DE60028367T2

DE60028367T2 - Oligonukleotide die eine antisense-sequenz enthalten die durch eine sekondärstruktur stabilisiert sind und pharmazeutische zusammensetzungen die sie enthalten

Info

Publication number: DE60028367T2
Application number: DE60028367T
Authority: DE
Inventors: Claude Malvy; Andrei Maksimenko; Valerie Helin; Marina Moscou GOTTIKH
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Gustave Roussy (IGR); Bioalliance Pharma SA
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Gustave Roussy (IGR); Bioalliance Pharma SA
Priority date: 1999-03-09
Filing date: 2000-03-09
Publication date: 2007-02-08
Anticipated expiration: 2020-03-10
Also published as: DE60028367D1; FR2790757A1; ATE328074T1; EP1175489B1; JP2004500018A; US20020156261A1; CA2363255A1; AU3295700A; ES2265916T3; EP1175489A1; DK1175489T3; WO2000053745A1; PT1175489E; WO2000053745A9; US7022832B2; FR2790757B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft pharmazeutische Rezepturen bzw. Zusammensetzungen, Oligonucleotide aufweisend, die mit einer Nukleinsäurezielsequenz hybridisieren können und die durch eine Sekundärstruktur derart stabilisiert werden, dass sie in biologischen Milieus Degradation gegenüber resistent sind, hauptsächlich gegenüber Degradation durch Nukleasen.
Die Antisense-Nukleinsäuren sind Nukleinsequenzen, die selektiv mit zellularer Ziel-mRNA hybridisieren können, um deren Translation in Protein zu inhibieren. Diese Oligonucleotide bilden mit der Ziel-mRNA durch Interaktion in der Art einer klassischen Watson-Crick-Interaktion lokal doppelsträngige Regionen.
Viele pathologische Zustände sind Folge der Expression eines abnormen Gens in einer Zelle. Derartige fremde Gene können sich in die Zell-DNA integrieren, zum Beispiel nach einer Virusinfektion, und können demnach von der Zelle exprimiert werden. Gleiches gilt für viele onkogene Gene, die einer eukaryotischen Zelle den karzinomatösen Phänotyp verleihen können und einen Tumor im gesamten Organismus.
Eine der vorgeschlagenen Methoden nach dem Stand der Technik zur Inhibition der Wirkung derartiger Gene besteht in der Verwendung von Antisense-Oligonucleotiden (1–3). Die Regulierung der Expression von Zielgenen mit Antisense-Oligonucleotiden stellt in der Tat eine therapeutische Methode dar, die in weiterer Entwicklung begriffen ist. Diese Methode stützt sich auf die Fähigkeit der Oligonucleotide, speziell mit komplementären Regionen einer Nukleinsäure zu hybridisieren und damit speziell die Expression bestimmter Gene zu inhibieren. Diese Inhibition kann sowohl auf translatorischer (Antisense-Oligonucleotid) als auch auf transkriptorischer Ebene (Antigen-Oligonucleotid) erfolgen.
Die therapeutische Anwendung einer Antisense-Technologie wurden bei vielen Virusinfektionen umfassend untersucht, den Virus des erworbenen Immundefizits (4), den Influenzavirus (5), den Epstein-Barr-Virus (6), die humanen Papillomaviren (7, 8) und den Herpes-simplex-Virus (9, 10) eingeschlossen.
Es kann sich zum Beispiel um synthetische Oligonucleotide handeln, die klein und komplementär zur zellulare mRNA sind und in die Zielzellen eingeführt werden. Derartige Oligonucleotide wurden zum Beispiel in der europäischen Patentanmeldung Nr. 92 574 beschrieben. Es kann sich ebenfalls um Antisense-Gene handeln, deren Expression in der Zielzelle zur zellularen mRNA komplementäre RNA generiert. Derartige Gene sind zum Beispiel in der europäischen Patentanmeldung Nr. 140 308 beschrieben worden.
Allerdings stößt die in vivo-Verwendung von Antisense-Nukleinsäuren auf einige Schwierigkeiten, die bis heute deren therapeutischen Einsatz einschränken.
Die Nukleinsäuren weisen nämlich eine hohe Sensibilität gegenüber Degradation durch Enzyme des Organismus auf, wie zum Beispiel Nukleasen (11, 12), was den Einsatz größerer Dosen erfordert. Außerdem dringen sie nur schlecht in bestimmte Zellarten ein und verteilen sich oft inadäquat im Zellinnern, weswegen sie keine therapeutische Wirkung haben. Schließlich ist es wichtig, über ausreichend selektive und stabile Sequenzen verfügen zu können, um eine spezielle Wirkung zu erhalten, ohne andere Zellfunktionen zu beeinträchtigen.
Seit der ersten Versuche von Stephenson et Zamecnik (13) zur Inhibition des Roussarkom-Virus durch den Einsatz von Phosphodiester-Oligonucleotiden wurden viele Anstrengungen unternommen, um die Wirksamkeit dieser Oligonucleotide zu optimieren, vor allem im Hinblick auf die Zellpenetration (14–16), die Fixierung auf ihrem Ziel (17), die Resistenz gegenüber Nukleasen (18–20).
Das Problem der Resistenz der Oligonucleotide gegenüber Nukleasen ist nach wie vor ein Problem, welches die Entwicklungsmöglichkeiten dieser therapeutischen Strategie begrenzt. Um zu versuchen, dieses Problem zu lösen, wurde nach dem Stand der Technik vorgeschlagen, das Phosphodiester-Skelett der Nukleinsäuren zu modifizieren, um neue Klassen künstlicher Oligonucleotide zu schaffen (21–23). Unter diesen wären die Phosphonat-, Phophoramidat- und Phosphorothioat-Oligonucleotide zu nennen, die zum Beispiel in der internationalen Patentanmeldung PCT Nr. WO 94/08003 beschrieben sind, oder die an verschiedene Substanzen wie zum Beispiel Cholesterin, ein Peptid, ein kationisches Polymer usw. gekoppelten Oligonucleotide.
