DE60012318T2

DE60012318T2 - pH ABHÄNGIGE IONTAUSCHERMATRIX UND ANWENDUNGSVERFAHREN IN DER ISOLIERUNG VON NUKLEINSÄUREN

Info

Publication number: DE60012318T2
Application number: DE60012318T
Authority: DE
Inventors: E. Craig SMITH; L. Diana HOLMES; J. Daniel SIMPSON; Jehoshua Katzhendler; M. Rex BITNER; C. Josephine GROSCH
Original assignee: Promega Corp
Current assignee: Promega Corp
Priority date: 1999-05-14
Filing date: 2000-05-05
Publication date: 2005-08-04
Anticipated expiration: 2020-05-06
Also published as: EP1179057B1; ATE271605T1; WO2000069872A2; DE60012318D1; AU772046B2; AU5126100A; JP2002543979A; US6310199B1; WO2000069872A3; US6806362B2; CA2372054A1; JP4377550B2; US20010014650A1; EP1179057A2

Description

Technisches Gebiet
Diese Erfindung betrifft im allgemeinen Materialien und Verfahren zur Isolierung einer Zielnukleinsäure, wie einer Plasmid-DNA, chromosomalen DNA, Gesamt-RNA, mRNA oder RNA/DNA-Hybride aus Verunreinigungen, wie Proteinen, Fetten, Zelltrümmern und Nukleinsäuren ohne Ziel. Diese Erfindung betrifft insbesondere pH-abhängige Ionenaustauschermatrixen mit der Fähigkeit, eine Zielnukleinsäure in der Gegenwart einer Lösung bei einem ersten pH zu adsorbieren und die Zielnukleinsäure in der Gegenwart einer zweiten Lösung bei einem zweiten pH, der sich von dem ersten pH unterscheidet, zu desorbieren. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung und Verwendung solcher pH-abhängiger Ionenaustauschermatrixen zum Isolieren von Zielnukleinsäure.
Hintergrund der Erfindung
Viele molekularbiologische Verfahren, wie Umkehrtranskription, Klonierung, Restriktionsanalyse, Amplifizierung und Sequenzierung erfordern, dass die in den Verfahren verwendeten Nukleinsäuren im wesentlichen frei von Verunreinigungen sind, die mit den Abläufen und Analyseverfahren differieren. Solche Verunreinigungen umfassen im allgemeinen Substanzen, die chemische Reaktionen blockieren oder inhibieren, (z.B. Substanzen, Nukleinsäurehybridisierungen, enzymatisch katalysierte Reaktionen und andere Reaktionstypen, die bei molekularbiologischen Verfahren verwendet werden, die blockieren oder inhibieren), Substanzen, die den Abbau oder die Depolymerisierung einer Nukleinsäure oder eines anderen biologischen Materials von Interesse katalysieren, oder Substanzen, die den Nachweis der Nukleinsäure von Interesse blockieren oder maskieren. Substanzen dieses letzten Typs können blockieren oder maskieren, indem sie einen "Hintergrund" liefern, der für die Gegenwart einer Menge einer Nukleinsäure von Interesse in einer Probe bezeichnend ist (auch als "Zielnukleinsäure" bezeichnet), wenn die Nukleinsäure von Interesse in der Tat nicht in der Probe vorhanden ist. Verunreinigungen umfassen auch makromolekulare Substanzen aus dem in-vivo- oder in-vitro-Medium, aus dem eine Zielnukleinsäure isoliert wird, makromolekulare Substanzen wie Enzyme, andere Proteintypen, Polysaccharide oder Polynukleotide sowie Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht, wie Lipide, Enzyminhibitoren mit niedrigem Molekulargewicht, Oligonukleotide oder Nukleinsäuren ohne Ziel. Verunreinigungen können außerdem in ein biologisches Zielmaterial aus Chemikalien oder anderen Materialien, die verwendet werden, um das Material aus anderen Substanzen zu isolieren, eingeführt werden. Geläufige Verunreinigungen dieses letzten Typs sind Spurenmetalle, Farbstoffe und organische Lösungsmittel.
Der Erhalt einer im wesentlichen von Verunreinigungen freien Ziel-Aminosäure für molekularbiologische Anwendungen ist durch die komplexen Systeme, in denen sich die Zielnukleinsäure normalerweise befindet, kompliziert. Diese Systeme, z.B. Zellen aus Geweben, Zellen aus Körperflüssigkeiten, wie Blut, Lymphe, Milch, Urin, Stuhlgang, Samen oder dergleichen, Zellen in Kultur, Agarose oder Polyacrylamidgelen oder Lösungen, in denen die Zielnukleinsäure-Amplifizierung durchgeführt worden ist, umfassen gewöhnlich signifikante Mengen an Verunreinigungen, von denen die Ziel-Aminosäure von Interesse gereinigt werden muss, bevor sie in molekularbiologischen Verfahren verwendet wird.
Die zuerst entwickelten Verfahren, die bei der Isolierung von Zielnukleinsäure aus solchen komplexen Systemen verwendet wurden, umfassen gewöhnlich mehrere organische Extraktions- und Ausfällungsschritte. Gefährliche Chemikalien, wie Chloroform und Phenol oder Mischungen davon wurden in den meisten solcher Verfahren verwendet. Geschlossene, kreisförmige Nukleinsäuremoleküle, wie Plasmid-DNA, wurde gewöhnlich durch weitere Ultrazentrifugierung aus Plasmid-DNA in der Gegenwart von Cäsiumchlorid und Ethidiumbromid isoliert. Siehe z.B. Molecular Cloning, ed. by Sambrook et al. (1989), Seiten 1.42-1.50. Ethidiumbromid ist ein Neurotoxin. Die Entfernung von sowohl Ethidiumbromid als auch Cäsiumchlorid aus der resultierenden Plasmid-DNA-Bande, die durch Ultrazentrifugierung erhalten wurde, war erforderlich, bevor die DNA in nachfolgenden Verfahren verwendet werden konnte, wie bei der Sequenzierung, Transfektion, Restriktionsanalyse oder der Polymerase-Kettenreaktion.
In den letzten Jahren wurden verschiedene unterschiedliche Matrixen entwickelt, die bei der Isolierung von Nukleinsäuren auf komplexen biologischen Materialien eingesetzt werden. Zum Beispiel wurden Matrixen entwickelt zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Ionenaustauscher-Chromatographie (z.B. J. of Chromatog. 508:73 (1990); Nucl. Acids Research 21(12):2913-2915 (1993); US-Patent Nrn. 5,856,192; 5,82,988; 5,660,984 und 4,699,717) durch Umkehrphase (z.B. Hirbayashi et al., J. of Chromatog. 722:135-142 (1996); US-Patent Nr. 5,057,426, durch Affinitätschromatographie (z.B. US-Patent Nr. 5,712,383 und PolyATract^® mRNA Purification System (Promega Corp., Madison, WI; siehe Promega's Technical Manual Nr. TM031) und durch Matrixen, die eine Kombination der obigen Möglichkeiten umfassen (siehe z.B. US-Patent Nr. 5,652,348; J. Chromatography 270:117-126 (1983)).
Einer der ersten Festphasen, die entwickelt wurde, um bei der Isolierung von Nukleinsäuren eingesetzt zu werden, war ein spezialisiertes Harz aus porösen Kieselgelteilchen, das bei der Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) verwendet werden kann. Die Oberfläche der porösen Kieselgelteilchen wurde mit Anionenaustauschern funktionalisiert, die sich mit Plasmid-DNA unter bestimmten Salz- und pH-Bedingungen austauschen können. Siehe z.B. US-Patent Nrn. 4,699,717 und 5,057,426. Machrey-Nagel Co. (Düren, Deutschland) war eine der ersten Firmen, die HPLC-Säulen bereitstellten, die mit solchen Kieselgel-Anionenaustauscherteilchen gepackt waren und verkauft solche Säulen bis heute. Siehe z.B. Informationen über NUCLEOGEN^® 4000-7DEAE in der Produktinformation, die von der Machrey-Nagel Internetseite vom 6.12.98 unter http://www.machrey-nagel.com herunterzuladen ist. Jede dieser Säulen wurde entworfen, so dass daran gebundene Plasmid-DNA in einer wässrigen Lösung eluiert wird, die eine hohe Konzentration an stark korrodierendem Salz enthält (z.B. Plasmid-DNA wurde von der NUCLEOGEN^® 4000-7DEAE-Säule in 6 M Harnstoff eluiert). Jede dieser Säulen musste gründlich zwischen jedem Isolationsverfahren gewaschen werden, um das korrodierende Salz und Verunreinigungen, die mit der DNA an die Säule gebunden sind, aus dem System zu entfernen. Die davon eluierte Nukleinsäurelösung musste auch weiteren Verfahrensschritten unterzogen werden, um das korrodierende Salz daraus zu entfernen, bevor sie in molekularbiologischen Standardtechniken, wie der Klonierung, Transformierung, dem Verdau mit Restriktionsenzymen oder der Amplifizierung verwendet werden konnte.
Verschiedene Festphasen-Trennungssysteme auf Siliziumdioxidbasis sind seit den oben beschriebenen frühen HPLC-Systemen entwickelt worden. (Siehe z.B. das Kieselgel und die Glasmischung zum Isolieren von Nukleinsäuren gemäß dem US-Patent Nr. 5,658,548 und der poröse Träger mit der Silan-gebundenen Phase der gemäß dem US-Patent Nr. 4,767,670 zum Isolieren von Nukleotiden verwendet wird.) Moderne Systeme auf Siliziumdioxidbasis setzen Glas mit kontrollierten Poren, Filter, die in Siliziumdioxidteilchen eingebettet sind, Kieselgelteilchen, Harze, umfassend Siliziumdioxid in der Form von Diatomeenerde, Glasfasern oder Mischungen davon ein. Jedes moderne Festphasen-Trennungssystem auf Siliziumdioxidbasis ist so konstruiert, dass es Nukleinsäurematerialien reversibel bindet, wenn es mit einem Medium in Kontakt gebracht wird, das solche Materialien in der Gegenwart von chaotropischen Mitteln enthält. Solche Festphasen sind so entworfen, dass sie an das Nukleinsäurematerial gebunden bleiben, wenn die Festphase einer äußeren Kraft ausgesetzt wird, wie der Zentrifugierung oder Vakuumfiltrierung, um die Matrix und das Nukleinsäurematerial, das daran gebunden ist, von den verbliebenen Komponenten des Mediums zu trennen. Das Nukleinsäurematerial wird anschließend aus der Festphase eluiert, indem die Festphase einer Elutionslösung, wie Wasser oder einem Elutionspuffer, ausgesetzt wird. Zahlreiche kommerzielle Quellen bieten Harz auf Siliziumdioxidbasis an, die entworfen wurden, um in Zentrifugierungs- und/oder Filtrations-Isolierungssystemen verwendet zu werden. Siehe z.B. Wizard^® DNA purification systems products von Promega Corporation (Madison, Wisconsin, U.S.A.); oder QiaPrep^® DNA-Reinigungssysteme von Quiagen Corp. (Charsworth, Kalifornien, USA).
Magnetisch ansprechbare Teilchen, die zuvor zum Isolieren und Reinigungen von Polypeptidmolekülen wie Proteinen oder Antikörpern verwendet wurden, sind ebenfalls für die Verwendung als Festphasen bei der Isolierung von Nukleinsäuren entwickelt worden. Verschiedene unterschiedliche Typen magnetisch ansprechbarer Teilchen, die zur Isolierung solcher Materialien entworfen wurden, sind in der Literatur beschrieben und viele dieser Teilchentypen sind im Handel erhältlich. Solche Teilchen lassen sich im allgemeinen zwei Kategorien zuordnen, in solche, die so konstruiert wurden, um direkt Nukleinsäurematerialien reversibel zu binden, und solche, die derart konstruiert wurden, um Nukleinsäurematerialien über einen Vermittler reversibel zu binden. Als Beispiel von Teilchen des ersten Typs siehe poröse Teilchen auf Siliziumbasis, die entworfen wurden, um direkt an DNA reversibel zu binden, wie MagneSil^TM-Teilchen von Promega oder BioMag^® magnetische Teilchen von PerSeptive Biosystems. Als Beispiele von Teilchen und Systemen des zweiten Typs, die entworfen wurden, um einen bestimmten Nukleinsäuretyp (mRNA) zu binden, siehe das PolyATract^® Series 9600^TM mRNA Isolierungssystem von Promega Corporation (Madison, Wisconsin, USA) oder die ProActive^®-Linie von Streptavidin-beschichteten Mikroteilchen von Bangs Laboratories (Carmel, Indiana, USA). Beide dieser letzteren beiden Systeme setzen magnetisch ansprechbare Teilchen mit Avidin-Untereinheiten ein, die kovalent daran gebunden sind und Streptavidin mit einem Oligo-dT-Anteil, der kovalent daran gebunden ist. Die Streptavidin-Oligo-dT-Moleküle wirken als Vermittler, die mit dem Poly A-Ende der mRNA-Moleküle hybridisieren, wenn sie damit in Kontakt gebracht werden, woraufhin sie über eine trennbare Streptavidin-Avidinbindung an die Teilchen binden.
Die indirekten magnetischen Bindungssysteme zur Isolierung oder Trennung von Nukleinsäuren erfordern alle mindestens drei Komponenten, d.h. magnetische Teilchen, einen Vermittler und ein Medium, das das Nukleinsäurematerial von Interesse enthält. Die Vermittler-/Nukleinsäure-Hybridisierungsreaktion und Vermittler-/Teilchen-Bindungsreaktion erfordert häufig eine unterschiedliche Lösung und/oder Temperaturreaktionsbedingungen. Jede zusätzliche, bei dem Nukleinsäure-Isolierungsverfahren verwendete Komponente oder Lösung erhöht das Risiko der Verunreinigung des isolierten Endproduktes durch Nukleasen, Metalle und andere schädliche Substanzen.
Verschiedene Typen von magnetisch ansprechbaren Teilchen auf Siliziumdioxidbasis sind als Festphasen entwickelt worden, um in direkten oder indirekten Nukleinsäure-Bindungsisolierungsverfahren verwendet zu werden. Ein solcher Teilchentyp ist ein magnetisch ansprechbares Glaskügelchen, bevorzugt mit einer kontrollierten Porengröße. Siehe z.B. Magnetic Porous Glass (MPG) Teilchen von CPG, Inc. (Lincoln Park, New Jersey, USA) oder poröse magnetische Glasteilchen, die in den US-Patenten Nrn. 4,395,271; 4,233,169 oder 4,297,337 beschrieben sind. Nukleinsäurematerial tendiert dazu, sehr fest an Glas zu binden, so dass es schwierig sein kann, es, wenn es einmal gebunden ist, zu entfernen. Daher neigen Elutionswirksamkeiten magnetischer Glasteilchen dazu, niedrig zu sein im Vergleich zu Elutionswirksamkeiten von Teilchen, die geringere Mengen an Nukleinsäure-Bindungsmaterial enthalten, wie bei Siliziumdioxid.
Ein anderer Typ eines magnetisch ansprechbaren Teilchen, das entworfen wurde, um als Festphase bei der direkten Bindung und Isolierung von Nukleinsäuren, insbesondere DNA, verwendet zu werden, ist ein Teilchen, das sich zusammensetzt aus Agarose, eingebettet mit kleineren ferromagnetischen Teilchen und beschichtet mit Glas. Siehe z.B. US-Patent 5,395,498. Ein dritter Typ eines magnetisch ansprechbaren Teilchens, das zur direkten Bindung und Isolierung von Nukleinsäuren entworfen wurde, wird durch Einführung von magnetischen Teilchen in die Matrix von polymeren Siliziumdioxidverbindungen hergestellt. Siehe z.B. Deutsches Patent Nr. DE 43 07 262 A1 . Die letzten beiden Typen von magnetischen Teilchen, das Agaroseteilchen und die polymere Siliziumdioxidmatrix neigen dazu, Eisen in ein Medium unter Bedingungen, die zur Bindung von Nukleinsäurematerialien direkt an solche magnetische Teilchen erforderlich ist, herauszulösen. Es ist ebenfalls schwierig, solche Teilchen mit einer ausreichend gleichförmigen und konzentrierten magnetischen Kapazität herzustellen, um schnelle und effiziente Isolierung von daran gebundenen Nukleinsäurematerialien sicherzustellen.
Nukleinsäuren-Isolierungssysteme mit Festphasen auf Basis von Siliziumdioxid, entweder direkte oder indirekte Bindung auf magnetischer oder nicht-magnetischer oder konfigurierter Basis, sind schnell und einfach zu verwenden und erfordern nicht die Verwendung von korrodierenden oder schädlichen Chemikalien. Jedoch sind sie zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Verunreinigung, wie Endotoxinen, die dazu neigen, an solche festen Träger unter den gleichen Bedingungen wie Nukleinsäuren zu binden und eluieren, nicht wirksam. Siehe z.B. Cotten, Matt et al., Gene Therapy (1994) 1:239-246.
Einige Nuklein-Isolierungsysysteme sind entwickelt worden, bei denen eine Nukleinsäurelösung, die Proteine enthält, mit Proteasen vorbehandelt wird, um mindestens einige der darin enthaltenen Proteine zu verdauen, bevor die Nukleinsäure unter Verwendung eines Festträgers auf Siliziumdioxidbasis vom oben beschriebenen Typ isoliert wird. Siehe z.B. QiaAmp^TM Blood Kit von QUIAGEN Inc. (Santa Clarita, Californien), das Protease eingesetzt und Wizard^® Plus SV Minipreps DNA Reinigungssystem, von Promega Corp. (Madison, Wisconsin), das alkalische Protease einsetzt. Solche Vorbehandlungssysteme erfordern jedoch die Einführung einer Verunreinigung in eine Mischung, um eine andere Verunreinigung zu verdauen. "Übertragbare" Proteasen können die Einsetzbarkeit von Nukleinsäuren, die unter Verwendung solcher modifizierten Systeme auf Siliziumdioxidbasis isoliert werden, einschränken, zumindest derart, dass in Nukleinsäureproben, die mit den Proteinen verunreinigt sind, Proteasen zum Verdau eingeführt werden. Bei geeigneten Lösungsbedingungen verdauen Proteasen in einer Nukleinsäurelösung jedes Protein, das in die Lösung eingeführt wird, einschließlich Enzyme, die eingeführt werden, um die darin enthaltene Nukleinsäure zu modifizieren, schneiden oder transkribieren, zur weiteren Verarbeitung oder Analyse. Die Proteasezugabe, Inkubierung und die Entfernungsschritte erhöhen die Kosten der Nukleinsäureisolierung, benötigen Zeit und Geld im Vergleich zu Isolierungssystemen mit keinen solchen zusätzlichen Schritten.
In all den oben beschriebenen Festphasensystemen weist jede darin verwendete Festphase eine im wesentlichen einheitliche Oberflächenzusammensetzung auf, die entworfen wurde, um eine Nukleinsäure von Interesse zu binden, in der Form einer Siliziumdioxid- oder Kieselgeloberfläche oder in der Form eines Kieselgels oder Polymeroberfläche, die mit chemischen Gruppen, die anionische Austauscheraktivitäten entfalten, modifiziert sind. Bimodale und multimodale Systeme sind entwickelt worden, wie Systeme: (1) bei denen multiple Säulen verwendet werden, wobei jede eine Festphase enthält, die mit einer unterschiedlichen chemischen Gruppe von den anderen Säulen in dem System enthält (z.B. Wheatley J. B., J. Chromatogr. (1992) 603:273); (2) bei denen eine einzelne Säule mit einer einzelnen Festphase verwendet wird mit mindestens zwei unterschiedlichen chemischen Gruppen (z.B. Patent 80; Little, E. L. et al., Anal. Chem. (1991) 63: 33); oder (3) bei denen zwei unterschiedliche Festphasen in der gleichen Säule eingesetzt werden, wobei die beiden Festphasen voneinander innerhalb der Säule durch feste poröse Unterteiler getrennt sind (z.B. US-Patent Nr. 5,660,984). Jede der chemischen Gruppen auf der Oberfläche der festen Träger in einer einzelnen Säule oder in Mehrfachsäulenmultimodalen Systemen wird konfiguriert, um an unterschiedliche Materialien in jedem gegebenen Substrat, das in das System eingeführt wird, zu binden. Nur wenige solcher bimodalen oder multimodalen Säulenchromatographiesysteme sind speziell für die Nukleinsäureisolierung entwickelt worden (siehe z.B. US-Patent Nr. 5,316,680). Oberflächengruppen-Kombinationen, die in solchen Festphasensystemen verwendet werden, umfassen Umkehr-, Ionenaustauscher-, Größenausschluss-, normale Phasen-, hydrophobe Wechselwirkung-, hydrophile Wechselwirkung- und Affinitätschromatographie. Solche Systeme werden so entworfen, dass nur eine der Oberflächengruppen an das Ziel, z.B. eine Nukleinsäure, bindet, wohingegen die andere Oberflächengruppe/Oberflächengruppen eine oder mehrere Komponenten in einer Mischung, die kein Ziel sind, binden oder daraus entfernen.
Bimodale oder multimodale Systeme sind bei weitem nicht einfache effiziente Alternativen zu herkömmlichen organischen Verfahren oder Harzverfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren, die oben beschrieben sind. Multisäulensysteme sind inhärent komplex laufen zu lassen, da jede Säule einen einzigartigen Satz an mobilen Phasenbedingungen erfordert, um die gewünschte Zielart oder die Art, die kein Ziel ist, die an die stationäre Festphase des Systems gebunden ist, zu binden und/oder freizusetzen. Komponenten, die kein Ziel sind, neigen dazu, benachbarte funktionale Gruppen zu blockieren, die konfiguriert sind, um die Zielkomponente zu binden, wodurch die allgemeine Ausbeute negativ beeinträchtigt wird. Darüber hinaus sind alle bimodalen oder multimodalen Systeme nur dahingehend entworfen, eine Zielkomponente von anderen Komponenten, für die funktionale Gruppen Affinität aufweisen, zu trennen.
Mindestens ein Festphasensystem mit Ionenaustausch auf gemischte Weise ist zur Verwendung bei der Isolierung von bestimmten Typen von Zielverbindungen, wie Proteinen oder Peptiden, aus einer wässrigen Lösung entwickelt worden. Siehe US-Patent Nr. 5,652,348 (hiernach "Burton et al. '348"), Säule 4, Zeilen 21 bis 25. Dieses System des Ionenaustausches auf gemischte Weise von Burton et al. '348 umfasst einen Festphasenträger mit ionisierbaren Liganden, der kovalent an die feste Trägermatrix gebunden ist. Der ionisierbare Ligand kann mit der Zielverbindung bei einem ersten pH wechselwirken und adsorbieren und bei einem zweiten pH die Zielverbindung freigeben oder desorbieren. Die ionisierbare Funktionalität ist "entweder bei dem zweiten pH weiter elektrostatisch geladen oder bei einer anderen Polarität geladen" (Burton et al. '348, Anspruch 1, Säule 25, Zeilen 46-50). Die von Burton et al. nm '348-Patent gelieferten Beispiele der Festphasensysteme mit Ionenaustausch auf gemischte Weise enthalten nur eine einzelne ionisierbare Funktionalität, einen Aminrest, der als Anionenaustauschergruppe beim ersten pH wirken kann. Die Konzentration der auf den festen Trägermatrixen vorhandenen ionisierbaren Liganden, die in Burton et al. '348 offenbart ist, ist ausreichend hoch, um "das Binden des Proteins sowohl bei hoher als auch niedriger Ionenstärke zu erlauben". Die einzige Ligandendichte, die als ausreichend hoch offenbart und beansprucht ist, um die Festphase des Ionenaustauschers in gemischter Form von Burton et al. '348 an Proteine bei hoher oder niedriger Ionenstärke zu binden, ist eine Ligandendichte, die "größer als der kleinere von zumindest ungefähr 1 mmol/g Trockengewicht Harz (greater than the smaller) oder mindestens ungefähr 150 μmol/ml Harz" (Säule 13, Zeilen 22-23, und Anspruch 1) ist. Das Ionenaustauschersystem der gemischten Form von Burton et al. '348 ist speziell zur Verwendung bei der Isolierung von Proteinen und Peptiden, Nicht-Nukleinsäuren oder Nukleotiden entworfen worden.
Materialien und Verfahren werden benötigt, die schnell, sicher und effizient Zielnukleinsäuren isolieren, die ausreichend frei von Verunreinigung sind, um in molekularbiologischen Verfahren eingesetzt zu werden. Die vorliegende Erfindung richtet sich auf den Bedarf an Materialien und Verfahren, die ein schnelles und effizientes Verfahren zur Isolierung von Zielnukleinsäuren aus einer Mischung von Zielnukleinsäuren und Verunreinigung einschließlich Lysaten aus gram-negativen Bakterien, bereitstellt, wodurch gereinigte Nukleinsäuren bereitgestellt werden, die bei einer Vielzahl von biologischen Anwendungen, einschließlich der Transfektion von kultivierten Zellen und in der in-vivo-Verabreichung von Nukleinsäuren an Organismen verwendet werden können.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Kurz gesagt umfasst die vorliegende Erfindung in einem Aspekt eine pH-abhängige Ionenaustauschermatrixe, die zur Verwendung bei der Isolierung einer Zielnukleinsäure entworfen wurde, indem die Zielnukleinsäure bei einem Absorptions-pH adsorbiert wird und die Zielnukleinsäure bei einem Desorptions-pH, der höher ist als der Absorptions-pH, freigesetzt wird.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform umfasst die pH-abhängige Ionenaustauschermatrixe einen festen Träger und eine Vielzahl von ersten Ionenaustauscherliganden, wobei jeder erste Ionenaustauscherligand umfasst:
eine Kappe, umfassend ein Amin mit einem pK von weniger als 9, wobei das Amin ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem primären, sekundären oder tertiären Amin;
einen Spacer, der kovalent mit der Kappe verbunden ist, wobei der Spacer eine Alkylkette aufweist mit einem Aminoterminus und eine Säuregruppe, welche kovalent mit der Spaceralkylgruppe verbunden ist, und
einen Linker, aufweisend eine Linker-Alkylgruppe, kovalent verbunden mit dem festen Träger an einem ersten Ende der Linker-Alkylgruppe und kovalent verbunden mit dem Aminoterminus des Spacers an dem zweiten Ende der Linker-Alkylgruppe.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung eine bimodale, pH-abhängige Ionenaustauschermatrix mit der gleichen Basisstruktur, wie die oben beschriebene Matrix, außer dass der Spacer keine Säuregruppe umfasst, wobei die bimodale, pH-abhängige Ionenaustauschermatrix außerdem eine Vielzahl von zweiten Ionenaustauscherliganden umfasst, die kovalent mit dem festen Träger verbunden sind. Jeder zweite Ionenaustauscherligand umfasst eine Alkylkette mit einem sauren Substituenten, der kovalent mit der Alkylkette verbunden ist.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Isolierung einer Zielnukleinsäure unter Verwendung einer pH-abhängigen Ionenaustauschermatrix, gemäß der Schritte umfassend:

