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CN109810977A - 具有递送功能的基因表达调控用单链核酸分子 - Google Patents

具有递送功能的基因表达调控用单链核酸分子 Download PDF

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CN109810977A
CN109810977A CN201910126856.6A CN201910126856A CN109810977A CN 109810977 A CN109810977 A CN 109810977A CN 201910126856 A CN201910126856 A CN 201910126856A CN 109810977 A CN109810977 A CN 109810977A
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CN
China
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aforementioned
nucleic acid
single stranded
stranded nucleic
residue
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Withdrawn
Application number
CN201910126856.6A
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大木忠明
青木绘里子
江村智佐登
滨崎智洋
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Bo Nake Of Co Ltd
Original Assignee
Bo Nake Of Co Ltd
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Publication date
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Abstract

本申请提供一种具有递送功能的基因表达调控用单链核酸分子。具体来说，本申请提供一种单链核酸分子，其具有递送功能，能够抑制靶基因的表达。本申请涉及一种分子，其特征在于当沿着从5’侧向3’侧的方向观察时以下列顺序包括5’侧区域(Xc)、连接子区域(Lx)、内部区域(Z)、连接子区域(Ly)和3’侧区域(Yc)。

Description

具有递送功能的基因表达调控用单链核酸分子
本申请为申请号为“201380028696.2”，申请日为“2013年5月25日”，发明名称为“具有递送功能的基因表达调控用单链核酸分子”的申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及具有递送功能(delivery function)的基因表达抑制用单链核酸分子，包含其的组合物及其用途。
背景技术
作为用于抑制基因表达的技术，例如RNA干扰(RNAi)是已知的(非专利文献1)。RNA干扰对基因表达的抑制一般例如通过将短双链RNA分子投与至细胞等来进行。前述双链RNA分子一般称作siRNA(小干扰RNA)。已报道称基因表达还可被经分子内退火而具有部分形成于其中的双链的环状RNA分子所抑制(专利文献1)。然而，在这些技术中，诱导基因表达抑制的RNA分子具有下列问题。
首先，为了生产前述siRNA，必须单独合成正义链和反义链并在该过程结束时将这些链杂交。因此，存在制造效率低下的问题。此外，当前述siRNA投与至细胞时，必须在抑制单链RNA解离的同时将siRNA投与至细胞，这需要设定用于操作siRNA的条件的繁重工作。环状RNA分子具有的问题在于其合成困难。为了应对现状，本发明人构建了具有通过自身退火产生的双环结构的新的单链核酸分子，解决了上述问题(专利文献2)。
[文献列表]
[专利文献]
专利文献1：JP-A-2008-278784
专利文献2：WO 2012/005368
[非专利文献]
非专利文献1：Fire,等人,Nature,vol.391,p.806-811,1998
发明内容
发明要解决的问题
此外，此类新的单链核酸分子需要进一步实现至靶标的优异递送功能。
因此，本发明旨在提供具有递送功能的能够抑制靶基因表达的单链核酸。
用于解决问题的方案
为了实现前述目的，本发明的单链核酸分子为具有递送功能的靶基因表达抑制用单链核酸分子，所述单链核酸分子从5’侧至3’侧依下列顺序包括5’侧区域(Xc)、连接子区域(Lx)、内部区域(Z)、连接子区域(Ly)和3’侧区域(Yc)，其中前述内部区域(Z)通过内部5’侧区域(X)和内部3’侧区域(Y)的连接构成，前述5’侧区域(Xc)与前述内部5’侧区域(X)互补，前述3’侧区域(Yc)与前述内部3’侧区域(Y)互补，前述内部区域(Z)、前述5’侧区域(Xc)和前述3’侧区域(Yc)的至少之一包括抑制靶基因的表达的表达抑制序列，且选自由5’末端、3’末端、前述连接子区域(Lx)和前述连接子区域(Ly)组成的组的至少之一结合至生物相关物质。
发明的效果
本发明的单链核酸分子能够实现向靶标的优异递送能力，而不必须(essentially)需要例如递送用载体。因此，例如，不需要考虑载体的毒性，并且可避免设定与形成核酸分子和载体的复合体相关的各种条件的研究。因此，例如，可减少生产和使用方面的劳力和成本。
附图说明
图1示出说明本发明单链核酸分子的实例的示意图。
图2示出说明本发明单链核酸分子的另一实例的示意图。
图3为示出本发明实施例中稳定表达萤火虫荧光素酶(pGL3 Luc)的乳腺癌细胞系MCF-7的萤火虫荧光素酶基因表达抑制效果(荧光素酶的相对活性)的图。
图4为示出本发明实施例中稳定表达萤火虫荧光素酶(pGL3 Luc)的乳腺癌细胞系MCF-7的萤火虫荧光素酶基因表达抑制效果(荧光素酶的相对活性)的另一图。
图5为示出本发明实施例中稳定表达萤火虫荧光素酶(pGL3 Luc)的乳腺癌细胞系MCF-7的萤火虫荧光素酶基因表达抑制效果(荧光素酶的相对活性)的又一图。
图6为示出本发明实施例中稳定表达萤火虫荧光素酶(pGL3 Luc)的乳腺癌细胞系MCF-7的萤火虫荧光素酶基因表达抑制效果(荧光素酶的相对活性)的又一图。
图7为示出本发明实施例中稳定表达萤火虫荧光素酶(pGL3 Luc)的乳腺癌细胞系MCF-7的萤火虫荧光素酶基因表达抑制效果(荧光素酶的相对活性)的又一图。
图8为示出本发明实施例中稳定表达萤火虫荧光素酶(pGL3 Luc)的乳腺癌细胞系MCF-7的萤火虫荧光素酶基因表达抑制效果(荧光素酶的相对活性)的又一图。
图9为示出本发明实施例中稳定表达萤火虫荧光素酶(pGL3 Luc)的乳腺癌细胞系MCF-7的萤火虫荧光素酶基因表达抑制效果(荧光素酶的相对活性)的又一图。
图10示出本发明实施例中小鼠萤火虫荧光素酶基因表达抑制的测量结果的照片。图10(a)为示出用本发明单链核酸处理的小鼠的测量结果的照片，图10(b)为未处理小鼠的测量结果的照片。
图11为示出图10照片所示全身荧光素酶活性(萤火虫荧光素酶基因的表达抑制)的测量结果的图。
图12为示出图10照片所示脑荧光素酶活性(萤火虫荧光素酶基因的表达抑制)的测量结果的图。
具体实施方式
除非另有说明，本说明书中使用的术语意指它们在本领域中通常的含义。
1.ssNc分子
如上所述，本发明的单链核酸分子为具有递送功能的靶基因表达抑制用单链核酸分子，并且所述单链核酸分子的特征在于其从5’侧至3’侧以下列顺序包括5’侧区域(Xc)、连接子区域(Lx)、内部区域(Z)、连接子区域(Ly)和3’侧区域(Yc)，其中
前述内部区域(Z)通过内部5’侧区域(X)和内部3’侧区域(Y)的连接构成，
前述5’侧区域(Xc)与前述内部5’侧区域(X)互补，
前述3’侧区域(Yc)与前述内部3’侧区域(Y)互补，
前述内部区域(Z)、前述5’侧区域(Xc)和前述3’侧区域(Yc)的至少之一包括抑制靶基因的表达的表达抑制序列，和
选自由5’末端、3’末端、前述连接子区域(Lx)和前述连接子区域(Ly)组成的组的至少之一结合至生物相关物质。
本发明中，“靶基因的表达抑制”意指例如抑制前述靶基因的表达。前述抑制实现的机理不特别限定，并可为例如下调或沉默。前述靶基因的表达抑制可通过例如来源于靶基因的转录产物量的降低；前述转录产物活性的降低；由前述靶基因产生的翻译产物量的降低；或前述翻译产物活性的降低等来证实。前述蛋白质可为例如成熟蛋白质、进行加工之前或翻译后修饰的前体蛋白质。
本发明的单链核酸分子在下文中还可称为本发明的“ssNc分子”。本发明的ssNc分子可用于体内或体外抑制例如靶基因的表达，且还可称为“靶基因的表达抑制用ssNc分子”或“靶基因的表达抑制剂”。此外，本发明的ssNc分子可通过例如RNA干扰抑制前述靶基因的表达，且其还可称为“RNA干扰用ssNc分子”、“RNA干扰诱导分子”、“RNA干扰剂”或“RNA干扰诱导剂”。本发明的ssNc分子还可例如抑制干扰素等的副作用。
在本发明的ssNc分子中，5’端和3’端不相互连接。因此，本发明的ssNc分子还可称为“线性单链核酸分子”。在本发明的ssNc分子中，例如，前述内部5’区域(X)和前述内部3’区域(Y)在前述内部区域(Z)处直接连接。
在本发明的ssNc分子中，前述5’侧区域(Xc)与前述内部5’侧区域(X)互补，前述3’侧区域(Yc)与前述内部3’侧区域(Y)互补。因此，在5’侧，双链可通过前述区域(Xc)向区域(X)的折回并且前述区域(Xc)和(X)的自身退火而形成，在3’侧，双链可通过前述区域(Yc)向区域(Y)的折回且前述区域(Yc)和(Y)的自身退火而形成。
在本发明的ssNc分子中，前述表达抑制序列为显示例如将本发明的ssNc分子体内或体外引入细胞时抑制前述靶基因表达的活性的序列。前述表达抑制序列不特别限定，且可根据靶基因的种类适当设定。作为前述表达抑制序列，例如，由siRNA引起的RNA干扰中涉及的序列可适当使用。一般而言，RNA干扰为长双链RNA(dsRNA)在细胞中被Dicer裂解(cleaved)产生由约19至21个碱基对组成且具有凸出的3’端的双链RNA(siRNA：小干扰RNA)，并且单链RNA之一结合至靶mRNA以降解前述mRNA，从而抑制mRNA的翻译的现象。作为结合至前述靶mRNA的前述siRNA的单链RNA的序列，例如，已报道了用于各种靶基因的各种序列。在本发明中，例如，前述siRNA的单链RNA的序列可用作前述表达抑制序列。在本发明中，不仅可使用在本申请提交时已知的siRNA的单链RNA的序列，而且还可使用未来将鉴定出的序列，例如作为前述表达抑制序列。
前述表达抑制序列为例如优选与前述靶基因的设定区域至少90％的互补、更优选95％的互补，仍更优选98％的互补，且特别优选100％的互补。当满足这种互补时，例如可充分减少脱靶效应。
推测前述由本发明的ssNc分子造成的靶基因的表达抑制，例如通过由在前述内部区域(Z)、前述5’侧区域(Xc)和前述3’侧区域(Yc)的至少之一中配置前述表达抑制序列的结构所引起的RNA干扰或类似于RNA干扰的现象(RNA干扰样的现象)来实现。然而，应注意的是，本发明决不限于该机理。不像所谓的siRNA，本发明的ssNc分子不以由两条单链RNA构成的dsRNA的形式引入细胞等，且其不总是必须在细胞中裂解出前述表达抑制序列。因此，可以说，例如，本发明的ssNc分子显示RNA干扰样的功能。
在本发明的ssNc分子中，前述表达抑制序列如上所述包括在前述内部区域(Z)、前述5’侧区域(Xc)和前述3’侧区域(Yc)的至少之一中。本发明的ssNc分子可包括例如一个上述表达抑制序列或两个以上的上述表达抑制序列。
在后一种情况中，本发明的ssNc分子可包括例如：两个以上的针对同一靶基因的相同表达抑制序列；两个以上的针对同一靶基因的不同表达抑制序列；或者两个以上的针对不同靶基因的不同表达抑制序列。当本发明的ssNc分子包括两个以上的上述表达抑制序列时，各表达抑制序列的位置不特别限定，且它们可在选自前述内部区域(Z)、前述5’侧区域(Xc)和前述3’侧区域(Yc)的一个区域或不同区域中。当本发明的ssNc分子包括两个以上的针对不同靶基因的上述表达抑制序列时，例如本发明的ssNc分子可抑制两种以上的不同靶基因的表达。
如上所述，前述内部区域(Z)由相互连接的前述内部5’区域(X)和前述内部3'区域(Y)构成。例如，前述区域(X)和(Y)直接相互连接而二者之间没有间插序列。前述内部区域(Z)表示为“由相互连接的前述内部5'侧区域(X)和前述内部3'侧区域(Y)构成”仅表示前述5'侧区域(Xc)和前述3'侧区域(Yc)之间的序列关系。该定义不意欲限定，例如在前述ssNc分子的使用中，前述内部区域(Z)中的前述5'侧区域(Xc)和前述3'侧区域(Yc)是离散的独立区域。即，例如当前述表达抑制序列包括在前述内部区域(Z)中时，前述表达抑制序列可排列成横跨前述内部区域(Z)中的前述区域(X)和(Y)。
在本发明的ssNc分子中，前述5'侧区域(Xc)与前述内部5'侧区域(X)互补。必须的仅是前述区域(Xc)具有与前述区域(X)的全部区域或部分区域互补的序列。具体地，例如，优选前述区域(Xc)包括与前述区域(Xc)的全部区域或部分区域互补的序列或由与前述区域(Xc)的全部区域或部分区域互补的序列组成。前述区域(Xc)可例如优选与前述区域(X)的全部区域或部分区域互补，或者前述区域(Xc)中的一个或几个碱基可与之非互补。优选地，前述区域(Xc)与之完美互补。在本发明的ssNc分子，前述3'侧区域(Yc)与前述内部3'侧区域(Y)互补。必须的仅是前述区域(Yc)具有与前述区域(Y)的全部区域或部分区域互补的序列。具体地，例如，优选前述区域(Yc)包括与前述区域(Y)的全部区域或部分区域互补的序列或者由与前述区域(Y)的全部区域或部分区域互补的序列组成。前述区域(Yc)可例如优选与前述区域(Y)的全部区域或部分区域互补，或者前述区域(Yc)中的一个或几个碱基可与之非互补。优选地，前述区域(Yc)与之完美互补。前述表达“一个或几个碱基”意指例如1至3个碱基，优选1个碱基或2个碱基。
本发明的ssNc分子可构造为使得其在前述5’侧区域(Xc)和内部5’侧区域(X)之间具有连接子区域(Lx)，并且前述区域(Xc)和(X)经前述连接子区域(Lx)连接。
本发明的ssNc分子在前述3’侧区域(Yc)和内部3’侧区域(Y)之间具有连接子区域(Ly)，前述区域(Yc)和(Y)经前述连接子区域(Ly)连接。
前述连接子区域(Lx)和前述连接子区域(Ly)各自优选在自体区域内部具有无自身退火的结构。
在本发明的ssNc分子中，前述生物相关物质为显示对生物体的亲和性的物质并且还称为生物相容性物质。前述生物相关物质为例如包含在源于生物体的组分中的物质或者具有与该组分相同或相似结构的物质。前述生物相关物质不特别限定，只要其显示对生物体的亲和性即可，例如，可提及各种功能性物质如维生素和激素等。更具体地，例如，其为如下所述。
例如，前述生物相关物质的第一形态为脂质。本发明的ssNc分子可通过具有脂质来改善例如向细胞内的引入效率和/或耐酶促降解性。这被认为是由于例如下述机理。即，本发明的ssNc分子通过与前述脂质区域和其它核酸区域作为整体形成微团结构(micellstructure)而具有改善的细胞膜透过性和改善的耐酶促降解性。另外，本发明的ssNc分子由于前述脂质区域和其它核酸区域形成作为整体的外切体(exosome)样复合体而被理解为具有更加改善的在生物体内的移动性。本发明不限定为此类机理。
前述脂质的具体实例包括单纯脂质、复合脂质、衍生脂质和脂溶性维生素等。前述单纯脂质的实例包括为脂肪酸和醇的酯的单链脂质。前述复合脂质的实例包括双链磷脂和糖脂质等。前述衍生脂质的实例包括脂肪酸如饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸等，以及类固醇(steroids)如胆固醇、和类固醇激素等，等等。前述脂溶性维生素的实例包括视黄醇、生育酚和钙化醇等。除了这些以外，前述脂质的实例包括油脂、烃类如角鲨烯等和高级醇等。