Auch wenn einige dieser modifizierten Oligonucleotide eine gute Resistenz gegenüber Nukleasen aufweisen, können diese Modifikationen den Nachteil haben, dass sie vom Verlust anderer Eigenschaften begleitet werden, die für die Antisense-Aktivität wichtig sind, wie zum Beispiel ihre Affinität für die Ziele der RNA, ihre Fähigkeit, die Degradation der RNA durch RNasen zu modulieren, und ihre Fähigkeit, in die verschiedenen Zellkompartimente einzudringen und sich dort zu verteilen, bleibt sehr schwach (1, 22, 24). Außerdem ist ihre biologische Aktivität nicht immer erhöht, und sie können be stimmte Nebenwirkungen aufweisen, die mit dem Vorhandensein nicht natürlicher Muster in ihrer Struktur verbunden sind. Derart modifizierte Oligonucleotide weisen nämlich unerwünschte Merkmale auf, wie nicht spezifische Interaktionen mit Zellproteinen, und eine hohe Zytotoxizität (25–29).
Eine andere Methode, mit der die Resistenz der Oligonucleotide gegenüber Nukleasen erhöht werden kann, bei der jedoch natürliche Phosphodiester verwendet werden, besteht darin, auf das Ende 3' der zu schützenden Sequenz ein Dodecanolkonjugat zu pfropfen (europäische Patentanmeldungen Nr. EP 117 777 und Nr. EP 169 787 ).
Um diesen zuvor dargelegten Nachteilen abzuhelfen, wurde nach dem Stand der Technik ebenfalls vorgeschlagen, so zum Beispiel in der internationalen Patentanmeldung PCT Nr. WO 94/12633, dem einen und/oder anderen Ende der zu schützenden Antisense-Sequenz Nukleotidsequenzen hinzuzufügen, deren Sekundärstruktur sich in Form von Schleifen oder Haarnadeln darstellt und die in der Lage sind zu verhindern, dass die Nukleasen die Antisense-Sequenz beschädigen (30–35). Allerdings ist diese Technik nicht zufriedenstellend, da das Vorhandensein zusätzlicher Nukleotide der Haarnadelsequenzen die Hybridisierung der Antisense-Sequenz mit den Ziel-Nukleinsäuren behindert.
Die vorliegende Erfindung zielt genauer darauf ab, neue Oligonucleotide anzubieten, die in der Lage sind, die Expression von Genen in vivo oder in vitro, die gegenüber der Nukleaseverdauung resistent sind, zu modifizieren oder zu inhibieren, ohne die oben beschriebenen Nachteile aufzuweisen.
Die Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung des EWING-Sarkoms, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Wirkstoff mindestens eines der Oligonucleotide aufweist, die in der Folgeliste bzw. Sequenzliste unter den Nummern SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 aufgeführt sind.
Die Erfindung betrifft ebenfalls pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein oder mehrere zuvor beschriebene identische oder unterschiedliche Oligonucleotide enthalten, die in der besagten Zusammensetzung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Überträger verbunden sind. Die erfindungsgemäßen Oligonucleotide können frei, eingekapselt, gekoppelt, mit verschiedenen Substanzen wie Antikörpern, Proteinen, Liposomen, Mikrosphären, Mikroorganismen oder Zellen, die den verwendeten Verabreichungsmethoden angepasst wurden, verbunden sein, oder mit jedem anderen Vektortyp, wie Nanopartikel, Dendrimere, kationische Lipide oder Peptide.
Andere Vorteile und Merkmale der Erfindung ergeben sich aus den folgenden Beispielen und den 1 bis 6, die schematisch Beispiele für die Realisierung der erfindungsgemäßen Oligonucleotide veranschaulichen. In diesen Figuren symbolisieren die dicken Linien die Antisense-Sequenz, die dünnen Linien symbolisieren die supplementäre(n) Sequenz(en), sofern vorhanden, und die waagerechten Striche symbolisieren die Verbindungen des Basenpaars.
Beispiel 1: Untersuchung erfindungsgemäßer Antisense-Oligonucleotide, die eine zur Initiationsregion der Translation der RNA env des Retrovirus der Friend-Murine-Leukämie komplementäre Region aufweisen
Bei diesem Beispiel wird auf die Zeichnungen in der Anlage Bezug genommen, von denen:
die 7 die im folgenden experimentellen Teil verwendeten Oligonucleotide darstellt. Die Zielsequenzen der DANN und RNA 21 mer sind unterstrichen. Die Sequenzen der zu den Zielen D und R komplementären Antisense-Oligodeoxy ribonucleotide sind in Schriftzeichen in Fettdruck dargestellt.
Die 8 stellt die Analyse durch Elektrophorese der Formation von Duplexen in natürlichem Layout 15% bei 37°C dar. A zeigt: Fixierung des mit ³²P markierten Ziels der RNA (Zeile 1) an die Oligodeoxynucleotide 21L (Zeile 2), 21PS (Zeile 3), H6 (Zeile 4), H8 (Zeile 5), H0 (Zeile 6), Dh6 (Zeile 7), L8 (Zeile 8), L10 (Zeile 9), SL (Zeile 10), 55L (Zeile 11). B zeigt: Fixierung des mit ³²P markierten Ziels der DNA (Zeile 1) an die Oligodeoxynucleotide 21L (Zeile 2), 21PS (Zeile 3), H6 (Zeile 4), H8 (Zeile 5), H0 (Zeile 6), Dh6 (Zeile 7), L8 (Zeile 8), L10 (Zeile 9), SL (Zeile 10) 55L (Zeile 11).
Die 9 zeigt die Spaltung des Ziels der RNA durch die RNase H in Gegenwart der Antisense-Oligonucleotide 21L (Zeile 2), 21PS (Zeile 3), H6 (Zeile 4), H8 (Zeile 5), H0 (Zeile 6), Dh6 (Zeile 7), L8 (Zeile 8), L10 (Zeile 9), SL (Zeile 10), 55L (Zeile 11). Mit ³²P markierte rRNA, allein (Zeile 1) und in Gegenwart von RNase H ohne ODNS (Zeile 12). Die Pfeile zeigen die wichtigsten Stellen an, an denen die Spaltung stattfindet.
Die 10 zeigt die Degradation der Antisense-Oligonucleotide in DMEM supplementiert mit 10% durch Wärme inaktivierte FBS in Gegenwart (a, b) und in Abwesenheit (c, d) von SuperFect^TM.