(a) Bereitstellen einer pH-abhängigen Ionenaustauschermatrix,
(b) Vereinigen der Matrix mit einer Mischung, umfassend die Zielnukleinsäure und mindestens eine Verunreinigung,
(c) Inkubieren der Matrix und der Mischung bei einem Absorptions-pH, wobei die Zielnukleinsäure an die Matrix unter Bildung eines Komplexes adsorbiert wird,
(d) Trennung des Komplexes von der Mischung und
(e) Vereinigen des Komplexes mit einer Elutionslösung bei einem Desorptions-pH, wobei die Zielnukleinsäure aus dem Komplex desorbiert wird.

In wiederum einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer pH-abhängigen Ionenaustauschermatrix, umfassend die Schritte:

(a) Bereitstellen eines festen Trägers,
(b) Bereitstellen eines Linkers, umfassend eine Alkylkette mit einem ersten und einem zweiten Ende,
(c) Vereinigen des festen Trägers und des Linkers unter Bedingungen, bei welchen eine kovalente Bindung zwischen dem festen Träger und dem ersten Ende der Linker-Alkylkette gebildet wird, wobei ein Linker-modifizierter festen Träger hergestellt wird,
(d) Bereitstellen eines Alkylamins, umfassend eine Kappe, umfassend ein Amin mit einem pK von weniger als 9, wobei das Amin ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem primären, sekundären oder tertiären Amin, einem Spacer, welcher kovalent mit der Kappe verbunden ist, wobei der Spacer eine Spaceralkylkette mit einem Aminoterminus und einen sauren Substituenten, welcher kovalent mit der Spaceralkylkette verbunden ist, aufweist, und
(e) Vereinigen der Linker-modifizierten festen Phase mit dem Alkylamin unter Bedingungen, bei welchen eine kovalente Bindung zwischen dem Aminoterminus der Spaceralkylette des sauren aromatischen Amins und dem zweiten Ende des Linkers gebildet wird.

In wiederum einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer pH-abhängigen Ionenaustauschermatrix, gemäß den Schritten, umfassend:

(a) Bereitstellen eines festen Trägers,
(b) Bereitstellen eines ersten Ionenaustauscherliganden, umfassend: eine Kappe, aufweisend ein Amin mit einem pK von weniger als 9, wobei das Amin ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem primären, sekundären oder tertiären Amin, einen Spacer, welcher kovalent mit der Kappe verbunden ist, wobei der Spacer eine Spaceralkylkette mit einem Aminoterminus, einem sauren Substituenten, welcher kovalent mit der Spaceralkylkette verbunden ist, und eine Schutzgruppe, die kovalent mit dem sauren Substituenten verbunden ist, umfasst und einen Linker, aufweisend eine Linker-Alkylgruppe, die ein erstes und ein zweites Ende besitzt, wobei das zweite Ende kovalent mit dem Aminoterminus des Spacers verbunden ist,
(c) Vereinigen des festen Trägers und des ersten Ionenaustauscherliganden unter Bedingungen, bei welchen eine kovalente Bindung zwischen dem festen Träger und dem ersten Ende der Linker-Alkylkette gebildet wird,
(d) Entfernen der sauren Gruppe des ersten Liganden.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bereitstellung einer bimodalen pH-abhängigen Ionenaustauschermatrix nach den Schritten, umfassend:

(a) Bereitstellen eines festen Trägers,
(b) Bereitstellen eines ersten Ionenaustauscherliganden, umfassend: eine Kappe, umfassend ein Amin mit einem pK von weniger als 9, wobei das Amin ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus einem primären, sekundären oder tertiären Amin, einen Spacer, welcher mit der Kappe kovalent verbunden ist, wobei der Spacer eine Spaceralkylgruppe mit einem Aminoterminus aufweist, und einen Linker, der eine Linker-Alkylkette mit einem ersten Ende und einem zweiten Ende aufweist, wobei das zweite Ende mit dem Aminoterminus des Spacers kovalent verbunden ist, und
(c) Vereinigen des festen Trägers und des ersten Ionenaustauscherliganden unter Bedingungen, bei welchen eine kovalente Bindung zwischen dem festen Träger und dem ersten Ende der Linker-Alkylkette gebildet wird,
(d) Vereinigen des ersten Ionenaustauscher-modifizierten festen Trägers mit einem zweiten Ionenaustauscherliganden unter Bedingungen, welche die Bindung einer kovalenten Bindung zwischen dem festen Träger und einem Ende des zweiten Ionenaustauscherliganden ermöglicht, wobei der Ionenaustauscherligand eine zweite Alkylkette, einen sauren Substituenten, der kovalent mit der zweiten Alkylkette verbunden ist und eine Schutzgruppe, die mit dem sauren Substituenten verbunden ist, umfasst,
(e) Entfernen der Schutzgruppe von dem sauren Substituenten.

