DE60027873T2

DE60027873T2 - Moleküle für die behandlung und diagnose von tumoren

Info

Publication number: DE60027873T2
Application number: DE60027873T
Authority: DE
Inventors: Ariel Roger ALBERTO; Pascal HÄFLIGER
Original assignee: Zurich Universitaet Institut fuer Medizinische Virologie
Current assignee: Zurich Universitaet Institut fuer Medizinische Virologie
Priority date: 1999-02-24
Filing date: 2000-02-24
Publication date: 2006-12-21
Anticipated expiration: 2020-02-25
Also published as: EP1154798A1; ES2259603T3; JP2002537360A; WO2000050086A1; AU3282300A; CA2360419A1; ATE325624T1; CA2360419C; DE60027873D1; EP1154798B1; DK1154798T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Moleküle für die Behandlung und Diagnose von Tumoren. Die Erfindung betrifft außerdem therapeutische Zusammensetzungen, die eines oder mehrere dieser Moleküle umfassen und die Verwendung beider in der Behandlung und Diagnose von Krebs.
Die Diagnose und Therapie von Krebs erfordert weiterhin einen großen Aufwand der pharmazeutischen und chemischen Industrie. Obwohl eine beträchtliche Anstrengung zur Entwicklung neuer Behandlungen erfolgt, gibt es immer noch viele Tumortypen, für die keine Behandlung existiert. Ein zusätzliches Problem ist die Bildung von Mikrometastasen, die nicht diagnostiziert oder behandelt werden können.
Ein wichtiges Problem bei der Behandlung ist die Ähnlichkeit zwischen normalen Zellen und Krebszellen. Behandlungen, die das Wachstum von Tumorzellen beeinträchtigen, beeinträchtigen ebenfalls das Wachstum gesunder Zellen. Radiotherapie, wie sie derzeit bekannt ist, besteht im Wesentlichen aus einem willkürlichen Kreuzfeuer von außerhalb der Zelle oder des Zytoplasmas. Da dies eine ziemlich grobe Behandlung ist, können umgebende Zellen und Gewebe ebenfalls beschädigt werden, was zu mehr oder weniger schweren Nebenwirkungen führt.
Die Bereitstellung einer verbesserten Radiotherapie und eines diagnostischen Verfahrens für Krebs, das sehr geringe Mengen von Radionukliden verwendet und zu einer direkten Behandlung in der bösartigen Zelle führt, ist daher hoch erwünscht.
Es ist bekannt, dass sich der Metabolismus von Krebszellen von dem normaler Zellen unterscheidet. Außerdem scheinen Krebszellen verglichen mit normalen Zellen eine erhöhte Membranpermeabilität durch eine gesteigerte Expression von Membranrezeptoren aufzuweisen. Die Folge ist, dass Krebszellen für biologische Vektoren, wie Proteine und Peptide, durchlässiger sind.
Die gesteigerte Aufnahme solcher biologischer Vektoren kann in der Diagnose von Tumoren verwendet werden, indem ein Radionuklid an ein Protein gebunden wird, z.B. durch Jodierung von Tyrosinfunktionalitäten im Protein oder durch kovalente Bindung von radioaktiven Metallkomplexen. Diese Moleküle vereinen eine tumorsuchende Funktion und eine radioaktive Funktion. Obwohl diese Typen von Molekülen zur Diagnose verwendet worden sind, ist ihre Verwendung in der Therapie noch nicht beschrieben worden.
Es ist eine Aufgabe dieser Erfindung, die oben beschriebenen Moleküle weiter zu verbessern, um zu einer noch besser maßgeschneiderten Behandlung bösartiger Zellen zu gelangen.
Diese Aufgabe wird durch die Erfindung durch die Bereitstellung eines Moleküls gelöst, das eine interkalierende Gruppe aufweist, die an eine radioaktive [M(CO)₃]⁺-Gruppe koordiniert ist, wobei M ein Metall ausgewählt aus ^99mTc, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re und Mn ist, und ein tumorsuchendes Molekül, das durch eine direkte Bindung mit einer Koordinationsstelle an dem Metall verbunden ist. Das Molekül kann durch das tumorsuchende Molekül spezifisch auf den Tumor gerichtet sein und durch die Zelle verinnerlicht werden. Die interkalierende Gruppe wird sich dann in den DNA-Strang einschieben und Brüche hervorrufen. Außerdem wird auch das radioaktive Metall zu Strangbrüchen der DNA führen. Der Vorteil der neuen Moleküle besteht darin, dass sie spezifisch auf die bösartige Zelle gerichtet sind und von der Zelle aufgenommen werden.
