DE60107526T2

DE60107526T2 - Wasserstoffperoxid-indikator mit enzym und farbstoff

Info

Publication number: DE60107526T2
Application number: DE60107526T
Authority: DE
Inventors: Todd Morrison; Veronica V. Thralls; Franklin Jurik
Original assignee: Ethicon Inc
Current assignee: Ethicon Inc
Priority date: 2000-12-21
Filing date: 2001-12-20
Publication date: 2005-12-08
Anticipated expiration: 2021-12-21
Also published as: EP1217373A1; AU784107B2; KR100859423B1; ES2233571T3; CA2366109A1; AU9733401A; DE60107526D1; US6635439B2; US20020119508A1; EP1217373B1; KR20020050752A; CA2366109C; JP2002209599A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Nachweis von Wasserstoffperoxid.
Es gibt viele Anwendungen, in denen es wünschenswert ist, die Wasserstoffperoxidkonzentration zu messen. In der Nahrungsmittelindustrie wird Wasserstoffperoxid zum Beispiel dazu verwendet, um Metalldosen für Dosen-Nahrungsmittelpräparationen zu sterilisieren. Ein Sicherstellen einer geeigneten Anwendung des Wasserstoffperoxids für solche Dosen ist wichtig, um eine geeignete Nahrungsmittelsicherheit aufrechtzuerhalten. Wasserstoffperoxid wird auch als chemisches desinfizierendes Mittel für Sterilräume verwendet. Am wichtigsten ist die Verwendung von Wasserstoffperoxid bei der Sterilisierung von industriellen und medizinischen Vorrichtungen. Bei einer solchen Anwendung kann Wasserstoffperoxid als eine flüssige Lösung oder bevorzugterweise als ein Dampf aufgetragen werden. Wasserstoffperoxiddampf kann mit der Anwendung eines Plasmafelds kombiniert werden. Solche Systeme sind weiter in U.S.-Patent Nrn. 4,643,876 und 4,756,882 beschrieben. Ein solch kommerziell erhältliches System ist der STERRAD^®-Markensterilisator von Advanced Sterilization Products aus Irvine, Kalifornien.
In den STERRAD^® und ähnlichen Systemen werden Instrumente, die sterilisiert werden sollen typischerweise zuerst gereinigt, getrocknet und dann in einem Bakterien-sicheren dampfdurchlässigen Umschlag, wie zum Beispiel einer TYVEK^® (spinn-gebundene Olefin- )/MYLAR (Polyesterfilm-)Tasche oder zentralen Zuführungsraum-Umschlag (CSR-Umschlag) eingeschlossen. Diese Instrumente werden in eine Sterilisationskammer plaziert, und das Gas wird innerhalb der Kammer evakuiert, um die Kammer einem Vakuumdruck zu unterziehen. Wasserstoffperoxiddampf tritt in die Kammer ein und kontaktiert die Instrumente, um diese zu sterilisieren. Energie, die durch elektromagnetische Bestrahlung oder andere Mittel zugeführt wird, erzeugt ein Plasma des Wasserstoffperoxids, bevorzugterweise am Ende des Zyklus. Nachdem die Energiequelle entfernt wurde, die dazu verwendet wurde, um das Plasma zu erzeugen, rekombinieren die Plasmaionen, um Sauerstoff und Wasser zu bilden.
Das Sterilisationsverfahren kann auf verschiedenen Wegen überprüft werden. Zum Beispiel können biologische Indikatoren an verschiedenen Orten innerhalb der Sterilisationskammer plaziert werden, um das Sterilisationsverfahren zu untersuchen. Ein typischer biologischer Indikator ist in U.S.-Patent Nr. 5,552,320 von Smith gezeigt. Im allgemeinen enthält ein biologischer Indikator eine bekannte Menge eines lebenden Testorganismus. Nach dem Sterilisationsverfahren wird der Organismus kultiviert, um zu sehen, ob einer der Testorganismen das Sterilisationsverfahren überlebt hat. Solch ein Kultivierungsverfahren enthält erforderlicherweise eine Zeitverzögerung, gewöhnlicherweise einen Tag oder mehr.
Ein alternatives Verfahren zur Überprüfung der Funktion des Sterilisationszyklus ist es, auf die Anwesenheit und Menge von Wasserstoffperoxiddampf innerhalb des Sterilisationskammer zu testen. Wenn die gewünschte Menge von Wasserstoffperoxid innerhalb der Kammer erreicht wurde, kann man zumindest vermuten, daß die Sterilisationsvorrichtung wie vorgesehen funktioniert. Die Evaluierung sollte bevorzugterweise sofort sein, so daß, falls ein bestimmter Zyklus des Sterilisationsverfahrens dabei versagte, die erforderliche Menge von Wasserstoffperoxiddampf zu erreichen, dieser Zyklus unmittelbar wiederholt werden kann. Streifen existieren, um auf die Anwesenheit von Wasserstoffperoxid zu testen, sind im allgemeinen jedoch schlecht bei einer Evaluierung des Ausmaßes an Aussetzen.
US-A-5710012 beschreibt die Verwendung von wasserlöslichen Salzen von Hydrazonverbindungen zur kolorimetrischen Bestimmung von Wasserstoffperoxid.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren und eine Vorrichtung zur schnellen und leichten Bestimmung der Anwesenheit von Wasserstoffperoxid und, weiter bevorzugt, der Menge des integrierten Aussetzens gegenüber Wasserstoffperoxid zur Verfügung.
Ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung weist das integrierte Aussetzen von Wasserstoffperoxid in einer Atmosphäre nach. Das Verfahren umfaßt Plazieren eines Substrats, das in der Lage ist, Wasserstoffperoxid zu absorbieren in die Atmosphäre, In-Kontakt-Bringen des Substrats mit dem Wasserstoffperoxid, Reagieren des Wasserstoffperoxids mit einem Farbintermediat und einem Enzym, um ein Chromophor zu produzieren, das für das integrierte Aussetzen von Wasserstoffperoxid in der Atmosphäre anzeigend ist, und Korrelie ren des Chromphors mit dem integrierten Aussetzen von Wasserstoffperoxid in der Atmosphäre.
Bevorzugterweise umfaßt das Farbintermediat eine Farbstoff-Kopplung von 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazonhydrochlorid (MBTH) und 3-Dimethylaminobenzoesäure (DMAB). Auch bevorzugt ist das Enzym Peroxidase.
Das Farbintermediat umfaßt bevorzugterweise einen Sauerstoffakzeptor, wie zum Beispiel einen der folgenden: O-Dianisidin, O-Toluidin, O-Tolidin, Benzidin, 2,2'-Azinodi-(3-ethylbenzthiazolinsulfonsäure-(6)), 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon plus N,N-Dimethylanilin, Phenyl plus 4-Aminophenazon, sulfoniertes 2,4-Dichlorphenol plus 4-Aminophenazon, 3-Methyl-2-benzothiazlinonhydrazon plus 3-(Dimethylamino)benzoesäure, 2-Methoxy-4-allylphenol oder 4-Aminoantipyrendimethylanilin.