Die erfindungsgemäßen Verfahren und Materialien können verwendet werden, um Zielnukleinsäuren zu isolieren, einschließlich Plasmid-DNA, Gesamt-RNA, amplifizierte Nukleinsäuren und Genom-DNA, aber nicht darauf beschränkt, aus einer Vielzahl von Verunreinigungen, einschließlich aber nicht beschränkt auf Agarose und Komponenten von Bakterien, Tiergewebe, Blutzellen und Nukleinsäuren, die kein Ziel sind.
Die Anwendungen der Verfahren und Zusammensetzung der Erfindung, um Nukleinsäuren aus einer Vielzahl von unterschiedlichen Media zu isolieren, wird anhand der detaillierten nachfolgenden Beschreibung verständlich. Dem Fachmann ist klar, dass die detaillierte Beschreibung der Erfindung exemplarisch ist und nicht den erfindungsgemäßen Umfang einschränkt.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1 stellt ein Verfahren zur Herstellung einer pH-abhängigen Ionenaustauschermatrix dar, wobei eine Kappe, umfassend ein Amin mit einem pK von weniger als ungefähr 9, kovalent an einen festen Träger über einen Glycidyllinker gebunden ist.
2 stellt ein Verfahren zur Herstellung einer pH-abhängigen Ionenaustauschermatrix dar, wobei ein Aminoalkylspacer und eine Kappe, umfassend einen aromatischen Kohlenwasserstoffring mit einem Aminmitglied, an einen festen Träger über eine Harnstoffverbindung gebunden wird.
3 stellt ein Verfahren zur Herstellung einer bimodalen pH-abhängigen Ionenaustauschermatrix dar.
4 ist eine Reproduktion einer Fotografie aus amplifizierter DNA, die mit Magnesil^TM und mit pH-abhängigen magnetischen Kieselgelteilchen, wie in Beispiel 12 beschrieben, isoliert ist, anschließend über Gelelektrophorese fraktioniert und mit Ethidiumbromid gefärbt ist.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Der Ausdruck "Alkylkette", wie er hier verwendet wird, betrifft ein geradkettiges Alkan, wahlweise mit mindestens einem Sauerstoff-, Stickstoff- oder Schwefelatom substituiert.
Der Ausdruck "pH-abhängige Ionenaustauschermatrix", wie er hier verwendet wird, betrifft eine Matrix aus einem festen Träger und einer Vielzahl von Liganden, die kovalent daran gebunden sind, wobei mindestens ein Ligand einen sauren Anteil umfasst und der gleiche oder ein unterschiedlicher Ligand kovalent an die gleiche Matrix gebunden ist, umfassend ein Amin mit einem pK von weniger als 9, wobei die Matrix eine Kapazität aufweist, um eine Zielaminosäure bei einem ersten pH zu absorbieren, und die Zielaminosäure bei einem Desproptions-pH, der höher ist als der erste pH, zu desorbieren.
Der Ausdruck "fester Träger", wie er hier im chromatischen Sinn verwendet wird, betrifft eine unlösliche, im Allgemeinen feste Matrix oder eine stationäre Phase, die mit einem gelösten Stoff, in diesem Fall einer Zielaminosäure, in einer Mischung aus gelösten Stoffen wechselwirkt. Der Ausdruck fester Träger, wie er hier verwendet wird, umfasst stationäre Phasen der Flüssigkeitschromatographie (LC), Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC), partikuläre Matrixen, eingebettet in oder gebunden an Filter und magnetische oder nicht-magnetische poröse Matrixteilchen, die mit gelösten Stoffen wechselwirken, wenn sie zu einer Mischung aus gelösten Stoffen direkt zugegeben werden.
Der Ausdruck "Kieselgel", wie er hier verwendet wird, betrifft Kieselgel vom chromatographischen Grad, eine Substanz, die im Handel von unterschiedlichen Quellen erhältlich ist. Kieselgel wird im allgemeinen durch Ansäuern einer Silikat enthaltenden Lösung hergestellt, z.B. durch Ansäuern von Natriumsilikat auf einen pH von weniger als 11 und die angesäuerte Lösung anschließend ein Gel bildet. Siehe z.B. die Diskussion zur Kieselgelherstellung in Kurt-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, Band 21, 4. Auflage, Mary Howe-Grand, Herausgeber Wiley & Sons, pub., 1997, Seite 1021.
Der Ausdruck "Glasteilchen", wie er hier verwendet wird, bedeutet Teilchen aus kristallinen oder vitriösen Silikaten, obgleich kristalline Silikate im allgemeinen nicht "Gläser" sind, da sie nicht amorph sind, oder Teilchen aus Glas, hergestellt primär aus Kieselgel. Der Ausdruck umfasst Quarz, vitröses Kieselgel, Glasteilchen mit kontrollierten Poren und Glasfasern.
Der Ausdruck "magnetische Kieselgelteilchen" bedeutet, wie er hier verwendet wird, feste Träger auf Kieselgelbasis, die darüber hinaus Materialien umfassen, die kein magnetisches Feld aufweisen, die aber ein magnetisches Dipol bilden, wenn sie einem magnetischen Feld ausgesetzt werden, d.h. Materialien, die in der Gegenwart eines magnetischen Feldes magnetisiert werden können, die aber selbst in der Abwesenheit eines solchen Feldes nicht magnetisch sind.
Der Ausdruck "magnetisch", wie er hier verwendet wird, betrifft magnetische Kieselgelteilchen, die Materialien, die paramagnetisch oder supermagnetisch sind, umfasst. Der Ausdruck "magnetisch", wie er hier verwendet wird, umfasst auch temporär-magnetische Materialien, wie ferromagnetische Materialien. Außer wenn es anders unten angezeigt ist, umfassen die erfindungsgemäßen magnetischen Kieselgelteilchen bevorzugt einer super-paramagnetischen Kern, der mit kieselgelhaltigem Sauerstoff beschichtet ist mit einer Oberfläche, die wässrigen kieselgelhaltigen Sauerstoff adsorbiert (d.h. eine Oberfläche, die durch die Gegenwart von Silanolgruppen gekennzeichnet ist.)
Der Ausdruck "Oberfläche", wie er hier verwendet wird, betrifft den Teil des Trägermaterials einer Festphase, die in direktem Kontakt mit einer Lösung steht, wenn der feste Träger damit verbunden wird.
Der Ausdruck "Nukleinsäure", wie er hier verwendet wird, betrifft jedes DNA- oder RNA-Molekül oder ein DNA/RNA-Hybridmolekül. Der Ausdruck umfasst Plasmid-DNA, amplifizierte DNA oder RNA-Fragmente, Gesamt-RNA, mRNA und Genom-DNA.
Der Ausdruck "Zielnukleinsäure", wie er hier verwendet wird, betrifft die bestimmte Art der zu isolierenden Nukleinsäure in jeder Anwendung der Verfahren oder der Verwendung der pH-abhängigen Ionenaustauschermatrix der Erfindung. Die Zielnukleinsäure ist bevorzugt mindestens 20 Nukleotide lang, besonders bevorzugt mindestens 100 Nukleotide lang und am meisten bevorzugt mindestens 1.000 Nukleotide lang.
Die feste Trägerkomponente der pH-abhängigen Ionenaustauschermatrix kann aus jedem gewöhnlichen Trägermaterial hergestellt sein, einschließlich weichen Gelträgern, wie Agarose, Polyacrylamid oder Cellulose oder hartem Trägermaterial, wie Polystyrol, Latexmethacrylat oder Kieselgel. Wenn das Festphasenträgermaterial Siliziumdioxid ist, ist es bevorzugt in der Form von Kieselgel, kieselhaltigem Sauerstoff, festem Siliziumdioxid, wie Glas oder Diatomeenerde oder eine Mischung aus zwei oder mehr der obigen. Festphasen auf Siliziumdioxidbasis, die sich zur Verwendung in den erfindungsgemäßen pH-abhängigen Ionenaustauschermatrixen eignen, umfassen die Mischung aus Kieselgel und Glas, wie im US-Patent Nr. 5,658,548 beschrieben, den magnetischen Siliziumdioxidteilchen, die in der PCT-Veröffentlichungsnummer WO 98/31840 beschrieben sind und Festphasen, die von Promega Corporation zur Verwendung bei der Plasmid-DNA-Isolierung verkauft werden, wie Wizard^® Minipreps DNA Purification Resin. Kieselgelteilchen sind besonders bevorzugt, um als fester Träger in der pH-abhängigen Ionenaustauschermatrix und den Verfahren der Erfindung verwendet zu werden. Kieselgelteilchen sind bei viel höheren Drücken stabil als Festphasen, die aus weichem Gelträgermaterial hergestellt werden, wodurch sich die festen Träger aus Kieselgel für HPLC sowie LC und Chargen-Trennungsanwendungen eignen.
Die erfindungsgemäß verwendete pH-abhängige Ionenaustauschermatrix liegt bevorzugt in einer Form vor, die getrennt werden kann von einer Mischung aus gelöstem Stoff, umfassend die Zielnukleinsäure und mindestens eine Verunreinigung, nachdem die Mischung aus gelöstem Stoff damit gemischt wird. Für den Fachmann ist verständlich, dass die Art der externen Kraft, die sich für die Trennung der Matrix aus der Mischung von gelöstem Stoff eignet, von der Form, in der sich die Matrix in der Mischung von gelöstem Stoff befindet und von den physikalischen Eigenschaften der Matrix selbst abhängt. Zum Beispiel kann Schwerkraft verwendet werden, um das pH-abhängige Ionenaustauschermaterial von der Mischung aus gelöstem Stoff zu trennen, wenn sich die Matrix in der Form eines chromatographischen Harzes befindet, das auf einer LC-Säule geladen ist, wenn die Matrix in der Form von Siliziumdioxidteilchen ist (z.B. Glas mit kontrollierten Poren, Kieselgelteilchen oder magnetischen Siliziumdioxidteilchen), die chargenweise zu einer Mischung aus gelöstem Stoff gegeben wird und anschließend durch Dekantieren oder Filtrieren davon getrennt wird oder wenn die Matrix aus gemischter Form in der Form eines Filters mit Kieselgelteilchen oder chromatographischem Harz, das darin eingebettet oder daran gebunden ist, ist.
Die externe Kraft, die im Isolierungsverfahren verwendet wird, ist Hochdruckflüssigkeit, wenn die pH-abhängige Ionenaustauschermatrix die stationäre Phase einer Hochdruck-Flüssigkeitschromatographiesäule (HPLC) ist. Andere Formen der externen Kraft, die sich in dem erfindungsgemäßen Verfahren eignen, umfassen Vakuumfiltrierung (z.B. wenn die Festphasenkomponente der Matrixteilchen aus Glas mit kontrollierten Poren, Teilchen aus Kieselgel oder magnetische Siliziumdioxidteilchen sind oder Mischungen aus einem oder mehreren der obigen Teilchenarten, die darin eingebettet oder an einen Filter gebunden sind), Zentrifugierung (z.B. wenn die Festphase des gemischten Bettes aus einzelnen Teilchen besteht) oder magnetisch (z.B. wenn die Festphase mit gemischtem Bett magnetische oder paramagnetische Teilchen umfasst).
Wenn die Festphasenkomponente der pH-abhängigen Ionenaustauschermatrix ein Kieselgelteilchen ist, ist es am meisten bevorzugt ein magnetisches Kieselgelteilchen. Ein magnetisches Kieselgelteilchen kann aus einer Lösung unter Verwendung von externen oben beschriebenen Verfahren getrennt werden, um mit anderen Arten von Festphasen, wie solchen, die oben beschrieben sind, verwendet zu werden. Im Gegensatz zu den anderen Festphasen kann ein magnetisches Kieselgelteilchen aus einer Lösung durch magnetische Kraft, ein schnelles und effizientes Verfahren zur Trennung einer Matrix aus einer Lösung, getrennt werden.
Wenn die feste Trägerkomponente der pH-abhängigen Ionenaustauschermatrix ein magnetisches Kieselgelteilchen ist, werden die Teilchen bevorzugt wie folgt ausgewählt. Kleinere magnetische Kieselgelteilchen liefern eine größere Oberfläche (auf einer Basis pro Gewichtseinheit) zur kovalenten Bindung an die Vielzahl von Ionenaustauscherliganden, dagegen sind kleinere Teilchen in der Menge des magnetischen Materials, das in solche Teilchen im Vergleich zu größeren Teilchen eingeführt wird, beschränkt. Die mittlere Teilchengröße der magnetischen Kieselgelteilchen, die in einer bestimmten bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform verwendet wird, ist ungefähr 1 bis 15 μm, besonders bevorzugt ungefähr 3 bis 10 μm und am meisten bevorzugt ungefähr 4 bis 7 μm. Die Teilchengrößenverteilung kann sich auch unterscheiden. Eine verhältnismäßig enge monodale Teilchengrößenverteilung ist jedoch bevorzugt. Die monodale Teilchengrößenverteilung ist bevorzugt derart, dass ungefähr 80 Gew.% der Teilchen in einem 10 μm-Bereich der mittleren Teilchengröße liegen, bevorzugt innerhalb eines 8 μm-Bereichs und am meisten bevorzugt innerhalb eines 6 μm-Bereiches.
Die Festträgerkomponente der pH-abhängigen Ionenaustauschermatrix kann porös oder nicht-porös sein. Wenn der feste Träger porös ist, liegen bevorzugt die Poren in einem kontrollierten Größenbereich vor, der ausreichend groß ist, um das Zielnukleinsäurematerial in das Innere des Festphasenteilchens aufzunehmen und an funktionale Gruppen oder Siliziumdioxid auf der inneren Oberfläche der Poren zu binden. Das Gesamtporenvolumen eines magnetischen Kieselgelteilchens, wie es durch das Stickstoff-BET-Verfahren gemessen wird, ist bevorzugt wenigstens ungefähr 0,2 ml/g Teilchenmasse. Das Gesamtporenvolumen von porösen magnetischen Kieselgelteilchen, die sich besonders als Komponenten der erfindungsgemäßen pH-abhängigen Ionenaustauschermatrix eignen, ist bevorzugt der das mindestens ungefähr 50 Å des Porenvolumens in Poren mit einem Durchmesser von 600 Å oder größer enthalten ist, gemäß Stickstoff-BET gemessen.
Magnetische Kieselgelteilchen können Substanzen enthalten, wie Übergangsmetalle oder flüchtige organische Stoffe, die nachteilig die Einsetzbarkeit von Zielnukleinsäuren, die wesentlich mit solchen Substanzen verunreinigt sind, beeinträchtigen. Insbesondere können solche Verunreinigungen nachfolgende Verfahrensschritten, Analysen und/oder die Verwendung solcher Materialien beeinträchtigen, z.B. durch Inhibieren der Enzymaktivität oder Abbauen der Zielnukleinsäuren, die damit isoliert werden. Einige solcher Substanzen, die in magnetischen Siliziumdioxidteilchen, die erfindungsgemäß verwendet werden, vorhanden sind, sind bevorzugt in einer Form vorhanden, die kaum aus dem Teilchen heraustritt und in das isolierte biologische Zielmaterial, das gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wird, eintritt. Eisen ist eine solche ungewünschte Verunreinigung, insbesondere wenn das biologische Zielmaterial eine Zielnukleinsäure ist.
Eisen in der Form von Magnetit ist in dem Kern von besonders bevorzugten Formen von magnetischen Kieselgelteilchen, die als Festphasenkomponente der erfindungsgemäßen pH-abhängigen Ionenaustauschermatrixen verwendet werden, vorhanden. Eisen hat einen breiten Absorptionspeak zwischen 260 und 270 Nanometer (nm). Zielnukleinsäuren haben einen Absorptionspeak bei ungefähr 260 nm, so dass die Eisenverunreinigung in einer Zielnukleinsäureprobe nachteilig die Richtigkeit der Ergebnisse von quantitativen spektrophotometrischen Analysen solcher Proben beeinträchtigt. Jede Eisen enthaltenden, magnetischen Siliziumdioxidteilchen, die erfindungsgemäß zur Isolierung von Zielnukleinsäuren verwendet werden, erzeugen bevorzugt kein isoliertes Zielnukleinsäurematerial, das wesentlich mit Eisen verunreinigt ist, so dass das Eisen mit spektrophotometrischen Analysen des Materials bei oder um 260 nm interferiert.
Die am meisten bevorzugten magnetischen Kieselgelteilchen, die in den erfindungsgemäßen Matrixen und Verfahren verwendet werden, sind magnetische Siliziumdioxidteilchen, die mit kieselhaltigem Sauerstoff beschichtet sind, und diese treten nicht mehr als 50 ppm, bevorzugter nicht mehr als 10 ppm und am meisten bevorzugt nicht mehr als 5 ppm aus den Übergangsmetallen heraus, wenn wie folgt untersucht. Genauer gesagt, werden die Teilchen wie folgt untersucht: 0,33 g Teilchen (ofengetrocknet @ 110°C) werden mit 20 ml 1 N HCl wässriger Lösung (deionisiertes Wasser wird verwendet) gemischt. Die resultierende Mischung wird anschließend geschüttelt, um die Teilchen zu dispergieren. Nach ungefähr 10minütiger Kontaktzeit wird ein Teil der flüssigen Form der Mischung auf Metallgehalt untersucht. Jedes herkömmliche elementare Analyseverfahren kann eingesetzt werden, um die Menge des Übergangsmaterials in der resultierenden Flüssigkeit zu quantifizieren, aber Spektroskopie mit induktiv gekoppeltem Plasma ist bevorzugt.
Mindestens zwei im Handel erhältliche magnetische Siliziumdioxidteilchen sind zur Verwendung in der erfindungsgemäßen Matrix bevorzugt, BioMag^® Magnetic Particles von PerSeptive Biosystems und die NagneSil^TM-Teilchen, die von Promega Corporation (Madison Wisconsin) erhältlich sind. Jede Art magnetischer Kraft, die ausreichend stark ist, um die magnetischen Siliziumdioxidteilchen aus einer Lösung zu trennen, eignet sich bei den erfindungsgemäßen Verfahren zur Isolierung einer Nukleinsäure. Die magnetische Kraft wird jedoch bevorzugt in Form eines magnetischen Trennungsgerüstes bereitgestellt, wie bei den MagneSphere^® Technology Magnetic Trennungsgerüsten (Katalog Nrn. Z5331 bis 3 oder Z5341 bis 3) von Promega Corporation.
Die erfindungsgemäßen pH-abhängigen Ionenaustauschermatrixen umfassen alle eine Vielzahl eines ersten Ionenaustauscherliganden, der kovalent an eine Festphase gebunden ist gemäß der allgemeinen Strukturformel
wobei die gewellte Linie die Oberfläche eines festen Trägers darstellt. Linker umfasst eine Linker-Alkylkette, bevorzugt eine Alkylkette, die drei (3) bis acht (8) Kohlenstoffatome umfasst. Der Linker umfasst auch bevorzugt mindestens ein zusätzliches Mitglied, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Sauerstoff, Amin und Carbonyl. Der Linker ist bevorzugt ein Epoxid, wie ein Glycidylanteil oder eine Harnstoff-Verknüpfung. Der Spacer umfasst eine Spaceralkylkette mit einem Aminoterminus, wobei der Aminoterminus kovalent an den Linker gebunden ist. Das andere Ende der Spaceralkylkette ist kovalent an die Kappe gebunden. Die Spaceralkylkette kann durch mindestens einen Schwefelrest substituiert sein. Die Kappe umfasst ein primäres, sekundäres oder tertiäres Amin mit einem pK-Wert von weniger als 9. Die Kappe umfasst bevorzugt außerdem einen aromatischen Kohlenwasserstoffring, wobei das Amin entweder daran gebunden ist oder ein Mitglied des Ringes ist. Wenn die Kappe einen aromatischen Kohlenwasserstoffring und ein Amin umfasst, ist das Amin bevorzugt ein Mitglied des Rings. Die Kappe umfasst bevorzugter einen 5- oder 6-gliedrigen aromatischen Aminring, wie Imidazol oder Pyridin.
Bei einer erfindungsgemäßen Ausführungsform, bei der die Vielzahl von ersten Ionenaustauscherliganden die einzigen Ionenaustauscherliganden sind, die an den festen Träger gebunden sind, umfasst der Spacer außerdem einen ersten sauren Anteil, der kovalent an die Spaceralkylkette gebunden ist. Der saure Anteil ist bevorzugt ein Carboxylrest. Der Spacer ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Cystein, Alanin und dem Alkylkettenanteil einer polaren Aminosäure, bestehend aus einer Alkylkette und einem Kohlenwasserstoff, wie Histamin und Histidin. Spacer und Kappe zusammen definieren am meisten bevorzugt einen Histamin- oder einen Histidinanteil.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung eine pH-abhängige Ionenaustauschermatrix, umfassend eine Vielzahl von ersten Ionenaustauscherliganden und eine Vielzahl von zweiten Ionenaustauscherliganden, die kovalent an den festen Träger gebunden sind, wie das gleiche magnetische Kieselgelteilchen. Der zweite Ionenaustauscherligand umfasst eine zweite Alkylkette und einen Ionenaustauscherrest, der kovalent daran gebunden ist. Die zweite Alkylkette ist bevorzugt ein nicht-verzweigtes Alkan mit ein (1) bis fünf (5) Kohlenwasserstoffatomen. Der Ionenaustauscherrest ist bevorzugt ein saurer Anteil, bevorzugter eine Carbonsäure. Der zweite Ionenaustauscherligand ist am meisten bevorzugt Propionat.
Bei der zweiten Ausführungsform der pH-abhängigen Ionenaustauschermatrix kann jeder erste Ionenaustauscherligand die gleiche Struktur aufweisen, die in der obigen Formel (I) dargestellt ist, außer dass der erste Ionenaustauscherligand keinen sauren Anteil benötigt, der an die Spaceralkylkette kovalent gebunden ist, wenn der zweite Ionenaustauscherligand einen solchen Anteil umfasst. Wenn der zweite Ionenaustauscherligand einen sauren Anteil umfasst, ist er bevorzugt, ein Carbonsäurerest, bevorzugter ein Carbonsäurerest, der kovalent mit dem Terminus der zweiten Alkylkette verbunden ist.
Der zweite Typ der eben beschriebenen pH-Ionenaustauschermatrix, hiernach die "bimodale" Ionenaustauschermatrix, weist bevorzugt auf einen sauren Anteil auf einem Liganden, dem zweiten Ionenaustauscherliganden, und mindestens einen basischen Anteil auf dem anderen Liganden, dem Aminmitglied der aromatischen Kohlenwasserstoffringkomponente des ersten Ionenaustauscherligands. Bei einer bevorzugten Konfiguration kann die Bindung der Zielnukleinsäure und das Freisetzungsvermögen der Matrix kontrolliert und sogar fein eingestellt werden, indem das relative Verhältnis der ersten und zweiten Ionenaustauscherliganden, die kovalent mit dem festen Träger verbunden sind, variiert wird. Durch dieses Merkmal der bimodalen Ionenaustauschermatrix wird es insbesondere möglich, sie in den erfindungsgemäße Verfahren einzusetzen, obgleich die oben beschriebene monomodale Ionenaustauschermatrix sich auch gut dazu eignet, bei der Isolierung von Zielnukleinsäure gemäß dem vorliegenden Verfahren verwendet zu werden.
Wenn die feste Phase auf Siliziumdioxidbasis ist, ist jeder Ionenaustauscherligand bevorzugt an die feste Phase über eine Silangruppe, wie in Formel (II) unten gezeigt, verbunden:
worin R¹ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -OH, -OCH₃ und -OCH₂CH₃ und R² dargestellt ist durch die Formel -(OSiR¹ ₂)_y-R¹, worin y mindestens 0 ist. Wenn y Null (0) ist, wird der Ligand mit dem festen Träger über ein Silanmonomer verbunden. Wenn y größer als 0 ist, ist die Verbindung über ein Silanpolymer.
Zielnukleinsäuren sind inhärent bei jedem pH über 2 negativ geladen und können daher unter Lösungsbedingungen reversibel Anionenaustauscher binden, bei denen Ionen zwischen dem Ionenaustauscher und der Zielaminosäure ausgetauscht werden. Die erfindungsgemäße, pH-abhängige Ionenaustauschermatrix ist ein Anionenaustauscher, wobei bei einem ersten pH die vorliegende Matrix neutral bis positiv geladen ist, und bei einem zweiten höheren pH die Matrix neutral bis negativ geladen ist in Abhängigkeit von dem pK des sauren Anteils des Ionenaustauscherliganden. Die Zielnukleinsäure kann an die Matrix bei dem ersten pH adsorbiert und von der Matrix bei dem zweiten pH desorbiert werden. Der mögliche pH-Bereich sowohl des ersten als auch des zweiten pH hängt von der Natur der Vielzahl von Ionenaustauscherliganden auf der pH-abhängigen Ionenaustauschermatrix ab.
Die Vielzahl von Liganden umfasst mindestens einen Anionenaustauscheranteil und mindestens einen Kationenaustauscheranteil. Der mindestens eine Anionenaustauscheranteil der pH-abhängigen Ionenaustauschermatrix ist mindestens ein Amin mit einem pK von weniger als 9, worin das Amin ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem primären, sekundären oder tertiären Amin. Der mindestens eine Kationenaustauscheranteil ist ein saurer Anteil, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Hydroxyl und Carboxyl.
Die erfindungsgemäße pH-abhängige Ionenaustauscherfestphase wird zur Verwendung bei der Isolierung von Zielnukleinsäuren entworfen. Sowohl die Ligandenkonfiguration, die oben beschrieben ist, als auch die Ligandendichte können eingestellt werden, um optimale Adsorption und Desorption einer gegebenen Zielnukleinsäure sicherzustellen. Die höchste Ligandendichte, die sich zur Verwendung bei den erfindungsgemäßen Matrixen eignet, beträgt 500 μmol pro Gramm Trockengewicht. Die niedrigste Ligandendichte, die sich zur Verwendung bei den erfindungsgemäßen pH-abhängigen Ionenaustauschermatrixen eignet, beträgt ungefähr 25 μmol/g Trockengewicht. Die Ligandendichte bei den erfindungsgemäßen Matrixen liegt am meisten bevorzugt zwischen 50 und 200 μmol/g Trockengewicht Festphase.
Der Anionenaustauscheranteil und Kationenaustauscheranteil der vorliegenden Matrix variiert in der Ladung in Abhängigkeit der Lösungsbedingungen. In der Gegenwart einer Lösung mit einem ersten pH ist der basische Anteil (d.h. das Amin) positiv geladen und die Matrix kann sich mit der Zielnukleinsäure austauschen. In der Gegenwart einer Lösung mit einem zweiten pH, der höher ist als der erste pH, hat der saure Anteil eine negative Ladung und der basische Anteil eine neutrale Ladung. Die Matrix ist entworfen, um die Zielnukleinsäure bei dem ersten pH zu adsorbieren und die Zielnukleinsäure bei einem pH zu desorbieren, der mindestens ungefähr der zweite pH ist. pH-Bedingungen, die notwendig sind, um die Adsorption der Zielnukleinsäure an die erfindungsgemäße Matrix und die Desorption davon zu gewährleisten, hängen von den Salzbedingungen der Absorptions- und Desorptionslösungen ab und von der spezifischen Zusammensetzung und Dichte der Vielzahl von Liganden, die an die Festphase gebunden sind. Genauer gesagt liegt der erste pH, bei dem die Desorption stattfindet, bevorzugt zwischen 6 und 8, wenn die Ionenstärke der Lösung bevorzugt nicht höher als ungefähr 1 M Salz, bevorzugt nicht mehr als ungefähr 500 mM Salz und am meisten bevorzugt nicht mehr als ungefähr 50 mM Salz beträgt.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Isolierung einer Zielnukleinsäure kann den einen oder anderen Typ der oben beschriebenen erfindungsgemäßen pH-abhängigen Ionenaustauschermatrix einsetzen oder ein gemischtes Bett einer pH-abhängigen Ionenaustauschermatrix und einem anderen Matrixtyp, der die Zielaminosäure unter unterschiedlichen Lösungsbedingungen binden und freisetzen kann, wie z.B. die in der US-Patentanmeldung 09/312,139 für MIXED BED SOLID PHASE AND IST USE IN THE ISOLATION OF NUCLEIC ACIDS beschriebenen.
Das vorliegende Verfahren umfasst die Schritte des Bereitstellens der pH-abhängigen Ionenaustauschermatrix, die in dem Verfahren verwendet wird, wobei eine Mischung bereitgestellt wird, umfassend die Zielnukleinsäure und mindestens eine Verunreinigung, Kombinieren der Mischung und der Matrix bei einem ersten pH unter Bedingungen, bei denen die Zielnukleinsäure an die Matrix unter Bildung eines Komplexes adsorbiert, Trennen des Komplexes von der Mischung und Desorbieren der Nukleinsäure vom Komplex durch Verbinden des Komplexes mit einer Elutionslösung bei einem Desorptions-pH. Die exakten Lösungsbedingungen, die notwendig sind, um die Adsorption und Desorption der Zielnukleinsäure an die Matrix sicherzustellen, hängen von verschiedenen Faktoren ab, einschließlich der Natur der Zielnukleinsäure (z.B. RNA oder DNA, Molekulargewicht und Nukleotidsequenz-Zusammensetzung), dem pKa und pKb der sauren und basischen Untereinheiten der Liganden, der Ligandendichte auf der Oberfläche einer festen Phase und der Fähigkeit der festen Phase, direkt an die Zielnukleinsäure zu binden. Einige Verunreinigungen in der Mischung können ebenfalls mit der Haftung an die Matrix interferieren.
Bevorzugt sind keine chaotropischen Mittel (z.B. Guanidinhydrochlorid oder Guanidinisothiocyanat) oder niedrigmolekulargewichter Alkohol (z.B. Ethanol oder Methanol) in einer der Lösungen eingeschlossen, die mit der Matrix in Kontakt treten, unabhängig von der bestimmten Art der Zielnukleinsäure. Sogar kleine Menge chaotropischer Mittel oder Ethanol in einer Zielnukleinsäurelösung können die Verwendbarkeit der Nukleinsäure in darauffolgenden Verfahrensschritten oder Analysen stark limitieren.
Wenn die Zielnukleinsäure Plasmid-DNA ist, kann die erfindungsgemäße pH-abhängige Ionenaustauschermatrix direkt zu dem gesäuberten Lysat aus Bakterien, die mit der Plasmid-DNA transformiert sind, und mit einer alkalischen Lyselösung lysiert sind, gegeben und mit einer alkalischen Lyselösung lysiert werden. Alkalische Lyseverfahren, die sich erfindungsgemäß eignen, sind in Sambrook et al., Molecular Cloning, Band 1, 2. Auflage (pub. 1989 von Cold Spring Harbor Laboratory Press), Seiten 1.25-1.28 und in Technical Bulletin Nrn. 202, 225 und 259 (Promega Corp.) aufgeführt. Plasmid-DNA aus einer Lysatlösung, die wie oben beschrieben hergestellt wurde, wird an die pH-abhängige Ionenaustauschermatrix nach deren Mischung damit adsorbieren, vorausgesetzt, dass die Insgesamtladung auf der Matrix positiv ist und vorausgesetzt, dass die Ladungsdichte ausreichend hoch ist, um zu ermöglichen, dass die Plasmid-DNA am Anionenaustausch mit den Anionenaustauscherliganden der Matrix bei einem ersten pH teilnimmt. Sobald an die Matrix unter Bildung eines Komplexes adsorbiert, kann der Komplex in einer Waschlösung mit Puffer und Salz gewaschen werden, unter Bedingungen, die sicherstellen, dass die Plasmid-DNA an der Matrix bei jedem Waschschritt adsorbiert bleibt, wobei mindestens eine Verunreinigung entfernt wird. Letztlich wird die Plasmid-DNA auf dem Komplex durch Kombinieren des Komplexes mit einem Elutionspuffer, der einen zweiten pH aufweist, der über dem des Lysats und der Waschlösungen liegt, eluiert, wobei der zweite pH ausreichend hoch ist, um die Desorption der Plasmid-DNA aus der Matrix zu fördern.
Die pH-abhängige Ionenaustauschermatrix und die erfindungsgemäßen Verfahren können verwendet werden, um Genom-DNA aus Lebendgewebe zu isolieren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Blut, Samen, Vaginalzellen, Haar, buccalem Gewebe, Speichel, Kulturgewebezellen, Pflanzenzellen, Plazentazellen oder fötalen Zellen, die in der Amnioflüssigkeit vorhanden sind und Mischungen aus Körperflüssigkeiten. Wenn die Zielnukleinsäure Genom-DNA ist, ist es notwendig, das Gewebe zu zerstören, um die Ziel-Genom-DNA aus der Assoziierung mit anderem Material in dem Gewebe freizusetzen, so dass die Ziel-Genom-DNA an die pH-abhängige Matrix in der Gegenwart einer Lösung bei einem ersten pH haften kann. Der resultierende Komplex aus Matrix und Genom-DNA wird von dem zerstörten Gewebe getrennt und gewaschen, um zusätzliche Notwendigkeiten zu entfernen (wenn notwendig). Die Genom-DNA wird anschließend aus dem Komplex eluiert durch Kombinieren des Komplexes mit einer Elutionslösung mit einem zweiten pH, der höher ist als der erste pH.
Wenn die Zielnukleinsäure RNA ist, wird die Adsorption der Zielnukleinsäure an die pH-abhängige Ionenaustauschermatrix bevorzugt unter Bedingungen durchgeführt, die die bevorzugte Adsorption von RNA an die Matrix fördern. Wenn sowohl RNA als auch DNA in einer Lösung vorhanden sind, können die Lösungsbedingungen derart entworfen sein, dass die bevorzugte Adsorption von RNA an die pH-abhängige Ionenaustauschermatrix gefördert wird. Die spezifischen Lösungsbedingungen, die erforderlich sind, um die Adsorption und Desorption von RNA an eine pH-abhängige Ionenaustauschermatrix zu fördern, hängt von den Eigenschaften der Matrix selbst ab und müssen daher für jede Matrix bestimmt werden.
1 bis 3 stellen drei zusätzliche erfindungsgemäße Ausführungsformen dar, insbesondere drei unterschiedliche Verfahren zur Herstellung von drei unterschiedlichen Typen von pH-abhängigen Ionenaustauschermatrixen. Das erste solche Verfahren, das in 1 dargestellt ist, ist ein Verfahren zur Herstellung einer pH-abhängigen Ionenaustauschermatrix durch Verbinden einer Kappe, umfassend einen aromatischen Kohlenwasserstoffring mit einem Aminmitglied, wobei das Amin einen pK von weniger als ungefähr 9 hat, an eine feste Phase über einen Glycidyllinker. Das Verfahren umfasst drei Schritte. Im ersten Schritt wird die Verbindung der Formel (IV), ein Glycidpropylsilan mit drei identischen Untereinheiten ("R¹", das -OH, -OCH₃ oder -OCH₂CH₃ ist) kovalent mit dem Silanrest verbunden, mit einer festen Phase mit mindestens einer Oberfläche, wie in Formel (III) gezeigt, mit Hydroxylgruppen, die kovalent damit verbunden sind, unter Bedingungen verbunden, die die Bildung einer kovalenten Bindung zwischen dem Silanrest, fördern, wobei die Glycidyl-modifizierte feste Phase der Formel (IV) gebildet wird. Schließlich wird die Glycidyl-modifizierte feste Phase mit entweder einer Aminosäure, die eine Aminosäure mit einem aromatischen Kohlenwasserstoffring mit einem Aminmitglied, wie Histidin, oder einer Aminsäure, die kovalent mit einem aromatischen Kohlenwasserstoff verbunden ist, wie Pyridylcystein oder Pyridylalanin, umfasst, unter Bedingungen verbunden, die die Bildung einer Peptidbindung zwischen den zwei Verbindungen über den N-Terminus der Aminosäure oder dem Aminosäureanteil fördern. Bevorzugte Verbindungen, die in diesem bestimmten Schritt des Verfahrens verwendet werden, sind als R²H dargestellt, wobei die Strukturen der R²-Komponente jeder Verbindung (d.h. Histidin, Pyridylcystein und Pyridylalanin) in 1 dargestellt sind. Das Endprodukt dieser Reaktion ist die pH-abhängige Ionenaustauschermatrix der Formel (VI).
Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung einer pH-abhängigen Ionenaustauschermatrix, durch Verbinden eines ersten Anteils, umfassend einen Aminoalkylspacer und eine Kappe, umfassend einen aromatischen Kohlenwasserstoffring mit einem Aminmitglied, an eine feste Phase über eine Harnstoffverbindung. 2 stellt ein solches Syntheseverfahren dar, wobei Histidin der erste Anteil, der mit der festen Phase verbunden ist, ist. Es ist jedoch beabsichtigt, dass das im wesentlichen gleiche Verfahren verwendet werden könnte, um andere Anteile an feste Phasen über Harnstoff, einschließlich Histamin, zu binden. Wie in 2 dargestellt, wird Histidin, das gemäß Formel (VII) durch Schutz der Carboxylgruppe mit einer Methylgruppe modifiziert ist, mit der Verbindung der Formel (VIII), einem 3-Isocyanatpropylsilan mit drei identischen Untereinheiten ("R¹", das -OH, -OCH₃ oder -OCH₂CH₃ ist) kovalent mit dem Silanrest verbunden, kombiniert. Es wird der resultierenden Mischung ermöglicht, unter Bedingungen zu reagieren, die die Bildung einer kovalenten Bindung zwischen dem N-Terminus der geschützten Aminosäure (in diesem Fall Histidin, geschützt durch eine Methylgruppe) und dem Cyanato-Kohlenstoffrest der Verbindung der Formel (VIII) fördert, was in der Bildung eines Harnstoffrestes resultiert. Das Produkt der ersten Reaktion wird anschließend mit der festen Phase der Formel (III) unter Bedingungen kombiniert, die die Bildung einer kovalenten Bindung zwischen dem Silanrest des Produktes und der Hydroxylgruppen an eine Oberfläche der Festphase fördern. Das Endprodukt der zweiten Reaktion wird durch Formel (IX) dargestellt. Letztlich wird die Schutzgruppe von dem Carbonsäurerest des Aminosäureanteils durch Reaktion mit einem Oxidant, wie Salzsäure; entfernt. Das Produkt der Reaktion ist durch die Formel (X) dargestellt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer bimodalen oder multimodalen pH-abhängigen Ionenaustauschermatrix. 3 stellt die Synthese einer solchen bimodalen Matrix nach dem erfindungsgemäßen Verfahren dar. Der erste Verfahrensschritt, der in 3 gezeigt ist, ist die Zugabe der Verbindung der Formel (XI), ein Imidazolethyl-N'-3-propylsilylharnstoff, wobei drei Untereinheiten zwei R¹-Untereinheiten, jede als -OH, -OCH₃ oder -OCH₂CH₃ definiert und eine R²-Untereinheit durch die Formel -(OSiR¹ ₂)_y-R¹ definiert, wobei y mindestens 0 ist, kovalent verbunden mit dem Silanrest, zu einer Festphase mit Hydroxylgruppen, die kovalent daran gebunden sind, wie in Formel (III) gezeigt. Die Verbindung der Formel (XI) kann aus Histidin und 3-Isocyanatpropyltri-substituiertem Silan unter Verwendung eines ähnlichen Verfahrens, zu dem das zur Bildung der Harnstoffverbindung in dem ersten Schritt des Verfahrens, der gerade zuvor diskutiert wurde, synthetisiert werden. Es wird der Verbindung der Formel (XI) und der Festphase der Formel (III) ermöglicht, unter Bedingungen zu reagieren, die die Bildung einer kovalenten Bindung zwischen dem Silanrest der Verbindung der Formel (XI) und den Hydroxylgruppen an der Oberflächen der Festphase fördern, wodurch die Festphase mit einem ersten Linkertyp, der daran gebunden ist, gebildet wird, die Struktur der Formel (XII).
Die Synthese bimodaler und multimodaler pH-abhängiger Ionenaustauschermatrixen wird durch die Zugabe von mindestens einem anderen Linker fortgesetzt. Bei einer bimodalen Matrix ist der mindestens eine andere Linker ein zweiter Linker, der eine saure Gruppe, die kovalent damit verbunden ist, umfasst. Das Verbinden eines zweiten Linkers an die Struktur der Formel (XII) gemäß dem vorliegenden Verfahren ist in 3 dargestellt. Eine Alkylkette mit einer geschützten sauren Gruppe, die kovalent daran gebunden ist, und ein terminaler Silanrest mit drei identischen Untereinheiten ("R³", das -OH, -OCH₃ oder -OCH₂CH₃ ist), die kovalent mit dem Silanrest verbunden sind, wie die Verbindung der Formel (III), werden mit der Festphase/ersten Linkerverbindung der Formel (XII) unter Bedingungen kombiniert, die die Bildung einer kovalenten Bindung zwischen dem Silanrest und den Hydroxylgruppen an einer Oberfläche der Festphase fördern. Die Schutzgruppe (z.B. eine Methylgruppe) wird anschließend aus der resultierenden Verbindung der Formel XIV) unter Verwendung eines Oxidanz wie Salzsäure, entfernt, wodurch die Verbindung der Formel (XV) gebildet wird. Der Silanrest sowohl der Zwischenverbindung der Formel (XIV) und des Endprodukts der Formel (XV) haben zwei damit verbundene Untereinheiten, R³ und R⁴, wobei R³ -OH, -OCH₃ oder -OCH₂CH₃ ist und R⁴ -(OSiR³ ₂)₂-R³ ist, wobei X mindestens 0 ist.
Multimodale pH-abhängige Ionenaustauschermatrixen können außerdem hergestellt werden durch kovalentes Verbinden zusätzlicher Linker mit sauren oder basischen Resten einer Festphase, um die Ladungsdichte und die insgesamte Ladung einer Festphase fein einzustellen, so dass bestimmte Zielnukleinsäuren ausgewählt werden.
Die folgenden, nicht einschränkend anzusehenden Beispiele lehren verschiedene erfindungsgemäße Ausführungsformen. Bei den Beispielen und anderswo in der Beschreibung und den Ansprüchen sind Volumen und Konzentrationen bei Raumtemperatur, wenn nicht anders angegeben. Die magnetischen Siliziumdioxidteilchen, die unten in den Beispielen verwendet werden, waren alle entweder poröse oder nicht-poröse MagneSil^TM-Teilchen mit den allgemein bevorzugten Dimensionen und siliziumhaltiger Sauerstoff, der wie oben beschrieben, bevorzugt beschichtet war. Genauer gesagt, wurden die in den Beispielen verwendeten porösen MagneSil^TM-Teilchen einem von zwei Chargen von Teilchen entnommen, die die folgenden Charakteristiken aufweisen: (1) ein Oberflächengebiet von 55 m²/g, Porenvolumen von 0,181 ml/g Teilchen von < 600 Å Durchmesser, Porenvolumen von 0,163 ml/g Teilchen von > 600 Å Durchmesser, mittlere Teilchengröße von 5,3 μm und Eisenausfluss von 2,8 ppm, wenn wie hier beschrieben, unter Verwendung von ICP untersucht, oder (2) ein Oberflächengebiet von 49 m²/g, Porenvolumen von 0,160 ml/g (< 600 Å Durchmesser), Porenvolumen von 0,163 ml/g > 600 Å Durchmesser), mittlere Teilchengröße von 5,5 μm und Eisenausfluss von 2,0 ppm. Beschreibungen der Glasteilchen, die in den Beispielen unten verwendet werden, werden nachfolgend beschrieben.
Ein Fachmann kann die Lehre der vorliegenden Offenbarung einsetzen, um feste Träger auszuwählen und zu verwenden, die sich von den drei festen Trägern auf Siliziumbasis, die zur Herstellung der pH-abhängigen Ionenaustauscherteilchen verwendet wurden, unterscheiden, deren Synthese und Verwendung in den nachfolgenden Beispielen dargestellt ist. Die Beispiele sind nicht als einschränkend für den Umfang der Erfindung anzusehen. Andere pH-abhängige Ionenaustauschermatrixen und Verfahren zur Verwendung der Matrixen, um Zielmaterial gemäß der Erfindung zu isolieren, sind für den Fachmann der chromatographischen Trennungen und Molekularbiologie offensichtlich.
Beispiele
Die folgenden Beispiele sind aufgeführt, um verschiedene erfindungsgemäße Aspekte darzustellen, ohne deren Umfang einzuschränken:
Beispiel 1- Gelelektrophorese
Proben von Zielnukleinsäuren, die gemäß den nachfolgend beschriebenen Beispielen isoliert worden sind, wurden auf Verunreinigung mit Nukleinsäuren, die kein Ziel sind und auf ihre Größe wie folgt untersucht. Die Proben wurden auf einem Agarosegel geeigneter Dichte (z.B. 1,0 % Agarosegel wurde verwendet, um Plasmid-DNA zu analysieren, während 1,5 % Agarosegel verwendet wurde, um RNA zu analysieren) fraktioniert. Die fraktionierte Nukleinsäure wurde unter Verwendung einer Fluoreszenzmarkierung oder durch Färben des Gels mit einem DNA-empfindlichen Farbstoff, wie Ethidiumbromid oder Silberfärbung, sichtbar gemacht. Die resultierende fraktionierte, sichtbar gemachte Nukleinsäure wurde entweder fotografiert oder unter Verwendung eines Fluorimagers visualisiert und das resultierende Bild wurde unter Verwendung eines Laserdruckers ausgedruckt.
In einigen Fällen wurden Größenstandards auf dem gleichen Gel wie die Zielnukleinsäure fraktioniert und verwendet, um die ungefähre Größe der Zielnukleinsäure zu bestimmen. In jedem Fall wurde eine Geluntersuchung durchgeführt, die Fotografie oder das Fluorbild der fraktionierten Nukleinsäure wurde auf Verunreinigung mit Nukleinsäuren, die kein Ziel sind, inspiziert. Zum Beispiel wurden Bilder der fraktionierten Proben der Plasmid-DNA auf RNA inspiziert, die auf dem gleichen Gel wesentlich schneller läuft als DNA und auf chromosomale DNA, die auf dem gleichen Gel wesentlich langsamer läuft, als Plasmid-DNA. Bilder der isolierten Plasmid-DNA wurden auch inspiziert, um zu bestimmen, ob die meiste Plasmid-DNA, die auf dem Bild gezeigt ist, intakte, gedrehte Plasmid-DNA ist.
Beispiel 2 – Absorptionsspektrophotometrie
Proben von Nukleinsäuren, die aus verschiedenen Media isoliert wurden, wie nachfolgend beschrieben, wurden auch unter Verwendung von Adsorptionsspektrophotometrie untersucht. Absorptionsmessungen wurden bei 260, 280 und 230 Nanometern (nm) durchgeführt. A₂₆₀/A₂₈₀-Absorptionsverhältnisse wurden durch die Messungen berechnet. Ein A₂₆₀/A₂₈₀ größer als oder gleich 1,80 wurde als Indikator interpretiert, dass die analysierte Probe verhältnismäßig frei von Proteinverunreinigung war. Die Konzentration der Nukleinsäure in jeder Probe wurde aus der Absorptionsmessung bei 260 nm (A₂₆₀) bestimmt.
Beispiel 3 – Synthese von porösen magnetischen, pH-abhängigen Ionenaustauscher-Siliziumdioxidteilchen
Verschiedene pH-abhängige Ionenaustauscherliganden wurden an poröse magnetische Siliziumdioxidteilchen gemäß den folgenden Verfahren gebunden. Die magnetischen pH-abhängigen Ionenaustauscher-Siliziumdioxidteilchen, die, wie hier beschrieben, synthetisiert wurden, wurden verwendet, um Zielnukleinsäuren, wie in den nachfolgenden Beispielen beschrieben, zu isolieren.
A. Herstellung von Glycidyl-modifizierten magnetischen Siliziumdioxidteilchen