Das tumorsuchende Molekül ist bevorzugt ein Biomolekül, wie etwa ein Peptid oder ein Protein, das aktiv auf die Tumorzelle gerichtet ist. Beispiele für diese Biomoleküle sind Somatostatin-, Neurotensin-, Bombesin-rezeptorbindende Moleküle, monoklonale Antikörper, Penetratine^® und Glykoproteine, die an GPIIb/IIIa-Rezeptoren binden. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt und ist allgemeiner ebenfalls auf ande re tumorsuchende Mittel anwendbar. Diese Kategorie umfasst außerdem Verbindungen, von denen bekannt ist, dass sie in den Kern oder die Kernmembran transportiert werden. Beispiele dafür sind Antisense-Oligonukleotide, proliferierende Mittel wie Deoxyuridin und kleine Moleküle wie Spermidin.
Die interkalierende Einheit ist bevorzugt ein aromatisches Molekül mit einer interkalativen Bindungsaffinität für doppelsträngige DNA. Beispiele für solche aromatische Verbindungen sind Verbindungen, die z.B. Akridin, Porphyrin, Ellipticin, Phenanthrolin, Carbazol, Benzimidazol oder Verbindungen mit bekannter zytostatischer Aktivität (Antibiotika) aus der Klasse der Tetrazykline (Anthrazykline), wie etwa Daunorubizin, Epirubizin oder Mixoxantron, umfassen und mit Liganden funktionalisiert sind, welche die [M(CO)₃]⁺-Gruppe koordinieren können. Beispiele für solche Liganden sind jene, die in EP-879 606 erwähnt sind und außerdem Polyaminopolycarboxylate, Phosphate und Phosphonate, aliphatische oder aromatische oder gemischte Triamine und Thione.
Die interkalierenden und tumorsuchenden Funktionen sind manchmal in existierenden Molekülen kombiniert. Beispiele für interkalierende Mittel, die eine interkalierende Gruppe und ein Peptid kombinieren, sind Aktinomyzin und Triostin.
Das radioaktive Molekül wird ausgewählt aus ^99mTc, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re und Mn. Diese reinen γ-emittierenden Nuklide werden verwendet, da ihre begleitenden Konversionselektronen mit niedriger Reichweite zur Spaltung von Bindungen führen, die dem zerfallenden Kern nahe sind. Die Dosisbelastung für den Patienten bleibt daher sehr niedrig.
Besonders geeignete Kombinationen der drei Funktionen sind in 1 gezeigt.
Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung der Moleküle in Therapie und Diagnose und therapeutische und diagnostische Zusammensetzungen, die eines oder mehrere dieser Moleküle umfassen.
Therapeutische Zusammensetzungen umfassen mindestens eine geeignete Menge des Moleküls in einem Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff. Solche Zusammensetzungen können die Form von Lösungen aufweisen und werden intravenös, intraperitoneal oder intrathekal verabreicht. Geeignete Mengen zur Verabreichung hängen von der Art der Verabreichung, dem verwendeten Radionuklid und der zu behandelnden oder diagnostizierenden Indikation ab. Geeignete Mengen variieren zwischen 10^–9 und 10^–1 g pro kg Körpergewicht.
Hilfsstoffe und Verdünnungsmittel für diese Art der Medikation sind dem Fachmann bekannt. Die vorliegenden Moleküle erfordern jedoch bestimmte Bedingungen, um stabil zu sein. Bevorzugt sollte der Hilfsstoff oder das Verdünnungsmittel hydrophiler und bevorzugt organischer Natur sein.
Für diagnostische Zwecke besteht die Zusammensetzung mindestens aus einer geeigneten Menge des Moleküls in einem Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff Diagnostische Verfahren, die mit der Zusammensetzung der Erfindung verwendet werden können, sind Szintigraphie oder Magnetresonanzbildgebung (MRI).
Es wurde nun festgestellt, dass das Verfahren zur Synthese von Tc- und Re-Carbonylen aus Wasser, das in EP-879 606 beschrieben ist, zur Herstellung der Moleküle der Erfindung geeignet ist. Mit diesem Verfahren ist es insbesondere möglich, interkalierende Liganden einzuführen, die sehr stabile Komplexe (in vitro und in vivo) mit den genannten Carbonylen bilden.