Das Substrat ist bevorzugterweise ein poröse Aufnahme. Das Substrat kann das Farbintermediat vor dem Schritt von In-Kontakt-Bringen des Substrats mit dem Wasserstoffperoxid tragen. Alternativ kann das Farbintermediat auf das Substrat nach In-Kontakt-Bringen des Substrats mit dem Wasserstoffperoxid hinzugefügt werden.
Ein Verfahren zum Korrelieren des Chromophors mit dem integrierten Aussetzen von Wasserstoffperoxid in der Atmosphäre umfaßt Ablesen des Chromophors mit einem Spektrophotometer. Alternativ kann es mit einer Farbtafel verglichen werden. Ähnlich kann das Enzym entweder auf dem Substrat vor oder nach dem In-Kontakt-Bringen des Substrats mit Wasserstoffperoxid vorhanden sein.
Das Substrat kann hydratisiert werden, bevorzugt nach dem Schritt von Aussetzen des Substrats gegen das Wasserstoffperoxid. Ein Verdickungsmittel, wie zum Beispiel Weißleim, kann zu dem Substrat hinzugefügt werden.
Das oben genannten Verfahren ist besonders in Zusammenhang mit den Schritten von Entfernen der Luft aus der Atmosphäre und Erzeugen von Wasserstoffperoxiddampf in der Atmosphäre brauchbar.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die vorliegende Erfindung kann leichter in Bezug auf die folgende genaue Beschreibung verstanden werden, wenn in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen gelesen, worin:
1 ein perspektivische Ansicht einer Ausführungsform einer Testvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung ist;
2 ein Blockdiagramm schematisch für eine Vorrichtung ist, die in der Durchführung der Erfindung verwendet werden kann;
3 eine perspektivische Ansicht einer bevorzugten Ausführungsform der Testvorrichtung der vorliegenden Erfindung plaziert innerhalb eines Meßsystems ist;
4 eine vergrößerte Aufsicht einer bevorzugten Ausführungsform der Testvorrichtung der vorliegenden Erfindung plaziert innerhalb eines Meßsystems ist;
5 ein Graph ist, der eine polynomiale Kalibrierungskurve der vorliegenden Erfindung ist;
6 ein Graph ist, der ein Maß der Reflexion einer Testvorrichtung gemäß der Erfindung versus eines Volumens von Wasserstoffperoxid ist; und
7 ein Graph ist, der die Reagenzkinetiken mit verschiedenen Mengen von Wasserstoffperoxid wie injiziert zeigt.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt eine verbesserte, einfache und schnelle Vorrichtung und Methodologie zum Bestimmen von Wasserstoffperoxid-Aussetzen zur Verfügung. Wie in 1 gezeigt, umfaßt ein Indikator 10 ein hydrophiles Matrix-Kissen 11, an das eine oder mehrere Reagenzien gebunden sind, die die Reflexion der Matrix verändern, wenn Wasserstoffperoxid nachgewiesen wird. Die Reagenzien umfassen ein Enzym- und Farbstoffsystem, das ein Licht-absorbierendes Produkt in Konjunktion mit dem Enzym erzeugt. Es ist das Licht absorbierende Produkt, das das Reflexionssignal des Matrixsystems verändert. Peroxidase kann als das Enzym dieser Erfindung verwendet werden.
Die Veränderung in der Reflexion über eine vorbestimmte Zeitdauer als ein Ergebnis der Bildung von Reaktionsprodukt wird dann mit der Menge von Wasserstoffperoxid auf der Matrix in Zusammenhang gebracht, die umgekehrt dem integrierten Aussetzen von Wasserstoffperoxid entspricht, d.h. der Konzentration von Wasserstoffperoxid über die Zeit des Aussetzens der Matrix gegenüber dem Wasserstoffperoxid. Das integrierte Aussetzen hängt sowohl von der Konzentration des Wasserstoffperoxids und der Zeitdauer des Aussetzens ab. Es ist die integrierte Fläche unter der Konzentrationskurve über die Aussetzungszeit. Daher kann der Test mit hoher Peroxidkonzentration und kurzer Aussetzungszeit dieselbe integrierte Testposition mit einem Test unter niedriger Konzentration und langer Aussetzungszeit produzieren. Die Intensität der verwendeten Lichtquelle um die Probe zu analysieren, kann natürlich auch sorgfältig überwacht und reguliert, um die Wiederholbarkeit der Messung sicherzustellen.
Typischerweise wird das Matrix-Kissen 11 an einen Halter angebracht sein, um ihm eine physikalische Form und Festigkeit zu geben, obwohl dies nicht erforderlich sein muß. Zum Beispiel trägt auf dem Indikator 10 ein Plastikhalter oder Griff 12 das dünne hydrophile Matrix-Kissen 11 mittels eines Klebstoffs 13, der direkt und fest das Kissen 11 an den Griff 12 anbringt. Eine Öffnung 14 in dem Plastikhalter 12 angrenzend an das Kissen 11 erlaubt es, Flüssigkeit auf die eine Seite des Kissens 11 aufgetragen zu werden und Licht auf der anderen Seite reflektiert zu werden.
Das Matrix-Kissen 11 sollte auf eine kontrollierte Weise absorbierend für Wasserstoffperoxid sein. Wenn eine Wasserstoffperoxid-Atmosphäre für eine gegebene Zeitdauer ausgesetzt wird, zeigt die in das Kissen 11 absorbierte Menge von Wasserstoffperoxid das integrierte Aussetzen von Wasserstoffperoxid in der Atmosphäre an. Verschiedene Faktoren kontrollieren, wieviel Wasserstoffperoxid durch das Kissen absorbiert wird, wobei der wichtigste die Konzentration von Wasserstoffperoxid in der Atmosphäre, die Konzentration von anderen Substanzen, wie zum Beispiel Wasserdampf, der durch das Kissen 11 absorbiert werden kann, und die Zeit sind, über die das Kissen 11 hinweg ausgesetzt wird. Das Kissen 11 zeigt daher eine integrierende Funktion im Hinblick auf die Wasserstoffperoxidkonzentration über die Zeit hinweg. Die Gesamtmenge von Peroxid absorbiert in das Kissen 11 hängt stark von dem Substrat des Kissens 11 ab. Verschiedene Kalibrierungen sind für verschiedene Substrate er forderlich. Falls das Kissen 11 zu absorbierend ist, kann es zuviel Peroxid absorbieren und mit dem Sterilisations- oder Desinfektionsprozeß interferieren. Auf der anderen Seite, wenn das Kissen 11 dabei versagt, Wasserstoffperoxid zu absorbieren oder leicht mit Wasserstoffperoxid gesättigt wird, kann es nicht die richtige Menge von Wasserstoffperoxid in der Atmosphäre geeignet anzeigen.
Ein bevorzugtes Material für das Kissen 11 umfaßt zellulosisches Material, Nylon und andere Substrate, die in der Lage sind, Wasserstoffperoxid zu absorbieren. Die Verwendung von Polyamidoberflächen, um das Reagenzelement 11 zu bilden, stellte eine Zahl von wünschenswerten Charakteristika der vorliegenden Erfindung zur Verfügung. Es ist hydrophil (d.h. nimmt Wasserstoffperoxiddampf und hydratisierende Lösungen leicht auf, verformt sich nicht bei Benässung (um so ein flache Oberfläche für die Reflexionsablesung zur Verfügung zu stellen), ist mit Enzymen kompatibel (um eine gute Lagerfähigkeit zu verleihen), nimmt ein begrenztes Probenvolumen pro Einheitsvolumen der Membran auf (erforderlich, um einen vergrößerten dynamischen Bereich von Messungen zu zeigen) und zeigt eine asreichende Naßfestigkeit, um eine routinemäßige Herstellung zu ermöglichen.