Die 11 zeigt die Degradation der Antisense-Oligonucleotide in den Zelllysaten: (a, b) Lysat HeLa, (c, d) Lysat NIH 3T3.
Die 12 zeigt die Degradation der mit SuperFect^TM komplexierten Antisense-Oligonucleotide im Zellinnnern: (a, b) HeLa, (c, d) NIH 3T3.
I – Materialien und Methoden
1) Oligonucleotide
Die Oligonucleotide wurden bei der Gesellschaft Eurogentec (Seraing, Belgien) beschafft, danach über G25 Sephadex-Säulen entsalzt und durch Adsorbanz bei 260 nm quantifiziert.
2) Schutz des 5'-Phosphat-Endes der Antisense-Oligonucleotide
Die Markierung am 5'-Ende der Oligonucleotide erfolgte mit ATP(³²P-) (Amersham) und T4-Polynukleotid-Kinase (Promega). Die markierten Oligonucleotide wurden durch Elektrophorese auf einem denaturierenden Polyacrylamidgel 20% gereinigt und danach in 100 l N-Methylmorphin 1 M Puffer (pH 7,5), MgCl₂ 20 mM, 50% Ethanol enthaltend, gelöst, und die Lösung wurde mit 10 mg 1-Ethyl 3(3'-dimethylaminopropyl)carbodiimid supplementiert. Die Reaktion wurde 16 Stunden bei 4°C durchgeführt, und die Oligonucleotide wurden zweimal mit 1 ml einer LiClO₄-Lösung 2% in Azeton prezipitiert und mit Azeton gewaschen. Diese Oligonucleotide mit dem durch einen Ethylrest gegen die Hydrolyse durch eine Phosphatase geschützten Endphosphat wurden danach mit nicht markierten Oligodexynucleotiden (ODNs) gemischt und verwendet, um ihre Resistenz gegenüber einer enzymatischen Verdauung zu untersuchen.
3) Versuche zur thermischen Denaturierung
Die Aborbanz/Temperatur-Kurven wurden bei 260 nm unter Verwendung eines Uvikon 933 Spektrophotometers aufgezeichnet, das mit einem Instrument zur Temperaturüberwachung ausgerüstet war. Die ODNs-Lösungen wurden in 600 l Natriumphosphatpuffer 10 mM (pH 7,5) mit NaCl 50 mM vorbereitet. Die Konzentration jedes Oligonucleotidstrangs beträgt 10^–6 M. Die Adsorbanz wurde während der Zeit gemessen, in der die Temperatur von 20°C auf 80°C um 0,5°C pro Minute erhöht wurde. Die Fusionstemperaturen (T_m) wurden ausgehend von der ersten Adsorbanzableitung gemäß 1/T durch Datenabgleich bestimmt. Die Genauigkeit der T_m wurde nach Versuchswiederholungen auf ±0,5°C geschätzt. Die Werte der für den Zerfall des Duplexes freien Energie wurden durch Datenabgleich aus den Fusionskurven bei Verwendung des Modells der zwei Zustände (36) abgeleitet.
4) Natives Elektrophoresegel
Die RNA- und DNA-Matrizen (R und D) wurden mit ATP(³²P-) und T4-Polynukleotid-Kinase markiert. Die Oligonucleotide (10 pmol für jeden Strang) wurden in 10 l Trisacetatpuffer (pH 7,5), CH₃COONa 150 mM, MgCL₂ 2 mM gelöst und bei 37°C 1 Stunde inkubiert und danach mit 1 l einer Glycerollösung 70% Xylen Cyanol und Bromphenolblau enthaltend supplementiert. Die Elektrophoresen wurden in einem nicht denaturierendem Acrylamidgel 15% (19:1 Acrylamid/Bisacrylamid) im selben Trisacetatpuffer bei 37°C 24 Stunden lang durchgeführt (9 V/cm).
5) Spaltung durch die RNase H
Um das Einsetzen der RNase H-Aktivität durch die ODNs zu untersuchen, wurden 10 pmol davon mit 1 pmol der an 5' mit (³²P) markierten RNA-Matrize (R) in 10 μl Tris-HCL Puffer 20 mM (pH 7,5), MgCl₂ 10 mM; KCl 100 mM, DTT 0,1 mM in Gegenwart von 0,5 μl RNasin (Gibco BRL) gemischt und 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Danach wurde 0,5 U RNase H von E. coli (Promega, Madison, WI) hinzugefügt, und die Gemische wurden 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Proben wurden mit Aceton, das 2% LiClO₄ enthielt, prezipitiert, getrocknet, in 4 μl Formamid:Wasser (4:1), 0,01% Bromphenolblau und 0,01% Xylen Cyanol gelöst und durch Elektrophorese in einem denaturierenden Polyacrylamidgel 20% analysiert, gefolgt von einer Autoradiographie.
6) Zellen und Medien
Die Zelllinien NIH 3T3 und HeLa wurden in DMEM kultiviert, das mit jeweils 5% und 10% fötalem Rinderserum (FBS) (Gibco, BRL), das mit Wärme inaktiviert worden war, Streptomycin (100 mg/l) und Penicillin (100 U/ml) supplementiert wurde. Alle Zellen wurden bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert.
7) Vorbereitung der Zelllysate
Die NIH 3T3- und HeLa-Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen und danach in 1 ml Natriumphosphatpuffer 10 mM (pH 7,5), MgCl₂ 10 mM, NaCl 150 mM, DTT 1 mM, 1% NP-40, 02 mg/ml Phenylmethylsulphonylfluorid (PMSF) deponiert und bei –20°C 30 Minuten lang aufbewahrt. Nach dem Auftauen wurden die Zellen mit 14000 g 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verwendet, um die enzymatische Degradation der Oligonucleotide zu untersuchen. Die Protein-Konzentration in jedem Lysat wurde unter Verwendung von BSA als Standard quantifiziert (37).
