DE60118921T2

DE60118921T2 - Verfahren und Zusammensetzungen unter Verwendung von Chinazolinonen

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Publication number: DE60118921T2
Application number: DE60118921T
Authority: DE
Inventors: T. Jeffrey Foster City FINER; Gustav Pacifica BERGNES; Bainian Foster City FENG; W. Whitney El Cerrito SMITH; C. John Mountainside CHABALA; J. David Los Altos MORGANS
Original assignee: Cytokinetics Inc
Current assignee: Cytokinetics Inc
Priority date: 2000-06-21
Filing date: 2001-04-27
Publication date: 2006-11-23
Anticipated expiration: 2021-04-28
Also published as: EP1296959A1; US7294634B2; CN1229353C; AU2006236024A1; KR100847788B1; US6562831B1; CN1437585A; CZ20024178A3; CZ303007B6; DE60118921D1; WO2001098278A1; CA2413426A1; AU2001259270B2; KR20030047903A; HUP0301201A2; EP1296959B1; EP1707563A3; US6545004B1; ATE323684T1; US7105668B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft Chinazolinon-Derivate, die Inhibitoren des mitotischen Kinesins KSP sind und nützlich in der Behandlung von zellulären proliferativen Erkrankungen, zum Beispiel Krebs, Hyperplasie, Herzhypertrophie, Immunerkrankungen und Entzündungen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das Interesse der medizinischen Chemie von Chinazolinon-Derivaten wurde in den frühen 1950er Jahren geweckt, mit der Aufklärung der Struktur eines Chinazolin-Alkaloids, 3-[β-Keto-gamma-(3-hydroxy-2-piperidyl)-propyl]-4-chinazolon, aus einer asiatischen Pflanze, die für ihre Anti-Malariaeigenschaften bekannt ist. Bei der Suche, zusätzliche Anti-Malaria-Substanzen zu finden, wurden verschiedene substituierte Chinazoline synthetisiert. Von spezieller Wichtigkeit war die Synthese des Derivates 2-Methyl-3-o-tolyl-4-(3H)-chinazolinon. Obwohl diese Verbindung, die als Methaqualon bekannt ist, ineffektiv entgegen Protozoen ist, stellte sie sich als ein starkes Hypnotikum heraus.
Seit der Einführung von Methaqualon und seiner Entdeckung als Hypnotikum wurde die pharmakologische Aktivität von Chinazolinonen und verwandten Verbindungen erforscht. Es ist heute bekannt, dass Chinazolinone und seine Derivate ein breites Spektrum an biologischen Eigenschaften haben, einschließlich hypnotischer, sedierender, analgetischer, antikonvulsiver, antitussiver und antiinflammatorischer Wirkungen.
Chinazolinon Derivate für die spezifische biologische Anwendungen beschrieben worden sind, umfassen das US. Patent Nr. 5,147,875, das 2-(substituiertes Phenyl)-4-oxo Chinazoline mit bronchodilatatorischer Wirkung beschreibt. US. Patente Nr. 3,723,432, 3,740,442, und 3,925,548 beschreiben eine Klasse von 1-substituierten-4-Aryl-2(1H)-chinazolinon Derivaten, die als antiinflammatorische Wirkstoffe verwendet werden. Die europäische Patentveröffentlichung EP 0 056 637 B1 beansprucht eine Klasse von 4(3H)-Chinazolinon Derivaten für die Behandlung von Hochdruck. Die europäische Patentveröffentlichung EP 0 884 31 9 A1 beschreibt pharmazeutische Zusammensetzungen von Chinazolin-4-one Derivaten zur Behandlung von neurodegenerativen, psychotropen, und Drogen und Alkohol induzierten zentralen und peripheren Nervensystemstörungen.
Chinazoline gehören zu einer wachsenden Zahl von therapeutischen Wirkstoffen, die zur Behandlung von zellulären proliferativen Erkrankungen, einschließlich Krebs, verwendet werden. Z. B. beschreibt die PCT WO 96/06616 eine pharmazeutische Zusammensetzung mit einem Chinazolinon Derivat, um die Proliferation der vaskulären glatten Muskulatur zu hemmen. Die PCT WO 96/19224 verwendet dasselbe Chinazolinon Derivat, um die Proliferation der mesangialen Zellen zu hemmen. Die US. Patente Nr. 4,981,856, 5,081,124 und 5,280,027 beschreiben die Verwendung von Chinazolinon Derivaten zur Inhibierung der Thymidylat-Synthase, das Enzym, das die Methylierung von Deoxyuridinmonophosphat katalysiert, um Thymidinmonophosphat zu produzieren, dass für die DNA Synthese benötigt wird. Die US. Patente Nr. 5,747,498 und 5,773,476 beschreiben Chinazolinon Derivate, die zur Behandlung von Krebs eingesetzt werden, welcher durch eine Überaktivität oder fehlgesteuerte Aktivität von Tyrosin-Rezeptor-Kinasen charakterisiert ist. Das U.S. Patent Nr. 5,037,829 beansprucht (1H-azol-1-ylmethyl) substituierte Chinazolin Zusammensetzungen, um Karzinome zu behandeln, die in Epithelzellen auftreten. Die PCT WO 98/34613 beschreibt eine Zusammensetzung, die ein chinazolinonhaltiges Derivat enthält, dass für die Abschwächung von Neovaskularisierungen und für die Behandlung von bösartigen Tumoren geeignet ist. Das U.S. Patent 5,187,167 beschreibt pharmazeutische Zusammensetzungen, die Chinazolin-4-one Derivate aufweisen, welche Antitumor-Aktivität besitzen. WO 01 30768 beschreibt Chinazolin-4-one Derivate für die Behandlung von zellulären proliferativen Erkrankungen und anderen Störungen, die mit der KSP Kinesin Aktivität assoziiert sind. WO 01 161 14 beschreibt Chinazolin-4-one Derivate für die Behandlung von z.B. inflammatorischen Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen oder Tumoren.
Andere therapeutische Wirkstoffe, die in der Behandlung von Krebs verwendet werden, umfassen die Taxane und Vinca-Alkaloide. Die Taxane und Vinca-Alkaloide entfalten ihre Wirkung an den Mikrotubuli, die an zahlreichen zellulären Strukturen vorhanden sind. Die Mikrotubuli sind die primären Strukturelemente der mitotischen Spindel. Die mitotische Spindel ist für die Verteilung der replizierten Kopien des Genoms auf jede der zwei Tochterzellen, die aus der Zellteilung hervorgehen, verantwortlich. Man vermutet, dass die Störung der mitotischen Spindel durch diese Wirkstoffe eine Hemmung der Krebszellteilung verursacht, und die Induktion des Krebszelltods. Jedoch bilden Mikrotubuli andere Typen von zellulären Strukturen, einschließlich Schienen für den intrazellulären Transport bei Nervenvorgängen. Weil diese Wirkstoffe nicht spezifisch für mitotische Spindeln sind, haben sie Nebeneffekte, die die Verwendung einschränken.
Verbesserungen in der Spezifität von Wirkstoffen zur Behandlung von Krebs sind auf Grund des therapeutischen Nutzens, der realisiert werden könnte, wenn die Nebeneffekte, die mit der Gabe dieser Wirkstoffe verbunden sind, reduziert werden könnten, von erheblichem Interesse. Traditionell sind dramatische Verbesserungen in der Behandlung von Krebs mit der Identifizierung von therapeutischen Wirkstoffen verbunden, die durch neuartige Mechanismen wirken. Beispiele dafür sind nicht nur die Taxane, sondern auch die Camptothecin Klasse der Topoisomerase I Inhibitoren. Unter diesen beiden Gesichtspunkten sind mitotische Kinesine interessante Ziele für neue Antikrebsmittel.
Mitotische Kinesine sind Enzyme, die essenziell für den Zusammenbau und die Funktion der mitotischen Spindel sind, aber sie sind nicht generell ein Teil von anderen mikrotubulären Strukturen, so wie bei den Nervenvorgängen. Diese Enzyme sind „molekulare Motoren", die die durch Hydrolyse von ATP freigesetzte Energie in mechanische Kraft transformieren, welche die gerichtete Bewegung von zellulären Nutzlasten entlang der Mikrotubuli antreibt. Die katalytische Domäne, die für diese Aufgabe ausreichend ist, ist eine kompakte Struktur von ungefähr 340 Aminosäuren. Während der Mitose organisieren Kinesine die Mikrotubuli in die bipolare Struktur, die die mitotische Spindel ist. Kinesine vermitteln die Bewegung der Chromosomen entlang der Spindel-Mikrotubuli, genauso wie strukturelle Veränderungen in der mitotischen Spindel, die mit den spezifischen Phasen der Mitose einhergehen. Eine experimentelle Störung der mitotischen Kinesin Funktion verursacht eine Fehlbildung oder Fehlfunktion der mitotischen Spindel, die oft zum Stillstand des Zellzyklus und Zelltod führt.
Unter den identifizierten mitotischen Kinesinen ist KSP. KSP gehört zu einer evolutionär konservierten Kinesin Subfamilie von plusendegerichteten Mikrotubuli Motoren, die sich aus bipolaren Homotetrameren zusammensetzen, die aus antiparallelen Homodimeren bestehen. Mikroinjektion von gegen KSP gerichteten Antikörpern in menschliche Zellen verhindert die Spindelpoltrennung während der Prometaphase und erhöht die monopolaren Spindeln und verursacht Mitose-Stillstand und die Induktion des programmierten Zelltods. KSP und verwandte Kinesine in anderen nichtmenschlichen Organismen bündeln antiparallele Mikrotubuli und verschieben sie relativ zueinander, wodurch sie die beiden Spindel-Pole auseinanderzwingen. KSP kann ebenfalls in der Anaphase B die Spindel-Verlängerung und das Zusammenführen der Mikrotubuli am Spindel-Pol vermitteln.
Humanes KSP (auch als HsEg5 bezeichnet) wurde beschrieben [Blangy, et al., Cell, 83:1159–69 (1995); Whitehead, et al., Arthritis Rheum., 39:1635–42 (1996); Galgio et al., J. Cell Biol., 135:339–414 (1996); Blangy, et al., J Biol. Chem., 272:19418–24 (1997); Blangy, et al., Cell Motil Cytoskeleton, 40:174–82 (1998); Whitehead und Rattner, J. Cell Sci., 11 1:2551–61 (1998); Kaiser, et al., JBC 274:18925–31 (1999); GenBank Zugriffsnummern: X85137, NM004523 und U374261, und ein Fragment von dem KSP Gen (TRIPS) wurde beschrieben [Lee, et al., Mol Endocrinol., 9:243–54 (1995). GenBank Zugriffsnummer L40372]. Über Xenopus KSP Homologe (Eg5), als auch Drosophila KLP61 F/KRP130 wurde berichtet.
Mitotische Kinesine sind attraktive Zielsubstanzen für die Entdeckung und Entwicklung von neuartigen mitotischen Chemotherapeutika. Dementsprechend ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren und Zusammensetzungen zur Verfügung zu stellen, die für die Inhibierung von KSP, einem mitotischen Kinesin, verwendet werden können.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In Übereinstimmung mit den oben umrissenen Aufgaben, stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren zur Verfügung, die zur Behandlung von Krankheiten von proliferativen Zellen verwendet werden können. Die Zusammensetzungen sind KSP Inhibitoren, insbesondere menschliche KSP Inhibitoren.
In einer Hinsicht hängt die Erfindung mit Verfahren zur Behandlung von zellulären proliferativen Erkrankungen zusammen, zur Behandlung von Störungen, die mit KSP Kinesin Aktivität verbunden sind, und zur Hemmung von KSP Kinesin. Die Verfahren verwenden Verbindungen aus der Gruppe bestehend aus: Eine Verbindung der Formel:
oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon; wobei die Isopropylgruppe in der R-Konfiguration angeheftet ist; R₁ ist eine Benzyl-, Chlorobenzyl-, Methylbenzyl-, Methoxybenzyl-, Cyanobenzyl- oder Hydroxybenzylgruppe; R₂ ist Halo oder Cyano; und R₃ ist eine Methyl- und/oder Halo-substituierte Phenylgruppe.
