DE60030978T2

DE60030978T2 - Verfahren zur anwendung einer sensoreinheit

Info

Publication number: DE60030978T2
Application number: DE60030978T
Authority: DE
Inventors: Ernst Wolfgang BUDACH; Dieter Neuschaefer
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1999-07-05
Filing date: 2000-07-03
Publication date: 2007-06-14
Anticipated expiration: 2020-07-04
Also published as: DE60030978D1; PT1192448E; JP2003503732A; ATE340996T1; CN1369059A; KR20020019473A; CN100397068C; US6707561B1; HK1046438B; WO2001002839A1; EP1192448A1; EP1192448B1; JP4684507B2; ES2273704T3; CY1107541T1; DK1192448T3; HK1046438A1; AU5824300A; KR100883079B1

Description

Die Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Analyse von Proben und insbesondere aber nicht ausschließlich die Anwendung im Gebiet der Affinitätssensorik, beispielsweise jene, die als DNA-, Protein-, Peptid- und Antikörperchiptechnologie bekannt ist. Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse von Proben, die eine Sensorplattform verwenden.
Techniken zur Analyse von zweidimensionalen Anordnungen von Proben sind bekannt. Eine solche Technik ist als ELISA Test bekannt und basiert auf der innigen biochemischen Reaktion zwischen Antikörpern und Antigenen. Es werden spezielle mono- oder polyklonale Antikörper auf Substrate immobilisiert und reagieren mit komplementären Spezies. Es werden mit Fluorophor markierte Marker zugegeben, über Enzym-gebundene Antikörper aktiviert und die Proben werden mit Licht bestrahlt, um die Fluoreszenz zu induzieren. Die Fluoreszenz wird detektiert und die Intensität der Fluoreszenz zeigt die Affinitätsreaktion an.
Eine weitere bekannte Technik ist die, welche in WO 98 27 430 A beschrieben ist. Hierin ist eine große Anzahl an unterschiedlichen Spezies in einer Anordnung auf einem Substrat immobilisiert. Die Spezies sind durch photolithographische Mittel auf dem Substrat immobilisiert. Es werden Fluorophor-markierte Marker zu den Spezies gegeben. Es wird eine Probe hergestellt und mit der immobilisierten Spezies umgesetzt und der gesamte Chip wird mit einem fokussierten Laserstrahl gescanned. Alternativ dazu wird eine Probe hergestellt und mit Fluorphor-markierten Markern modifiziert und mit der immobilisierten Spezies umgesetzt und der gesamte Chip wird mit einem fokussierten Laserstrahl gescanned. Die Fluoreszenzsignale werden durch Photodetektoren detektiert und es wird ein 2D Muster hergestellt. Veränderungen in diesem Muster zwischen individuellen Proben liefern eine Indikation für Unterschiede in der Genexpression und liefern daher eine Information über Pharmakologie und Toxikologie.
Eine weitere Technik ist jene, die auf abklingenden Wellensensoren basiert. Diese verwenden kohärentes Laserlicht, das in einer sehr dünnen Schicht gefangen wird und sogenannte abklingende elektromagnetische Felder erzeugt, die sich über eine kleine Strecke außerhalb des tatsächlichen physikalischen Sensors ausdehnen.
Das Feld kann mit Molekülen wechselwirken, die an die Oberfläche des Sensors gebunden sind. Diese abklingende Anregung oder Wechselwirkung ist auf eine Region sehr nahe zur Nachbarschaft des Wellenleiters beschränkt, typischerweise 0,5 μm für das sichtbare Licht von der Oberfläche. Die abklingenden Felder bleiben räumlich lokalisiert und transferieren ihre gespeicherte Energie nicht in andere Regionen. Die Wechselwirkung des Laserlichts mit Molekülen kann in vielen verschiedenen Wegen verwendet werden. Diese umfassen:

1. Detektion der durch das abklingende Feld induzierten Lumineszenz
2. Detektion von Veränderungen im Brechungsindex, die auftreten, wenn die Moleküle einer Probe an Einfangmoleküle binden.
3. Detektion von Oberflächenplasmonresonanz.

Ein bestimmter Sensor, der ein abklingendes Feld verwendet, ist als planarer Wellenleitersensor bekannt. Der planare Wellenleitersensor umfasst ein planares Substrat, worauf eine dünne Wellenleiterschicht ausgebildet ist. Ein Teil der Wellenleiterschicht umfasst ein Raster auf das das Laserlicht trifft und wovon das Laserlicht ausgeht, so dass es sich durch die Wellenleiterschicht auf eine Sensorregion fortsetzt, die vom Raster entfernt ist. Der Wellenleitersensor kann entweder in einem Masse-sensitiven Modus (siehe 2,3 oben) oder mit überlegener Empfindlichkeit in Kombination mit der Lumineszenzanregung und -detektion (siehe 1 oben) verwendet werden. Die Einfangmoleküle sind im Sensorbereich immobilisiert und der Analyt (Probe) wird dann mit dem Sensorbereich/Einfangmolekülen in Gegenwart von zugegebenen markierten Molekülen mit einer ähnlichen Affinität (Kompetition) in Kontakt gebracht. Alternativ dazu können die Analytmoleküle an immobilisierte Einfangmoleküle binden und es werden Fluoreszenzmarkierungen durch Umsetzung einer weiteren markierten Spezies mit den eingefangenen Analytmolekülen eingeführt. Das in die Wellenleiterschicht eintretende Licht führt zur abklingenden Anregung der Fluorophore, die dann die Quantifizierung des Analyten erlaubt.
Die emittierte Fluoreszenz wird detektiert und die Intensität der Fluoreszenz liefert eine Indikation der Interaktion, die zwischen den Affinitätspartnern aufgetreten ist, die im Analyten und den immobilisierten Einfangmolekülen vorkommen. Es sollte erwähnt werden, dass in diesem Typ der Anordnung die Laserbestrahlung sich innerhalb des Wellenleiters über relativ lange Distanzen fortsetzt und das Kupplungsraster und die Sensorbereiche geometrisch getrennt sind (Siehe WO 95 33 197 A, WO 95 33-198 A und WO 96 35 940 A).
Die EP 0 455 067 A2 beschreibt einen planaren Wellenleitersensor, der das Detektionsprinzip der Brechungsindexveränderungen ausnutzt. Die flachen Rinnen, die über die gesamte Plattform ausgebildet sind, kuppeln polarisiertes, kohärentes Licht in die transparente Wellenleiterschicht, wo es nach einer bestimmten Strecke ausgekuppelt wird. Der Winkel der ausgekuppelten Strahlveränderungen verändert sich, wenn Analytmoleküle an Einfangmoleküle binden.
Ein weiteres Beispiel für den Brechungsindextyp ist in US 5 738 825 A angegeben. Die Plattform enthält individuelle Raster, die im Kontakt mit den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte stehen.
Die EP 0 178 083 A beschreibt Oberflächenplasmonresonanz (SPR), worin die Energie der eintreffenden Photonen in elektrische Energie als Oberflächenplasmonwelle umgewandelt wird. Die Sensorarchitektur erfordert eine Metallschicht im Gegensatz zur Plattform der vorliegenden Erfindung und die Menge an reflektiertem Licht beim kritischen Winkel beträgt oder ist nahe 0 im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung, worin die reflektierte Intensität fast 100% erreicht.
Alle obigen Techniken leiden an verschiedenen Nachteilen. Einige sind sehr langsam, da jede Probe einzeln angeregt werden muss. Andere, wie der planare Wellenleiter, erlauben eine Anregung von mehr als einer Probe gleichzeitig, aber stellen nicht vollkommen verlässliche Ergebnisse aufgrund des Fluoreszenzaustausches zwischen den unterschiedlichen Einfangelementen und den lokal variierenden Anregungslichtintensitäten aufgrund von Verlusten der Wellenleiter und lokalen Variationen der gekuppelten Energie aufgrund von Variationen in der Rasterung der Kupplungseffizienzen bereit.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Technik, die es erlaubt, mehrere Proben simultan in einer extrem empfindlichen, verlässlichen und quantitativen Art zu analysieren.
Im Gegensatz zu planaren Wellenleitersensoren zeigt die vorliegende Erfindung keinen Lumineszenzaustausch und die lokalen Lichtintensitäten sind gut definiert. Die vorliegende Erfindung erlaubt einen echten Mehrfachansatz, das heißt der Umwandler erfordert keine gestapelte Struktur (wie es der Fall für planare Wellenleiter ist) und kann als universelle Plattform gesehen werden, bei der in Abhängigkeit von den Anforderungen die Größe und Anzahl der Erkennungselemente innerhalb der technisch möglichen Grenzen variiert werden kann ohne dass Veränderungen in der Chipstruktur notwendig sind (gewellte Bereiche und Sensorbereiche sind nicht getrennt wie im Fall von planaren Wellenleitern). Zusätzlich liefert die Erfindung etwa hundertfach stärkere Lumineszenzintensitäten im Vergleich zu vorherigen Epifluoreszenztechniken. Die experimentelle Anordnung ist sehr einfach und erfordert nur eine einfache Anpassung des Winkels des eintreffenden Lichtstrahls. Die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Umwandler können leicht an herkömmliche Fluoreszenzmikroskope, konfokale Mikroskope und Laserscanner angepasst werden. Ferner fallen für Umwandler mit einer breiten Resonanzbreite (definiert als volle Breite am halben Maximum, FWHM) und einer Resonanzposition bei oder nahe dem normalen Eintreffen Winkelanpassungen weg.
Das Produktionsverfahren der Plattform ist relativ einfach (billig) und die Performance der existierenden Systeme (das heißt Fluoreszenzscanner, Mikroskope, Fluoreszenzmikrotiterplattenlesegeräte ...) können leicht durch mäßige Anpassungen der jeweiligen Einstellungen erhöht werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Analyse einer Probe oder von Proben bereitgestellt, das den Schritt aufweist, die eine oder die mehreren Proben mit der Sensorfläche einer Sensorplattform in Kontakt zu bringen, wobei diese Plattform ein optisch transparentes Substrat mit einem Brechungsindex n₁ aufweist, wobei eine nichtmetallische, optisch transparente Schicht auf einer Fläche des Substrats ausgebildet ist, wobei diese Schicht einen Brechungsindex n₂ aufweist, der größer ist als n₁, wobei in der Plattform eine oder mehrere wellenförmige Strukturen ausgebildet sind, die periodische Rinnen aufweisen, die einen oder mehrere Sensorbereiche oder -regionen jeweils für ein oder mehrere Einfangelemente definieren, wobei:

(a) die Tiefe der Rinnen von 3 nm bis zur Dicke der optisch transparenten Schicht reicht,
(b) die Dicke der optisch transparenten Schicht im Bereich von 30 bis 1000 nm liegt,
(c) die Periode der wellenförmigen Struktur im Bereich von 200 bis 1000 nm liegt,
(d) das Verhältnis der Rinnentiefe zur Dicke der optisch transparenten Schicht (32) im Bereich von 0,02 bis 1 liegt, und
(e) das Verhältnis der Rinnenbreite zur Periode der Rinnen im Bereich von 0,2 bis 0,8 liegt, wodurch
1) kohärentes Licht, das in einem entsprechenden Winkel auf die Plattform auftrifft, in einzelne Strahlen oder Beugungsordnungen gebeugt werden kann, die miteinander interferieren, was zu einer Reduzierung des durchgelassenen Strahls und einer abnormal hohen Reflexion des einfallenden Lichts führt, wodurch ein erhöhtes abklingendes Feld an der Oberfläche des einen oder der mehreren Sensorbereiche erzeugt wird; oder
2) kohärentes und linear polarisiertes Licht, das in einem entsprechenden Winkel auf die Plattform auftrifft, in einzelne Strahlen oder Beugungsordnungen gebeugt werden kann, die miteinander interferieren, was zu einer nahezu vollständigen Auslöschung des durchgelassenen Strahls und einer abnormal hohen Reflexion des einfallenden Lichts führt, wodurch ein erhöhtes abklingendes Feld an der Oberfläche des einen oder der mehreren Sensorbereiche erzeugt wird, und wodurch die Sensorplattform mit einem Lichtstrahl bestrahlt wird, der in einem solchen Winkel auf die Plattform auftrifft, dass eine abklingende Resonanz hervorgerufen wird, wodurch das erhöhte abklingende Feld innerhalb des Sensorbereichs der Plattform entsteht und Detektionsstrahlung von dem Sensorbereich abgestrahlt wird.