1. Magnetische Siliziumdioxidteilchen wurden durch Erwärmung unter Vakuum bei 110°C über Nacht aktiviert.
2. 10 g aktivierte Teilchen wurden in 100 ml Toluol und einem Kolben suspendiert und 3,2 ml 3-Glycidylpropyltrimethoxysilan wurden dazugegeben.
3. Der Kolben, der die Mischung enthält, wurde mit einem Kondensator verbunden und die Reaktion wurde 5 Stunden refluxiert. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Reaktion 48 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen.
4. Die Reaktionsmischung wurde anschließend filtriert und das Retentat, einschließlich Glycidyl-modifizierten magnetischen Siliziumdioxidteilchen, die in der Reflux-Reaktion hergestellt wurden, wurden mit Toluol gewaschen (2 × 100 ml), Hexan (2 × 100 ml) und Ethylether (1 × 150 ml). Das gewaschene Produkt wurde stehengelassen, um in der Luft zu trocknen.
5. Ein kleiner Teil des Produktes wurde in einem 110°C Ofen weiter getrocknet und elementar untersucht. Die Ergebnisse (%C 0,75, %H 0,58) sind konsistent mit der Glycidylmodifizierung von Kieselgelteilchen, wie unten in Formel (III) dargestellt. Die wellige Linie in dieser und anderen Formeln, die hier und in den weiteren nachfolgenden Beispielen gezeigt sind, stellt die Oberfläche einer festen Phase dar, eines porösen magnetischen Kieselgelteilchens in diesem bestimmten Beispiel.
worin R -OH, OCH₃ oder -OCH₂CH₃ ist.
6. Die Glycidyl-modifizierten magnetischen Kieselgelteilchen, die, wie oben beschrieben, hergestellt wurden, wurden anschließend weiter über eine Bindung einer Aminosäure, wie Histidin, Alanin oder Cystein an Teilchen durch Reaktion mit dem terminalen Ring des Glycidylanteils, wie nachfolgend beschrieben, modifiziert.