Krankheiten und Störungen die an eine Therapie mit Verbindungen der Erfindung ansprechen, umfassen Krebs, Hyperplasie, Restenose, Herzhypertrophie, Immunerkrankungen oder Entzündungen, vorzugsweise Krebs, Hyperplasie, Restenose und Herzhypertrophie, insbesondere Krebs.
In anderer Hinsicht bezieht sich die Erfindung auf Verbindungen, die für die Hemmung von KSP Kinesin geeignet sind. Die Verbindungen haben die oben gezeigten Strukturformeln.
In einer zusätzlichen Hinsicht stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Screening von Verbindungen zur Verfügung, die an ein KSP Kinesin binden, zum Beispiel Verbindungen, die die Bindung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen ersetzen oder damit konkurrieren. Die Verfahren umfassen die Kombination einer markierten Verbindung der Erfindung, ein KSP Kinesin, und mindestens einen Wirkstoffkandidaten und die Bestimmung der Bindung des bioaktiven Wirkstoffkandidaten an das KSP Kinesin.
In weiterer Hinsicht stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Screening von Modulatoren der KSP Kinesin Aktivität zur Verfügung. Die Verfahren umfassen eine erfindungsgemäße Zusammensetzung, ein KSP Kinesin, und die Bestimmung der Wirkung des bioaktiven Wirkstoffkandidaten auf die KSP Kinesin Aktivität.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt ein allgemeines Syntheseschema zur Herstellung von Verbindungen der Erfindung.
2 zeigt einen Syntheseweg für die Synthese von ähnlichen Chinazolinon KSP Inhibitoren.
3 zeigt einen Syntheseweg für im wesentlichen reine einzelne Enantiomere.
4 zeigt Synthesewege für Verbindungen der Erfindung.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung der zieht sich auf eine Klasse von neuartigen Verbindungen, die auf einer Chinazolinon-Struktur als Kern beruhen, die Modulatoren des mitotischen Kinesins sind. Durch die Hemmung oder Modulation mitotischer Kinesine, aber nicht anderer Kinesine (z. B. Transport-Kinesine), wird eine spezifische Hemmung der zellulären Proliferation erreicht. Deshalb konzentriert sich die vorliegende Erfindung auf den Befund, dass die Störung der mitotischen Kinesin-Funktion eine Fehlbildung oder Fehlfunktion der mitotischen Spindeln verursacht, was meistens den Stillstand des Zellzyklus und Zelltod zur Folge hat. Die Verfahren zur Hemmung eines humanen KSP Kinesins umfassen das in Kontakt bringen eines erfindungsgemäßen Inhibitors mit einem KSP Kinesin, insbesondere humane KSP Kinesine, einschließlich Fragmente und Varianten von KSP. Die Hemmung kann die ATP Hydrolyse Aktivität von dem KSP Kinesin und/oder die Aktivität der Spindelbildung betreffen, so dass die mitotischen Spindeln gestört sind. Meiose-Spindeln können ebenso gestört werden.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Entwicklung von Inhibitoren und Modulatoren von mitotischen Kinesinen, insbesondere KSP, für die Behandlung von Störungen, die mit der Zellproliferation assoziiert sind. Traditionell sind dramatische Verbesserungen in der Behandlung von Krebs, eines Typs einer Störung der Zellproliferation, mit der Identifizierung von therapeutischen Wirkstoffen verbunden, die durch neuartige Mechanismen wirken. Beispiele dafür sind nicht nur die Taxan Klasse von Wirkstoffen, sondern auch die Camptothecin Klasse der Topoisomerase I Inhibitoren. Diese hier beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren können sich in ihrer Selektivität unterscheiden und werden vornehmlich zur Behandlung von Erkrankungen von proliferativen Zellen benutzt, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Krebs, Hyperplasie, Restenose, Herzhypertrophie, Immunstörungen und Entzündungen.
Dementsprechend bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Verbindungen und Verfahren unter Verwendung von Verbindungen der Formel
oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon; wobei die Isopropylgruppe in der R-Konfiguration angeheftet ist; R₁ ist eine Benzyl-, Chlorobenzyl-, Methylbenzyl-, Methoxybenzyl-, Cyanobenzyl- oder Hydroxybenzylgruppe; R₂ ist Halo oder Cyano; und R₃ ist eine Methyl- und/oder Halo-substituierte Phenylgruppe.
Vorzugsweise ist R₁ ein Benzyl.
Halogen bezieht sich auf Fluor, Chlor, Brom oder Jod. Fluor, Chlor und Brom werden bevorzugt. Vorzugsweise ist es Chlor.
Die hier beschriebenen Verbindungen enthaften ein asymmetrisches Zentrum und führen deshalb zu (R)- oder (S)-Isomeren. Optisch aktive (R)-Isomere können unter Verwendung chiraler Synthons oder chiraler Reagenzien hergestellt oder unter Verwendung konventioneller Techniken getrennt werden. Ebenso ist es beabsichtigt, alle tautomeren Formen auch einzuschließen.
Die (R)- und (S)-Isomere können, wenn gewünscht, durch im Stand der Technik bekannte Verfahren getrennt werden, z. B. durch Bildung von diastereoisomeren Salzen oder komplexen, die getrennt werden können, zum Beispiel durch Kristallisation, Gas-Flüssigkeits- oder Flüssigkeitschromatographie; selektive Reaktion eines Enantiomers mit einem enantiomerspezifischen Reagenz, zum Beispiel enzymatischer Oxidation oder Reduktion, gefolgt durch Trennung des modifizierten und unmodifizierten Enantiomers; oder Gas-Flüssigkeits- oder Flüssigkeitschromatographie in einer chiralen Umgebung, zum Beispiel auf einem chiralen Hilfsmittel, so wie Silica mit einem gebundenen chiralen Liganden oder in der Gegenwart eines chiralen Lösungsmittels. Es ist hervorzuheben, dass, wenn das gewünschte Enantiomer in eine andere chemische Substanz durch eine der oben beschriebenen Trennungsprozeduren umgewandelt wird, ein weiterer Schritt notwendig sein kann, um die gewünschte enantiomere Form freizusetzen. Alternativ können spezifische Enantiomere durch asymmetrische Synthese unter Verwendung optisch aktiver Reagenzien, Substrate, Katalysatoren oder Lösungsmittel synthetisiert werden, oder durch Konvertierung eines Enantiomers in das andere durch asymmetrische Transformation. Ein Beispiel für eine Synthese aus optisch aktiven Startmaterialien ist in 3 gezeigt.
Diese Erfindung beschäftigt sich mit der Verwendung von reinen Enantiomeren und Mischungen von Enantiomeren, einschließlich razemischer Mischungen, obwohl die Verwendung des im wesentlichen reinen Enantiomers im allgemeinen bevorzugt wird, insbesondere das R-Enantiomer, wo eine i-Propylgruppe an das erste Kohlenstoffatom der Seitenkette angeheftet ist.
Synthese, Testung und Verwendung
Die Verbindungen dieser Erfindung werden wie unten beschrieben synthetisiert, unter Verwendung von Techniken, die im Stand der Technik gut bekannt sind. Zum Beispiel, können Chinazolinone durch säurekatalysierte Kondensation von N-Acyl- Anthranilsäuren mit aromatischen primären Aminen erhalten werden, wie von Ager et al., J. of Med. Chem., 20:379–386 (1977) beschrieben. Andere Verfahren zur Herstellung von Chinazolinonen sind in den U.S. Patentanmeldungen 5,783,577, 5,922,866 und 5,187,167 beschrieben.
Die Verbindungen der Erfindung können, wie in den 1–4 gezeigt, hergestellt werden.
Einmal hergestellt, finden die erfindungsgemäßen Verbindungen Verwendung in einer Vielzahl von Anwendungen. Wie im Stand der Technik gewürdigt wird, kann die Mitose auf vielerlei Arten verändert werden; dies bedeutet, man kann die Mitose entweder durch Erhöhung oder Verminderung der Aktivität einer Komponente des mitotischen Ablaufweges beeinflussen. Differenziert ausgedrückt kann die Mitose durch Störung des Gleichgewichts beeinflusst (beispielsweise gestört) werden, entweder durch Hemmung oder Aktivierung bestimmter Komponenten. Ähnliche Ansätze können zur Veränderung der Meiose verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Modulation der mitotischen Spindelbildung verwendet, um so einen verlängerten Zellzyklus-Stillstand in der Mitose zu bewirken. Mit „Modulation" ist hierbei die Veränderung der mitotischen Spindelbildung gemeint, einschließlich einer Erhöhung und Verminderung der Spindelbildung. Mit „mitotischer Spindelbildung" ist hier die Organisation der Mikrotubuli in bipolare Strukturen durch mitotische Kinesine gemeint. Mit „mitotischer Spindel Fehlfunktion" ist hier der mitotische Stillstand und die monopolare Spindelbildung gemeint.
Die Verbindungen der Erfindung sind geeignet um an ein mitotisches Kinesin, KSP, zu binden und/oder die Aktivität zu modulieren. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das KSP humanes KSP, obwohl KSP Kinesine von anderen Organismen verwendet werden können. In diesem Zusammenhang bedeutet modulieren entweder eine, eine Fehlbildung verursachende, Erhöhung oder Verminderung der Spindelpoltrennung, zum Beispiel durch Spreizung der Mitosespindelpole oder durch andere morphologische Störungen der Mitosespindel. In die Definition von KSP für diese Zwecke sind Varianten und/oder Fragmente von KSP eingeschlossen. Siehe das US. Patent "Methods of Screening for Modulators of Cell Proliferation and Methods of Diagnosing Cell Proliferation States", eingereicht am 27 Okt. 1999 (US. Patent Nummer 6,617,115). Zusätzlich können andere mitotische Kinesine in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Wie auch immer, es wurde gezeigt, dass die Verbindungen dieser Erfindung spezifisch für KSP sind.
Um die Aktivität zu bestimmen ist im Allgemeinen entweder KSP oder eine erfindungsgemäße Verbindung nicht-diffundierbar an einen unlöslichen Träger gebunden, der isolierte Bereiche zur Aufnahme der Proben hat (z. B. eine Microtiterplatte, ein Array usw.). Der unlösliche Träger kann aus jeder Art von Verbindung bestehen, an die die Verbindungen binden können, er ist schnell vom löslichen Material trennbar, und ist ansonsten kompatibel mit dem gesamten Screening-Verfahren. Die Oberfläche von solchen Trägermitteln kann fest oder porös sein und jede geeignete Form haben. Beispiele für geeignete unlösliche Trägermittel sind Microtiterplatten, Arrays, Membranen und Kügelchen. Diese sind typischerweise aus Glas, Plastik (z. B. Polystyrol), Polysacchariden, Nylon, Nitrozellulose, Teflon^TM, usw. Microtiterplatten und Arrays sind besonders geeignet, weil eine große Anzahl von Assays gleichzeitig mit kleinen Mengen von Reagenzien und Proben durchgeführt werden kann. Die besondere Art der Bindung von der Zusammensetzung ist nicht kritisch, solange sie mit den Reagenzien und gesamten Methoden der Erfindung kompatibel ist und sie die Aktivität der Zusammensetzung aufrechterhält und nicht diffundierbar ist. Bevorzugte Bindungsverfahren umfassen die Verwendung von Antikörpern (welche weder die Liganden-Bindungsstelle oder Aktivierungssequenz sterisch blockieren, wenn das Protein an den Träger gebunden ist), die direkte Bindung an „klebrige" oder ionische Träger, chemische Querverlinkung, die Synthese des Proteins oder Wirkstoffes auf der Oberfläche, usw. Nach der Bindung des Proteins oder Wirkstoffes wird überschüssiges ungebundenes Material durch Waschen entfernt. Die Bereiche, die die Probe aufnehmen, können dann durch Inkubation mit Kälberserum-Albumin (BSA), Casein oder einem anderen unschädlichen Bestandteil blockiert werden.