8) Untersuchung der Degradation des Oligonucleotids in einem biologischen Medium
Die Bestimmung des Degradationsgrades des Oligonucleotids wurde in DMEM vorgenommen, das 10% durch Wärme inaktiviertes FSB (30 Minuten bei 56°C) enthielt und in den Zelllysaten. Die Lysate wurden in einem Natriumphosphatpuffer 10 mM (pH 7,5), MgCl₂ 10 mM, NaCl 150 mM, DTT 1 mM verdünnt, um über dieselbe Gesamt-Proteinkonzentration von 1,22 mg/ml zu verfügen. Zur Vermeidung der enzymatischen Spaltung des mit ³²P markierten Phosphats wurden die mit dem geschützten Endphosphat vorbereiteten Oligonucleotide verwendet, wie oben beschrieben. Die mit ³²P markierten ODNs mit einer Konzentration von 10 M wurden in 120 l des entsprechenden Mediums bei 37°C inkubiert. Zu verschiedenen Zeiten wurden Aliquots von 15 l entnommen, mit 15 l EDTA 50 mM supplementiert und bei –20°C eingefroren. Die Proben wurden zweimal mit einem Phenolchloroformisoamylalkohol-Gemisch extrahiert (24/24/1). Die Oligonucleotide wurden in wässrigen Fraktionen à 10 Volumen Azeton mit 2% LiClO₄ prezipitiert, getrocknet und in 5 l eines Formamid- Wasser-Gemischs (4/1), 0,01% Bromphenolblau und 0,01% Xylen Cyanol gelöst. Die Proben wurden durch Elektrophorese auf einem denaturierenden Polyacrylamidgel 20% analysiert. Die gewonnenen Gele wurden mit einem Phosphorimager (Storm 840, Molecular Dynamics) gescannt. Die Degradation der Oligonucleotide wurde als Verhältnis des Leistungssignals der Bänder, die intakten und degradierten Oligonucleotiden entsprechen, quantifiziert. Die Präzision der Degradationsquoten wurde auf der Basis von Versuchswiederholungen auf ±0,5% geschätzt.
9) Untersuchung der Degradation des Oligonucleotids in der Zelle
Einen Tag zuvor wurde ein Plättchen mit 6 Vertiefungen mit den Zellen beimpft, um 60–80% Konfluenz (4 × 10⁵ Zellen) zu erhalten. 5 g jedes ODN wurden mit 6 l SuperFect^TM (Quiagen, Kanada) in einem finalen Volumen von 150 l DMEM (ohne FBS und Antibiotikum) 10 Minuten lang bei Zimmertemperatur gemischt. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen, die SuperFect^TM-ODN-Gemische wurden mit 850 l 10% (für die HeLa-Zellen) oder 5% (für die NIH 3T3-Zellen) FBS DMEM (mit Antibiotika) verdünnt und den Zellen hinzugefügt.
Der Überstand wurde nach 16 bzw. 48 Stunden extrahiert, und die Zellen wurden durch Trypsinbehandlung geerntet. Danach wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen, in 500 l Natriumphosphatpuffer 10 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 20 mM, 1% NP-40 suspendiert und 30 Minuten –20°C ausgesetzt. Nach dem Auftauen wurden die Zellen 30 Minuten auf 90°C erhitzt, um alle Zellkompartimente vollständig zu zerstören, und zweimal mit einem Phenolchloroformisoamylalkoholi-Gemisch (25/24/1) extrahiert. Die ODNs wurden aus wässrigen Fraktionen, die 0,5 M Natriumazetat enthalten, unter Hinzufügen von fünfmal mehr Ethanol prezipitiert, in einem Formamid-Wasser-Gemisch (4/1), 0,01% Bromphenolblau und 0,01% Xylen Cyanol gelöst und durch Elektrophorese auf denaturierendem Gel 20% analy siert. Die gewonnenen Gele wurden mit einem Phosphorimager (Storm 840, Molecular Dynamics) gescannt. Die Degradation der Oligonucleotide wurde als Verhältnis des Leistungssignals der Bänder, die intakten und zerfallenen Oligonucleotiden entsprechen, quantifiziert.
II – Ergebnisse
1) Strukturen der strukturierten Oligonucleotide
Wie 7 zeigt, enthalten alle untersuchten Oligodeoxyribonucleotide die 21-Basen-Sequenz 5'-TGAACACGCCATGTCGATTCT-3', die auf 7 unterstrichen oder in Fettdruck dargestellt und zur Initiationsregion der Translation der RNA env des Retrovirus der Friend-Murine-Leukämie komplementär ist. Die Oligonucleotide 21L und 55L haben eine lineare Struktur wie das Oligonucleotid 21PS. Allerdings enthält dieses Letztgenannte zwei Phosphothioat-Gruppen an jedem Ende, um es vor enzymatischer Degradation zu schützen. Die Oligonucleotide H6, H8 und H10 weisen eine unterschiedliche Anzahl von Basenpaaren (pb) in der supplementären Sequenz der haarnadelförmigen Sekundärstruktur auf, die am Ende 3' lokalisiert ist. DH6 kann mit den Schwänzen von 6 pb an den Enden 5' und 3' eine haarnadelförmige Sekundärstruktur bilden. L8 und L10 können schleifenförmige Sekundärstrukturen mit 13 Nucleotiden in der Schleife und in den Schwänzen mit jeweils 8 und 10 pb bilden.
2) Untersuchung der Bindungseigenschaften der Oligonucleotide
Nachfolgende Tabelle 1 stellt die Fusionstemperatur (T_m) und G° ₃₇ dar, die zugleich für die Oligonucleotide (ONs) allein und für die Komplexe mit den Zielen DNA (D) oder RNA (R) in 10 mM Phosphat, 50 mM NaCl, pH = 7,5 bestimmt wurden. Tabelle 1

H, S und G sind Mittelwerte mehrerer Werte, die aus unabhängigen Fusionskurven ermittelt und gerundet wurden.
(a): Der Fehler bei den T_m beläuft sich auf ±0,5°C.
(b): Der Fehler bei den H beläuft sich auf ±5 kcalmol^–1.
(c): Der Fehler bei den D beläuft sich auf ±10 e.u.