前述单链脂质由例如RCOO-表示。前述双链脂质由例如下式表示。R为例如饱和脂肪酸如棕榈酸、硬脂酸和肉豆蔻酸等，以及不饱和脂肪酸如油酸等，等等。
前述生物相关物质的第二形态为例如肽。本发明的ssNc分子具有，例如前述肽可改善向细胞内的引入效率和/或耐酶促降解性。
前述肽不特别限定，且实例包括可结合至靶细胞膜蛋白的蛋白质或其肽；选择性并入靶位点的蛋白质或其肽，对特定的受体起作用的生物分子或其肽，和与细胞表面上递呈的抗原反应的抗体蛋白质或其肽等。前述可结合至膜蛋白的蛋白质为例如穿膜蛋白质(membrane-permeable protein)等，其肽为例如精氨酸肽(arginine peptide)等。前述抗体蛋白质的肽为例如Fab结构域等。
前述生物相关物质的其它形式包括例如聚乙二醇(PEG)、聚胺、荧光分子、生物素、嵌入分子(intercalator molecule)、糖类、水溶性维生素、金属螯合剂和交联剂等。
在本发明的ssNc分子中，前述生物相关物质的数不特别限定，其为例如1–4个，优选1–3个，更优选1或2个。前述生物相关物质的结合位点如上所述为5’末端、3’末端、前述核酸分子的前述连接子区域(Lx)和/或前述连接子区域(Ly)。
在本发明的ssNc分子中，前述生物相关物质可例如直接或间接结合至前述核酸分子，优选间接。当间接结合时，例如经结合用连接子的结合是优选的。前述结合用连接子的结构不特别限定，且例如可提及下式的结构。在下式中，n为正整数，Y为例如NH、S、O和CO等。在本发明的ssNc分子中，当前述生物相关物质具有氨基酸如半胱氨酸等时，例如前述生物相关物质可经二硫键结合至前述核酸分子。
本发明的ssNc分子的核酸结构的一个实施方案通过图1的示意图示出。图1A为示出从前述ssNc分子的5’侧至3’侧各区域的顺序的示意图。图1B为示出在前述ssNc分子中形成双链的状态的示意图。如图1B中所示，在前述ssNc分子中，前述5’侧区域(Xc)折回，在前述5’侧区域(Xc)和前述内部5’侧区域(X)之间形成双链，前述3’侧区域(Yc)折回，在前述3’侧区域(Yc)和前述内部3’侧区域(Y)之间形成双链，前述Lx区域和前述Ly区域各自具有环结构。图1中示出的示意图仅说明其中各区域连接的顺序和形成双链的各区域的位置关系，它们并不限定例如各区域的长度等。
在本发明的ssNc分子中，前述生物相关物质可如上所述结合至例如图1中的前述5’侧区域(Xc)的未结合末端、前述3’侧区域(Yc)的未结合末端、连接子区域(Lx)和连接子区域(Ly)中任一个。
在本发明的ssNc分子中，前述5’侧区域(Xc)、前述内部5’侧区域(X)、前述内部3’侧区域(Y)和前述3’侧区域(Yc)的碱基数不特别限定，且其为例如如下所述。本发明中，“碱基数”意指“长度”，例如，其还可称为“碱基长度”。
如上所述，例如，前述5’侧区域(Xc)可与前述内部5’侧区域(X)的全部区域互补。在该情况中，优选例如前述区域(Xc)具有与前述区域(X)相同的碱基长度，并由与前述区域(X)从5’末端至3’末端的全部区域互补的碱基序列组成。更优选前述区域(Xc)具有与前述区域(X)相同的碱基长度，且前述区域(Xc)中的所有碱基与前述区域(X)中的所有碱基互补，即，例如优选区域(Xc)与区域(X)完美互补。然而要注意的是，区域(Xc)的构造不限于此，例如如上所述，区域(Xc)中的一个或几个碱基可与区域(X)中的对应碱基非互补。
此外，如上所述，前述5’侧区域(Xc)可与例如前述内部5’侧区域(X)的部分区域互补。在该情况中，优选例如前述区域(Xc)具有与前述区域(X)的部分序列具有相同的碱基长度，即，前述区域(Xc)由碱基长度比前述区域(X)的碱基长度短一个碱基以上的碱基序列组成。更优选前述区域(Xc)具有与前述区域(X)的部分序列相同的碱基长度，且前述区域(Xc)中的所有碱基与前述区域(X)的部分区域中的所有碱基互补，即，例如优选，区域(Xc)优选与区域(X)的部分序列完美互补。前述区域(X)的部分区域优选为具有由例如从前述区域(X)中5’端碱基(第1个碱基)开始的连续碱基组成的碱基序列的区域(片段)。
如上所述，前述3’侧区域(Yc)可与例如前述内部3’侧区域(Y)的全部区域互补。在该情况下，优选例如前述区域(Yc)具有与前述区域(Y)相同的碱基长度，且由与前述区域(Y)从5’末端至3’末端的全部区域互补的碱基序列组成。更优选前述区域(Yc)具有与前述区域(Y)相同的碱基长度，且前述区域(Yc)中的所有碱基与前述区域(Y)中的所有碱基互补，即，例如优选区域(Yc)与区域(Y)完美互补。然而要注意的是，区域(Yc)的构造不限于此，且例如如上所述区域(Yc)中的一个或几个碱基可与区域(Y)中的对应碱基非互补。
此外，如上所述，前述3’侧区域(Yc)可与例如前述内部3’侧区域(Y)的部分区域互补。在该情况下，优选例如前述区域(Yc)具有与前述区域(Y)的部分区域相同的碱基长度，即，前述区域(Yc)由碱基长度比前述区域(Y)的碱基长度短一个碱基以上的碱基序列组成。更优选前述区域(Yc)具有与前述区域(Y)的部分区域的碱基长度相同，且前述区域(Yc)中的所有碱基与前述区域(Y)的部分区域中的所有碱基互补，即，例如优选区域(Yc)与区域(Y)的部分区域完美互补。前述区域(Y)的部分区域优选为具有由例如从前述区域(Y)中3’端碱基(第1个碱基)开始的连续碱基组成的碱基序列的区域(片段)。
在本发明的ssNc分子中，前述内部区域(Z)中的碱基数(Z)与前述内部5’侧区域(X)中的碱基数(X)和前述内部3’侧区域(Y)中的碱基数(Y)的关系以及前述内部区域(Z)中的碱基数(Z)与前述内部5’侧区域(X)的碱基数(X)和前述5’侧区域(Xc)中的碱基数(Xc)的关系满足例如下式(1)和(2)的条件。
Z＝X+Y (1)
Z≥Xc+Yc (2)
在本发明的ssNc分子中，前述内部5’侧区域(X)中的碱基数(X)与前述内部3’侧区域(Y)中的碱基数(Y)的关系不特别限定，且可满足例如下式的条件中的任一个：
X＝Y (19)
X<Y (20)
X>Y (21).
在本发明的ssNc分子中，前述内部5’侧区域(X)中的碱基数(X)与前述5’侧区域(Xc)中的碱基数(Xc)的关系，前述内部3’侧区域(Y)中的碱基数(Y)与前述3’侧区域(Yc)中的碱基数(Yc)的关系满足例如下列条件(a)至(d)中任一个：(a)满足下式(3)和(4)的条件。
X>Xc (3)
Y＝Yc (4)
(b)满足下式(5)和(6)的条件。
X＝Xc (5)
Y>Yc (6)
(c)满足下式(7)和(8)的条件。
X>Xc (7)
Y>Yc (8)
(d)满足下式(9)和(10)的条件。
X＝Xc (9)
Y＝Yc (10)
在上述条件(a)至(d)中，例如，前述内部5’侧区域(X)中的碱基数(X)与前述5’侧区域(Xc)中的碱基数(Xc)之差，以及前述内部3’侧区域(Y)中的碱基数(Y)与前述3’侧区域(Yc)中的碱基数(Yc)之差优选满足下列条件。
(a)满足下式(11)和(12)的条件。
X-Xc＝1至10，优选1、2、3或4，
更优选1、2或3 (11)
Y-Yc＝0 (12)
(b)满足下式(13)和(14)的条件。
X-Xc＝0 (13)
Y-Yc＝1至10，优选1、2、3或4，
更优选1、2或3 (14)
(c)满足下式(15)和(16)的条件。
X-Xc＝1至10，优选1、2或3，
更优选1或2 (15)
Y-Yc＝1至10，优选1、2或3，
更优选1或2 (16)
(d)满足下式(17)和(18)的条件。
X-Xc＝0 (17)
Y-Yc＝0 (18)
关于满足前述条件(a)至(d)的ssNc分子，它们结构的实例分别示于图2的示意图中。图2示出包括前述连接子区域(Lx)和(Ly)的ssNc分子。图2A示出满足前述条件(a)的ssNc分子的实例；图2B示出满足前述条件(b)的ssNc分子的实例；图2C示出满足前述条件(c)的ssNc分子的实例；和图2D示出满足前述条件(d)的ssNc分子的实例。图2，虚线表示双链通过自身退火形成的状态。图2中示出的ssNc分子所有都针对前述内部5’侧区域(X)中的碱基数(X)与前述内部3’侧区域(Y)中的碱基数(Y)之间的关系满足前述式(20)的“X<Y”的实例。然而要注意的是，该关系不限于此，且如上所述前述式(19)的“X＝Y”或前述式(21)的“X>Y”可满足。图2示出的示意图仅说明前述内部5’侧区域(X)与前述5’侧区域(Xc)之间的关系以及前述内部3’侧区域(Y)与前述3’侧区域(Yc)之间的关系，且它们不限定例如各区域的长度和形状，以及连接子区域(Lx)和连接子区域(Ly)的存在与否。
上述(a)至(c)的ssNc分子为具有能够不与前述内部区域(Z)中的前述5’侧区域(Xc)和前述3’侧区域(Yc)配对的碱基的构造，这是由于例如前述5’侧区域(Xc)和前述内部5’侧区域(X)，以及前述3’侧区域(Yc)和前述内部3’侧区域(Y)各自形成双链。它们还可为具有所述不形成双链的碱基的构造。在前述内部区域(Z)中，能够不配对的前述碱基(也称为不形成双链的碱基)在下文中称为“未配对碱基”。在图2中，前述未配对碱基的区域由“F”表示。前述区域(F)的碱基数不特别限定。前述区域(F)中的碱基数(F)为例如前述(a)的ssNc分子的“X-Xc”的碱基数；上述(b)的ssNc分子的“Y-Yc”的碱基数；和前述(c)的ssNc分子的“X-Xc”的碱基数和“Y-Yc”的碱基数。
另一方面，构造满足前述条件(d)的的ssNc分子以使例如前述内部区域(Z)的全部区域与前述5’侧区域(Xc)和前述3’侧区域(Yc)配对，换言之，前述内部区域(Z)的全部区域形成双链。在满足前述条件(d)的ssNc分子中，前述5’侧区域(Xc)的5’端和前述3’侧区域(Yc)的3’端不相互连接。
在下文示出本发明的ssNc分子的各区域长度，但本发明不限于此。本发明中，例如碱基数的数值范围公开了落入该范围的所有正整数，且例如“1–4个碱基”意指所有“1、2、3、4个碱基”(下同)。
前述5’侧区域(Xc)中的碱基、前述3’侧区域(Yc)的碱基和前述内部区域(Z)中的前述未配对碱基(F)中的碱基的总数例如等于前述内部区域(Z)中的碱基数。因此，前述5’侧区域(Xc)的长度和前述3’侧区域(Yc)的长度可根据例如前述内部区域(Z)的长度、前述未配对碱基s(F)的数量和未配对碱基的位置而适当确定。
前述内部区域(Z)中的碱基数为例如19以上。碱基数的下限为例如19、优选20、更优选21。前述碱基数的上限为例如50、优选40、更优选30。前述内部区域(Z)中碱基数的具体实例为19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。
当前述内部区域(Z)包括前述表达抑制序列时，前述内部区域(Z)可为例如仅由前述表达抑制序列组成的区域或包括前述表达抑制序列的区域。前述表达抑制序列的碱基数为例如19至30，优选19、20或21。当前述内部区域(Z)包括前述表达抑制序列时，前述表达抑制序列另外可在其5’侧和/或3’侧具有附加序列。前述附加序列中的碱基数为例如1至31，优选1至21，更优选1至11，仍更优选1至7。
前述5’侧区域(Xc)的碱基数为例如1至29，优选1至11，更优选1至7，仍更优选1至4，且特别优选1、2或3。当前述内部区域(Z)或前述3’侧区域(Yc)包括前述表达抑制序列时，例如优选如上所述的碱基数。具体实例如下：当前述内部区域(Z)的碱基数为19至30(例如19)时，前述5’侧区域(Xc)的碱基数为例如1至11，优选1至7，更优选1至4，且仍更优选1、2或3。
当前述5’侧区域(Xc)包括前述表达抑制序列时，前述5’侧区域(Xc)可为例如仅由前述表达抑制序列组成的区域或包括前述表达抑制序列的区域。例如，前述表达抑制序列的长度如上所述。当前述5’侧区域(Xc)包括前述表达抑制序列时，前述表达抑制序列另外可在其5’侧和/或3’侧具有附加序列。前述附加序列中的碱基数为例如1至11，优选1至7。
前述3’侧区域(Yc)中的碱基数为例如1至29，优选1至11，更优选1至7，仍更优选1至4，且特别优选1、2或3。当前述内部区域(Z)或前述5’侧区域(Xc)包括前述表达抑制序列时，例如优选如上所述的碱基数。具体实例如下：当前述内部区域(Z)中的碱基数为19至30(如19)时，前述3’侧区域(Yc)的碱基数为例如1至11，优选1至7，更优选1至4，且仍更优选1、2或3。
当前述3’侧区域(Yc)包括前述表达抑制序列时，前述3’侧区域(Yc)可为例如仅由前述表达抑制序列组成的区域或包括前述表达抑制序列的区域。前述表达抑制序列的长度为例如如上所述。当前述3’侧区域(Yc)包括前述表达抑制序列时，前述表达抑制序列另外可在其5’侧和/或3’侧具有附加序列。前述附加序列中的碱基数为例如1至11，优选1至7。
如上所述，前述内部区域(Z)中的碱基数、前述5’侧区域(Xc)中的碱基数和前述3’侧区域(Yc)中的碱基数之间的关系可由例如前述式(2)：“Z≥Xc+Yc”表示。具体地，由“Xc+Yc”表示的碱基数例如等于前述内部区域(Z)的碱基数，或低于前述内部区域(Z)的碱基数。在后一种情况中，“Z-(Xc+Yc)”为例如1至10，优选1至4，更优选1、2或3。前述“Z-(Xc+Yc)”对应于例如前述内部区域(Z)中前述未配对碱基区域(F)的碱基数(F)。
在本发明的ssNc分子中，前述连接子区域(Lx)和(Ly)的长度不特别限定。前述连接子区域(Lx)优选具有例如允许前述内部5’侧区域(X)和前述5’侧区域(Xc)形成双链的长度，前述连接子区域(Ly)优选具有例如允许前述内部3’侧区域(Y)和前述3’侧区域(Yc)形成双链的长度。当前述连接子区域(Lx)和前述连接子区域(Ly)的构成单元包括一个(或多个)碱基时，前述连接子区域(Lx)和前述连接子区域(Ly)的碱基数可相同或不同，而且，其碱基序列可相同或不同。就前述连接子区域(Lx)和前述连接子区域(Ly)的碱基数而言，碱基数的下限为例如1，优选2，更优选3，其上限为例如100，优选80，更优选50。前述连接子区域各自中的碱基数具体为例如1至50、1至30、1至20、1至10、1至7，或1至4，但不限于这些实例。
本发明的ssNc分子的全长不特别限定。在本发明的ssNc分子中，总碱基数(全长的碱基数)的下限为例如38，优选42，更优选50，仍更优选51，且特别优选52，其上限为例如300，优选200，更优选150，仍更优选100，且特别优选80。在本发明的ssNc分子中，不包括前述连接子区域(Lx)和(Ly)中的碱基数的总碱基数的下限为例如38，优选42，更优选50，仍更优选51，且特别优选52，其上限为例如300，优选200，更优选150，仍更优选100，且特别优选80。
在本发明的ssNc分子中，构成单元不特别限定。其实例包括核苷酸残基。前述核苷酸残基的实例包括核糖核苷酸残基和脱氧核糖核苷酸残基。前述核苷酸残基可为例如未被修饰的核苷酸残基(非修饰核苷酸残基)或已被修饰的核苷酸残基(修饰核苷酸残基)。通过构造本发明的ssNc分子包括前述修饰核苷酸残基，例如ssNc分子的耐核酸酶性可改善，从而使得ssNc分子的稳定性得以改善。此外，本发明的ssNc分子另外可包括例如除前述核苷酸残基以外的非核苷酸残基。前述核苷酸残基和前述非核苷酸残基的细节稍后描述。
在本发明的ssNc分子中，前述内部区域(Z)、前述5’侧区域(Xc)和前述3’侧区域(Yc)各自的构成单元优选前述核苷酸残基。前述各区域由例如下列残基(1)至(3)组成：
(1)一个(或多个)非修饰核苷酸残基
(2)一个(或多个)修饰核苷酸残基
(3)一个(或多个)非修饰核苷酸残基和一个(或多个)修饰核苷酸残基。
在本发明的ssNc分子中，前述连接子区域(Lx)和Ly)的构成单元不特别限定，且其实例包括前述核苷酸残基和前述非核苷酸残基。前述连接子区域各自可仅由例如一个(或多个)前述核苷酸残基组成，仅由一个(或多个)前述非核苷酸残基组成，或由一个(或多个)前述核苷酸残基和一个(或多个)前述非核苷酸残基二者组成。前述连接子区域各自由例如下列残基(1)至(7)组成：