Die erfindungsgemäßen antimitotischen Wirkstoffe können für sich allein benutzt werden, um die Aktivität eines mitotischen Kinesins, insbesondere KSP, zu modulieren. In dieser Ausführungsform sind die mitotischen Wirkstoffe der Erfindung mit KSP kombiniert und die Aktivität von KSP wird gemessen. Die Kinesin Aktivität ist im Stand der Technik bekannt und umfasst eine oder mehrere Kinesin Aktivitäten.
Kinesin Aktivitäten umfassen die Fähigkeit, die ATP Hydrolyse zu beeinflussen; die Mikrotubuli Bindung; Gleiten und Polymerisation/Depolymerisation (Effekte auf die Mikrotubuli-Dynamik); Bindung an andere Proteine der Spindel; Bindung an Proteine, die an der Steuerung des Zellzyklus beteiligt sind; das Dienen als Substrat für andere Enzyme; so wie Kinasen oder Proteasen; und spezifische zelluläre Kinesin Aktivitäten, so wie die Spindelpoltrennung.
Verfahren zur Durchführung von Beweglichkeitsassays sind dem Sachkundigen des Standes der Technik wohl bekannt. [Siehe z. B., Hall, et al. (1996), Biophys. J., 71: 3467–3476, Turner et al., 1996, Anal. Biochem. 242 (1):20–5; Gittes et al., 1996, Biophys. J. 70(1): 41 8–29; Shirakawa et al., 1995, J. Exp. Biol 198: 1809–15; Winkelmann et al., 1995, Biophys. J. 68: 2444–53; Winkelmann et al., 1995, Biophys. J. 68: 72S.]
Nach dem Stand der Technik bekannte Verfahren zur Bestimmung der ATPase-Hydrolyse-Aktivität können ebenso verwendet werden. Vorzugsweise werden lösungsbasierte Assays verwendet. Das US. Patent Nummer 641 0254, eingereicht am 18. Mai 1999, beschreibt solche Assays. Alternativ können konventionelle Methoden verwendet werden. Zum Beispiel kann die P; Freisetzung durch Kinesin quantifiziert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird für den ATPase-Hydrolyse-Aktivitäts-Assay 0.3 M PCA (Perchlorsäure) und Malachit-Grün Reagenz (8.27 mM Natriummolybdat II, 0.33 mM Malachit-Grün Oxalat, und 0,8 mM Triton X-100) verwendet. Um den Assay durchzuführen, werden 10 μl der Reaktion in 90 μl kalter PCA gestoppt. Damit die Daten im mM anorganische Phosphatfreisetzung umgerechnet werden können, werden Phosphat-Standards benutzt. Wenn alle Reaktionen und Standards durch PCA gestoppt worden sind, werden 100 μl des Malachit-Grün Reagenz zu den Vertiefungen in beispielsweise einer Microtiterplatte zugegeben. Die Mischung wird für 10 bis 15 Minuten entwickelt und die Platte wird bei einer Absorption von 650 nm gemessen. Bei Verwendung von Phosphatstandards können die Absorptionswerte in mM P_i umgerechnet und der Zeitverlauf aufgetragen werden. Zusätzlich umfassen die nach dem Stand der Technik bekannten ATPase-Assays den Luziferase-Assay.
Die ATPase Aktivität von Kinesin Motordomänen kann ebenso benutzt werden, um die Effekte von modulierenden Wirkstoffen nachzuweisen. In einer Ausführungsform werden ATPase-Assays von Kinesin in Abwesenheit von Mikrotubuli durchgeführt. In einer anderen Ausführungsform werden die ATPase-Assays in Anwesenheit von Mikrotubuli durchgeführt. Durch die oben genannten Assays können verschiedene Typen von modulierenden Wirkstoffen nachgewiesen werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Effekt eines modulierenden Wirkstoffes unabhängig von der Konzentration der Mikrotubuli und ATP. In einer anderen Ausführungsform kann der Effekt des Wirkstoffs auf die Kinesin ATPase durch Erhöhung der Konzentrationen von ATP, der Mikrotubuli oder von beiden vermindert werden. In noch einer anderen Ausführungsform wird der Effekt des modulierenden Wirkstoffes durch Erhöhung der Konzentrationen von ATP, der Mikrotubuli oder von beiden erhöht.
Wirkstoffe, die die biochemische Aktivität von KSP in vitro modulieren, können dann in vivo gescreent werden. Methoden für solche Wirkstoffe in vivo umfassen Assays für die Zellzyklus-Verteilung, die Zell-Wachstumsfähigkeit, oder die Anwesenheit, Morphologie, Aktivität, Verteilung, oder Menge von Mitosespindeln. Methoden zur Überwachung der Zellzyklus-Verteilung einer Zellepopulation, z. B. durch Durchflusszytometrie, sind dem Sachkundigen des Standes der Technik wohl bekannt, genauso wie Methoden zur Bestimmung der Zell-Wachstumsfähigkeit. Siehe zum Beispiel das US Patent "Methods of Screening for Modulators of Cell Proliferation and Methods of Diagnosing Cell Proliferation States," eingereicht am 27. Okt. 1999, Patent Nummer 6,617,115.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen Assays, sind dem Sachkundigen des Standes der Technik mikroskopische Methoden zur Überwachung der Spindelbildung und -missbildung bekannt (siehe z. B. Whitehead and Rattner (1998), J. Cell Sci. 11 1:2551–61; Galgio et al, (1996) J. Cell biol., 135:399–414).
Die Verbindungen der Erfindung hemmen das KSP Kinesin. Ein Maß der Inhibierung ist IC₅₀, was als die Konzentration der Verbindung definiert ist, bei der die Aktivität von KSP um fünfzig Prozent vermindert ist. Bevorzugte Verbindungen haben IC₅₀ von weniger als etwa 1 mM, bevorzugte Ausführungsformen haben IC₅₀ von weniger als etwa 100 μM, mehr bevorzugte Ausführungsformen haben IC₅₀ von weniger als etwa 10 μM, bevorzugtere Ausführungsformen haben IC₅₀ von weniger als etwa 1 μM, und besonders bevorzugte Ausführungsformen haben IC₅₀ von weniger als etwa 100 nM, und die am meisten bevorzugte Ausführungsform hat einen IC₅₀ von weniger als etwa 10 nM. Die Messung von IC₅₀ geschieht unter Verwendung eines ATPase Assays.
Ein anderes Maß der Inhibierung ist K_i. Für Verbindungen mit IC₅₀ von weniger als 1 μM ist der K_i oder K_d definiert als die Dissoziationskonstante für die Wechselwirkung des Chinazolinons mit KSP. Bevorzugte Verbindungen haben K_i's von weniger als 100 μM, bevorzugte Verbindungen haben K_i's von weniger als 10 μM, bevorzugtere Verbindungen haben K_i's von weniger als 1 μM, besonders bevorzugte Verbindungen haben K_i's von weniger als 100 nM, und die am meisten bevorzugten Verbindungen haben K_i's von weniger als 10 nM. Der K_i für eine Verbindung wird aus dem IC₅₀ auf der Basis von drei Annahmen bestimmt. Erstens bindet nur ein Molekül der Verbindung an das Enzym und es gibt keine Kooperativität. Zweitens sind die Konzentrationen an aktivem Enzym und der getesteten Verbindung bekannt (d.h., es gibt keine signifikanten Mengen von Verunreinigungen oder inaktiven Formen in den Präparationen). Drittens ist die enzymatische Geschwindigkeit des Enzym-Inhibitor-Komplexes null. Die Werte der Geschwindigkeit (d.h., die Konzentration der Verbindung) werden mit der folgenden Gleichung angepasst:
Hierbei ist V die beobachtete Geschwindigkeit, V_max die Geschwindigkeit des freien Enzyms, I₀ ist die Inhibitorkonzentration, und K_d ist die die Dissoziationskonstante des Enzym-Inhibitor-Komplexes.
Ein anderes Maß der Inhibierung ist GI₅₀, definiert als die Konzentration der Verbindung, das eine Reduzierung der Zellwachstumsrate von 50% bewirkt. Bevorzugte Verbindungen haben GI₅₀'s von weniger als etwa 1 mM. Der Grad der Bevorzugung von Verbindungen ist eine Funktion ihrer GI₅₀: Solche GI₅₀ von weniger als etwa 20 μM, sind mehr bevorzugt; solche GI₅₀ von 10 μM sind es noch mehr; solche GI₅₀ von weniger als etwa 1 μM sind es noch mehr; solche GI₅₀ von 100 nM sind es noch mehr; solche GI₅₀ von weniger als 10 nM sind eben noch mehr bevorzugt. Die Messung von GI₅₀ wird mittels Verwendung eines Zellproliferations-Assays durchgeführt.
Die Zusammensetzungen der Erfindung werden verwendet, um zelluläre Proliferationskrankheiten zu behandeln. Krankheitszustände, welche durch die hier angegebenen Verfahren und Zusammensetzungen behandelt werden können, einschließlich, jedoch nicht auf diese beschränkt, Krebs (weiter unten diskutiert), Autoimmunerkrankungen, Arthritis, Transplantatabstoßung, entzündliche Darmerkrankung, nach medizinischer Behandlung induzierte Proliferation, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, Chirurgie, Angioplastik und dergleichen. Es wird geschätzt, dass in manchen Fällen, obwohl sich die Zellen in keinem hyper- oder hypoproliferativen Zustand (abnormalen Zustand) befinden, trotzdem eine Behandlung nötig ist. Zum Beispiel proliferieren die Zellen während einer Wundheilung vielleicht „normal", aber eine Proliferationssteigerung kann erwünscht sein. Wie oben erwähnt können sich in gleicher Weise im landwirtschaftlichen Bereich die Zellen in einem „Normalzustand" befinden, aber eine Proliferationssteuerung kann erwünscht sein, um den Anbauertrag zu erhöhen, durch direkte Wachstumssteigerung der Anbaupflanze, oder durch Inhibierung von Wachstum einer Pflanze, oder eines Organismus, welche einen nachteiligen Effekt auf die Ertragspflanze aufweisen. Somit beinhaltet diese Erfindung in einer Ausführungsform die Anwendung an Zellen oder Individuen, die von einer dieser Erkrankungen oder Krankheitszuständen befallen sind oder davon bedroht sind, befallen zu werden.