2 zeigt ein System, worin das Reagenz auf die Seite des Indikators 10 der Öffnung 14 in dem Trägergriff 12 aufgetragen wird, während Licht auf der anderen Seite des Kissens 11 reflektiert und gemessen wird. Andere Strukturen als die dargestellten können verwendet werden. Das Kissen 11 kann verschiedene Umrisse und Formen annehmen, innerhalb der hier zur Verfügung gestellten Begrenzungen. Das Kissen 11 sollte an mindestens einer Oberfläche, bevorzugterweise zwei Oberflächen, zugänglich sein.
Weiterhin kann das hydrophile Kissen 11 auf den Träger 12 durch jedes bequeme Mittel (z.B. einen Halter, Klammer oder Klebstoffe) angebracht sein, jedoch ist es im bevorzugten Verfahren auf die Rücklage gebunden. Das Binden kann mit jedem nicht-reaktiven Klebstoff durch ein thermales Verfahren durchgeführt werden, wobei die Trägeroberfläche genug geschmolzen wird, um einiges des Materials, das für die hydrophile Lage verwendet wird, einzuschließen, oder durch Mikrowellen- oder Ultraschall-Bindungsverfahren, die ähnlich die hydrophilen Proben-Kissen auf die Rücklage fusionieren.
Die Interaktion zwischen Wasserstoffperoxid und den Reagenzien auf dem Kissen 11 produzierte eine sichtbare Veränderung. Zum Beispiel kann Wasserstoffperoxid mit einem Farbin termediat oder -Vorläufer in einer katalysierten oder nicht-katalysiserten Reaktion reagieren, um eine oxidierte Form des Intermediats oder Vorläufers zu produzieren. Dieses oxidierte Material kann das gefärbte Produkt produzieren oder mit einem zweiten Vorläufer reagieren, um den finalen Farbstoff zu bilden. Nicht begrenzende Beispiele von Reagenzien schließen Peroxidase und einen Sauerstoffakzeptor, wie zum Beispiel O-Dianisidin; O-Toluidin; O-Tolidin; Benzidin; 2,2'-Azinodi-(3-ethylbenzthiazolinsulfonsäure-(6)); 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon plus N,N-Dimethylanilin; Phenyl plus 4-Aminophenazon; sulfoniertes 2,4-Dichlorphenol plus 4-Aminophenanzon; 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon plus 3-(Dimethylamino)benzoesäure; 2-Methoxy-4-allylphenol und 4-Aminoantipyrendimethylanilin ein. Weitere Beispiele des Einzelindikatortyps schließen 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin, O-Toluidin und Guargummi ein, brauchbare gekoppelte Indikatoren schließen 4-Aminoantipyrin mit 2-Methylindol, 4,5-Dichlor-2-hydroxybenzensulfonat (DCHBS) oder CNSP ein. Eine herkömmlich Farbkopplung ist 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazonhydrochlorid (MBTH) und 3-Dimethylaminobenzoesäure (DMAB); solch eine Farbstoffkopplung und seine Verwendung in einem Meßsystem für die Messung von Glukosespiegeln sind in U.S.-Patent Nr. 5,059,394 beschrieben. Eine Farbstoffkopplung umfassend 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon in freier Form oder in saurer Form (MBTH) und 8-Anilino-1-naphthalinsulfonat, in saurer oder in Salzform (ANS) kann anstelle der herkömmlichen MBTH-DMAB-Farbstoffe verwendet werden. Sie ist nach Oxidierung weniger löslich und stellt daher einen stabileren Endpunkt zur Verfügung, mit minimalem Farbstoffverblassen, verglichen mit der oxidierten MBTH-DMAB-Farbkopplung.
U.S.-Patent Nr. 5,563,031 beschreibt ein weiteres Reagenzsystem, umfassend eine Farbkopplung, die in der Lage ist, ein Chromophor zu bilden nach der Oxidation des Wasserstoffperoxid oder eines anderen oxidierenden Mittels, wobei die Farbkopplung die Verbindung:
umfaßt, worin R ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alkyl, substituiertem Alkyl, Aryl,
substituiertem Aryl, heterozyklischem, quaternärem Amin oder organischen Säuregruppen, und Y ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus NO₂, SO_3-, H, Halid, Alkyl oder SiZ₃, worin Z entweder Alkyl oder Aryl ist. Bevorzugterweise ist Y H. In einer bevorzugten Ausführungsform ist R:
worin jedes von R1, R2 und R3 unabhängig voneinander ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, Alkyl, Aryl, Silyl, Halid, Hydroxid, Mercaptid, Alkoxid, Thioalkoxid, Amin, Sulfonat oder Carboxylat, und X ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Amin, Sulfonat oder Carboxylat.
Die peroxidativ-aktive Substanz in der Testzusammensetzung ist bevorzugterweise Peroxidase, erhalten aus natürlichen Quellen, wie zum Beispiel Rettich und Kartoffel. Andere Substanzen, die peroxidative Aktivität aufweisen, schließen anorganische Verbindungen ein, die eine Peroxidase-Aktivität aufweisen, wie zum Beispiel Gemische von Kaliumjodid und Natriummolybdat, sowie andere Jodite, wie zum Beispiel Natrium- und Ammoniumjodit und andere Molybdate, wie z um Beispiel Kalium- und Ammoniummolybdat können verwendet werden. Zusätzlich kann Urohaemin und eine Zahl von anderen Porphyrin-Substanzen, die peroxidative Aktivität aufweisen, verwendet werden. Verschiedene Komplex-bildende Verbindungen, die Metalloporphyrine aktivieren, die jedoch nicht als solche brauchbar sind, können damit verwendet werden, wie zum Beispiel 2-Aminobenzothiazol, Pyridin, Bipyridiyl, Bipyridylpyridin, Nikotinsäure oder ähnliches. Andere Substanzen, die nicht Enzyme sind, jedoch peroxidative Aktivität aufweisen, schließen solche Verbindungen, wie zum Beispiel Eisensulfocyanat, Eisentanat, Eisen-haltiges Ferrocyanid, Kaliumchromsulfat und ähnliches ein.
