlinge wurden nach 5 Tagen bewertet.
Die transgenen Pflanzen werden auf ihre verbesserte Salztoleranz gescreent, was zeigt, dass die Transgenexpression eine Salztoleranz vermittelt.
Beispiel 8
Detekion der PLC-1-, PLC-2-, 14-3-3P-1-, 14-3-3P-2- und CBP-1-Transgene in den transgenen Arabidopsis-Linien
Um die Anwesenheit der PpPLC-1-, PpPLC-2-, Pp14-3-3P-1-, Pp14-3-3P-2- und PpCBP-1-Transgene in transgenen Arabidopsis-Linien zu prüfen, wurde PCR auf genomischer DNA durchgeführt, welche die RNA-Proben kontaminiert, welche wie in Beispiel 9 unten beschrieben genommen wurden. 2,5 μl RNA-Probe wurde in einer 50 μl-PCR-Reaktion verwendet, wobei Taq-DNA-Polymerase (Roche Molecular Biochemicals) gemäß den Instruktionen des Herstellers verwendet wurde. Der Primer für die Binärvekterregion (5'GCTGACACGCCAAGCCTCGCTAGTC-3') (SEQ ID NO: 35) und der genspezifische 3'-Primer für jedes Transgen (siehe Tabelle 7), welcher für die RT-PCR mit voller Länge verwendet wurde, wurde für die PCR verwendet. Das PCR-Prgramm war wie folgt: 30 Zyklen 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 62°C und 4 Minuten bei 70°C, gefolgt von 10 Minuten bei 72°C. Ein Binärvektorplasmid mit den klonierten Transgenen wurde als positive Kontrolle verwendet, und die Wildtyp-C24-genomische DNA wurde als negative Kontrolle in den PCR-Reaktionen verwendet. 10 μl PCR-Reaktion wurde auf 0,8% Agarose-Ethidiumbromidgel analysiert.
Die Transgene mit der erwarteten Größe (für PpPLC-1: 2,3-kb-Fragment, PpPLC-2: 2,2-kb-Fragment, Pp14-3-3P-1: 0,9-kb-Fragment, Pp14-3-3P-2: 0,9-kb-Fragment, PpCBP-1: 1,8-kb-Fragment) wurden erfolgreich von den T1-transgenen Linien und von der positiven Kontrolle amplifiziert, aber nicht vom Wildtyp C24. Dieses Ergebnis zeigte, dass die T1-transgenen Pflanzen wenigstens eine Kopie der Transgene enthalten. Es gab kein Anzeichen einer Existenz von entweder identischen oder sehr ähnlichen in nichtransformierten Arabidopsis thaliana, welche in diesem Verfahren in den Wildtyppflanzen amplifiziert werden könnte.
Beispiel 9
Defektion der PLC-1-, PLC-2-, 14-3-3P-1-, 14-3-3P-2- und CBP-1-transgenen mRNA in transgenen Arabidopsis-Linien
Transgenexpression wurde unter Verwendung von RT-PCR detektiert. Gesamt-RNA wurde aus stressbehandelten Pflanzen isoliert, wobei ein Verfahren adaptiert von (Verwoerd et al. 1989. NAR 17:2362) verwendet wurde. Blattproben (50–100 mg) wurden gesammelt und zu einem feinen Pulver in flüssigem Stickstoff gemahlen. Gemahlenes Gewebe wurde in 500 μl einer 80°C 1:1 Mischung von Phenol zu Extraktionspuffer (100 mM LiCl, 100 mM Tris pH 8, 10 mM EDTA, 1 SDS) resuspendiert, gefolgt von kurzem Vortexten zum Mischen. Nach dem Hinzufügen von 250 μl Chloroform wurde jede Probe kurz gevortext. Proben wurden dann für 5 Minuten bei 12,000 × g zentrifugiert. Die obere wässrige Phase wurde in ein frisches Eppendorfröhrchen überführt. RNA wurde durch Hinzufügen von 1/10 Volumen 3M Natriumacetat und 2 Volumina 95% Ethanol präzipitiert. Die Proben wurden durch Inversion gemischt und für 30 Minuten auf Eis gebracht. RNA wurde durch Zentrifugation bei 12,000 × g für 10 Minuten pelletiert. Der Überstand wurde entfernt und die Pellets kurz luftgetrocknet. RNA-Probenpellets wurden in 10 μl DEPC-behandeltem Wasser resuspendiert. Um kontaminierende DNA aus den Proben zu entfernen, wurde jede Probe mit RNase-freier DNase (Roche) gemäß den Empfehlungen des Herstellers behandelt. cDNA wurde aus der Gesamt-RNA synthetisiert, wobei der cDNA-Synthesekit für die Synthese des ersten Strangs (1^st Strand cDNA synthesis kit, Boehringer Mannheim) verwendet wurde, wobei den Empfehlungen des Herstellers gefolgt wurde.