Die in EP-879 606 beanspruchten Liganden und Akridin, Porphyrin, Ellipticin, Phenanthrolin, Carbazol, Benzimidazol, stabilisieren die fac-[Tc(CO)₃]⁺-Gruppe im Serum und bilden bei sehr geringen Konzentrationen Komplexe. Diese Liganden können ortsspezifisch an die Biomoleküle gekuppelt werden und nachfolgend mit z.B. Tc-99m markiert werden. Da das Radionuklid dem interkalierenden Liganden sehr nahe ist, wird sein Elektron mit niedriger Energie die DNA-Strängen sehr gut durchdringen und Strangbrüche hervorrufen. Wenn es in einer der Furchen interkaliert, ist die Wahrscheinlichkeit eines Treffers sehr hoch, da der Kern praktisch von DNA umgeben ist.
Die erfindungsgemäß derivatisierten Biomoleküle zeigen eine hohe Selektivität und werden verinnerlicht. Wie von rein organischen Interkalatoren bekannt ist, wird der Komplex die DNA insbesondere interkalieren, wenn sich die Zelle teilt. Im Gegensatz zu anderen Therapeutika kann mit dieser Kombination eine hohe Selektivität erreicht werden.
Wenn Re-188 als das Radionuklid verwendet wird, werden die Schäden viel schwerwiegender sein als im Falle von Tc-99m, aber folglich wird die verabreichte Menge an Radioaktivität viel geringer sein als im Falle einer "normalen" Radiotherapie. Daher könnten schwere Nebenwirkungen wie etwa Knochenmarkstoxizität vermieden werden.
Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen, die nur zur Verdeutlichung der Erfindung, aber in keiner Weise zur Beschränkung von deren Schutzbereich gedacht sind, weiter erläutert.
In den Beispielen wird auf die folgenden Figuren Bezug genommen:
1: Schematische Wiedergabe der Moleküle der Erfindung.
2: Beispiel eines Tc(I)-Komplexes mit diesem interkalierenden Liganden und einem potentiellen Biomolekül, das durch direkte Bindung an eine andere Koordinationsstelle gebunden ist.
3: Schematische Darstellung des Verfahrens zur Herstellung von Molekülen der Erfindung.
4: Schematische Darstellung der drei Typen von Plasmidstrukturen.
5: Ethidiumbromid-gefärbtes Agarosegel der drei Strukturen I, II, III der DNA (linke Spur) und des Molekulargewichtsmarkers (rechte Spur).
6: Ethidiumbromid-gefärbtes Agarosegel einer Plasmidzubereitung, die mit der Verbindung [^99mTc(P₁)(teta)(CO)₃] behandelt wurde; Der Auftragungsort der Probe ist am unteren Ende des Gels. Spur 1 ist die Molekulargewichtsmarkierungssubstanz; Spur 2 ist eine Referenzlösung, die hochverdrilltes, entspanntes (Einzelstrangbruch) und linearisiertes (Doppelstrangbruch) Plasmid enthält, Spur 3 ist die experimentelle Lösung, die sowohl ein Plasmid als auch den Interkalator der Erfindung enthält, und Spur 4 ist die negative Vergleichsprobe, die nur Plasmid enthält.
7: Reaktionsschema für die Herstellung bifunktionaler Modellinterkalatoren.
8: Reaktionsschema für die Herstellung trifunktionaler Modellinterkalatoren.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
Synthese der Moleküle der Erfindung
1. Einführung
Um für eine starke Interkalation zu sorgen, sollte der Interkalator bevorzugt planar und aromatisch-heterozyklisch sein. Außerdem müssen die Seitengruppen des Interkalators stabil an das Radionuklid (d.h. ^99mTc) koordiniert sein. In diesem Beispiel ist es nicht zwingend, dass die koordinierende Einheit ein mehrzähniger Ligand mit hoher thermodynamischer Stabilität sein muss, da die meisten Komplexe mit Tc(I) eine extrem hohe kinetische Stabilität aufweisen. Aus diesen Gründen und wegen der bereits bekannten Prinzipien der Komplexierung mehrerer ein- und zweizähniger Liganden (besonders Pikolinsäure) wurde 5,6-Benzochinolin-3-carbonsäure als Interkalator ausgewählt.