Wie hierin verwendet soll die Orientierung so verstanden werden, dass der elektrische Feldvektor von linear polarisiertem Licht parallel oder senkrecht zu den Rinnen läuft. Wie hierin verwendet soll kohä rentes Licht so verstanden werden, dass die Kohärenzlänge der Strahlung, das heißt die räumliche Ausdehnung, zu der der eintreffende Strahl eine definierte Phasenbeziehung aufweist, groß im Vergleich zur Dicke der Plattform ist.
Das abklingende Feld zerfällt exponentiell innerhalb der Wellenlängendimensionen des eintreffenden Strahls (weniger als 1 μm).
Ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer Plattform, worin die sogenannte abklingende Resonanz erzeugt werden kann. Abnormale Reflexion ist ein Phänomen, das theoretisch im Stand der Technik beschrieben wurde, beispielsweise in einer Veröffentlichung mit dem Titel "Theory and applications of guided mode resonance filters" von S. S. Wang und R. Magnusson in Applied Optics, Band 32, Nr. 14, 10. Mai 1993, Seiten 2606 bis 2613 und in einer Veröffentlichung mit dem Titel "Coupling gratings as waveguide functional elements" von O. Parriaux et al, Pure & Applied Optics 5, (1996), Seiten 453–469. Wie in diesen Veröffentlichungen erklärt kann das Resonanzphänomen in planaren Brechungsrinnen der dielektrischen Schicht auftreten, wo ein fast 100% Wechsel der optischen Energie zwischen reflektierten und übertragenen Wellen auftritt, wenn die Rinnen des Brechungsrasters eine ausreichende Tiefe haben und die eintreffende Bestrahlung auf die Rasterstruktur in einem bestimmten Winkel auftritt. In der vorliegenden Erfindung wird dieses Phänomen im Sensorbereich der Plattform ausgenutzt, wobei die Sensorfläche Brechungsrinnen mit ausreichender Tiefe umfasst und das Licht auf die Sensorfläche der Plattform mit einem solchen Winkel eintrifft, dass die abklingende Resonanz im Sensorbereich auftritt. Dies erzeugt in der Sensorregion ein verstärktes abklingendes Feld, das zur Anregung der zu untersuchenden Proben verwendet wird. Es sollte erwähnt werden, dass der oben erwähnte 100% Wechsel mit einem Parallelstrahl und linear polarisiertem kohärentem Licht auftritt und der Effekt eines verstärkten abklingenden Feldes kann auch mit nicht polarisiertem Licht eines nicht parallel fokussierten Laserstrahls erreicht werden.
Bei Resonanzbedingungen wechselwirken die einzelnen Strahlen auf eine solche Weise, dass der übertragene Strahl ausgelöscht wird (destruktive Interferenz) und der reflektierte Strahl konstruktiv unter Bildung einer abnormal hohen Reflexion wechselwirkt.
Durch die Auswahl von geeigneten Parametern für die oben erwähnte gerasterte Schichtstruktur verbleibt die Anregungsenergie hoch lokalisiert. Solche Strukturen sind in der Literatur als Photonenbandlückenstrukturen beschrieben, Materialen mit periodischen räumlichen Variationen ihres Brechungsindex, so dass sich die elektromagnetische Strahlung nicht in jede Richtung fortsetzen kann. Photonenbandlückenstrukturen erlauben das Auftreten von hoch lokalisierten Modi, siehe beispielsweise die Veröffentlichung mit dem Titel "Localisation of One Photon States" von C. Adlard, E. R. Pike und S. Sarkar in Physical Review Letters, Band 79, Ni. 9, Seiten 1585–1587 (1997). Solche Strukturen zeigen extrem große Fortpflanzungsverluste, die zu einer Moduslokalisation in ihrem Regime führen.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendete Plattform kann als optisch aktiv im Gegensatz zu optisch passiven Plattformen bezeichnet werden, die beispielsweise aus einem Glas oder einem Polymer konstruiert sind. Hier meint optisch aktiv die Verstärkung des elektromagnetischen Felds des Anregungsstrahls durch eine Energieeinsperrung.
Das Substrat der Plattform kann aus anorganischen Materialien gebildet werden, wie Glas, SoO₂, Quartz und Si. Alternativ kann das Substrat aus organischen Materialien gebildet werden, wie Polymeren, vorzugsweise Polycarbonat (PC), Polymethylmethacrylat (PMMA), Polyimid (PI), Polystyrol (PS), Polyethlyen (PE), Polyethylenterephthalat (PET) oder Polyurethan (PU) Diese organischen Materialien sind besonders bevorzugt für Gesundheitsstellen (POC) und personalisierte medizinische Anwendungen, da Glas in einer solchen Umgebung nicht akzeptiert ist. Plastiksubstrate können leichter als Glas strukturiert (geformt) werden. In einem Beispiel ist das Substrat aus Glas gebildet.
Die optisch transparente Schicht kann aus anorganischem Material hergestellt werden. Alternativ dazu kann sie aus organischem Material sein. In einem Beispiel ist die optisch transparente Schicht ein Metalloxid, wie Ta₂O₅, TiO₂, Nb₂O₅, ZrO₂, ZnO oder HfO₂. Die optisch transparente Schicht ist nicht metallisch.
Alternativ dazu kann die optisch transparente Schicht aus organischem Material sein, wie Polyamid, Polyimid, Polypropylen (PP), PS, PMMA, Polyacrylsäuren, Polyacrylethern, Polythioether, Polyphenylensulfid und Derivaten hiervon (siehe beispielsweise S. S. Hardecker et al., J. of Polymer Science: Polymer Physics, Band 31, 1951–1963, 1993).
Die Tiefe der Brechungsrinnen beträgt vorzugsweise 10 nm zur Dicke der optisch transparenten Schicht, beispielsweise 30 nm zur Dicke der optisch transparenten Schicht. Die Dicke der optisch transparenten Schicht beträgt vorzugsweise 50–200 nm, wobei die Periode der gerasterten Struktur vorzugsweise 250–500 nm beträgt, das Verhältnis der Rinnentiefe zur Dicke der optisch transparenten Schicht vorzugsweise 0,3 bis 0,7 beträgt und das Verhältnis der Rinnenbreite zur Periode der Rinnen ("Betriebszyklus") im Bereich von 0,4 bis 0,6 liegen kann.
Die Rinnen können im allgemeinen rechteckig im Querschnitt sein. Alternativ dazu können die Rinnen sinusförmig oder sägezahnförmig im Querschnitt sein. Die Oberflächenstruktur kann im allgemeinen symmetrisch sein. Bevorzugte Geometrien umfassen rechteckige, sinusförmige und trapezoide Querschnitte. Alternativ dazu können die Rinnen einen Sägezahnquerschnitt (aufgebranntes Raster) oder eine andere asymmetrische Geometrie aufweisen. In einem weiteren Aspekt kann die Rinnentiefe variieren, beispielsweise in periodischen Modulationen.
Die Plattform kann viereckig oder rechteckig sein und die Rinnen können sich linear entlang der Plattform fortsetzen, um die Oberfläche zu bedecken. Alternativ dazu kann die Plattform scheibenförmig sein und die Rinnen können zirkulär oder linear sein.
Die Rinnen können auf der Oberfläche des Substrats gebildet werden. Alternativ dazu können die Rinnen auf der Oberfläche der optisch transparenten Schicht gebildet werden. Als weitere Alternative können die Rinnen sowohl auf der Oberfläche des Substrats, das der Übergang ist, als auch auf der Oberfläche der optisch transparenten Schicht gebildet werden.
Die gerasterte Oberfläche einer einzelnen Sensorfläche kann für eine bestimmte Anregungswellenlänge und für einen bestimmten Polarisierungstyp optimiert werden. Durch geeignete Mittel, beispielsweise der Superposition von mehreren periodischen Strukturen, die parallel oder senkrecht zueinander stehen, können periodische Oberflächenreliefs erhalten werden, die für eine multiple Wellenlängenverwendung der Plattform geeignet sind ("Mehrfarbenanwendungen"). Alternativ dazu können einzelne Sen sorbereiche auf einer Plattform auf verschiedene Wellenlängen und/oder Polarisierungsorientierungen optimiert werden.
Die Oberfläche der optisch transparenten Schicht kann eine oder mehrere gerasterte Sensorbereiche umfassen, die ein oder mehrere Einfangelemente tragen.
Jedes Einfangelement kann individuelle und/oder Gemische an Einfangmolekülen enthalten, die zu Affinitätsreaktionen fähig sind. Die Form eines individuellen Einfangelements kann rechteckig, zirkulär, ellipsoidal sein oder eine andere Form aufweisen. Die Fläche eines individuellen Einfangelements beträgt zwischen 1 μm² und 10 mm², beispielsweise zwischen 20 μm² und 1 mm² und vorzugsweise zwischen 100 μm² und 1 mm². Die Einfangelemente können in einer herkömmlichen zweidimensionalen Anordnung angeordnet werden.
Der Zentrum-zu-Zentrum (ctc) Abstand der Einfangelemente kann zwischen 1 μm und 1 mm, beispielsweise 5 μm bis 1 mm, vorzugsweise 10 μm bis 1 mm liegen.
Die Anzahl an Einfangelementen pro Sensorbereich beträgt zwischen 1 und 1 000 000, vorzugsweise 1 und 100 000. In einem weiteren Aspekt ist die Anzahl der auf der Plattform zu immobilisierenden Einfangelemente nicht beschränkt und kann beispielsweise der Zahl an Genen, DNA Sequenzen, DNA Motiven, DNA Mikrosatelliten, Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs), Proteinen oder Zellfragenten, die ein Genom einer Spezies oder eines Organismus von Interesse darstellen oder einer Auswahl oder Kombination hiervon entsprechen. In einem weiteren Aspekt kann die Plattform die Genome von zwei oder mehreren Spezies enthalten, beispielsweise der Maus und der Ratte.
Die Plattform kann eine Adhäsions-fördernde Schicht umfassen, die an der Oberfläche der optisch transparenten Schicht abgelagert wird, um die Immobilisierung von Einfangmolekülen zu ermöglichen. Die adhäsionsfördernde Schicht kann auch eine mikroporöse Schicht (Keramik, Glas, Si) zur weiteren Erhöhung der Test und Detektionseffizienz oder der Gelschichten umfassen, die entweder als Medium zur Ausführung der Einfangelementimmobilisierung und Probenanalyse verwendet werden können, wobei die Test- und Detektionseffizienz weiter erhöht wird oder die Trennung der Analytgemische im Sinn der Gelelektrophorese erlauben. Die Plattform kann mit einer Vielzahl an Sensorflächen oder -regionen gebildet werden, die jeweils die eigenen Brechungsrinnen haben.
Ein Merkmal der Erfindung ist, dass die Lichtenergie, die in die optisch transparente Schicht eintritt, aufgrund der Art der gerasterten Plattform sofort aus der Schicht herausgebrochen wird. Daher tritt keine oder eine vernachlässigbare Wellenleitung auf. Typischerweise beträgt die Fortpflanzungsstrecke 100 μm oder weniger, vorzugsweise 10 μm oder weniger. Dies ist eine sehr überraschend kurze Strecke. Die Fortpflanzungsstrecke ist die Strecke, über die die Energie der Bestrahlung auf 1/e verringert wird.
Der Winkelbereich des eintreffenden Lichtstrahls auf die Plattform, der zur Erzeugung einer Resonanzbedingung geeignet ist, ist durch den Winkel der Totalreflexion des eintreffenden Lichts auf die Plattform begrenzt. Bevorzugte Winkel betragen weniger als 45°, beispielsweise 30° oder weniger, beispielsweise 20° bis 10° oder weniger, beispielsweise 0,1° bis 9,9°. Der Winkel kann gleich oder nahe zum normalen Einfall sein. Der Lichtstrahl kann durch Licht-erzeugende Mittel erzeugt werden, die einen Laser umfassen, der einen kohärenten Laserstrahl emittiiert. Andere geeignete Lichtquellen umfassen Entladungslampen oder Niederdrucklampen, beispielsweise Hg oder Xe, bei denen die emittierten Spektrallinien eine ausreichende Kohärenzlänge aufweisen und Licht-emittierende Dioden (LED). Geräte zur Ausführung des Verfahrens umfassen optische Elemente zur Lenkung des Laserstrahls, so dass er auf der Plattform mit einem Winkel von 0 eintrifft und Elemente zur Formung der Polarisationsebene des kohärenten Strahls, der beispielsweise so angepasst ist, dass er linear polarisiertes Licht überträgt. Der Winkel 0 kann durch die Gleichung sin9 = n-/A definiert werden, worin A für die Periode der Brechungsrinnen steht, X für die Wellenlänge des eintreffenden Lichts steht und n für den effektiven Brechungsindex der optisch transparenten Schicht steht.
Beispiele für Laser, die verwendet werden können, sind Gaslaser, Festphasenlaser, Farblaser und Halbleiterlaser. Erforderlichenfalls kann die Emissionswellenlänge durch nicht lineare optische Elemente verdoppelt werden. Besonders geeignete Laser sind Argonionenlaser, Kryptonionenlaser, Argon/Kryptonionenlaser und Helium/Neon Laser, die Wellenlängen zwischen 275 und 753 nm emittieren. Sehr geeignet sind Diodenlaser oder frequenzverdoppelte Diodenlaser aus Halbleitermaterial, die kleine Dimensionen und einen geringen Energieverbrauch aufweisen.
Ein weiterer geeigneter Anregungstyp verwendet VCSEL's (Vertikalkavitätoberflächenemissionslaser), die individuell die Erkennungselemente auf der Plattform anregen.
Das Gerät zur Ausführung des Verfahrens kann Detektionsmittel umfassen, die so angeordnet sind, dass sie Lumineszenz detektieren, wie Fluoreszenz. Die Affinitätspartner können auf eine solche Weise markiert werden, dass ein Förster Fluoreszenzenergietransfer (FRET) bei der Bindung von Analytmolekülen an die Einfangmoleküle auftreten kann. Das Maximum der Lumineszenzintensität kann leicht relativ zur Position der höchsten abnormalen Reflexion in Abhängigkeit der Brechungsindexwerte des Schichtsystems und der entsprechenden Fresnel Coeffizienten verschoben werden.
Die Proben können entweder unverdünnt oder mit zugegebenen Lösemitteln verwendet werden. Geeignete Lösemittel umfassen Wasser, wässrige Pufferlösungen, Proteinlösungen, natürliche oder künstliche Oligomer- oder Polymerlösungen und organische Lösemittel. Geeignete organische Lösemittel umfassen Alkohole, Ketone, Ester, aliphatische Kohlenwasserstoffe, Aldehyde, Acetonitril oder Nitrile.
Löslichkeitsvermittler oder Zusätze können eingearbeitet werden und können organische oder anorganische Verbindungen oder biochemische Reagenzien sein, wie Diethylpyrocarbonat, Phenol, Formamid, SSC (Natriumcitrat/Natriumchlorid), SDS (Natriumdodecylsulfat), Pufferreagenzien, Enzyme, reverse Transkriptase, RNase, und organische oder anorganische Polymere.
Die Probe kann auch Bestandteile umfassen, die nicht in den verwendeten Lösemitteln löslich sind, wie Pigmentpartikel, Dispergiermittel und natürliche und synthetische Oligomere oder Polymere.
Die Lumineszenzfarbstoffe, die als Marker verwendet werden, können chemisch oder physikalisch, beispielsweise elektrostatisch, an einen oder mehrere Affinitätsbindepartner (oder Derivate hiervon) gebunden sein, die in der Analytlösung vorhanden sind und/oder an die Plattform angeheftet werden. Im Fall von natürlich vorkommenden Oligomeren oder Polymeren, wie DNA, RNA, Sacchariden, Proteinen oder Peptiden wie auch synthetischen Oligomeren oder Polymeren, die in den Affinitätsreaktionen beteiligt sind, sind auch interkalierende Farbstoffe geeignet. Luminophore können durch die biologische Wechselwirkung an Affinitätspartner angeheftet werden, die in der Analytlösung vorhanden sind, wie Biotin/Avidin Bindung oder Metallkomplexbildung, wie HIS Anhang-Kupplung.
Es können einer oder mehrere Lumineszenzmarker an Affinitätspartner gebunden werden, die in der Analytlösung vorkommen, um Elemente zu fangen, die an der Plattform immobilisiert sind oder sowohl Affinitätspartner, die in der Analytlösung vorhanden sind als Einfangelemente, die auf der Plattform immobilisiert sind, um das Vorkommen von einem oder mehreren Affinitätsbindungspartnern qualitativ zu bestimmen. Die spektroskopischen Eigenschaften der Lumineszenzmarker können so ausgewählt werden, dass sie die Bedingungen des Förster Energietransfers oder photoinduzierten Elektronentransfers erfüllen. Der Abstand und die konzentrationsabhängige Lumineszenz der Akzeptoren und Donoren können dann zur Quantifizierung der Analytmoleküle verwendet werden.
Die Quantifizierung der Affinitätsbindungspartner kann auf der intermolekularen und/oder intramolemukularen Wechselwirkung zwischen solchen Donoren und Akzeptoren basieren, die an Moleküle gebunden sind, welche in den Affinitätsreaktionen beteiligt sind. Die intramolekularen Zusammensetzungen der Lumineszenzdonoren und -akzeptoren, die kovalent an die Affinitätsbindungspartner gebunden sind, Molecular Beacons (S. Tyagi et al., Nature Biotechnology), die den Abstand zwischen Donor und Akzeptor nach einer Affinitätsreaktion verändern, können auch als Einfangmoleküle oder als Additive für die Analytlösung verwendet werden. Zusätzlich können pH und potentiell sensitive Luminophore oder Luminophore, die gegenüber einer Enzymaktivität sensitiv sind, verwendet werden, wie die durch Enzyme vermittelte Bildung von fluoreszierenden Derivaten.
Transfluorosphären oder Derivate hiervon können zur Fluoreszenzmarkierung verwendet werden und chemilumineszente oder elektrolumineszente Moleküle können als Marker verwendet werden.
Lumineszente Verbindungen mit einer Lumineszenz im Bereich von 400 nm bis 1200 nm, die funktionalisiert oder modifiziert sind, um an einen oder mehrere der Affinitätspartner angehängt zu werden, wie Derivate von
Polyphenyl und heteroaromatischen Verbindungen
Stilbenen,
Coumarinen,
Xanthenfarbstoffen,
Methinfarbstoffen,
Oxazinfarbstoffen,
Rhodaminen,
Fluoreszeinen,
Coumarinen, Stilbenen,
Pyrenen, Perylenen,
Cyaninen, Oxacyaninen, Phthalocyaninen, Porphyrinen, Naphthalocyaninen, Azobenzenderivaten, Distyrylbiphenylen,
Übergangsmetallkomplexen, beispielsweise Polypyridyl-Ruthenium-Komplexen, Tris(2,2'-bipyridyl)rutheniumchlorid, Tris(1,10-phenanthrolin)rutheniumchlorid, Tris(4,7-diphenyl-1,10-phenanthrolin)rutheniumchlorid und Polypyridyl-Phenazin-Ruthenium-Komplexen, wie beispielsweise Octaethyl-Platin-Porphyrin, Europium- und Terbium-Komplexen
können als Lumineszenzmarker verwendet werden.
Zur Analyse von Blut oder Serum geeignet sind Farbstoffe mit einer Absorption- und Emissionswellenlänge im Bereich von 400 nm bis 1000 nm. Ferner können Luminophore, die für zwei oder drei Photonenanregungen geeignet sind, verwendet werden.
Farbstoffe, die in dieser Erfindung geeignet sind, können funktionelle Gruppen zur kovalenten Bindung enthalten, beispielsweise Fluoresceinderivate, wie Fluoresceinisothiocyanat.
Ebenfalls geeignet sind die funktionellen Fluoreszenzfarbstoffe, die im Handel von Amersham Life Science, Inc. Texas und Molecular Probes Inc. erhältlich sind.
Andere geeignete Farbstoffe umfassen Farbstoffe, die mit Desoxynukleotidtriphosphat (dNTP) modifiziert sind, das enzymatisch in RNA oder DNA Stränge eingebaut werden kann.
Weitere geeignete Farbstoffe umfassen Quantum Dot Partikel oder Perlen (Quantum Dot Cooperation, Palo Alto, CA) oder Derivate hiervon oder Derivate von Übergangsmetallkomplexen, die mit ein und derselben definierten Wellenlänge angeregt werden können und Derivate, die eine Luminszenzemission bei unterscheidbaren Wellenlängen zeigen.
Analyten können entweder über direkt gebundene Lumineszenzmarker oder indirekt durch Kompetition mit zugegebenen mit Lumineszenz markierten Molekülen oder durch eine konzentrations-, abstands-, pH-, potential oder redoxpotentialabhängige Wechselwirkung von Lumineszenzdonoren und Lumineszenz/Elektronenakzeptoren detektiert werden, die als Marker verwendet werden, welche an ein und/oder mehrere Analytmoleküle und/oder Einfangelemente gebunden sind. Die Lumineszenz des Donors und/oder die Lumineszenz der Löschsubstanz können zur Quantifizierung der Analyten gemessen werden.
Auf dieselbe Weise können Affinitätspartner so markiert werden, dass der Elektronentransfer oder der photoinduzierte Elektronentransfer zur Löschung der Fluoreszenz nach der Bindung der Analytmoleküle an die Einfangmoleküle führt.
Geeignete Detektoren für die Lumineszenz umfassen CCD Kameras, Photovervielfacherröhren, Lawinenphotodioden, Photodioden, und Hybridphotovervielfacherröhren.
Das Detektionsmittel kann so angeordnet werden, dass es zusätzliche Veränderungen im Brechungsindex detektiert.
Der eintreffende Strahl kann so angeordnet werden, dass er die Sensorfläche oder alle Sensorflächen in einer gemeinsamen Plattform beleuchtet. Alternativ dazu kann der Strahl so angeordnet werden, dass er nur eine kleine Subfläche der zu analysierenden Sensorfläche beleuchtet und der Strahl und/oder die Plattform können so angeordnet werden, dass sie eine relative Bewegung ausführen, um die Sensorfläche der Plattform zu scannen.
Demnach kann die Detekionsvorrichtung so auf geeignete Weise angeordnet werden, um die Lumineszenzsignalintensitäten der gesamten Sensorfläche in einem einzigen Expositionsschritt zu erhalten.
Alternativ dazu kann die Detektions- und/oder Anregungsvorrichtung so angeordnet werden, um die Sensorfläche schrittweise zu scannen.
Das Gerät kann eine Kassette gegenüber der Sensorfläche der Plattform umfassen, um eine Probe mit der Sensorfläche in Kontakt zu bringen. Die Kassette kann ferner ein Mittel umfassen, um eine Probenpräparation, Verdünnung, Konzentrierung, Mischung, bio/chemische Reaktion und Trennung in einem miniaturisierten Format auszuführen (siehe WO 97 02 357 A). Das Gerät kann eine Vorrichtung vom Mikrotitertyp umfassen, um eine Vielzahl an zu untersuchenden Proben zu enthalten.
Die Erfindung wird nun nur durch Beispiele unter besonderem Bezug auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben. Die Zeichnungen sind wie folgt:
Die 1 ist eine schematische Erläuterung eines Qualitätskontrollgeräts zur Analyse der optischen Parameter und des abklingenden Resonanzzustands einer Sensorplattform.
Die 2 ist eine schematische Erläuterung einer Sensorplattform.
Die 3 ist eine schematische Ansicht, die das abklingende Feldprofil in Relation zur Plattform zeigt.
Die 4a und 4b sind schematische Ansichten, die eine Chipkassette zeigen.
Die 5 zeigt ein Anordnungslayout in einem Beispiel der vorliegenden Erfindung.
Die 6 zeigt schematisch das Layout, welches zur Messung der Fluoreszenzen gemäß einem Beispiel der Erfindung verwendet wird.
Die 7 zeigt einen Vergleich der Ergebnisse, die durch den Stand der Technik und die vorliegende Erfindung erhalten werden.
Die 8 zeigt alternative Formen der Plattform.
Die 9a bis 9c zeigen Fluoreszenzbilder, die nach der Inkubation von 30 pM PM Analyt, Regeneration und 30 pM MM Analyt unter Verwendung der vorliegenden Plattform unter Resonanzbedingungen erhalten wurden, wie dies in Beispiel 5 beschrieben ist.
Die 10 zeigt Fluoreszenzbilder und Daten, die mittels der vorliegenden Plattform unter Epifluoreszenz- und Resonanzbedingungen erhalten werden, wie dies in Beispiel 6 beschrieben ist.
Die Erfindung wird in Bezug auf die Bestimmung der Luminszenz beschrieben, die in den Proben angeregt wird. Die Bestimmung umfasst die Verwendung einer Sensorplattform, die einen Aspekt der vorliegenden Erfindung darstellt, aber es ist verständlich, dass die Verwendung einer solchen Plattform nicht notwendigerweise auf die bestimmte zu beschreibende Anwendung beschränkt ist. Die Verwendung der Plattform ist auf den in Anspruch 1 definierten Prozess beschränkt. Vor der Beschreibung der Plattform im Detail wird eine Beschreibung in allgemeinen Ausdrücken der Art bereitgestellt, wie die Plattform zur Bestimmung der Lumineszenz der Proben verwendet werden kann.
Das folgende sind Definitionen von Ausdrücken, die in der Beschreibung verwendet werden:

Plattform:: Ein gesamter Umwandler/Chip, der einen oder eine Vielzahl an Sensorbereichen enthält
Sensorbereich:: Eine gesamte gerasterte Fläche, die zur Erzeugung eines abklingenden Felds durch einen Resonanzeffekt fähig ist und ein oder eine Vielzahl an Einfangelementen enthält.
Einfangelement:: Ein individueller Sensorfleck, der ein oder eine Vielzahl an Arten von Einfangmolekülen enthält.
Einfangmolekül:: Ein individuelles Molekül, das zu einer Affinitätsreaktion fähig ist.

In den folgenden Beispielen sind alle Temperaturen in Grad Celsius angegeben und nicht korrigiert.
Unter Bezugnahme auf die 1a wird eine in der vorliegenden Erfindung verwendete Plattform in (10) gezeigt und kann ein kohärentes Licht von einem Laser (11) erhalten, wobei der Laser durch einen Linsensatz (12, 14) erweitert wurde, die einen erweiterten und parallelen Strahl (16) bilden und durch einen Polarisator (18) polarisiert wird. Wie es später detaillierter beschrieben wird, weist die Plattform (10) einen Sensorbereich auf, an den Einfangmoleküle gebunden sind. Die Wellenlänge des Lichts liegt typischerweise im UV bis NIR Bereich, vorzugsweise zwischen 350 nm und 1000 nm.
Das Gerät umfasst auch einen Detektor (20), der das durch die Plattform (10) transmittierte Licht detektiert, eine CCD Kamera (21) zur Detektion des reflektierten Lichts und eine Datenprozessierungseinheit (22).
Bei der Verwendung des Geräts lässt man einen hoch parallelen, erweiterten, kohärenten, linear polarisierten Laserstrahl (16) auf die Sensorfläche der Plattform (10) in einem geeigneten Winkel eintreffen und das durch die Plattform transmittierte Licht wird durch den Detektor (20) erfasst und das reflektierte Licht wird durch die CCD Kamera (21) aufgezeichnet. Der Durchmesser des erweiterten Anregungsstrahls übersteigt die Größe der Plattform (10). Der Winkel des einfallenden Strahls auf die Plattform wird durch Rotation der Plattform eingestellt, bis der Detektor (20) effektiv kein Licht detektiert, das durch die Plattform transmittiert wird. Dies zeigt die Existenz einer Resonanzposition, bei der die abklingende Resonanz in der Sensorfläche der Plattform auftritt. Unter dieser Bedingung erreicht die reflektierte Lichtintensität, die durch die Kamera (21) aufgezeichnet wird, ein Maximum und die Daten von der Kamera werden von der Datenprozessierungseinheit (22) zur Prozessierung aufgenommen.
Wenn man sich der Figur der Zeichnungen 2 zuwendet umfasst eine Ausführungsform der Plattform (10) ein Glassubstrat (30) in dessen Oberfläche eine Mehrzahl an Rinnen (31) geätzt wurde. Es wird eine Schicht aus optisch transparenten Metalloxid (32) auf die oberste Oberfläche des Substrats (30) abgelagert und diese Schicht (32) hat ebenfalls Rinnen (33). Das Substrat (30) kann beispielsweise aus Glas sein, wie Glas AF45, das von Schott hergestellt wird, und typischerweise eine Dicke von 0,5 mm bis 1,0 mm aufweist. Es ist ersichtlich, dass andere organische oder anorganische Materialien als Substrat verwendet werden können, vorausgesetzt sie sind optisch transparent.
Die optisch transparente Schicht ist ein dielektrischer, transparenter Metalloxidfilm, wie Ta₂O₅ mit einem hohen Brechungsindex von etwa 2,2 bei einer Wellenlänge von 633 nm, das heißt signifikant höher als der Brechungsindex des Substrats. Die Dicke dieser Schicht liegt typischerweise im Bereich von 50 bis 200 nm oder größer, beispielsweise 50 bis 300 nm. Die gerasterten Strukturen (31) und (33) haben eine Periode im Bereich von 200 bis 1000 nm, beispielsweise 200 bis 500 nm, typischerweise 250 bis 500 nm. Die Tiefe der gerasterten Strukturen/Brechungsrinnen kann im Bereich von 3 nm bis zur Dicke des optisch transparenten Schicht, vorzugsweise 10 nm bis zur Dicke der optisch transparenten Schicht betragen. Das Metalloxid kann jedes einer Anzahl von Beispielen sein, wie Ta₂O₅, TiO₂, Nb₂O₅, ZrO₂, ZnO oder HfO₂.
In einer Plattform, wie sie in 2 gezeigt ist, tritt, wenn ein paralleler Strahl eines polarisierten Laserlichts hierauf in einem bestimmten Einfallwinkel eintrifft, ein als abnormale Reflexion bekannter Effekt in dieser Schicht (32) auf. Wenn dieser Effekt auftritt, wird im wesentlichen kein Licht durch die Plattform (10) transmittiert und es wird effektiv das gesamte Licht in der Schicht (32) reflektiert, so dass das kohärente Laserlicht auf die sehr dünne Schicht (32) des Metalloxids beschränkt ist. Das entstehende hohe Laserfeld gerät teilweise aus der Schicht (32), was zu einem abklingenden Feld führt, dessen Abklingen fluoreszentes Material anregt, das sich auf der Oberfläche oder in naher Nachbarschaft der Schicht (32) befindet. Es sollte erwähnt werden, dass dieser Resonanzzustand nur erreicht werden kann, wenn die Brechungsrinnen (31, 33) mit einer bestimmten Tiefe oder mehr verwendet werden und es sollte ebenfalls erwähnt werden, dass die Strahlungsverluste einer solchen gerasterten Struktur sehr hoch sind, so dass effektiv keine Wellenleitung einer elektromagnetischen Strahlung im bevorzugten Wellenlängenbereich innerhalb der Schicht des Metalloxids (32) auftritt. Es ist ebenfalls bevorzugt, dass die Tiefe der Rinnen mindestens 10 nm beträgt, aber die abklingende Resonanz schon beginnt, sich mit flacheren Rinnen auszubilden. Wenn jedoch die zu untersuchende Probe in der Nähe der Schicht (32) ist, an der die Resonanz erzeugt wird, kann das abklingende Feld verwendet werden, um eine Lumineszenz, wie eine Fluoreszenz in der Probe anzuregen.
Ein wichtiges Merkmal der vorliegenden Plattform ist, dass die Amplitude des abklingenden Feldes bei der Resonanzposition durch eine Größenordnung von etwa 100 signifikant größer ist als die der Anordnungen des Stands der Technik (Epifluoreszenz entspricht dem Zustand ohne Resonanz).
Dies bedeutet, dass die Intensität der Lumineszenz, beispielsweise Fluoreszenz, die aus den Proben erzeugt werden kann, auch durch einen Faktor 100 erhöht wird. Die Funktion der Plattform kann in Bezug auf die Brechungsstruktur, die als Volumenraster wirkt, die Licht bricht und dass die Brechungsstrahlen unter Bildung eines Resonanzzustands wechselwirken, bei der das aus der ersten Grenzfläche reflektierte Licht und Licht, das aus der obersten Grenzfläche der obersten Oberfläche der Schicht (32) reflektiert wird, konstruktiv unter Bildung der Reflexionsmaxima wechselwirken. Unter Resonanzbedingungen wird die Laserenergie im wesentlichen auf die Dicke der dünnen Schicht (32) beschränkt, was die elektrische Feldstärke erhöht. Für eine gegebene Laserwellenlänge und Periode der gerasterten Struktur ist die Resonanz winkelabhängig. Die winkelabhängige Resonanz hat typischerweise eine Breite bei der halbmaximalen Höhe (FWHM) von > 0,1°, vorzugsweise 0,5° oder größer, beispielsweise 1,0° oder größer. Diese Resonanzbreite hängt von der Tiefe der Rinnen, dem Betriebszyklus und der Geometrie der gerasterten Struktur ab. Im Vergleich zum Kupplungsverhalten einer Wellenleiterrasterung ist die FWHM der beschriebenen Resonanz um viele Größenordnungen höher.
Es ist ersichtlich, dass die Brechungsrinnen (31, 33) auf der Plattform durch geeignete herkömmliche Techniken gebildet werden können. Ein Weg, dies zu erreichen, ist die Rinnen durch eine photographische Technik zu ätzen. Hierbei wird eine Photowiderstandzusammensetzung auf der Oberfläche des Substrats bis zu einer Tiefe von etwa 1 μm abgelagert, wobei eine periodische Struktur die der Rinnenbildung entspricht, dann in den Widerstand entweder durch Zweistrahlinterferometrie/Holographie oder durch die Verwendung einer Phasenmaske geschrieben wird und dann der Widerstand mit einer reaktiven Ionenätztechnik mittels Argongas geätzt wird und schließlich das restliche Photowiderstandmaterial von der Oberfläche entfernt wird. Diese Technik kann zur Bildung sowohl der Rinnen (31) als auch der Rinnen (33) verwendet werden. Andere Wege zur Einarbeitung der gerasterten Strukturen umfassen Prägen, Elektronenstrahlschreiben, Laserablation und LIGA Prozess.
Um eine Plattform des beschriebenen Typs in Bezug zu 2 so herzustellen, dass sie in einer Messung verwendet werden kann, wie sie in 6 erläutert ist, sollten mehrere Verfahren befolgt werden.
Der erste Schritt ist die Säuberung der Plattform zur Entfernung von Verunreinigungen von der Plattformoberfläche. Das Säuberungsverfahren kann durch viele Mittel, beispielsweise mittels eines Ultraviolettreinigers, durch Plasmareinigung oder durch chemische Reinigung mittels Materialien, wie Säuren, Basen, Lösemitteln, Gasen oder Flüssigkeiten erreicht werden.
Wenn die Plattform gereinigt wurde, ist der nächste Schritt die Aufbringung einer Schicht eines adhäsionsfördernden Mittels auf die Metalloxidschicht. Diese Schicht wird auf die Plattform aufgetragen, da Einfangelemente, die auf die Plattform aufgetragen werden müssen, nicht leicht an die Metalloxidschicht selbst haften könnten. Es gibt mehrere Wege, durch die die Schicht gebildet werden kann. Ein Weg ist die Bildung einer Netzwerkschicht aus Silanmolekülen und ein anderer Weg ist die Anwendung dessen, was als selbstzusammensetzende Monoschichten (SAM) bekannt ist. Dies sind bekannte Tech niken, die dem Fachmann bekannt sind. Eine Silanisierung, die eine Flüssig- oder Gasphase umfasst, ist beispielsweise in Colloids and Interface Science 6, L. Boksanyi, O. Liardon, E. Kovats, 1976, 95–237 beschrieben. Die Bildung von selbstzusammensetzenden Monoschichten ist beispielsweise in "Ultra thin organic films" von Abraham Ulman, 1991, Academic Press, Inc. beschrieben. Zusätzlich sind weitere Verfahren zur Immobilisierung von Einfangelementen verfügbar, wie