PCR-Amplifizierung eines genspezifischen Fragments aus der synthetisierten cDNA wurde unter Verwendung der Taq-DNA-Polymerase (Roche) und genspezifischer Primer wie unten gezeigt in der folgenden Reaktion durchgeführt: 1 × PCR-Puffer, 1,5 mM MgCl₂, 0,2 μM jedes Primers, 0,2 μM dNTPs, 1 Einheit Polymerase, 5 μl cDNA von der Synthesereaktion. Amplifizierung wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Vordenaturierung 94°C 3 Minuten, Denaturierung 94°C 30 Sekunden, Zusammenlagerung 62°C 30 Sekunden Verlängerung 72°C 2 Minuten, 30 Zyklen, Verlängerung 72°C 5 Minuten, Stopp 4°C andauernd. PCR-Produkte wurden auf einem 1%-Agarosegel laufen gelassen, mit Ethidiumbromid gefärbt und unter UV-Licht visualisiert, wobei das Quantity-One-Geldokumentationssystem (Bio-Rad) verwendet wurde.
Expression des Transgenes wurde in den T1-transgenen Linien detektiert. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Transgene in den transgenen Linien exprimiert werden, und legte ausdrücklich nahe, dass ihr Genprodukt die Pflanzen-Stresstoleranz in den transgenen Linien verbesserte. In Übereinstimmung mit der früheren Erklärung konnte keine Expression identischer oder sehr ähnlicher endogener Gene durch dieses Verfahren detektiert werden. Diese Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit den Daten von Beispiel 7.
Tabelle 11
Primer, welche für die Amplifikation der jeweiligen transgenen mRNA in einer PCR unter Verwendung einer RNA isoliert aus transgenen Arabidopsis-Pflanzen als Template verwendet werden.
Beispiel 10
Konstruieren von stresstoleranten Sojabohnenpflanzen durch Überexpression des PLC-1-, PLC-2-, 14-3-3P-1-, 14-3-3P-2- und CBP-1-Gens
Die Konstrukte pBPSSY009, pBPSYW009, pBPSJYW018, pBPSSY031 und pBPSLVM182 wurden verwendet, um Sojabohnen wie unten beschrieben zu transformieren.
Saaten der Sojabohne wurden mit 70 % Ethanol für 4 Minuten bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Schütteln gefolgt von 20% (v/v) Clorox supplementiert mit 0,05 % (v/v) Tween für 20 Minuten unter kontinuierlichem Schütteln oberflächensterilisiert. Dann wurde die Saat 4 mal mit destilliertem Wasser gespült und auf befeuchtetes steriles Filterpapier in eine Petrischale bei Raumtemperatur für 6 bis 39 Stunden gebracht. Die beschichtete Saat wurde gepellt, und Kotyledonen werden von der embryonalen Achse getrennt. Die embryonale Achse wurde untersucht, um sicherzustellen, dass die meristematische Region nicht beschädigt wurde. Die ausgeschnittenen embryonalen Achsen wurden in einer halb offenen sterilen Petrischale gesammelt und bis zu einem Feuchtigkeitsgehalt von weniger als 20% (Frischgewicht) in einer versiegelten Petrischale bis zur weiteren Verwendung luftgetrocknet.
Eine Agrobacterium-tumefaciens-Kultur wurde aus einer einzelnen Kolonie in festem LB-Medium plus geeignete Antibiotika (z. B. 100 mg/l Streptomycin, 50 mg/l Kanamycin) hergestellt, gefolgt von Wachstum der einzelnen Kolonie in flüssigem LB-Medium bis zu einer optischen Dichte von 0,8 bei 600 nm. Dann wurde die Bakterienkultur bei 7000 rpm für 7 Minuten bei RT pelletiert und in MS-Medium (Murashige und Skoog, 1962) supplementiert mit 100 μM Acetosyringon resuspendiert. Die Bakterienkulturen wurden in diesem Präinduktionsmedium für 2 Stunden bei Raumtemperatur vor Verwendung inkubiert. Die Achse des zygotischen Sojabohnen-Saatembryos bei annähernd 15% Feuchtigkeitsgehalt wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur mit der vorinduzierten Agrobacterium- Suspensionskultur imbibiert. Die Embryos werden aus der Imbibitionskultur entfernt und wurden auf Petrischalen übertragen, welche festes MS-Medium supplementiert mit 2% Saccharose enthalten, und für 2 Tage im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Alternativ wurden die Embryos werden auf befeuchtetes (flüssiges MS-Medium) steriles Filterpapier in einer Petrischale gebracht und unter denselben Bedingungen wie oben beschrieben inkubiert. Nach dieser Zeit wurden die Embryos auf entweder festes oder flüssiges MS-Medium supplementiert mit 500 mg/L Carbenicillin oder 300 mg/L Cefotaxim übertragen, um die Agrobakterien zu töten. Das Flüssigmedium wurde zum Befeuchten des sterilen Filterpapiers verwendet. Die Embryos wurden für 4 Wochen bei 25°C unter 150 μmolm^–2sec^–1 und 12 Stunden Photoperiode inkubiert. Als die Sämlinge Wurzeln gebildet hatten, wurden sie auf sterilen Metromix-Boden übertragen. Das Medium der in-vitro-Pflanzen wurde vor Übertragen der Pflanzen auf den Boden abgewaschen. Die Pflanzen wurden unter einer Plastikabdeckung für 1 Woche behalten, um den Akklimatisierungsprozess zu unterstützen. Dann wurden die Pflanzen in einen Wuchsraum übertragen, wobei sie bei 25°C unter 150 μmolm^–2sec^–1 Lichtintensität und 12 Stunden Photoperiode für etwa 80 Tage inkubiert wurden.
