DE60006685T2

DE60006685T2 - Rot-emittierende [8,9]benzophenoxazin-nukleinsäurefarbstoffe und verfahren zu deren verwendung

Info

Publication number: DE60006685T2
Application number: DE60006685T
Authority: DE
Inventors: Xiongwui Yan; Sheri Miraglia; Pau Miau Yuan
Original assignee: Applera Corp
Current assignee: Applied Biosystems LLC
Priority date: 1999-09-03
Filing date: 2000-09-01
Publication date: 2004-10-14
Anticipated expiration: 2020-09-02
Also published as: US6140500A; EP1208160A1; AU753608B2; CA2382593C; JP2003509528A; DE60006685D1; AU7101500A; CA2382593A1; ATE254648T1; EP1208160B1; WO2001018124A1

Description

1. GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft fluoreszierende rot-emittierende [8,9]Benzophenoxazin-Farbstoffe, die zum Anfärben, Markieren und/oder Detektieren von Nukleinsäuren verwendbar sind.
2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Viele Gebiete der Grundlagenforschung profitieren von der Fähigkeit, schnell und sensitiv Nukleinsäuren zu detektieren. Zum Beispiel besteht in vielen Gebieten der naturwissenschaftlichen Forschung, einschließlich biologischer, biomedizinischer, genetischer, Fermentations-, Aquakultur-, Agrikultur-, forensischer und Umweltschutzforschung, ein Bedarf, Nukleinsäuren sowohl innerhalb als auch ohne Zellen als eine Routinekomponente von experimentellen Standardverfahren zu identifizieren. Ein allgemeines Beispiel ist die weitverbreitete Verwendung der Gelelektrophorese zur Charakterisierung von Nukleinsäuren, wobei eine Begrenzung davon die Sensitivität des Anfärbeverfahren ist, das zur Detektion der Nukleinsäurebanden verwendet wird.
In den Bio- und Medizinwissenschaften müssen Forscher und Techniker oft intrazelluläre Nukleinsäuren identifizieren und/oder Zellen, basierend auf der Menge an in den Zellen vorhandenen Nukleinsäuren sortieren. Die Menge an vorhandenen Nukleinsäuren kann auf den Typ von Zellen oder sogar das Vorhandensein von Krankheitszuständen in Zellen (z. B. kernhaltige humane Erythrozyten) hinweisen. Solche Anwendungen benötigen eine schnelle, sensitive und selektive Methodik, die Nukleinsäuren detektieren kann, sogar wenn sie durch zellulären Membranen begrenzt (oder umgeben) sind.
Farbstoffe, die im Allgemeinen zum Anfärben von Nukleinsäuren über eine große Breite von Anwendungen verwendbar sind, weisen vorzugsweise die nachstehenden Eigenschaften auf:

i) Der Nukleinsäure-Farbstoff-Komplex sollte ein sehr hohes Signal mit einem niedrigen Hintergrund erzeugen, so dass kleine Mengen von Nukleinsäuren sensitiv in sowohl zellfreien als auch auf Zellen basierenden Tests detektiert werden können, und
ii) der Nukleinsäure-Farbstoff-Komplex sollte fotostabil sein, so dass das Fluoreszenzsignal ohne ein wesentliches Fotoausbleichen beobachtet, überwacht und aufgezeichnet werden kann.

Für Anwendungen, die ein Färben von Nukleinsäuren in Zellen, insbesondere lebenden Zellen einschließen, sollten die Farbstoffe vorzugsweise die nachstehenden zusätzlichen Eigenschaften aufweisen:

iii) Der Farbstoff sollte für Zellmembranen permeabel sein, so dass er in Zellen abgeschiedene Nukleinsäuren binden kann,
iv) die Membranpermeationskinetiken sollten relativ schnell sein, so dass detektierbare Signale nach relativ kurzen Expositionen gegenüber dem Farbstoff erhalten werden können, und
v) der Farbstoff sollte gegenüber lebenden Zellen nicht toxisch sein, so dass ein Anfärben nicht die normalen metabolischen Vorgänge der Zellen unterbricht oder einen vorzeitigen Zelltod bewirkt.

Eine Vielzahl von Farbstoffen, die zum Anfärben von Nukleinsäuren in zellfreien und/oder intrazellulären Tests verwendbar sind, wurden beschrieben. Zum Beispiel wurde eine Vielzahl von asymmetrischen Cyanin-Farbstoffen (Brooker et al., 1942, J. Am. Chem. Soc. 64:199) und Thioflavin-Farbstoffen (US-PSen 4,554,546 und 5,057,413), die zum Anfärben von Nukleinsäuren verwendbar sind, beschrieben. Der nicht chimäre, asymmetrische Cyanin-Farbstoff, der unter dem Handelsnahmen Thiazole Orange verkauft wird, stellt besondere Vorteile bei der quantitativen Analyse von unreifen Blutzellen oder Reticulocyten ( US-PS 4,883,867 ) und bei einem Präferenzanfärben von Nukleinsäuren von mit Blut übertragenen Parasiten ( US-PS 4,937,198 ) bereit. Obwohl Thiazole Orange und andere Thioflavin-Cyanin-Farbstoffe für Membranen von vielen Säugerzellen permeabel sind, sind sie für viele eukaryotische Zellen nicht permeabel.
Andere verwandte Cyanin-Farbstoffe wurden beschrieben, die für lebende Zellen nicht permeabel sind, wenn nicht deren Membranen zerstört wurden (siehe US-PSen 5,321,130 und 5,410,030). Eine Vielzahl von Dimer-Farbstoffen mit kationischen Gruppen, die zum Anfärben von Nukleinsäuren in elektrophoretischen Gelen verwendbar sind, sind in den US-PSen 5,312,921, 5,401,847, 5,565,554 und 5,783,687 beschrieben.
Substituierte asymmetrische Cyanin-Farbstoffe, die fähig sind, Membranen eines breiten Spektrums von sowohl lebenden als auch toten Zellen zu permeieren, wurden ebenfalls beschrieben (siehe US-PS 5,436,134 ).