(1)一个(或多个)非修饰核苷酸残基
(2)一个(或多个)修饰核苷酸残基
(3)一个(或多个)非修饰核苷酸残基和一个(或多个)修饰核苷酸残基
(4)一个(或多个)非核苷酸残基
(5)一个(或多个)非核苷酸残基和一个(或多个)非修饰核苷酸残基
(6)一个(或多个)非核苷酸残基和一个(或多个)修饰核苷酸残基
(7)一个(或多个)非核苷酸残基、一个(或多个)非修饰核苷酸残基和一个(或多个)修饰核苷酸残基。
当本发明的ssNc分子具有前述连接子区域(Lx)和前述连接子区域(Ly)二者时，例如，两个构成单元可相同或不同。其具体实例包括其中两个连接子区域的构成单元为前述核苷酸残基的形态，其中两个连接子区域的构成单元为前述非核苷酸残基的形态，以及其中一个区域的构成单元为前述核苷酸残基，另一个连接子区域的构成单元为非核苷酸残基的形态等。
本发明的ssNc分子的实例包括仅由前述核苷酸残基组成的分子；包括除了前述核苷酸残基以外的一个(或多个)前述非核苷酸残基的分子。在本发明的ssNc分子中，例如如上所述，前述核苷酸残基可仅为前述非修饰核苷酸残基；仅为前述修饰核苷酸残基；或者为一个(或多个)前述非修饰核苷酸残基和一个(或多个)前述修饰核苷酸残基二者。当前述ssNc分子包括前述非修饰核苷酸残基和前述修饰核苷酸残基时，前述修饰核苷酸残基的数量不特别限定，且为例如“一个至几个”，具体例如1至5个，优选1至4个，更优选1至3个，最优选1或2个。当本发明的ssNc分子包括前述非核苷酸残基时，前述非核苷酸残基的数量不特别限定，且为例如“一个至几个”，具体例如1至8个，1至6个，1至4个，1、2或3个。
在本发明的ssNc分子中，例如，前述核苷酸残基优选核糖核苷酸残基。在该情况中，例如，本发明的ssNc分子还称为“RNA分子”或“ssRNA分子”。前述ssRNA分子的实例包括仅由前述核糖核苷酸残基组成的分子；包括除前述核糖核苷酸残基以外的一个(或多个)前述非核苷酸残基的分子。如上所述，作为前述核糖核苷酸残基，例如，前述ssRNA分子可包括：仅前述非修饰的核糖核苷酸残基；仅前述修饰的核糖核苷酸残基；或一个(或多个)前述非修饰的核糖核苷酸残基和一个(或多个)前述修饰的核糖核苷酸残基二者。
当前述ssRNA分子包括例如除前述非修饰的核糖核苷酸残基以外的一个(或多个)前述修饰的核糖核苷酸残基，前述修饰的核糖核苷酸残基的数量不特别限定，且为例如“一个至几个”，具体例如1至5个，优选1至4个，更优选1至3个，最优选1或2个。前述修饰的核糖核苷酸残基与前述非修饰的核糖核苷酸残基相比可为例如通过用脱氧核糖残基取代核糖残基获得的前述脱氧核糖核苷酸残基。当前述ssRNA分子包括例如除一个(或多个)前述非修饰的核糖核苷酸残基以外的前述脱氧核糖核苷酸残基时，前述脱氧核糖核苷酸残基的数量不特别限定，且为例如“一个至多个”，具体例如1至5个，优选1至4个，更优选1至3个，最优选1或2个。
本发明的ssNc分子可包括例如标记物质，并可用前述标记物质标记。前述标记物质不特别限定，并可为例如，荧光物质、染料或同位素等。前述标记物质的实例包括：荧光团如芘、TAMRA、荧光黄、Cy3染料和Cy5染料。前述染料的实例包括Alexa染料如Alexa 488。前述同位素的实例包括稳定同位素和放射性同位素。其中，优选稳定同位素。例如，前述稳定同位素具有低辐射照射风险，并且它们不需要专用的设备。因此，稳定同位素的可操作性优异，且能够有助于减少成本。此外，例如，前述稳定同位素不改变被其标记的化合物的物理性质，因而具有优异的作为示踪物的性质。前述稳定同位素不特别限定，其实例包括2H、13C、15N、17O、18O、33S、34S和36S。
如上所述，本发明的ssNc分子可抑制前述靶基因的表达。因此，本发明的ssNc分子可用作例如治疗由基因引起的疾病的治疗剂。当本发明的ssNc分子包括例如作为前述表达抑制序列的抑制引起前述疾病的基因的表达的序列时，例如，其可通过前述靶基因的表达抑制来治疗前述疾病。本发明中，术语“治疗”包括：前述疾病的预防；疾病的改善；和预后的改善，例如其可意指它们中的任一种。
使用本发明的ssNc分子的方法不特别限定。例如，前述ssNc分子可投与至具有前述靶基因的对象。
投与本发明的ssNc分子的前述对象的实例包括细胞、组织和器官等。前述对象的实例还包括人类和例如非人哺乳动物即排除人类的哺乳动物等的非人动物等。前述投与可例如在体内或体外进行。前述细胞不特别限定，且其实例包括：各种培养细胞如HeLa细胞、293细胞、NIH3T3细胞和COS细胞；干细胞如ES细胞和造血干细胞；和从生物体分离的细胞如原代培养细胞。
本发明中，表达将被抑制的前述靶基因不特别限定，且可将任何期望的基因设为靶基因。此外，如上所述，前述表达抑制序列可根据前述靶基因的种类而适当设计。
关于本发明的ssNc分子的使用，可参考下面关于后述根据本发明的组合物、表达抑制方法和治疗方法等的记载。
由于本发明的ssNc分子可如上所述抑制靶基因的表达，例如其作为药用产品，诊断剂，农药，和进行对农药、医学、生命科学等的研究的工具。
2.核苷酸残基
前述核苷酸残基包括例如糖、碱基和磷酸作为其组分。前述核苷酸残基可为例如如上所述的核糖核苷酸残基或脱氧核糖核苷酸残基。前述核糖核苷酸残基具有例如核糖残基作为糖；腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)作为碱基。前述脱氧核糖残基具有例如脱氧核糖残基作为糖；腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)作为碱基。
前述核苷酸残基可为例如非修饰核苷酸残基或修饰核苷酸残基。前述非修饰核苷酸残基的组分例如与天然存在的核苷酸残基相同或实质上相同。优选地，所述组分与人体内天然存在的核苷酸残基的组分相同或实质上相同。
前述修饰核苷酸残基为例如通过修饰前述非修饰核苷酸残基获得的核苷酸残基。例如，前述修饰核苷酸残基可为前述非修饰核苷酸残基的任一组分被修饰的核苷酸残基。本发明中，“修饰”意指例如取代、添加和/或删除任一种前述组分；以及取代、添加和/或删除一个(或多个)前述组分中的一个(或多个)原子和/或一个(或多个)官能团。其还可称为“改变”。前述修饰核苷酸残基的实例包括天然存在的核苷酸残基和人工修饰的核苷酸残基。关于前述天然来源的修饰核苷酸残基，可参考例如Limbach等(Limbach等,1994,Summary:the modified nucleosides of RNA,Nucleic Acids Res.22:第2183至2196页)。前述修饰核苷酸残基可为例如前述核苷酸的代替物的残基。
前述核苷酸残基的修饰的实例包括核糖-磷酸骨架的修饰(下文中称为“核糖磷酸骨架(ribophosphate backbone)”)。
在前述核糖磷酸骨架中，例如，核糖残基可被修饰。在前述核糖残基中，例如，2’位碳可被修饰。具体地，键合至例如2’位碳的羟基可被氢或卤素如氟取代。通过用氢取代键合至前述2’位碳的羟基，可用脱氧核糖取代核糖残基。前述核糖残基可例如用其立体异构体取代，并且可用例如阿拉伯糖残基取代。
前述核糖磷酸骨架可用例如具有非核糖残基和/或非磷酸的非核糖磷酸骨架取代。前述非核糖磷酸骨架可为例如被修饰为不带电的前述核糖磷酸骨架。前述核苷酸中通过用前述非核糖磷酸骨架取代核糖磷酸骨架获得的代替物的实例包括吗啉基、环丁基和吡咯烷。前述代替物的其它实例包括人工核酸单体残基。其具体实例包括PNA(肽核酸)、LNA(锁核酸)和ENA(2’-O,4’-C-乙烯桥联的核酸(Ethylenebridged Nucleic Acids))。其中，优选PNA。
在前述核糖磷酸骨架中，例如，磷酸基团可被修饰。在前述核糖磷酸骨架中，与糖残基最紧密接近的磷酸基团称为“α-磷酸基团”。前述α-磷酸基团带负电，且电荷均匀分布在未结合至糖残基的两个氧原子上。前述α-磷酸基团的四个氧原子中，在核苷酸残基之间的磷酸二酯键中不结合至糖残基的两个氧原子下文中称为“非结合(non-linking)氧”。另一方面，在前述核苷酸残基之间的磷酸二酯键中不结合至糖残基的两个氧原子下文中称为“结合(linking)氧”。例如，前述α-磷酸基团优选修饰成不带电，或使前述非结合氧之间的电荷分布非对称。
在前述磷酸基团中，例如，可取代一个(或多个)前述非结合氧。一个(或多个)前述氧可由选自S(硫)、Se(硒)、B(硼)、C(碳)、H(氢)、N(氮)和OR(R为烷基或芳基)的任意原子取代，且优选由S取代。优选例如非结合氧之一由S取代，且更优选两个前述非结合氧被取代。前述修饰的磷酸基团的实例包括硫代磷酸酯(phosphorothioates)、二硫代磷酸酯(phosphorodithioates),磷硒酸酯(phosphoroselenates)、硼烷磷酸酯(boranophosphates)、硼烷磷酸的酯(boranophosphate esters)、氢膦酸酯(hydrogenphosphonates)、氨基磷酸盐(phosphoroamidates)、磷酸烷基酯或磷酸芳基酯，和磷酸三酯。特别地，优选其中前述两个非结合氧均由S取代的二硫代磷酸酯。
在前述磷酸基团中，例如，一个(或多个)前述结合氧可被取代。一个(或多个)前述氧由例如选自S(硫)、C(碳)和N(氮)的任意原子取代。前述修饰的磷酸基团的实例包括：由用N取代得到的桥联的氨基磷酸盐；由用S取代得到的桥联的硫代磷酸酯；和由用C取代的桥联的亚甲基膦酸酯。优选地，一个(或多个)前述结合氧的取代在例如本发明的ssNc分子的5’端核苷酸残基和3’端核苷酸残基的至少之一中进行。当在5’侧进行取代时，优选用C取代。当在3’侧进行取代时，优选用N取代。
前述磷酸基团可用例如前述无磷酸酯的连接子取代。前述连接子可包含硅氧烷、碳酸酯、羧甲基、氨基甲酸酯、酰胺、硫醚、环氧乙烷连接子、磺酸酯、磺酰胺、硫代甲酰缩醛(thioformacetal)、甲酰缩醛(formacetal)、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基甲基亚氨基、亚甲基亚肼基(methylenehydrazo)、亚甲基二甲基亚肼基或亚甲基氧基甲基亚氨基等。优选地，连接子可包含亚甲基羰基氨基和亚甲基甲基亚氨基。
在本发明的ssNc分子中，例如，3’端核苷酸残基和5’端核苷酸残基的至少之一可被修饰。例如，3’端和5’端任一处的核苷酸残基可被修饰，或者3’端和5’端两处的核苷酸残基可被修饰。前述修饰可为例如如上所述的，且优选修饰末端的一个(或多个)磷酸基团。例如，全部前述磷酸基团可被修饰，或者前述磷酸基团中的一个以上的原子可被修饰。在前一种情况中，全部磷酸基团可被取代或删除。
在一个(或两个)末端的一个(或多个)前述核苷酸残基的修饰可为例如任何其它分子的添加。前述其它分子的实例包括功能性分子例如如上所述的标记物质和保护基团。前述保护基团的实例包括S(硫)、Si(硅)、B(硼)和含酯基团。功能性分子如前述标记物质可用于例如本发明的ssNc分子的检测等。
前述其它分子可例如添加至前述核苷酸残基的磷酸基团，或者可经间隔子添加至前述磷酸基团或前述糖残基。例如，前述间隔子的末端原子可添加至或取代前述磷酸基团的任一个前述结合氧，或者糖残基的O、N、S或C。前述糖残基的结合位点优选为例如3’位的C、5’位的C，或与之键合的任何原子。例如，前述间隔子还可添加至或取代前述核苷酸代替物如PNA的末端原子。
前述间隔子不特别限定，且其实例包括-(CH2)n-、-(CH2)nN-、-(CH2)nO-、-(CH2)nS-、O(CH2CH2O)nCH2CH2OH、无碱基糖(abasic sugars)、酰胺、羧基、胺、羟基胺、羟基亚胺、硫醚、二硫化物、硫脲、磺酰胺和吗啉基，以及生物素试剂和荧光黄试剂。在前述式中，n为正整数，且优选n＝3或6。
附加在上述末端的分子可以的其他实例包括例如色素、嵌入剂(例如，吖啶)、交联剂(例如，补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、特沙弗林(Texaphyrin)、沙弗林(Sapphyrin))、多环式芳香族烃(例如，吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶(例如，EDTA)、亲油性载体(例如，胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、牻牛儿醇基己基(geranyloxyhexyl)、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆酸、二甲氧基三苯甲基或者吩噁嗪)和肽复合体(例如，黑腹果蝇触足肽、Tat肽)、烷基化剂、磷酸、氨基、巯基、PEG(例如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、取代烷基、放射线标记物、酶、半抗原(例如，生物素)、输送/吸收促进剂(例如，阿司匹林、维生素E、叶酸)、和合成核糖核酸酶(例如，咪唑、二咪唑、组胺、咪唑簇、吖啶-咪唑复合体、四氮杂大环的Eu3+复合体)等。
本发明的ssNc分子中，前述5’端可以用例如磷酸基团或磷酸基团类似物修饰。前述磷酸基团的实例包括：
5’单磷酸((HO)2(O)P-O-5’)；
5’二磷酸((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；
5’三磷酸((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；
5’-鸟苷帽(7-甲基化或非甲基化，7m-G-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；
5’-腺苷帽(Appp)；
任意的修饰或非修饰核苷酸帽结构(N-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；
5’-单硫代磷酸(硫代磷酸酯：(HO)2(S)P-O-5’)；
5’-单二硫代磷酸(monodithiophosphate)(二硫代磷酸酯：(HO)(HS)(S)P-O-5’)；
5’-硫醇化磷酸(phosphorothiolate)((HO)2(O)P-S-5’)；
硫取代的单磷酸；二磷酸和三磷酸(例如，5’-α-硫代三磷酸、5’-γ-硫代三磷酸等)；
5’-磷酰胺酯((HO)2(O)P-NH-5’、(HO)(NH2)(O)P-O-5’)；
5’-烷基膦酸(例如，RP(OH)(O)-O-5’、(OH)2(O)P-5’-CH2、R为烷基(例如，甲基、乙基、异丙基或丙基等))；和
5’-烷基醚膦酸(例如，RP(OH)(O)-O-5’、R为烷基醚(例如，甲氧基甲基或乙氧基甲基等))。
前述核苷酸残基中，前述碱基没有特别限制。前述碱基例如可为天然的碱基，也可为非天然的碱基。前述碱基例如可为天然来源的碱基，也可为合成碱基。作为前述碱基，例如可使用一般的碱基和其修饰类似物等。