Die transgenen Pflanzen wurden dann auf ihre verbesserte Trockenheits-, Salz- und Kältetoleranz mit dem Screeningverfahren, welches in Beispiel 7 beschrieben ist, gescreent, was zeigt, dass die Transgenexpression eine Stresstoleranz vermittelt.
Beispiel 11
Konstruieren von stresstoleranten Raps/Canolapflanzen durch Überexpression der PLC-1-, PLC-2-, 14-3-3P-1-, 14-3-3P-2- und CBP-1-Gene
Die Konstrukte pBPSSY009, pBPSYW009, pBPSJYW018, pBPSSY031 und pBPSLVM182 wurden verwendet, um Raps/Canola wie unten beschrieben zu transformieren.
Das hierin beschriebene Verfahren der Pflanzentransformation ist ebenso auf Brassica und andere Ertragspflanzen anwendbar. Saaten von Canola werden mit 70 Ethanol für 4 Minuten bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Schütteln gefolgt von 20% (v/v) Clorox supplementiert mit 0,05 % (v/v) Tween für 20 Minuten bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Schütteln oberflächensterilisiert. Dann wird die Saat 4 mal mit destilliertem Wasser gespült und auf befeuchtetes steriles Filterpapier in eine Petrischale bei Raumtemperatur für 18 Stunden gebracht. Dann werden die Saathüllen entfernt, und die Saaten werden über Nacht in einer halb offenen sterilen Petrischale luftgetrocknet. Während dieser Dauer verlieren die Saaten annähernd 85% ihres Wassergehalts. Die Saaten werden dann bei Raumtemperatur in einer versiegelten Petrischale bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt. DNA-Konstrukte und embryonale Imbibition sind wie in Beispiel 10 beschrieben. Proben der primären transgenen Pflanzen (T0) werden durch PCR analysiert, um die Anwesenheit von T-DNA zu bestätigen. Diese Ergebnisse werden durch Southern-Hybridisierung bestätigt, in welcher DNA auf einem 1 %-Agarosegel elektrophoretisiert und auf eine positiv geladene Nylonmembran (Roche Diagnostika) übertragen wird. Der PCR-DIG-Sondensynthesekit (Roche Diagnostika) wird zum Herstellen einer digoxigeninmarkierten Sonde durch PCR verwendet und wie durch den Hersteller empfohlen verwendet.
Die transgenen Pflanzen werden dann auf ihre verbesserte Stresstoleranz mit dem Screeningverfahren, welches in Beispiel 7 beschrieben ist, gescreent, was zeigt, dass die Transgenexpression eine Trockenheitstoleranz vermittelt.
Beispiel 12
Konstruieren von stresstoleranten Maispflanzen durch Überexpression der PLC-1-, PLC-2-, 14-3-3P-1-, 14-3-3P-2- und CBP-1-Gene
Die Konstrukte pBPSSY009, pBPSYW009, pBPSJYW018, pBPSSY031 und pBPSLVM182 wurden verwendet, um Mais wie unten beschrieben zu transformieren.
Transformation von Mais (Zea mays L.) wird mit dem Verfahren beschrieben von Ishida et al. 1996. Nature Biotech 14745–50) durchgeführt. Unreife Embryos werden mit Agrobacterium tumefaciens kokultiviert, welche "superbinäre" Vektoren tragen, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Dieses Verfahren stellt eine Transformationseffizienz zwischen 2,5% und 20% bereit. Die transgenen Pflanzen werden dann auf ihre verbesserte Trockenheits-, Salz- und Kältetoleranz mit dem Screeningverfahren, welches in Beispiel 7 beschrieben ist, gescreent, was zeigt, dass die Transgenexpression eine Stresstoleranz vermittelt.