Die Doppelstrangbereiche der ODNs, die eine Sekundärstruktur besitzen (auch als „SODNs" bezeichnet) waren unter deutlich physiologischen Bedingungen stabil. Die thermische Stabilität der internen Duplexe in den ODNs H6, H8, H10 und L8 und L10 hängt von der Anzahl der Basenpaare in ihrer Schwanzregion ab. Allerdings, so zeigt Tabelle 1, sind alle SODNs in der Lage, zugleich mit den Zielen der DNA und der RNA zusammenzuwirken, um intermolekulare Duplexe zu bilden, die andere thermodynamische Parameter haben als die intramolekularen Duplexe. Der für diese bimolekularen Duplexe ermittelte T_m unterscheidet sich signifikant von dem T_m der SODNs und entspricht in etwa dem für die von der linearen ODN 21L mit den beiden Zielen gebildeten Duplexe ermitteltem T_m. Die einzige Ausnahme bildet das Oligonucleotid H10, das eine sehr stabile Haarnadel aufweist (T_m = 75°C). Die Fusionskurve weist in Gegenwart der Ziele D oder R drei Perioden auf:

– Die erste Periode entspricht der Fusion eines partiellen intermolekularen Duplex, der zwischen dem einstrangigen Fragment 11 mers dieser ODN und dem Ziel (43°C mit dem Ziel der DNA und 40°C mit dem Ziel der RNA) gebildet wurde.
– Die zweite Periode entspricht der Fusion des kompletten intermolekularen Duplex (60°C mit dem Ziel der DNA und 57°C mit dem Ziel der RNA).
– Die dritte Periode entspricht der Fusion seines eigenen Bereichs zu einer Doppelhelix (73°C).

Die Fixierung der SODNs mit den Zielen der DNA und RNA wurde weiterhin anhand eines Mobilitätstests auf Gel untersucht. Die ODNs wurden mit D- und R-Zielen, die mit (³²P) markiert worden waren, bei 37°C inkubiert, und die Mobilität der gebildeten Komplexe wurde durch Elektrophorese in einem nicht denaturierenden Polyacrylamidgel 15% bestimmt. Die 8 zeigt, dass sich die elektrophoretische Mobilität der beiden Ziele in Gegenwart aller SODNs aufgrund ihrer Implikation in die Herausbildung der entsprechenden Komplexe ändert.
Die Fähigkeit der SODNs, mit dem komplementären RNA-Strang zu hybrisidieren und den Bruch durch die RNase H auszulösen, ist ebenfalls untersucht worden. Die 9 zeigt das Ergebnis der Inkubation des Ziels der RNA (0,1 M) und ver schiedener ODNs (1 M) mit 0,5 Einheiten RNase H innerhalb von 15 Minuten bei 37°C. Der Bruch der RNA (R) durch die RNase H in Gegenwart des linearen Oligonucleotids 21L und aller SODNs findet mit derselben Effizienz und an denselben Stellen statt. Auf die wichtigsten Bruchstellen weisen auf 9 Pfeile hin. Bei Abwesenheit komplementärer ODNs wurde kein Bruch der RNA beobachtet.
Alle diese Ergebnisse zeigen, dass durch die interne Doppelstrangstruktur der ODNs deren Interaktion mit ihren DNA- und RNA-Zielen nicht verhindert wird. Die internen Duplexe scheinen sich aufzulösen, wenn die bimolekularen Komplexe zwischen den SODNs und ihren Zielen gebildet werden. Allerdings werden die bimolekularen Duplexe thermodynamisch bevorzugt, wie Tabelle 1 zeigt.
3) Stabilität der Antisense-Oligonucleotide gegenüber nukeolytischer Degradation
Die Fähigkeit der ODNs mit einer Sekundärstruktur, der enzymatischen Hydrolyse zu widerstehen, wurde in DMEM, mit 10% durch Wärme inaktiviertem FSB supplementiert, untersucht, das im allgemeinen für das Zellwachstum verwendet wird, sowie in den Zelllysaten zweier Typen dieser Zelllinien (NIH 3T3 und HeLa). Um die Spaltung des mit (³²P) markierten Phosphats zu verhindern, wurden für diesen Versuch Oligonucleotide mit einem an 5' durch einen Ethylrest geschützten Phosphat verwendet.
Die 10(a) und (b), die sich auf die Analyse der Degradation des ODN im Kulturmedium mit FBS beziehen, zeigt, dass die Resistenz gegenüber den Nukleasen der SODNs durch die sekundäre Haarnadel-, Schleifen- oder Schneckenstruktur signifikant verbessert wird. Die Resistenz der ODNs mit Haarnadel oder Schleife gegenüber Degradation hängt vom Typ der internen Duplexe und ihrer thermischen Stabilität ab. So ist zum Beispiel die Halbwertzeit der thermostabilsten Haarnadel H10 grö ßer als die der Haarnadeln H6 und H8. Gleichzeitig ist ODN L10 mit einer Schleife ebenso resistent gegenüber Degradation wie ODN H8 mit einer Haarnadel, wobei dessen thermische Stabilität geringer ist (53°C für L10 und 60°C für H8). Alle linearen Oligonucleotide 21L, 55L und 21PS sind schnell degradiert. Diese Ergebnisse bestätigen die zuvor berichteten Daten über die sehr kurze Halbwertzeit linearer Phosphorothoat- und Phosphodiester-Oligonucleotide in dem Serum (10, 11).
Um die Penetration des Oligonucleotids in die Zellen zu erhöhen, können mehrere Transfektionsreagenzien verwendet werden (38–42). Es wurde der Einfluss eines Reagenz – ein Dendrimermolekül mit der Bezeichnung SuperFect^TM – auf die Stabilität von ODN in mit 10% FBS supplementiertem DMEM untersucht. Wie auf den 10(c) und (d) gezeigt, weisen die von den ODNs mit SuperFect^TM gebildeten Komplexe gegenüber nukleolytischer Degradation eine größere Resistenz auf als ODNs allein. Die Erhöhung der Resistenz ist mit den linearen ODNs 55L und 21PS am signifikantesten. So beträgt zum Beispiel die Halbwertzeit des Phosphorothioate-ODN 21PS mit und ohne SuperFect^TM jeweils ca. 12 Stunden bis 30 Minuten. Dieselbe Stabilitätserhöhung wurde mit 55L beobachtet, wie auf den 10(a) und (c) gezeigt. Das stimmt mit den aus der Literatur bekannten Daten überein, die zeigen, dass durch die Bildung von Polyaminverbindungskomplexen mit ODNs deren Stabilität gegenüber Nukleasen verbessert wird (38). Im übrigen ist die Halbwertzeit des nicht modifizierten ODN 21L mit und ohne SuperFect^TM etwa identisch. Es ist möglich, dass der von SuperFect^TM mit diesem kurzen ODN gebildete Komplex die Enden des Oligonucleotids nicht ausreichend schützt, die dann enzymatisch degradiert werden.