前述碱基的实例包括：嘌呤碱基如腺嘌呤和鸟嘌呤；嘧啶碱基如胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶。前述碱基的其它实例包括肌苷、胸腺嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、水粉蕈素(nubularine)、异鸟嘌呤核苷(isoguanisine)和杀结核菌素(tubercidine)。前述碱基的实例还包括2-氨基腺嘌呤、6-甲基化嘌呤等烷基衍生物；2-丙基化嘌呤等烷基衍生物；5-卤代尿嘧啶和5-卤代胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶；6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶和6-偶氮胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、5-卤代尿嘧啶、5-(2-氨基丙基)尿嘧啶、5-氨基烯丙基尿嘧啶；8-卤化、氨基化、硫醇化、硫代烷基化、羟基化和其他的8-取代嘌呤；5-三氟甲基化和其他的5-取代嘧啶；7-甲基鸟嘌呤；5-取代嘧啶；6-氮杂嘧啶；N-2、N-6和O-6取代嘌呤(包含2-氨基丙基腺嘌呤)；5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶；二氢尿嘧啶；3-去氮-5-氮杂胞嘧啶；2-氨基嘌呤；5-烷基尿嘧啶；7-烷基鸟嘌呤；5-烷基胞嘧啶；7-去氮腺嘌呤；N6,N6-二甲基腺嘌呤；2,6-二氨基嘌呤；5-氨基-烯丙基-尿嘧啶；N3-甲基尿嘧啶；取代1,2,4-三唑；2-吡啶酮；5-硝基吲哚；3-硝基吡咯；5-甲氧基尿嘧啶；尿嘧啶-5-氧基乙酸；5-甲氧基羰基甲基尿嘧啶；5-甲基-2-硫尿嘧啶；5-甲氧基羰基甲基-2-硫尿嘧啶；5-甲氨基甲基-2-硫尿嘧啶；3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿嘧啶；3-甲基胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；N4-乙酰基胞嘧啶；2-硫胞嘧啶；N6-甲基腺嘌呤；N6-异戊基腺嘌呤；2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤；N-甲基鸟嘌呤；O-烷基化碱基。嘌呤和嘧啶的实例包括美国专利第3,687,808号、“Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering”、858至859页、Kroschwitz J.I.编、John Wiley&Sons、1990；和Englisch等,Angewandte Chemie,International Edition,1991,30卷,613页所公开的那些物质。
前述修饰核苷酸残基的其它实例包括不含有碱基的那些核苷酸残基，即具有无碱基的核糖磷酸骨架的那些核苷酸残基。另外，作为前述修饰核苷酸残基，可使用例如美国临时申请第60/465,665号(申请日：2003年4月25日)和国际申请第PCT/US04/07070号(申请日：2004年3月8日)中记载的那些核苷酸残基，本发明能够援引这些文献。
3.非核苷酸残基
前述非核苷酸残基没有特别限制。本发明的ssNc分子，例如作为前述非核苷酸残基，可具有包含氨基酸残基或肽残基的非核苷酸结构。构成前述氨基酸残基或肽残基的氨基酸的实例包括碱性氨基酸和酸性氨基酸等。前述碱性氨基酸的实例包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸等。前述酸性氨基酸的实例包括天冬氨酸和谷氨酸等。前述非核苷酸残基优选存在于例如前述连接子区域(Lx)和前述连接子区域(Ly)的至少之一。前述非核苷酸残基可存在于例如前述连接子区域(Lx)或前述连接子区域(Ly)或两个前述连接子区域。前述连接子区域(Lx)和前述连接子区域(Ly)可例如相同或不同。
在本发明的单链核酸分子中，用前述生物相关物质修饰5’末端、3’末端、前述连接子区域(Lx)和前述连接子区域(Ly)的方法不特别限定。
作为本发明方法的第一实施方案，例如，例如在下列流程1中示出前述核酸分子的5’末端的修饰方法的实例。
作为修饰方法的第二实施方案，下面示出例如具有氨基酸残基或肽残基的连接子区域的修饰方法的实例。
首先，亚酰胺(amidite)通过下列流程2的合成方法合成。下列流程2为实例，本方法不限于此。例如，下列流程2中将Fmoc用作Lys侧链的氨基的保护基团。然而，例如，Tfa可用于后述实施例中的流程6，或者也可使用其它保护基团。
然后，使用具有前述结合连接子的前述亚酰胺，并通过下列流程3的方法，合成核酸分子，并将前述生物相关物质连接至前述核酸分子中的前述结合连接子。
当引入硫醇连接子作为前述结合连接子时，前述核酸分子通过下列流程4的合成方法合成。
然后，如下列流程5所示，前述生物相关物质经S-Sbr键连接至前述核酸分子中的前述硫醇连接子。
这些方法为范例，且本发明决不受这些实施方案的限制。例如，前述流程2和3示出当前述氨基酸为赖氨酸残基时合成方法的一个实施方案。甚至当前述氨基酸残基或前述肽残基具有源自其它氨基酸的结构时，也可以相同的方式合成。
4.组合物
如上所述，根据本发明的表达抑制用组合物为抑制靶基因的表达的组合物，所述组合物包含前述本发明的ssNc分子。本发明组合物的特征在于其包含前述本发明的ssNc分子，且决不限制其它构造。本发明的表达抑制用组合物也可称为例如表达抑制用试剂。
根据本发明，例如，通过向其中存在前述靶基因的对象投与时，可抑制前述靶基因的表达。
此外，如上所述，根据本发明的药学组合物包含前述本发明的ssNc分子。本发明组合物的特征在于其包含前述本发明的ssNc分子，且决不限制其它构造。本发明的药学组合物还可称为例如医药品。
根据本发明，例如，向患有由基因引起的疾病的患者投与可抑制前述基因的表达，从而治疗前述疾病。本发明中，术语“治疗”如上所述包括例如前述疾病的预防；疾病的改善；和预后的改善，并且其可意指它们中的任一种。
本发明中，要治疗的疾病不特别限定，且其实例包括由基因表达引起的疾病。根据前述疾病的种类，引起疾病的基因可设定为前述靶基因，另外，根据前述靶基因，前述表达抑制序列可适当设定。
具体实例如下。通过设定前述TGF-β1基因为前述靶基因并将前述基因的表达抑制序列并入前述ssNc分子中，ssNc分子可用于治疗例如炎性疾病、具体为急性肺损伤等。
使用根据本发明的表达抑制用组合物和药学组合物的方法(下文中，两种组合物简称为“组合物”)不特别限定，且其实例包括将前述ssNc分子投与至具有前述靶基因的对象。
投与本发明ssNc分子的前述对象的实例包括细胞、组织和器官。前述对象的实例包括人，非人动物如非人哺乳动物，即除人以外的哺乳动物。前述投与可例如在体内或体外进行。前述细胞不特别限定，且其实例包括：各种培养细胞如HeLa细胞、293细胞、NIH3T3细胞和COS细胞；干细胞如ES细胞和造血干细胞；和从生物体分离的细胞如原代培养细胞。
前述投与方法不特别限定，其例如根据对象适当确定。当前述对象为培养细胞时，投与方法可为例如使用转染试剂或电穿孔等的方法。
例如，本发明各组合物可仅包含本发明的ssNc分子或另外可包含除ssNc分子以外的添加剂。前述添加剂不特别限定，且优选例如药学可接受添加剂。前述添加剂的种类不特别限定，且可根据例如对象种类而适当选择。
5.表达抑制方法
根据本发明的表达抑制方法如上所述为抑制靶基因的表达的方法，其中使用前述本发明的ssNc分子。本发明表达抑制方法的特征在于前述本发明的ssNc分子用于其中，且决不限制其它步骤和条件。
在本发明的表达抑制方法中，前述基因表达受到抑制的机理不特别限定，其实例包括通过RNA干扰或RNA干扰样现象的表达抑制。本发明的表达抑制方法为例如诱导RNA干扰抑制前述靶基因表达的方法，且其还可指特征在于前述本发明的ssNc分子用于其中的表达诱导方法。
本发明的表达抑制方法包括例如将前述ssNc分子投与至其中存在前述靶基因的对象的步骤。通过前述投与步骤，例如使前述ssNc分子与投与ssNc分子的前述对象相接触。投与本发明的ssNc分子的前述对象的实例包括细胞、组织和器官。前述对象的实例还包括人，非人动物如非人哺乳动物，即除人以外的哺乳动物。前述投与可例如在体内或体外进行。
在本发明的表达抑制方法中，例如，前述ssNc分子可单独投与，或者可投与包含前述ssNc分子的本发明前述组合物。前述投与方法不特别限定，且例如可根据对象的种类而适当选择。
6.治疗方法
如上所述，根据本发明的疾病的治疗方法包括将前述本发明的ssNc分子投与至患者的步骤，且前述ssNc分子包括作为前述表达抑制序列的抑制引起前述疾病表达的序列。本发明治疗方法的特征在于前述本发明的ssNc分子用于其中，且决不限制其它步骤和条件。
关于根据本发明的前述表达抑制方法的描述还适用于例如本发明的治疗方法等。前述投与方法不特别限定且可为例如口服和肠胃外投与的任一种。
7.ssNc分子的用途
根据本发明的用途为前述本发明的ssNc分子用于前述靶基因的表达抑制的用途。而且，根据本发明的用途为前述本发明的ssNc分子用于诱导RNA干扰的用途。
根据本发明的核酸分子为用于疾病治疗的核酸分子。前述核酸分子为前述本发明的ssNc分子，且前述ssNc分子包括抑制引起前述疾病的基因表达的序列作为前述表达抑制序列。
实施例
现说明本发明的实施例。然而，本发明不限于下列实施例。
(Lys亚酰胺的合成)
根据下列流程6，合成DMTr-Lys亚酰胺(7)，其为赖氨酸(Lys)亚酰胺。在下列流程6中，“Tfa”为三氟乙酰基。
(1)化合物2的合成
向6-羟基己酸(6g,15.1mmol)在吡啶中的溶液(124mL)添加4,4’-二甲氧基三苯甲基氯(20g,1.3当量)和二甲氨基吡啶(0.5g,0.1当量)，并将混合物室温搅拌20小时。反应完成后，添加甲醇(10mL)，搅拌混合物10分钟，并蒸发溶剂。反应液体用乙酸乙酯稀释，用TEAA缓冲液(pH 8-9)洗涤三次，并用饱和盐水洗涤一次。有机层经硫酸钠干燥，并减压下蒸发溶剂，从而给出为浅黄色油状物质的化合物2(31g，含吡啶)。
(2)化合物4的合成
向化合物3(2.7g,7.9mmol)、二环己基碳二亚胺(1.9g,1.2当量)和1-羟基苯并三唑一水合物(2.6g,2.4当量)在乙腈中的溶液(45mL)添加4-氨基-1-丁醇(0.86g,1.2当量)在乙腈中的溶液(5mL)，并将混合物室温搅拌16小时。反应完成后，通过过滤收集沉淀，并通过蒸发器蒸发滤液中的溶剂。二氯甲烷加入所得残余物中，并将混合物用醋酸盐缓冲液(pH4)洗涤三次并用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤三次。有机层经硫酸钠干燥，并减压下蒸发溶剂。将所得粗产物通过硅胶柱层析(洗脱液：二氯甲烷/甲醇＝10/1)纯化，从而给出为白色固体的化合物4(2.8g，产量85％)。以下示出化合物4的仪器分析值。
化合物4：
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.07(br,1H),6.72(t,J＝5.6Hz,1H),4.03(m,1H),3.66(d,J＝4.9Hz,2H),3.37(dd,J＝12.9,6.3Hz,2H),3.29(dd,J＝12.4,6.3Hz,2H),1.83(s,2H),1.66-1.60(m,6H),1.44(s,9H),1.41-1.37(m,2H)
(3)化合物5的合成
化合物4(2.5g,6.1mmol)在盐酸/四氢呋喃溶液(4M,45mL)中室温搅拌2小时。反应完成后，减压下蒸发溶剂。所得残留物溶解在乙醇中，并与甲苯共沸。蒸发溶剂，从而给出为白色固体的化合物5(1.9g)。以下示出化合物5的仪器分析值。
化合物5：
1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ:3.85-3.81(m,1H),3.59-3.56(m,2H),3.32-3.20(m,2H),1.94-1.80(m,2H),1.66-1.58(m,6H),1.46-1.40(m,2H)
(4)化合物6的合成
向化合物2(含吡啶，24g,35.5mmol)、二环己基碳二亚胺(8.8g,1.2当量)和1-羟基苯并三唑一水合物(7.2g,1.5当量)的溶液(150mL)添加三乙胺(4.5mL,0.9当量)，并进一步添加化合物5(10g,0.9当量)在N,N-二甲基甲酰胺中的溶液(30mL)，并将混合物室温搅拌20小时。反应完成后，通过过滤收集沉淀，并通过蒸发器蒸发滤液中的溶剂。将二氯甲烷添加至所得残留物，并用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤混合物。有机层经硫酸钠干燥，并减压下蒸发溶剂。所得粗产物通过硅胶柱层析(洗脱液：二氯甲烷/甲醇＝20/1+0.05％吡啶)纯化，从而给出为浅黄色固体的化合物6(16g，产量70％)。以下示出化合物6的仪器分析值。
化合物6：
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.43-7.40(m,2H),7.32-7.26(m,6H),7.21-7.17(m,1H),6.81(d,J＝8.8Hz,4H),4.39-4.37(m,1H),3.78(s,6H),3.64-3.61(m,2H),3.33-3.22(m,4H),3.03(t,J＝6.6Hz,2H),2.19(t,J＝7.6Hz,2H),1.79-1.54(m,12H),1.40-1.34(m,4H)
(5)化合物7的合成
向通过乙腈共沸干燥的起始物质(1.26g,1.73mmol)在无水乙腈中的溶液(3.5mL)添加四唑二异丙基铵(diisopropylammonium tetrazolide)(394mg,1.3当量)和2-氰基乙氧基-N,N,N’,N’-四异丙基磷二亚酰胺(700mg,1.3当量)，并将混合物室温搅拌2.5小时。添加二氯甲烷，将混合物用饱和碳酸氢钠和饱和盐水洗涤并经硫酸钠干燥，并蒸发溶剂。将所得粗产物通过硅胶柱层析(氨基二氧化硅(amino silica)，洗脱液：正己烷/乙酸乙酯＝2/3)纯化，从而给出为白色固体的化合物7(1.3g，产量78％)。以下示出化合物7的仪器分析值。
化合物7：
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.43-7.41(m,2H),7.32-7.17(m,7H),6.81(dt,J＝9.3,2.9Hz,4H),4.42-4.37(m,1H),3.78(s,6H),3.88-3.54(m,6H),3.32-3.20(m,4H),3.03(t,J＝6.3Hz,2H),2.19(t,J＝7.6Hz,2H),1.83-1.53(m,12H),1.42-1.31(m,4H),1.28-1.24(m,2H),1.18-1.16(m,12H)
31P-NMR(162MHz,CDCl3)δ:146.9
(Gly亚酰胺的合成)
根据下列流程7，合成为甘氨酸(Gly)亚酰胺的DMTr-Gly亚酰胺(化合物12)。
(1)N-(4-羟丁基)-Nα-Fmoc-甘氨酰胺(化合物8)
向Fmoc-甘氨酸(4.00g,13.45mmol)、二环己基碳二亚胺(3.33g,16.15mmol)和1-羟基苯并三唑一水合物(4.94g,32.29mmol)在无水N,N-二甲基甲酰胺中的溶液(100mL)添加4-氨基丁醇(1.44g,16.15mmol)在无水N,N-二甲基甲酰胺中的溶液(30mL)，并将混合物在氩气气氛下室温搅拌过夜。所得沉淀通过过滤分离，并减压浓缩滤液。将二氯甲烷(200mL)添加至所得残留物，并将混合物用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤三次，并进一步用饱和盐水洗涤。经硫酸钠干燥后，减压下蒸发溶剂。所得残留物进行硅胶柱层析(洗脱液：二氯甲烷-甲醇(95:5)，从而给出N-(4-羟丁基)-Nα-Fmoc-甘氨酰胺(8)(4.30g,87％)。以下示出N-(4-羟丁基)-Nα-Fmoc-甘氨酰胺(8)的仪器分析值；
N-(4-羟丁基)-Nα-Fmoc-甘氨酰胺(8)：
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ＝7.78-7.76(2H,d,J＝7.3Hz),7.65-7.63(2H,d,J＝7.3Hz),7.42-7.41(2H,t,J＝7.6Hz),7.34-7.30(2H,td,J＝7.6,1.1Hz),4.42-4.40(2H,d,J＝7.3Hz),4.25-4.22(1H,t,J＝6.8Hz),3.83(2H,s),3.60-3.55(2H,m),3.30-3.25(2H,m),1.61-1.55(4H,m).