2 zeigt ein Beispiel eines Tc(I)-Komplexes mit diesem interkalierenden Liganden und ein potentielles Biomolekül, das durch eine direkte Bindung mit einer weiteren Koordinationsstelle verbunden ist.
2. Synthese des Beispiel-Interkalators
2.1 3-Cyano-4-benzoyl-3,4-dihydrobenzo(f)chinolin 2
648 μl (5,58 mmol) Benzoylchlorid wurden zu einem Zweiphasensystem aus Wasser/Methylenchlorid während eines Zeitraums von zwei Stunden zugegeben. Diese zwei Phasen enthalten 500 mg (2,79 mmol) Benzo(f)chinolin in der Methylenchloridschicht und 545 mg (8,37 mmol) KCN in Wasser. Das Rühren wurde für 6 Stunden fortgesetzt. Die organische Phase wurde abgetrennt und mit Wasser, 5%iger Salzsäure, Wasser, 5%iger NaOH-Lösung und erneut mit Wasser gewaschen. Nach Trocknung über Magnesiumsulfat wurde die Lösung zur Trockene eingedampft.
Das Bromidsalz dieser sogenannten Reissert-Verbindung wurde aus 95%igem Ethanol umkristallisiert, um die analytisch reine Substanz zu ergeben. Ausbeute: 612 mg (71%).
2.2 5,6-Benzochinolin-3-carbonsäure (P1)
2 ml 48%ige Bromwasserstoffsäure wurden zu 287 mg (0,93 mmol) der in 2 ml Essigsäure gelösten Reissert-Verbindung gegeben. Die Lösung wurde 24 Stunden unter Rückfluss gekocht, gekühlt und filtriert. Das filtrierte Produkt wurde mit Diethylether gewaschen, getrocknet, und aus Methanol umkristallisiert, um 169 mg (0,76 mmol) (82%) des Hydrobromids des Interkalators als gelben Feststoff zu ergeben.
2.3 Makroskopische Synthese von Technetium- und Rhenium-Komplexen mit P1 (5,6-Benzochinolin-3-carbonsäure)
2.3.1 [NEt₄][ReBr(P1)(CO)₃]
Eine Suspension von 102 mg (133 μmol) [NEt₄][ReBr₃(CO)₃], 29,7 mg (133 μmol) P1 und 116 μl (226 mmol) Trioctylamin wurde in Dichlormethan unter Rückfluss gekocht, bis eine klare Lösung erreicht wurde. Nach Eindampfen der Lösung wurde Komplex 5 in THF extrahiert. Nach dem Verdampfen von THF wurde der Rest mit Diethylether gewaschen, um Trioctylammoniumbromid zu entfernen. Ausbeute: 63 mg (67%) des gelben Komplexes.
2.3.2 [Re(P₁)(H₂O)(CO)₃]
200,0 mg (0,26 μmol) [NEt₄]₂[ReBr₃(CO)₃] wurden in Gegenwart von 29,1 mg des Interkalators P1 während 4 Stunden in 1 M MES-Pufferlösung unter Rückfluss gekocht. Dann wurde der gelbe Niederschlag abfiltriert. Ausbeute: 114,2 mg (86%).
2.4 Mikroskopische Synthese von (^99mTc(H₂O)(P₁)(CO)₃)
Die ^99mTc-Komplexe wurden in einem Zweischrittverfahren mit einem normalen Generatoreluat synthetisiert. In einem ersten Schritt wurde der Komplex in > 97% Ausbeute gemäß der Literatur (R. Alberto et al., J. Am. Chem. Soc. 120, 7987 (1998)) synthetisiert. Die Lösung wurde dann mit Phosphatpuffer im Reaktionsgefäß neutralisiert, und eine Lösung des entsprechenden Liganden wurde zugegeben. Die Endkonzentration betrug zwischen 10^–4 und 10^–5. Es wurde für 30 Minuten bei 75°C stehen gelassen. Die radiochemische Reinigung und die Ausbeute wurden durch HPLC-Chromatographie bestimmt, und es wurde entdeckt, dass [^99mTc(HPO₄)(P₁)(CO₃)]^2– (Verbindung 10) mit einer Ausbeute von 80–95% (abhängig von der Ligandenkonzentration und der Reaktionsdauer) gebildet wurde.