Zusätzliche Komponenten, wie zum Beispiel Puffer, Oberflächen-aktive Mittel und Stabilisatoren können auch zur Zusammensetzung hinzugefügt werden. Der pH und daher die Hinzufügung einer puffernden Substanz kann den Farbton einer bestimmten Form einer Indikatorkomponente bestimmen. Zum Beispiel wird saures Orange 8 von orange auf eine blaß strohfarbene Farbe bei pH 7,5 oxidiert, wird jedoch bei pH 9,5 zu einem (blaß) gelb oxidiert. Nitrorot wird von violett zu einem schwachen braun bei einem pH von 7,5 oxidiert, wird jedoch bei pH 9,5 zu einem schwachen blau-braun oxidiert. Ein pH-Zustand kann wünschenswerter sein als ein anderer, um den gewünschten Bereich von Farbtönen herzustellen. Viele Probesubstanzen sind dem Fachmann im Stand der Technik bekannt und können verwendet wer den, unter der Voraussetzung, daß sie nicht mit der Wirkung von Peroxidase und Wasserstoffperoxid interferieren, um die Indikatorkomponenten zu oxidieren. Jeder der oben beschriebenen Farbstoffe und Farbkopplungen wurde im Stand der Technik früher und im Hinblick auf die Analyse von Serumprobenanalyten, wie zum Beispiel Blutglukose, beschrieben. In solchen Systemen reagiert ein weiteres Enzym, wie zum Beispiel Glukonase, mit dem Analyten, um Wasserstoffperoxid in Relation mit der Menge von vorhandenem Analyt zu produzieren. Die oben beschriebenen Reagenzien messen dann den Wasserstoffperoxidgehalt, um den Analytgehalt in der Serumprobe zu bestimmen. Bis jetzt waren sie nicht zum Messen von Wasserstoffperoxid Aussetzen in einer Atmosphäre bekannt.
Der Indikator 10 kann auf verschiedene Weise konstruiert und betrieben werden. Zum Beispiel kann er ohne jedes Reagenz auf dem Kissen 11 zugeführt werden. In dieser Ausführungsform wird der Indikator 10 ohne Reagenzien der Wasserstoffperoxid-Atmosphäre ausgesetzt und nach einem solchen Aussetzen wird eine wäßrige Lösung, die die Reagenzien enthält oder getrennte Lösungen für jede der Reagenzkomponenten auf das Kissen 11 aufgetragen, um die Reaktion zu initiieren. Wie unten gezeigt werden wird, schreitet die Reaktion über die Zeit hinweg und eine Messung der Farbveränderung wird bevorzugterweise zu einer angegebenen Zeit nach Hydratisieren des Kissens 11 mit den Reagenzien genommen. Alternativ können eines oder mehrere der Reagenzien auf dem Kissen 11 vorliegen, während der Indikator 10 der Wasserstoffperoxid-Atmosphäre ausgesetzt wird. Zum Beispiel kann das Kissen 11 bereits mit dem Sauerstoffrezeptor vor dem Aussetzen des Indikators der Wasserstoffperoxid-Atmosphäre imprägniert sein, wobei in diesem Fall das Kissen lediglich mit einer Peroxidaselösung hydratisiert werden muß, um die Reaktion zu beginnen. Das Kissen 11 kann sowohl die Peroxidase und den Sauerstoffrezeptor vor dem Aussetzen des Indikators der Wasserstoffperoxidase-Atmosphäre enthalten, wobei in diesem Fall das Kissen lediglich mit Wasser hydratisiert werden muß, um die Reaktion zu beginnen. In Abhängigkeit von der erhältlichen Menge von Wasserstoffperoxid und Wasser in der Atmosphäre kann es bevorzugt sein, die Peroxidase aus dem Kissen 11 wegzulassen, bis zum Start der Reaktion bereit, um eine bessere Kontrolle zu behalten. Zuviel Wasserstoffperoxid kann das Enzym inaktivieren oder inhibieren und zuviel Wasser kann die Reaktion zu früh starten.
Das Analyseverfahren dieser Erfindung beruht bevorzugterweise auf einer Veränderung in der spektralen Absorption, wie durch Diffusionsreflexion gemessen, die von dem integrierten Aussetzen von Wasserstoffperoxid abhängig ist, das auf dem Kissen 11 vorhanden ist. Nach dem der Indikator 10 einer Wasserstoffperoxid-Atmosphäre ausgesetzt wurde, wird dann das Kissen 11 in der Anwesenheit der Peroxidase des Sauerstoffakzeptors hydratisiert, was die Reaktion startet. Die Zeit zur Messung kann sorgfältig vom Start der Hydratisierung bestimmt werden oder die Absorption kann über die Zeit hinweg gemessen werden, um zu bestimmen, wann die Reaktion einen vorbestimmten Meßpunkt erreicht hat. Die Absorption betrifft in dieser Anmeldung nicht nur Licht innerhalb des sichtbaren Wellenlängenbereichs, sondern auch außerhalb des sichtbaren Wellenlängenbereichs, wie zum Beispiel infrarote oder violette Strahlung. Aus diesen Messungen der Absorption kann eine Rate der Farbentwicklung im Hinblick auf den Wasserstoffperoxidspiegel kalibriert werden.
Ein geeignetes Instrument, wie zum Beispiel ein Diffusionsreflexionspektrophotometer mit einer geeigneten Software kann hergestellt werden, um automatisch die Reflexion zu bestimmten Zeitpunkten abzulesen, die Rate der Reflexionsveränderung zu berechnen und, unter der Verwendung von Kalibrierungsfaktoren, den Spiegel an Wasserstoffperoxid auszugeben. Solch eine Vorrichtung 60 ist schematisch in 2 gezeigt, wobei eine physikalische Ausführungsform in den 3 und 4 gezeigt wird. Mindestens eine Lichtquelle 5 wie zum Beispiel eine Hochintensitäts-Lichtemittierende Diode (LED) projiziert einen Lichtstrahl auf das Kissen 11. Ein wesentlicher Teil (mindestens 25%, bevorzugterweise mindestens 35% und weiter bevorzugt mindestens 50% in der Abwesenheit von Reaktionsprodukt) dieses Lichts wird von dem Reagenzkissen diffusiv reflektiert und wird durch einen Lichtdetektor 6, zum Beispiel einem Phototransistor, nachgewiesen, der einen Ausgangsstrom proportional zu dem Licht, das er aufnimmt, ausgibt.
Die Lichtquelle 5 und/oder -Detektor 6 kann so angepaßt sein, um ein Licht bestimmter Wellenlänge zu erzeugen oder darauf zu reagieren, falls gewünscht. Die Ausgabe des Detektors 6 wird zu einem Verstärker 7 passiert, zum Beispiel einem linearen integrierten Schaltkreis, der den Phototransistorstrom in eine Spannung umwandelt. Die Ausgabe des Verstärkers 7 kann zu einem Meß- und Haltekreis 8 zugeführt werden. Dies ist ein kombinierter linearer/digitaler integrierter Schaltkreis, der die analoge Spannung des Verstärkers 7 mißt oder verfolgt und, nach Anweisung von einem Mikroprozessor 20, die Spannung auf ihrem aktuellen Spiegel arretiert oder hält.