(2)N-(4-O-DMTr-羟丁基)-Nα-Fmoc-甘氨酰胺(化合物9)
将化合物8(4.20g,11.40mmol)用无水吡啶共沸干燥三次。4,4’-二甲氧基三苯甲基氯(5.80g,17.10mmol)和无水吡啶(80mL)通过共沸添加至残留物，并将混合物室温搅拌过夜。甲醇(20mL)添加至所得反应混合物并将混合物室温搅拌30分钟，并减压下蒸发溶剂。之后，添加二氯甲烷(200mL)，并将混合物用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤三次，并进一步用饱和盐水洗涤。经硫酸钠干燥后，减压下蒸发溶剂，从而给出未纯化的N-(4-O-DMTr-羟丁基)-Nα-Fmoc-甘氨酰胺(9)(11.40g)。
(3)N-(4-O-DMTr-羟丁基)-甘氨酰胺(化合物10)
室温下向未纯化的化合物9(11.40g,16.99mmol)添加N,N-二甲基甲酰胺(45mL)和哌啶(11.7mL)，并将混合物室温干燥过夜。减压下蒸发反应混合物中的溶剂，并将所得残留物进行硅胶柱层析(洗脱液：二氯甲烷-甲醇(9:1)+0.05％吡啶)，从而给出甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基丁酰胺(glycine-4,4’-dimethoxytrityloxybutanamide)(3)(4.90g,96％,2步)。以下示出N-(4-O-DMTr-羟丁基)-甘氨酰胺(10)的仪器分析值。
N-(4-O-DMTr-羟丁基)-甘氨酰胺(10)：
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ＝7.44-7.42(2H,m),7.33-7.26(6H,m),7.21-7.20(1H,m),6.83-6.80(4H,m),3.79(6H,s),3.49(2H,s),3.30-3.28(2H,t,J＝6.3Hz),3.09-3.06(2H,t,J＝5.9Hz),1.61-1.55(4H,m).
(4)N-(4-O-DMTr-羟丁基)-Nα-(6-羟基己酰基)-甘氨酰胺(化合物11)
将化合物10(4.80g,10.70mmol)与无水吡啶共沸干燥三次，氩气气氛下室温添加6-羟基己酸(1.70g,12.84mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(2.46g,12.84mmol)、1-羟基苯并三唑一水合物(3.93g,25.69mmol)和无水二氯甲烷(60mL)，并将混合物搅拌10分钟。三乙胺(3.90g,38.53mmol)添加至由此获得的混合物，并在氩气气氛下将混合物室温搅拌过夜。二氯甲烷(200mL)添加至所得反应混合物，并将混合物用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤三次，并进一步用饱和盐水洗涤一次。有机层分离并经硫酸钠干燥，并减压下蒸发溶剂。将所得残留物进行硅胶柱层析(洗脱液：二氯甲烷-甲醇(95:5)+0.05％吡啶)，从而给出N-(4-O-DMTr-羟丁基)-Nα-(6-羟基己酰基)-甘氨酰胺(11)(4.80g,80％)。以下示出N-(4-O-DMTr-羟丁基)-Nα-(6-羟基己酰基)-甘氨酰胺(11)的仪器分析值。
N-(4-O-DMTr-羟丁基)-Nα-(6-羟基己酰基)-甘氨酰胺(11)：
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ＝7.43-7.40(2H,m),7.33-7.26(6H,m),7.22-7.20(1H,m),6.83-6.80(4H,m),3.85(2H,s),3.78(6H,s),3.63-3.60(2H,t,J＝6.3Hz),3.26-3.23(2H,t,J＝6.1Hz),3.07-3.05(2H,t,J＝5.6Hz),2.26-2.22(2H,t,J＝7.3Hz),1.68-1.52(8H,m),1.41-1.36(2H,m).
(5)N-(4-O-DMTr-羟丁基)-Nα-(6-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基亚磷酰基(phosphityl))-羟基己酰基)-甘氨酰胺(化合物12)
化合物11(4.70g,8.35mmol)用无水吡啶共沸干燥三次。然后，添加四唑二异丙基铵(1.72g,10.02mmol)，将混合物减压下脱气(deaerated)并用氩气填充，并添加无水乙腈(5mL)。此外，添加2-氰基乙氧基-N,N,N’,N’-四异丙基磷二亚酰胺(3.02g,10.02mmol)在1:1的无水乙腈-二氯甲烷混合物中的溶液(4mL)，并在氩气气氛下将混合物室温搅拌4小时。二氯甲烷(150mL)添加至所得反应混合物中，并将混合物用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，并进一步用饱和盐水洗涤一次。有机层分离并经硫酸钠干燥，并减压下蒸发溶剂。将所得残留物进行使用氨基二氧化硅的柱层析(洗脱液：正己烷-丙酮(3:2)+0.1％三乙胺)，从而给出羟基己酸酰胺甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基丁酰胺亚磷酰胺(phosphoramidite)(12)(4.50g,71％,HPLC 98.2％)。以下示出N-(4-O-DMTr-羟丁基)-Nα-(6-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基亚磷酰基)-羟基己酰基)-甘氨酰胺(12)的仪器分析值。
N-(4-O-DMTr-羟丁基)-Nα-(6-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基亚磷酰基)-羟基己酰基)-甘氨酰胺(12)：
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ＝7.43-7.40(2H,m),7.33-7.26(6H,m),7.22-7.20(1H,m),6.83-6.80(4H,m),3.85-3.81(4H,s),3.78(6H,s),3.63-3.61(2H,t,J＝6.3Hz),3.26-3.23(2H,t,J＝6.1Hz),3.05-2.97(4H,m),2.64-2.62(2H,t,J＝6.4Hz),2.25-2.23(2H,t,J＝7.3Hz),1.68-1.52(8H,m),1.40-1.38(2H,m),1.13-1.20(12H,m).
31P-NMR(162MHz,CDCl3):δ＝146.57.
(脯氨酸亚酰胺的合成)
根据下列流程8，合成为包含脯氨酸骨架的亚酰胺的化合物17。
(1)N-(4-羟丁基)-Nα-Fmoc-L-脯氨酰胺(化合物14)
化合物13(Fmoc-L-脯氨酸)用作起始原料。将前述化合物13(10.00g,29.64mmol)、4-氨基-1-丁醇(3.18g,35.56mmol)和1-羟基苯并三唑(10.90g,70.72mmol)混合在一起。前述混合物减压下脱气并用氩气填充。室温将无水乙腈(140mL)添加至前述混合物，并进一步向其中添加二环己基碳二亚胺(7.34g,35.56mmol)在无水乙腈中的溶液(70mL)。之后，将其在氩气气氛下室温搅拌15小时。反应完成后，将产生的沉淀物通过过滤除去，并减压下蒸发收集滤液中的溶剂。将二氯甲烷(200mL)添加至所得残留物，并将混合物用饱和碳酸氢钠水溶液(200mL)洗涤。然后，将有机层回收并经硫酸镁干燥。之后，前述有机层过滤，并减压下蒸发所得滤液中的溶剂。二乙醚(200mL)添加至残留物，从而将残留物转化为粉末。将由此获得的粉末通过过滤收集。因此，获得无色粉末状的化合物14(10.34g，产量84％)。以下示出前述化合物14的仪器分析值。
化合物14：
1H-NMR(CDCl3):δ7.76-7.83(m,2H,Ar-H),7.50-7.63(m,2H,Ar-H),7.38-7.43(m,2H,Ar-H),7.28-7.33(m,2H,Ar-H),4.40-4.46(m,1H,CH),4.15-4.31(m,2H,CH2),3.67-3.73(m,2H,CH2),3.35-3.52(m,2H,CH2),3.18-3.30(m,2H,CH2),2.20-2.50(m,4H),1.81-2.03(m,3H),1.47-1.54(m,2H)；
Ms(FAB+):m/z409(M+H+).
(2)N-(4-O-DMTr-羟丁基)-L-脯氨酰胺(化合物15)
Fmoc-羟基酰胺-L-脯氨酸(化合物14)(7.80g,19.09mmol)与无水吡啶(5mL)混合，并将混合物通过共沸蒸馏室温干燥。向所得残留物添加4,4’-二甲氧基三苯甲基氯(8.20g,24.20mmol)、DMAP(23mg,0.19mmol)和无水吡啶(39mL)。将混合物室温搅拌1小时，添加甲醇(7.8mL)，并将混合物室温搅拌30分钟。混合物用二氯甲烷(100ml)稀释，用饱和碳酸氢钠水溶液(150ml)洗涤，并将有机层分离。前述有机层经硫酸钠干燥并过滤。减压下蒸发所得滤液中的溶剂。向所得未纯化的残留物添加无水二甲基甲酰胺(39mL)和哌啶(18.7mL,189mmol)，将混合物室温搅拌1小时。反应完成后，室温减压下蒸发前述混合物中的溶剂。将所得残留物进行硅胶柱层析(商品名Wakogel C-300，洗脱剂：CH2Cl2:CH3OH＝9:1,含0.05％吡啶)，从而给出为浅黄色油状的化合物15(9.11g，产量98％)。以下示出前述化合物15的仪器分析值。
化合物15：
1H-NMR(CDCl3):δ7.39-7.43(m,2H,Ar-H),7.30(d,J＝8.8Hz,4H,Ar-H),7,21(tt,1H,4.9,1.3Hz,Ar-H),6.81(d,J＝8.8Hz,4H,Ar-H),3.78(s,6H,OCH3),3.71(dd,H,J＝6.3Hz,5.4Hz,CH),3.21(2H,12.9,6.3Hz,2H,CH2),3.05(t,J＝6.3Hz,2H,CH2),2.85-2.91(m,2H,CH2),2.08-2.17(m,1H,CH),1.85-2.00(m,3H),1.55-1.65(m,5H)；
Ms(FAB+)；m/z 489(M+H+),303(DMTr+).
(3)N-(4-O-DMTr-羟丁基)-Nα-(6-羟基己酰基)-L-脯氨酰胺(化合物16)
混合所得DMTr-酰胺-L-脯氨酸(化合物15)(6.01g,12.28mmol)、EDC(2.83g,14.74mmol)、1-羟基苯并三唑(3.98g,29.47mmol)和三乙胺(4.47g,44.21mmol)在无水二氯甲烷中的溶液(120ml)。氩气气氛下室温向该混合物进一步添加6-羟基己酸(1.95g,14.47mmol)，之后将混合物氩气气氛下室温搅拌1小时。前述混合物用二氯甲烷(600ml)稀释，并用饱和盐水(800ml)洗涤3次。有机层回收，经硫酸钠干燥，并过滤。减压下蒸发所得滤液中的溶剂，从而获得浅黄色泡状的前述化合物16(6.29g，产量85％)。以下示出前述化合物16的仪器分析值。
化合物16：
1H-NMR(CDCl3):δ7.41-7.43(m,2H,Ar-H),7.27-7.31(m,4H,Ar-H),7.19-7.26(m,2H,Ar-H),7.17-7.21(m,1H,Ar-H),6.79-6.82(m,4H,Ar-H),4.51-4.53(m,1H,CH),3.79(s,6H,OCH3),3.61(t,2H,J＝6.4Hz,CH2),3.50-3.55(m,1H,CH),3.36-3.43(m,1H,CH),3.15-3.24(m,2H,CH2),3.04(t,J＝6.3Hz,2H,CH2),2.38-2.45(m,1H,CH),2.31(t,6.8Hz,2H,CH2),2.05-2.20(m,1H,CH),1.92-2.00(m,1H,CH),1.75-1.83(m,1H,CH),1.48-1.71(m,8H),1.35-1.44(m,2H,CH2)；
Ms(FAB+):m/z 602(M+),303(DMTr+).
(4)N-(4-O-DMTr-羟丁基)-Nα-(6-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基亚磷酰基)-羟基己酰基)-L-脯氨酰胺(化合物17)
所得前述DMTr-羟基二酰胺-L-脯氨酸(化合物16)(8.55g,14.18mmol)与无水乙腈混合，并将混合物通过共沸蒸馏三次室温干燥。向所得残留物添加四唑二异丙基铵(2.91g,17.02mmol)，并将混合物减压下脱气并用氩气填充。向前述混合物添加无水乙腈(10ml)，进一步地添加2-氰基乙氧基-N,N,N’,N’-四异丙基磷二亚酰胺(5.13g,17.02mmol)在无水乙腈中的溶液(7mL)。氩气气氛下将混合物室温搅拌2小时，然后用二氯甲烷稀释，用饱和碳酸氢钠水溶液(200ml)洗涤3次，并用饱和盐水(200ml)洗涤。有机层回收，经硫酸钠干燥，并过滤。减压下蒸发所得前述滤液中的溶剂。所得残留物进行使用氨基硅胶(amino silicagel)作为填充物的柱层析(洗脱剂：己烷:乙酸乙酯＝1:3,含0.05％吡啶)，从而给出为无色浆液状的化合物17(10.25g，纯度92％，产量83％)。以下示出前述化合物17的仪器分析值。
化合物17：
1H-NMR(CDCl3):δ7.40-7.42(m,2H,Ar-H),7.29-7.31(m,4H,Ar-H),7.25-7.27(m,2H,Ar-H),7.17-7.21(m,1H,Ar-H),6.80-6.82(m,4H,Ar-H),4.51-4.53(m,1H,CH),3.75-3.93(m,4H),3.79(s,6H,OCH3),3.45-3.60(m,4H),3.35-3.45(m,1H,CH),3.20-3.29(m,1H),3.04(t,J＝6.4Hz,2H,CH2),2.62(t,J＝5.8Hz,2H,CH2),2.40-2.44(m,1H,CH),2.31(t,7.8Hz,2H,CH2),2.03-2.19(m,1H,CH),1.92-2.02(m,1H,CH),1.70-1.83(m,1H,CH),1.51-1.71(m,8H),1.35-1.44(m,2H,CH2),1.18(d,J＝6.8Hz,6H,CH3),1.16(d,J＝6.8Hz,6H,CH3)；
31P-NMR(CDCl3):δ147.17；
Ms(FAB+):m/z 802(M+),303(DMTr+),201(C8H19N2OP+).