Obwohl viele dieser Farbstoffe eine Verwendung als Nukleinsäure-Farbstoffe gefunden haben, weisen sie etliche Nachteile auf, die deren allgemeine Verwendbarkeit, insbesondere in Tests mit lebenden Zellen, begrenzen. Zum Beispiel fluoreszieren die meisten der verfügbaren Farbstoffe in dem grünen Bereich des sichtbaren Spektrums. Grüne Laser sind nicht nur teurer als rote Laser und eine grüne Fluoreszenz ergibt höhere Hintergrundsignale in Tests mit lebenden Zellen aufgrund von, neben anderen Faktoren, Autofluoreszenz von zellulären Komponenten und Testapparatur. Diese höheren Hintergrundsignale vermindern die Sensitivität des Tests. Außerdem absorbieren viele zelluläre Komponenten grünes Licht, wodurch die Sensitivität des Tests weiter vermindert wird.
Da rote Laser billiger sind als grüne Laser und zelluläre Komponenten im Allgemeinen für rotes Licht durchlässig sind, sind Nukleinsäure-Farbstoffe, die Anregungs- und Emissionsmaxima in dem roten Bereich des sichtbaren Spektrums aufweisen, für Tests mit lebenden Zellen bevorzugt. Jedoch ist die Verfügbarkeit von Membran-permeablen, rot-emittierenden Nukleinsäure-Farbstoffen mit für Tests mit lebenden Zellen geeigneten Eigenschaften begrenzt. Leider sind die meisten gebräuchlichen wasserlöslichen, rot-emittierenden Farbstoffe, die Cyanin-Farbstoffe, wie der Farbstoff Cy5, nicht fotostabil. Folglich sind sensitive Nukleinsäure-Farbstoffe, die fotostabil sind, Anregungs- und Emissionsmaxima in dem roten Bereich des sichtbaren Spektrums aufweisen, und die für Zellmembranen permeabel sind, hochgradig wünschenswert.
3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Farbstoffe mit diesen und anderen vorteilhaften Eigenschaften, werden durch die Erfindung bereitgestellt, die in einem Aspekt eine neue Klasse von rotemittierenden[8,9]Benzophenoxazin-Farbstoffen zum Markieren, Anfärben und/oder Detektieren von Nukleinsäuren bereitstellt. Die neuen erfindungsgemäßen [8,9]Benzophenoxazin-Farbstoffe sind durch eine aliphatische kationische Kette gekennzeichnet, die an einen Stamm-[8,9]Benzophenoxazin-Ring gebunden ist. Der Stamm-[8,9]Benzophenoxazin-Ring enthält zwei stickstoffhaltige Substituenten: einen Aminosubstituenten an dem C3-Kohlenstoffatom und einen Imminiumsubstituenten an dem C7-Kohlenstoffatom. Der C3-Aminosubstituent kann eine primäre, sekundäre oder tertiäre Aminogruppe sein. Wenn die Aminogruppe eine sekundäre oder tertiäre Aminogruppe ist, sind die Stickstoffsubstituenten eine oder mehrere der gleichen oder verschiedenen (C₅-C₁₄)Aryl- oder (C₁-C₆)Alkylgruppen, mehr bevorzugt eine oder mehrere der gleichen oder unterschiedlichen (C₁-C₆)Alkylgruppen. Alternativ kann das Stickstoffatom in einem aliphatischen Ring eingeschlossen sein. In diesem Fall ist das Amino-Stickstoffatom mit einer aliphatischen Brücke, typischerweise einer (C₂-C₈)Alkyldiylgruppe substituiert. Die kationische Kette, die genauer nachstehend beschrieben wird, ist an dem C7-Iminium-Stickstoffatom über ein Methylen-Kohlenstoffatom gebunden.
Der Stamm-[8,9]Benzophenoxazin-Ring kann unabhängig an den C1-, C2-, C4-, C6-, C11-, C12-, C13- und/oder C14-Positionen mit einer großen Vielzahl von verschiedenen Substituenten, die gleich oder verschieden sein können, substituiert sein. Ein jeglicher solcher Substituent sollte im Allgemeinen ungeladen sein, um die Fähigkeit des Farbstoffs, durch Zellmembranen zu permeieren oder über diese zu diffundieren, nicht nachteilig zu beeinflussen. Typische Substituenten sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogenatom, (C₁-C₆)Alkylgruppe, -OR, -SR, -NRR, -CN, -NO₂ und -C(O)R, worin jede R-Gruppe unabhängig ein Wasserstoffatom oder eine (C₁-C₆)Alkylgruppe ist. Solche Substituenten können verwendet werden, um die spektralen Anregungs- und/oder Emissionseigenschaften der Farbstoffe für bestimmte Anwendungen und Apparaturen anzupassen oder fein abzustimmen. Außerdem kann der Stamm-[8,9]Benzophenoxazin-Ring eine oder mehrere (C₅-C₁₄)Arylenobrücken enthalten, die an die C1- und C2-Kohlenstoffatome, die C11- und C12-Kohlenstoffatome, die C12- und C13-Kohlenstoffatome und/oder die C13- und C14-Kohlenstoffatome kondensiert sind. Ein Hinzufügen solcher Arylenobrücken-Substituenten zu dem Stamm-[8,9]Benzophenoxazin-Ring verschiebt im Allgemeinen die Anregungs- und Emissionsmaxima des Farbstoffs zum roten Bereich. Diese Arylenobrücken können auch weiter mit einer oder mehreren der gleichen oder verschiedenen ungeladenen Gruppen, wie vorstehend beschrieben, substituiert sein.
Die aliphatische kationische Kette in den erfindungsgemäßen Verbindungen weist die Struktur -(CH₂)_n-[NRR-(CH₂)_n]_m-NRRR auf, worin jedes n unabhängig eine ganze Zahl von 2 bis 6 ist, m eine ganze Zahl von 0 bis 6 ist, und jede R-Gruppe unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom und (C₁-C₆)Alkylgruppe. Ohne die positive Ladung, die durch das C7-Imminium-Stickstoffatom des Stamm-[8,9]Benzophenoxazin-Rings beigesteuert wird, weist die kationische Kette mindestens 1 positive Ladung und gewöhnlich nicht mehr als 4 positive Ladungen, typischerweise nicht mehr als 3 positive Ladungen unter denjenigen Bedingungen auf, unter denen der Farbstoff verwendet wird. In Ausführungsformen, in denen der Stamm-[8,9]Benzophenoxazin-Ring insgesamt 4 kondensierte Ringe umfasst, weist die kationische Kette vorzugsweise 1 oder 2 positive Ladungen auf, wobei die positive Ladung, die durch das C7-Imminium-Stickstoffatom beigesteuert wird, nicht enthalten ist. In Ausführungsformen, in denen der Stamm-[8,9]Benzophenoxazin-Ring insgesamt 5 kondensierte Ringe umfasst, weist die kationische Kette vorzugsweise 1 oder 3 positive Ladungen auf, wobei die positive Ladung, die durch das C7-Imminium-Stickstoffatom beigesteuert wird, nicht enthalten ist.