Ein Analog zu Digital Konverter 19 nimmt die analoge Spannung von dem Meß- und Haltekreis 8 ab und überführt sie, zum Beispiel, in eine 12-bit binäre digitale Nummer nach An weisung des Mikroprozessors 20. Der Mikroprozessor 20 kann ein digital integrierter Schaltkreis sein. Er dient den folgenden Kontrollfunktionen: 1) Zeitmessen für das gesamte System; 2) Ablesen der Ausgabe des Analog/Digital Konverters 19; 3) Zusammen mit dem Programm und dem Datenspeicher 21, Speichern von Daten, die der Reflexion entsprechen, die zu bestimmten Zeitintervallen gemessen wurde; 4) Berechnen von Wasserstoffperoxidspiegeln aus den gespeicherten Reflexionen; und 5) Ausgeben von Daten zu einer Anzeige 22. Der Speicher 21 kann ein digitaler integrierter Schaltkreis sein, der Daten und das Mikroprozessorbetriebsprogramm speichert. Die Darstellungs- und Berichtvorrichtung 22 kann verschiedene Hardcopy- und Softcopy-Formen annehmen. Bevorzugterweise umfaßt sie ein visuelles Display, wie zum Beispiel ein Flüssigkeitskristall (LCD)- oder LED-Display, sie kann jedoch auch ein Banddrucker, hörbares Signal oder ähnliches sein. Das Instrument kann auch einen Start-Stop-Schalter einschließen und kann eine hörbare oder sichtbare Zeitausgabe zur Verfügung stellen, um die Zeiten zur Aufbringung von Proben, der Abnahme von Messungen usw. anzuzeigen, falls gewünscht.
In der vorliegenden Erfindung kann der Reflexionskreis selbst dazu verwendet werden, um die Zeitmessung zu beginnen, durch Messen eines Tropfens in der Reflexion, die auftritt, wenn der wäßrige Teil der Suspensionslösung, die auf das Reagenzkissen 11 aufgetragen wurde, zu der Oberfläche wandert, an der die Reflexion gemessen wird. Typischerweise wird die Meßvorrichtung in einen "Bereit"-Modus geschaltet, wobei die Reflexionsablesungen automatisch zu eng beabstandeten (typischerweise 0,2 Sekunden) Intervallen von dem typischerweise crème-farbenen, im wesentlichen trockenen, nicht-reagierten Reagenzstreifen, durchgeführt werden. Die anfängliche Messung wird typischerweise vor der Penetration der Matrix durch die hydratisierende Flüssigkeit gemacht, kann jedoch gemacht werden nachdem die Flüssigkeit auf einen Ort auf dem Reagenzelement, anders als dort wo die Reaktion gemessen wird, aufgetragen wurde. Der Reflexionswert wird durch den Mikroprozessor evaluiert, typischerweise durch Speichern von aufeinanderfolgenden Werten im Speicher und dann Vergleichen jedes Werts mit dem anfänglichen nicht reagierten Wert. Wenn die wäßrige Lösung die Reagenzmatrix durchdringt, signalisiert der Abfall in der Reflexion den Beginn des Meßzeitintervalls. Abnahmen in der Reflexion von 5–50% können dazu verwendet werden, um die Zeitgebung zu initiieren, typischerweise ein Abfall von 10%. Auf diese einfache Weise besteht eine exakte Synchronisierung von Testmedium, das die Oberfläche erreicht, von der die Messung genommen wird und Beginn der Sequenz von Ablesung, ohne das Erfordernis von Aktivität durch den Verwender.
Wie weiter in 3 und 4 gesehen, falls gewünscht, kann der Streifen 10 in einen Schacht 50 eingeführt werden, auf der Scan-Maschine 60, durch Plazierung einer Einkerbung auf dem Indikator 10 bei ungefähr dem mittleren Punkt seiner Oberkante. Durch Bewegen der Einkerbung 15 gegen einen Pfosten 65, wird der Indikator 10 um diesen Pfosten 65 an der Einkerbung 15 drehen, so daß seine Kanten 16 innerhalb der Seiten 55 des Schachtes 50 passen werden. Dies ordnet natürlich auch wiederholt das Loch 14 über eine Testmitte 80, umfassend mindestens eine LED 5 in der Scan-Maschine 60, an. Dies stellt sicher, daß das Loch 14, das eine Probe enthält, eine gleichmäßige Dosis von einfallendem Licht für die Analyse aufweisen wird.
Eine entfernbare Kappe oder andere Abdeckung 90 wird bevorzugterweise über die Optik plaziert, um die Anordnung vom umgebenden Licht abzuschirmen. Während der Initialisierungsprozeß im Licht beginnen kann, neigen direktes Sonnenlicht oder Raumbeleuchtung hoher Intensität dazu, die Ergebnisse zu inhibieren. Die Kappe 90 muß nicht lichtdicht sein. Es ist ausreichend, daß sie das Kissen 11 lediglich von direktem Licht abschirmt.
Die Meßsequenz wird dann durch Drücken eines Knopfes auf dem Meßapparat initiiert, der den Mikrocomputer aktiviert, um eine Messung von reflektiertem Licht von dem nicht-reagierten Reagenzkissen abzunehmen, was eine R_W-Ablesung genannt wird. Die Kappe 90 wird dann entfernt und eine hydratisierende Lösung wird auf den Indikator 10 aufgetragen, typischerweise während der Reagenzstreifen 10 mit der Optik und der Ablesevorrichtung registriert wird. Wie früher beschrieben, kann die hydratisierende Lösung einige oder alle der Reagenzien enthalten oder die Reagenzien können in dem Kissen 11 inkorporiert sein, was die Verwendung von deionisiertem Wasser allein als hydratisierendes Mittel ermöglicht. Es ist bevorzugt, daß der Reagenzstreifen in Registrierung mit der Optik belassen wird, um eine Handhabung zu minimalisieren. Die Kappe 90 wird dann geschlossen.
Eine besonderes genaue Evaluierung von Wasserstoffperoxidspiegel kann unter der Verwendung des Hintergrundstroms, d.h. des Stroms aus dem angeschalteten Photodetektor, wobei jedoch kein Licht von dem Reagenzkissen reflektiert wird, durchgeführt werden, um eine Hintergrundkorrektur durchzuführen.
Mit einer leichten Modifikation des Verfahrens kann jedoch dieser Wert bei jeder Analyse für genauere Ergebnisse gemessen (oder normalisiert) werden. Jede LED wird vor der Hydratisie rung des Kissens 11 angeschaltet. Ein Reflexionswert des Indikators 10 wird dann gemessen, wobei die Lichtschutzkappe 90 geschlossen ist. Falls dieses Messung unterschiedlich zu der Ausgangsmessung des Reflexionswerts ist, wird die Spannung an die LED erhöht, so daß die Reflexion dieselbe sein wird. Die Einrichtung des Verfahrens hat zwei Gründe. Erstens wird die Intensität von Licht-emittierenden Dioden von LED zu LED stark variieren, sogar wenn die Meß-LED neu ist. Zweitens wird die LED-Effizienz sowohl mit der Temperatur als auch der Halbwertszeit der LED variieren. Mit diesem Verfahren sind Ergebnisse auf derselben Skala wiederholbar.
Die zur Berechnung eines Ergebnis in einem Wasserstoffperoxidtest erforderlichen Rohdaten sind ein Hintergrundstrom, berichtet als Hintergrundreflektion R_b wie oben beschrieben; eine Ablesung des nicht-reagierten Indikators 10 R_W, der ungefähr 95% undurchlässig gegenüber Licht ist und auch oben beschrieben ist und eine Endpunktinessung R_t. Unter der Verwendung der hier beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen ist der Endpunkt nicht besonders stabil und muß genau von der Hydratisierung gemessen werden. Die Endpunktmessung R_t hängt von der Zeit der Hydratisierung ab. Verschiedenen Kalibrierungskurven sind für verschiedene Hydratisierungszeiten erforderlich. Experimentelle Ergebnisse zeigen, daß eine 30-Sekunden-Reflexionsablesung R₃₀ zur Bestimmung der Menge von Wasserstoffperoxid auf dem Kissen 11 geeignet ist. Sobald das Timing bestimmt wurde und die Kalibrierung etabliert wurde, führt das Meßgerät, wie hier beschrieben, die Messung automatisch mit der vorbestimmten Zeiteinstellung durch.