(脂肪酸活性酯体(fatty acid active ester form)的合成)
根据下列流程9，各自合成肉豆蔻酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(C14-NHS)、棕榈酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(C16-NHS)或硬脂酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(C18-NHS)。另外，根据下列流程10，合成油酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(C18:1-NHS)。
肉豆蔻酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(C14-NHS)的合成
将肉豆蔻酸(1.5g,6.6mmol)溶解在二氯甲烷(30ml)中并搅拌混合物。向此溶液添加N-羟基琥珀酰亚胺(0.91g,1.2当量)和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)(1.5g,1.2当量)，并搅拌混合物过夜。用水洗涤两次后，将混合物用饱和盐水洗涤一次，经硫酸钠干燥，并减压下蒸发溶剂。所得残留物通过硅胶柱层析(乙酸乙酯/己烷＝1/3)纯化，从而给出目标产物(1.4g，产量67％)。以下示出所得肉豆蔻酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(C14-NHS)的NMR测量结果。
肉豆蔻酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(C14-NHS)：
1H-NMR(CDCl3)δ:2.83(4H,s),2.60(2H,t,J＝7.6Hz),1.74(2H,q,J＝7.6Hz),1.44(2H,q,J＝6.9Hz),1.48-1.22(18H,m),0.88(3H,t,J＝6.8Hz).
棕榈酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(C16-NHS)的合成：
将棕榈酸(6.0g,23mmol)溶解在二氯甲烷(110ml)中并搅拌混合物。向此溶液添加N-羟基琥珀酰亚胺(3.2g,1.2当量)和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)(5.4g,1.2当量)，并搅拌混合物过夜。用水洗涤两次后，将混合物用饱和盐水洗涤一次，经硫酸钠干燥，并减压下蒸发溶剂。所得残留物通过硅胶柱层析(乙酸乙酯/己烷＝1/2)纯化，从而给出目标产物(7.8g，产量94％)。以下示出所得棕榈酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(C16-NHS)的NMR测量结果。
棕榈酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(C16-NHS)：
1H-NMR(CDCl3)δ:2.84(4H,s),2.60(2H,t,J＝7.6Hz),1.74(2H,q,J＝7.6Hz),1.38(2H,q,J＝6.9Hz),1.43-1.20(m,22H),0.88(3H,t,J＝6.8Hz).
硬脂酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(C18-NHS)的合成
将硬脂酸(3.0g,11mmol)溶解在二氯甲烷(100ml)中并搅拌混合物。向此溶液添加N-羟基琥珀酰亚胺(1.5g,1.2当量)和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)(2.4g,1.2当量)，并搅拌混合物2天。用水洗涤两次后，将混合物用饱和盐水洗涤一次，经硫酸钠干燥，并减压下蒸发溶剂。所得残留物通过硅胶柱层析(乙酸乙酯/己烷＝1/3)纯化，从而给出目标产物(2.8g，产量70％)。以下示出所得硬脂酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(C18-NHS)的NMR测量结果。
硬脂酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(C18-NHS)：
1H-NMR(CDCl3)δ:2.84(4H,m),2.60(2H,t,J＝7.6Hz),1.74(2H,q,J＝7.6Hz),1.38(2H,q,J＝6.9Hz),1.43-1.20(m,26H),0.88(3H,t,J＝6.8Hz).
油酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(C18:1-NHS)的合成
将油酸(4.0g,14mmol)溶解在二氯甲烷(70ml)中并搅拌混合物。向此溶液添加N-羟基琥珀酰亚胺(2.0g,1.2当量)和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)(3.3g,1.2当量)，并搅拌混合物过夜。用水洗涤两次后，将混合物用饱和盐水洗涤一次，经硫酸钠干燥，并减压下蒸发溶剂。所得残留物通过硅胶柱层析(乙酸乙酯/己烷＝1/3)纯化，从而给出目标产物(5.2g，产量97％)。以下示出所得油酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(C18:1-NHS)的NMR测量结果。
油酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(C18:1-NHS)：
1H-NMR(CDCl3)δ:5.35(2H,m),2.83(4H,s),2.60(2H,t,J＝7.6Hz),2.01(4H,m),1.75(2H,q,J＝7.6Hz),1.41-1.27(20H,m),0.88(3H,t,J＝6.8Hz).
(实施例A1：5’末端脂质缀合的(conjugated)核酸的合成)
合成其中脂质结合至5’末端的5’末端脂质缀合的核酸(称为“5’末端脂质缀合物(lipid conjugate)”，“5’末端脂质修饰核酸”，或简称“脂质修饰核酸”)。以下示意性示出合成的5’末端脂质缀合的核酸的结构。在下列5’末端脂质缀合的核酸中，“阴性对照”具有与下述靶序列非互补的序列(由稳定表达萤火虫荧光素酶(pGL3 Luc)的乳腺癌细胞系MCF-7保持的萤火虫荧光素酶基因的序列)，并对应于参考例。“靶序列(target sequence)”为具有与前述靶序列互补的序列的核酸。“靶序列(target sequence)”中，siRNA型(siRNAtype)为其中脂质结合至双链核酸的5’末端之一的核酸，并对应于参考例。“靶序列(targetsequence)”中，nkRNA(注册商标)型和PnkRNA(商品名称)型为其中脂质结合至单链核酸的5’末端的核酸，并对应于实施例。
以下示出为前述5’末端脂质缀合的核酸中的siRNA型的NI-0089-C16和NI-0089-DPPE以及为其合成原料的NI-0089s-氨基的具体序列和结构，包括结合至5’末端的脂质的结构。
NI-0089-C16和NI-0089-DPPE的上侧序列由下列SEQ ID NO:1表示，下侧序列由下列SEQ ID NO:2表示。SEQ ID NO:1的5’末端的“B”表示生物相关物质(脂质)。NI-0089s-氨基的序列也由下列SEQ ID NO:1表示。
5’-B-CUUACGCUGAGUACUUCGATT-3’(SEQ ID NO:1)
5’-UCGAAGUACUCAGCGUAAGTT-3’(SEQ ID NO:2)
以下示出为前述5’末端脂质缀合的核酸中的nkRNA型的NK-0139-C16和NK-0139-DPPE以及为其合成原料的NK-0139-氨基的具体序列和结构，包括结合至5’末端的脂质的结构。
NK-0139-C16、NK-0139-DPPE和NK-0139-氨基的序列中，区域Xc的序列由下列SEQID NO:3表示，区域X的序列由下列SEQ ID NO:4表示，整个序列由下列SEQ ID NO:5表示。SEQ ID NO:5的5’末端的“B”表示生物相关物质(脂质)。
5’-ACUUACGCUGAGUACUUCGAUUCC-3’(SEQ ID NO:3)
5’-GGAAUCGAAGUACUCAGCGUAAGUUC-3’(SEQ ID NO:4)
以下示出为前述5’末端脂质缀合的核酸中的PnkRNA型的PK-0071-C16和PK-0071-DPPE以及为其合成原料的PK-0071-氨基的具体序列和结构，包括结合至5’末端的脂质的结构。
PK-0071-C16、PK-0071-DPPE和PK-0071-氨基的序列由下列SEQ ID NO:6表示。除了连接子区域Lx和Ly被代替核酸序列的脯氨酸残基Lp置换以外，下列SEQ ID NO:6的序列与SEQ ID NO:5的序列相同。另外，Lp的具体结构由下式表示。
5’-B-ACUUACGCUGAGUACUUCGAUUCC-Lp-GGAAUCGAAGUACUCAGCGUAAGUUC-Lp-G-3(SEQ ID NO:6)
以下示出前述5’末端脂质缀合的核酸中具有阴性对照序列的NI-0000的具体序列和结构。
NI-0000的上侧序列由下列SEQ ID NO:7表示，下侧序列由下列SEQ ID NO:8表示。
5’-UACUAUUCGACACGCGAAGTT-3’(SEQ ID NO:7)
5’-CUUCGCGUGUCGAAUAGUATT-3’(SEQ ID NO:8)
除了上侧序列被下列SEQ ID NO:9而不是下列SEQ ID NO:7置换以外，NI-0000-C16和NI-0000-DPPE的序列与NI-0000的序列相同。除了生物相关物质(脂质)B结合至5’侧以外，下列SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:7相同，并且B的结构与前述si型或nk型RNA的相同。为NI-0000-C16和NI-0000-DPPE的合成原料的NI-0000s-氨基的结构还由下列SEQ ID NO:9表示。在该情况中，前述B的结构由NH2-(CH2)6-O-PO(OH)-O-表示。
5’-B-UACUAUUCGACACGCGAAGTT-3’(SEQ ID NO:9)
前述RNA(5’末端脂质缀合的核酸)分别如下合成。
NI-0089s-氨基的合成
NI-0089s-氨基从3’侧向5’侧基于亚磷酰胺法通过核酸合成仪(商品名称ABIExpedite(注册商标)8909核酸合成系统，Applied Biosystems)合成。RNA亚酰胺(2’-O-TBDMSi，商品名称，ST Pharma)用作RNA亚磷酰胺用于前述合成(下文同)。另外，将5’-氨基-修饰剂C6-TFA亚酰胺用于将氨基引入5’末端(下文同)。前述亚酰胺根据常规方法去保护，并将合成的RNA通过HPLC纯化。在下列实施例中，除了特别说明，否则RNA合成(核酸序列的形成)以相同的方式进行。
<5’末端修饰>
NI-0089-C16的合成
混合NI-0089s-氨基(1.5mM,60μL)、10mM C16-NHS/DMF溶液(356μL)、5％二异丙基胺水溶液(5μL)和DMF(150μL)，并将混合物室温搅拌过夜。反应液在乙醇中沉淀，并将所得沉淀物溶解在注射用蒸馏水中，并通过HPLC(Develosil C8-UG-5,2.5mm,10×50mm,4.7mL/min,260nm,35℃,缓冲液A：50mM TEAA,5％CH3CN；缓冲液B：CH3CN；B浓度(B conc.)0-100％/20min)纯化，分级目标产物的峰。通过分级获得的级分在乙醇中沉淀，并将所得沉淀物溶解在注射用蒸馏水中。测量UV 260nm下的吸光度，并计算产量。通过该方式，得到NI-0089s-氨基-C16(NI-0089-C16的正义链，前述SEQ ID NO:1)(1.16mg，纯度97.64％)。质谱分析值为7024.17(计算值：7024.37)。将所得NI-0089s-氨基-C16和NI-0089的反义链混合，并使混合物进行退火操作，从而给出NI-0089-C16。
NI-0000-C16的合成
NI-0000s-氨基通过与NI-0089s-氨基的类似的核酸合成法合成，且除了使用NI-0000s-氨基代替NI-0089s-氨基以外，NI-0000-C16通过与NI-0089-C16的类似的方法合成。
NK-0139-C16的合成
NK-0139-氨基通过与NI-0089s-氨基的类似的核酸合成法合成。接着，混合NK-0139-氨基(687μM,50μL)、10mM C16-NHS/DMF溶液(172μL)、5％二异丙基胺水溶液(5μL)和DMF(75μL)，并将混合物室温搅拌过夜。反应液在乙醇中沉淀，并将所得沉淀物溶解在注射用蒸馏水中，并通过HPLC(Develosil C8-UG-5,2.5mm,10×50mm,4.7mL/min,260nm,35℃,缓冲液A：50mM TEAA,5％CH3CN；缓冲液B：CH3CN；B浓度(B conc.)0-100％/20min)纯化，分级目标产物的峰。通过分级获得的级分在乙醇中沉淀，并将所得沉淀物溶解在注射用蒸馏水中。测量UV 260nm下的吸光度，并计算产量。通过该方式，得到NK-0139-C16(1.33mg，纯度95.67％)。质谱分析值为20173.23(计算值：20173.11)。
PK-0071-氨基的合成
PK-0071-氨基通过与上述类似的亚酰胺法合成。具体而言，前述化合物17首先连接至鸟苷的5’侧以引入脯氨酸残基。接着，将由SEQ ID NO:4表示的前述RNA经前述脯氨酸残基连接至前述鸟苷的5’侧。此外，前述化合物17间接至5’侧以引入脯氨酸残基。此外，将由下列SEQ ID NO:10表示的RNA经前述脯氨酸残基连接至5’侧。下列SEQ ID NO:10除了B连接至5’末端以外与前述SEQ ID NO:3相同。在PK-0071-氨基的情况中，前述B的结构由NH2-(CH2)6-O-PO(OH)-O-表示。
5’-B-ACUUACGCUGAGUACUUCGAUUCC-3’(SEQ ID NO:10)
PK-0071-C16的合成
混合PK-0071-氨基(739μM,100μL)、10mM C16-NHS/DMF溶液(296μL)、5％二异丙基胺水溶液(3μL)和DMF(250μL)，并将混合物室温搅拌过夜。反应液在乙醇中沉淀，并将所得沉淀物溶解在注射用蒸馏水中，并通过HPLC(Develosil C8-UG-5,2.5mm,10×50mm,4.7mL/min,260nm,35℃,缓冲液A：50mM TEAA,5％CH3CN；缓冲液B：CH3CN；B浓度(B conc.)0-100％/20min)纯化，分级目标产物的峰。通过分级获得的级分在乙醇中沉淀，并将所得沉淀物溶解在注射用蒸馏水中。测量UV 260nm下的吸光度，并计算产量。通过该方式，得到PK-0071-C16(0.57mg，纯度94.59％)。质谱分析值为17450.88(计算值：17450.78)。
NI-0089-DPPE的合成
混合NI-0089s-氨基(1.5mM,60μL)、10mM DPPE-NHS乙醇溶液(445μL)、5％三乙胺水溶液(15μL)、乙醇(130μL)和注射用蒸馏水(220μL)，并将混合物室温搅拌过夜。反应液在乙醇中沉淀，并将所得沉淀物溶解在注射用蒸馏水中，并通过HPLC(Develosil C8-UG-5,2.5mm,10×50mm,4.7mL/min,260nm,35℃,缓冲液A：50mM TEAA,5％CH3CN；缓冲液B：CH3CN；B浓度(B conc.)0-100％/20min)纯化，分级目标产物的峰。通过分级获得的级分在乙醇中沉淀，并将所得沉淀物溶解在注射用蒸馏水中。测量UV 260nm下的吸光度，并计算产量。得到NI-0089s-氨基-DPPE(NI-0089-DPPE的正义链，前述SEQ ID NO:1)(1.53mg，纯度92.41％)。质谱分析值为7573.71(计算值：7573.67)。将所得NI-0089s-氨基-DPPE和NI-0089的反义链混合，并使混合物进行退火操作，从而给出NI-0089-DPPE。
NK-0139-DPPE的合成
混合NK-0139-氨基(687μM,100μL)、10mM DPPE-NHS乙醇溶液(343μL)、5％三乙胺水溶液(15μL)、乙醇(50μL)和注射用蒸馏水(150μL)，并将混合物室温搅拌过夜。反应液在乙醇中沉淀，并将所得沉淀物溶解在注射用蒸馏水中，并通过HPLC(Develosil C8-UG-5,2.5mm,10×50mm,4.7mL/min,260nm,35℃,缓冲液A：50mM TEAA,5％CH3CN；缓冲液B：CH3CN；B浓度(B conc.)0-100％/20min)纯化，分级目标产物的峰。通过分级获得的级分在乙醇中沉淀，并将所得沉淀物溶解在注射用蒸馏水中。测量UV 260nm下的吸光度，并计算产量。得到NK-0139-DPPE(1.42mg，纯度95.79％)。质谱分析值为20722.75(计算值：20722.41)。