Die Stabilität der ODNs in den Lysaten der HeLa- und NIH 3T3-Zellen variiert mit dem Lysattyp. Es ist darauf hinzuweisen, dass die Proteinkonzentration in diesen Lysaten identisch ist. Folglich hängt die Unterscheidung ihrer nukleolyti schen Aktivitäten vom quantitativen oder qualitativen Unterschied der Aktivität der Nukleasen ab. Die 11(a) und (b) zeigen, dass die Degradation im HeLa-Lysat schneller verläuft. Alle linearen ODNs – 21L, 21PS und 55L – sind schnell degradiert, wobei ihre Halbwertzeit ca. 10 Minuten betrug.
Im Hinblick auf das NIH 3T3-Lysat zeigen die 11(c) und (d), dass der Degradationsgrad der SODN geringer ist als im HeLa-Lysat. Interessant ist, dass die SODNs Dh6, L8 und L10, die alle einen 5'- und 3'-Schutz haben, stabiler sind als die SODNs H6 bis H10, die am 3'-Ende lediglich eine Haarnadel aufweisen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Beitrag der exnuleasischen Aktivität 5' auf die Degradation des ODN in diesem Lysat sehr groß ist. Allerdings hat die Modifizierung durch ein End-Phosphorothioat keinen signifikanten Einfluss auf die Resistenz des ODN, in bezug auf die ODNs 21L und 21PS.
Die 12 stellt die Entwicklung der ODNs in den beiden Zelllinien HeLa und 3T3 dar. Zur Verbesserung der Penetration der ODN in die Zellen wurden ihre Komplexe mit dem Transfektionsagens TransFect^TM gebildet und mit den Zellen inkubiert. Die 12(b) und (d) zeigen, dass nach 16-stündiger Inkubationszeit in den beiden Zelltypen nur Spuren von 21L gefunden wurden. Dem gegenüber zeigen die 12(a) bis (d), dass signifikante Mengen (50 bis 80%) der anderen ODNs, die linearen (55L und 21PS) eingeschlossen, in den Zellen nachgewiesen wurden. Nach 48 Stunden Inkubation sinkt die Menge intakter ODNs in den Zellen, bleibt aber auf einem Niveau von 20 bis 30%. Die 12(a), (b) und (c), (d) zeigen, dass es keinen signifikanten Unterschied zwischen diesen beiden Zelllinien gibt. Alle ODNs mit einer Sekundärstruktur haben dieselbe Stabilität, die über der Stabilität der linearen ODNs 55L und 21PS liegt.
Beispiel 2: Inhibition der Proteinexpression des Reportergens pEGFP-N1
Dieses Beispiel stellt die Ergebnisse des -gal/pEGFP-N1-Tests auf HeLa-Zellen dar.
Nachstehende Tabelle 2 gibt über die Merkmale der in diesem Beispiel verwendeten Oligonucleotide Auskunft, deren Sequenzen in beiliegender 13 dargestellt sind.
Tabelle 2
Vorliegendes Beispiel stellt ebenfalls die Ergebnisse dar, die durch Einschleusen von Phosphorothiat-Nukleotiden, die in 13 mit * gekennzeichnet sind, in drei erfindungsgemäße Antisense-Oligonucleotiden ermittelt wurden.
Nachstehende Tabelle 3 zeigt die Inhibition der Proteinexpression des Reportergens pEGFP-N1 (in %) durch die Phosphodiester- und Phosphorothioat-Oligonucleotide.
Tabelle 3
Beispiel 3: Untersuchung erfindungsgemäßer Antisense-Oligonucleotide mit einer komplementären Region des Onkogens EWS-Fli1 des Ewing-Sarkoms
1) Auswahl der erfindungsgemäßen Antisense-Oligonucleotide
EWS-Fli1 ist das onkogene Gen des Ewing-Sarkoms (solider und hämatologischer Tumor bei Kindern) und primitiver neuroektodermaler Tumoren.
Zur Inhibition des Gens EWS-Fli1 wurde die RNA als Ziel gewählt, da sie ein chimerisches Protein EWS-Fli1 produziert. Dieses Protein, das für die Krankheit verantwortlich ist, verursacht die Entwicklung des Ewing-Sarkoms an (Tanaka, K., Iwakuma, T., Harimaya, K., Sato, H., Iwamoto, Y. J. Clin. Invest. 1997, 239–247; Toreetsky, J. A., Connell, Y., Neckers, L., Bhat, K. J. Neuro-Oncology. 1997, 31, 9–16). Die RNA besteht zur Hälfte aus der Rekombination 5' EWS (Gen des Chromosoms 22) mit der Hälfte der Rekombination 3' (Gen Fli1 des Chromosoms 11), hierbei handelt es sich um eine Translokation der Chromosomen 22 und 11, um eine 22/11-Chimere herzustellen.
Das proteinartige Onkogen umfasst 1500 Basen. Um das Onkogen zu inhibieren, sind Antisense-Oligonucleotide zu verwenden, die auf den „break point" des Fusionsokongens zentriert sind. In den Artikeln nach dem Stand der Technik (Tanaka, K., Iwakuma, T., Harimaya, K., Sato, H., Iwamoto, Y. J. Clin. Invest. 1997, 239–247; Toreetsky, J. A., Connell, Y., Neckers, L., Bhat, K. J. Neuro-Oncology. 1997, 31, 9–16) identifizieren die Autoren Phosphorothioat-Oligonucleotide als befähigt, das chimerische Onkogen in vitro und in vivo zu inhibieren: diese Oligonucleotide sind linear.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden Antisense-Phosphorothioat-Oligonucleotide, die aber hier von einer Sekundärstruktur strukturiert sind, vorbereitet mit dem Ziel, einerseits den Antisens vor Degradation zu schützen und andererseits seine Interaktion mit dem Ziel und seine in vitro- und in vivo-Effizienz zu erleichtern.