B. Synthese der Glycidyl-Histidin-modifizierten magnetisches Siliziumdioxidteilchen

1. 2,0 g D,L-Histidin wurden in einer Mischung aus 20 ml Tetrahydrofuran und 20 ml Wasser durch Erwärmen der Lösung aufgelöst, um refluxiert zu werden.
2. Zu dieser Lösung wurden 2 g Glycidyl-modifizierte magnetische Siliziumdioxidteilchen gegeben und die resultierende Suspension wurde über Nacht refluxiert (18 Stunden).
3. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung gemischt und das Retentat wurde einmal mit 100 ml Aceton, dreimal mit 150 ml Wasser und einmal mit 150 ml Ether gewaschen. Der Feststoff wurde luftgetrocknet.
4. Ein kleiner Teil des getrockneten Feststoffes aus Schritt 3 wurde bei 110°C getrocknet und eine Elementaranalyse durchgeführt. Ergebnisse: %C 1,35, %H 0,68, %N 0,50. Die Ergebnisse sind konsistent mit der Glycidyl-Histidin-Verbindung, in Figur (XVII) unten gezeigt:
worin R -OH, OCH₃ oder -OCH₂CH₃ ist.

C. Synthese von Glycidyl-Alanin-modifizierten magnetischen Siliziumdioxidteilchen

1. 3-(3-Pyridyl)-D-alanin (1 g) wurde in 20 ml Wasser aufgelöst.
2. Zu dieser Lösung wurden 2 g Glycidyl-modifizierte magnetsiche Siliziumdioxidteilchen gegeben und die resultierende Mischung wurde über Nacht refluxiert.
3. Nach dem Abkühlen wurde die Reaktionsmischung filtriert und zweimal mit Wasser und einmal mit Ethylether gewaschen.
4. Die Elementaranalyse einer Probe des Erzeugnisses aus Schritt 3 zeigte: %C 0,98, %H 0,56, %N 0,20. Die Ergebnisse sind konsistent mit der Glycidyl-Alanin-Modifizierung, in Formel (XVIII) unten dargestellt:
worin R -OH, OCH₃ oder -OCH₂CH₃ ist.

D. Synthese von Glycideyl-Cystein-modifizierten magnetischen Siliziumdioxidteilchen

1. 1 g S-[2-(4-Pyridyl)ethyl]-L-cystein wurde in 20 ml Wasser suspendiert und erwärmt, um das Material aufzulösen.
2. Zu dieser Lösung wurden 2,5 g Glycidyl-modifizierte. magnetische Dioxidteilchen gegeben und die resultierend Mischung wurde über Nacht refluxiert.
3. Nach dem Abkühlen wurde die Reaktionsmischung filtriert und dreimal mit Wasser und Ethylether gewaschen. Das Material wurde luftgetrocknet.
4. Die Elementaranalyse des Materials aus Schritt 3 zeigte: %C 1,08, %H 0,42, %N 0,16. Die Ergebnisse sind konsistent mit der Glycidyl-Cystein-Modifizierung von magnetischen Siliziumdioxidteilchen, in der nachfolgenden Formel (XIX) gezeigt.
worin R -OH, -OCH₃ oder -OCH₂CH₃ ist.

Beispiel 4 – Synthese von nicht-porösem Magnesil, Glasfaser und Kieselgel-Glycidyl-verknüpften, pH-abhängigen Ionenaustauscher festen Phasen
A. Synthese von Glycidyl-Histidin-modifiziertem nicht-porösem magnetischem Siliziumdioxid

1. Glycidyl-Modifizierung: 6 ml nicht-poröse magnetische Siliziumdioxidteilchen (Part Nr. SMR22-552, bereitgestellt von W.R. Grace) wurden in 6 ml Toluol suspendiert und 0,7 ml 3-Glycidylpropyltrimethoxysilan wurden zu der Suspension gegeben. Die resultierende Mischung wurde auf einen Rotationsverdampfer gelegt und über Nacht stehengelassen. Die Reaktionsmischung wurde filtriert und das Retentat, einschließlich des modifizierten magnetischen Kieselgelteilchen-Erzeugnisses, wurden zweimal mit 20 ml Methylenchlorid und einmal mit 20 ml Ethylether gewaschen. Das Erzeugnis wurde unter Vakuum in einem Trockengerät unter Phosphorpentoxid getrocknet. Die Elementaranalyse zeigt: %C 0,3, %H 0,63. Das Ergebnis ist konsistent mit der Glycidyl-Modifizierung, wie oben für Formel (XVI) gezeigt.
2. Histidin-Verknüpfung: 0,5 g D,L-Histidin wurden in einer Mischung aus 4 ml Tetrahydrofuran und 6 ml Wasser aufgelöst. 1,2 g Glycidyl-modifizierte magnetische Kieselgelteilchen wurden zu der Mischung gegeben und die resultierende Suspension wurde 5 Stunden refluxiert. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung filtriert, der Feststoff einmal mit 50 ml Methanol und 50 ml Ethylether gewaschen. Das Erzeugnis wurde unter Vakuum in einem Trockengefäß über Phosphorpentoxid getrocknet. Die Elementaranalyse ergab: %C 0,44, %H 0,64, %N 0,0. Dieses Ergebnis ist konsistent mit der Glycidyl-Verknüpfung von Histidin an die nichtporösen magnetischen Siliziumdioxidteilchen, gemäß der obigen Formel (XVII).

B. Synthese von Glycidyl-Histidin-modifizierten Glasfasern

1. Glycidin-Modifizierung: 0,7 g Glasfaserfilter (Ahlstrom-122, Ahlstrom Filtration Inc., Helsinki, Finnland) wurden in 15 ml Toluol suspendiert und 1,0 ml 3-Glycidylpropyltrimethoxysilan wurde zu der Suspension gegeben. Die resultierende Mischung wurde bei Raumtemperatur 48 Stunden inkubiert. Die Lösung wurde von den resultierenden modifizierten Glasfaserfilterprodukten durch Pipettieren entfernt. Die Filtererzeugnisse wurden zweimal mit 30 ml Methylenchlorid gewaschen, anschließend in Methylenchlorid 30 Minuten eingeweicht und nochmals zweimal mit jeweils 30 ml Methylenchlorid gewaschen. Das Einweich- und Waschverfahren wurde wiederholt. Die Filter wurden unter Vakuum auf einem Rotationsverdampfer getrocknet.
2. Histidin-Verknüpfung: 0,6 g D,L-Histidin wurden in einer Mischung aus 10 ml Tetrahydrofuran und 15 ml Wasser aufgelöst. Die Lösung wurde zu den Filtern gegeben und die resultierende Suspension wurde 20 Stunden refluxiert. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurden die Flüssigkeiten aus der Reaktion durch Pipettieren entfernt und die Filter wurden extensiv mit Wasser und mit Methanol gewaschen. Die gewaschenen Filter wurden über Nacht luftgetrocknet. Die Elementaranalyse des Endproduktes zeigte: %C 0,55, %H 0,16, %N 0,0. Diese Ergebnisse sind konsistent mit der Glycidyl-Histidin-Verknüpfung gemäß der obigen Formel (IV).

C. Synthese von Glycidyl-Histidin-modifiziertem Siliziumdioxidgel

1. Glycidin-Modifizierung: 10,0 g Siliziumdioxidgel 110HP [Chromatographischer Siliziumdioxidgrad 110HP aus W.R. Grace (Baltimore, MD)] wurden in 45 ml Toluol suspendiert und 5,0 ml 3-Glycidylpropyltrimethoxysilan wurden zu der Suspension gegeben. Die resultierende Mischung wurde auf einem Rotationsverdampfer über Nacht gesetzt. Die Reaktionsmischung wurde filtriert und das feste Erzeugnis wurde einmal mit 20 ml Methylenchlorid und einmal mit 20 ml Ethylether gewaschen. Das Erzeugnis wurde unter Vakuum in einem Trockengerät über Phosphorpentoxid getrocknet. Elementaranalyse: %C 7,75, %H 1,67. Diese Ergebnisse sind mit der Glycidin-Modifizierung konsistent.
2. Histidin-Verknüpfung: 10 g jedes des oben modifizierten Siliziumdioxids wurden in 30 ml Tetrahydrofuran und 50 ml Wasser suspendiert. Zu dieser Lösung wurden 3,8 g D,L-Histidin gegeben und die resultierende Suspension wurde über Nacht refluxiert (ungefähr 18 Stunden). Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung filtriert, einmal mit 200 ml Methanol und einmal mit 50 ml Ethylether gewaschen. Das resultierende Erzeugnis wurde unter Vakuum in einem Trockengerät über Phosphorpentoxid getrocknet. Die Elementaranalyse ergab: %C 9,88, %H 1,92, %N 1,68. Diese Ergebnisse sind konsistent mit der Glycidyl-Histidin-Modifizierung gemäß der obigen Formel (IV).