Da sogar primäre Aminogruppen basisch genug sind, um mindestens eine teilweise positive Ladung bei den typischen verwendeten pH-Werten (d.h. pH-Werten von pH 6 bis pH 9) beizusteuern, können die Aminogruppen, die sich entweder innerhalb der aliphatischen Kette oder an einem Ende befinden, entweder substituiert oder unsubstituiert sein. Da sich die Basizität von Aminogruppen im Allgemeinen mit steigender Substitution erhöht, sind die inneren Aminogruppen vorzugsweise mindestens monosubstituiert und die endständigen Aminogruppen sind vorzugsweise mindestens disubstituiert. Alternativ können die Aminogruppen vollständig substituiert sein (d.h. quaternäre Aminogruppen), so dass sie eine perma nente positive Ladung tragen. Wenn die kationische Kette nur eine einzige innere Aminogruppe umfasst, ist sie vorzugsweise eine quaternäre Aminogruppe (disubstituiert). Wenn die kationische Kette mehr als eine innere Aminogruppe umfasst, sollte mindestens eine dieser Gruppen eine quaternäre Aminogruppe sein. Eine jegliche endständige Aminogruppe kann eine primäre, sekundäre, tertiäre oder quaternäre Aminogruppe sein, aber sie ist vorzugsweise eine tertiäre (disubstituierte) oder quaternäre Gruppe.
Vorzugsweise sind die Stickstoffatome der inneren und endständigen Aminogruppen jeweils unabhängig mit einer oder mehreren der gleichen oder verschiedenen geradkettigen (C₁-C₃)Alkylgruppen, am meisten bevorzugt einer oder mehreren Methanylgruppen substituiert.
Die Aminogruppen der kationischen Kette sind gewöhnlich voneinander durch so wenig wie 2 bis so viel bis 6 Kohlenstoffatome voneinander getrennt. Typischerweise sind die Aminogruppen der kationischen Kette durch 2 oder 3 Kohlenstoffatome getrennt. Auch das C7-Imminium-Stickstoffatom ist durch eine Aminogruppe durch so wenig wie 2 bis so viel wie 6 Kohlenstoffatome, vorzugsweise durch 3 Kohlenstoffatome, getrennt.
Die neuen erfindungsgemäßen [8,9]Benzophenoxazin-Farbstoffe können als interkalierende oder nicht-interkalierende Farbstoffe verwendet werden, um Nukleinsäuren für eine nachfolgende Detektion in einem breiten Bereich von Kontexten, einschließlich zum Beispiel in Lösungen, in Elektrophoresegelen, auf Blots und in anderen Tests, anzufärben oder zu markieren. Obwohl nicht beabsichtigt ist, an irgendeine bestimmte Theorie des Vorgangs gebunden zu sein, wird angenommen, dass, wenn die Farbstoffe als interkalierende Farbstoffe oder Anfärbemittel verwendet werden, wie zum Beispiel zum Anfärben von doppelsträngiger DNA oder RNA, deren Fähigkeit, Nukleinsäuren zu binden, größtenteils durch den Stamm-[8,9]Benzophenoxazin-Ring vermittelt wird, der zwischen Basenpaare interkaliert. Wenn die Farbstoffe als nicht-interkalierende Farbstoffe oder Anfärbemittel verwendet werden, wie zum Beispiel von Anfärben von einzelsträngiger DNA oder RNA, wird angenommen, dass deren Fähigkeit, Nukleinsäuren zu binden, größtenteils durch ionische Anziehung zwischen dem anionischen Phosphodiester-Rückgrat der Nukleinsäure und der kationischen Kette des Farbstoffs vermittelt wird. Jedoch wird der Fachmann erkennen, dass sowohl ionische als auch hydro phobe Wechselwirkungen als auch andere Arten von Wechselwirkungen wahrscheinlich bei der Bindung von sowohl einzelsträngigen als auch doppelsträngigen Nukleinsäuren beteiligt sind. Die am meisten bevorzugten erfindungsgemäßen Farbstoffe sind diejenigen, die Membran-permeabel sind.
Die neuen erfindungsgemäßen [8,9]Benzophenoxazin-Farbstoffe weisen etliche Eigenschaften auf, die sie zum Anfärben von Nukleinsäuren über einen breiten Bereich von Anwendungen ideal geeignet machen. Zum Beispiel, (i) weisen die neuen erfindungsgemäßen [8,9]Benzophenoxazin-Farbstoffe hohe molare Absorptionswerte auf mit Extinktionskoeffizienten von ≥ 50.000 cm^–1M^–1 in dem roten Bereich (≥ 630 nm) des sichtbaren Spektrums, (ii) sie weisen lange Emissionswellenlängen, typischerweise ≥ 650 nm auf, abhängig von dem Substitutionsmuster des Stamm-[8,9]Benzophenoxazin-Rings, (iii) sie weisen hervorragende Fotostabilitäts-Eigenschaften auf, (iv) sie erzeugen einen dramatischen Anstieg bei der Quantenausbeute nach Bindung von Nukleinsäuren, wobei sie typischerweise signifikant heller sind als verfügbare und/oder beschriebene Nukleinsäure-Farbstoffe, und (v) sie weisen eine hohe Bindungsaffinität zu sowohl einzelsträngigen als auch doppelsträngigen Nukleinsäuren auf.