PK-0071-DPPE的合成
混合PK-0071-氨基(739μM,100μL)、10mM DPPE-NHS乙醇溶液(369μL)、5％三乙胺水溶液(10μL)、乙醇(110μL)和注射用蒸馏水(120μL)，并将混合物室温搅拌过夜。反应液在乙醇中沉淀，并将所得沉淀物溶解在注射用蒸馏水中，并通过HPLC(Develosil C8-UG-5,2.5mm,10×50mm,4.7mL/min,260nm,35℃,缓冲液A：50mM TEAA,5％CH3CN；缓冲液B：CH3CN；B浓度(B conc.)0-100％/20min)纯化，分级目标产物的峰。通过分级获得的级分在乙醇中沉淀，并将所得沉淀物溶解在注射用蒸馏水中。测量UV260nm下的吸光度，并计算产量。通过该方式，得到PK-0071-DPPE(2.18mg，纯度97.67％)。质谱分析值为18000.50(计算值：18000.08)。
(实施例B1)通过5’末端脂质缀合的核酸对萤火虫荧光素酶基因的表达抑制效果
使用上述5’末端脂质缀合的核酸，证实了萤火虫荧光素酶基因的体外表达抑制。
(1)材料和方法
RNA溶液通过将前述RNA分别溶解在注射用蒸馏水(Otsuka Pharmaceutical Co.,Ltd.，下文同)中以达到期望的浓度(20μmol/L)来制备。
使用稳定表达萤火虫荧光素酶(pGL3 Luc)的乳腺癌细胞系MCF-7，并将含10％FBS的RPMI Medium 1640(Invitrogen)用作培养基。培养条件设为37℃和5％CO2。
更具体地，稳定表达萤火虫荧光素酶(pGL3 Luc)的乳腺癌细胞系MCF-7如下培养。
[1]前述细胞在培养基中培养，且将培养液(culture medium)以50μL达到1×104个细胞/孔分配于96孔板。
[2]接着，用RNA样品通过使用转染试剂脂质体(Lipofectamine)2000(Invitrogen)根据所附步骤转染孔中的前述细胞。具体地，前述RNA样品与前述转染试剂的复合物50μL/孔添加至总量100μL，并使前述RNA样品的终浓度为为0.1、1或10nmol/L。作为对照1，制备不加入前述RNA样品和前述转染试剂的细胞(-)，作为对照2，制备转染时不加入前述RNA样品但单独加入前述转染试剂的细胞(模拟)。
[3]前述转染后将细胞进一步培养48小时。
荧光素酶活性如下测量。荧光素酶活性测量为对由稳定表达萤火虫荧光素酶(pGL3 Luc)的乳腺癌细胞系MCF-7保持的萤火虫荧光素酶基因表达的抑制效果的测量。
[1]首先使用Steady-Glo荧光素酶测定系统(商品名)(Promega)，根据所附步骤测量萤火虫荧光素酶的活性。具体而言，在每个前述孔中加入基质溶液(100μL)，并通过多功能酶标仪(multilabel reader)ARVO X2(PerkinElmer)测量荧光素酶的发光量。
[2]前述[1]中荧光素酶活性测量结果以与不添加RNA样品和转染试剂的细胞(-)(前述对照1，非添加细胞组)(为1)的相对活性表示。
(2)结果
结果示于图3-5。图3-5为示出荧光素酶活性相对值的图。
如图3所示，为siRNA型(双链RNA)的参考例B1-1(NI-0089)、参考例B1-2(NI-0089-C16)和参考例B1-3(NI-0089-DPPE))，各自示出对荧光素酶发光的抑制。为具有阴性对照序列的siRNA型(双链RNA)的参考例B1-4(NI-0000)、参考例B1-5(NI-0000-C16)和参考例B1-6(NI-0000-DPPE)不显示对荧光素酶发光的抑制。
如图4所示，为nkRNA型的NK-0139(参考例B1-7)、NK-0139-C16(实施例B1-1)和NK-0139-DPPE(实施例B1-2)各自示出对荧光素酶发光的抑制。具有脂质结合至其5’末端的(修饰的)NK-0139-C16(实施例B1-1)和NK-0139-DPPE(实施例B1-2)各自示出不次于为脂质不结合的(无修饰的)NK-0139(参考例B1-7)的荧光素酶活性抑制效果。此外，由于脂质(生物相关物质)已结合，可实现优异的向靶标的递送能力而不必须需要例如递送用载体。此外，NK-0139-C16(实施例B1-1)和NK-0139-DPPE(实施例B1-2)示出不次于为siRNA型(双链RNA)的参考例B1-1至B1-3的荧光素酶活性抑制效果。由于NK-0139-C16(实施例B1-1)和NK-0139-DPPE(实施例B1-2)为单链核酸，它们与siRNA型(双链RNA)相比容易合成和操作。
如图5所示，为PnkRNA型的PK-0071(参考例B1-11)、PK-0071-C16(实施例B1-3)和PK-0071-DPPE(实施例B1-4)各自示出对荧光素酶发光的抑制。具有脂质结合至其5’末端的(修饰的)PK-0071-C16(实施例B1-3)和PK-0071-DPPE(实施例B1-4)各自示出不次于脂质未结合的(无修饰的)PK-0071(参考例B1-8)的荧光素酶活性抑制效果。此外，由于脂质(生物相关物质)已结合，可实现优异的向靶标的递送能力而不必须需要例如递送用载体。此外，PK-0071-C16(实施例B1-3)和PK-0071-DPPE(实施例B1-4)示出不次于为siRNA型(双链RNA)的参考例B1-1至B1-3的荧光素酶活性抑制效果。此外，由于PK-0071-C16(实施例B1-3)和PK-0071-DPPE(实施例B1-4)为单链核酸，它们与siRNA型(双链RNA)相比容易合成和操作。
(实施例A2：内部脂质缀合的核酸的合成)
合成其中脂质内部结合至除核酸末端以外的位点的内部脂质缀合的核酸(称为“内部脂质缀合物”，“内部脂质修饰核酸”，或简称为“脂质修饰核酸”)。以下示意性示出合成的内部脂质缀合的核酸的结构。表示核酸(“K(R)-0101-C16”等)的符号中，“K”为下述的赖氨酸残基，“G”为下述的甘氨酸残基。“R”在下图中表示右侧的连接子区域(连接子区域Lx)为前述赖氨酸残基或前述甘氨酸残基。“L”在下图中表示左侧的连接子区域(连接子区域Ly)为前述赖氨酸残基或前述甘氨酸残基。“LR”在下图中表示右侧和左侧的连接子区域(连接子区域Lx和Ly)为前述赖氨酸残基或前述甘氨酸残基。“C16”表示与实施例A1和B1的类似的单链脂质结合至前述赖氨酸残基。“DPPE”表示与实施例A1和B1的类似的双链脂质结合至前述赖氨酸残基。
在上述内部脂质缀合的核酸中，“阴性对照”具有与靶序列(由稳定表达萤火虫荧光素酶(pGL3 Luc)的乳腺癌细胞系MCF-7保持的萤火虫荧光素酶基因的序列)非互补的序列，且对应于参考例。“靶序列(target sequence)”为具有与前述靶序列互补的序列的核酸。“靶序列(target sequence)”G(R)-0101、G(L)-0102和G(LR)-0100中，生物相关物质(脂质)未如下所述结合，它们对应于参考例。“靶序列(target sequence)”中，K(R)-0101-C16、K(R)-0101-DPPE、K(L)-0101-C16、K(L)-0101-DPPE、K(LR)-0101-C16和K(LR)-0101-DPPE为如下所述的其中脂质内部结合至除单链核酸末端以外的位点的核酸，并对应于实施例。
在前述内部脂质缀合的核酸中，为R型的K(R)-0101-C16、K(R)-0101-DPPE和G(R)-0101的具体序列和结构如下。在下列结构式中，“Lys”为连接子区域的赖氨酸残基，“Gly”为连接子区域的甘氨酸残基。
包括Lys(赖氨酸残基)和Gly(甘氨酸残基)的K(R)-0101-C16和G(R)-0101的具体结构如下。K(R)-0101-DPPE的赖氨酸残基Lys的结构与K(R)-0101-C16中的相同，前述双链脂质(DPPE)代替单链脂质(C16)结合至Lys。
K(R)-0101-C16和K(R)-0101-DPPE的序列由下列SEQ ID NO:11表示。在下列SEQID NO:11中，Ll为前述赖氨酸残基Lys，其为连接子区域Lx。如上所述，在K(R)-0101-C16和K(R)-0101-DPPE中，脂质结合至Lys。G(R)-0101的序列由下列SEQ ID NO:12表示。在下列SEQID NO:12中，Lg为前述甘氨酸残基Gly，其为连接子区域Lx。
5’-ACUUACGCUGAGUACUUCGAUUCC-Ll-GGAAUCGAAGUACUCAGCGUAAGUUCUUCGG-3’(SEQID NO:11)
5’-ACUUACGCUGAGUACUUCGAUUCC-Lg-GGAAUCGAAGUACUCAGCGUAAGUUCUUCGG-3’(SEQID NO:12)
前述内部脂质缀合的核酸中为L型的K(L)-0102-C16、K(L)-0102-DPPE和G(L)-0102的具体序列和结构如下。在下列结构式中，“Lys”为连接子区域的赖氨酸残基，“Gly”为连接子区域的甘氨酸残基。Lys和Gly的结构与前述R型的相同。
K(L)-0102-C16和K(L)-0102-DPPE的序列由下列SEQ ID NO:13表示。在下列SEQID NO:13中，Ll为前述赖氨酸残基Lys，其为连接子区域Ly。如上所述，在K(L)-0102-C16和K(L)-0102-DPPE中，脂质结合至Lys。G(L)-0102的序列由下列SEQ ID NO:14表示。在下列SEQID NO:14中，Lg为前述甘氨酸残基Gly，其为连接子区域Ly。
5’-ACUUACGCUGAGUACUUCGAUUCCCCACACCGGAAUCGAAGUACUCAGCGUAAGUUC-Ll-G-3’(SEQ ID NO:13)
5’-ACUUACGCUGAGUACUUCGAUUCCCCACACCGGAAUCGAAGUACUCAGCGUAAGUUC-Lg-G-3’(SEQ ID NO:14)
前述内部脂质缀合的核酸中为LR型的K(LR)-0100-C16、K(LR)-0100-DPPE和G(LR)-0100的具体序列和结构如下。在下列结构式中，“Lys”为连接子区域的赖氨酸残基，“Gly”为连接子区域的甘氨酸残基。Lys和Gly的结构与前述R型和前述L型的那些相同。
K(LR)-0100-C16和K(LR)-0100-DPPE的序列由下列SEQ ID NO:15表示。在下列SEQID NO:15中，Ll为前述赖氨酸残基Lys，其为连接子区域Ly。如上所述，在K(LR)-0100-C16和K(LR)-0100-DPPE中，脂质结合至Lys。G(LR)-0100的序列由下列SEQ ID NO:16表示。在下列SEQ ID NO:16中，Lg为前述甘氨酸残基Gly，其为连接子区域Ly。
5’-ACUUACGCUGAGUACUUCGAUUCC-Ll-GGAAUCGAAGUACUCAGCGUAAGUUC-Ll-G-3’(SEQID NO:15)
5’-ACUUACGCUGAGUACUUCGAUUCC-Lg-GGAAUCGAAGUACUCAGCGUAAGUUC-Lg-G-3’(SEQID NO:16)
前述各RNA(内部脂质缀合的核酸)如下合成。
K(R)-0101的合成
除了脂质不结合至Lys以外具有与K(R)-0101-C16和K(R)-0101-DPPE的相同结构(前述SEQ ID NO:11)的K(R)-0101根据与上述类似地亚磷酰胺法合成。具体而言，前述化合物7首先连接至由SEQ ID NO:17表示的核酸的5’侧以引入赖氨酸残基。接着，由前述SEQ IDNO:3表示的RNA经前述赖氨酸残基连接至由前述SEQ ID NO:17表示的核酸的5’侧，从而合成K(R)-0101。
5’-GGAAUCGAAGUACUCAGCGUAAGUUCUUCGG-3’(SEQ ID NO:17)
K(R)-0101-C16的合成
混合K(R)-0101(500μM,80μL)、50mM C16-NHS/DMF溶液(32μL)、异丙醇(128μL)和碳酸盐缓冲液(pH 9.2,160μL)(终浓度100mM)，并将混合物在40℃下搅拌3小时。反应液通过HPLC(Develosil C8-UG-5,2.5mm,10×50mm,4.7mL/min,260nm,35℃,缓冲液A：50mMTEAA,5％CH3CN；缓冲液B：CH3CN；B浓度0-100％/20min)纯化，分级目标产物的峰。通过分级获得的级分在乙醇中沉淀，并将所得沉淀物溶解在注射用蒸馏水中。测量UV 260nm下的吸光度，并计算产量。通过该方式，得到K(R)-0101-C16(405μg，纯度99.50％)。质谱分析值为18203.18(计算值：18203.41)7024.17(7024.37)。
K(L)-0102-C16的合成
除了前述SEQ ID NO:17改为鸟苷和前述SEQ ID NO:3改为下列SEQ ID NO:18以外，通过与K(R)-0101-C16类似的方法，进行合成，从而给出K(L)-0102-C16(316μg，纯度96.69％)。质谱分析值为19124.88(计算值：19125.01)。
5’-ACUUACGCUGAGUACUUCGAUUCCCCACACCGGAAUCGAAGUACUCAGCGUAAGUUC-3’(SEQID NO:18)
K(LR)-0100的合成
除了脂质不结合至Lys以外具有与K(LR)-0100-C16和K(LR)-0100-DPPE的相同结构的K(LR)-0100根据与上述类似的亚磷酰胺法合成。具体而言，前述化合物7首先连接至由鸟苷表示的核酸的5’侧以引入-赖氨酸残基。然后，由SEQ ID NO:19表示的核酸经前述赖氨酸残基引入前述鸟苷的5’侧。此外，前述化合物7连接至由前述SEQ ID NO:19表示的核酸的5’侧以引入赖氨酸残基。此外，由前述SEQ ID NO:3表示的RNA经前述赖氨酸残基连接至由前述SEQ ID NO:19表示的核酸的5’侧，从而合成K(LR)-0100。
5’-GGAAUCGAAGUACUCAGCGUAAGUUC-3’(SEQ ID NO:19)
K(LR)-0100-C16的合成
除了使用K(LR)-0100代替K(R)-0101以外通过与K(R)-0101-C16类似的方法，进行合成，从而给出K(LR)-0100-C16(317μg，纯度98.07％)。质谱分析值为17572.21(计算值：17572.52)。
K(R)-0101-DPPE的合成
混合K(R)-0101(500μM,160μL)、10mM DPPE-NHS乙醇溶液(320μL)、1％三乙胺水溶液(80μL)、乙醇(160μL)和注射用蒸馏水(80μL)，并将混合物在40℃下搅拌24小时。反应液通过HPLC(Develosil C8-UG-5,2.5mm,10×50mm,4.7mL/min,260nm,35℃,缓冲液A：50mMTEAA,5％CH3CN；缓冲液B：CH3CN；B浓度0-100％/20min)纯化，分级目标产物的峰。通过分级获得的级分在乙醇中沉淀，并将所得沉淀物溶解在注射用蒸馏水中。测量UV 260nm下的吸光度，并计算产量。通过该方式，得到K(R)-0101-DPPE(0.98mg，纯度99.55％)。质谱分析值为18752.70(计算值：18753.04)。
K(L)-0102-DPPE的合成
除了前述SEQ ID NO:17改为鸟苷和前述SEQ ID NO:3改为前述SEQ ID NO:18以外，通过与K(R)-0101-DPPE的类似的方法，进行合成，从而给出K(L)-0102-DPPE(1.05mg，纯度99.10％)。质谱分析值为19674.36(计算值：19674.64)。
K(LR)-0100-DPPE的合成
混合K(LR)-0100(500μM,120μL)、10mM DPPE-NHS乙醇溶液(360μL)、1％三乙胺水溶液(90μL)和注射用蒸馏水(30μL)，并将混合物在40℃下搅拌24小时。反应液通过HPLC(Develosil C8-UG-5,2.5mm,10×50mm,4.7mL/min,260nm,35℃,缓冲液A：50mM TEAA,5％CH3CN；缓冲液B：CH3CN；B浓度0-100％/20min)纯化，分级目标产物的峰。通过分级获得的级分在乙醇中沉淀，并将所得沉淀物溶解在注射用蒸馏水中。测量UV 260nm下的吸光度，并计算产量。通过该方式，得到K(LR)-0100-DPPE(0.54mg，纯度99.14％)。质谱分析值为18670.42(计算值：18671.78)。
(实施例B2)内部脂质缀合的核酸对萤火虫荧光素酶基因的表达抑制效果
除了使用前述内部脂质缀合的核酸代替前述5’末端脂质缀合的核酸以外，以与实施例B1相同的方式，证实了体外萤火虫荧光素酶基因的表达抑制。这些结果示于图6-8。图6-8为示出荧光素酶活性相对值的图。
如图6-8所示，G(R)-0101(参考例B2-1)、K(R)-0101-C16(实施例B2-1)、K(R)-0101-DPPE(实施例B2-2)、G(L)-0102(参考例B2-2)、K(L)-0102-C16(实施例B2-3)、K(L)-0102-DPPE(实施例B2-4)、G(LR)-0100(参考例B2-3)、K(LR)-0100-C16(实施例B2-5)和K(LR)-0100-DPPE(实施例B2-6)各自显示对荧光素酶发光的抑制。