2.5 Synthese von trifunktionalen Modellmolekülen der Erfindung
Dies ist ein Beispiel, wie ein trifunktionales Molekül aufgebaut werden kann. Die Vorschrift basiert auf bekannten Synthesemethoden für die entsprechenden Kupplungsverfahren. Das schematische Verfahren ist in 3 gezeigt.
1. Synthesen der bifunktionalen Liganden, die einen Interkalator und eine koordinierende Funktionalität haben
Ein bifunktionaler Ligand wurde gemäß der in 3 beschriebenen Strategie hergestellt. 7 zeigt das spezifische Reaktionsschema der Reaktion, das im Folgenden beschrieben wird.
2-Methylchinolin (1)
2-Methylchinolin (1) wurde von Fluka gekauft und ohne weitere Reinigung verwendet.
Chinolin-2-carbaldehyd (2)
Eine Mischung von 5,5 g Selendioxid (49,5 mmol) in 50 ml Dioxan und 2 ml Wasser wurde in kleine Portionen während 10 Minuten zu einer kochenden Lösung von 4,4 g (30,7 mmol) 2-Methylchinolin (1) in 20 ml Dioxan hinzugegeben. Nach 6 Stunden kochen wurde die warme Reaktionsmischung filtriert. Das Filtrat wurde eingedampft, in Dichlormethan gelöst und durch Alox filtriert. Das gelb-braune feste Produkt, das nach Verdamp fung des Lösungsmittels erhalten wurde, wurde aus Dichlormethan umkristallisiert. Ausbeute: 3,76 g (78%).
¹H-NMR (DMSO): δ, 10,12s, 8,61d, 8,22d, 8,12d, 7,99d, 7,91t, 7,79t
Verbindung 3a
Eine Mischung aus 500 mg Chinolin-2-carbaldehyd (2) (3,2 mmol) und 330 mg N-(2-Aminoethyl)-acetamid (3,23 mmol) in 15 ml Methanol wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das erhaltene hellbraune feste Produkt wurde direkt für die nächste Reaktion verwendet. Ausbeute: ~770 mg (~100%).
¹H-NMR (CDCl₃): δ, 8,57s, 8,21d, 8,13d, 8,10d, 7,85d, 7,75t, 7,59t
Verbindung 3b
Eine Lösung von 175 mg (4,62 mmol) NaBH₄ in 10 ml Ethanol wurde langsam während 2 Stunden zu einer gerührten Lösung von 500 mg (2,07 mmol) von 3a in 30 ml Ethanol bei 0°C zugegeben. Diese Mischung wurde dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die nach Verdampfung des Lösungsmittels erhaltene feste Substanz wurde mit einer 3 M Na₂CO₃-Lösung verrieben. Das gewünschte hellbraune Produkt (3b) wurde dann mit Dichlormethan extrahiert. Ausbeute: 382 mg (76%)
¹H-NMR (CDCl₃): δ, 8,15d, 8,05d, 7,81d, 7,71t, 7,54t, 7,35d, 6,84br, 4,21s, 3,50q, 3,02t, 2,02s
Verbindung 3c
Eine Lösung von 200 mg 3b (0,82 mmol) in 20 ml 2 N HCl wurde für 6 Stunden unter Rückfluss gekocht. Das nach Verdampfung des Lösungsmittel erhaltene Öl wurde mit Ethanol gewaschen und ergab das gewünschte hellbraune feste Hydrochloridsalz 3c. Ausbeute: 203 mg (90%)
¹H-NMR (D₂O): δ, 8,40d, 7,95t, 7,76t, 7,59t, 7,49d, 4,57s, 3,46t, 3,34t
N-BOC-diethylentriamin (4)
Eine Lösung von 500 mg (2,29 mmol) Di-tert-butyldicarbonat ((BOC)₂O) in 30 ml Dioxan wurde langsam zu einer Lösung von 1,49 ml (1,42 g) (13,74 mmol) Diethylentriamin in 80 ml Dioxan bei 10°C zugegeben. Die Mischung wurde dann 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das gewünschte Produkt schlug sich als ein Öl nieder, das dann vom Rest der Lösung abgetrennt wurde, in Wasser gelöst wurde, filtriert wurde und mit Dichlormethan extrahiert wurde und schließlich das gewünschte Produkt als hellgelbes Öl ergab. Ausbeute: 260 mg (56%).