– chemische Modifikation der Chipoberfläche mit reaktiven Gruppen und der Einfangmoleküle mit geeigneten Linkern (U. Maskos und E. M. Southern, Nucleic Acids Research 1992, Band 20, 1679–1684)
– Modifikation der Oberfläche und Einfangmoleküle mit photoreaktiven Linkern/Gruppen (WO 98 27 430 A und WO 91 16 425 A)
– Immobilisierung über Coulombsche Wechselwirkung ( EP 0 472 990 A2 )
– Kupplung über Anhänge (beispielsweise Proteinanhänge, HIS-Anhänge) in Chelatreaktionen
– und verschiedene weitere Verfahren, wie sie beispielsweise in Methods in Enzymology, Academic Press, New York, Klaus Mosbacher (Herausgeber), Band 137, Immobilised Enzymes and Cells, 1988, beschrieben wird.
– Plasma induzierte Immobilisierung/Erzeugung von adhäsionsfördernden Schichten, die funktionelle/reaktive Gruppen enthalten, die eine direkte Kupplung von Einfangmolekülen oder derivatisierten Einfangmolekülen ermöglichen oder indirekte Kupplung von Einfangmolekülen oder derivatisierten Einfangmolekülen über chemische Linker oder photochemische Linker.

Eine adhäsionsfördernde Schicht kann beispielsweise durch Silanisierung mit 3-(Glycidoxypropyl)trimethozysilan (GOPTS) gebildet werden. Verbindungen, die nukleophile Gruppen enthalten, wie Amine, können mit der Epoxyfunktion des Silans reagieren, um kovalent immobilisiert zu werden. Eine solche Silanisierung kann daher beispielsweise zur Immobilisierung von Antikörpern verwendet werden, die mehrere Aminogruppen enthalten, da Antikörper aus Aminosäuren bestehen. Zusätzlich können auch DNA/RNA/PNA Stränge als Einfangmoleküle mit Aminogruppen modifiziert werden, um diese Einfangmoleküle kovalent an die Plattform zu binden, wie dies in Anwendungsbeispiel 4 (SNP Diskriminierung) gezeigt ist. In diesem Beispiel werden Oligonukleotide mit Aminofunktion kovalent an die Oberfläche der Plattform immobilisiert. Jedoch können andere Typen an Einfangmolekülen für diesen Zweck modifiziert werden.
Zusätzlich kann eine adhäsionsfördernde Schicht ferner chemisch modifiziert werden, um die Oberflächeneigenschaften zu ändern. Beispielsweise kann eine GOPTS-silanisierte Plattform mit funktionalisierten gesättigten oder ungesättigten organischen/heteroorganischen/anorganischen Molekülen/Derivaten funktionalisiert werden, um die hydrophobe/hydrophile Balance der Plattform zu manipulieren, das heißt den Kontaktwinkel der Plattform zu verändern. Ferner können ionische oder potentiell ionische Verbindungen verwendet werden, um positive oder negative Ladungen an der Oberfläche der Plattform zu erzeugen. Einfangmoleküle können entweder kovalent oder durch Physisorption oder durch Coulombsche Wechselwirkung von geladenen Molekülen oder durch eine Mischung hiervon an solche modifizierten Oberflächen/Plattformen gebunden werden. Dies wird später in Anwendungsbeispiel 2 gezeigt, wo 3-Amino-1-propanol verwendet wird, um die Oberflächencharakteristiken der GOPTS-silanisierten Plattform in einem zweiten Reaktionsschritt zu modifizieren, um die DNA/RNA/PNA Einfangmoleküle zu immobilisieren. In diesem Beispiel wird der an der Oberfläche der Plattform eingeführte Stickstoff (Amingruppe) durch Protonen quarternisiert und liefert daher positive Ladungen, die mit den negativen Ladun gen der DNA wechselwirken (Polyelektrolyt). Anstelle von 3-Amino-1-propanol können auch andere organische Derivate von Aminen, beispielsweise aliphatische Amine oder verzweigte aliphatische Amine oder Amine, die aromatische oder nicht-aromatische cyclische Strukturen enthalten oder Amine, die Heteroatome enthalten oder Amine, die funktionelle Gruppen enthalten oder Amine, die Kombinationen hiervon enthalten, zur Immobilsierung der Einfangmoleküle, beispielsweise DNA/RNA/PNA Stränge verwendet werden.
Es können funktionalisierte organische Moleküle verwendet werden, die Kohlenwasserstoffketten bereitstellen, um die Plattform hydrophober zu machen, polare Gruppen können verwendet werden, um die Plattform hydrophiler zu machen oder ionische Gruppen oder potentiell ionische Gruppen können verwendet werden, um Ladungen einzuführen. Beispielsweise können Polyethylenglycol (PEG) oder Derivate hiervon verwendet werden, um die Plattform hydrophil zu machen, was eine unspezifische Adsorption von Proteinen auf der Plattform/Oberfläche verhindert.
Reaktive oder photoreaktive Gruppen können an die Oberfläche der Plattform angefügt werden, die als Ankergruppen für weitere Reaktionsschritte dienen können.
Eine SAM als adhäsionsfördernde Schicht, die zur Immobilisierung von Antikörpern geeignet ist, kann durch die Behandlung der Plattform mit amphiphilen Alkylphosphaten (beispielsweise Stearylphosphat) erhalten werden. Die Phosphatkopfgruppe reagiert mit den Hydroxygruppen an der Oberfläche der Plattform und führt zur Bildung einer geordneten Monoschicht der amphiphilen Alkylphosphate. Die hydrophilen Alkylketten machen die Oberfläche der Plattform hydrophob und ermöglichen so die Physisorption von Antikörpern, wie dies in Anwendungsbeispiel 6 (Mehrfachimmuntests) gezeigt ist.
Eine SAM kann zur Immobilisierung von anderen Einfangmolekülen verwendet werden, beispielsweise für DNA/RNA/PNA Stränge. In diesem Fall können auch amphiphile Phosphate/modifizierte Phosphate, beispielsweise mit Amingruppen oder Epoxygruppen, verwendet werden. Die Einfangmoleküle können entweder direkt an die SAM gebunden werden, beispielsweise an eine aminmodifizierte SAM oder nachdem die Plattform mit organischen Aminderivaten umgesetzt wurde, beispielsweise aliphatischen Aminen oder verzweigten aliphatischen Aminen oder Aminen, die aromatische oder nicht-aromatische cyclische Strukturen enthalten oder Aminen, die Heteroatome enthalten oder Aminen, die funktionelle Gruppen enthalten oder Aminen, die Kombinationen hiervon enthalten oder alle anderen organischen, heteroorganischen und/oder anorganischen Moleküle (beispielsweise Epoxy-modifizierte SAM).
Eine adhäsionsfördernde Schicht kann aus mehreren Schichten bestehen, um die Oberflächeneigenschaften zu manipulieren, beispielsweise die Hydrophobizität, den Kontaktwinkel und die Ladungsdichte. Zusätzlich kann eine Schicht, die an die Plattform durch eine der oben erwähnten Methoden gebunden ist, eine chemische Funktionalität bereitstellen oder einführen, die entweder für die nächste, anschließende Schicht oder für die Kupplung von Einfangmolekülen oder derivatisierten Einfangmolekülen erforderlich ist. Ein Anhang von chemischen Linkermolekülen oder photochemischen Linkermolekülen kann auch als Zwischenschicht angesehen werden, die die Anbindung von Einfangmolekülen an die Plattform ermöglicht.
Diese kontrollierte Kombination an Schichten/Molekülen mit unterschiedlichen Funktionalitäten wird im allgemeinen als supramolekulare Chemie bezeichnet (J. M. Lehn, Supramolecular chemistry – Scope and Perspectives. Molecules, supermolecules and molecular devices (Nobel Lecture, 8.12.1987), Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 27, 89, 1988). Die erhaltene supramolekulare Struktur liefert eine Funktionalität, die sich von der Funktionalität der einzelnen Moleküle unterscheidet, die für die individuellen Schichten verwendet werden. Für die vorliegende Erfindung kann eine Zwischenschicht auch Luminophore in ein solches Schichtsystem einführen, das entweder als Energiedonor oder Energieakzeptor/Löscher im Sinn des Förster Energie Transfers (FRET) oder des photoinduzierten Elektronentransfers oder potentiell sensitiver Luminophore verwendet werden kann, bevor Einfangmoleküle oder modifizierte Einfangmoleküle an die Plattform gebunden werden.
Für die oben beschriebenen Methoden der Oberflächenbehandlung können die folgenden organischen oder anorganischen Moleküle und Derivate hiervon verwendet werden:
Amine, modifizierte Amine, Jeffamine, aliphatische Amine, Alkohole, Säuren, Aldehyde, Ketone, Amide, Anhydride, Phosphate, Phosphonate, Sulfate, Sulfonate, Thiole, Heteroatom-enthaltende Verbindungen, aromatische und aliphatische organisch funktionalisierte Moleküle, aromatische und aliphatische hetero-organische Moleküle, natürliche und künstliche Polymere, Silane, Moleküle, die mit chemischen oder photochemisch aktiven Gruppen modifiziert sind, Derivate hiervon und funktionalisierte, beispielsweise Omega-funktionalisierte Derivate der angegebenen Spezies.
Im Prinzip sind zum Aufbau der Schichtstrukturen, die aus einer oder mehreren Schichten bestehen, chemisch reaktive Gruppen und/oder chemische Gruppen mit speziellen physikalischen oder elektrochemischen Eigenschaften (beispielsweise Ladungen) für die verwendeten Moleküle mit allen oben beschriebenen Oberflächenbehandlungen erforderlich.
Es können entweder chemische/photochemische Wechselwirkungen (beispielsweise Addition, nukleophile/elektrophile Substitution, radikalische Reaktion, Kondensation, Reaktionen mit organischen/heteroorgansichen/anorganischen Carbonylderivaten oder photoinduzierte Reaktionen oder thermoindizierte Reaktionen, Lewis Säure/Basekonzept) und/oder
physikalische/elektrochemische Wechselwirkung (beispielsweise Coulomb-Wechselwirkung, hydrophobe/hydrophile Wechselwirkung) und/oder
biologische Wechselwirkung (beispielsweise Antigen/Antikörper, Hybridisierung, Streptavidin/Avidin-Biotin Wechselwirkung, Agonist/Antagonistwechselwirkung) und/oder
photochemische/photophysikalische Wechselwirkung
zur Kupplung zwischen Molekülen/Komponenten verwendet werden, die in ein solches Schichtsystem/eine Adhäsions-fördernde Schicht eingearbeitet werden.
Eine Adhäsionsförderung kann auch durch Ablagerung von mikroporösen Schichten oder Gelen auf der Oberfläche der Plattform, der Oberflächencharakteristiken/Funktionalität der mikroporösen Schichten oder Gele erreicht werden, die die Ablagerung von Einfangelementen erleichtern, was die erforderliche Inkubationszeit verkürzt und die Sensitivität der anschließenden Maßnahmen erhöht. Die mikroporösen Schichten können organische Verbindungen umfassen, wie Polymere, Monomere, molekulare Zusammensetzungen und supramolekulare Zusammensetzungen oder sie können anorganische Verbindungen umfassen, wie Glas, Quartz, Keramik, Silicium und Halbleiter.
Eine adhäsionsfördernde Schicht kann durch Silanisierung, beispielsweise mittels 3-(Glycidoxypropyl)trimethoxysilan (GOPTS) hergestellt werden. Die adhäsionsfördernde Schicht kann ferner chemisch modifiziert werden, um die Oberflächeneigenschaften zu verändern. Beispielsweise kann eine GOPTS-silanisierte Plattform mit funktionalisierten gesättigten oder ungesättigten organischen Molekülen umgesetzt werden, um die hydrophobe/hydrophile Balance der Plattform zu manipulieren und hierbei den Kontaktwinkel der Plattform zu verändern.
Wenn die adhäsionsfördernde Schicht auf der Plattform gebildet wurde, können ein zusätzlicher Schritt oder zusätzliche Schritte erforderlich sein, um überschüssige Chemikalien zu entfernen, die bei der Herstellung einer solchen Schicht verwendet werden. Nach der Reinigung ist die Plattform dann fertig, um die Einfangelemente zu erhalten.
Es wird eine zweidimensionale Anordnung von Einfang- oder Erkennungselementen auf der 3-D Oberfläche der adhäsionsfördernden Schicht gebildet, die vorher auf der Plattform abgelagert wurde. Die Anordnung der Einfangelemente kann auf eine Vielzahl an Wegen abgelagert werden. Techniken, die verwendet werden können, um Einfangelemente abzulagern, umfassen Tintenstrahldrucker, die piezoelektrische Auslöser, elektromagnetische Auslöser, Druck/Magnetventilauslöser oder andere Kraftumwandler aufweisen, Blasenjetdrucker, die thermoelekrische Auslöser verwenden oder Laserauslöser, Ringnadeldrucker, Nadelwerkzeugauftragungen, eine Auf-Chip-Synthese, wie sie in WO 90 03 382 A oder WO 92 10 092 A beschrieben ist, im sehr großen Maßstab immobilisierte Polymersynthese (VLSIPS), wie sie in WO 98 27 430 A beschrieben ist, Photoaktivierung/Photoabspaltung von speziell entworfenen photoreaktiven Gruppen, die an der Oberfläche der adhäsionsfördernden Schicht verankert sind, Mikrokontaktdruck, Mikrokontaktschreibstifte, Zeichenstifte oder Kissentransfer/Stempeln von Einfangelementen, Mikrofluidkanäle und Fließzellen, die durch Gießen aus Polymervorlagen, wie PMMA beispielsweise mittels PDMS (Polydimethoxysilan) hergestellt werden oder durch mikromechanische oder mechanische Mittel oder durch Ätztechniken zur lokalen Ablagerung von Einfangelementen, Strukturierung von Einfangelementen durch Photoablation oder Ablagerung von Einfangelementen, auf Gelkissen mittels einer der vorher erwähnten Techniken oder jede andere Photoimmobilisierungstechnik.