Die hier beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren werden insbesondere als nützlich erachtet zur Behandlung von Krebs, einschließlich solider Tumoren, solche wie Haut-, Brust-, Hirn-, Zervixkarzinomen, etc. Vorzugsweise können Krebsarten mit den Zusammensetzungen und Verfahren dieser Erfindung behandelt werden, einschließlich, jedoch nicht auf diese beschränkt: Herz: Sarkom (Angiosarkom, Fibrosarkom, Rhabdomyosarkom, Liposarkom), Myxom, Rhabdomyom, Fibrom, Lipom, und Teratom; Lunge: bronchogenes Karzinom (squamöses Karzinom, indifferenziertes Kleinzellkarzinom, indifferenziertes Großzellkarzinom, Adenokarzinom), alveoläres (bronchioläres) Karzinom, Bronchialadenom, Sarkom, Lymphom, chondromatöses Hamartom, Mesotheliom; Gastrointestinaltrakt: Ösophagus (squamöses Zellkarzinom, Adenokarzinom, Leiomyosarkom, Lymphom) Magen (Karzinom, Lymphom, Leiomyosarkom), Pankreas (duktales Adenokarzinom, Insulinom, Glukagonom, Gastrinom, Karzinoid-Tumore, VIPom), Dünndarm (Adenokarzinom, Lymphom, Karzinoid-Tumore, Kaposi-Sarkom, Leiomyom, Hämangiom, Lipom, Neurofibrom, Fibrom), Dickdarm (Adenokarzinom, tubuläres Adenom, villöses Adenom, Hamartom, Leiomyom); Urogenitaltrakt: Niere (Adenokarzinom, Wilms-Tumor [Nephroblastom], Limphom, Leukämie), Harnblase und Urethra (squamöses Zellkarzinom, Transitionalzellkarzinom, Adenokarzinom), Prostata (Adenokarzinom, Sarkom), Hoden (Seminom, Teratom, Embryonalkarzinom, Teratokarzinom, Choriokarzinom, Sarkom, interstitielles Karzinom, Fibrom, Fibroadenom, adenomatoide Tumore, Lipom); Leber: Hepatom (hepatozelluläres Karzinom), Cholangiokarzinom, Hepatoblastom, Angiosarkom, hepatozelluläres Adenom, Hämangiom; Knochen: osteogenes Sarkom (Osteosarkom), Fibrosarkom, malignes fibröses Histiozytom, Chondrosarkom, Ewingsarkom, malignes Lymphom (Retikulumzellsarkom), multiples Myelom, maligner Riesenzelltumor, Chordom, Osteochondrom (kartilaginäre Exostose), benignes Chondrom, Chondroblastom, Chondromyxofibrom, Osteoidosteom und Riesenzelltumore; Nervensystem: Schädel (Osteom Hämangiom, Granulom, Xanthom, Osteitis deformans), Meningen (Meningiom, Meningiosarkom, Gliomatose), Hirn (Astrozytom, Medulloblastom, Gliom, Ependymom, Germinom [Pinealom], multiformes Glioblastom, Oligodendrogliom, Schwannom, Retinoblastom, kongenitale Tumore), Rückenmark (Neurofibrom, Meningiom, Gliom, Sarkom); weibliche Geschlechtsorgane: Uterus (endometriumkarzinom), Zervix (Zervixkarzinom, präkanzeröse Zervixdysplasie), Ovarien (Ovarialkarzinom [seröses Zystadenokarzinom, muzinöses Zystadenokarzinom, unklassifiziertes Karzinom], Granulosa-Theka-Zelltumore, Sertoli-Leydig-Zelltumore, Dysgerminom, malignes Melanom), Vulva (squamöses Zellkarzinom, intraepitheliales Karzinom, Adenokarzinom, Fibrosarkom, Melanom), Vagina (klarzelliges Karzinom, squamöses Zellkarzinom, Botryoidsarkom [embryonales Rhabdomyosarkom], Eileiter (Karzinom); hämatologisches Sytem: Blut (myeloische Leukämie [akute und chronische] akute Lymphoblastenleukämie, chronische Lymphoblastenleukämie, myeloproliferative Erkrankungen, multiples Myelom, myelodysplastisches Syndrom), Morbus Hodgkin, Non-Hodgkin-Lymphom [malignes Lymphom]; Haut: malignes Melanom, Basalzellkarzinom, squamöses Zellkarzinom, Kaposi-Sarkom, Muttermale [dysplastische Nävi], Lipom, Angiom, Dermatofibrom, Keloide, Psoriasis; und Nebennieren: Neuroblastom. Folglich beinhaltet der Terminus „kanzeröse Zelle", wie hier beschrieben, eine Zelle, die durch eine der oben beschriebenen Zustände betroffen ist.
Dementsprechend werden die Zusammensetzungen der Erfindung Zellen verabreicht. Mit „verabreicht" ist hier gemeint, Zellen eine therapeutisch effektive Dosis der erfindungsgemäßen mitotischen Substanzen zu verabreichen, entweder einer Zellkultur oder einem Patient. Mit „therapeutisch effektiver Dosis" ist hier eine Dosis gemeint, welche die Wirkung erzeugt, für welche sie verabreicht wird. Die exakte Dosis hängt vom Zweck der Behandlung ab und wird durch Sachkundige des Standes der Technik bestimmt. Wie nach dem Stand der Technik bekannt, können Anpassungen hinsichtlich systemischer oder lokaler Gabe, Alter, Körpergewicht, Allgemeinzustand, Geschlecht, Ernährung, Zeit der Verabreichung, Arzneimittelinteraktion und der Grad der Erkrankung erforderlich sein und sind durch Routineexperimente ermittelbar, durch Sachkundige des Standes der Technik. Mit „Zellen" ist hier fast jede Zelle gemeint, in welcher Mitose oder Meiose erfolgt.
Ein „Patient" für den Zeck der gegenwärtigen Erfindung schließt sowohl Menschen und andere Tiere, insbesondere Säugetiere und andere Organismen ein. Deshalb sind die Verfahren anwendbar bei sowohl der Therapie für den Menschen und veterinäre Anwendungen. In der bevorzugten Ausführungsform ist der Patient ein Säugetier, und in der am meisten bevorzugten Ausführungsform ist der Patient menschlich.
Mitotische Substanzen, welche die erwünschte pharmakologische Aktivität auffeisen, können durch einen physiologisch akzeptablen Träger einem Patienten verabreicht werden, wie hier beschrieben. Angelehnt an die Darlegungen in der Einführung, können die Bestandteile auf verschiedenen Weisen formuliert sein, wie weiter unten dargelegt wird. Die Konzentration von therapeutisch aktiven Bestandteilen in der Formulierung kann von etwa 0,1 bis 100 Gew.% variieren. Die Wirkstoffe können einzeln oder in Kombination mit anderen Behandlungsverfahren, wie zum Beispiel Bestrahlung oder anderen chemotherapeutischen Substanzen, eingesetzt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform, sind die pharmazeutischen Bestandteile in einer wasserlöslichen Form, wie pharmazeutisch akzeptable Salze, welche sowohl Säure-gebundene als auch Basen-gebundene Salze beinhalten. „Pharmazeutisch akzeptables Säure-gebundenes Salz" bezieht sich auf Salze, die biologische Wirksamkeit von freien Basen behalten und die nicht biologisch oder anderweitig unerwünscht sind und mit anorganischen Säuren, wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure und ähnlichen, und organischen Säuren, wie Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Brenztraubensäure, Oxasäure, Maleinsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Salizylsäure und dergleichen gebildet sind. „Pharmazeutisch akzeptable Basen-gebundene Salze" beinhalten solche, die sich aus anorganischen Basen ableiten, wie Natrium-, Kalium-, Lithium-, Ammonium-, Kalzium-, Magnesium-, Eisen-, Zink-, Kupfer-, Mangan-, Aluminiumsalze und dergleichen. Insbesondere bevorzugt sind die Ammonium-, Kalium-, Natrium-, Kalzium- und Magnesiumsalze. Salze, abgeleitet von pharmazeutisch akzeptablen organischen nicht-toxischen Basen beinhalten Salze von primären, sekundären und tertiären Aminen, zyklischen Aminen und basischen Ionenaustauschharzen, wie Isopropylamin, Trimethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Tripropylamin und Ethanolamin.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können in verschiedenen Darreichungsformen hergestellt sein, wie Granulate, Tabletten, Dragees, Zäpfchen, Kapseln, Suspensionen, Salben, Lotionen und dergleichen. Pharmazeutisch qualitative organische oder anorganische Träger und/oder Verdünnungsmittel, die zur oralen oder topischen Anwendung geeignet sind, können zu Bildung von Zusammensetzungen verwendet werden, die die therapeutisch wirksame Verbindung enthalten. Nach dem Stand der Technik bekannte Verdünnungsmittel beinhalten wässrige Medien, pflanzliche und tierische Öle und Fette. Stabilisierungssubstanzen, Benetzungsmittel und Emulgatoren, Salze zur Variierung des osmotischen Druckes oder Puffer zur Sicherstellung eines geeigneten pH-Wertes und Hautdurchlässigkeitserhöher können als Hilfsmittel verwendet werden. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können ebenso eine oder mehrere der folgenden Substanzen beinhalten: Trägerproteine, wie Serumalbumin; Puffer; Füllmittel, wie mikrokristalline Zellulose, Laktose, Korn- und andere Stärkearten; Bindungsmittel; Süßmacher und andere Geschmacksstoffe; Farbstoffe und Polyethylenglykol. Hilfsmittel sind im Stand der Technik wohl bekannt und werden in einer Vielzahl von Formulierungen verwendet.
Die Verabreichung von mitotischen Wirkstoffen der vorliegenden Erfindung kann auf verschiedenen Wegen wie oben dargelegt durchgeführt werden, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, oral, subkutan, intravenös, intranasal, transdermal, intraperitonal, intramuskulär, intrapulmonal, vaginal, rektal oder intraokular. In manchen Fällen, zum Beispiel bei der Behandlung von Wunden und Entzündungen, sollte der antimitotische Wirkstoff als Lösung oder Spray direkt verabreicht werden.
Um die erfindungsgemäßen Verbindungen in einem Verfahren zum Screening von an das Kinesin-Spindel-Protein (KSP) sich bindenden Verbindungen einzusetzen, ist das KSP an einem Träger gebunden und eine erfindungsgemäße Verbindung (der mitotische Wirkstoff) wird dem Assay zugegeben. Alternativ dazu ist die Verbindung der Erfindung am Träger gebunden und KSP wird hinzugegeben. Klassen von Verbindungen unter welchen neuartige Bindungssubstanzen gesucht werden können, beinhalten spezifische Antikörper, nichtnatürliche Bindungssubstanzen, die durch Suche in chemischen Bibliotheksbeständen identifiziert werden können, Peptidanaloga, etc. Vom besonderen Interesse sind die Screening-Assays für Wirkstoffe, welche eine niedrige Toxizität für humane Zellen aufweisen. Eine breite Anzahl von Assays kann für diesen Zweck verwendet werden, einschließlich markierte in vitro Protein-Protein-Bindungs-Assays, elektrophoretische Mobilitätsassays, Immunoassays für die Proteinbindung, Funktionsassays (Phosphorylierungsassays usw.) und dergleichen.
Die Bestimmung der Bindung vom mitotischem Wirkstoff an KSP kann auf verschiedenen Wegen erfolgen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der mitotische Wirkstoff (die Verbindung der Erfindung) mit zum Beispiel einer fluoreszenten oder radioaktiven Gruppe markiert und die Bindung wird direkt bestimmt. Dies kann zum Beispiel erfolgen durch die Anheftung des gesamten oder eines Teiles des KSP an einen festen Träger, Zugabe eines markierten mitotischen Wirkstoffes (zum Beispiel einer Verbindung dieser Erfindung, bei welcher mindestens ein Atom durch ein nachweisbares Isotop ersetzt worden ist), Reinigung vom überschüssigen Wirkstoff, und Bestimmung, ob die Menge der Markierung die ist, die auf dem festen Träger vorhanden ist. Verschiedene Blockierungs- und Waschschritte können nach dem Stand der Technik verwendet werden.
Mit „markiert" ist hier gemeint, dass die Verbindung entweder direkt oder indirekt mit einem Marker markiert ist, welcher ein nachweisbares Signal liefert, wie zum Beispiel Radioisotop, Fluoreszenzmarker, Enzym, Antikörper, Partikel, wie magnetische Partikel, Chemolumineszenzmarker, oder spezifische Bindungsmoleküle usw. Spezifische Bindungsmoleküle umfassen Paare, wie Biotin und Streptavidin, Digoxin und Antidigoxin usw. Für den spezifische Bindungspartner ist der Komplementärpartner normalerweise mit einem Molekül markiert, das sich mit bekannten Verfahren für den Nachweis eignet, wie oben dargelegt wurde. Der Marker kann direkt oder indirekt ein Signal liefern.