Beispiel 13
Konstruieren von stresstoleranten Weizenpflanzen durch Überexpression der PLC-1-, PLC-2-, 14-3-3P-1-, 14-3-3P-2- und CBP-1-Gene
Die Konstrukte pBPSSY009, pBPSYW009, pBPSJYW018, pBPSSY031 und pBPSLVM182 wurden verwendet, um Weizen wie unten beschrieben zu transformieren.
Transformation von Weizen wird mit dem Verfahren beschrieben von Ishida et al. 1996. Nature Biotech 14745–50) durchgeführt. Unreife Embryos werden mit Agrobacterium tumefaciens kokultiviert, welche "superbinäre" Vektoren tragen, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Dieses Verfahren stellt eine Transformationseffizienz zwischen 2,5% und 20% bereit. Die transgenen Pflanzen werden dann auf ihre verbesserte Stresstoleranz mit dem Screeningverfahren, welches in Beispiel 7 beschrieben ist, gescreent, was zeigt, dass die Transgenexpression eine Trockenheitstoleranz vermittelt.
Beispiel 14
Identifizierung von homologen und heterologen Genen
Gensequenzen können zum Identifizieren homologer oder heterologer Gene aus cDNA oder genomischen Bibliotheken verwendet werden. Homologe Gene (z. B. cDNA-Klone über die gesamte Länge) können über Nukleinsäurehybridisierung isoliert werden, wobei zum Beispiel cDNA-Bibliotheken verwendet werden. Abhängig von der Abundanz des interessierenden Gens werden 100.000 bis zu 1.000.000 rekombinante Bakteriophagen platiert und auf Nylonmembranen übertragen. Nach Denaturierung mit Alkali wird DNA auf der Membran durch z. B. eine UV-Kreuzverbindung immobilisiert. Hybridisierung wird unter hohen Stringenzbedingungen ausgeführt. Wässrige Hybridisierung und Waschen wird bei einer Ionenstärke von 1 M NaCl und einer Temperatur von 68°C durchgeführt. Hybridisierungssonden werden z. B. durch radioaktive (³²p) Nick-Transkriptionsmarkierung (High Prime, Roche, Mannheim, Deutschland) erzeugt. Signale werden durch Autoradiographie detektiert.
Teilweise homologe oder heterologe Gene, welche verwandt, aber nicht identisch sind, können in einer Weise analog zum obigen-beschriebenen Verfahren identifiziert werden, wobei eine Hybridisierung und Waschbedingungen mit niedriger Stringenz verwendet werden. Für eine wässrige Hybridisierung wird die Ionenstärke normal bei 1 M NaCl gehalten, während die Temperatur progressiv von 68 auf 42°C gesenkt wird.
Eine Isolierung von Gensequenzen mit Homologien (oder Sequenzidentität/Ähnlichkeit) kann nur in einer unterschiedenen Domäne von (zum Beispiel 10–20 Aminosäuren) durch Verwenden synthetischer radiomarkierter Oligonukleotidsonden ausgeführt werden. Radiomarkierte Oligonukleotide werden durch Phosphorylierung des 5'-Endes von zwei komplementären Oligonukleotiden mit T4-Polynukleotidkinase hergestellt. Die komplementären Oligonukleotide werden zusammengelagert und ligiert, um Konkatemere zu bilden. Die doppelsträngigen Konkatemere sind dann zum Beispiel durch Nick-Transkription radiomarkiert. Hybridisierung wird normal unter niedrigen Stringenzbedingungen durchgeführt, wobei hohe Oligonukleotidkonzentrationen verwendet werden.
Oligonukleotid-Hybridisierungslösung:

6 × SSC
0,01 M Natriumphosphat
1 mM EDTA (pH 8)
0,5 % SDS
100 μg/ml denaturierte Lachssamen-DNA
0,1 % getrocknete Magermilch

Während der Hybridisierung wird die Temperatur schrittweise auf 5–10°C unter den geschätzten Oligonukleotid-Tm oder auf Raumtemperatur gesenkt, gefolgt von Waschschritten und Autoradiographie. Waschen wird mit niedriger Stringenz durchgeführt, wie zum Beispiel 3 Waschschritten, wobei 4 × SSC verwendet wird. Weitere Details werden durch Sambrook, J. et al. (1989), "Molecular Cloning : A Laboratory Manual [Molekulares Klonen: Ein Laborhandbuch]", Cold Spring Harbor Laboratory Press oder Ausubel, F. M. et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology [Aktuelle Protokolle der Molekularbiologie]", John Wiley & Sons, beschrieben.