Die Rohdaten werden verwendet, um Parameter proportional zum dem Integrierten des Wasserstoffperoxids zu berechnen, die leichter visualisiert werden können, als Reflexionsmessungen. Eine logarithmische Transformation von Reflexion analog zur Beziehung von Absorption und dem integrierten Aussetzen von Wasserstoffperoxid, das in der Transmissionsspektroskopie beobachtet wurde (Beersches Gesetz) kann verwendet werden, wenn gewünscht. Eine Vereinfachung der Kubelka-Monk-Gleichungen, spezifisch abgeleitet für Reflexionsspektroskopie, hat sich als besonders brauchbar erwiesen. In dieser Ableitung wird K/S mit dem integrierten Aussetzen von Wasserstoffperoxid in Zusammenhang gebracht, wobei K/S durch Gleichung 1 definiert wird. (K/S)t = (1–R*)2 / (2 × R*)
R* ist die Reflektivität, gemessen an einem bestimmten Endzeitpunkt t und ist die absorbierte Fraktion des eingestrahlten Lichtstrahls, beschrieben durch Gleichung 2, worin Rt die Endpunktreflexion R₃₀ ist. R* = (Rt – Rb) / (RW – Rb)
R* variiert von 0 für kein reflektiertes Licht (Rb) bis 1 für gesamtes reflektiertes Licht (R_W). Die Verwendung von Reflektivität in den Berechnungen vereinfacht den Meßaufbau als eine hoch-stabile Quelle stark und ein Nachweisschaltkreis wird unnötig, da diese Komponenten bei jeder R_W– und R_b-Messung überwacht werden. Für eine einzelne Wellenlängenablesung kann K/S bei 30 Sekunden (K/S)₃₀, berechnet werden. Die Kalibrierungskurven, die diese Parameter mit Wasserstoffperoxid integriertem Aussetzen (HPIE)-Messungen in Zusammenhang bringen, können genau durch die polynomiale Gleichung dritter Ordnung, die in Gleichung 3 angegeben ist, beschrieben werden. HPIE = a0 + a1(K/S) + a2(K/S)2 + a3(K/S)3
Tabelle 1 zeigt die Hintergrundreflexion R_b, die Reflexion des nicht-reagierten Indikators, R_W, die Reflexion von Endpunktmessung nach 30 Sekunden, R₃₀, die Reflexion nach 30 Sekunden R* und die Ableitung von K/S bei 30 Sekunden, (K/S)₃₀, mit verschiedenen Mengen von Wasserstoffperoxid, wie auf das Kissen 11 hinzugefügt. 5 zeigt die 30 Sekunden K/S gegenüber Wasserstoffperoxidkalibrierungskurve, wobei die Koeffizienten a0, a1, a2 und a3 jeweils –21.567, 11.966, 12,78 und 0,1391 entsprechen.
TABELLE I Koeffizienten für polynomiale Anpassung dritter Ordnung von Einzelwellenlängen- Kalibrierungskurven
Das System 60 enthält zwei Dioden 5. Falls die Dioden 5 so ausgewählt sind, um Licht bei verschiedenen Wellenlängen zu emittieren, können die Interferenzen beim Messen der Probe mathematisch beseitigt werden. Dies ist genauer in U.S.-Patent Nr. 5,304,468 beschrieben.
Die Erfindung wurde nun allgemein beschrieben, dieselbe wird unter Bezug auf die folgenden spezifischen Beispiele, die lediglich für die Zwecke der Verdeutlichung angegeben werden und nicht als die Erfindung begrenzend betrachtet werden, falls nicht anders angegeben, besser verstanden werden.
BEISPIEL 1: ONE TOUCH^TM-Streifen mit Wasserstoffperoxid/Gasplasmaverfahren
ONE TOUCH^TM-Marken-Blutglukose-Teststreifen wurden in dem STERRAD^®100-Dampfphasen-Wasserstoffperoxid/Gasplasma-Sterilisator behandelt, um zu versuchen, das integrierte Aussetzen von Wasserstoffperoxid (H₂O₂), das in einen Testpack hinein diffundiert, zu quantifizieren. Testpacks umfassen Vorrichtungen, die einen Innenraum aufweisen, der in flüssiger Verbindung mit dem Äußeren des Testpacks durch eine Diffusionsbarriere steht, wie zum Beispiel einem gewundenen Weg, um die Schwierigkeit bei der Diffusion eines sterilen Dampfes in reale Vorrichtungen zu simulieren. Das für diese Untersuchung verwendete Testpack ist ähnlich zu dem U.S.-Design-Patent 325,442 Sterilisator-Testpack. Der TYVEK/MYLAR-verpackte ONE TOUCH^TM-Streifen, der Farbstoff (MBTH und DMAB) und Enzym (Peroxidase) enthielt, wurde im Mittelteil des Testpacks plaziert. Zwei simulierte Krankenhausbeladungen mit repräsentativen Metall- und Plastikvorrichtungen wurden in die Kammer mit dem Testpack plaziert. Alle Streifen wurden bei 25 Minuten Diffusion und 15 Minuten Plasmazyklen mit verschiedenen Injektionsvolumen von 59% H₂O₂ evaluiert. Nach jedem Verfahren wurde der Streifen aus dem Testpack entfernt und mit Wasser hydratisiert, das ungefähr 17% ELMER'S Marke Weißleim (eine Polyvinylacetatharzemulsion) enthielt. Die Ablesungen wurden 30 Sekunden nach dem Hydratisierungsschritt genommen. Der Leim wird als ein Verdickungsmittel verwendet, so daß sich die Flüssigkeit nicht auf dem Streifen verteilt. Wie in 6 gezeigt wurde beobachtet, daß Standard-ONE TOUCH^TM-Marken-Blutglukose-Teststreifen für bestimmte Volumen von injiziertem Peroxid zu sensitiv sein können. Bei weniger als 1250 μl Injektion von Peroxid reagiert die Indikatorfarbe, die auf die ONE TOUCH^TM-Streifen beschichtet ist mit Wasserstoffperoxid, um eine blaue Farbe zu bilden, mit der enzymatischen Hilfe von Peroxidase nach Hydratisierung. Bei hohen Injektionsvolumen vn 59% H₂O₂ ( > 1250 μl) zeigten die ONE TOUCH^TM-Marken-Teststreifen ein "Ausbleichen" der Reagenzien, die auf diese beschichtet waren. Untersuchungen wurden dann durchgeführt, um dieses "Ausbleichungs"-Phänomen zu identifizieren und eine geeignetere Lösung festzustellen.