In einigen Ausführungsformen ist nur eine Verbindung markiert. Zum Beispiel können die Kinesinproteine an den Tyrosin-Positionen mittels ¹²⁵I oder mit Fluorophoren markiert werden. Alternativ können mehr als eine Komponente mit verschiedenen Markern markiert sein; zum Beispiel durch Verwendung von ¹²⁵I für Proteine und einem Fluorophor für den mitotischen Wirkstoff.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können außerdem als Kompetitoren zum Screenen zusätzlicher Wirkstoffkandidaten verwendet werden. „Bioaktiver Wirkstoffkandidat" oder „ Arzneimittelkandidat" oder grammatikalische Äquivalente, wie hier verwendet, bezeichnen jedes Molekül, zum Beispiel Protein, Oligopeptid, kleines organisches Molekül, Polysaccharid, Polynukleotid, etc., um auf Bioaktivität getestet zu werden. Sie können imstande sein, direkt oder indirekt den zellulären Proliferationsphenotyp oder die Exprimierung einer zellulären Proliferationssequenz, eingeschlossen sowohl die Nukleinsäurensequenz und die Proteinsequenz, zu verändern. In anderen Fällen wird auf die Änderung von zellulärer Proliferationsproteinbindung und/oder -aktivität getestet. Testungen solcher Art können in An- oder Abwesenheit von Mikrotubuli erfolgen. Im dem Fall, wo die Proteinbindung oder -aktivität gescreent wird, schließen bevorzugte Ausführungsformen Moleküle aus, die dafür bekannt sind, das bestimmte Protein zu binden, zum Beispiel Polymerstrukture wie Mikrotubuli und Energiequellen wie ATP. Bevorzugte Ausführungsformen von Assays hierin schließen Kandidatenwirkstoffe ein, welche das zelluläre Proliferationsprotein in seinem endogenen Nativzustand nicht binden, die hier als „Exogenwirkstoffe" bezeichnet werden. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform schließen Exogenwirkstoffe des weiteren Antikörper gegen KSP aus.
Kandidatenwirkstoffe können eine Vielzahl von Substanzklassen umfassen, obwohl sie typischerweise organische Moleküle sind, sind sie vorzugsweise kleine organische Verbindungen mit einem Molekülargewicht von mehr als 100 und weniger als etwa 2.500 Daltons.
Kahdidatenwirkstoffe umfassen funktionelle Gruppen, die für strukturelle Interaktion mit Proteinen erforderlich sind, insbesondere Wasserstoffbindung und lipophile Bindung und typischerweise enthalten sie mindestens eine Amin-, Carbonyl-, Hydroxyl-, Ether-, oder Carboxylgruppe, vorzugsweise mindestens zwei der funktionellen chemischen Gruppen. Kandidatenwirkstoffe umfassen häufig zyklische Kohlenstoff- oder heterozyklische Strukturen und/oder aromatische oder polyaromatische Strukturen, die mit einer oder mehreren der oben genannten funktionellen Gruppen substituiert sind. Kandidatenwirkstoffe sind ebenso unter Biomolekülen einschließlich Peptiden, Sacchariden, Fettsäuren, Steroiden, Purinen, Pyrimidinen, Derivaten, Strukturanaloga oder Kombinationen davon zu finden. Insbesondere bevorzugt sind Peptide.
Kandidatenwirkstoffe sind aus einem breiten Spektrum von Quellen erhältlich, einschließlich Sammlungen von synthetischen oder natürlichen Verbindungen. Zum Beispiel sind eine Vielzahl von Mitteln durch Zufall und gezielte Herstellung einer breiten Vielfalt von organischen Verbindungen und Biomolekülen, einschließlich Exprimierung von zufälligen Oligonukleotiden, erhältlich. Alternativ sind Sammlungen von natürlichen Verbindungen in Form von bakteriellen, pilzlichen, pflanzlichen und tierischen Extrakten erhältlich oder leicht herstellbar. Zusätzlich sind natürlich oder synthetisch hergestellte Sammlungen und Verbindungen durch konventionelle chemische, physikalische und biochemische Mittel leicht modifizierbar. Bekannte pharmazeutische Wirkstoffe können Gegenstand von gezielten oder zufälligen chemischen Modifikationen sein, wie Acylierung, Alkylierung, Veresterung, Amidierung, um Strukturanaloga herzustellen.
Kompetitive Screening-Assays können durch Kombinierung von KSP und einem Wirkstoffkandidaten in einer ersten Probe durchgeführt werden. Eine zweite Probe umfasst einen mitotischen Wirkstoff, KSP und einen Wirkstoffkandidat. Dies kann in der An- oder Abwesenheit von Mikrotubuli erfolgen. Die Bindung des Wirkstoffkandidaten wird für beide Proben bestimmt und eine Änderung oder Differenz in der Bindung zwischen den beiden Proben weist auf die Präsenz eines Wirkstoffes hin, der imstande ist, an KSP zu binden und potenziell seine Aktivität zu modulieren. Wenn die Bindung des Wirkstoffkandidaten in der zweiten Probe im Vergleich zur ersten Probe unterschiedlich ist, dann ist der Wirkstoffkandidat fähig, an KSP zu binden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Bindung des Wirkstoffkandidaten durch die Verwendung von kompetitiven Bindungs-Assays bestimmt. In dieser Ausführungsform ist der Kompetitor ein Bindungsrest, der für die Bindung an KSP bekannt ist, wie ein Antikörper, Peptid, Bindungspartner, Ligand usw. Unter bestimmten Bedingungen kann eine kompetitive Bindung wie zwischen dem Wirkstoffkandidaten und dem Bindungseinheit vorhanden sein, so dass die Bindungseinheit den Wirkstoffkandidaten ersetzt.
In einer Ausführungsform ist der Wirkstoffkandidat markiert. Entweder werden der Wirkstoffkandidat oder der Kompetitor oder beide zuerst zu KSP für eine für die Entstehung einer Bindung ausreichende Zeit hinzugegeben, wenn vorhanden. Inkubationen können bei jeder Temperatur erfolgen, welche eine optimale Aktivität ermöglicht, typischerweise zwischen 4 und 40° C.
Inkubationsperioden werden für optimale Aktivität ausgelegt, sie können aber auch weiter optimiert werden, um ein Screening mit schnellem hohen Durchsatz zu ermöglichen. Typischerweise ist eine Inkubationszeit zwischen 0,1 und 1 Stunde ausreichend. Überschüssiger Wirkstoff wird im Allgemeinen entfernt oder weggewaschen. Die zweite Komponente wird dann hinzugegeben und die Anwesenheit oder Abwesenheit der markierten Komponente wird gemessen, um eine Bindung nachzuweisen.
In einer bevorzugten Ausführungsform, wird der Kompetitor zuerst hinzugefügt, gefolgt von Wirkstoffkandidaten. Der Austausch des Kompetitors ist ein Anzeichen dafür, dass der Wirkstoffkandidat an KSP bindet und folglich zur Bindung und potenziell zur Modulierung der KSP-Aktivität geeignet ist. in dieser Ausführungsform kann jede Komponente markiert sein. Wenn zum Beispiel der Kompetitor markiert ist, zeigt die Anwesenheit vom Marker in der Waschlösung einen Austausch durch den Wirkstoff. Wenn alternativ der Wirkstoff markiert ist, zeigt die Anwesenheit vom Marker auf dem Träger einen Austausch.
In einer alternativen Ausführungsform wird der Wirkstoffkandidat zuerst hinzugegeben, mit Inkubation und Waschen, gefolgt durch den Kompetitor. Die Abwesenheit einer Bindung durch den Kompetitor kann darauf hinweisen, dass der Wirkstoffkandidat an KSP mit einer höheren Affinität gebunden ist. Daher kann bei einem markierten Wirkstoffkandidaten die Anwesenheit vom Marker auf dem Träger zusammen mit einer fehlenden Kompetitor-Bindung darauf hinweisen, dass der Wirkstoffkandidat zur Bindung an KSP fähig ist.
Es kann von Wert sein, die Bindungsstelle von KSP zu identifizieren. Dies kann auf verschiedenen Wegen erfolgen. In einer Ausführungsform wurde KSP einmal als an den mitotischen Wirkstoff bindend identifiziert, KSP ist fragmentiert oder modifiziert und die Assays wurden wiederholt um die erforderlichen Komponenten für die Bindung zu identifizieren.
Die Modulation wird für Wirkstoffkandidaten, die in der Lage sind, die Aktivität von KSP zu modulieren, durch Screening getestet, was die Schritte der Kombination eines Wirkstoffkandidaten mit KSP wie oben beschrieben umfasst, und die Bestimmung einer Änderung in der biologischen Aktivität von KSP. Daher sollte in dieser Ausführungsform der Wirkstoffkandidat sowohl an KSP binden (und obwohl dies nicht notwendig sein muss) und wie hier beschrieben seine biologische oder biochemische Aktivität verändern. Die Verfahren umfassen sowohl in vitro Screening Methoden als auch in vivo Screening von Zellen für Veränderungen in der Zellzyklus-Verteilung, Celle Vermehrung, oder für die Anwesenheit, Morphologie, Aktivität, Verteilung oder Menge von Mitosespindeln, wie dies allgemein oben ausgeführt ist.
Alternativ kann ein Differenzial-Screening verwendet werden, um Wirkstoffkandidaten zu identifizieren, die an ein aktives KSP binden, aber nicht an modifiziertes KSP binden können.
In den Assays können positive und negative Kontrollen verwendet werden. Vorzugsweise werden alle Kontroll- und Test-Proben mindestens dreimal durchgeführt, um statistisch signifikante Ergebnisse zu erhalten. Die Inkubation von allen Proben erfolgt für einen Zeitraum, der ausreicht, dass der Wirkstoff an das Protein binden kann. Nach der Inkubation werden alle Proben von unspezifisch gebundenem Material freigewaschen und die Menge von gebundenem, im allgemeinen markierten Wirkstoff wird bestimmt. Wenn zum Beispiel eine radioaktive Markierung verwendet wird, können die Proben in einem Szintillationszähler gezählt werden, um die Menge der gebundenen Komponente zu bestimmen.
Eine Vielzahl von anderen Reagenzien kann in den Screening Assays verwendet werden. Diese umfassen Reagenzien wie Salze, neutrale Proteine, zum Beispiel Albumin, Detergenzien, usw. die verwendet werden können, um eine optimale Protein-Proteinbindung zu erzielen und/oder unspezifische oder Hintergrund-Wechselwirkungen zu reduzieren. Ebenso können Reagenzien, die auf andere Weise die Effizienz des Assays verbessern, wie Protease-Inhibitoren, Nuklease-Inhibitoren, antimikrobielle Wirkstoffe, usw. verwendet werden. Die Mischung der Komponenten kann in jeder Reihenfolge hinzugegeben werden, die die notwendige Bindung unterstützt.
Das folgenden Beispiele, wobei Beispiel 4 ein Beispiel der Erfindung ist, dient dazu, ausführlicher die Art der Verwendung der oben beschriebenen Erfindung zu beschreiben.
BEISPIELE
Abkürzungen und Definitionen
Die folgenden Abkürzungen und Begriffe haben stets die angezeigten Bedeutungen:

AC: = Acetyl
BNB: = 4-Bromomethyl-3-nitrobenzoesäure
BOC: = t-Butyloxycarbonyl
BU: = Butyl
c-: = Cyclo
CBZ: = Carbobenzoxy = Benzyloxycarbonyl
DBU: = Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene
DCM: = Dichloromethan = Methylenchlorid = CH, Cl,
DCE: = Dichloroethylen
DEAD: = Diethyl azodicarboxylat
DIC: = Diisopropylcarbodiimid
DIEA: = N,N-Diisopropylethylamin
DMAP: = 4-N,N-Dimethylaminopyridin
DMF: = N,N-Dimethylformamid
DMSO: = Dimethylsulfoxid
DVB: = 1,4-Divinylbenzen
EEDQ: = 2-Ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1,2-dihydroquinoline
Et: = ethyl
Fmoc: = 9-Fluorenylmethoxycarbonyl
GC: = Gaschromatographie
HATU: = 0-(7-Azabenzotriazol-I-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium Hexafluorophosphat
HMDS: = Hexamethyldisilazan
HOAc: = Essigsäure
HOBt: = Hydroxybenzotriazol
Me: = Methyl
mesyl: = Methanesulfonyl
MTBE: = Methyl t-butylether
NMO: = N-Methylmorpholinoxid
PEG: = Polyethylenglycol
Ph: = Phenyl
PhOH: = Phenol
PtP: = Pentafluorophenol
PPTS: = Pyridinium-p-toluensulfonat
Py: = Pyridin
PyBroP: = Bromo-tris-pyrrolidino-phosphonium-hexafluorophosphat
RT: = Raumtemperatur
sat=d: = gesättigt
s-: = sekundär
t-: = tertiär
TBDMS: = t-Butyldimethylsilyl
TES: = Triethylsilan
TFA: = Trifluoressigsäure
THF: = Tetrahydrofuran
TMOF: = Trimethylorthoformiat
TMS: = Trimethylsilyl
Tosyl: = p-Toluensulfonyl
Trt: = Triphenylmethyl

Referenz Beispiel 1
Synthese von Verbindungen
Die allgemeine Synthese ist in den 1 und 2 gezeigt.