Beispiel 5 – Herstellung von porösen magnetischen Harnstoff-verknüpften pH-abhängigen Ionenaustauscher-Siliziumdioxidteilchen
A. Magnetische Siliziumdioxidteilchen, verknüpft über Harnstoff an Histidin

1. Modifizierung mit Harnstoff: 5 g Histidin-Ethylether-Dihydrochlorid wurden in 50 ml Chloroform und 4,0 ml Triethylamin suspendiert. 4,8 g 3-Isocyanatpropyl-trimethoxysilan wurden zu dieser Lösung tropfenweise über einen Zusatztrichter gegeben und die resultierende Silan-/Chloroformlösung wurde über Nacht gerührt. 2,0 g poröse magnetische Siliziumdioxidteilchen wurden in 25,0 ml Silan-/Chloroformlösung suspendiert und diese Mischung wurde auf einen Rotationsverdampfer 20 Stunden gesetzt. Die resultierende Reaktionsmischung wurde filtriert und das Retentat, das das magnetische Lithiumdioxidteilchen modifiziert in der Reaktion einschloss, wurde einmal mit 50 ml Chloroform und einmal mit 50 ml Ethylether gewaschen. Das gewaschene Erzeugnis wurde in einem Trockengerät unter Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet. Die Elementaranalyse ergab: %C 2,38, %H 0,96, %N 0,81. Diese Ergebnisse sind konsistent mit Ergebnissen, die von mit Harnstoff modifizierten magnetischen Siliziumdioxidteilchen zu erwarten wären.
2. 1,0 g modifizierte Teilchen wurden in 5 % HCl suspendiert und 4 Stunden gerührt. Die Teilchen wurden aus der HCl-Lösung getrennt, mit Wasser gewaschen, in 25 ml Wasser wieder suspendiert und filtriert. Das Retentat, das die modifizierten magnetischen Siliziumdioxidteilchen beinhaltete, wurde einmal mit 50 ml Wasser, einmal mit 50 ml Methanol und einmal mit 50 ml Ethylether gewaschen. Der gewaschene Feststoff wurde unter Vakuum in einem Trockengerät über Phosphorpentoxid getrocknet. Die Elementaranalyse ergab %C 1,59, %H 0,984, %N 0,55. Diese Ergebnisse sind konsistent mit denen, die man erwarten würde von einem über Harnstoff an Histidin verknüpften magnetischen Siliziumdioxidteilchen, wie in Formel (XX) nachfolgend dargestellt.
worin R -OH, -OCH₃ oder -OCH₂CH₃ ist.

B. Synthese von magnetischen Siliziumdioxidteilchen, die an Histamin und Propionat gebunden sind

1. Synthese von N-2-(4-Imidazol)ethyl-N'-3-propyltriethoxysilylharnstoff: 4,5 g Histamin wurden in 50 ml Chloroform suspendiert. 9,8 g 3-Isocyanatopropyltrimethoxysilan wurden tropfenweise zu der Suspension über einen Zufuhrtrichter gegeben und die resultierende Reaktion über Nacht gerührt. Nach dieser Reaktionsperiode wurde bis zur Trockenheit verdampft. Das Erzeugnis wurde nicht weiter gereinigt. Die Ergebnisse der Analyse dieses Zwischenproduktes unter Verwendung von nuklearer magnetischer Resonanzspektroskopie (NMR) war konsistent mit dem, was erwartet werden würde von N-2-(4-Imidazol)ethyl-N'-3-propyltriethoxysilylharnstoff. Genauer gesagt, NMR (CD3OD)-Ergebnisse, die festgestellt wurden, waren: 7,6 ppm (s,1H), 6,8 (s,1H), 4,7 (breit s,4H), 3,8 (q,4H), 3,6 (q,1H) 3,36 (t,2H), 3,30 (m,1H), 3,07 (t,2H), 2,72 (t,2H), 1,55 (m,2H), 1,2 (m,6H).
2. Verknüpfung von Histamin über Harnstoff: 1,0 g magnetische Siliziumdioxidteilchen wurden in 10 ml Chloroform suspendiert und 1,2 g N-2-(4-Imidazol)-ethyl-N'-3-propyltriethoxysilylharnstoff, hergestellt im obigen Schritt 1, wurden zu der Suspension gegeben. Die resultierende Mischung wurde auf einen Rotationsverdampfer 48 Stunden gesetzt. Die Reaktion wurde filtriert und in 40 ml Chloroform wieder suspendiert. Der Feststoff wurde filtriert und mit Chloroform und Ethanol gewaschen. Der Feststoff wurde in einem Trockengerät unter Vakuum über Phosphorpentoxid 2 Stunden getrocknet. Die Elementaranalyse ergab (%C 5,46, %H 1,16, %N 2,35) und war konsistent mit den Ergebnissen, die man erwarten würde von magnetischen Siliziumdioxidteilchen, die mit Histamin modifiziert sind.
3. Methylpropionat-Modifizierung: 1 g der gesamten Menge der Histamin-modifizierten magnetischen Siliziumdioxidteilchen aus dem obigen Schritt 2 wurden in 10 ml Toluol suspendiert und 1,0 ml 2-(Carbomethoxy)ethyltrichlorsilan wurden tropfenweise unter Rühren zugegeben. Die resultierende Reaktionsmischung wurde 2 Stunden gerührt. Nach dieser Zeit wurde der Feststoff filtriert und mit Chloroform und Ethanol gewaschen. Das Erzeugnis wurde unter Vakuum eine Stunde in einem Trockengerät über Phosphorpentoxid getrocknet. Die Ergebnisse der Elemtaranalyse (%C 7,24, %H 1,52, %N 2,07) waren konsistent mit der Methyl-Propionat-Modifizierung von Histamin-modifizierten Teilchen.
4. Entfernung der Methylgruppe aus den Propionatresten: 1 g magnetische Siliziumdioxidteilchen, die in Schritt 3 modifiziert wurden, wurden in 5 % HCl suspendiert und 4 Stunden gerührt. Die Reaktionserzeugnisse wurden aus der Lösung über Filtrierung getrennt. Das Retentat des Reaktionserzeugnisses, das die modifizierten Teilchen umfasste, wurde mit Wasser und Methanol gewaschen. Das gewaschene Erzeugnis wurde unter Vakuum in einem Trockengerät über Phosphorpentoxid getrocknet. Die Ergebnisse der Elementaranalyse (%C 6,14, %H 1,37, %N 1,47) waren konsistent mit magnetischen Siliziumdioxidteilchen, die über Harnstoff an Histamin gebunden sind und auch durch Propionat modifiziert sind, gemäß der nachfolgenden Formel (XXI):
worin R¹ und R³ unabhängig voneinander -OH, -OCH₃ oder -OCH₂CH₃ sind, R² -(OSiR₂ ²)_y-R² ist, worin y mindestens 0 ist und R⁴ -(OSiR₃ ²)_z-R³ ist, worin z mindestens 0 ist.

C. Synthese von magnetischen Siliziumdioxidteilchen, die an Histidin und Propionat gebunden sind.

1. Histidin wurde kovalent an magnetische Siliziumdioxidteilchen über eine Harnstoffverknüpfung gebunden unter Verwendung eines Verfahrens ähnlich zu dem, das verwendet wurde, um Histamin in dem obigen Teil A dieses Beispiels anzuknüpfen.
2. Die gleichen beiden Endschritte, die verwendet wurden, um Propionat an die Harnstoff-verknüpften Histaminteilchen im obigen Teil B des Beispiels zu verknüpfen wurden verwendet, um kovalent Propionat an die magnetischen Siliziumdioxidteilchen, die an Histidin über Propionat gebunden sind, zu verknüpfen.

Beispiel 6 – Herstellung von gereinigtem Lysat aus Plasmid-DNA
E. coli Bakterienzellen, DH5α-Stamm, wurden mit pGL3-Kontrollvektor (Promega) Plasmid-DNA transformiert und in einer Luria-Brühe ("LB")-Medium bei 37°C über Nacht kultiviert, anschließend durch Zentrifugierung geerntet.
Die folgenden Lösungen wurden verwendet, um ein Lysat aus geernteten Zellen herzustellen, wie nachfolgend beschrieben:
Zellsuspensionslösung:

50 mM Tris-HCl, pH 7,5
10 mM EDTA
100 μg/ml DNase-freie Ribonuklease A (RNase A)

Wizard^®-Neutralisierungspuffer (Promega Corp.):

1,32 M KOAc (Kaliumacetat), pH 4,8

Zell-Lyse-Lösung:

0,2 M NaOH
1 % SDS (Natriumdodecylsulfat)

Ein gereinigtes Lysat aus transformierten Zellen wurde wie folgt hergestellt:

1. Die Zellen aus 1 bis 10 ml Bakterienkultur wurden durch Zentrifugieren der Kultur 1 bis 2 Minuten bei einer Höchstgeschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge geerntet. Die geernteten Zellen wurden in 250 μl Zellresuspensionslösung wieder suspendiert und in ein Mikrozentrifugenröhrchen übertragen. Die resultierende Lösung der wieder suspendierten Zellen war trüb.
2. 250 μl Zell-Lyse-Lösung wurden anschließend zu der Lösung der suspendierten Zellen gegeben und durch Inversion, bis die Lösung verhältnismäßig klar wurde, gemischt, was anzeigt, dass die suspendierten Zellen lysiert waren.
3. 350 μl Wizard^®-Neutralisierungspuffer wurden zu der Lysatlösung gegeben und durch Inversion gemischt. Das Lysat wurde, nachdem die Neutralisierungslösung zugegeben worden war, trüb.
4. Die Lösung wurde anschließend in einer Mikrozentrifuge bei hoher Geschwindigkeit (ungefähr 12.000 G) 10 Minuten gedreht, um das Lysat zu reinigen.

Beispiel 7 – Isolierung der Plasmid-DNA unter Verwendung von porösen magnetischen Glycidyl-Histidin pH-abhängigen Ionenaustauscher-Siliziumdioxidteilchen
Alle Präparate wurden in 1,5 ml Röhrchen verarbeitet und alle Schritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt:

1. Das gereinigte Lysat aus Schritt 5 des Beispiels 6 wurde in ein klares 1,5 ml Röhrchen, enthaltend 150 μl pH-abhängiger poröser magnetischer Ionenaustauscher-Siliziumdioxidteilchen (15 mg Teilchen), die an Histidin über einen Glycidylanteil gebunden sind, übertragen, wobei die Teilchen wie in Beispiel 3B hergestellt wurden. Die resultierende Mischung der Teilchen und die Lösung wurden gewirbelt und bei Raumtemperatur 5 Minuten inkubiert.
2. Die magnetischen Ionenaustauscher-Siliziumdioxidteilchen, die in dem Röhrchen enthalten waren, wurden gegen die innere Seitenwand des Röhrchens durch magnetische Kraft gehalten, während die Röhrchenkappe und die Seitenwand mit Lysatlösung viermal durch Inversion gewaschen und eine Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen wurden. Die Lösung wurde entfernt und verworfen.
3. Die Teilchen, Röhrchen und Kappe wurden mit 1,0 ml nanoreinem Wasser gewaschen.
4. Magnetische Kraft wurde verwendet, um die magnetischen Siliziumdioxidteilchen in dem Röhrchen zu halten, während die Flüssigkeit in dem Röhrchen und von der Röhrchenkappe entfernt wurden. Die Flüssigkeit wurde verworfen.
5. Die Teilchen wurden durch Wirbeln in 300 μl 66 mM Kaliumacetat und 800 mM NaCl (pH 4,8) wieder suspendiert. Schritt 3 wurde wiederholt.
6. Schritt 5 wurde dreimal wiederholt, insgesamt für vier Salzwaschungen.
7. Die magnetischen Siliziumdioxidteilchen, die in dem Röhrchen verblieben, wurden in 1,0 ml nanoreinem Wasser suspendiert.
8. Die magnetischen Ionenaustauscher-Siliziumdioxidteilchen wurden aus Wasser durch magnetische Kraft getrennt. Die Röhrchenkappe und Seitenwand wurde mit Wasser durch Röhrcheninversion (4X) gewaschen und eine Minute stehengelassen.
9. Die Flüssigkeit wurde aus dem Röhrchen und der Kappe entfernt.
10. Schritte 7 bis 9 wurden insgesamt für zwei Waschungen mit Wasser wiederholt.
11. 100 μl 10 mM Tris, pH 8,0, wurden zu dem Röhrchen gegeben, um die DNA zu eluieren und das Röhrchen wurde gründlich gewirbelt.
12. Die magnetischen Ionenaustauscher-Siliziumdioxidteilchen wurden aus dem Eluat durch magnetische Kraft getrennt und das Eluat in ein sauberes Röhrchen überführt.

Die analysische Analyse des Eluats aus Schritt 12 zeigte, das Plasmid-DNA erhalten wurde, die verhältnismäßig frei von kontaminierenden Proteinen oder anderen Nukleinsäuren war.
Genauer gesagt zeigt die Analyse des Eluats unter Verwendung von Gelelektrophorese gemäß dem obigen, in Beispiel 1 aufgeführten Verfahren, keine RNA- oder chromosomale RNA-Verunreinigung. Die Analyse des Eluats unter Verwendung von Absorptionsspektroskopie, wie in Beispiel 2 beschrieben, zeigte, dass die Ausbeute pGL-3-Plasmid DNA bei 30 μg betrug. Die Ergebnisse des Absorptionsverhältnisses (A₂₆₀/A₂₈₀-Verhältnis von 1,84) zeigten, dass die nach dem obigen beschriebenen Verfahren isolierte Plasmid-DNA frei von Proteinverunreinigung war.
Beispiel 8 – Isolierung der Plasmid-DNA aus einem gereinigten Lysat unter Verwendung von Glycidyl-Histidin-Glasfasern
Ein gereinigtes Lysat aus 5 ml DH5α-Zellen, die mit der pGL3-Kontrollvektor-Plasmid-DNA transformiert waren, und über Nacht kultiviert worden sind, wurden wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt. Das gereinigte Lysat wurde zu einer Säule, enthaltend 42 mg Ahlstrom 121-Glasfaser, modifiziert durch Glycidyl-Histidin, wie im obigen Beispiel 4B beschrieben, gegeben. Nach 10minütiger Bindungszeit wurde die Säule zentrifugiert, um die alkalische Lysatlösung zu entfernen. Die Säule wurde anschließend unter Verwendung von 700 μl nanoreinem Wasser gewaschen, das durch Säulenzentrifugierung entfernt wurde. Diese Wasserwaschung wurde zweimal wiederholt (insgesamt für drei Waschungen). Die DNA wurde mit einer 100 μl 10 mM Tris, pH 8,0, eluiert und die Lösung in einem 1,5 ml Röhrchen durch Säulenzentrifugierung gesammelt. Die eluierte DNA wurde durch Gelelektrophorese gemäß dem in Beispiel 1 aufgeführten Verfahren untersucht und keine RNA- oder chromosomale DNA-Verunreinigung wurde nachgewiesen. Die Analyse durch Atomabsorptionsspektroskopie zeigte eine DNA-Ausbeute von 36 μg und ein A₂₆₀/A₂₈₀-Verhältnis von 1,86.
Die Säule wurde mit 400 μl 10 mM Tris, pH 8,0, gewaschen (das durch Säulenzentrifugierung entfernt wurde) und wieder mit 2 × 700 μl 100 mM Tris, 2,0 M NaCl (ebenfalls durch Säulenzentrifugierung entfernt) gewaschen. Die Säule wurde anschließend mit 700 μl nanoreinem Wasser (durch Säulenzentrifugierung entfernt) gewaschen und 12 Stunden bei Raumtemperatur luftgetrocknet.
Die Säule wurde wieder den oben beschriebenen Verfahren folgend verwendet. Die resultierende DNA zeigte wieder keine sichtbare RNA durch Gelelektrophorese und die DNA-Ausbeute betrug 30 μg und das A₂₆₀/A₂₈₀-Verhältnis 1,84.
Beispiel 9 – Isolierung von Plasmid-DNA aus einem gereinigten Lysat unter Verwendung von nicht-porösen Glycidyl-Histidin-Ionenaustauscherteilchen, die mit Glycidyl-Histidin funktionalisiert sind
Ein gereinigtes Lysat aus DH5α-Zellen, die mit pGL3-Kontrollvektor-Plasmid-DNA transformiert sind, wurden wie in Beispiel 6 beschrieben, hergestellt, außer dass 500 μl und nicht 350 μl Wizard^®-Neutralisierungspuffer zu den lysierten Zellen in Schritt 3 gegeben wurden. Die Plasmid-DNA wurde aus dem gereinigten Lysat unter Verwendung von nicht-porösen Glycidyl-Histidin-Siliziumdioxidteilchen, die wie in Beispiel 4A beschrieben, wie folgt hergestellt:
Das gereinigte Lysat wurde mit 15 mg Glycidyl-Histidin-nicht-porösen Siliziumdioxidteilchen in einer 3 ml Spritze kombiniert und bei Raumtemperatur 1 Stunde stehengelassen.
Das Lysat wurde anschließend durch die Spritze mit positivem Druck gedrückt. Zwei 1,0 ml Waschungen mit nanoreinem Wasser wurden durchgeführt unter Verwendung von positivem Druck, um die Flüssigkeit zu entfernen. Dann wurden 100 μl 10 mM Tris, pH 8,0, verwendet, um die DNA zu eluieren. Die eluierte DNA wurde durch positiven Druck in ein klares 1,5 ml Röhrchen überführt.
Die Analyse durch Gelelektrophorese, gemäß dem Verfahren nach Anspruch 1, zeigte, dass das Eluat supergedrehte Plasmid-DNA enthielt und es bestand kein Hinweis auf Verunreinigung mit chromosomaler DNA oder RNA. Die Absorptionsanalyse des Eluats, gemäß dem Verfahren nach Beispiel 2, zeigte eine Ausbeute von 10 mg DNA und ein Absorptionsverhältnis A₂₆₀/A₂₈₀ von 1,61.
Beispiel 10 – Isolierung von Plasmid-DNA aus einem gereinigten Lysat unter Verwendung von porösem magnetischem Siliziumdioxid-Glycidin-Alanin
Plasmid-DNA wurde aus DH5α E. coli Bakterienzellen, die mit pGEM-3Zf+ DNA transformiert sind, wie folgt isoliert. Die Präparate wurden in 1,5 ml Röhrchen weiter verarbeitet. Alle Schritte wurden bei Raumtemperatur, wenn unten nicht anders angegeben, durchgeführt.