¹H-NMR (CDCl₃): δ, 5,15br, 3,25br, 3,18t, 2,77t, 2,69t, 2,63t, 1,76br, 1,41s, 1,19t
Verbindung 5a
Eine Mischung von 140 mg Chinolin-2-carbaldehyd (2) (0,89 mmol) und 200 mg N-BOC-diethylentriamin (0,99 mmol) in 30 ml Methanol wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der nach Verdampfung des Lösungsmittels erhaltene Feststoff wurde dann mit Wasser gewaschen und ergab das gewünschte hellbraune Produkt. Ausbeute: 304 mg (94%).
¹H-NMR (DMSO): δ, 8,32d, 7,97t, 7,73t, 7,71d, 7,57t, 6,65t, 4,33s, 3,08t, 2,97t, 2,85t, 1,28s, 1,09t
Verbindung 5b
Eine Lösung von 41 mg (1,08 mmol) NaBH₄ in 10 ml Ethanol wurde langsam während 2 Stunden zu einer gerührten Lösung von 148 mg (0,43 mmol) 5a in 30 ml Ethanol bei 0°C zugegeben. Diese Mischung wurden dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das nach Verdampfung des Lösungsmittels erhaltene feste braune Öl wurde mit einer 3 M Na₂CO₃-Lösung verrieben. Das gewünschte hellbraune Produkt (3b) wurde dann mit Dichlormethan extrahiert. Ausbeute: 136 mg (92%)
¹H-NMR (DMSO): δ, 8,29d, 7,94d, 7,92d, 7,71t, 7,61d, 7,54t, 6,71t, 3,95s, 2,96q, 2,59s, 1,33s, 1,22t
Verbindung 5c
Eine Lösung von 100 mg 5b (0,29 mmol) in 3 N HCl wurde für 2 Stunden unter Rückfluss gekocht. Das nach Verdampfung des Lösungsmittels erhaltene Öl wurde mit Diethylether gewaschen und gab das gewünschte hellbraune feste Hydrochloridsalz 5c. Ausbeute: 102 mg (94%)
¹H-NMR (D₂O): δ, 8,44d, 7,95t, 7,77t, 7,6t, 7,51d, 4,51s, 3,44s, 3,34t, 3,27t
2. Synthese von trifunktionalen Modellinterkalatoren
Trifunktionale Modellinterkalatoren wurden ausgehend von 5a und 3b von Teil 1 oben hergestellt. 8 zeigt das spezielle Reaktionsschema.
1. Alkylierung eines Amins mit Bromessigsäureethylester
Amin I (7; 547 mg, 2,83 mmol) und Triethylenamin (0,510 ml, 3,08 mmol) wurden in Methanol gerührt. Die Lösung wurde auf 0°C gekühlt, und Ethylbromacetat II (0,313 ml, 2,83 mmol) wurde innerhalb von 5 Minuten tropfenweise zugegeben. Nach Rühren der Lösung bei Raumtemperatur für 18 Stunden wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in Dichlormethan (50 ml) gelöst und dreimal mit Wasser (20 ml) gewaschen. Die wässrigen Phasen wurden zweimal mit Dichlormethan (50 ml) gewaschen. Die organischen Phasen wurden über MgSO₄ getrocknet, filtriert, und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, so dass III als gelbes Öl erhalten wurde. Ausbeute: 590 mg (2,11 mmol, 74,6%).
DC (Kieselgel, Ethanol) R_F 0,4
¹H NMR (200 MHz, d₆-Aceton) δ = 8,44 (m, 1H, Picolin), 7,65 (m, 1H, Picolin), 7,45 (m, 1H, Picolin), 7,21 (m, 1H, Picolin), 4,12 (q, 2H, J = 7,2 Hz, CH₂ Ester), 3,94 (s, 2H, CH₂), 3,64 (s, 2H, CH₂), 3,32 (m, 2H, N-CH₂-CH₂-N), 2,82 (m, 2H, N-CH₂-CH₂-N), 1,84 (s, 3H, CH₃-CO), 1,21 (t, 3H, J = 7,2 Hz, CH₃ Ester).
2. Entschützung
Amin III (576 mg, 1,94 mmol) wurde in Ethanol (4 ml) und Wasser (8 ml) gelöst. 2 M NaOH (2 ml) wurde zugegeben, und die Lösung wurde bei Raumtemperatur 1,5 Stunden gerührt. Analytische HPLC zeigten einen einzigen Peak, was darauf hindeutet, dass die Estergruppe quantitativ gespalten wurde.
Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, der Rückstand wurde in Wasser (8 ml) gelöst, und 2 N HCl (1 ml) wurde zugegeben, um die Lösung zu neutralisieren. 33%-ige HCl (1,0 ml) wurde zugegeben, und die Reaktionsmischung wurde bei 90°C 48 Stunden gerührt. NaHCO₃ wurde zugegeben, um die Reaktionsmischung zu neutralisieren, das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde mit Ethanol gewaschen. Entfernen des Lösungsmittels ergab das entschützte Produkt V als gelbes Öl. Ausbeute: 352 mmol (1,68 mmol, 68,6%).
¹H NMR (300 MHz, D₂O) δ = 8,44 (m, 1H, Picolin), 7,85 (m, 1H, Picolin), 7,45 (m, 1H, Picolin), 7,39 (m, 1H, Picolin), 3,78 (s, 2H, CH₂), 3,35 (m, 2H, N-CH₂-CH₂-N), 3,22 (s, 2H, CH₂), 3,32), 2,79 (m, 2H, N-CH₂-CH₂-N).
BEISPIEL 2
Strangbruch mit Molekülen der Erfindung in einem Modellsystem
1. Einführung
1.1 Die Verwendung von Plasmiden
Um die Fähigkeit der interkalierenden Komplexe mit ^99mTc zum Hervorrufen von DNA-Strangbrüchen zu untersuchen, wurden Plasmide als Modellsystem verwendet. Plasmide sind sehr geeignet, da elektrophoretische Analysen es ermöglichen, zwischen doppelten und einfachen Strangbrüchen zu unterscheiden. Außerdem können großen Mengen von Plasmiden sehr einfach unter Verwendung zellbiologischer Verfahren hergestellt werden.
Ein Plasmid ist ein ringförmiges, doppelsträngiges DNA-Molekül, wobei die Doppelhelixachse zu einer Superhelix verdrillt sein kann. Diese Form der Superhelix wird als Typ I beschrieben. Dieser Typ kann seine Superhelixstruktur durch einen einzelnen Strangbruch verlieren und liegt dann als entspannte ringförmige DNA (Typ II) vor. Durch einen doppelten Strangbruch beider Typen wird eine lineare Form (Typ III) des Plasmids erzeugt. 4 zeigt ein Beispiel für die Struktur dieser drei DNA-Typen.
Da diese drei DNA-Typen unterschiedliche Strukturen aufweisen, können sie aufgrund ihrer Größe und besonders ihrer Form durch Elektrophorese auf Agarosegel gut getrennt werden. Die zu untersuchende Mischung (Typ I–III nach dem Experiment) wird auf ein Agarosegel geladen. Dann wird eine Konstantspannung angelegt, und die negativ geladenen DNA-Fragmente wandern in Richtung der Kathode. Je größer die Form des Fragments, desto langsamer ist die Wanderung entlang des Gels. DNA des Typs I (am kompaktesten) bewegt sich am schnellsten, Typ II am langsamsten. Das Gel wird dann in eine Lösung gegeben, die sehr wenig Ethidiumbromid enthält. Die DNA-Fragmente werden durch Interkalation und Bestrahlung mit UV-Licht von 300 nm, das rot-orangefarbige Fluoreszenz (590 nm) zeigt, sichtbar gemacht. Dieses Verfahren ist so empfindlich, dass weniger als 5 ng DNA pro Bande detektiert werden kann. In der fotografischen Aufnahme der Gele in 5 ist die Wanderungsrichtung vom oberen Ende nach unten.
1.2 Herstellung der Plasmide
Das Plasmid Bluescript KS^® mit einer Größe von 2958 Basenpaaren wurde gemäß dem Standardprotokoll des Unternehmens QIAGEN hergestellt. Üblicherweise liegt dieses Plasmid in der Superhelixform (Typ I) vor. Mit dem Restriktionsenzym KpnI kann die linearisierte Form der Plasmid-DNA (Typ III) hergestellt werden. Ein einzelner Strangbruch, der zur entspannten ringförmigen Form des Plasmids (Typ II) führt, kann durch das Enzym DNAase I induziert werden. 5, rechte Spur, zeigt die Elektrophorese auf Agarosegel einer Mischung dieser drei Typen von DNA. Für die Elektrophorese ist eine Markierungssubstanz mit mehreren Größen von DNA-Stücken als Vergleichssubstanz verwendet worden (linke Spur).