Schritt 1: N-Butyryl-Anthranilsäure.
In einen dreistutzigen 500 ml Glaskolben mit rundem Boden und Thermometer, Tropftrichter und einem effizienten magnetischem Rührstab wurden Anthranilsäure (1) (0,5 Mol), (68,5 g) und Dimethylformamid (250 ml) gegeben. Zu dieser Lösung wurde Butyrylchlorid (0,55 Mol, 75,1 ml) tropfenweise mit einer Rate gegeben, bei der die Temperatur der Mischung nicht über 40°C anstieg. Die Suspension wurde kräftig bei Raumtemperatur für mindestens drei zusätzliche Stunden gerührt. Die Mischung wurde in Wasser (2000 ml) gegeben und für eine weitere Stunde gerührt. Das ausgefällte Produkt wurde durch Filtration gesammelt, mit kaltem Wasser gewaschen und unter reduziertem Druck über P₂O₅ getrocknet, und ergab die Verbindung 2 (67,3 g, 65%).
Schritt 2: 2-Propyl-3,1-[4H]benzoxazin-4-one.
Verbindung 2 (51,8 g, 0.25 Mol) wurde in Essigsäureanhydrid (180 ml) in einem 500 ml Glaskolben mit rundem Boden mit einem magnetischem Rührstab einem Claisen-Destillationskopf (mit Vakuumeinlass) und Thermometer aufgelöst. Der Kolben wurde in ein Ölbad gesetzt und langsam unter kräftigem Rühren auf 170–180°C erhitzt. Die entstehende Essigsäure wurde langsam unter atmosphärischem Druck wegdestilliert. Die Überwachung der Kopftemperatur der Destillationseinheit wurde verwendet, um den Fortschritt der Umwandlung zu verfolgen. Die Reaktionsmischung wurde dann auf 60°C abgekühlt und der Überschuss an Essigsäureanhydrid wurde durch Destillation bei reduziertem Druck (etwa 2,666 kPa (20 mm Hg)) entfernt. Das Harz wurde danach gekühlt und das Produkt kristallisiert. Das Produkt wurde mit n-Hexan (75 ml) pulverisiert und durch Filtration isoliert und ergab 2-Propyl-3,1-[4H]benzoxazin-4-one (3) (29,3 g, 62%). Die obige Prozedur ergab ausreichend reine Verbindung 3, um direkt in dem nächsten Schritt verwendet zu werden.
Schritt 3: 2-Propyl-3-benzylchinazolin-4-one.
Verbindung 3 (28,4 g, 0,15 Mol) und Benzylamin (17,5 ml, 0,16 Mol) werden in Chloroform (50 ml) in einem einstutzigen 250 ml Glaskolben mit rundem Boden für 6 Stunden gegossen. Nach komplettem Verbrauch von Verbindung 3 wird das Chloroform unter reduziertem Druck evaporiert. Ethylenglycol (100 ml) and NaOH Pellets (0,60 g) werden zu dem Harz und dem Gaskolben mit einem Claisen-Destillationskopf und einem magnetischem Rührstab gegeben. Der Gaskolben wird in ein Ölbad getaucht und unter starkem Rühren auf eine Badtemperatur von 130–140°C erhitzt und dort für fünf Stunden gehalten, während das produzierte Wasser durch Destillation entfernt wird. Nach Abschluss der Reaktion wird die klare Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt und über die Nacht gehalten, damit das Produkt ausfällt. Der pH der Suspension wurde durch Zugabe von 3% wässriger HCL auf 7–8 eingestellt, die Kristalle wurden abgefiltert und mit kaltem Wasser gewaschen und dann mit Isopropanol (oder alternativ Aceton) rekristallisiert, um die Verbindung 2-Propyl-3-benzylquinazolin-4-one (Verbindung 4) (28,0 g, 67%) zu erhalten.
Schritt 4: 2-(1'-Brompropyl)-3-benzylchinazolin-4-one.
In einen dreistutzigen 250 ml Glaskolben mit rundem Boden und Thermometer, Tropftrichter und einem effizienten magnetischem Rührstab wurden Verbindung 4 (27,8 g, 0,10 Mol), wasserfreies Natriumacetat (10,0 g) und eisgekühlte Essigsäure (130 ml) gegeben. In Essigsäure (10 ml) gelöstes Brom (16,0 g, 0,10 Mol) wurde tropfenweise zu der obigen Lösung bei 40°C für 1–2 Stunden gegeben. Nach dem die Zugabe abgeschlossen war, wurde die Mischung in Wasser (1500 ml) gegossen und für 1–2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Erst ausgefällte Produkt, 2-(1'-Brompropyl)-3-benzylchinazolin-4-one, wurde durch Filtration isoliert, mit warmem Wasser gewaschen um Spuren der Essigsäure zu entfernen und mit einer kleinen Menge Isopropanol gespült. Trocknung ergab die Verbindung 5 (33,0 g, 92%).
Schritt 5: 2-[1'-(NN-Dimethylethylendiamin)propyl]-3-Benzylchinazolin-4-one.
Verbindung 5 (10,7 g, 0,03 Mol) und N,N-Dimethylethylendiamin (6,6 ml, 0,06 Mol) wurden in reinem Ethanol (60 ml) aufgelöst und mit Rücklauf für sechs Stunden erhitzt. Nach Abschluss der Reaktion wurde das Lösungsmittel unter reduziertem Druck evaporiert. Das Harz wurde in Dichlormethan (150 ml) aufgelöst und mit 3% wässriger NaOH Lösung (etwa 10–20 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über MgSO₄ getrocknet und bis zur Trocknung unter reduziertem Druck evaporiert. Das übrig gebliebene ölige Produkt wurde durch Flash-Chromatographie auf einem kurzen Silica-Gelkissen unter Verwendung von CHCl₃-MeOH-aq.NH₃, 90:10:0,1, als Elutionsmittel aufgereinigt, um die gewünschte Verbindung (5), -[1'-(NN-Dimethylethylendiamin)propyl]-3-Benzylchinazolin-4-one (6) (6,0 g, 55%) zu erhalten.
Schritt 6: 2-[1'-(N-4-Fluorbenzoyl)-(NN-Dimethylethylendiamin)propyl]-3-Benzylchinazolin-4-one.
Eine Stammlösung der Verbindung 5 (1,822 g, 5,0 mMol) wurde in HPLC Grade CHCl₃ (0,5 ml) hergestellt. Eine Stammlösung von p-Flurobenzoylchlorid (160,2 mg, 1 mMol) in HPLC Grade 1,2-Dichlorethan (2,0 ml) wurde in einem 2,0 ml großen Kolben hergestellt. Eine dritte Lösung Triethylamin (2,0 ml aus 0,5 M) wurde in HPLC Grade 1,2-Dichlorethan hergestellt. Ein 100 μl Aliquot jeder Lösung wurde in ein Glas-Reaktionsgefäß unter Verwendung eines automatischen Beckman Biomet 2000 Flüssigkeitsdispensers pippetiert. Die Redaktionsmischung wurde unter Verwendung eines mechanischen Schüttlers geschüttelt, in einem Ultraschall-Wasserbad beschallt und dann über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die Mischung wurde dann in CHCl₃ (300 μl) verdünnt und mit 5% wässrigem NaHCO₃ und Wasser gewaschen. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, um die Verbindung 6 (65%) zu erhalten. Die Reinheit der Verbindung wurde mit TLC analysiert, dass mit CH₂Cl₂-Ethanol-konzentriertem wässrigen NH₃, 100:10:1, eluiert wurde.
Referenz Beispiele 2 und 3 Synthese von Verbindungen der allgemeinen Formel 1d
Alle wasserfreien Lösungsmittel wurden von der Aldrich Chemical Company in SureSeal^® Behältern gekauft. Die meisten Reagenzien wurden von der Aldrich Chemical Company gekauft. Abkürzungen: DCM, Dichloromethan; DIEA, N,N-Diisopropylethylamin; DMF, N,N-Dimethylformamid; TES, Triethylsilan; TFA, Trifluoressigsäure. Die Synthese wurde in 15 × 75 mm Glasampullen mit runden Boden und Schraubverschluss durchgeführt, die in einem 4 × 6 Array Syntheseblock aus Aluminium enthalten waren, der mit einer Teflon überzogenen Gummimembran versiegelt war. Die Reagenzien wurden zugegeben und die wässrigen Extraktionen wurden mit Einzel- oder Mehrkanal-Pipettierhilfen durchgeführt. Die Filtration wurden mit Whatman/Polyfiltronics 24 Well, 10 ml Filtrationsblocks durchgeführt. Die Evaporation von flüchtigen Materialien aus dem Array wurde mit einem Labconco Vortex-Evaporator oder mit einem 4 × 6 Stickstoff-Verteiler durchgeführt.
Referenz Beispiel 2 (Festkörpersynthese einer einzelnen Verbindung)

Schritt 1: 1,3-Diaminopropan-tritylharz (Novabiochem, 1,2 mmol/g) (0,20 g, 0,24 mmol) wurde in eine Schraubverschluss-Ampulle abgewogen und 3 ml einer 1:1 Mischung von DMF und Chloroform wurde zugegeben. DIEA (0,130 ml, 0,72 mmol) und 2-(1'-Brompropyl)-3-Benzylchinazolin-4-one (aus Beispiel 1) (0,188 g, 0,48 mmol) wurde zugegeben. Die Ampulle wurde versiegelt, auf 70°C erhitzt und über Nacht geschüttelt. Das Harz wurde gefiltert und gewaschen (3 × DCM, 2 × MeOH, 1 × DCM, 2 × Ether) und unter Vakuum getrocknet. Ein 27 mg Aliquot des Harzes wurde mit 5:5:90 TFA:TES:DCM für 15 min behandelt und die Mischung wurde gefiltert und evaporiert und ergab 8 mg (64% Ausbeute) des Chinazolinon-Diamin Zwischenprodukts. Die LCMS Analyse zeigte > 80% Reinheit.
Schritt 2: Das Harz aus Schritt 1 wurde in 3 ml DCM aufgequollen. DIEA (0,130 ml, 0,72 mmol) und 4-Brombenzylbromid (0,12 g, 0,48 mmol) wurden zugegeben. Die Ampulle wurde versiegelt und über Nacht geschüttelt. Die LCMS Analyse eines abgeteilten Aliquots ergab eine ungefähre 1:1 Mischung von Startmaterial und Produkt. Andere 0,130 ml DIEA und 0,12 g 4-Brombenzylbromid wurde hinzugegeben und die Mischung wurde bei 70° Celsius 8 Stunden geschüttelt. Das Harz wurde gefiltert, gewaschen (wie oben beschrieben) und unter Vakuum getrocknet.