Die Einfang- oder Erkennungselemente, die auf die Plattform abgelagert werden können, sind viele und variieren. Allgemein gesprochen sollten die verwendeten Einfangmoleküle für Affinitätsreaktionen fähig sein. Beispiele für Erkennungs- oder Einfangmoleküle, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind folgende:
Nukleotide, Oligonukleotide (und deren chemische Derivate)
DNS (Doppelstrang, Einzelstrang) a) linear (und deren chemische Derivate) b) kreisförmig (zum Beispiel Plasmide, Cosmide, BACs, YACs)
Komplett-RNS, Boten-RNS, cRNS, Mitochondrien-RNS, künstliche RNS, Aptamere
PNS (Peptidnucleinsäuren)
polyklonale, monoklonale, rekombinante, gentechnisch hergestellte Antikörper, Antigene, Haptene, Antikörper-FAB-Untereinheiten (erforderlichenfalls modifiziert)
Proteine, modifizierte Proteine, Enzyme, Enzymkofaktoren oder -inhibitoren, Proteinkomplexe, Lectine, Histidin-markierte Proteine, Chelatoren für Histidinmarkierungskomponenten (HIS-tag), markierte Proteine, künstliche Antikörper, molekulare Abdrücke, Plastikörper
Membranrezeptoren, ganze Zellen, Zellfragmente und zelluläre Substrukturen, Synapsen, Agonisten/Antagonisten, Zellen, Zellorganellen, beispielsweise Mikrosome
kleine Moleküle wie beispielsweise Benzodiazapine,
Prostaglandine,
Antibiotika, Arzneistoffe, Metaboliten, Arzneistoffmetaboliten
natürliche Produkte
Kohlehydrate und Derivate
natürliche und künstliche Liganden
Steroide, Hormone
Peptide
native oder künstliche Polymere
Molekularsonden
natürliche und künstliche Rezeptoren
und deren chemische Derivate
chelierende Reagenzien, Kronenether, Liganden, supramolekulare Anordnungen
Indikatoren (pH, Potenzial, Membranpotenzial, Redoxpotenzial) und
Gewebsproben (Gewebemikroanordnungen).
Die Aktivität oder die Dichte der Einfangmoleküle kann auf mehrere Wege optimiert werden. Die Plattform mit den hierauf abgelagerten Einfangelementen kann in gesättigter Wasserdampfatmosphäre für eine definierte Periode inkubiert werden, um die gedruckten Stellen zu rehydrieren. Dies optimiert die Dichte der Einfangmoleküle, das heißt erhöht die verfügbaren Bindungsstellen pro Einheitsfläche. Anschließend können die inkubierten Chips für einen definierten Zeitraum, beispielsweise 1 Minute bei 80°C für cDNA Einfangmoleküle gebacken werden. Die Plattform kann durch Benetzen mit einer kleinen Menge an reinem Wasser oder allen anderen geeigneten Flüssigkeiten oder Lösungen gewaschen werden, um eine Kreuzkontamination der Einfangelemente durch überschüssiges ungebundenes Material zu vermeiden. Nach diesen Verfahren kann die präparierte Plattform bis zur Verwendung in einem Exsikkator gelagert werden. Vor der Verwendung des Chips kann ein zusätzliches Waschverfahren mit 0,1 bis 10 ml Hybridisierungspuffer oder anderen geeigneten Lösungen/Flüssigkeiten erforderlich sein, um die getrockneten Einfangelemente zu reaktivieren/rehydrieren und um weiter überschüssige ungebundene Einfangelemente/Pufferreste zu entfernen. Im Fall von DNA Einfangmolekülen ist das Waschverfahren am effektivsten, wenn es bei einer Temperatur zwischen 50 und 85°C ausgeführt wird.
Die Verfahrensschritte für die Chiphandhabung können durch die Verwendung von Hybridisierungsstationen automatisiert werden, wie beispielsweise der Gene TAC^® Hybridisierungsstation von Genomic Solutions Inc., Michigan, US.
Die bestimmte Messtechnik, die beschrieben werden muss, ist eine, die Lumineszenz, insbesondere Fluoreszenz umfasst. Bei der Ausführung einer Messung wird eine zu untersuchende Probe auf die Sensorfläche der Plattform gebracht, auf der die Einfangelemente bereitgestellt wurden. Um eine Fluoreszenz zu erreichen, werden Fluorophore zum System gegeben, bevor die Messung ausgeführt wird. Die Fluorophore können zur Probe beispielsweise als markierte Affinitätspartner gegeben werden, obwohl es auch möglich ist, Fluorophore an die Einfangelemente auf der Plattform anzubringen. Die Messungen basieren auf der Tatsache, dass die Fluoreszenzemission von den Einfangelementen, die markierte Einfangmoleküle enthalten und/oder von markierten Affinitätspartnern durch die Wechselwirkung mit dem zu untersuchenden Analyten oder der Probe verändert wird. Markierungen mit unterschiedlichen Anregungs- und Emissionswellenlängen können verwendet werden, wobei einer oder mehrere unterschiedliche Markierungen vorhanden sein können, wobei die Markierung 1 für ein Kontrollexperiment und die Markierung 2 für das Experiment verwendet werden können.
Die 3 zeigt schematisch das Energieprofil des abklingenden Felds in der Resonanzposition und wie es sich über die Oberfläche der Metalloxidschicht (32) hinaus fortsetzt, so dass es Fluorophore in der nahen Nachbarschaft der Sensorfläche anregen kann, beispielsweise Fluorophore, die an Einfangmoleküle gebunden sind oder Fluorophore, die an Moleküle gebunden sind, die an die Einfangmoleküle (38) gebunden sind. Das abklingende Feld nimmt exponentiell auf 0 innerhalb von etwa 1 μm ab.
Es ist ersichtlich, dass bei der Ausführung der Analyse eine oder mehrere Messungen ausgeführt werden. Eine kann eine Hintergrundmessung sein bevor die Probe mit den Einfangelementen in Kontakt gebracht wird. Eine zweite Messung kann ausgeführt werden, mit/nachdem die Probe mit den Einfangelementen in Kontakt gebracht wird. Zum Vergleich von mehreren Proben, beispielsweise "Kontrolle" und "behandelte" Probe in Genexpressionsexperimenten, kann der Chip nach dem "Kontrollexperiment" wie im Anwendungsbeispiel 2 beschrieben regeneriert werden und es können eine weitere Hintergrundmessung und eine Messung mit der "behandelten" Probe oder nachdem die Probe auf den Chip aufgetragen wurde, registriert werden. Um Information bezüglich der Reaktionskinetiken der Affinitätspartner zu sammeln, kann ein kompletter Satz an Messungen als Funktion der Inkubationszeit und/oder Nachwaschzeit aufgezeichnet werden. Eine typische Anordnung für eine solche Messung ist in 6 gezeigt. Die in 2 gezeigte Plattform wird in den Winkel eingestellt, bei der die abklingende Resonanz erreicht wird und es wird eine Messung der von der Oberfläche der Plattform emittierten Fluoreszenz mittels der CCD Kamera (66) ausgeführt. Dies liefert eine Indikation der von jeder Position emittierten Fluoreszenz auf der Anordnung der Einfangelemente, die auf der Plattform abgelagert sind. Dies kann analysiert werden, um die Affinität der Reaktionen abzuleiten, die zwischen den Einfangelementen und der zu untersuchenden Probe stattgefunden haben.
Eine Anordnung, wie sie in 6 gezeigt ist, fängt das gesamte Bild der Lumineszenz, beispielsweise die Fluoreszenz der gesamten Plattform mit einem Schuss ohne dass sich bewegende Teile während der Messung erforderlich sind. Eine solche nicht-scannende Vorrichtung kann sehr einfach und billig sein und ist speziell für Gesundheitsstellen oder tragbare Systeme geeignet. Eine weitere typische Anordnung beschränkt das kohärente Laserlicht auf Mikrometerdimensionen durch optische Elemente, wobei das elektrische Feld im Brennpunkt verstärkt wird und den Sensorbereich oder die Sensorbereiche scanned.
Es ist ersichtlich, dass eine große Vielzahl an Proben mittels der vorliegenden Technik analysiert werden kann. Die Probe wird im allgemeinen so entnommen, dass sie die gesamte zu analysierende Lösung ist und sie eine oder viele zu detektierende Substanzen enthält. Die Probe kann eine Lösung eines gereinigten und prozessierten Gewebes oder anderer Materialen sein, die aus einer Biopsie, Untersuchung, Erforschung, Forschung und Entwicklung erhalten wurde, einschließlich eine Probe für diagnostische Zwecke. Die Probe kann auch ein biologisches Medium sein, wie Eigelb, Körperflüssigkeiten oder Komponenten hiervon, wie Blut, Serum und Urin. Es können auch Oberflächenwasser, Lösungen oder Extrakte aus natürlichen oder synthetischen Medien, wie Böden oder Teile von Pflanzen, alkoholische Getränke aus biologischen Prozessen oder synthetische alkoholische Getränke sein.
Um die Messung auszuführen kann die Probe in eine Probenzelle des in den 4a und 4b der Zeichnungen gezeigten Typs eingeführt werden. Die Zelle umfasst ein Gehäuse (41), das aus einem Polymer, wie PMMA hergestellt ist. Das Polymer wurde so bearbeitet, dass es ein zentrales Kompartiment (44) mit den Abmessungen definiert, die den Dimensionen der Plattform entsprechen. Es wird eine weitere Absenkung in das Kompartiment (44) geformt, um eine Kammer (46) zu definieren, die entlang der Kanten durch einen O-Ring (47) abgedichtet ist. Die Kammer (46) ist oben und unten offen. Die zu analysierende Lösung kann in die Kammer (46) innerhalb des O-Rings (47) durch eine Flusslinie (45) eingeführt werden. Der Fluss innerhalb der Flusslinie (45) kann durch Ventile (43) kontrolliert werden. Die Zelle umfasst einen Deckel (49), der daraufgesetzt werden kann und am Gehäuse (41) befestigt werden, um die Zelle oben zu schließen. Der Deckel (49) umfasst ein Fenster (50), das sich über dem Kompartiment (46) befindet und es so erlaubt, die Strahlung durch den Deckel und in die Zelle (46) vorzudringen.
Bei der Verwendung der Zelle ist das Gehäuse (41) gegen die Oberfläche der Plattform gerichtet, die die hierauf gebildeten Einfangelemente aufweist, so dass der Deckel (49) von der Oberfläche wegsteht. Dies bringt die Kammer (46) mit der Sensoroberfläche der Plattform zusammen. Die zu untersuchende Probe wird dann in das Kompartiment (46) durch die Flusslinie (45) so eingefüllt, dass sie mit den Einfangelementen auf der Oberfläche der Plattform in Kontakt gebracht wird. Eine Messung der an verschiedenen Einfangpunkten induzierten Fluoreszenz wird dann ausgeführt, wie dies vorher beschrieben ist.
Die 8 erläutert mögliche alternative Formen der Plattform.
Die Sensorelemente können auf verschiedenen Wegen angeordnet werden, beispielsweise rechteckig, kreisförmig, hexagonal-zentriert, elipsoid, linear oder labyrinthförmig. Die Sensorfläche kann rechteckig oder rund sein oder jede andere Form aufweisen. Die Rinnen können entweder linear im gleichen Abstand oder kreisförmig im gleichen Abstand angeordnet sein oder Segmenten solcher Strukturen entsprechen.
Die Plattform kann entweder rechteckig oder scheibenförmig sein oder jede andere Geometrie aufweisen. Die Plattform kann eine oder mehrere Sensorflächen umfassen, wobei jede Sensorfläche ein oder mehrere Einfangelemente umfassen kann und jedes Einfangelement ein oder mehrere markierte oder unmarkierte Einfangmoleküle umfassen kann.
Die Plattform kann auch an Platten/Vorrichtungen vom Mikrotitertyp angepasst werden, um einen oder mehrere Tests in den individuellen Mikrotiterplattenvertiefungen auszuführen. Dies kann für alle Plattentypen erreicht werden: 96, 384, 1536 oder eine noch höhere Anzahl an Vertiefungen unabhängig von den Dimensionen der jeweiligen Mikrotiterplatte.
Das Folgende ist ein spezifisches Beispiel für eine Plattform:
1. Physikalische Performance einer 3-D Plattform: Abnormale Reflexion
1a: Plattform 1
Die Genchipsignalwandlerplattform umfasst ein planares, transparentes Substrat (Glas AF45 von Schott) mit einer Dicke von 0,7 mm. In das Substrat wird eine periodische Oberflächenstruktur durch photolithographische Mittel geätzt (Ablagerung des Photowiderstands < 1 μm, Schreiben der periodischen Struktur in den Widerstand entweder durch Zweistrahlinterferometrie/Holographie, Ätzen des Widerstands durch reaktive Ionenätzung mittels Ar Gas, Entfernung des restlichen Photowiderstands).