BEISPIEL 2: Erhöhte Farbstoffspiegel
Um zu untersuchen, ob der Ausbleichmechanismus einer Variable war, der von der Menge von vorhandenem Farbstoff abhing, wurden Streifen mit der zweifachen Menge von Indikatorfarbstoff getestet. Bei geringen Injektionsvolumen von 59% H₂O₂ (< 1250 μl) ergaben diese neuen Streifen ungefähr zweimal die Farbänderung als die regulären Streifen (siehe 6). Jedoch wurde bei höheren Peroxidspiegeln die Farbbildung ausgeschaltet. Ein definitiver Ausschaltpunkt wurde beobachtet. Dieser Farbabbau kann andere Inaktivierungsmechanismen zwischen Wasserstoffperoxid und Reagenzien anzeigen. Jedoch lag die Unfähigkeit, die verarbeiteten Streifen zu lesen, an nicht ausreichendem Indikatorfarbstoff.
BEISPIEL 3: Reagenzkinetiken
Die Rate der Reaktion von verarbeiteten Streifen wurde auch evaluiert. Die Streifen wurden bei Halbzyklen (wie Beispiel 1) laufen gelassen, wobei die Injektionsvolumen variiert wurden und dann mit einem Meß- und Aufnahmeprogramm abgelesen. Wie in 7 gezeigt wurde klar beobachtet, daß, wenn das integrierte Aussetzen gegenüber Wasserstoffperoxid anstieg, die Reaktionsrate abnahm und der Mechanismus wurde vollständig bei 2500 μl von 59% H₂O₂ eingestellt. Offensichtlich muß einer der Inhaltsstoffe auf dem Streifen bei hohen Injektionsvolumen von Wasserstoffperoxid während des Wasserstoffperoxid/Gasplasmaprozeß verschwinden, inhibiert werden oder inaktiviert werden. Bei niedrigem Spiegel von Wasserstoffperoxidinjektion (250 μl und 500 μl) verblieben immer noch ausreichend sowohl Farbe und Enzym auf dem Streifen, um die blaue Farbe zu ergeben. Wenn mehr Wasserstoffperoxid in die Kammer eingeführt wurde (750 μl, 1000 μl und 1500 μl) benötigte es eine längere Zeit, die blaue Farbe herzustellen. Dies zeigt, daß die Reduktion von entweder Farbstoff oder Enzym den Mechanismus verlangsamt, um die blaue Farbe zu produzieren. Wenn 2500 μl 59% Wasserstoffperoxid in die Kammer injiziert wurde, kann keine blaue Farbe produziert werden. Offensichtlich muß entweder die Farbe oder das Enzym verschwunden sein, inhibiert werden oder in einem Ausmaß inaktiviert werden, daß keine blaue Verbindung gebildet werden kann. Wie in Beispiel 2 gezeigt, verstärkte dieses Erhöhen des Farbstoffspiegels nicht das Farbauftreten bei dem großen Injektionsvolumen. Dieses Phänomen deutet auf Enzymverschwinden, Inaktivierung oder Inhibierung durch hohe Spiegel an Wasserstoffperoxid.
BEISPIEL 4: Effekt von Farbstoff (MBTH/DMAB) und Enzym (Peroxidase)
Zehn TYVEK/MYLAR-verpackte ONE TOUCH^TM-Streifen wurden in zehn Testpacks plaziert. Um den Effekt von Wasserstoffperoxid/Gasplasmaprozeß zu maximieren, wurden die Zyklen ohne die simulierte Beladung durchgeführt und bei 50 Minuten Diffusion und 15 Minuten Plasmazyklus durch den STERRAD-Marken-Wasserstoffperoxid/Gasplasma-Sterilisator mit einer Injektion von 2500 μl 59% H₂O₂ prozessiert und zehn unverarbeitete Proben wurden einer zweifachen Analyse unterzogen.
Analyse Eins: MBTH/DMAB-Konzentrationen durch HPLC
Die Menge von jedem der zwei Farbstoffkomponenten (MBTH und DMAB) wurden bestimmt durch HPLC (High Performance Liquid Chromatography) in den behandelten (2500 ml) und unbehandelten ONE TOUCH^TM-Marken-Teststreifen (Tabelle 2). Beide Farbstoffkomponenten wurden um ungefähr 25% in den verarbeiteten Streifen reduziert. Jedoch, basierend auf den zurückliegenden Daten, sollte diese Reduktion keinen signifikanten Einfluß auf die Farbentwicklung der Streifen haben. Es erschien ausreichend Farbstoff vorhanden zu sein, um behandelte Streifen zu entwickeln, bei den angegebenen Wasserstoffperoxidspiegeln.
Tabelle 2 HPLC-Analyse von behandelten und unbehandelten Streifen
Beachte, daß die DMAB- und MBTH-Spiegel Peak-Flächen relativ zu dem internen Standard sind.
Analyse Zwei: Peroxidase-Analyse durch COBAS
Der Spiegel von Peroxidase auf dem Streifen wurde durch die Verwendung von COBAS analysiert, einem Enzymanalysator, der durch Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, hergestellt wurde. Der Peroxidasespiegel wurde in den behandelten Streifen dramatisch beeinträchtigt (Tabelle 3). Die Peroxidase-Aktivität wurde um 96,2 % verringert. Diese Verringerung in der Peroxidase-Aktivität würde bedeuten, daß ein hoch integriertes Aussetzen von Wasserstoffperoxid das Enzym ausreichend inaktiviert (tötet), um die Entwicklung von blauer Farbe zu verhindern.
Tabelle 3 COBAS-Analyse von Enzymspiegeln
BEISPIEL 5: Peroxidase-Untersuchung und Zeit
Ein Testen wurde durch Verarbeiten von ONE TOUCH^TM-Marken-Teststreifen bei vier Injektionsvolumen (1250, 1450, 1800 und 2500 μl) in dem Sterilisator durchgeführt. Sechs Streifen wurden pro Zyklus untersucht. Die Beladungs- und Testbedingungen waren dieselben wie in Beispiel 1. Zwei Streifen wurden unmittelbar nach Zyklusvervollständigung entwickelt: einer mit DI H₂O (deionisiertem Wasser) und der andere mit Peroxidaselösung (0,03 Gewichtsprozent). Bei geringem integriertem Aussetzen gegenüber Wasserstoffperoxid entwickelten beide Verdünnungsmittel die Streifen (siehe Tabelle 4). Bei höherem Wasserstoffperoxid integriertem Aussetzen (> 1500 μl) wurde keine Farbveränderung in den behandelten Streifen beobachtet, wenn mit DI H₂O hydratisiert (alles der Peroxidase war inaktiviert). Jedoch bildete sich ein dunkelblaue Farbe sofort in den selben behandelten Streifen, wenn mit Peroxdiaselösung hydratisiert. Dieses Experiment bestätigte hohe Spiegel von Wasserstoffperoxidinaktivierter Peroxidase.
Um den Effekt der Zeit auf die behandelten Streifen zu verstehen, wurden zwei Streifen bei 24 Stunden und zwei bei 48 Stunden analysiert. Es gab keine Farbveränderung in all denjenigen Streifen die mit DI H₂O entwickelt wurden. Jedoch veränderten sich alle behandelten Streifen sofort ins dunkelblaue, wenn mit Peroxidaselösung entwickelt. Dies läßt vermuten, daß über die Zeit hinweg das Wasserstoffperoxid fortfährt, die aktive Peroxidase auf den Streifen abzutöten und das Wasserstoffperoxid für mindestens 48 Stunden nach Zyklusvervollständigung stabil ist. Tabelle 4 Qualitative Analyse von Wasserstoffperoxid-Aktivität über die Zeit mit Peroxidase-Enzym
Anmerkungen:

– Die ersten drei Injektionsvolumen bei 5 min. Testen veränderten sich von weiß zu leicht bläulich. Jedoch veränderten sich die Streifen, die mit Peroxidase entwickelt wurden, zu einer viel dunkleren blauen Farbe.