Zusätzlich zu den wünschenswerten Eigenschaften sind die meisten der erfindungsgemäßen [8,9]Benzophenoxazin-Farbstoffe fähig, durch Membranen von intakten lebenden Zellen zu permeieren oder darüber zu diffundieren, was sie für ein Anfärben bei lebenden Zellen von sowohl DNA als auch RNA ideal geeignet macht. Bis heute zeigten die erfindungsgemäßen Membran-permeablen Farbstoffe eine gute Permeabilität bei allen getesteten Zelllinien. Ziemlich signifikant überqueren die neuen [8,9]Benzophenoxazin-Farbstoffe Zellmembranen bei Geschwindigkeiten, die signifikant größer sind als diejenigen von derzeitig verfügbaren Nukleinsäure-Farbstoffen für lebende Zellen. Ein direkter Vergleich der Geschwindigkeit der Aufnahme in HCT-116-Zellen zwischen zwei erfindungsgemäßen [8,9]Benzophenoxazin-Farbstoffen mit dem bekannten Cyanin-Farbstoff SYTO 61^® (Molecular Probes, Eugene, OR) zeigt eine signifikant schnellere Aufnahmegeschwindigkeit durch die neuen erfindungsgemäßen Farbstoffe (2).
Außerdem können mit den erfindungsgemäßen Farbstoffen angefärbte eukaryotische Zellen eine mehr als 1000-fach größere Fluoreszenz aufweisen als Zellen, die mit herkömmlichen Cyanin-Farbstoffen, wie SYTO 61^® angefärbt wurden. Wegen ihrer helleren Signale und erhöhten Permeationskinetiken stellen die neuen erfindungsgemäßen [8,9]Benzophenoxazin-Farbstoffe schnellere Ergebnisse mit weit weniger Farbstoff in den Nukleinsäure-Tests mit lebenden Zellen bereit als gegenwärtig erhältliche Farbstoffe. Außerdem können durch eine einfache synthetische Modifikation der kationischen Kette und/oder von Substituenten, die an den Stamm-[8,9]Benzophenoxazin-Ring gebunden sind, Farbstoffe leicht erhalten werden, die günstige Permeabilitäts-Eigenschaften und spektrale Absorptions- und Emissionseigenschaften in dem roten Bereich des sichtbaren Spektrums aufweisen. Häufig stellen die erfindungsgemäßen [8,9]Benzophenoxazin-Farbstoffe eine neue Klasse von fotostabilen, sichtbar anregbaren, Nukleinsäure-Farbstoffen für lebende Zellen dar, die viele der Nachteile der gegenwärtig erhältlichen Nukleinsäure-Farbstoffe für lebende Zellen überwinden.
4. KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A ist ein Foto von HCT-116-Zellen, die mit 0,57 μg/ml Cy5-markiertem Antikörper anti-HLA-A,B,C angefärbt wurden.
1B ist ein Foto von HCT-116-Zellen, die mit 20 nM Bona 12 angefärbt wurden;
1C ist ein Foto von HCT-116-Zellen, die mit 20 nM Bona 24 angefärbt wurden;
1D ist ein Foto von HCT-116-Zellen, die mit 20 nM Bona 25 angefärbt wurden;
1E ist ein Foto von HCT-116-Zellen, die mit 4 nM SYTO 61^® (Molecular Probes, Eugene, OR) angefärbt wurden;
2 ist ein Diagramm, das die schnelleren Anfärbekinetiken und helleren Fluoreszenzsignale veranschaulicht, die mit den Farbstoffen Bona 12 und Bona 25 im Vergleich mit käuflich erhältlichem SYTO 61^® (Molecular Probes, Eugene, OR) (alle Farbstoffe bei 0,156 nM) erreicht wurden.
5. GENAUE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
5.1 Zählsystem
Für die erfindungsgemäßen Zwecke wird der Stamm-[8,9]Benzophenoxazin-Ring wie folgt nummeriert:
5.2 Definitionen
Wie hierin verwendet, ist es beabsichtigt, dass die nachstehenden Begriffe die nachstehenden Bedeutungen aufweisen:
"Alkylgruppe" betrifft einen gesättigten oder ungesättigten, verzweigten, geradkettigen oder cyclischen monovalenten Kohlenwasserstoffrest, der sich durch die Entfernung eines Wasserstoffatoms von einem einzigen Kohlenstoffatom eines Stammalkans, -alkens oder -alkins ableitet. Typische Alkylgruppen umfassen in nicht begrenzender Weise Methyl (Methanyl-)-Gruppe, Ethylgruppen, wie Ethanyl-, Ethenyl-, Ethinylgruppe, Propylgruppen, wie Propan-1-yl-, Propan-2-yl- (Isopropyl-) Gruppe, Cyclopropan-1-yl-, Prop-1-en-1-yl-, Prop-1-en-2-yl-, Prop-2-en-1-yl-, Cycloprop-1-en-1-yl-, Cycloprop-2-en-1-yl-, Prop-1-in-1-yl-, Prop-2-in-1-yl-Gruppe, etc., Butylgruppen, wie Butan-1-yl-, Butan-2-yl-(sec-Butyl-), 2-Methylpropan-1-yl- (Isobutyl-), 2-Methylpropan-2-yl- (t-Butyl-), Cyclobutan-1-yl-, But-1-en-1-yl-, But-1-en-2-yl-, 2-Methylprop-1-en-1-yl-, But-2-en-1-yl-, But-2-en-2-yl-, Buta-1,3-dien-1-yl-, Buta-1,3-dien-2-yl-, Cyclobut-1-en-1-yl-, Cyclobut-1-en-3-yl-, Cyclobuta-1,3-dien-1-yl, But-1-in-1-yl-, But-1-in-3-yl-, But-3-in-1-yl-Gruppe, etc., und dergleichen.
"Alkyldiylgruppe" betrifft einen gesättigten oder ungesättigten, verzweigten, geradkettigen oder cyclischen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen und mit zwei monovalenten Radikalzentren, der sich durch die Entfernung von zwei Wasserstoffatomen von dem gleichen oder zwei verschiedenen Kohlenstoff atomen eines Stammalkans, -alkens oder -alkins ableitet. Typische Alkyldiylreste umfassen in nicht begrenzender Weise 1,2-Ethyldiyl-, 1,3-Propyldiyl-, 1,4-Butyldiyl-Gruppe und dergleichen.