Beispiel 15
Identifizierung von homologen Genen durch Screenen von Expressionsbibliotheken mit Antikörpern
cDNA-Klone können zum Herstellen eines rekombinanten Proteins verwendet werden, zum Beispiel in E. coli (z. B. Qiagen QIAexpress-pQE-System). Rekombinante Proteine werden dann normal über Ni-NTA-Affinitätschromatographie (Qiagen) affinitätsgereinigt. Rekombinante Proteine werden dann zum Herstellen spezifischer Antikörper verwendet, indem zum Beispiel Standardtechniken zur Kaninchen-Immunisierung verwendet werden. Antikörper werden affinitätsgereinigt, wobei eine Ni-NTA-Säule gesättigt mit dem rekombinanten Antigen wie von Gu et al., 1994 BioTechniques 17: 257–262 beschrieben verwendet wird. Der Antikörper kann dann zum Screenen von Expressions-cDNA-Bibliotheken zum Identifizieren homologer oder heterologer Gene über ein immunologisches Screenen verwendet werden (Sambrook, J. et al. (1989), "Molecular Cloning : A Laboratory Manual [Molekulares Klonen: Ein Laborhandbuch]", Cold Spring Harbor Laboratory Press oder Ausubel, F. M. et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology [Aktuelle Protokolle der Molekularbiologie]", John Wiley & Sons).
Beispiel 16
In-vivo-Mutagenese
In-vivo-Mutagenese von Mikroorganismen kann durch Passage von Plasmid-DNA (oder anderer Vektor-DNA) durch E. coli oder andere Mikroorganismen (z. B. Bacillus spp. oder Hefen wie zum Beispiel Saccharomyces cerevisiae) durchgeführt werden, welche in ihrer Fähigkeit zum Aufrechterhalten der Integrität ihrer genetischen Information beeinträchtigt sind. Typische Mutator-Stämme haben Mutationen in den Genen für das DNA-reparierende System (z. B. mutHLS, mutD, mutT etc., als Referenz siehe Rupp, W. D. (1996) DNA repair mechanisms, in: Escherichia coli and Salmonella [DNA-Reparaturmechanismen, in: Escherichia coli und Salmonella], S. 2277–2294, ASM: Washington.) Derartige Stämme sind den Fachleuten gut bekannt. Die Verwendung von derartigen Stämmen wird zum Beispiel in Greener, A. und Callahan, M. (1994) Strategies 7: 32–34. erläutert. Transfer von mutierten DNA-Molekülen in Pflanzen wird vorzugsweise nach Selektion und Testen in Mikroorganismen durchgeführt. Transgene Pflanzen werden gemäß verschiedenen Beispielen der Erläuterungen dieses Dokuments erzeugt.
Beispiel 17
In-vitro-Analyse der Funktion von Physcomitrella-Genen in transgenen Organismen
Die Bestimmung von Aktivitäten und kinetischen Parametern von Enzymen ist im Stand der Technik gut etabliert. Experimente zum Bestimmen der Aktivität von einem beliebigen gegebenen veränderten Enzym muß auf die spezifische Aktivität des Wildtyp-Enzyms maßgeschneidert werden, was klar innerhalb der Fähigkeiten des Fachmanns liegt. Übersichten etwa über Enzyme im Allgemeinen, als auch spezifische Details betreffend Struktur, Kinetik, Prinzipien, Verfahren, Anwendungen und Beispiele für die Bestimmung von vielen Enzymaktivitäten können zum Beispiel in den folgenden Referenzen: Dixon, M. und Webb, E. C., (1979) Enzymes [Enzyme]. Longmans: London, Fersht, (1985) Enzyme Structure and Mechanism [Enzymstruktur und Mechanismus]. Freeman: New York, Walsh, (1979) Enzymatic Reaction Mechanisms [Enzymatische Reaktionsmechanismen]. Freeman: San Francisco, Price, N. C., Stevens, L. (1982) Fundamentals of Enzymology [Grundlagen der Enzymologie]. Oxford Univ. Press: Oxford, Boyer, P. D., Hrsg. (1983) The Enzymes [Die Enzyme], 3. Auflage. Academic Press: New York, Bisswanger, N., (1994) Enzymkinetik, 2. Auflage. VCH: Weinheim (ISBN 3527300325), Bergmeyer, H. U., Bergmeyer, J., Grail, M., Hrsg. (1983–1986) Methods of Enzymatic Analysis [Verfahren zur enzymatischen Analyse], 3. Auflage, Band I–XII, Verlag Chemie: Weinheim, und Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry [Ullmanns Enzyklopädie der industriellen Chemie] (1987) Band. A9, Enzymes [Enzyme]. VCH: Weinheim, S. 352–363 gefunden werden.