Schritt 3: Das Harz aus Schritt 2 wurde zweimal für 30 Minuten mit 5:5:90 TFA:TES:DCM geschüttelt und gefiltert. Die Filtration wurden zusammengeführt und evaporiert und ergaben 140 Milligramm eines orangen Öls. Dieses Material wurde durch präparative Reverse-Phase-HPLC (Acetonitril-Wasser Gradient) aufgereinigt um 27 mg (17% für 3 Schritte) von dem Mono-TFA-Salz zu erhalten.

Referenz Beispiel 3 (Kombinatorische Synthese von mehreren Verbindungen)

Schritt 1: 1,2-Diaminoethan-tritylharz (Novabiochem, 0,95 mmol/g) (200g, 1,9 mmol) und 1,3-Diaminopropan-tritylharz (Novabiochem, 1,14 mmol/g) (2,0 g, 2,28 mmol) wurden jeweils in verschiedene 10 ml Polypropylen-Fritteröhrchen (Bio-Rad) gegeben. Zu jedem wurden 4 ml DMF, 4 ml Chloroform, 3 eq. DIEA (jeweils 1,0 ml und 1,2 ml) und 2 eq. 2-(1'-Brompropyl)-3-benzylchinazolin-4-one (aus Beispiel 1) (jeweils 1,5 g und 1,8 g) gegeben. Die Mischungen wurden bei 70°C über Nacht geschüttelt. Jede Mischung wurde gewaschen (3 × DCM, 2 × MeOH, 1 × DCM, 2 × Ether) und unter Vakuum getrocknet. Die Analyse eines abgeteilten Aliquots ergab die Anwesenheit des entsprechenden Chinazolin-Diamins mit jeweils einer Reinheit von > 90%.
Schritt 2: Das Chinazolin-Ethyl-Diamin-Harz (105 mg, 0,10 mmol) wurde in jede der Ampullen in den ersten 2 Reihen des Arrays gegeben und das Chinazolin-Propyl-Diamin-Harz (88 mg, 0,10 mmol) wurde in jede Ampulle in den letzten 2 Reihen des Arrays gegeben. Zu jeder Ampulle wurde DIEA (0,131 ml, 0, 75 mmol) gegeben. In jede Ampulle der ersten zwei Reihen des Arrays wurde ein unterschiedliches Amin gegeben und die Zugaben wurden für die letzten zwei Reihen des Arrays wiederholt. Der Reaktionsblock wurde über Nacht bei 70°C geschüttelt. Die Flüssigkeit wurde aus jeder Ampulle durch eine Multikanal-Pipette unter Verwendung feiner Gelvertiefungs-Spitzen entfernt und die Harze wurden gewaschen (2 × DCM, 1 × MeOH, 1 × DCM) und unter Vakuum getrocknet.
Schritt 3: Zu jeder Ampulle des Arrays wurde 2 ml einer 10:5:85 TFA:TES:DCM Lösung zugegeben. Der Reaktionsblock wurde für 45 min geschüttelt und die Mischungen wurden auf einen Filterblock gegeben, gefiltert und zweimal mit 0,75 ml DCM gewaschen. Die Lösung wurden evaporiert um gelbe-bis-rote Öle zu erhalten. Diese dicken Öle wurden zweimal mit Ether pulverisiert, in DCM gelöst und mit 4 M HCl in Dioxan behandelt um die HCl-Salze (unbekannte Anzahl von Salzen pro Verbindung) als bräunlich-bis-weiße pulverförmige oder nicht kristalline Feststoffe zu erhalten. Die LCMS Analyse zeigte, dass alle > 75% rein waren.

Beispiele 4–6
Sechs razemische Chinazolinone wurden in ihre Enantiomere durch chirale Chromatographie aufgetrennt. Die chirale Chromatographie von dreien von diesen Verbindungen ist unten beschrieben:
Beispiel 4
Säule – Chiralpak AD, 250 × 4,6 mm (Diacel Inc.). Probe – 0,5 mg/ml in EtOH. Bedingungen – 15 min bei 60% EtOH in Hexan, Enantiomer 1 eluiert bei 4,5 min, Enantiomer 2 eluiert bei 4,9 min.
Referenz Beispiel 5
Säule – Chiralcel OJ, 250 × 4,6 mm (Diacel Inc.). Probe – 0,5 mg/ml in EtOH. Bedingungen – 15 min bei 10% EtOH in Hexan, (R)-Enantiomer eluiert bei 8.4 min, (S)-Enantiomer eluiert bei 9.6 min.
Referenz Beispiel 6
Säule – Chiralpak AD, 250 × 4,6 mm (Diacel Inc.). Probe – 0,5 mg/ml in EtOH. Bedingungen – 15 min bei 70% EtOH in Hexan, Enantiomer 1 eluiert bei 6,5 min, Enantiomer 2 eluiert bei 8,8 min.
Die Tabelle unten zeigt die IC₅₀ Aktivität der Racemate und der Enantiomere von drei anderen Referenz-Verbindungen, die wie oben getrennt wurden. In allen drei Fällen war ein Enantiomer signifikant potenter als die anderen. Nach einer unabhängigen chiralen Synthese scheint das aktivere Enantiomer das R-Enantiomer zu sein.
Referenz Beispiele 7 und 8
Die folgenden zwei Verbindungen wurden als einzelne Enantiomere auf die Weise wie in 4 gezeigt, synthetisiert. Die Daten zeigen, dass das aktivere Enantiomer das R-Enantiomer ist.
Referenz Beispiel 9
Chirale Auflösung durch Rekristallisation mit Weinsäure Intermediärprodukt A, in Beispiel 1 hergestellt, kann in Intermediärprodukt B umgewandelt werden, welches nach der Auflösung, eine Alternative zu den ersten fünf in 3 gezeigten Schritten darstellt. Der Vorgang ist in dem Schema unten gezeigt:
Das R-Enantiomer von B kann selektiv kristallisiert werden, indem man eine Mischung von B mit 1:1 Äquivalenten von D-Weinsäure in einer Mischung von Isopropanol und Methanol erhitzt und dann die Mischung auf Raumtemperatur abkühlen lässt.
Referenz Beispiel 9: X = Cl, R = H
Das razemische Zwischenprodukt B (1,5 g) wurde in 100 ml kochendem Isopropanol aufgelöst und mit 0,8 g D-Weinsäure in 100 ml kochendem Methanol gemischt. Die Mischung wurde langsam auf Raumtemperatur gebracht. Nachdem sie über Nacht stehen gelassen wurde, wurde der Feststoff durch Filtration entfernt und mit Ethylacetat und Hexanen gespült und an der Luft getrocknet. Der getrocknete Feststoff (0,8 g) wurde dann in einer kochenden Mischung aus 50 ml Isopropanol und 50 ml Methanol aufgelöst und langsam auf Raumtemperatur gebracht. Nachdem sie über Nacht stehen gelassen wurde, wurde der resultierende Feststoff durch Filtration entfernt und mit Ethylacetat und Hexanen gespült und an der Luft getrocknet. Der getrocknete Feststoff wurde dann mit gesättigtem Natriumbicarbonat 30 Minuten gerührt und mit Ethylacetat extrahiert. Die organischen Stoffe wurden getrocknet (MgSO₄), gefiltert und zur Trocknung evaporiert. Das erhaltene klare Öl wog 345 mg. Die chirale Reinheit von > 95% wurde durch Umwandlung eines Teils in das S-Mosher Amid und Untersuchung des Produkts durch ¹HNMR bestimmt. Die enantiomeren reinen Verbindungen unten wurden gemäß den verbleibenden Schritten in 4, aus dem Material, das von der oben beschriebenen Prozedur unter Verwendung von sowohl D- als auch L-Weinsäure stammt, hergestellt.
Beispiel 10
Induktion eines mitotischen Stillstands in Zellpopulationen, die mit Chinazolinon KSP Inhibitor behandelt wurden
Eine FACS Analyse zur Bestimmung der Zellzyklus-Phase durch Messung des DNA-Gehalts wurde wie folgt durchgeführt. Skov-3 Zellen (humaner Ovarialkrebs) wurden 1:10 getrennt, um sie auf 10 cm Schalen auszuplattieren und im Zusammenfluss mit RPMI 1640 Medium, welches 5% fötales Kälberserum (FTS) enthielt, wachsen zu lassen. Die Zellen wurden dann entweder mit 10 nM Paclitaxel, 400 nM Chinazolinon 1,200 nM Chinazolinon 2, oder 0.25% DMSO (Träger für Verbindungen) für 24 Stunden behandelt. Die Zellen wurden dann mit PBS, das 5 mM EDTA enthielt, von den Platten gespült, pelletiert, einmal in 1% FCS haltigem PBS gewaschen, und dann über Nacht in 85% Methanol bei 4°C fixiert. Vor der Analyse wurden die Zellen pelletiert, einmal gewaschen, und in einer Lösung von 10 μg Propidiumiodid und 250 μg Ribonuklease (RNAse) A pro Milliliter bei 37°C für eine halbe Stunde gefärbt. Eine Durchflusszytometrie Analyse wurde auf einem Becton-Dickinson FACScan durchgeführt und die Daten von 10.000 Zellen pro Probe wurden mit der Modfit Software analysiert. Die Chinazolinon Verbindungen, genauso wie der bekannte antimitotische Wirkstoff Paclitaxel, verursachten eine Verschiebung in der Zellpopulation von einer G0/G1 Zellzyklusphase (2n DNA Gehalt) zu einer G2/M Zellzyklusphase (4n DNA Gehalt). Andere Verbindungen dieser Klasse hatten ähnliche Wirkung.
Monopolare Spindelbildung folgt der Anwendung von einem Chinazolinon KSP Inhibitor
Um die Natur der G2/M Akkumulation zu bestimmen, wurden die menschlichen Tumorzellenlinien Skov-3 (ovarial), HeLa (zervikal) und A549 (Lunge) auf 96-Well Platten bei Dichten von 4000 Zellen pro Well (Skov-3 & HeLa) oder 8000 Zellen pro Well (A549) ausplattiert, wobei sie 24 Stunden anwachsen konnten, und mit verschiedenen Konzentrationen von den Chinazolinon-Verbindungen für 24 Stunden behandelt. Die Zellen wurden in 4% Formaldehyd fixiert und mit Antitubulin-Antikörpern (anschließend nachgewiesen mit einem fluoreszenzmarkierten zweiten Antikörper) und Hoechst Farbstoff (der DNA färbt) gefärbt.
Die visuelle Überprüfung ergab, dass die Chinazolinon Verbindungen einen Zellzyklus-Stillstand im Stadium der Prometaphase der Mitose verursachten. Die DNA war kondensiert und die Spindelbildung hatte begonnen, aber die gehemmten Zellen zeigten einheitlich monopolare Spindeln, was anzeigt, dass eine Hemmung der Spindelpoltrennung erfolgte. Eine Mikroinjektion von Anti-KSP Antikörpern verursachte ebenso einen mitotischen Stillstand mit gehemmten Zellen, die monopolare Spindeln zeigten.
Hemmung der zellulären Proliferation in mit Chinazolinon-KSP-Inhibitoren behandelten Tumorzellenlinien
Zellen wurden auf 96-Well Platten bei Dichten von 1000–2500 Zellen/Well einer 96-Well Platte (in Abhängigkeit der Zelllinie) ausplattiert, wobei sie 24 Stunden anwachsen/wachsen konnten. Sie wurden dann mit verschiedenen Konzentrationen des Wirkstoffes für 48 Stunden behandelt. Der Zeitpunkt, bei dem die Verbindungen zugegeben werden, wird als T₀ bezeichnet. Ein Tetrazolium-basierter Assay unter Verwendung des Reagenz 3-(43-Dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-Carboxymethoxyphenyl)-2-(4-Sulfophenyl)-2H-Tetrazolium (MTS) (Patent Nr. 5,185,450) (siehe Promega Produktkatalog Nr. G3580, CellTiter 96^® AQ_ueous One Solution Cell Proliferation Assay) wurde verwendet, um die Anzahl von wachstumsfähigen Zellen bei T₀ und die Anzahl von Zellen nach 48 Stunden unter Einwirkung der Verbindung zu messen. Die Anzahl der übrig gebliebenen Zellen nach 48 Stunden wurde mit der Anzahl der wachstumsfähigen Zellen zum Zeitpunkt der Wirkstoffzugabe verglichen und erlaubte die Berechnung der Wachstumshemmung.