"Aromatisches Ringsystem" betrifft ein ungesättigtes cyclisches oder polycyclisches Ringsystem mit einem konjugierten π-Elektronensystem. Insbesondere eingeschlossen innerhalb der Definition von "aromatischem Ringsystem" sind kondensierte Ringsysteme, in denen ein oder mehrere der Ringe aromatisch sind und ein oder mehrere der Ringe gesättigt oder ungesättigt sind, wie zum Beispiel Indan, Inden, Phenalen, etc. Typische aromatische Ringsysteme umfassen in nicht begrenzender Weise Aceanthrylen, Acenaphthylen, Acephenanthrylen, Anthracen, Azulen, Benzol, Chrysen, Coronen, Fluoranthen, Fluoren, Hexacen, Hexaphen, Hexalen, as-Indacen, s-Indacen, Indan, Inden, Naphthalen, Octacen, Octaphen, Octalen, Ovalen, Penta-2,4-dien, Pentacen, Pentalen, Pentaphen, Perylen, Phenalen, Phenanthren, Picen, Pleiaden, Pyren, Pyranthren, Rubicen, Triphenylen, Trinaphthalen und dergleichen.
"Arylgruppe" betrifft einen monovalenten aromatischen Kohlenwasserstoffrest, der sich durch die Entfernung eines Wasserstoffatoms von einem einzigen Kohlenstoffatom eines aromatischen Ringsystems ableitet. Typische Arylgruppen umfassen in nicht begrenzender Weise Reste, die sich von Aceanthrylen, Acenaphthylen, Acephenanthrylen, Anthracen, Azulen, Benzol, Chrysen, Coronen, Fluoranthen, Fluoren, Hexacen, Hexaphen, Hexalen, as-Indacen, s-Indacen, Indan, Inden, Naphthalen, Octacen, Octaphen, Octalen, Ovalen, Penta-2,4-dien, Pentacen, Pentalen, Pentaphen, Perylen, Phenalen, Phenanthren, Picen, Pleiaden, Pyren, Pyranthren, Rubicen, Triphenylen, Trinaphthalen und dergleichen ableiten. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Arylgruppe eine (C₅-C₂₀)Arylgruppe, wobei (C₅-C₁₀) sogar noch mehr bevorzugt ist. Besonders bevorzugte Arylgruppen sind Phenyl- (C₆-Aryl-) und Naphthyl- (C₁₀-Aryl-) Gruppen.
"Arylenogruppe" betrifft einen bivalenten Brückenrest mit zwei benachbarten monovalenten Radikalzentren, der sich durch die Entfernung eines Wasserstoffatoms von jedem von zwei benachbarten Kohlenstoffatomen eines aromatischen Stammringsystems ableitet. Ein Anbinden eines Arylenobrücken-Restes, zum Beispiel Benzo, an ein aromatisches Stammringsystem, zum Beispiel Benzol, ergibt ein kondensiertes aromatisches Ringsystem, zum Beispiel Naphthalen. Es wird ange nommen, dass die Brücke eine Maximalanzahl von nicht-kumulierten Doppelbindungen aufweist, übereinstimmend mit ihrer Anbindung zu dem sich ergebenden kondensierten Ringsystem. Wenn ein Arylenosubstituent dadurch gebildet wird, dass zwei benachbarte Substituenten an einer Struktur, die alternative Substituenten beinhaltet, zusammengenommen werden, ersetzen die Kohlenstoffatome der Arylenobrücke die verbrückenden Kohlenstoffatome der Struktur, um ein doppeltes Zählen von Kohlenstoffatomen zu vermeiden. Als ein Beispiel soll die nachstehende Struktur betrachtet werden:
worin
R¹, wenn für sich genommen, ein Wasserstoffatom ist oder, wenn mit R² zusammengenommen, eine (C₅-C₁₄)Arylenogruppe ist,
und R², wenn für sich genommen, ein Wasserstoffatom ist, oder, wenn mit R¹ zusammengenommen, eine (C₅-C₁₄)Arylenogruppe ist.
Wenn R¹ und R² jeweils ein Wasserstoffatom sind, ist die sich ergebende Verbindung Benzol. Wenn R¹ mit R² zusammengenommen eine C₆-Aryleno- (Benzeno-) Gruppe ist, ist die sich ergebende Verbindung Naphthalen. Wenn R¹ mit R² zusammengenommen eine C₁₀-Aryleno- (Naphthaleno-) Gruppe ist, ist die sich ergebende Verbindung Anthracen oder Phenanthren. Typische Arylenogruppen umfassen in nicht begrenzender Weise Aceanthryleno-, Acenaphthyleno-, Acephenanthryleno-, Anthraceno-, Azuleno-, Benzeno- (Benzo-), Chryseno-, Coroneno-, Fluorantheno-, Fluoreno-, Hexaceno-, Hexapheno-, Hexaleno-, as-Indaceno-, s-Indaceno-, Indeno-, Naphthaleno- (Naphtho-), Octaceno-, Octapheno-, Octaleno-, Ovaleno-, Penta-2,4-dieno-, Pentaceno-, Pentaleno-, Pentapheno-, Peryleno-, Phenaleno-, Phenanthreno-, Piceno-, Pleiadeno-, Pyreno-, Pyranthreno-, Rubiceno-, Triphenyleno-, Trinaphthalenogruppe und dergleichen. Wo eine spezifische Anbindung beabsichtigt ist, sind die beteiligten verbrückenden Kohlenstoffatome (der Arylenobrücke) in Klammern angegeben, zum Beispiel [1,2]Benzeno ([1,2]Benzo), [1,2]Naphthaleno, [2,3]Naphthaleno, etc.