1. 2,5 ml Wizard^®-Resuspensionslösung wurden zu 50 ml Pellets des Transformanten gegeben und kräftig gewirbelt, um die Zellen zu suspendieren.
2. 265 μl wieder suspendierte Zellen wurden zu zwei Röhrchen gegeben.
3. 250 μl Wizard^®-Lysepuffer wurden pro Tube zugegeben und behutsam gemischt, um das Sheering von Genom-DNA zu vermeiden.
4. 350 μl Wizard^®-Neutralisierungslösung wurden pro Tube zugegeben und behutsam gemischt.
5. Die Röhrchen wurden bei 14000 Upm 10 Minuten zentrifugiert.
6. Die gereinigte Lösung wurde entfernt und in ein saures 1,5 ml Röhrchen, enthaltend 150 μl 100 mg/ml (15 mg) magnetische Glycidyl-Analin-Siliziumdioxidteilchen, die hergestellt wurden, wie im obigen Beispiel 3C beschrieben, überführt. Die resultierende Mischung wurde gewirbelt und 5 Minuten inkubiert.
7. Die Teilchen wurden aus der Mischung unter Verwendung einer magnetischen Trennvorrichtung getrennt. Die Röhrchenkappen wurden durch Röhrcheninversion (4X) gewaschen und eine Minute inkubiert.
8. Die Flüssigkeit wurde aus Röhrchen, einschließlich Kappen entfernt.
9. Die Röhrchen wurden mit 1,0 ml nanoreinem Wasser gewaschen.
10. Die Schritte 7 und 8 wurden wiederholt.
11. Die Schritte 9 und 10 wurden zweimal wiederholt, insgesamt für 3 Waschungen.
12. Ein Elutionspuffer von 100 μl 20 mM Tris-HCl, pH 9,5 wurden zu dem Röhrchen gegeben. Die Teilchen und Puffer wurden gut gemischt, so dass es der Plasmid-DNR, die an die Teilchen adsorbiert worden ist, ermöglicht worden war, daraus zu eluieren.
13. Die Teilchen wurden aus dem resultierenden Eluat durch magnetische Kraft getrennt. Die Eluatlösung in jedem Röhrchen wurde in ein sauberes Röhrchen übertragen.

Zweifache Isolierungen, die gemäß dem obigen beschriebenen Verfahren durchgeführt worden sind, ergaben Ausbeuten von 21,7 μg (A₂₆₀/A₂₈₀ 186) und 16,1 μg (A₂₆₀/A₂₈₀ 1,89) Plasmid-DNA. Keine RNA war durch Analyse unter Verwendung von Gelelektrophorese sichtbar.
Beispiel 11 – Vergleich der Gegenionbedingungen, die erforderlich sind, um Plasmid-DNA aus magnetischen Harnstoff-verknüpften Histamin-Siliziumdioxidteilchen und magnetischen Harnstoff-verknüpften Histamin-Propionat-bimodalen Ionenaustauscher-Siliziumdioxidteilchen bei unterschiedlichen pH's zu eluieren
Die minimale Menge Natriumchlorid und Puffer, die erforderlich ist, um Plasmid-DNA aus jeweils zwei unterschiedlichen Arten von magnetischen, pH-abhängigen Ionenaustauscher-Siliziumdioxidteilchen zu eluieren, wurde bei eben der unterschiedlichen verschiedenen pH's gemäß dem folgenden Verfahren untersucht. Eine der beiden Arten von Teilchen, die in diesem Assay verwendet wurden, waren magnetische Siliziumdioxidteilchen, die an Histidin über einen Harnstoffrest gebunden sind (im vorliegenden Beispiel als "Harnstoff-Histidin-IE-Teilchen" bezeichnet), wie im obigen Beispiel 5A beschrieben, hergestellt. Die andere Art von in diesem Beispiel verwendete Teilchen waren magnetische Siliziumdioxidteilchen, die direkt an Propionat und Histamin über einen Harnstoffrest gebunden sind (hiernach als "bimodale Histamin-Propionat-IE-Teilchen" bezeichnet), hergestellt wie im obigen Beispiel 5B. Die Elementaranalysen der bimodalen Histamin-Propionat-IE-Teilchen zeigten 260 μmol Histamin und 900 μmol Propionat.
Die gereinigten Lysate wurden aus dem DH5α-Stamm der E. coli Bakterienzellen, die mit pGL-3-Kontrollvektor (Promega) transformiert sind, wie im obigen Beispiel 6 beschrieben, hergestellt und wie folgt modifiziert. Die Zellen aus 50 ml einer Übernachtkultur der Transformanten wurde durch Zentrifugierung geerntet und in 2,5 ml Wizard^®-Resuspensionslösung wieder suspendiert. Die Zellen wurden durch Zugabe von 2,5 ml Wizard^®-Lyselösung zu den suspendierten Zellen lysiert. 3,5 ml Wizard^®-Neutralisierungslösung wurden zu dem resultierenden Lysat gegeben. Das Lysat wurde durch Zentrifugierung gereinigt und der Überstand in ein steriles 50 ml Röhrchen überführt.
Die Harnstoff-Histidin-IE-Teilchen und bimodalen Histamin-Propionat-IE-Teilchen wurden untersucht und miteinander auf ihre Fähigkeit untersucht, Plasmid-DNA aus dem gereinigten Lysat, das wie gerade zuvor beschrieben hergestellt worden war, zu binden und freizugeben. Die Elutionslösung, die verwendet wurde, um Plasmid-DNA mit jedem der zwei Arten von Teilchen zu isolieren, variierte mit einem pH, der zwischen pH 4,2 und 9,5 lag:

1. 700 μl gereinigtes Lysat wurden zu jedem 1,5 ml Mikrofugenröhrchen in jeweils vier Sätzen aus zwei Proben für jeweils zwei Arten von zu untersuchenden Teilchen gegeben. Jedes 1,5 ml Mikrofugenröhrchen enthielt 150 μl einer der beiden Arten von Teilchen (15 mg). Jedes Röhrchen wurde mit einer Kappe versehen und durch Inversion gemischt. Die resultierende Suspension wurde bei Raumtemperatur 5 Minuten inkubiert.
2. Die Teilchen und Lösung wurden durch magnetische Kraft getrennt und die Lösung aus jedem Röhrchen entfernt. 1,0 ml nanoreines Wasser wurde zu jedem Röhrchen gegeben, um die Teilchen zu waschen, von den Teilchen durch magnetische Kraft getrennt, und aus dem Röhrchen entfernt. Für alle Sätze der Proben, außer derjenigen, die bei einem pH von weniger als pH 5 eluiert werden (z.B. Proben, die bei 4,2 oder 4,8 eluiert werden), wurde die Wasserwaschung wiederholt.
3. Die Teilchen wurden in 300 μl mutmaßlicher Elutionslösung suspendiert. Die Teilchen wurden magnetisch getrennt und die Lösung vorsichtig in ein saures 1,5 ml Röhrchen überführt. Die Salzkonzentration der Elutionslösung war durch Zugabe von entweder Wasser oder 5 M NaCl bis auf eine Endkonzentration von 1 M NaCl modifiziert. Die DNA (wenn vorhanden) wurde durch Ausfällung mit 1,0 ml –20°C Ethanol konzentriert. Die DNA wurde durch Zentrifugierung in einer Mikrofuge bei 12.000 × g 10 Minuten pelletiert. Die Pellets wurden getrocknet, um Ethanol zu entfernen und in 100 μl 10 mM Tris HCl, pH 9,5 suspendiert.
4. Die in Schritt 3 zurückgebliebenen Teilchen wurden einmal mit 1,0 ml nanoreinem Wasser gewaschen, und anschließend als Teilchen zu Beginn von Schritt 3 behandelt. Auf diese Weise wurde eine Vielzahl von Elutionslösungen auf eine schrittweise Art unter Verwendung der gleichen DNA-gebundenen Teilchen untersucht.
5. Bei Elutionsbedingungen über pH 8,0 wurden 100 μl 10 mM Tris-HCl im Fall der bifunktionalen IE-Teilchen verwendet. Ähnliche Untersuchungen der Harnstoff-Histamin-IE-Teilchen zeigten keine DNA-Elution bei 10 mM Tris-HCl, sogar bei pH 9,5. Die eluierte DNA wurde durch Gelelektrophorese untersucht, um die minimale Gegenionkonzentration zu bestimmen, die für die DNA-Elution erforderlich ist. Sobald die ungefähre Konzentration bestimmt worden war, wurde das Verfahren wiederholt, um die Konzentration von Kaliumacetat und NaCl bei pH 4,8 und die Konzentration von Tris-HCl und NaCl bei pH 7,3 und pH's über 7,3 zu bestätigen.

Die Elutionsbedingungen, die bei jedem Satz von Proben, die wie oben beschrieben hergestellt worden waren, verwendet wurden, sind in Tabelle 1 unten gezeigt:
Tabelle 1
Die Ergebnisse oben zeigen, dass die Zugabe von Propionatgruppen zu Harnstoff-Histidin-IE-Teilchen die Menge der Gegenkonzentration verringert, die erforderlich ist, um DNA aus diesen Teilchen zu eluieren.
Beispiel 12 – Isolierung von PCR-amplifizierter DNA aus einzeln inkorporierten Nukleotiden und Primern unter Verwendung von nicht-porösen magnetischen Glycidyl-Histidin pH-abhängigen Ionenaustauscher-Siliziumdioxidteilchen. Ähnliche Reinigung von pCR-amplifizierter DNA unter Verwendung von porösen magnetischen Glycidyl-Cystein pH-abhängigen Ionenaustauscher-Siliziumdioxidteilchen
Das humane APC (Adenomatous Polypoptosis Coli) Gen wurde in einer PCR-Amplifizierungsreaktion amplifiziert, wobei humane Genom-template-DNA zu einer Reaktionsmischung gegeben wurde, die:
40 μl 10X AmpliTaq^®-PCR-Puffer (kein Mg++) [Perkin Elmer],
40 μl 25 mM MgCl₂,
13 μl 10 mM dNTP-Mischung,
13 μl APC-Primer (50 pmole/μl) mit Nukleotidsequenzen:
5'GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GAA CAG ACC ACC ATG CAA ATC CTA AGA GAG AAC AAC TGT C3' [SEQ ID NO:1], und 5'CAC AAT AAG TCT GTA TTG TTT CTT3' [SEQ ID NO:2],
6,4 μl AmpliTaq^® [Perkin Elmer] und
273,6 μl nanoreines Wasser (insgesamt = 392 μl] enthält.
Die Amplifizierungsreaktion wurde über 35 Zyklen in einem Perkin Elmer 4800 Thermocycler laufen gelassen. Ein 1,8 kb DNA-Produkt war das Amplifizierungsergebnis.
Das resultierende PCR-amplifizierte Gen wurde von anderen Komponenten in der Reaktionsmischung gemäß dem folgenden Isolierungsverfahren isoliert:

1. 20 μl PCR-Reaktionsmischung wurden zu 200 μl 66 mM KOAc+900mM NaCl, pH 4,8 gegeben und gemischt. Anschließend wurden 20 μl (2 mg) nicht-poröse Glycidyl-Histidin-magnetische Siliziumdioxidteilchen zugegeben.
2. Nach dem Mischen wurde die Lösung 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Teilchen wurden durch Verwendung einer magnetischen Trennvorrichtung getrennt und die Lösung wurde in ein sauberes 1,5 ml Röhrchen überführt.
3. Die Teilchen wurden durch Wirbeln in 200 μl nanoreinem Wasser suspendiert und aus der resultierenden Lösung getrennt. Die Teilchen wurden unter Verwendung einer magnetischen Trennvorrichtung getrennt, die Kappe und die Seitenwände des Röhrchens wurden durch Invertieren des Röhrchens gewaschen und die Lösung wurde aus der Kappe und dem Röhrchen entfernt und in ein saures 1,5 ml Röhrchen überführt.
4. Die PCR-amplifizierte DNA wurde in 20 μl 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 eluiert. Die Teilchen wurden durch magnetische Kraft getrennt und die eluierte DNA wurde in ein saures 1,5 ml Röhrchen überführt.
5. Unter Verwendung von Gelelektrophorese (siehe Beispiel 1) wurden die Lösungen, die in den Schritten 2, 3 und 4 erhalten wurden, mit einer Probe der ursprünglichen PCR-Reaktion verglichen. Die Lösung aus Schritt 2 zeigte keine sichtbare PCR-amplifizierte DNA. Die Lösung aus Schritt 2 zeigte eine kleine Menge (ungefähr 10 % der Anfangsmenge) der PCR-DNA. Die Lösung aus Schritt 4 zeigte eine PCR-DNA-Menge, > 80 % der Anfangsmenge in der Reaktionsmischung und keine sichtbaren, nicht eingeführten Primer und Nukleotide, wie sie in der Anfangs-PCR-Reaktionslösung zu sehen sind.

Das gleiche Verfahren wurde unter Verwendung von MagneSil^TM (kein Histidinligand) porösen Teilchen verfolgt und führte zu keiner sichtbaren DNA am Ende von Schritt 4.
Die gleiche Amplifizierungsmischung wurde unter Verwendung von porösen magnetischen Glycidyl-Cystein-pH-abhängigen Ionenaustauscher-Siliziumdioxidteilchen und unter Verwendung von magnetischen Siliziumdioxidteilchen (als Kontrolle) gemäß dem folgenden Verfahren gereinigt:

1. Drei 1,5 ml Röhrchen wurden mit 20 μl Amplifizierungsmischung, die mit 200 μl 33 mM KOAc/400 mM NaCl, pH 4,8, gemischt worden war, versehen. Zu den Röhrchen 1 und 2 wurden 20 μl (2 mg) Mag-IE-Glycidyl-Cystein zugegeben und gemischt. Zum Röhrchen 3 wurden 20 μl Magnesil^TM-Teilchen gegeben und gemischt.
2. Jedes Röhrchen wurde bei 20°C 10 Minuten inkubiert und die Teilchen in jedem Röhrchen wurden aus der Lösung in jedem Röhrchen durch magnetische Kraft 2 Minuten getrennt.
3. Die Lösung wurde von jedem Röhrchen entfernt. Die Lösungen der Röhrchen 1 und 2 wurden gemäß den nachfolgenden Schritten 4 und 5 weiter behandelt. Die Teilchen in Röhrchen 3 wurden in 33 mM KOAc/400 mM NaCl, pH 4,8 magnetisch 2 Minuten getrennt und die Lösung entfernt und gemäß den nachfolgenden Schritten 4-5 weiter verarbeitet.
4. Die Teilchen wurden in 200 μl nanoreinem Wasser suspendiert, magnetisch getrennt und die Lösung aus dem Röhrchen entfernt.
5. DNA wurde in 20 μl 50 mM Tris-HCl, pH 9,5 eluiert.

Die Eluate der ursprünglichen Reaktionserzeugnisse der Amplifizierung und die Eluate von Magnesil^TM (Röhrchen 1, oben) und Mag-IE-Glycidyl-Histidin (Röhrchen 2-3, oben) wurden durch Elektrophorese analysiert, wie im obigen Beispiel 1 beschrieben. Das resultierende Gel wurde mit Ethidiumbromid gefärbt und eine Fotografie wurde unter W-Licht gemacht. 4 zeigt das Gel mit:

Bahn 1:	Eluat der Magnesil^TM-Teilchen (Röhrchen 1, oben).
Bahn 2:	Eluat der Mag-IE-Glycidyl-Histidin-Teilchen (Röhrchen 2, oben) mit keinem Waschschritt vor der Übertragung der Teilchen aus der Amplifikationsreaktionslösung zum nanoreinen Wasser in Schritt 4, oben.
Bahn 3:	Eluat der Mag-IE-Glycidyl-Histidin-Teilchen (Röhrchen 3, oben) nach dem Waschen der Teilchen in 33 mM KOAc/400 mM NaCl, pH 4,8 vor der Übertragung in nanoreines Wasser in Schritt 4, oben.
Bahn 4:	Aliquot der amplifizierten DNA-Reaktionsmischung.

Es ist zu bemerken, dass die amplifizierte DNA-Reaktionsmischung Banden einschließt außer den des gewünschten Amplifizierungserzeugnisses. Es scheint, dass die Magnesil^TM-Teilchen nicht jede nachweisbare Menge der amplifizierten DNA-Fragmente isolierte, da keine Banden in Bahn 1 der 4 sichtbar sind. Beide Isolierungsverfahren mit Mag-IE-Glycidyl-Histidin erzeugten amplifizierte DNA, die aus niedrigmolargewichtigen Arten isoliert wurden (die Bande unter der primären Bande in Bahn 4). Beträchtlich mehr amplifizierte DNA wurde jedoch bei Röhrchen 2 hergestellt, ohne den zusätzlichen Waschschritt, als bei Röhrchen 3 isoliert wurde mit dem zusätzlichen Waschschritt.
Beispiel 13 – Isolierung der humanen Genom-DNA aus bukkalen Bausch unter Verwendung von nicht-porösen magnetischen Glycidyl-Histidin-Siliziumdioxidteilchen
Genom-DNA wurde aus bukkalen Bauschen unter Verwendung von nicht-porösen magnetischen Glycidyl-Histidin-Ionenaustauscher-Siliziumdioxidteilchen, die, wie oben in Beispiel 3B beschrieben, synthetisiert worden waren, wie folgt isoliert:
Gewebeproben wurden aus zwei inneren Backengebieten des Menschen unter Verwendung von Baumwolltupfen (bukkale Sammlung) erhalten und die Tupfen wurden bei Raumtemperatur 10 Minuten in 700 μl Zellysepuffer (75 mM Na-Citrat, pH 5,0/1,5 % Tween) in einem 1,5 ml Mikrofugenröhrchen, wobei gelegentlich gerührt wurde, stehengelassen. Die Tupfen wurden entfernt und die Flüssigkeit in den Tupfen wurde herausgedrückt, indem sie über die Öffnung des Röhrchens geführt wurden, wobei die Tupfen in das Innere des Röhrchens gedrückt wurden.
30 μl Proteinase I (18 mg/ml) wurde zu dem Röhrchen gegeben und 50 μl (5 mg) nicht-poröse magnetische Glycidyl-Histidin-Siliziumdioxidteilchen wurden pro Röhrchen zugegeben und gut gemischt. Die Proben wurden bei Raumtemperatur 5 Minuten inkubiert unter gelegentlichem Mischen durch Röhrcheninversion.
Die Röhrchen wurden in einen magnetischen Ständer platziert, um die Trennung der Lösung und der Teilchen zu ermöglichen, und die Lösung wurde aus dem Röhrchen entfernt.
Die Teilchen wurden zweimal mit 1,0 ml nanoreinem Wasser gewaschen. Nach der Entfernung der zweiten 1 ml Wasserwaschung wurde die DNA in 40 μl 20 mM Tris-HCl, pH 9,5 bei 65°C 5 Minuten eluiert.
Magnetische Kraft wurde verwendet, um die Teilchen von der eluierten DNA zu trennen.
Die eluierte DNA wurde durch Gelelektrophorese, wie oben in Beispiel 1 beschrieben, untersucht und mit einer Kontrollprobe bekannter Genom-DNA-Menge verglichen, um die Menge der eluierten DNA zu schätzen. Es wurde festgestellt, dass jede 40 μl Probe der eluierten DNA mehr als 100 ng Genom-DNA enthält.
Beispiel 14 – Vergleich der Gegenion-Bedingungen, die erforderlich sind, um Plasmid-DNA aus magnetischen Harnstoff-Histidin pH-abhängigen Ionenaustauscher-Siliziumdioxidteilchen und magnetischen Harnstoff-Histidin-Propionat bimodalen, pH-abhängigen Ionenaustauscher-Siliziumdioxidteilchen zu eluieren.
Die minimale Menge an Natriumchlorid und Puffer, die erforderlich sind, um Plasmid-DNA aus jeweils zwei unterschiedlichen Arten von magnetischen pH-abhängigen Ionenaustauscher-Siliziumdioxidteilchen zu trennen, wurde bei jedem der verschiedenen pH's bestimmt, gemäß dem folgenden Verfahren. Magnetische Harnstoff-Histidin-IE-Siliziumdioxidteilchen, die wie in Beispiel 5A hergestellt wurden, und magnetischen bimodalen Harnstoff-Histidin-Propionat-IE-Siliziumdioxidteilchen, die wie im Beispiel 5C beschrieben hergestellt worden waren, wurden verwendet, um Plasmid-DNA aus gereinigtem Lysat wie folgt zu isolieren. Gereinigte Lysate wurden wie im Beispiel 11 beschrieben hergestellt. Das Verfahren zum Vergleichen der Elutionsprofile der beiden Teilchen entsprach der in Beispiel 11 beschriebenen. Die untersuchten pH's betrugen 4,8, 7,3 und 9,5. Die erhaltenen Ergebnisse sind unten in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
Bei der spektrophotometrischen Analyse ergaben die Elutionen in 100 μl 10 mM Tris HCl, pH 9,5 30 μg (A₂₆₀/A₂₈₀ 1,78) DNA-Ausbeute für die bimodalen Harnstoff-Histidin-Propionat-IE-Teilchen und weniger als 2 μg DNA-Ausbeute für die Harnstoff-Histidin-IE-Teilchen. Keine DNA wurde bei Analyse des Eluats der Harnstoff-Histidin-IE-Teilchen durch Gelelektrophorese festgestellt. Die obigen Ergebnisse deuten an, dass die Zugabe von Propionat zu den Harnstoff-Histidin-Teilchen die erforderliche Konzentration des Gegenions (Chlorid), die für die Elution der DNA erforderlich ist, bei pH 4,8, 7,3 und 9,5 verringerte.
Sequenzliste