Zur Auswahl der für das Ziel am besten geeigneten Sekundärstruktur wurde die Sekundärstruktur dieses Ziels mit Hilfe des Programms „RNA Structure 3.21" berechnet. Die anliegende 14 stellt die Struktur dieses Ziels dar. Es wurden alle Sequenzen der RNA EWS-Fli1 analysiert, wobei 6 Sekundärstrukturen die Strukturen des Ziels behalten haben. Die gegen dieses Ziel ausgewählten erfindungsgemäßen strukturierten Antisense-Oligonucleotide entsprechen zwei Typen.
Ein erster Typ mit der Bezeichnung EF 2929AS, dessen Struktur auf anliegender 15A dargestellt wird, wurde präpariert. Dieser verwendet kein Element, das gegenüber dem Ziel hinzugefügt wurde, um die Sekundärstruktur zu realisieren. 15B zeigt die Interaktionen mit dem Ziel. Er bildet bei 3' eine Struktur mit einer Schleife, die mit dem Ziel interagiert und hat ebenfalls bei 5' eine andere Interaktion mit einer Schleife des Ziels. Das strukturierte Oligonucleotid EF 2929AS stellt sich demnach wie eine komplementäre Abfolge des Ziels dar. Mit dieser neuen Konzeption gibt es viele Internaktionen mit dem Ziel, einerseits bei 3' mit einer Schleife und andererseits bei 5' "einsträngig" auf einer Schleife des Ziels selbst.
Ein zweiter erfindungsgemäßer Antisense-Oligonucleotid-Typ, dessen Struktur auf anliegender 16A dargestellt ist, wurde durch Hinzufügen einer supplementären Struktur an jedem Ende 3' und 5' präpariert. Die Interaktion erfolgt sowohl mit der Sekundärstruktur intern und mit dem Ziel extern auf mehreren Ebenen. Die 16B zeigt die Interaktionen mit dem Ziel.
Damit wurde ein strukturiertes Antisense-Oligonucleotid mit einem einzigen, bei 5' hinzugefügten Strukturelement mit der Bezeichnung EF 3008AS präpariert. Wie das Oligonucleotid EF 2929AS wurde das Oligonucleotid EF 3008AS entwickelt, um aufgrund seiner Sekundärstruktur nicht nur innerhalb des strukturierten Oligonucleotids zu interagieren, sondern auch, um zahlreiche Interaktionen auf mehreren Ebenen innerhalb des Ziels zu haben.
Die verschiedenen hergestellten strukturierten Oligonucleotide wurden im Hinblick auf den Schutz der in vitro- und in vivo-Aktivität getestet; eine Administration mit Nanopartikeln (Transdrug^®) oder einem Vektor mit der Bezeichnung Superfect^® wurden ebenfalls im Hinblick auf Schutz und Effizienz untersucht.
Die Sequenz der mit EF 2929AS und 3008AS bezeichneten Oligonucleotide und entsprechende Kontrollen sind auf der 17 dargestellt, wo * die Phosphorothioat-Gruppen kennzeichnet.
Die Sequenz des Oligonucleotids EF 2929AS ist in der anliegenden Sequenzliste unter der Nummer SEQ ID Nr. 1 dargestelt, und die Sequenz des Oligonucleotids 3008AS ist in der anliegenden Sequenzliste unter der Nummer SEQ ID Nr. 2 dargestellt.
2) Ergebnisse
a) Resistenz gegenüber Degradation
Die Fähigkeit der Oligonucleotide EF 2929AS und EF 3008AS, die, um der enzymatischen Hydrolyse zu widerstehen, mit einer erfindungsgemäßen Sekundärstruktur hergestellt wurden, wurde in DMEM untersucht, das mit 10% Serum von neugeborenen Kälbern (auch NCS – newborn calf serum heat inactivated genannt) und menschlichem Serum (MH) supplementiert worden war. Zur Vermeidung der Spaltung des mit (³²P) markierten Phosphats wurden für diese Studie Oligonucleotide mit einem bei 5' durch einen Ethyrest geschützten Phosphat verwendet.
Die 18 (bei A: 3008AS und bei B: 2929AS) bezieht sich auf die Analyse der Degradation des Oligonucleotids im Kulturmedium mit Serum von neugeborenen Kälbern (NCS) oder menschlichem Serum (MH), sie zeigt, dass die Sekundärstruktur die Resistenz der Oligonucleotide gegenüber Nukleasen signifikant erhöht.
Zwei Nanopartikel PIHCA (Transdrug^®) mit einer Größe von 65 nm (CD2) und 100 nm (CD3) wurden gemäß dem Monza-Patent (BioAlliance) hergestellt, eine Präparation von auf diesen Nanopartikeln adsorbierten Oligonucleotiden wurde herstellt. Der Einfluss dieser Präparation mit den Nanopartikeln auf die Stabilität des Oligonucleotids im DMEM, das mit 10% Serum von neugeborenen Kälber, NCS, und menschlichem Serum, MH, supplementiert worden war, wurde untersucht. Wie man auf der 18 sehen kann, weisen die Komplexe, die von den mit Nanopartikeln adsorbierten Oligonucleotiden gebildet wurden, eine größere Resistenz gegenüber nukleotidischer Degradation auf als Oligonucleotide allein.
b) Biologische Effizienz
Die Methoden zur Messung der Inhibition der Zellvermehrung ist folgende:
T1: 100.000 EWS/Fli1- und 3T3-Zellen je Vertiefung werden auf Plättchen mit 6 Vertiefungen verteilt (2 Vertiefungen für einen Punkt).
T2: Die Zellen werden mit PBS gewaschen, und 600 μl 10% einer Lösung aus Serum neugeborener Kälber (NCS) werden hinzugefügt.
Die ODNs-Komplexe werden mit SuperFect^TM oder Transdrug^® (BioAlliance Pharma), verdünnt in 200 μl Medium ohne NCS und ohne Antibiotika, hergestellt, die den Zellen hinzugefügt werden. Jeder Vertiefung wird komplettes Medium hinzugefügt, um über ein abschließendes Volumen von 800 μl zu verfügen.