Das Wachstum über 48 Stunden von Zellen in den Kontroll-Wells, die ausschließlich mit der Trägersubstanz (0,25% DMSO) behandelt worden waren, wurde als 100% Wachstum angenommen und das Wachstum der Zellen in den Wells mit den Verbindungen damit verglichen. Chinazolinon-KSP-Inhibitoren hemmten die Zellproliferation in menschlichen Tumorzelllinien der folgenden Tumortypen: Lunge (NCl-H460, A549), Brust (MDA-MB-231, MCF-7, MCF-7/ADR-RES), Kolon (HT29, HCTI5), Ovarium (SKOV-3, OVCAR-3), Leukämie (HL-6O(TB), K-562), Zentrales Nervensystem (SF-268), Niere (A498), Osteosarkom (U2-0S), und Zervix (HeLa). Zusätzlich wurde eine Mäusetumorlinie (B16, Melanom) in der Anwesenheit der Chinazolinon-Verbindungen im Wachstum gehemmt.
Ein Gi₅₀ wurde berechnet, indem die Konzentration der Verbindung in μM gegen den Prozentsatz des Zellwachstums in den behandelten Wells aufgetragen wurde. Der für die Verbindungen berechnete Gi₅₀ ist die geschätzte Konzentration, bei der das Wachstum verglichen mit der Kontrolle um 50% gehemmt ist, d.h. die Konzentration bei der gilt: 100 × [(Behandelt48 – T0)/(Kontrolle48 – T0)] = 50.
Alle Konzentrationen sind doppelt getestet und die Kontrollen sind über 12 Wells gemittelt. Eine sehr ähnliche 96-Well-Platten Anordnung und Gi₅₀ Berechnungsschema wird von dem National Cancer Institute (siehe Monks, et al., J. Natl. Cancer Inst. 83:757–766 (1991)) verwendet. Die Methode mit dem das National Cancer Institute die Zellzahl quantifiziert, verwendet nicht MTS, aber benutzt stattdessen andere Methoden.
Die Berechnung von IC₅₀:
Für die Messung des IC₅₀ für die KSP Aktivität einer Verbindung wird ein ATPase Assay verwendet. Die folgenden Lösungen werden benutzt: Lösung 1 besteht aus 3 mM Phosphoenolpyruvatkaliumsalz (Sigma P-7127), 2 mM ATP (Sigma A-3377), 1 mM IDTT (Sigma D-9779), 5 μM Paclitaxel (Sigma T-7402), 10 ppm Antifoam 289 (Sigma A-8436), 25 mM Pipes/KOH pH 6.8 (Sigma P6757), 2 mM MgC12 (VWR JT400301), und 1 mM EGTA (Sigma E3889). Lösung 2 besteht aus 1 mM NADH (Sigma N8129), 0,2 mg/ml BSA (SigmaA7906), Pyruvat Kinase 7U/ml, L-Lactat-Dehydrogenase 10 U/ml (Sigma P0294), 100 nM KSP Motordomäne, 50 μg/ml Mikrotubuli, 1 mM DTT (Sigma D9779), 5 μM Paclitaxel (Sigma T-7402), 10 ppm Antifoam 289 (Sigma A-8436), 25 mM Pipes/KOH pH 6.8 (Sigma P6757), 2 mM MgC12 (VWR JT4003-01), und 1 mM EGTA (Sigma E3889). Fortlaufende Verdünnungen (8–12 zweifach Verdünnungen) der Zusammensetzung werden in einer 96-Well Microtiterplatte (Corning Costar 3695) unter Verwendung von Lösung 1 durchgeführt. Nach der folgenden fortlaufenden Verdünnung hat jeder Well 50 μl von Lösung 1. Die Reaktion wird durch Zugabe von 50 μl der Lösung 2 in jedes Well gestartet. Dies kann mit einer Multikanal-Pipettierhilfe entweder manuell oder mit automatisierten Flüssigkeits-Handhabungsvorrichtungen geschehen. Die Microtiterplatte wird dann in ein Mikroplatten-Absorptionsmessgerät gebracht und mehrere Absorptionsmessungen bei 340 nm werden für jeden Well in einer kinetischen Betriebsart aufgenommen. Die beobachtete Änderungsrate, die proportional zur ATPase Rate ist, wird dann als Funktion der Verbindungskonzentration aufgetragen. Für eine Standardbestimmung von IC₅₀ werden die erhaltenen Daten durch die folgende Gleichung mit vier Parametern unter Verwendung eines nichtlinearen Fitting-Programms (z.B. Grafit 4) angepasst:
Wobei y die beobachtete Geschwindigkeit und x die Konzentration der Verbindung ist.
Die Chinazolinon Verbindungen inhibieren das Wachstum einer Anzahl von Zelllinien, einschließlich der Zelllinien (MCF-7/ADR-RES, HCT1 5), die P-Glycoprotein (auch bekannt als Multidrug Resistance MDR⁺) exprimieren, welches die Resistenz für andere chemotherapeutische Arzneimittel, wie Paclitaxel, überträgt. Deshalb sind die Chinazolinone Antimitotika, die die Zellproliferation hemmen und nicht der Resistenz durch Überexprimierung von MDR⁺ durch wirkstoffresistente Tumorlinien unterliegen.
Es hat sich gezeigt, dass andere Verbindungen dieser Klasse die Zellproliferation inhibieren, obwohl die GI₅₀ Werte variierten. Die GI₅₀ Werte für die getesteten Chinazolinon-Verbindungen reichten von 200 nM bis größer als die höchsten getesteten Konzentrationen. Damit ist gemeint, dass, obwohl die meisten der Verbindungen, die die KSP Aktivität biochemisch inhibierten, die Zellproliferation inhibierten, einige bei der höchsten getesteten Konzentration (im allgemeinen über 20 μM), das Zellwachstum zu weniger als 50% hemmten. Viele der Verbindungen haben GI₅₀ Werte von weniger als 10 μM, und etliche haben GI₅₀ Werte von weniger als 1 μM. Antiproliferative Verbindungen, die erfolgreich in der Klinik zur Behandlung von Krebs (Krebs Chemotherapeutika) eingesetzt wurden, haben GI₅₀, die erheblich variieren. Zum Beispiel ist in A549 Zellen der GI₅₀ für Paclitaxel 4 nM, Doxorubicin 63 nM, 5-Fluoruracil 1 μM und Hydroxyurea 500 μM (die Daten wurden vom National Cancer Institute, Developmental Therapeutic Program, http://dtp.nci.nih.gov/ zur Verfügung gestellt). Daher können Verbindungen, die die zelluläre Proliferation hemmen, bei nahezu jeder Konzentration nützlich sein. Jedoch haben Verbindungen vorzugsweise GI₅₀ Werte von weniger als 1 mM. Bevorzugter haben Verbindungen GI₅₀ Werte von weniger als 20 μM. Noch bevorzugter haben Verbindungen GI₅₀ Werte von weniger als 10 μM. Eine weitere Reduktion der GI₅₀ Werte kann ebenso wünschenswert sein, einschließlich Verbindungen mit GI₅₀ Werten von weniger als 1 μM. Einige der erfindungsgemäßen Chinazolinon Verbindungen inhibieren die Zellproliferation mit GI₅₀ Werten von unter 200 nM bis unter 10 nM.
Beispiel 11
Weiblichen Nacktmäusen mit einem Gewicht von ungefähr 20 g wurden subkutan durch Trokar Fragmente von menschlichen Tumorkrebszellen implantiert, die subkutan aus wachsenden Tumoren von Nacktmaus Spendern entnommen wurden. Wenn die Tumore eine ungefähre Größe von 77 mg erreicht hatten, wurden die Tiere paarweise in Behandlungs- und Kontrollgruppen aufgeteilt. Jede Gruppe enthielt 8 Tumormäuse, von denen jede am Ohr markiert war und individuell während des Experimentes beobachtet wurde. Die initialen Dosen (10 ml/kg eines 66 mM Citratpuffers, pH 5.0/0,9% Salz/10% Tween 80 Formulierung von jeder Testverbindung mit einer maximalen Konzentration von 5 mg/ml) wurden am Tag 1 entsprechend der Paarbildung gegeben, wobei nach der indizierten Menge und Zeit dosiert wurde.
Die Mäuse wurden zweimal wöchentlich gewogen und die Tumormessungen wurden zweimal wöchentlich mit dem Messschieber durchgeführt, beginnend am Tag 1. Die Tumormessungen wurden in Milligramm Tumorgewicht durch die bekannte Formel W² × L/2 umgerechnet. Das Experiment wurde beendet, wenn die Tumoren der Kontrollgruppe eine durchschnittliche Größe von 1 g erreichten. Nach dem Abbruch wurden die Mäuse gewogen, geopfert und ihre Tumoren untersucht. Die Tumoren wurden gewogen und das mittlere behandelte Tumorgewicht pro Gruppe wurde berechnet. In diesem Modell wurde die Änderung im mittleren behandelten Tumorgewicht/Änderung im mittleren Kontroll-Tumorgewicht × 100% (ΔT/ΔC) von 100% subtrahiert, um die Tumorwachstumshemmung (TGI) für jede Gruppe zu ermitteln.
Die Referenz-Verbindungen 1–5 (unten) wurden durch die oben beschriebene Methode getestet und ergaben die Ergebnisse, die unten in den Tabellen A–D zusammengefasst sind. Andere Verbindungen der vorliegenden Erfindung zeigen vergleichbare Aktivitäten, wenn sie mit dieser Methode getestet werden.

Claims

Verbindung der Formel:
oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon; wobei die Isopropylgruppe in der R-Konfiguration angeheftet ist, R₁ eine Benzyl-, Chlorobenzyl-, Methylbenzyl-, Methoxybenzyl-, Cyanobenzyl- oder Hydroxybenzylgruppe ist; R₂ Halo oder Cyano ist und R₃ eine Methyl- und/oder Halo-substituierte Phenylgruppe ist.
Verbindung oder Salz, wie in Anspruch 1 beansprucht, in der Form eines im Wesentlichen reinen optischen R-Isomers.
Verbindung oder Salz, wie in Ansprüchen 1 oder 2 beansprucht, wobei R₁ eine Benzylgruppe ist.
Verbindung oder Salz, wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht, wobei R₂ Chlor ist.
Verbindung oder Salz, wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei R₁ eine Benzylgruppe ist, R₂ Chlor ist und R₃ eine 4-Methylphenylgruppe ist.
Verbindung oder Salz, wie in Anspruch 5 beansprucht, in der Form eines im Wesentlichen reinen optischen R- Isomers.
In-vitro Verfahren zum Hemmen von KSP-Kinesin, umfassend das in Kontrakt bringen von KSP-Kinesin mit einer Verbindung oder einem Salz, wie in einem der vorhergehenden Ansprüche beansprucht.
Verbindung oder Salz, wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 beansprucht, zur Verwendung als Medikament.
Verbindung oder Salz, wie in Anspruch 6 beansprucht, zur Verwendung als Medikament.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer zellulären, proliferativen Erkrankung.
Verwendung wie in Anspruch 10 beansprucht, wobei die Erkrankung Krebs, Hyperplasie, Restenose, Herzhypertrophie, Immunerkrankung oder Entzündung ist.
Verwendung einer Verbindung oder eines Salzes wie in Anspruch 5 oder 6 beansprucht, zur Behandlung von Krebs, wie in Anspruch 11 beansprucht.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung oder ein Salz nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und einen Träger dafür umfasst.