Die Aktivität von Proteinen, welche an DNA binden, kann durch mehrere gut etablierte Verfahren gemessen werden, wie zum Beispiel DNA-Bandenverschiebungstests (auch Gel-Retardationstests genannt). Die Wirkung von derartigen Proteinen auf die Expression von anderen Molekülen kann gemessen werden, indem Reportergentests verwendet werden (wie zum Beispiel solche beschrieben in Kolmar, H. et al. (1995) EMBO J. 14: 3895–3904 und darin zitierte Referenzen). Reportergen-Testsysteme sind gut bekannt und für Anwendungen sowohl in pro- als auch eukaryotischen Zellen etabliert, wobei Enzyme wie zum Beispiel β-Glactosidase, grünes fluoreszierendes Protein und mehrere andere verwendet werden.
Die Bestimmung der Aktivität von Membrantransportproteinen kann gemäß Techniken wie zum Beispiel denjenigen beschrieben in Gennis, R. B. Pores, Channels and Transporters [Poren, Kanäle und Transporter], in Biomembranes, Molecular Structure and Function [Biomembranen, Molekulare Struktur und Funktion], Seiten 85–137, 199–234 und 270–322, Springer: Heidelberg (1989) durchgeführt werden.
Beispiel 18
Reinigung des gewünschten Produkts aus transformierten Organismen
Gewinnung des gewünschten Produkts aus Pflanzenmaterial (d. h. Physcomitrella patens oder Arabidopsis thaliana), Pilzen, Algen, Ciliaten, C.-glutamicum-Zellen oder anderen bakterielle Zellen, welche mit den hierin beschriebenen Nukleinsäuresequenzen transformiert werden, oder aus dem Überstand der oben beschriebenen Kulturen kann durch verschiedene Verfahren durchgeführt werden, welche im Stand der Technik gut bekannt sind. Wenn das gewünschte Produkt nicht aus den Zellen sekretiert wird, kann das gewünschte Produkt aus der Kultur durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit geerntet werden, die Zellen können durch Standardtechniken lysiert werden, wie zum Beispiel mechanische Kraft oder Beschallung. Organe von Pflanzen können mechanisch von anderen Geweben oder Organen getrennt werden. Nach Homogenisierung werden zelluläre Trümmer durch Zentrifugation entfernt, und die Überstandsfraktion, welche die löslichen Proteine enthält, wird für eine weitere Reinigung der gewünschten Verbindung zurückbehalten. Wenn das Produkt von gewünschten Zellen sekretiert wird, dann werden die Zellen aus der Kultur durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit entfernt, und die Überstandsfraktion wird für eine weitere Reinigung zurückbehalten.
Die Überstandsfraktion von jedem Reinigungsverfahren wird einer Chromatographie mit einem geeigneten Harz unterzogen, in welchem das gewünschte Molekül entweder auf einem Chromatographieharz zurückbehalten wird, während viele der Verunreinigungen in der Probe nicht zurückbehalten werden, oder wobei die Verunreinigungen durch das Harz zurückbehalten werden, während die Probe nicht zurückbehalten wird. Derartige Chromatographieschritte können falls notwendig wiederholt werden, wobei dasselbe oder verschiedene Chromatographieharze verwendet werden. Der Fachmann ist versiert bei der Auswahl von geeigneten Chromatographieharzen und in ihrer effizientesten Anwendung für ein bestimmtes Molekül, welches gereinigt werden soll. Das gereinigte Produkt kann durch Filtration oder Ultrafiltration konzentriert werden und bei einer Temperatur aufbewahrt werden, bei welcher die Stabilität des Produkts maximiert wird.