T3: Nach Inkubation mit den ODNs (16 Stunden nach der Transfektion) werden die Zellen mit PBS gewaschen, und 1 ml einer NCS-Lösung 10% wird hinzugefügt. Am Abend werden die Zellen mit PBS gewaschen, und 600 μl einer NCS-Lösung 10% werden hinzugefügt.
Die in 200 μl Medium ohne NCS und ohne Antibiotika verdünnten ODNs mit SuperFect^TM werden den Zellen hinzugefügt. Komplettes Medium wird jeder Vertiefung hinzugefügt, um ein abschließendes Volumen von 800 μl zu erhalten.
T4: Nach Inkubation mit den ODNs (16 Stunden nach der Transfektion) werden die Zellen mit PBS gewaschen, und 400 μl Trypsin werden hinzugefügt. Danach wird das Zellwachstum berechnet.
Eine Inhibitionswirkung der Oligonucleotide wurde berechnet als I(AO) = [N1(AO) – N0(AO)]/N,wobei

N: – Anzahl der Zellen ohne Oligonucletide
N₀(AO): – Anzahl der Zellen vor der Transfektion
N₁(AO): – Anzahl der Zellen 2 Tage nach der ersten Transfektion

Die Inhibition der Zellvermehrung wurde auf den 3T3-Zellen durchgeführt, die EWS/fli1 exprimieren, durch eine Kon trolle mit normalen 3T3-Zellen konnten die Auswirkung der Inhibition des Zellwachstums gemessen werden. Diese Ergebnisse sind auf der anliegenden 19 dargestellt. Es ist deutlich zu sehen, dass das strukturierte Antisense-Oligonucleotid EF 3008AS im Hinblick auf dieses Kriterium aktiv ist, verglichen mit der negativen Kontrolle des strukturierten Oligonucleotids, das eine umgekehrte EF 3008RLS-Sequenz hat. Es ist festzustellen, dass EF 3008AS 50% der Inhibition des Zellwachstums indiziert.
c) in vivo-Modell des EWING-Sarkoms
Die Untersuchung wurde an transgenen Mäusen (nu nu Maus, vom Team von C. Auclair F. Subra entwickeltes Modell) durchgeführt, die EWS/Fli1 exprimieren und die Krankheit in Tumorform (Ewing-Sarkom) aufweisen, dieser tastbare Tumor entsteht 14 bis 28 Tage nach der Injektion von Tumorzellen.
Es wurde nachfolgend beschriebenes Protokoll durchgeführt.
Es wurden 6 Wochen alte männliche nu nu Mäuse vorbereitet, sie erhalten die EWS/Fli1-Zellen aus Zellkulturen, die in der Größenordnung von 5 10⁶ Zellen je ml in PBS resuspendiert wurden, 200 Mikroliter dieser Lösung wurden in jede Maus injiziert (Gruppe von 3 Mäusen für jeden getesteten Aufbereitungstyp). 14 bis 28 Tage nach der Inokulierung wurden die Aufbereitungen intratumoral in einen Tumor injiziert, der mindestens 2 bis 4 mm³ groß ist, danach wurden 4 andere Injektionen am Tag 5, 8, 12, 15 nach der ersten Injektion vorgenommen. Die Tiere wurden 21 Tage nach der letzten Injektion getötet.
Das Tumorvolumen wurde während des Versuchs anhand zweier Messungen im rechten Winkel (Länge L und Breite W, wobei die Berechnung LW 2/2 ergibt) ermittelt.
Die auf den 20 und 21 erfassten Aufbereitungsgruppen sind folgende:
Gruppe 1: Testmäuse ohne Oligonucleotid-Injektion
Gruppe 2: Mäuse 1, 2, 3; strukturierte Antisense-Oligonucleotide 100 Mikroliter PBS mit 20 Mikrogramm Oligonucleotide EF 3008AS auf Nanopartikeln adsorbiert (50 Mikrogramm/ml) und 50 Mikromol CTAB. Größe der Nanopartikel 65 Nanometer.
Gruppe 3: Mäuse 1c, 2c, 3c; Oligonucleotide negative Kontrolle EF 3008RLS unter denselben Bedingungen mit Nanopartikeln 65 Nanometer.
Gruppe 4: Mäuse 1, 2, 3; strukturierte Antisense-Oligonucleotide 100 Mikroliter PBS mit 20 Mikrogramm Oligonucleotide EF 3008AS auf Nanopartikeln adsorbiert (50 Mikrogramm/ml) und 50 Mikromol-Gramm CTAB. Größe der Nanopartikel 100 Nanometer.
Gruppe 5: Mäuse 1c, 2c, 3c; Oligonucleotide negative Kontrolle EF 3008RLS unter denselben Bedingungen mit Nanopartikeln 100 Nanometer.
Gruppe 6: Mäuse 1, 2, 3; strukturierte Antisense-Oligonucleotide 100 Mikroliter PBS mit 20 Mikrogramm Oligonucleotide EF 3008AS injiziert mit SuperFect^TM 54 Mikrogramm.
Gruppe 7: Mäuse 1AS, 2AS, 3AS; Oligonucleotide negative Kontrolle EF 3008RLS unter denselben Bedingungen ohne Super-Fect^TM.
Es wird eine in vivo-Effizienz mit einer Stabilisierung des Tumorwachstums durch intratumorale Injektion von erfindungsgemäßen strukturierten Oligonucleotiden beobachtet im Vergleich mit negativen Tests. Diese Wirkung wurde ebenfalls beobachtet, wenn diese mit einem klassischen Vektor verabreicht werden oder unter Verwendung von Nanopartikeln unterschiedlicher Größe, um das Eindringen der Oligonucleotide in die Zelle zu erleichtern.
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SEQUENZLISTE

Claims

Einsatz zumindest eines der Oligonucleotide, die in der Folgeliste unter den Nummern SEQ ID NO. 1 oder SEQ ID NO. 2 aufgeführt werden, als Wirkstoff zur Herstellung einer pharmazeutischen Rezeptur zur Behandlung eines EWING-Sarkoms.
Einsatz gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonucleotide identisch oder unterschiedlich, frei, eingekapselt, gekoppelt, mit anderen unterschiedlichen Substanzen vereinigt, in der besagten Rezeptur mit einem aus pharmazeutischer Sicht annehmbaren Arzneistoffträger verbunden sind.