另外，如图6-8所示，除了其末端以外在内部具有脂质结合的(修饰的)K(R)-0101-C16(实施例B2-1)、K(R)-0101-DPPE(实施例B2-2)、K(L)-0102-C16(实施例B2-3)、K(L)-0102-DPPE(实施例B2-4)、K(LR)-0100-C16(实施例B2-5)和K(LR)-0100-DPPE(实施例B2-6)各自显示不次于脂质未结合(无修饰的)G(R)-0101(参考例B2-1)、G(L)-0102(参考例B2-2)和G(LR)-0100(参考例B2-3)的荧光素酶活性抑制效果。此外，由于脂质(生物相关物质)已结合，可实现优异的向靶标的递送能力而不必须需要例如递送用载体，另外，前述实施例B2-1-B2-6的核酸显示不次于为siRNA型(双链RNA)的参考例B1-1至B1-3的荧光素酶活性抑制效果。此外，由于它们为单链核酸，它们与siRNA型(双链RNA)相比容易合成和操作。
(实施例A3：具有脂质结构变化的内部脂质缀合的核酸的合成)
合成K(R)-0101-C14、K(R)-0101-C18和K(R)-0101-C18:1，其为其中K(R)-0101-C16(前述实施例A2的R型核酸)的脂质结构由C16(棕榈酸)分别改为具有一个不饱和键的C14(肉豆蔻酸)、C18(硬脂酸)和C18(油酸)的核酸。其各结构如下。
K(R)-0101-C14的合成混合K(R)-0101(500μM,40μL)、50mM C14-NHS/DMF溶液(16μL)、异丙醇(64μL)和碳酸盐缓冲液(pH 9.2,80μL)(终浓度100mM)，并将混合物在40℃下搅拌3小时。反应液通过HPLC(Develosil C8-UG-5,2.5mm,10×50mm,4.7mL/min,260nm,35℃,缓冲液A：50mM TEAA,5％CH3CN；缓冲液B：CH3CN；B浓度0-100％/20min)纯化，分级目标产物的峰。通过分级获得的级分在乙醇中沉淀，并将所得沉淀物溶解在注射用蒸馏水中。测量UV260nm下的吸光度，并计算产量。通过该方式，得到K(R)-0101-C14(193μg，纯度94.43％)。质谱分析值为18175.91(计算值：18175.36)。
K(R)-0101-C18的合成
混合K(R)-0101(500μM,40μL)、50mM C18-NHS/DMF溶液(16μL)、异丙醇(64μL)和碳酸盐缓冲液(pH 9.2,80μL)(终浓度100mM)，并将混合物在40℃下搅拌3小时。反应液通过HPLC(Develosil C8-UG-5,2.5mm,10×50mm,4.7mL/min,260nm,35℃,缓冲液A：50mM TEAA,5％CH3CN；缓冲液B：CH3CN；B浓度0-100％/20min)纯化，分级目标产物的峰。通过分级获得的级分在乙醇中沉淀，并将所得沉淀物溶解在注射用蒸馏水中。测量UV 260nm下的吸光度，并计算产量。通过该方式，得到K(R)-0101-C18(188μg，纯度95.97％)。质谱分析值为18231.08(计算值：18231.46)。
K(R)-0101-C18:1的合成
混合K(R)-0101(500μM,40μL)、50mM C18:1-NHS/DMF溶液(16μL)、异丙醇(64μL)和碳酸盐缓冲液(pH 9.2,80μL)(终浓度100mM)，并将混合物在40℃下搅拌3小时。反应液通过HPLC(Develosil C8-UG-5,2.5mm,10×50mm,4.7mL/min,260nm,35℃,缓冲液A：50mM TEAA,5％CH3CN；缓冲液B：CH3CN；B浓度0-100％/20min)纯化，分级目标产物的峰。通过分级获得的级分在乙醇中沉淀，并将所得沉淀物溶解在注射用蒸馏水中。测量UV 260nm下的吸光度，并计算产量。通过该方式，得到K(R)-0101-C18:1(192μg，纯度96.22％)。质谱分析值为18230.49(计算值：18229.45)。
(实施例B3)具有脂质结构变化的内部脂质缀合的核酸对萤火虫荧光素酶基因的表达抑制效果
除了使用K(R)-0101-C14、K(R)-0101-C18和K(R)-0101-C18:1代替K(R)-0101-C16以外，以与实施例B2相同的方式，证实体外萤火虫荧光素酶基因的表达抑制(实施例B3-2至实施例B3-4)。另外，表达抑制还以与G(R)-0101(参考例B3-1)和K(R)-0101-C16(实施例B3-1)相同的方式证实。这些结果示于图9中。图9为示出荧光素酶活性的相对值的图。如图所示，荧光素酶活性的抑制效果主要为C14修饰<C18:1修饰<C16修饰<C18:0修饰的顺序，但未发现大的差异。即，由于所有实施例B3-2至实施例B3-4显示不次于实施例B3-1的荧光素酶活性抑制效果，证实了即使在改变脂质结构时也可获得本发明的效果。另外，实施例B3-1至B3-4显示不次于脂质未结合的参考例B3-1的荧光素酶活性抑制效果。
(实施例C4)
如下所述通过使用组成型表达萤火虫荧光素酶基因的小鼠(荧光素酶转基因小鼠)检查K(R)-0101-C16在体内的效果。即，准备荧光素酶转基因小鼠(C57Blac/J)(♀4周大)(2组，每组5只小鼠)。向一组从尾静脉以200μg/100μL/头(head)投与K(R)0101-C16。另一组不投与(未处理)。投与后四天，将D-荧光素(Promega)以3mg/头来腹膜内投与，在乙醚麻醉下解剖小鼠，分离各器官。通过IVIS成像系统(Caliper Co.,)测量化学发光强度15分钟，并分析结果。
图10的照片显示通过前述IVIS分析的萤火虫荧光素酶基因的表达抑制的测量结果。图10(a)为显示用本发明的单链核酸(K(R)0101-C16)处理的小鼠的测量结果的照片。图10(b)为显示未处理小鼠的测量结果的照片。
图11为显示图10照片中全身荧光素酶活性(萤火虫荧光素酶基因的表达抑制)的测量结果的图。图12为显示图10照片中脑荧光素酶活性(萤火虫荧光素酶基因的表达抑制)的测量结果的图。在图11和12中，纵轴显示荧光素酶活性，“未处理(Nontreat)”显示未处理小鼠的测量结果，和“K(R)-0101-C16”显示用K(R)-0101-C16处理的小鼠的测量结果。如图所示，用K(R)-0101-C16处理的小鼠与未处理小鼠相比显示明显降低的荧光素酶活性，且发现了荧光素酶活性抑制效果。另外，如图12所示，由于用K(R)-0101-C16处理的小鼠显示脑中荧光素酶活性的降低，本发明的核酸可穿过血脑屏障并抑制脑中的基因表达。此外，由于脂质(生物相关物质)已结合，能够实现优异的向靶标的递送能力，而不必须需要例如递送用载体。
在上述参考说明性实施方案描述本发明的同时，本发明决不限于此。可在不偏离本发明的范围下对本发明的构成和细节进行对于本领域技术人员能够变得显而易见的各种改变。
产业上的可利用性
本发明的单链核酸分子能够实现对靶标的优异递送能力而不必须需要例如递送用载体。因此，例如，不需要考虑载体的毒性，并且可避免设定与形成核酸分子和载体的复合体相关的各种条件的研究。因此，例如，可减少生产和使用方面的劳力和成本。
序列表
<110> 株式会社博纳克
<120> 具有递送功能的基因表达调控用单链核酸分子
<130> TF13018WO
<150> JP2012-120337
<151> 2012-05-26
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸分子
<400> 1
cuuacgcuga guacuucgat t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸分子
<400> 2
ucgaaguacu cagcguaagt t 21
<210> 3
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸分子
<400> 3
acuuacgcug aguacuucga uucc 24
<210> 4
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸分子
<400> 4
ggaaucgaag uacucagcgu aaguuc 26
<210> 5
<211> 62
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸分子
<400> 5
acuuacgcug aguacuucga uuccccacac cggaaucgaa guacucagcg uaaguucuuc 60
gg 62
<210> 6
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸分子
<400> 6
acuuacgcug aguacuucga uuccggaauc gaaguacuca gcguaaguuc g 51
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸分子
<400> 7
uacuauucga cacgcgaagt t 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸分子
<400> 8
cuucgcgugu cgaauaguat t 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸分子
<400> 9
uacuauucga cacgcgaagt t 21
<210> 10
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸分子
<400> 10
acuuacgcug aguacuucga uucc 24
<210> 11
<211> 55
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸分子
<400> 11
acuuacgcug aguacuucga uuccggaauc gaaguacuca gcguaaguuc uucgg 55
<210> 12
<211> 55
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸分子
<400> 12
acuuacgcug aguacuucga uuccggaauc gaaguacuca gcguaaguuc uucgg 55
<210> 13
<211> 58
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸分子
<400> 13
acuuacgcug aguacuucga uuccccacac cggaaucgaa guacucagcg uaaguucg 58
<210> 14
<211> 58
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸分子
<400> 14
acuuacgcug aguacuucga uuccccacac cggaaucgaa guacucagcg uaaguucg 58
<210> 15
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸分子
<400> 15
acuuacgcug aguacuucga uuccggaauc gaaguacuca gcguaaguuc g 51
<210> 16
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸分子
<400> 16
acuuacgcug aguacuucga uuccggaauc gaaguacuca gcguaaguuc g 51
<210> 17
<211> 31
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸分子
<400> 17
ggaaucgaag uacucagcgu aaguucuucg g 31
<210> 18
<211> 57
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸分子
<400> 18
acuuacgcug aguacuucga uuccccacac cggaaucgaa guacucagcg uaaguuc 57
<210> 19
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸分子
<400> 19
ggaaucgaag uacucagcgu aaguuc 26

Claims (25)

1.一种单链核酸分子，其为具有递送功能的靶基因的表达抑制用单链核酸分子，所述单链核酸分子从5’侧至3’侧以下列顺序包括5’侧区域(Xc)、连接子区域(Lx)、内部区域(Z)、连接子区域(Ly)和3’侧区域(Yc)，其中
前述内部区域(Z)通过内部5’侧区域(X)和内部3’侧区域(Y)的连接而构成，
前述5’侧区域(Xc)与前述内部5’侧区域(X)互补，
前述3’侧区域(Yc)与前述内部3’侧区域(Y)互补，
前述内部区域(Z)、前述5’侧区域(Xc)和前述3’侧区域(Yc)的至少之一包括抑制靶基因的表达的表达抑制序列，和
选自由5’末端、3’末端、前述连接子区域(Lx)和前述连接子区域(Ly)组成的组的至少之一结合至生物相关物质。
2.根据权利要求1所述的单链核酸分子，其中所述生物相关物质为脂质。
3.根据权利要求2所述的单链核酸分子，其中所述生物相关物质为单纯脂质、复合脂质、衍生脂质、单链脂质、双链脂质、糖脂质、脂溶性维生素或类固醇。
4.根据权利要求2所述的单链核酸分子，其中所述脂质选自由棕榈酸、肉豆蔻酸、硬脂酸和油酸组成的组的至少之一。
5.根据权利要求1所述的单链核酸分子，其中所述生物相关物质为选自由抗体蛋白质、其肽和穿膜肽组成的组的至少之一。
6.根据权利要求1至5任一项所述的单链核酸分子，其满足下式(1)和(2)的条件：
Z＝X+Y (1)
Z≥Xc+Yc(2)
其中Z为内部区域(Z)的碱基数，X为内部5’侧区域(X)的碱基数，Y为内部3’侧区域(Y)的碱基数，Xc为5’侧区域(Xc)的碱基数，和Yc为3’侧区域(Yc)的碱基数。
7.根据权利要求1至6任一项所述的单链核酸分子，其包括至少一种修饰残基。
8.根据权利要求1至7任一项所述的单链核酸分子，其包括稳定同位素。
9.根据权利要求1至8任一项所述的单链核酸分子，其中所述连接子区域(Lx)和/或所述连接子区域(Ly)由核苷酸残基和非核苷酸残基的至少之一构成。
10.根据权利要求9所述的单链核酸分子，其中所述核苷酸残基为非修饰核苷酸残基和/或修饰核苷酸残基。
11.根据权利要求9或10所述的单链核酸分子，其中所述连接子区域(Lx)和/或所述连接子区域(Ly)由下列(1)-(7)的任一种残基构成：
(1)非修饰核苷酸残基
(2)修饰核苷酸残基
(3)非修饰核苷酸残基和修饰核苷酸残基
(4)非核苷酸残基
(5)非核苷酸残基和非修饰核苷酸残基
(6)非核苷酸残基和修饰核苷酸残基
(7)非核苷酸残基、非修饰核苷酸残基和修饰核苷酸残基。
12.根据权利要求1至11任一项所述的单链核酸分子，其中所述基因表达抑制为通过RNA干扰的表达抑制。
13.根据权利要求1至12任一项所述的单链核酸分子，其中所述单链核酸分子的碱基序列为SEQ ID NO:5、6、11、12、13、14、15或16的碱基序列。
14.一种靶基因的表达抑制用组合物，其包括根据权利要求1至13任一项所述的单链核酸分子。
15.一种药学组合物，其包括根据权利要求1至13任一项所述的单链核酸分子。
16.根据权利要求15所述的药学组合物，其用于治疗炎症。
17.一种抑制靶基因的表达的方法，其包括使用根据权利要求1至13任一项所述的单链核酸分子。
18.根据权利要求17所述的方法，其包括将所述单链核酸分子投与至细胞、组织或器官的步骤。
19.根据权利要求18所述的方法，其中将所述单链核酸分子在体内或体外投与。
20.根据权利要求17至19任一项所述的方法，其中所述基因表达抑制为通过RNA干扰的表达抑制。
21.一种诱导RNA干扰来抑制靶基因的表达的方法，其包括使用根据权利要求1至13任一项所述的单链核酸分子。
22.一种疾病的治疗方法，其包括将根据权利要求1至13任一项所述的单链核酸分子投与至患者的步骤，其中所述单链核酸分子具有抑制引起所述疾病的基因的表达的序列作为表达抑制序列。
23.根据权利要求1至13任一项所述的单链核酸分子的用途，其用于靶基因的表达抑制。
24.根据权利要求1至13任一项所述的单链核酸分子的用途，其用于诱导RNA干扰。
25.一种核酸分子，其用于治疗疾病，其中所述核酸分子为根据权利要求1至13任一项所述的单链核酸分子，和所述单链核酸分子具有抑制引起所述疾病的基因的表达的序列作为表达抑制序列。
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