Wie durch die drei Banden der rechten Spur gezeigt wird, wurden die drei Typen von DNA eindeutig getrennt und können nach Visualisierung unterschieden werden. Wenn Einzel- oder Doppelstrangbrüche auf Konversionselektronen zurückzuführen sind, sollten sie durch dieses Verfahren leicht detektierbar sein.
2. Untersuchung der Fähigkeit von [^99mTc(P₁)(Teta)(CO)₃] zur Erzeugung von Strangbrüchen
5 μl einer Lösung, die ungefähr 0,3 mCi/ml von [^99mTc(P₁)(Teta)(CO)₃] und 100 ng von Typ-I-Plasmid (~ = 3·10^–5 M in Basenpaaren) enthielt, wurde 18 Stunden stehen gelassen. Dann erfolgte eine Elektrophorese dieser Mischung und der drei Vergleichssubstanzen (6).
Es eindeutig sichtbar, dass die Plasmide in der Messlösung (Spur 3) langsamer wandern als in der Vergleichslösung. Der Grund für diese Beobachtung liegt darin, dass eine kleine Änderung der Struktur der Plasmide vermutlich durch Interkalation des Komplexes in dem Doppelstrang hervorgerufen wird. Diese Veränderung in der Tertiärstruktur des Plasmids erlaubte dann eine bessere Interkalation des Ethidiumbromids, so dass sich die stärkere Intensivität der Bande der Probelösung erklärt.
Außerdem ist im Vergleich mit der negativen Vergleichslösung (Spur 4) offensichtlich, dass eine oder möglicherweise zwei neue Banden (Pfeile) in der Spur der mit dem ^99mTc-Komplex behandelten Lösung erschienen. Die stärkere dieser beiden Banden entspricht ungefähr der Position von Typ II der Bande der Vergleichslösung in Spur 2, welche die drei Typen enthielt. Dies bedeutet, dass der Komplex einen Einzelstrangbruch im Plasmid hervorgerufen hat.

Claims

Moleküle zur Behandlung oder Diagnose von Tumoren and bösartigen Tumoren, die eine interkalierende Gruppe, die an eine radioaktive [M(CO)₃]⁺-Gruppe koordiniert ist, wobei M ein Metall ausgewählt aus ^99mTc, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re und Mn ist, und ein Tumor suchendes Biomolekül umfassen, das durch eine direkte Bindung mit einer Koordinationsstelle an dem Metal verbunden ist.
Moleküle gemäß Anspruch 1, wobei das Biomolekül ausgewählt ist, aus der Gruppe bestehend aus Somatostatin-, Neurotensin-, Bombesin-rezeptorbindenden Molekülen, Antikörpern, Penetratinen und Molekülen, die an GPIIb/IIIa-Rezeptoren binden.
Moleküle gemäß Ansprüchen 1 und 2, wobei das interkalierende Mittel ein aromatisches Molekül mit einer interkalativen Bindungsaffinität für doppelsträngige DNA ist.
Moleküle gemäß Anspruch 3, wobei das interkalierende Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Acridin, Porphyrin, Ellipticin, Phenantrolin, Carbazol, Benzimidazol oder Verbindungen mit bekannter Zytostatischer Aktivität (Antibiotika) aus der Klasse der Tetracycline (Anthracycline), wie etwa Daunorubicin, Epirubicin oder Mixoxantron.
Moleküle gemäß Ansprüchen 1 bis 4, welche die in 2 gezeigte allgemeine Strukturformel aufweisen.
Moleküle gemäß Ansprüchen 1 bis 5, die eine der in 1 gezeigten Strukturen auf weisen.
Moleküle gemäß Ansprüchen 1 bis 6 für die Verwendung als oder in einem therapeutischen oder diagnostischen Mittel zur Behandlung oder Diagnose von Tumoren oder bösartigen Tumoren.
Verwendung von Molekülen gemäß Ansprüchen 1 bis 6 für die Herstellung eines therapeutischen oder diagnostischen Mittels zur Behandlung oder Diagnose von Krebstumoren oder bösartigen Tumoren.
Therapeutische Zusammensetzung, die eines oder mehrere der Moleküle gemäß Ansprüchen 1 bis 6 und einen oder mehrere geeignete Hilfsstoffe umfasst.