– Die Reaktionsrate für Streifen, die mit Peroxidase entwickelt wurden ist schneller als die für DI H₂O.
– Bei einem Injektionsvolumen (2500 μl) können die Streifen nicht mit DI H₂O entwickelt werden.
– Die gesamte Peroxidase ist inaktiviert.
– Das Peroxid fährt damit fort, das Peroxidase-Enzym über die Zeit hinweg abzutöten.
– Kleinere Injektionsvolumen (1250 μl, 1440 μl und 1800 μl) wurden nicht mit Wasser entwickelt (keine Farbveränderung) bei 24 und 48 Stunden, im Gegensatz zu nach 5 Minuten.
– Peroxid verläßt die Nylonoberfläche der Streifen über die Zeit hinweg nicht. Die Streifen wurden mit Peroxidase bis zu 48 Stunden nach dem Testen entwickelt.

Auch wurde ein weiterer Test durchgeführt um die Reaktionsrate in den behandelten Streifen zu messen. Drei Injektionsvolumen (500, 1450 und 2500 μl) wurden untersucht; zwei Streifen pro Zyklus. Es wurde beobachtet, daß bei geringeren Injektionsvolumen Streifen, die mit Peroxidaselösung entwickelt wurden, signifikant schneller waren als die Streifen, die mit größeren Injektionsvolumen behandelt wurden. Es wird geglaubt, daß die verbleibende Peroxidase auf dem Streifen, wenn m it einem geringen Spiegel von Wasserstoffperoxid behandelt, die Entwicklung der Farbe verstärkt. Ein Streifen, der mit hoch integriertem Aussetzen von Wasserstoffperoxid behandelt wurde, kann nur mit der hinzugefügten Peroxidaselösung entwickelt werden, aufgrund der Inaktivierung von Peroxidase auf dem Streifen während des Wasserstoffperoxid/Gasplasma-Verfahrens.
Es scheint, daß die Peroxidase-Inaktivierung bei hoch integriertem Aussetzen von Wasserstoffperoxid die Farbkopplungsreaktion in dem Sterilisationssystem behindert. Unter Verstehen des aktuellen Mechanismus der Reaktion können Modifikationen mit den Streifen und dem ONE TOUCH^TM-Marken-Meßgerät gemacht werden, um eine quantitative Ablesung von Wasserstoffperoxid zu erhalten, die in jedem Bereich der Kammer vorhanden ist. Der Farbstoff und das Enzym können entweder vorher auf dem Streifen sein oder nach dem Wasserstoffperoxid oder Wasserstoffperoxid/Gasplasma-Verfahren hinzugefügt werden. Der Streifen kann verwendet werden, um die Menge von Wasserstoffperoxid entweder in wäßriger Wasserstoffperoxidlösung oder einem Dampfphase-Wasserstoffperoxid-Verfahren zu bestimmen. Für das Dampfphase-Wasserstoffperoxid-Verfahren oder das Wasserstoffperoxid/Gasplasma-Verfahren muß der Streifen nach dem Verfahren hydratisiert werden, um die Farbveränderung zu beginnen. Die Hydratisierungslösung kann ein Verdickungsmittel umfassen, um ein Verteilen der Flüssigkeit auf dem Substrat zu verhindern. Das Verdickungsmittel kann Weißleim oder andere Chemikalien umfassen, die die Viskosität der Lösung erhöhen, jedoch nicht mit der chemischen Reaktion oder der Ablesung der Reflexion interferieren.
Während die Erfindung nun vollständig beschrieben wurde, wird es dem Fachmann im Stand der Technik ersichtlich sein, daß viele Modifikationen und Veränderungen davon gemacht werden können, ohne sich von dem Bereich der Erfindung, wie in den folgenden Ansprüchen definiert, zu entfernen.

Claims

Verfahren zum Nachweis des integrierten Aussetzens von Wasserstoffperoxid in einer Atmosphäre, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt von: – Plazieren eine Substrats, das in der Lage ist Wasserstoffperoxid zu absorbieren, in die Atmosphäre; – In Kontakt bringen des Substrats mit dem Wasserstoffperoxid; – Reagieren des Wasserstoffperoxids mit einem Farbstoffzwischenprodukt und einem Enzym, um ein Chromophor zu produzieren, das für das integrierte Aussetzen von Wasserstoffperoxid in der Atmosphäre Indikativ ist; und – Korrelieren des Chromophors mit dem integrierten Aussetzen von Wasserstoffperoxid in der Atmosphäre.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Farbstoffzwischenprodukt eine Farbstoff-Kupplung von 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazonhydrochlorid (MBTH) und 3-Dimethylaminobenzoesäure (DMAB) umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Enzym Peroxidase ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Farbzwischenprodukt einen Sauerstoffakzeptor umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Sauerstoffakzeptor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: – O-Dianisidin; – O-Toluidin; – O-Tolidin; – Benzidin; – 2,2'-Azinodi-(3-ethylbenzthiazolinsulphonsäure-(6)); – 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon plus N,N-Dimethylanilin; – Phenyl plus 4-Aminophenazon; – Sulfoniertes 2,4-Dichlorphenol plus 4-Aminophenazon; – 3-Methyl-2-benzothialzolinonhydrazon plus 3-(Dimethylamino)benzoesäure; – 2-Methoxy-4-allylphenol; und – 4-Aminoantipyren-dimethylanilin.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Substrat eine poröse Aufnahme ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt von Korrelieren des Chromophors mit dem integrierten Aussetzen von Wasserstoffperoxid in der Atmosphäre ein Lesen des Chromophors mit einem Spektrophotometer umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt von Korrelieren des Chromophors mit dem integrierten Aussetzen von Wasserstoffperoxid in der Atmosphäre ein Vergleichen des Chromophors mit einer Farbtafel umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Farbstoffintermediat sich vor dem in Kontakt bringen des Substrats mit dem Wasserstoffperoxid auf dem Substrat befindet.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Farbstoffintermediat nach dem in Kontakt bringen des Substrats mit dem Wasserstoffperoxid auf das Substrat hinzugefügt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Farbstoffintermediat eine erste Farbe aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Chromophor das Auftreten einer zweiten Farbe bewirkt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Chromophor das Verschwinden der ersten Farbe bewirkt.
Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend ein Entfernen von Luft aus der Atmosphäre und Erzeugen von Wasserstoffperoxiddampf in der Atmosphäre.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Enzym vor einem in Kontakt bringen des Substrats mit dem Wasserstoffperoxid auf dem Substrat vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Enzym nach dem in Kontakt bringen des Substrats mit dem Wasserstoffperoxid auf das Substrat hinzugefügt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend Hydratisieren des Substrats.
Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend ein Hinzufügen von Verdickungsmittel zu dem Substrat.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Verdickungsmittel Weißleim umfaßt.