Es gibt ein weites Feld von Reinigungsverfahren, welche im Stand der Technik bekannt sind, und das voranstehende Verfahren zur Reinigung ist nicht als beschränkend gemeint. Derartige Reinigungstechniken werden zum Beispiel in Bailey, J. E. & Ollis, D. F. Biochemical Engineering Fundamentals [Biochemische Konstruktionsgrundlagen], McGraw-Hill: New York (1986) beschrieben. Zusätzlich kann die Identität und Reinheit der isolierten Verbindungen durch Techniken beurteilt werden, welche im Stand der Technik Standard sind. Dies schließt Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC), spektroskopische Verfahren, Färbeverfahren, Dünnschichtchromatographie, NIRS, enzymatische Tests oder mikrobiologische Test ein. Derartige Analyseverfahren werden zusammengefasst in: Patek et al., 1994 Appl. Environ. Microbiol. 60: 133–140, Malakhova et al., 1996 Biotekhnologiya 11: 27–32, und Schmidt et al., 1998 Bioprocess Engineer. 19: 67–70. Ulmann's Encyclopedia of Industrie) Chemistry [Ullmanns Enzymklopädie der industriellen Chemie], (1996) Band A27, VCH: Weinheim, S. 89–90, S. 521–540, S. 540–547, S. 559–566, 575–581 und S. 581–587, Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology [Biochemische Wege: Ein Atlas der Biochemie und Molekularbiologie], John Wiley and Sons, Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology [Anwendungen von HPLC in der Biochemie in: Labortechniken in der Biochemie und Molekularbiologie, Band 17. SEQUENZLISTE

Claims

Transgene Pflanzenzelle transformiert durch eine Nukleinsäure kodierend ein stressbezogenes Signaltransduktionsprotein (Signal Transduction Stress-Related Protein STSRP), wobei das STSRP ein Phospholipase-C-1-Protein (PLC-1) wie in SEQ ID NO: 11 definiert ist oder ein Polypeptid, welches wenigstens 80% Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 11 über ihre ganze Länge hat, und wobei Expression der Nukleinsäure in der Pflanzenzelle zu einer erhöhten Toleranz der Pflanzenzelle gegenüber Trockenheitsstress verglichen mit einer Wildtypvarietät der Pflanzenzelle führt.
Transgene Pflanzenzelle gemäß Anspruch 1, wobei das STSRP ein Phospholipase-C-1-Polypeptid (PLC-1) wie in SEQ ID NO: 11 definiert ist.
Transgene Pflanzenzelle gemäß Anspruch 1, wobei die STSRP-kodierende Nukleinsäure PLC-1 wie in SEQ ID NO: 6 definiert ist.
Transgene Pflanzenzelle gemäß Anspruch 1, wobei die STSRP-kodierende Nukleinsäure wenigstens 60% Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 6 über ihre ganze Länge hat.
Transgene Pflanzenzelle gemäß Anspruch 1, wobei die Pflanze eine Monocolyledone ist.
Transgene Pflanzenzelle gemäß Anspruch 1, wobei die Pflanze eine Dicolyledone ist.
Transgene Pflanzenzelle gemäß Anspruch 1, wobei die Pflanze ausgewählt ist aus die Gruppe bestehend aus Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Sojabohne, Erdnuss, Baumwolle, Raps, Canola, Yucca, Pfeffer, Sonnenblume, Tagetes, Nachtschattengewächsen, Kartoffel, Tabak, Aubergine, Tomate, Vicia-Arten, Erbse, Luzerne, Kaffee, Kakao, Tee, Salix-Arten, Ölpalme, Kokosnuss, perennierendem Gras und Futterpflanzen.
Transgene Pflanze umfassend eine Pflanzenzelle gemäß einem der Ansprüche 1–7.
Saatgut hergestellt durch eine transgene Pflanze umfassend eine Pflanzenzelle gemäß einem der Ansprüche 1–7, wobei das Saatgut eine reinrassige Zucht für eine erhöhte Toleranz gegenüber Trockenheitsstress verglichen mit einer Wildtypvarietät der Pflanzenzelle ist.
Isoliertes stressbezogenes Signaltransduktionsprotein (STSRP), wobei das STSRP ein Phospholipase-C-1-Protein (PLC-1) wie in SEQ ID NO: 11 definiert ist oder ein Polypeptid, welches wenigstens 80% Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 11 über ihre ganze Länge hat, und welches nach Expression in einer Pflanze zu einer erhöhten Toleranz der Pflanze gegenüber Trockenheitsstress verglichen mit einer Wildtypvarietät der Pflanze führt.
Isoliertes STSRP gemäß Anspruch 10, wobei das STSRP PLC-1 wie in SEQ ID NO: 11 definiert ist.
Isolierte Nukleinsäure kodierend ein stressbezogenes Signaltransduktionsprotein (STSRP), wobei die STSRP-kodierende Nukleinsäure ein Phospholipase-C-1-Protein (PLC-1) wie in SEQ ID NO: 11 definiert kodiert oder ein Polypeptid, welches wenigstens 80% Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 11 über ihre ganze Länge hat, und welches nach Expression in einer Pflanze zu einer erhöhten Toleranz der Pflanze gegenüber Trockenheitsstress verglichen mit einer Wildtypvarietät der Pflanze führt.
Isolierte STSRP-kodierende Nukleinsäure gemäß Anspruch 12, wobei die STSRP-kodierende Nukleinsäure ein Polypeptid wie in SEQ ID NO: 11 definiert kodiert.
Isolierte STSRP-kodierende Nukleinsäure gemäß Anspruch 12, wobei die STSRP-kodierende Nukleinsäure PLC-1 wie in SEQ ID NO: 6 definiert ist.