5.3 Farbstoffverbindungen per se
Die Erfindung stellt eine neue Klasse von [8,9]Benzophenoxazin-Farbstoffen bereit, die zum Anfärben oder Markieren von Nukleinsäuren für eine nachfolgende Detektion verwendbar sind. Wie in dem Zusammenfassungsabschnitt beschrieben, umfassen die neuen Farbstoffe im Allgemeinen einen substituierten oder unsubstituierten Stamm-[8,9]Benzophenoxazin-Ring und eine aliphatische kationische Kette. Die [8,9]Benzophenoxazin-Farbstoffe sind Verbindungen gemäß der Strukturformel (I)
einschließlich jeglicher zugehöriger Gegenionen, worin:
R¹, wenn für sich genommen, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff-, Halogenatom, (C₁-C₆)Alkylgruppe, -OR', -SR', -NR'R', -CN, -NO₂ und -C(O)R', oder, wenn mit R² zusammen genommen, eine (C₅-C₁₄)Arylenogruppe oder (C₅-C₁₄)Arylenogruppe ist, die mit einer oder mehreren der gleichen oder verschiedenen W-Gruppen substituiert ist,
R², wenn für sich genommen, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom, (C₁-C₆)Alkylgruppe, -OR', -SR', -NR'R', -CN, -NO₂ und -C(O)R', oder, wenn mit R¹ zusammen genommen, eine (C₅-C₁₄)Arylenogruppe oder eine (C₅-C₁₄)Arylenogruppe ist, die mit einer oder mehreren der gleichen oder verschiedenen W-Gruppen substituiert ist,
R³, wenn für sich genommen, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom, (C₁-C₆)Alkyl- und (C₅-C₁₄)Arylgruppe, oder, wenn mit R^3' zusammen genommen, eine (C₂-C₈)Alkyldiylgruppe ist,
R3', wenn für sich genommen, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom, (C₁-C₆)Alkyl- und (C₅-C₁₄)Arylgruppe, oder, wenn mit R3 zusammen genommen, eine (C₂-C₈)Alkyldiylgruppe ist,
R⁴ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom, (C₁-C₆)Alkylgruppe, -OR', -SR', -NR'R', -CN, -NO₂ und -C(O)R',
R⁶ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom, (C₁-C₆)Alkylgruppe, -OR', -SR', -NR'R', -CN, -NO₂ und -C(O)R',
R⁷ -(CH₂)_n-[NRR-(CH₂)_n]_m-NRRR ist, worin jedes n unabhängig eine ganze Zahl von 2 bis 6 ist, m eine ganze Zahl von 0 bis 6 ist und jede R-Gruppe unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom und (C₁-C₆)Alkylgruppe,
R¹¹, wenn für sich genommen, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom, (C₁-C₆)Alkylgruppe, -OR', -SR', -NR'R', -CN, -NO₂ und -C(O)R', oder, wenn mit R¹² zusammen genommen, eine (C₅-C₁₄)Arylenogruppe oder (C₅-C₁₄)Arylenogruppe ist, die mit einer oder mehreren der gleichen oder verschiedenen W-Gruppen substituiert ist,
R¹², wenn für sich genommen, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom, (C₁-C₆)Alkylgruppe, -OR', -SR', -NR'R', -CN, -NO₂ und -C(O)R', oder, wenn mit R¹¹ oder R¹³ zusammen genommen, eine (C₅-C₁₄)Arylenogruppe oder (C₅-C₁₄)Arylenogruppe ist, die mit einer oder mehreren der gleichen oder verschiedenen W-Gruppen substituiert ist,
R¹³, wenn für sich genommen, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom, (C₁-C₆)Alkylgruppe, -OR', -SR', -NR'R', -CN, -NO₂ und -C(O)R', oder, wenn mit R¹² oder R¹⁴ zusammen genommen, eine (C₅-C₁₄)Arylenogruppe oder eine (C₅-C₁₄)Arylenogruppe ist, die mit einer oder mehreren der gleichen oder verschiedenen W-Gruppen substituiert ist,
R¹⁴, wenn für sich genommen, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom, (C₁-C₆)Alkylgruppe, -OR', -SR', -NR'R', -CN, -NO₂ und -C(O)R', oder, wenn mit R¹³ zusammen genommen, eine (C₅-C₁₄)Arylenogruppe oder (C₅-C₁₄)Arylenogruppe ist, die mit einer oder mehreren der gleichen oder verschiedenen W-Gruppen substituiert ist,
jede W-Gruppe unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (C₁-C₆)Alkylgruppe, -OR', -SR', -NR'R', -CN, -NO₂ und -C(O)R' und jede R'-Gruppe unabhängig ein Wasserstoffatom oder eine (C₁-C₆)Alkylgruppe ist, mit der Maßgabe, dass die Benzophenoxazinverbindung nicht 3-Dimethylamino-7-[2-(diethylamino)ethyl]imino-5H-[8,9]benzophenoxazinchlorid ist, die in der DE-C-488 945 beschrieben ist.
Bevorzugte Verbindungen gemäß der Strukturformel (I) sind diejenigen Verbindungen, die fähig sind, passiv durch eine Membran einer lebenden prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle zu permeieren oder darüber zu diffundieren.
Wenn die Zelle eine eukaryotische Zelle ist, wie eine Säugerzelle, sind die bevorzugten Farbstoffe noch mehr bevorzugt fähig, passiv durch die Kernmembran zu permeieren oder darüber zu diffundieren und die Kernnukleinsäuren der Zelle anzufärben.
Die Membranpermeabilität eines erfindungsgemäßen Farbstoffes kann leicht dadurch getestet werden, dass eine oder mehrere Zellen mit einer Anfärbelösung, zum Beispiel Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, umfassend den Farbstoff (Anfärbelösungen sind genauer nachstehend beschrieben) in Kontakt gebracht werden und auf ein detektierbares Signal getestet wird. Im Allgemeinen werden die Zellen, wenn ein Farbstoff nicht Membran-permeabel ist, als dunkle Punkte erscheinen, wenn sie unter Verwendung von Lichtquellen und Detektoren detektiert werden, die zu den Anregungs- und Emissionswellenlängen des getesteten Farbstoffs passen. Farbstoffe, die ein detektierbares Signal (≥ 2-3-facher Hintergrund) in 5-10 Min. ergeben, wenn sie in einer Anfärbelösung (pH-Wert von pH 6 bis pH 8–9) bei einer Konzentration von 10 pM bis 100 nM (oder noch weniger) verwendet werden, werden als Membran-permeabel betrachtet. Farbstoffe, die sehr helle Signale (d.h. ≥ 100-facher Hintergrund) bei extrem niedrigen Konzentrationen (d.h. ≤ 10 nM oder noch weniger) in etwa 1–5 Min. erzeugen, sind besonders bevorzugt, da diese Farbstoffe eine erhöhte Sensitivität bereitstellen.