Claims

pH-abhängige Ionenaustauschermatrix, enthaltend: – einen festen Träger, und – eine Vielzahl von ersten Ionenaustauschliganden, wobei jeder erste Ionenaustauschligand – eine Kappe, aufweisend ein Amin mit einem pK von weniger als ungefähr 9, – einen Spacer, der kovalent mit der Kappe verbunden ist, wobei der Spacer eine Alkylkette aufweist mit einem Aminoterminus und einer Säuregruppe, welche kovalent mit der Spaceralkylgruppe verbunden ist; und – einen Linker, aufweisend eine Linkeralkylgruppe, kovalent verbunden mit dem festen Träger an einem ersten Ende der Linkeralkylgruppe und kovalent verbunden mit dem Aminoterminus des Spacers an dem zweiten Ende der Linkeralkylgruppe; wobei die Matrix die Eigenschaft besitzt, eine Zielnukleinsäure bei einem ersten pH zu adsorbieren und die Zielnukleinsäure bei einem Desorptions-pH freizusetzen, welcher höher als der erste pH ist.
Matrix nach Anspruch 1, wobei der feste Träger ein auf Kieselsäure basierendes Material ist.
Matrix nach Anspruch 2, wobei es sich bei dem auf Kieselsäure basierendem Material um Glasfasern handelt.
Matrix nach Anspruch 2, wobei es sich bei dem auf Kieselsäure basierenden Material um Kieselpartikel handelt.
Matrix nach Anspruch 4, wobei die Kieselgelpartikel magnetisch sind.
Matrix nach Anspruch 4 oder 5, wobei die Kieselgelpartikel porös sind.
Matrix nach Anspruch 4 oder 5, wobei die Kieselgelpartikel nicht porös sind.
Matrix nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Kappe ferner einen aromatischen Kohlenwasserstoffring aufweist.
Matrix nach Anspruch 8, wobei wenigstens ein Glied des aromatischen Kohlenwasserstoffringes ein Amin mit einem pK von weniger als ungefähr 9 ist.
Matrix nach Anspruch 9, wobei der aromatische Kohlenwasserstoffring ausgewählt ist aus einer Gruppe, bestehend aus Pyridin und Imidazol.
Matrix nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Amin mit einem pK von weniger als 9 einen pK von mindestens ungefähr 4 bis ungefähr 6 aufweist.
Matrix nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Säuregruppe ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Hydroxyl, Carboxyl und Carbonyl.
Matrix nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Spaceralkylkette zwei (2) bis fünf (5) Kohlenstoffatome aufweist.
Matrix nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Spacer ausgewählt sind aus einer Gruppe bestehend aus Cystein und Alanin.
Matrix nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei der aromatische Kohlenwasserstoff, welcher kovalent mit einem Spacer verbunden ist, eine basische Aminosäure definiert, welche aus der Gruppe bestehend aus Histidin und Histamin ausgewählt ist.
Matrix nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Linkeralkylkette drei (3) bis acht (8) Kohlenstoffatome aufweist.
Matrix nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Linkeralkylkette wenigstens ein Glied ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff, Amin und Carbonyl enthält.
Matrix nach Anspruch 1, wobei der Linker ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus Glycidyl und Harnstoff.
Matrix nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Matrix einen Anionenaustauscher darstellt, welcher in der Lage ist, die Zielnukleinsäure bei einem ersten pH auszutauschen, und wobei die Matrix eine neutrale oder negative Nettoladung bei dem Desorptions-pH aufweist.
Matrix nach einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei der Desorptions-pH mindestens ungefähr 4,0 und höchstens ungefähr 10,0 beträgt.
Matrix nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei die Matrix mindestens zwei Zyklen der Adsorption der Zielnukleinsäure an die Matrix bei dem ersten pH und der Freisetzung von der Matrix bei dem Desorptions-pH hindurch benutzt werden kann.
Multimodale pH-abhängige Ionenaustauschermatrix, aufweisend: – einen festen Träger; – eine Vielzahl von ersten Ionenaustauscherliganden, wobei jeder erste Ionenaustauscherligand aufweist: – eine Kappe, aufweisend ein Amin mit einem pK von weniger als ungefähr 9; – einen Spacer, welcher kovalent mit der Kappe verbunden ist, wobei der Spacer eine Spaceralkylkette mit einem Aminoterminus aufweist; und – einen Linker, aufweisend eine Linkeralkylkette, welche kovalent an den festen Träger an einem ersten Ende der Linkeralkylkette gebunden ist und welche kovalent mit dem Aminoterminus des Spacers an einem zweiten Ende der Linkeralkylkette gebunden ist; – eine Vielzahl von zweiten Ionenaustauscherliganden, wobei jeder zweite Ionenaustauscherligand aufweist: – eine zweite Alkylkette; und – eine zweite Säuregruppe, welche kovalent mit an die zweite Alkylkette gebunden ist, wobei die Matrix die Fähigkeit besitzt, an die Zielnukleinsäure bei einem ersten pH zu adsorbieren, und die Zielnukleinsäure bei einem Desorptions-pH, welche höher ist als der erste pH, freizusetzen.
Matrix nach Anspruch 22, wobei der feste Support ein auf Kieselsäure basierendes Material ist.
Matrix nach Anspruch 23, wobei das auf Kieselsäure basierende Material ein magnetischer Kieselsäurepartikel ist.
Matrix nach einem der Ansprüche 22 bis 24, wobei der feste Träger porös ist.
Matrix nach einem der Ansprüche 22 bis 24, wobei der feste Träger nicht porös ist.
Matrix nach einem der Ansprüche 22 bis 26, wobei die Kappe ferner einen aromatischen Kohlenwasserstoffring aufweist.
Matrix nach Anspruch 27, wobei mindestens ein Glied des aromatischen Kohlenwasserstoffringes ein Amin mit einem pK von weniger als ungefähr 9 ist.
Matrix nach Anspruch 27, wobei der aromatische Kohlenwasserstoffring ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Pyridin und Anilin.
Matrix nach einem der Ansprüche 22 bis 29, wobei die zweite Säuregruppe eine Caroxygruppe ist.
Matrix nach Anspruch 30, wobei die zweite Säuregruppe kovalent mit dem Terminus der zweiten Alkylkette verbunden ist.
Matrix nach einem der Ansprüche 22 bis 29, wobei wenigstens einer der Vielzahl von zweiten Ionenaustauscherliganden einen Propionatrest darstellt.
Matrix nach einem der Ansprüche 22 bis 32, wobei die Spaceralkylkette zwei (2) bis fünf (5) Kohlenstoffatome aufweist.
Matrix nach einem der Ansprüche 27 bis 32, wobei der aromatische Kohlenwasserstoff, welcher mit dem Spacer kovalent verbunden ist, eine basische Aminosäurengruppe darstellt, welche aus der Gruppe bestehend aus Histidin und Histamin ausgewählt ist.
Matrix nach einem der Ansprüche 22 bis 34, wobei die linke Alkylkette drei (3) bis acht (8) Kohlenstoffatome aufweist.
Matrix nach einem der Ansprüche 22 bis 35, wobei die Linkeralkylkette mindestens ein Glied aufweist, welches aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff, Amin und Carbonyl ausgewählt ist.
Matrix nach einem der Ansprüche 22 bis 34, wobei der Linker aus der Gruppe bestehend aus Glycidyl und Harnstoff ausgewählt ist.
Matrix nach einem der Ansprüche 22 bis 37, wobei die Matrix bei dem ersten pH ein Anionenaustauscher ist, welcher die Zielnukleinsäure auszutauschen in der Lage ist, bei einem zweiten pH, welcher höher als der erste pH ist, neutral ist, und bei einem dritten pH ein Kationaustauscher ist, welcher höher ist als der zweite pH.
Matrix nach Anspruch 38, wobei der zweite pH mindestens ungefähr 4,0 und bis zu ungefähr 10,0 beträgt.
Matrix nach einem der Ansprüche 22 bis 37, wobei das Verhältnis der Vielzahl von ersten Ionenaustauscherliganden und der Vielzahl von zweiten Ionenaustauscherliganden, welche kovalent mit der festen Phase verbunden sind, so ausgewählt ist, dass sichergestellt ist, dass, wenn die Matrix mit einer Lösung, die die Zielnukleinsäure bei einem ersten pH enthält, in Kontakt gebracht wird, die Matrix vorzugsweise an die Zielnukleinsäure bindet.
Matrix nach einem der Ansprüche 22 bis 40, wobei die Matrix mindestens zwei Zyklen der Bindung der Zielnukleinsäure an die Matrix bei einem ersten pH und der Freisetzung von der Matrix bei einem zweiten pH hindurch benutzt werden kann.
Verfahren zur Isolierung einer Zielnukleinsäure unter Verwendung einer pH-abhängigen Ionenaustauschermatrix, aufweisend die Schritte: (a) Bereitstellung einer pH-abhängigen Ionenaustauschermatrix nach einem der Ansprüche 1 bis 21 als eine multimodale pH-abhängige Ionenaustauschermatrix nach einem der Ansprüche 22 bis 41; (b) Bereitstellung eines Gemischs, aufweisend die Zielnukleinsäure; (c) Vereinigung des Gemischs mit der Matrix und Inkubation bei einem ersten pH, bis die Nukleinsäure an die Matrix adsorbiert, wobei sich ein Komplex bildet; (d) Trennung des Komplexes von dem Gemisch; und (e) Vereinigung des Komplexes mit einer Elutionslösung bei einem Desorptions-pH.
Verfahren nach Anspruch 42, wobei das Gemisch, das die Zielnukleinsäure aufweist, durch Aufbrechen von biologischem Mittel, welches die Zielnukleinsäure enthält, erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 42, wobei die Zielnukleinsäure RNA ist.
Verfahren nach Anspruch 42, wobei die Zielnukleinsäure DNA ist.
Verfahren nach Anspruch 45, wobei die Zielnukleinsäure Plasmid-DNA ist.
Verfahren nach Anspruch 45, wobei die Zielnukleinsäure genomische DNA ist.
Verfahren zur Herstellung einer pH-abhängigen Ionenaustauschermatrix nach Anspruch 1 bis 21, aufweisend die Schritte: (a) Bereitstellung eines festen Trägers; (b) Bereitstellung eines Linkers, aufweisend eine Alkylkette mit einem ersten und zweiten Ende; (c) Vereinigung des festen Trägers und des Linkers unter Bedingungen, bei welchen eine kovalente Bindung zwischen dem festen Träger und dem ersten Ende der Linkeralkylkette gebildet wird, wobei ein linkermodifizierter fester Träger hergestellt wird; (d) Bereitstellung eines sauren aromatischen Amins, aufweisend: einen aromatischen Kohlenwasserstoffring, wobei mindestens ein Glied des Ringes ein Amin ist; einen Spacer, welcher mit dem aromatischen Kohlenwasserstoff kovalent verbunden ist, wobei der Spacer eine Spaceralkylgruppe mit einem Aminoterminus aufweist; und einen sauren Substituenten, welcher kovalent mit der Spaceralkylgruppe verbunden ist; und (e) Vereinigung des linker-modifizierten festen Trägers mit dem sauren aromatischen Amin unter Bedingungen, bei welchen eine kovalente Bindung zwischen dem Aminoterminus der Spaceralkylkette des sauren aromatischen Amins und dem zweiten Ende des Linkers gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 48, wobei der feste Träger, welcher in Schritt (a) bereitgestellt wird, ein auf Kieselsäure basierendes Material darstellt, und der Linker kovalent mit dem festen Träger in Schritt (c) mit einem Kieselsäurerest verbunden ist, wobei der Kieselsäurerest kovalent mit einer ersten Untereinheit und einer zweiten Untereinheit verbunden ist, wobei die erste Untereinheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -OH, -OCH₃, -OCH₂CH₃, und wobei die zweite Untereinheit durch die Formel -(OSiR¹ ₂)_x-R¹, wobei R¹ dieselbe Gruppe wie die erste Untereinheit ist, und x mindestens 0 beträgt.
Verfahren zur Herstellung einer pH-abhängigen Ionenaustauschermatrix nach einem der Ansprüche 1 bis 21, aufweisend die folgenden Schritte: (a) Bereitstellung eines festen Trägers; (b) Bereitstellung einer Vielzahl von ersten Ionenaustauscherliganden, aufweisend: eine Kappe, aufweisend ein Amin mit einem pK von weniger als 9; einen Spacer, welcher kovalent mit der Kappe verbunden ist, wobei der Spacer einer Spaceralkylkette mit einem Aminoterminus, einem sauren Substituenten, welcher kovalent mit der Spaceralkylkette verbunden ist, aufweist; und einen Linker, aufweisend eine Linkeralkylkette, die ein erstes und ein zweites Ende besitzt, wobei das zweite Ende kovalent mit dem Aminoterminus des Spacers verbunden ist; (c) Vereinigen des festen Trägers und des ersten Ionenaustauscherliganden unter Bedingungen, bei welchen eine kovalente Bindung zwischen dem festen Träger und dem ersten Ende der Linkeralkylkette gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 50, wobei die Vielzahl der ersten Ionenaustauschliganden einen Imidazol-Silylharnstoff aufweist.
Verfahren nach Anspruch 49, wobei der saure Substituent des ersten Ionenaustauscherliganden ein Carboxylrest ist, welcher durch eine Methylgruppe geschützt wird, wobei die Methylgruppe nach Schritt (c) vom Carboxylrest entfernt wird.
Verfahren zur Herstellung einer multimodalen pH-abhängigen Ionenaustauschermatrix nach einem der Ansprüche 22 bis 41, aufweisend die Schritte: (a) Bereitstellung eines festen Trägers; (b) Bereitstellung eines ersten Ionenaustauscherliganden, aufweisend: eine Kappe, aufweisend ein Amin mit einem pK von weniger als ungefähr 9; einen Spacer, welcher mit der Kappe kovalent verbunden ist, wobei der Spacer eine Spaceralkylkette mit einem Aminoterminus aufweist; und einen Linker, der eine Linkeralkylkette mit einem ersten Ende und einem zweiten Ende aufweist, wobei das zweite Ende mit dem Aminoterminus des Spacers kovalent verbunden ist; (c) Vereinigen des festen Trägers und des ersten Ionenaustauscherliganden unter Bedingungen, bei welchen eine kovalente Bindung zwischen dem festen Träger und dem ersten Ende der Linkeralkylkette gebildet wird; (d) Bereitstellung eines zweiten Ionenaustauscherliganden, aufweisend eine zweite Alkylkette und einen sauren Rest, welcher kovalent damit verbunden ist, wobei die saure Gruppe eine Schutzgruppe aufweist, welche kovalent damit verbunden ist; (e) Vereinigen des festen Trägers mit dem ersten Ionenaustauscherliganden, welcher hieran gebunden ist, mit einem zweiten Liganden unter Bedingungen, welche die Bildung einer kovalenten Bindung zwischen den geschützten zweiten Ionenaustauscherliganden und dem festen Träger fördern; und (f) Entschützen der sauren Gruppe des zweiten Anionenaustauscherliganden durch Entfernung der Schutzgruppe.
Verfahren nach Anspruch 53, wobei die relativen Verhältnisse der Vielzahl der ersten Ionenaustauscherliganden und der Vielzahl des zweiten Ionenaustauscherrestes, welche kovalent mit dem festen Träger verbunden sind, zur Kontrolle des Ladungsverhältnisses auf der Oberfläche des festen Trägers ausgewählt sind, wodurch die Bindungsstärke des Zielnukleinsäurematerials an den festen Träger kontrolliert wird.
Verfahren nach Anspruch 53, wobei der zweite Ionenaustauscherligand einen Propionatrest darstellt.