Isolierte STSRP-kodierende Nukleinsäure gemäß Anspruch 12, wobei die STSRP-kodierende Nukleinsäure wenigstens 60% Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 6 über ihre ganze Länge hat.
Isolierter rekombinanter Expressionsvektor umfassend eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 12, 13, 14, oder 15, wobei Expression der Nukleinsäure in einer Wirtszelle zu einer erhöhten Toleranz der Wirtszelle gegenüber Trockenheitsstress verglichen mit einer Wildtypvarietät der Wirtszelle führt.
Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze enthaltend eine Nukleinsäure kodierend ein stressbezogenes Signaltransduktionsprotein (STSRP), wobei das STSRP ein Phospholipase-C-1-Protein (PLC-1) wie in SEQ ID NO: 11 definiert ist oder ein Polypeptid, welches wenigstens 80% Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 11 über ihre ganze Länge hat, und wobei Expression der Nukleinsäure in der Pflanze zu einer erhöhten Toleranz der Pflanze gegenüber Trockenheitsstress verglichen mit einer Wildtypvarietät der Pflanze führt, umfassend Transformieren einer Pflanzenzelle mit einem Expressionsvektor umfassend die Nukleinsäure, Erzeugen aus der Pflanzenzelle eine transgene Pflanze mit einer erhöhten Toleranz gegenüber Trockenheitsstress verglichen mit einer Wildtypvarietät der Pflanze.
Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei das STSRP ein Polypeptid wie in SEQ ID NO: 11 definiert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei die STSRP-kodierende Nukleinsäure PLC-1 wie in SEQ ID NO: 6 definiert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei die STSRP-kodierende Nukleinsäure wenigstens 60% Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 6 über ihre ganze Länge hat und wobei Expression der Nukleinsäure in einer Pflanze zu einer erhöhten Toleranz der Pflanze gegenüber Trockenheitsstress verglichen mit einer Wildtypvarietät der Pflanze führt.
Verfahren zum Modifizieren der Trockenheitsstresstoleranz einer Pflanze umfassend Modifizieren der Expression eines stressbezogenen Signaltransduktionsproteins (STSRP) in der Pflanze, wobei das STSRP ein Phospholipase-C-1-Protein (PLC-1) wie in SEQ ID NO: 11 definiert ist oder ein Polypeptid, welches wenigstens 80% Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 11 über ihre ganze Länge hat, und wobei Expression des STSRP in der Pflanze zu einer erhöhten Toleranz gegenüber Trockenheitsstress verglichen mit einer Wildtypvarietät der Pflanze führt.
Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei das STSRP ein Phospholipase-C-1-Protein (PLC-1) wie in SEQ ID NO: 11 definiert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 21; wobei das STSRP kodiert wird durch eine Nukleinsäure wie in SEQ ID NO: 6 definiert.
Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei das STSRP kodiert wird durch eine Nukleinsäure, welche wenigstens 60% Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 6 über ihre ganze Länge hat.
Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei die Stresstoleranz erhöht wird.
Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei die Pflanze nicht transgen ist.
Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei die Pflanze transgen ist.
Verfahren gemäß Anspruch 27, wobei die Pflanze mit einem Promotor transformiert wird, welcher Expression der STSRP-kodierenden Nukleinsäure steuert.
Verfahren gemäß Anspruch 28, wobei der Promotor gewebespezifisch ist.
Verfahren gemäß Anspruch 28, wobei der Promotor entwicklungsgesteuert ist.
Transgene Pflanzenzelle gemäß Anspruch 1, wobei Expression der Nukleinsäure in der Pflanzenzelle zu erhöhtem Trockengewicht der Pflanze verglichen mit einer Wildtypvarietät der Pflanze führt.
Rekombinanter Expressionsvektor gemäß Anspruch 16, wobei Expression der Nukleinsäure in einer Pflanzenzelle zu erhöhtem Trockengewicht der Pflanze verglichen mit einer Wildtypvarietät der Pflanze führt.
Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei Expression der Nukleinsäure in der Pflanze zu erhöhtem Trockengewicht der Pflanze verglichen mit einer Wildtypvarietät der Pflanze führt.
Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei Erhöhen der Expression der Nukleinsäure in der Pflanze zu erhöhtem Trockengewicht der Pflanze verglichen mit einer Wildtypvarietät der Pflanze führt.
Verwendung der transgenen Pflanze gemäß Anspruch 8 oder eines Teils davon für die Herstellung eines landwirtschaftlichen Produkts.
Verwendung des Saatguts gemäß Anspruch 9 für die Herstellung eines landwirtschaftlichen Produkts.