Eine noch weitere Gruppe von bevorzugten Verbindungen gemäß der Strukturformel (I) sind diejenigen Verbindungen, die ein oder mehrere Merkmale aufweisen, ausgewählt aus der nachstehenden Gruppe von Merkmalen:
R¹, R², R⁴ und R⁶ sind jeweils ein Wasserstoffatom,
R³ und R^3' sind jeweils unabhängig eine (C₅-C₁₀)Aryl- oder (C₁-C₃)Alkylgruppe,
die Arylenogruppe, die durch Zusammennehmen von R¹ mit R² gebildet wird, ist eine Benzo-, [1,2]Naphthaleno- oder [2,3]Naphthalenogruppe,
die Arylenogruppe, die durch Zusammennehmen von R¹¹mit R¹² gebildet wird, ist eine Benzogruppe,
die Arylenogruppe, die durch Zusammennehmen von R¹² mit R¹³ gebildet wird, ist eine Benzogruppe,
die Arylenogruppe, die durch Zusammennehmen von R¹³ mit R¹⁴ gebildet wird, ist eine Benzogruppe,
R¹¹, R¹², R¹³ und R¹⁴ sind jeweils ein Wasserstoffatom und/oder
R⁷ ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -(CH₂)_n-NRRR, -(CH₂)_n-NRR-(CH₂)_n-NRRR und -(CH₂)_n-NRR-(CH₂)_n-NRR-(CH₂)_n-NRRR, worin jedes n unabhängig eine ganze Zahl von 2 bis 3 ist und jede R-Gruppe unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom und (C₁-C₃)Alkylgruppe.
Eine weitere Gruppe von bevorzugten Verbindungen gemäß der Strukturformel (I) sind diejenigen Verbindungen, in denen:
R¹, wenn für sich genommen, ein Wasserstoffatom ist oder, wenn mit R² zusammengenommen, eine Benzo-, Naphthaleno-, [1,2]Naphthaleno- oder [2,3]Naphthalenogruppe ist,
R², wenn für sich genommen, ein Wasserstoffatom ist oder, wenn mit R¹ zusammengenommen, eine Benzo-, Naphthaleno-, [1,2]Naphthaleno- oder [2,3]Naphthalenogruppe ist,
R³ eine (C₁-C₃)Alkylgruppe ist,
R^3' eine (C₁-C₃)Alkylgruppe ist,
R⁴ ein Wasserstoffatom ist,
R⁶ ein Wasserstoffatom ist,
R⁷ eine aliphatische kationische Kette, wie vorstehend beschrieben, vorzugsweise -(CH₂)_n-NRRR, -(CH₂)_n-NRR-(CH₂)_n-NRRR oder -(CH₂)_n-NRR-(CH₂)_n-NRR-(CH₂)_n-NRRR ist, worin jedes n unabhängig eine ganze Zahl von 2 bis 3 ist, und jede R-Gruppe unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom und (C₁-C₃)Alkylgruppe,
R¹¹, wenn für sich genommen, ein Wasserstoffatom ist, oder, wenn mit R¹² zusammengenommen, eine Benzogruppe ist,
R¹², wenn für sich genommen, ein Wasserstoffatom ist, oder, wenn mit R¹¹ oder R¹³ zusammengenommen, eine Benzogruppe ist,
R¹³, wenn für sich genommen, ein Wasserstoffatom ist, oder, wenn mit R¹² oder R¹⁴ zusammengenommen, eine Benzogruppe ist, und
R¹⁴, wenn für sich genommen, ein Wasserstoffatom ist oder, wenn mit R¹³ zusammengenommen, eine Benzogruppe ist.
Eine noch weitere Gruppe von bevorzugten Verbindungen gemäß der Strukturformel (I) sind Verbindungen gemäß der Strukturformeln (II) und (III):
einschließlich jeglicher zugehöriger Gegenionen, worin R⁷ wie vorstehend für die Strukturformel (I) beschrieben ist. Verbindungen gemäß der Strukturformel (II) weisen typischerweise Anregungs- (Absorptions-) Maxima im Bereich von 630–650 nm und Emissionsmaxima in dem Bereich von 660–680 nm auf, während Verbindungen gemäß der Strukturformel (III) typischerweise Anregungs- (Absorptions-) Maxima in dem Bereich von 650–660 nm und Emissionsmaxima in dem Bereich von 680–720 nm aufweisen, abhängig von dem Puffer, dem pH-Wert, der Temperatur und anderen Probenbedingungen (siehe zum Beispiel Tabelle 1, Abschnitt 6.2, Seite 33, nachstehend).
Bevorzugte Verbindungen gemäß der Strukturformeln II und III sind diejenigen Verbindungen, in denen R⁷ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -(CH₂)_n-NRRR, -(CH₂)_n-NRR-(CH₂)_n-NRRR und -(CH₂)_n-NRR-(CH₂)_n-NRR-(CH₂)_n-NRRR, worin jedes n unabhängig eine ganze Zahl von 2 bis 3 ist und jede R-Gruppe unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom, (C₁-C₃)Alkyl- und Methylgruppe.
Besonders bevorzugte Verbindungen gemäß der Strukturformel (II), die eine gute Membranpermeabilität aufweisen, sind nachstehend veranschaulicht: Bona 11
Bona 12
Besonders bevorzugte Verbindungen gemäß der Strukturformel (III), die eine gute Membranpermeabilität aufweisen, sind nachstehend veranschaulicht: Bona 22
Bona 24
Bona 25
Der Fachmann wird einsehen, dass viele der durch die Formeln (I), (II) und (III) umfassten Verbindungen als auch die vorstehend spezifisch beschriebenen Verbindungsspezies die Phänomene der Tautomerie, Konformationsisomerie, geome trischen Isomerie und/oder Stereoisomerie aufweisen können. Da die Formelzeichnungen innerhalb dieser Beschreibung und der Ansprüche nur eine der möglichen Tautomeren, Konformationsisomeren, Enantiomeren oder geometrisch isomeren Formen darstellen können, soll verstanden werden, dass die Erfindung jegliche Tautomere, Konformationsisomere, Enantiomere und/oder geometrisch isomere Formen der Verbindungen, die eine oder mehrere der hierin beschriebenen nützlichen Eigenschaften aufweisen, umfasst.
Als ein spezifisches Beispiel wird überall in der Beschreibung auf C3-Amino- und C7-Imminium-Substituenten verwiesen. Da diese Nomenklatur mit den dargestellten Strukturformeln übereinstimmt, die nur eine der mehreren möglichen tautomeren Formen (oder Resonanzstrukturen) der Verbindungen entsprechen, soll verstanden werden, dass diese Hinweise nur der Einfachheit halber angegeben sind und dass keiner der Hinweise den Umfang der hierin beschriebenen Verbindungen begrenzen soll.