Die Formen der Oberflächenstruktur sind fast sinusförmig. Die Breite (Periode) einer Einzelstruktur beträgt 360 nm. Die Tiefe der Rinnen beträgt etwa 38 nm.
Auf der homogen strukturierten Glasoberfläche wird ein dielektrischer, transparenter Metalloxidfilm (Ta₂O₅) mit einem hohen Brechungsindex von etwa 2,2 bei 633 nm Wellenlänge abgelagert. Das Verfahren erfolgt durch Ionenplattierung. Die Schichtdicke beträgt 130 nm. Die primäre Struktur/Architektur der Glasoberfläche wird auf die Oberfläche der Metalloxidschicht aufgrund des hochenergetischen und anisotropen Ablagerungsverfahrens übertragen.
Wenn ein hoch paralleler, erweiterter, kohärenter Laserstrahl auf den Signalumwandler mit bestimmten Winkeln θ gerichtet wird, die einer sogenannten Resonanzposition entsprechen, wird fast das gesamte Licht durch die Singalwandlerplattform reflektiert und die Transmissionsintensität 0. Ordnung wird auf weniger als 1% verringert (verglichen mit 90–95% bei einem willlkürlichen Winkel).
Die Breite Δθ der Resonanzbedingung, bei der fast das gesamte Licht reflektiert wird, ist proportional zur Wellenlänge λ (633 nm, fixiert) und zum Strahlungsverlustkoeffizienten α. Der Strahlungsverlustkoeffizient wird durch die Tiefe des Rinnenrasters, der Geometrie und des Betriebszyklus der gewellten Struktur bestimmt und nimmt fast quadratisch mit ansteigender Rinnentiefe zu. Im vorliegenden Fall (Laserwellenlänge 633 nm, 130 nm Metalloxidschicht, 38 nm Rinnentiefe) beträgt der Strahlungsverlust etwa 2000/cm, das heißt die Ausbreitungsentfernung eines geführten Laserstrahls in einem solchen Schichtsystem beträgt 1/2000 cm = 5 μm, bevor er außerhalb der Plattform durch die periodische Struktur gestreut wird. Dies ist eine überraschend kurze Distanz. Daher findet unter diesen Umständen keine Wellenführung statt. Durch die Verfeinerung der Plattformspezifikationen kann die Ausbreitungsentfernung weiter verringert werden.
Zur Charakterisierung des Resonanzeffekts wird die Intensität des Parallelstrahls (TE Polarisation) für einen Bereich mit 4 mm Durchmesser auf 100 μW eingestellt (Energiemessgerät Newport NRC 1835). Der Winkel zwischen normalem und eintreffendem Strahl wird 1 bis 2 Grad aus der zentralen Position der anormalen Reflexion gedreht (Resonanzbedingung). Die zentrale Position liegt bei 2,5°. Die Plattform wird dann in Schritten von 5/1000° (Newport NRC Kontrollgerät PM 500) gedreht und die Veränderung der Energie des übertragenen Strahls wird verfolgt. Beim Resonanzwinkel erreicht weniger als 1% (< 1 μW) des ursprünglich übertragenen Strahls den Detektor. Die Energie des eintreffenden Laserstrahls wird vollkommen reflektiert (spiegelnd reflektierter Strahl: Etwa 100%).
Die volle Breite bei der Hälfte des Maximums der Resonanz für eine abnormale Reflexion (FWHM) beträgt im vorliegenden Fall 0,9°. Die Homogenität der Reflexion gegenüber der gesamten Signalumwandleroberfläche (18 mm × 18 mm) ist besser als 90%.
1b. Plattform 2
Die Form der Oberflächenstruktur ist fast rechteckig. Die Breite (Periode) einer Einzelstruktur beträgt 360 nm. Die Tiefe der Rinnen beträgt etwa 52 nm. Auf der homogen strukturierten Glasoberfläche wird ein dielektrischer, transparenter Metalloxidfilm (Ta205) mit einem hohen Brechungsindex von etwa 2,15 bei 633 nm Wellenlänge abgelagert. Das Verfahren erfolgt durch Zerstäuben. Die Schichtdicke beträgt 150 nm. Die Primärstruktur/Architektur der Glasoberfläche wird aufgrund des hochenergetischen und anisotropen Ablagerungsprozesses auf die Oberfläche der Metalloxidschicht übertragen.
Wenn ein hoch paralleler, erweiterter, kohärenter Laserstrahl auf den Signalumwandler mit bestimmten Winkeln θ gerichtet wird, die einer sogenannten Resonanzposition entsprechen, wird fast das gesamte Licht durch die Singalwandlerplattform reflektiert und die Transmissionsintensität 0. Ordnung wird auf weniger als 1% verringert (verglichen mit 90–95% bei einem willkürlichen Winkel).
Die Breite Δθ der Resonanzbedingung, bei der fast das gesamte Licht reflektiert wird, ist proportional zum Strahlungsverlustkoeffizienten α. Im vorliegenden Fall (Laserwellenlänge 633 nm, 150 nm Metalloxidschicht, 52 nm Rinnentiefe) beträgt der Strahlungsverlustkoeffizient mehr als 2000/cm, das heißt die Ausbreitungsentfernung von Licht, das in ein solches Schichtsystem eingebracht wird, beträgt 1/2000 cm = 5 μm, bevor es durch die periodische Struktur außerhalb der Plattform gestreut wird. Daher findet unter diesen Umständen keine Wellenführung statt.
Zur Charakterisierung des Resonanzeffekts wird die Intensität des Parallelstrahls (TE Polarisation) für einen Bereich mit 4 mm Durchmesser auf 600 μW eingestellt (Energiemessgerät Newport NRC 1835). Der Winkel zwischen normalem und eintreffendem Strahl wird 4 Grad weg vom normalem Auftreten gedreht. Die Plattform wird dann in Schritten von 5/1000° (Newport NRC Kontrollgerät PM 500) gedreht und die Veränderung der Energie des übertragenen Strahls wird verfolgt. Beim Resonanzwinkel erreichen weniger als 0,5% (< 3 μW) des ursprünglich übertragenen Strahls den Detektor. Die Energie des eintreffenden Laserstrahls wird vollkommen reflektiert (spiegelnd reflektierter Strahl: Etwa 100%).
Aufgrund der Verbreiterung der Resonanzbreite der Plattform 2 durch die tiefen Rinnen im Vergleich zu Plattform 1 überlappen die Resonanzkurven der +1 und –1 Brechungsordnung unter Bildung einer einzigen extrem breiten Resonanz, die exakt beim normalen Auftreten lokalisiert ist. Die volle Breite bei der Hälfte des Maximums der Resonanz für eine abnormale Reflexion (FWHM) beträgt im vorliegenden Fall 4,2°. Die Homogenität der Reflexion gegenüber der gesamten Signalumwandleroberfläche (18 mm × 18 mm) ist besser als 95%.
2. Beispiel für eine Genexpressionsanalyse
a) Herstellung
Sensorplattformen (Dimensionen 18 × 18 mm²) des beschriebenen Typs unter Bezugnahme auf 2 werden zuerst zweimal in Chloroform (Fluka, "puriss.") und anschließend zweimal in Isopropanol (Merck, "Uvasol^®") jeweils für 15 Minuten ultrabeschallt. Die Plattform wird dann im Vakuum getrocknet und in einem UV Reiniger für 30 Minuten gereinigt (Boeckel Industries Inc. Modell 135500). o-Xylol wird auf 75°C (Rühren) erhitzt und 2% V/V 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan (Fluka, "purum") wie auch 0,2% V/V N-Ethyldiisopropylamin (Fluka, "purum") werden zum erhitzten Lösemittel (Rühren) gegeben. Anschließend werden die Plattformen an Halter befestigt und dann für 7 h in der Lösung bei 75°C (Rühren) inkubiert. Anschließend werden die Plattformen dreimal in frischem Acetonitril (Fluka, "HPLC Reinheit") jeweils für 15 Minuten ultrabeschallt. Die Plattformen werden dann in einer Lösung aus 2% V/V an 3-Amino-1-propanol (Fluka, "purum") in Acetonitril für 15 Minuten ultrabeschallt und dann in derselben Lösung über Nacht bei Raumtemperatur (Rühren) inkubiert. Am nächsten Tag werden die Plattformen zuerst dreimal für 15 Minuten in frischem Isopropanol (Fluka, "HPLC Reinheit") ultrabeschallt und dann weitere dreimal für 15 Minuten in frischem Methanol (Merck, "Uvasol^®"). Schließlich werden die Plattformen getrocknet und im Vakuum gelagert.
b) Immobilisierung der Erkennungselemente
Tests, die aus 10 unterschiedlichen cDNAs bestehen (jeweils 10 cDNA Kopien: CYP 450 1A1, CYP 450 2B1 EST., CYP 450 2B1, CYP 450 2B2, CYP 450 3A1 Mensch, CYP 450 3A2, CYP 450 4A1, β-Actin, GAPDH, externer Standard) werden auf die Plattformen mit einem Tintenstrahldrucker (Microdrop GmbH, Norderstedt, Deutschland) gedruckt. Die Konzentration der cDNA Lösungen beträgt 50 ng/μl. Der Durchmesser (10 Tintenstrahltropfen/Position) beträgt etwa 250 μm und der Abstand der Flecken beträgt etwa 500 μm. Daher beträgt die Gesamtgröße der 10 × 10 Tests etwa 5 × 5 mm². Die Anordnung und die Zuordnung der immobilisierten cDNA Flecken ist schematisch in 5 gezeigt. Die Tests werden im Zentrum der Plattformen mit den Dimensionen (18 × 18 mm²) gedruckt. Anschließend werden die Plattformen über Nacht in einem geschlossenen Behälter in gesättigter Dampfatmosphäre inkubiert. Am nächsten Tag können die inkubierten Chips für eine definierte Periode vorgebacken werden, beispielsweise 1 Minute bei 80°C. Dann werden die Plattformen mit entionisiertem Wasser gewaschen und unter einem Stickstoffstrom getrocknet.
c) Detektionsanordnung
Die verwendete Detektionsanordnung ist schematisch in 6 gezeigt. Ein Anregungslaser (61) (HeNe Laser, 633 nm, 1,3 mW) und ein 20fach Strahlerweiterer (64) werden gemeinsam (62) auf ein Goniometer (63) montiert. Der erweiterte Laserstrahl wird durch einen dichroiden Spiegel (68) in Richtung der Plattform (67) gelenkt. Das Rotationszentrum für den Laserstrahl liegt in der Ebene der Metalloxidschicht der Plattform (67). Die von der Plattformoberfläche emittierte Fluoreszenz wird über den dichroiden Spiegel (68) gesammelt. Es werden zusätzliche Fluoreszenzfilter (65) verwendet, um die Fluoreszenz (69) vom Anregungslicht zu trennen. Eine gekühlte CCD Kamera (Astrocam EEV 30/11) (66), die mit einer Nikon Noct Linse (numerische Apertur 1,2) ausgestattet ist, wird zur Messung der Fluoreszenzbilder von den Oberflächen der Plattformen verwendet. Das Goniometer erlaubt die Einstellung des Winkels des eintreffenden erweiterten Laserstrahls in Bezug auf die normale Oberfläche der Plattform. Es werden Fluoreszenzbilder unter abnehmenden Resonanzbedingungen aufgenommen (das heißt der eintreffende erweiterte Laserstrahl wird auf den Winkel eingestellt, bei dem das durch die Plattform transmittierte Licht ein Minimum zeigt).
d) Chipkassette
Die Plattform wird auf die speziell entworfene Kassette (41) montiert, die aus PMMA/Polymer gefertigt ist, welche schematisch in 4 gezeigt ist. Die Bodenabsenkung (44) hat die Dimensionen (18 × 18 × 0,7 mm³) und die Inkubationskammer (46) ist 0,2 mm tief. Die Lösung in der Inkubationskammer wird über Fließkanäle (45) mit 0,5 mm Durchmesser ausgetauscht, die in das PMMA gebohrt werden. Der Inhalt der Kassette wird über den Einlass/Auslass (42) ausgetauscht. Die Plattform wird in die entsprechende Bodenabsenkung der Kassette positioniert, wobei die Sensorfläche in Richtung der Inkubationskammer schaut. Der Deckel (49) wird fixiert, um die Plattform gegen die Dichtung zu pressen. Das gefräste/mikrobearbeitete Fenster (50) im Deckel erlaubt die Bestrahlung mit Anregungslicht und den Erhalt von Fluoreszenzbildern der Plattformoberfläche. Das Ventil-zu-Ventil Volumen der Kassette beträgt etwa 14 μl.
e) Denaturierungseinheit
Es wird ein thermoelektrisches Element verwendet, um die Temperatur für die Denaturierung (79°C), Inkubation (42°C), Regeneration (79°C) und den Waschschritt (42°C) der Plattform in der Fließkassette zu kontrollieren.
f) Probenvorbereitung
Es werden 2 Gruppen an Ratten (jeweils 3 Ratten) für die vorliegende Studie verwendet. Eine Gruppe (behandelt) wird mit 80 mg Phenobarbital-Natriumsalz in Kochsalzlösung (0,9% G/V NaCl) pro kg Körpergewicht behandelt und die zweite Gruppe (Kontrolle) nur mit 0,9% NaCl. Es wird einmal täglich eine Behandlung für 4 aufeinanderfolgende Tage verabreicht. Am Ende der 4 Tage werden die Tiere getötet und die Leberproben werden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80°C gelagert.
Anschließend wird die gesamte RNA/mRNA isoliert und durch reverse Transkription in Erststrang cDNA markiert (Einbau von markierten Desoxynukleotiden, gleiche oder unterschiedliche Fluorophormarkierungen für die Kontrolle und die behandelte Gruppe), gereinigt und in 20 μl Hybridisierungspuffer gelöst.
g) Testprozessierung
Es wird eine Cavrostufenspritze verwendet, um Puffer und Lösungen in die Kassette zu pumpen/aspirieren.
Es werden die folgenden Schritte ausgeführt, um die CYP 450 Induktion in der Ratte zu messen:

1) 30 Minuten Vorwaschen bei 79°C mit 1 ml Hybridisierungspuffer (HB), Messung des Hintergrund 1 der Plattform im Kontakt mit HB.
2) Injektion der "Kontrollprobe" in die Kassette, 30 Minuten Denaturierung bei 79°C, dann über Nacht bei 42°C.
3) 10 Minuten Nachwaschen bei 42°C mit 1 ml HB, Messung der "Kontrollintensitäten" der Plattform im Kontakt mit HB.
4) Regeneration: 30 Minuten Waschschritt 79°C mit 1 ml Hybridisierungspuffer (HB), Messung von Hintergrund 2 der Plattform in Kontakt mit HB.
5) Injektion der "behandelten" Probe in die Kassette, 30 Minuten Denaturierung bei 79°C, dann über Nacht bei 42°C.
6) 10 Minuten Nachwaschen bei 42°C mit 1 ml HB, Messung der "behandelten" Intensitäten der Plattform in Kontakt mit HB.

Alle Fluoreszenzbilder werden unter abklingenden Resonanzbedingungen gemessen.
h) Datenprozessierung
Es werden die Nettointensitäten (Kontrolle – Hintergrund 1 und Behandelt – Hintergrund 2) für alle Flecken berechnet und alle Intensitäten des behandelten Datensatzes werden mit Hilfe der Intensitäten des externen Standards normalisiert. Die Expressionsverhältnisse (Größenordnungsänderung) zwischen den jeweiligen Genen werden berechnet durch Division von Größenordnungsänderung = normalisiert Behandelt/Kontrolle.
Es werden die Mittelwerte jeweils der 10 Kopien berechnet.
i) Ergebnisse
ER-Chips, die unter abklingenden Resonanzbedingungen gemessen werden, zeigen im allgemeinen etwa hundertfach stärkere Intensitäten und verbesserte Signal/Hintergrundverhältnisse.
Die Mittelwerte für die Größenordnungsänderung sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst:
3. Beispiel zur Erläuterung der erhöhten Amplifikation
Es wird eine Plattform gemäß dem gerade beschriebenen Beispiel hergestellt und prozessiert. Anschließend an die Inkubation mit der Probe werden 2 Bilder mit dem CDD Kameradetektionsaufbau gemacht, wie dies oben unter Bezugnahme auf 6 beschrieben ist. Das erste Bild wird im Epifluoreszenzmodus ohne Anpassung an die Bedingungen für eine abklingende Resonanz gemacht ("Epifluoreszenz" in 7a). Das zweite Bild wird unter abklingenden Resonanzbedingungen ("ER Verstärkung" in 7b) gemacht, das heißt der Winkel des eintreffenden Laserstrahls wird in Bezug auf die normale Oberfläche eingestellt bis das durch den Chip transmittierte Licht ein Minimum zeigt. Die Bildprofile (Nettosignale) zeigen, dass die mit der ER Verstärkung etwa 100 fach stärker als die Intensitäten sind, die mit der herkömmlichen Epifluoreszenz erhalten werden.
Im obigen Beispiel wird eine einzelne Probenzelle (41) verwendet, um die Probe in Kontakt mit dem Sensorbereich der Plattform zu bringen. Es ist ersichtlich, dass der Probenbehälter vom Mikrotitertyp in Kompensation mit einer Plattform mit einer Vielzahl an Sensorbereichen verwendet werden kann, um eine Messung einer Vielzahl an Proben zu erlauben und hierbei die Messeffizienz zu verbessern.
4. Oligonukleotidmikrochip zur Diskriminierung des Einzelnukleotidpolymorphismus (SNP)
a. Chipherstellung
Sensorplattformen (Dimensionen 18 × 18 mm²) des beschriebenen Typs unter Bezugnahme auf 2 werden zuerst zweimal in Chloroform (Fluka, "purum") und anschießend zweimal in Isopropanol (Merck, "Uvasol^®") jeweils für 15 Minuten ultrabeschallt. Die Plattformen werden dann im Vakuum getrocknet und in einem UV Reiniger für 30 Minuten gereinigt (Boeckel Industries Inc. Modell 135500). o-Xylol wird auf 75°C (Rühren) erhitzt und 2% V/V 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan (Fluka, "purum") wie auch 0,2% V/V N-Ethyldiisopropylamin (Fluka, "purum") werden zum erhitzten Lösemittel (Rühren) gegeben. Anschließend werden die Plattformen an Halter befestigt und dann für 7 h in der Lösung bei 75°C (Rühren) inkubiert. Anschließend werden die Plattformen dreimal in frischem Acetonitril (Fluka, "HPLC Reinheit") jeweils für 15 Minuten ultrabeschallt. Schließlich werden die Plattformen getrocknet und im Vakuum gelagert.
b) Immobilisierung der Einfangelemente
Es werden zwei unterschiedliche aminomodifzierte Oligonukleotide (Einfangsonden) in einer Schachbrett-artigen Anordnung (5 × 5 = 25 Flecken) auf silanisierte Plattformen gedruckt. Es wird eine GMS 417 Ringnadelanordnung für den Druck verwendet (Genetic Microsystems, Boston, MA). Die Konzentration der Oligonukleotide als Einfangmoleküle beträgt 100 nmol/ml. Der Durchmesser der Flecken beträgt 125 μm mit einem Zentrum-zu-Zentrum Abstand von 500 μm. Die 2 Oligonukleotide werden cPM ("Einfang mit perfekter Übereinstimmung") und cMM ("Einfang mit einer Fehlstelle") genannt und unterscheiden sich nur in einer Base:
cPM und cMM werden mit einer Aminogruppe am 5' Ende markiert, das die kovalente Bindung der Oligonukleotide an die epoxy-funktionalisierten Plattformen ermöglicht. Die Anordnungen werden im Zentrum der Plattformen mit den Dimensionen (18 × 18 mm²) gedruckt. Anschließend werden die Plattformen über Nacht in einem geschlossenen Behälter in gesättigter Wasserdampfatmosphäre inkubiert. Am nächsten Tag werden die Chips getrocknet und mit 1 ml wässriger 50% Harnstofflösung gewaschen. Alternativ dazu wird eine wässrige Rinderserumalbuminlösung (BSA 1 mg/ml) verwenedet. Nach dem Blockieren werden die Chips mit entionisiertem Wasser gewaschen und dann unter einem Stickstofffluss getrocknet.
c) Detektionsanordnung
Es wird die im vorherigen Beispiel beschriebene CCD Anordnung verwendet.
d) Chipkassette
Es wird die im vorherigen Beispiel beschriebene Kassette verwendet.
e) Analyten/Proben
Zwei Cy5-markierte Oligonukleotide, die PM ("perfekte Übereinstimmung") und MM ("Fehlstelle") genannt werden, mit Sequenzen, die komplementär zu den immobilisierten Einfangoligonukleotiden cPM und cMM sind, werden als Analyte verwendet:
Die Konzentration der Analytlösungen beträgt jeweils 30 pM.
f) Testprozessierung
Eine Plattform wird zuerst zweimal mit 1 ml Hybridisierungspuffer (HB) mit 1 Minute Verzögerung zwischen den Waschschritten gewaschen. Anschließend werden etwa 15 μl PM Analytlösung (30 pM) in die Fließkassette injiziert. Nach 30 Minuten Inkubation wird die Plattform mit 1 ml HB gewaschen und ein Fluoreszenzbild ("PM" in 9a) wird in der Resonanzposition des Chips gemacht. Anschließend werden die gebundenen Fluoreszenz-markierten Oligonukleotide entfernt (gestrippt), indem 2 × 1 ml einer wässrigen 50% Harnstofflösung mit einer Verzögerung von 2 Minuten zwischen den Injektionen injiziert werden. Nach weiteren 2 Minuten wird der Chip durch die Injektion mit 2 × 1 ml HB mit einer Verzögerung von 2 Minuten zwischen den Injektionen gewaschen und es wird ein Fluoreszenzbild ("Regeneration" in 9b) in der Resonanzposition des Chips gemacht. Schließlich werden etwa 15 μl MM Analytlösung (30 pM) in die Fließkassette injiziert. Nach einer Inkubation für 30 Minuten wird die Plattform erneut mit 1 ml HB gewaschen und es wird ein Fluoreszenzbild ("MM" in 9c) in der Resonanzposition des Chips gemacht. Alle Schritte werden bei Raumtemperatur ausgeführt.
g. Datenprozessierung
Die mittlere Intensität der 2 unterschiedlichen Gruppen der Einfangflecken (cPM und cMM) wird für beide Experimente berechnet (Inkubation von 30 pM PM Analyt und 30 pM MM Analyt). Zusätzlich wird der Unterschied der mittleren Intensität cPM – cMM und das Verhältnis cPM/cMM berechnet.
h. Ergebnisse
Alle Daten werden in der folgenden Tabelle zusammengefasst. Die zwei Oligonukleotidanalyten Cy-5 markiertes PM und Cy-5 markiertes MM, die sich nur in einer Base unterscheiden (SNP), können klar von den erhaltenen Daten unterschieden werden.
5. Beispiel für den Antikörperimmuntest
Es werden primäre Antikörper räumlich getrennt (beispielsweise im Schachbrettmuster) auf der Oberfläche der Sensorplattform immobilisiert. Die Bindung der zu detektierenden Antigene und der Lumineszenz-markierten sekundären Antikörper (zur Detektion eines zweiten Epitops der einzelnen zu detektierenden Antikörper verwendet) wird durch eine anschließende Inkubation zuerst mit dem Analyten, der die verschiedenen Antigene in verschiedenen Konzentrationen enthält, und dann mit dem Lumineszenz-markierten sekundären Antikörper erreicht.
Alternativ dazu können die Antigene (Analyt) und die Lumineszenz-markierten sekundären Antikörper in einem Vorinkubationsschritt gemischt werden, der die Komplexierung von Lumineszenz-markierten, sekundären Antikörpern mit den Antigenen erlaubt. Nach diesem Vorinkubationsschritt wird die Sensorplattformoberfläche mit dem Gemisch inkubiert.
Die Lumineszenz-markierten Immunkomplexe, die an die Oberfläche gebunden sind, werden mit der ER Einstellung quantifiziert. (Vorgewaschen mit geeignetem Puffer, PBS und erforderlichenfalls nachgewaschen).
6. Proteinmikrochips für Vielfachimmuntests
a. Chipherstellung
Die Sensorplattformen (Dimensionen 18 × 18 mm²) des oben beschriebenen Typs werden zweimal in Chloroform (Fluka, "purriss.") und anschließend zweimal in Isopropanol (Merck, "Uvasol^®") jeweils 15 Minuten gewaschen. Die Plattformen werden im Vakuum getrocknet und in einem UV Reiniger für 30 Minuten gereinigt (Boeckel Industries Inc., Modell 135500). Die Chips werden in einen kleinen Behälter gegeben und in einer 0,5 mM Lösung aus Octadecylphosphat in Propanol für 24 Stunden gelagert. Anschließend werden die Chips mit 5 ml Isopropanol gewaschen, um überschüssiges Alkylphosphat zu entfernen und im Stickstoffstrom getrocknet. Dieses Verfahren erzeugt eine selbstassemblierte Monolage (SAM) aus Alkylphosphat auf der Oberfläche der Plattformen. Die adhäsionsfördernde Schicht macht die Plattform hydophob (Kontaktwikel etwa 100°) und ermöglicht die Adsorption von Proteinen auf der Plattform durch hydrophobe Wechselwirkung.
b. Immobilisierung von Einfangelementen
Es werden zwei unterschiedliche monoklonale Antikörper, nämlich anti-humanes Choriongonadotropin (anti-hGC) und anti-Interleukin 6 (anti-IL6) in einer Schachbrett-ähnlichen Anordnung auf die hydrophoben Plattformen in gesättigter Wasserdampfatmosphäre gedruckt (4 × 4 Anordnung, 8 Flecken für jeden Antikörper). Die Konzentration der Einfangantikörperlösungen beträgt jeweils 400 und 100 μg/ml. Es wird ein Tintenstrahldrucker zum Drucken verwendet (Microdrop, Norderstaedt, Deutschland). Der Durchmesser der Flecken beträgt 150 μm mit einem 320 μm Abstand Zentrum-zu-Zentrum. Die gedruckten Anordnungen werden für 2 Stunden in einem geschlossenen Behälter in gesättigter Wasserdampfatmosphäre inkubiert. Anschließend werden die Chips getrocknet und mit 10 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, worin 10% Rinderserumalbumin (BSA), 5% Saccharose und 0,02% Natriumazid enthalten sind. Der Waschschritt blockiert die hydrophobe Oberfläche der Chips durch Adsorption von BSA und macht die Oberfläche hydrophiler, nachdem die Einfangelemente immobilisiert wurden. Als Konsequenz verhindert das Blockierungsverfahren die unspezifische Bindung von Proteinen auf die Plattform, die eine erhöhte Hintergrundfluoreszenz verursachen könnte. Nach der Blockierung werden die Chips mit entionisiertem Wasser gewaschen und mit einem Stickstoffstrom getrocknet. Die Plattformen werden bis zur Verwendung in einem Kühlschrank gelagert.
c. Detektionsanordnung
Es wird die in Beispiel 2 beschriebene CCD Einstellung verwendet.
d. Chipkassette
Es wird die in Beispiel 2 beschriebene Kassette verwendet.
e. Analyten/Proben
Es werden 3 Analytlösungen hergestellt:

I) Eine Lösung, die 500 ng/ml Cy-5 markiertes IL6 Antigen enthält
II) Eine Lösung, die 50 ng/ml Cy-5 markiertes humanes Choriogonadotropinantigen (hCG) enthält
III) Ein vorinkubiertes Gemisch (1 Stunde), das 50 ng/ml IL6 und 100 ng/ml polyklonalen anti-IL6 Antikörper enthält, der mit Cy5 markiert ist.

f. Testprozessierung
Es werden drei Plattformen (wie unter 6b beschrieben) für die Analyteninkubation (siehe e.) hergestellt, wobei die Plattformen in Kassetten eingebaut werden und mit 1 ml PBS pH 7,0 gewaschen werden, worin 1% BSA enthalten sind. Anschließend werden etwa 15 μl der Analytlösungen I), II) und III) in die Fließkassetten injiziert. Die Inkubationszeit beträgt jeweils 2 Stunden für I) und II). Für den Analyten III) beträgt die Inkubationszeit 12 Stunden. Nach der Inkubation des Analyten werden die Plattformen mit 1 ml PBS pH 7,0 gewaschen, worin 1% BSA enthalten ist. Es werden Fluoreszenzbilder von den Chips unter abwesenden Resonanzbedingungen (Epifluoreszenz, etwa 7° abweichend vom Resonanzwinkel) und unter Resonanzbedingungen für jeden Chip gemacht (Resonanz, eintreffendes Licht etwa 2,5° gegenüber normal). Die erhaltenen Bilder und Daten sind in 10 gezeigt. Alle Schritte werden bei Raumtemperatur ausgeführt.
g. Datenprozessierung
Die mittleren Intensitäten und der Hintergrund der Flecken werden mit Hilfe von Imagene^®, Array Software (Biodiscovery, Los Angeles, CA) berechnet. Der Fleckenmittelwert der 10 stellt die um den Hintergrund korrigierte mittlere Intensität der jeweiligen Einfangelemente von Interesse dar. Zusätzlich wird das Rauschen als Standardabweichung des Hintergrunds von den Fluoreszenzbildern berechnet. Daher entspricht Signal/Rauschen in 10 dem Verhältnis des Fleckenmittelwerts gegenüber der Hintergrundstandardabweichung.
h. Ergebnisse
Alle berechneten Daten sind in 1a zusammengefasst. In 10 sind Bilder und Daten zusammengefasst, die im Epifluoreszenzmodus wie auch unter Resonanzbedingungen erhalten wurden. Die Reihen I) und II) zeigen die Ergebnisse einer Immunreaktion zwischen immobilisierten monoklonalen Einfangantikörpern und markierten Antigenen (jeweils Cy5-markierte IL6 und hCG).
Die Reihe III) entspricht einer Immunreaktion vom Sandwichtyp zwischen einem immobilisierten monoklonalen Antikörper (anti IL6) und einem vorinkubierten Gemisch des IL6 Antigens und eines Cy5-markierten sekundären polyklonalen Antikörpers gegen IL6.
Für die Ergebnisse der Reihe I) erhöht sich die Signalintensität von 46 Zählungen im Epifluoreszenzmodus auf 1100 Zählungen im Resonanzmodus der Plattform. Dies entspricht einem Verstärkungsfaktor von etwa 24 in Bezug auf die Mittelwerte der Flecken. Das Signal/Rauschverhältnis verbessert sich von 7,0 (Epifluoreszenz) auf 69,2 (Resonanz), was einem Faktor von 10 entspricht.
Für die Ergebnisse von Reihe II) erhöht sich die Signalintensität von 32 Zählungen im Epifluoreszenzmodus auf 646 Zählungen im Resonanzmodus der Plattform. Dies entspricht einem Verstärkungsfaktor von etwa 20 in Bezug auf die Mittelwerte der Flecken. Das Signal/Rauschverhältnis verbessert sich von 5,0 (Epifluoreszenz) auf 75,1 (Resonanz), was einem Faktor von 15 entspricht.
Für die Ergebnisse von Reihe III) erhöht sich die Signalintensität von 25 Zählungen im Epifluoreszenzmodus auf 296 Zählungen im Resonanzmodus der Plattform. Dies entspricht einem Verstärkungsfaktor von etwa 12 in Bezug auf die Mittelwerte der Flecken. Das Signal/Rauschverhältnis verbessert sich von 3,8 (Epifluoreszenz) auf 44,1 (Resonanz), was einem Faktor 12 entspricht.
Die Fleckenmittelwerte und die Signal/Rauschverhältnisse für alle 3 Tests sind zumindest eine Größenordnung höher für die Chips im Resonanzmodus im Vergleich zu denselben Chips im Nicht-Resonanzmodus (Epifluoreszenz). Die Fluoreszenzbilder der Reihen I) und II) sind komplementär (Schachbrettanordnung). Alle verwendeten Chips haben denselben Satz an Fangelementen, das heißt monoklonales anti-hCG und monoklonales anti-IL6.
Es ist ersichtlich, dass viele Alternativen zu den beschriebenen Ausführungsformen möglich sind.
Ein weiteres Merkmal der vorliegenden Plattform ist, dass sie erlaubt, einen größeren Datensatz parallel zu ermitteln. Sie kann auch mehrmals verwendet werden. Die immobilisierten Affinitätskomplexe können bei erhöhter Temperatur mittels organischer Lösemittel und/oder chaotroper Reagenzien (Salzlösungen) regeneriert werden, während die Bindungskapazität im wesentlichen vollständig erhalten bleibt.
In der oben angegebenen Beschreibung wird der gesamte Bereich der Sensorregion bestrahlt. Es ist auch möglich, einen Laser mit einem nicht erweiterten fokussierten Strahl zu verwenden und den Sensorbereich so zu scannen, dass wiederum das Endeinfangelement angeregt wird. Diese Anordnung erlaubt die Verwendung eines billigeren Photodetektors als die CCD Kamera, beispielsweise kann ein Photoverstärker oder eine Lawinenphotodiode verwendet werden. Diese Anordnung erhöht ferner die Empfindlichkeit aufgrund der Tatsache, dass die Laserenergie begrenzter ist.
Es ist auch möglich, Plattformen zur Verwendung als Mikroskopobjektträger zu entwerten, was es erlaubt, sie mit einem Fluoreszenzmikroskop zu verwenden.
Die Plattformen können auch zur Verwendung mit Mikrofluidsystemen im großen Maßstab entworfen werden, wie dies in WO 97 02 357 A beschrieben ist.
In der obigen Beschreibung wurde die Verwendung der Plattform in Anwendungen beschrieben, die mit Fluoreszenz anregen und detektieren. Es ist ersichtlich, dass die Plattform in Anordnungen verwendet werden kann, in denen die Affinitätsreaktionen durch Veränderungen der Lumineszenz detektiert werden. Es ist ebenfalls ersichtlich, dass die Plattform in Anordnungen verwendet werden kann, worin die Affinitätsreaktionen durch Veränderungen des Brechungsindex detektiert werden.
Ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann in vielen Anwendungen verwendet werden, wobei die folgende Liste eine nicht-exklusive Liste ist:

– Genexpression
– Genomik
– Pharmakogenomik
– Toxikogenomik
– Toxikoproteomik
– Genetik
– Pharmakogenetik
– Toxikogenetik
– Exon-Intron-Expressionsprofilerstellung
– Humanleukozytenantigen (HLA)-Typisierung
– Analyse spleißender Varianten
– Proteomik (On-Chip-Proteinassays)
– Patientenüberwachung (Arzneistoffe, Metaboliten und Marker)
– Point-of-Care, personalisierte Medizin
– Diagnostik
– On-Chip-2D-Gele für die Proteomik oder 2D Trennung im allgemeinen
– SNP (Einzelnukleotidpolymorphismus), Minisequenzierung
– High-Throughput-Screening
– kombinatorische Chemie
– Protein-Protein-Wechselwirkung
– molekulare Wechselwirkung
– Wechselwirkung zwischen Chip-basierten Protein-Antikörpern und Peptiden
– grün fluoreszierendes Protein (GFP)
– in-situ-Hybridisierung
– konfokale Mikroskopie
– Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FKS)
– konventionelle Mikroskopie
– MALDI-TOF MS.

Claims

Verfahren zum Analysieren einer oder mehrerer Proben, das den Schritt aufweist, die eine oder die mehreren Proben mit der Sensorfläche einer Sensorplattform (10) in Kontakt zu bringen, wobei diese Plattform ein optisch transparentes Substrat (10) mit einem Brechungsindex n₁ aufweist, wobei eine nichtmetallische, optisch transparente Schicht (32) auf einer Fläche des Substrats ausgebildet ist, wobei diese Schicht einen Brechungsindex n₂ aufweist, der größer ist als n₁, wobei in der Plattform eine oder mehrere wellenförmige Strukturen (33) ausgebildet sind, die periodische Rinnen aufweisen, die einen oder mehrere Sensorbereiche oder -regionen jeweils für ein oder mehrere Einfangelemente definieren, wobei: (a) die Tiefe der Rinnen von 3 nm bis zur Dicke der optisch transparenten Schicht reicht, (b) die Dicke der optisch transparenten Schicht (32) im Bereich von 30 bis 1000 nm liegt, (c) die Periode der wellenförmigen Struktur (33) im Bereich von 200 bis 1000 nm liegt, (d) das Verhältnis der Rinnentiefe zur Dicke der optisch transparenten Schicht (32) im Bereich von 0,02 bis 1 liegt, und (e) das Verhältnis der Rinnenbreite zur Periode der Rinnen im Bereich von 0,2 bis 0,8 liegt, wodurch 1) kohärentes Licht, das in einem entsprechenden Winkel auf die Plattform auftrifft, in einzelne Strahlen oder Beugungsordnungen gebeugt werden kann, die miteinander interferieren, was zu einer Reduzierung des durchgelassenen Strahls und einer abnormal hohen Reflexion des einfallenden Lichts führt, wodurch ein erhöhtes abklingendes Feld an der Oberfläche des einen oder der mehreren Sensorbereiche erzeugt wird; oder 2) kohärentes und linear polarisiertes Licht, das in einem entsprechenden Winkel auf die Plattform auftrifft, in einzelne Strahlen oder Beugungsordnungen gebeugt werden kann, die miteinander interferieren, was zu einer nahezu vollständigen Auslöschung des durchgelassenen Strahls und einer abnormal hohen Reflexion des einfallenden Lichts führt, wodurch ein erhöhtes abklingendes Feld an der Oberfläche des einen oder der mehreren Sensorbereiche erzeugt wird, und wodurch die Sensorplattform mit einem Lichtstrahl (16) bestrahlt wird, der in einem solchen Winkel auf die Plattform (10) auftrifft, dass eine abklingende Resonanz hervorgerufen wird, wodurch das erhöhte abklingende Feld innerhalb des Sensorbereichs der Plattform entsteht und Detektionsstrahlung von dem Sensorbereich abgestrahlt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die wellenförmigen Strukturen (33) im Wesentlichen parallele periodische Rinnen aufweisen, die mono- oder multidiffraktional sind, und wobei diese Rinnen eine oder mehrere Sensorbereiche oder -regionen darstellen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei das Substrat (30) der Plattform aus anorganischem Material besteht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei das Substrat (30) aus organischem Material besteht.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Substrat (30) aus Glas, SiO₂, Quarz oder Si besteht.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Substrat (30) aus organischen Polymeren wie beispielsweise PP, PC, PMMA, PI, PS, PE, PET oder PU besteht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die optisch transparente Schicht (32) aus anorganischem Material besteht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die optisch transparente Schicht (32) aus organischem Material besteht.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die optisch transparente Schicht (32) ein Metalloxid wie beispielsweise Ta₂O₅, TiO₂, Nb₂O₅, ZrO₂, ZnO oder HfO₂ ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die optisch transparente Schicht (32) aus Polyamid, Polyimid, PP, PS, PMMA, Polyacrylsäuren, Polyacrylestern, Polythioether oder Poly(phenylensulfid) und deren Derivaten besteht.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Tiefe der Beugungsrinnen 10 nm bis zur Dicke der optisch transparenten Schicht beträgt.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Rinnen ein allgemein rechteckiges Profil haben.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Rinnen ein sinusförmiges, trapezförmiges oder sägezahnförmiges Profil haben.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Plattform (10) quadratisch oder rechteckig ist und die Rinnen linear entlang der Plattform verlaufen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Plattform (10) scheibenförmig ist und die Rinnen kreisförmig oder linear sind.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Rinnen auf einer Oberfläche des Substrats (30) ausgebildet sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Rinnen auf einer Oberfläche der optisch transparenten Schicht (32) ausgebildet sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Rinnen sowohl auf der Oberfläche des Substrats (30) als auch auf einer Oberfläche der optisch transparenten Schicht (32) ausgebildet sind.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die wellenförmige Oberfläche von einem oder mehreren Sensorbereichen für eine bestimmte Erregungswellenlänge und/oder einen bestimmten Polarisationstyp optimiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei die wellenförmige Oberfläche von einem oder mehreren Sensorbereichen für verschiedene Wellenlängen und/oder Polarisationsrichtungen optimiert ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Oberfläche der optisch transparenten Schicht (32) einen oder mehrere Sensorbereiche enthält, von denen jeder ein oder mehrere Einfangelemente trägt.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei jedes Einfangelement einzelne Einfangmoleküle und/oder Gemische aus Einfangmolekülen enthält, die zu Affinitätsreaktionen befähigt sind.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Einfangelemente in einer zweidimensionalen Gruppierung angeordnet sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 23, wobei die Plattform (10) eine Adhäsionsverstärkungsschicht enthält, die auf der Oberfläche der optisch transparenten Schicht angeordnet ist, um die Immobilisierung von Einfangmolekülen zu ermöglichen.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Adhäsionsverstärkungsschicht eine oder mehrere Schichten aus anorganischen und/oder organischen Molekülen oder deren Derivaten aufweist, die zusätzliche chemische, physikalische, spektroskopische und/oder fotophysikalische, fotochemische, biologische oder biochemische Eigenschaften bereitstellen, um die funktionalen Gesamteigenschaften des resultierenden Adhäsionsverstärkungsschicht-Systems zu beeinflussen.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Plattform (10) mit mehreren Sensorbereichen oder -regionen versehen ist, die jeweils eigene Beugungsrinnen oder mehrere übereinander angeordnete Rinnen aufweisen, die für eine mehrfarbliche Erregung und Detektion von Proben geeignet sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei die Anzahl an Einfangelementen oder -molekülen, die auf der Plattform zu immobilisieren sind, unbegrenzt ist und der Anzahl an Genen, DNS-Sequenzen, DNS-Motiven, DNS-Mikrosatelliten, Einzelnukleotidpolymorphismen, Proteinen oder Zellfragmenten, die zu einem Genom einer interessierenden Spezies oder eines interessierenden Organismus beitragen, oder einer Auswahl oder Kombination davon entspricht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 27, wobei das eine oder die mehreren Einfangelemente oder -moleküle eines oder mehrere der Folgenden aufweisen: Nukleotide, Oligonukleotide (und deren chemische Derivate) DNS (Doppelstrang, Einzelstrang) a) linear (und deren chemische Derivate) b) kreisförmig (zum Beispiel Plasmide, Cosmide, BACs, YACs) Komplett-RNS, Boten-RNS, cRNS, Mitochondrien-RNS, künstliche RNS, Aptamere PNS (Peptidnucleinsäuren) polyklonale, monoklonale, rekombinante, gentechnisch hergestellte Antikörper, Antigene, Haptene, Antikörper-FAB-Untereinheiten (erforderlichenfalls modifiziert) Proteine, modifizierte Proteine, Enzyme, Enzymkofaktoren oder -inhibitoren, Proteinkomplexe, Lectine, Histidin-markierte Proteine, Chelatoren für Histidinmarkierungskomponenten (HIS-tag), markierte Proteine, künstliche Antikörper, molekulare Abdrücke, Plastikörper Membranrezeptoren, ganze Zellen, Zellfragmente und zelluläre Substrukturen, Synapsen, Agonisten/Antagonisten, Zellen, Zellorganellen, beispielsweise Mikrosome kleine Moleküle wie beispielsweise Benzodiazapine, Prostaglandine, Antibiotika, Arzneistoffe, Metaboliten, Arzneistoffmetaboliten natürliche Produkte Kohlehydrate und Derivate natürliche und künstliche Liganden Steroide, Hormone Peptide native oder künstliche Polymere Molekularsonden natürliche und künstliche Rezeptoren und deren chemische Derivate chelierende Reagenzien, Kronenether, Liganden, supramolekulare Anordnungen Indikatoren (pH, Potenzial, Membranpotenzial, Redoxpotenzial) Gewebsproben (Gewebemikroanordnungen).
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei den untersuchten Proben fluoreszenzinduzierendes Material beigegeben wird und Fluoreszenz erfasst wird, die in den Proben durch Erregen der Proben mittels des erhöhten abklingenden Feldes induziert wurde.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei das fluoreszenzinduzierende Material einen Lumineszenzmarker aufweist.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei der Lumineszenzmarker eine oder mehrere Lumineszenzverbindungen aufweist, die eine Lumineszenz im Bereich von 400 nm bis 1200 nm haben und die funktionalisiert oder modifiziert sind, um an einen oder mehrere der Affinitätspartner angehängt zu werden, einschließlich Derivaten eines oder mehrerer der Folgenden: Polyphenyl und heteroaromatische Verbindungen Stilbene, Coumarine, Xanthenfarbstoffe, Methinfarbstoffe, Oxazinfarbstoffe, Rhodamine, Fluoreszeine, Coumarine, Stilbene, Pyrene, Perylene, Cyanine, Oxacyanine, Phthalocyanine, Porphyrine, Naphthalocyanine, Azobenzenderivate, Distyrylbiphenyle, Übergangsmetallkomplexe, beispielsweise Polypyridyl-Ruthenium-Komplexe, Tris(2,2'-bipyridyl)rutheniumchlorid, Tris(1,10-phenanthrolin)rutheniumchlorid, Tris(4,7-diphenyl-1,10-phenanthrolin)rutheniumchlorid und Polypyridyl-Phenazin-Ruthenium-Komplexe, wie beispielsweise Octaethyl-Platin-Porphyrin, Europium- und Terbium-Komplexe Quantenpunktpartikel oder -perlen oder deren Derivate.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wenn es in einem oder mehreren der Folgenden verwendet wird: – Genexpression – Genomik – Pharmakogenomik – Toxikogenomik – Toxikoproteomik – Genetik – Pharmakogenetik – Toxikogenetik – Exon-Intron-Expressionsprofilerstellung – Humanleukozytenantigen (NLA)-Typisierung – Analyse spleißender Varianten – Proteomik (On-Chip-Proteinassays) – Patientenüberwachung (Arzneistoffe, Metaboliten und Marker) – Point-of-Care, personalisierte Medizin – Diagnostik – On-Chip-2D-Gele für die Proteomik – ENP (Einzelnukleotidpolymorphismus), Minisequenzierung – High-Throughput-Screening – kombinatorische Chemie – Protein-Protein-Wechselwirkung – molekulare Wechselwirkung – Wechselwirkung zwischen Chip-basierten Protein-Antikörpern und Peptiden – grün fluoreszierendes Protein (GFP) – in-situ-Hybridisierung – konfokale Mikroskopie – Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FKS) – konventionelle Mikroskopie – MALDI-TOF MS.