Zusätzlich wird der Fachmann erkennen, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen in vielen verschiedenen Protonierungszuständen vorliegen können, abhängig neben anderen Faktoren von dem pH-Wert ihrer Umgebung. Während die hierin bereitgestellten Strukturformeln die Verbindungen in nur einem von mehreren möglichen Protonierungszuständen darstellen, soll verstanden werden, dass diese Strukturen nur beispielhaft sind und dass die Erfindung nicht auf einen besonderen Protonierungszustand begrenzt ist – jegliche und alle protonierten Formen der Verbindungen sollen innerhalb des Umfangs der Erfindung fallen.
Da die erfindungsgemäßen Verbindungen viele positive Ladungen tragen können, abhängig von ihrem physikalischen Zustand, können sie hierzu gehörige Gegenionen aufweisen. Die Identitäten) von jeglichen zugehörigen Gegenionen wird/werden typischerweise durch die Synthese- und/oder Isolationsverfahren bestimmt, durch die die Verbindungen erhalten werden. Typische Gegenionen umfassen in nicht begrenzender Weise Halogenide, Acetat, Trifluoracetat, etc. und Gemische davon. Es soll verstanden werden, dass die Identitäten) eines jeglichen zugehörigen Gegenions kein kritisches erfindungsgemäßes Merkmal ist und dass die Erfindung die Farbstoffe zusammen mit einem jeglichen Typ von Gegenionen umfasst. Außerdem soll die Erfindung, da die Verbindungen in einer Vielzahl von verschiedenen Formen auftreten können, nicht nur die Formen der Farbstoffe, die mit Gegenionen assoziiert sind (zum Beispiel trockene Salze), sondern auch Formen umfassen, die nicht mit Gegenionen assoziiert sind (zum Beispiel wässrige oder organische Lösungen).
5.4 Verfahren zum Synthetisieren der Verbindungen
Die erfindungsgemäßen [8,9]Benzophenoxazin-Farbstoffe können einfach aus Iod-Vorläufern, wie in den nachstehenden Schemata (I) und (II) veranschaulicht, synthetisiert werden. Schema (I) veranschaulicht die Synthese der Iod-Vorläufer. Schema (II) veranschaulicht die Verwendung der Iod-Vorläufer, um die erfindungsgemäßen [8,9]Benzophenoxazin-Farbstoffe zu erhalten. In den Schemata (I) und (II) sind die verschiedenen Rⁿ-Gruppen wie vorstehend für die Strukturformel (I) definiert.
Schema (I)
In Bezug auf das Schema (I) werden das 3-Hydroxy-2-nitrosoanilin-Derivat 30 (10 mM), das 1-Aminonaphthalen-Derivat 40 (10 mM) und HCl (0,24 M) in Methanol für etwa 2–50 h refluxiert, um das [8,9]Benzophenoxazin-Derivat 42 zu erhalten, das durch Flash-Silicagel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Methanol:Methylenchlorid als dem Eluenten isoliert wird.
Das [8,9]Benzophenoxazin-Derivat 42 (etwa 60 mM in Wasser bei etwa 60 °C) wird sodann mit einem gleichen Volumen an wässriger NaOH (0,5 M) behandelt. Die Reaktion wird 3× mit Methylenchlorid (100 ml) extrahiert, die vereinigten Extrakte mit Kochsalzlösung, gefolgt von wasserfreiem Natriumsulfat, getrocknet und das Restlösungsmittel wird durch Verdampfung entfernt, um die basische Form der Verbindung 42 zu ergeben. Diese basische Verbindung 42 (0,2 mM) wird in wasserfreiem Toluol (5 ml) gelöst, 1,3-Diiodpropan 10 (2,0 mmol) wird zugesetzt und das Gemisch unter Argon für etwa 16 h refluxiert. Der Iod-Vorläufer 44 wird durch Flash-Silicagel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Methanol:Methylenchlorid als dem Eluenten isoliert.
Verfahren zum Umwandeln des Iod-Vorläufers 44 in die erfindungsgemäßen Farbstoffe sind in dem Schema (II) veranschaulicht:
Mit Bezug auf Schema (II) wird das Iodatom des Iod-Vorläufers 44 durch ein aliphatisches Amin ersetzt. Die Identität des aliphatischen Amins hängt von der Art der gewünschten Kationenkette ab. Zum Beispiel ergibt ein Ersetzen des Iodatoms mit Trimethylamin 21 den Farbstoff 46, in dem die terminale Aminogruppe der kationischen Kette eine quaternäre Ammoniumgruppe ist. Ein Ersetzen des Iodatoms durch N,N,N',N'-Tetramethyl-1,3-diaminopropan 10 ergibt ein Gemisch von Farbstoffen 48 und 50 mit einer quaternären internen Ammoniumgruppe und/oder einer tertiären terminalen Aminogruppe. Ein Ersetzen des Iodatoms mit N,N,N',N',N''-Pentamethyldiethylentriamin 23 ergibt ein Gemisch von Farbstoffen 52 und 54 mit zwei internen Aminogruppen – eine quaternäre und eine tertiäre Gruppe – und/oder einer tertiären terminalen Aminogruppe. Bedingungen zum Durchführen der veranschaulichten Reaktionen und Verfahren zum Isolieren der Farbstoffprodukte sind in dem Beispielsteil gezeigt.
Die Schemata (I) und (II) veranschaulichen die Synthese von Farbstoffen mit bestimmten beispielhaften kationischen Ketten. Der Fachmann wird erkennen, dass Farbstoffe mit anderen kationischen Ketten leicht dadurch erhalten werden können, dass die geeigneten Diiodalkyl- und aliphatischen Amin-Ausgangsmaterialien verwendet werden. Zum Beispiel kann eine Vielzahl von verschiedenen Iod-Vorläufern mit unterschiedlicher Anzahl von Methylengruppen, die das C7-Imminium-Stickstoffatom und die Iodatome trennen, dadurch erhalten werden, dass Verbindung 42 mit einem Diiodalkylen mit der Struktur I-(CH₂)_n-I, worin n die gewünschte Anzahl von dazwischenliegenden Methylengruppen darstellt, umgesetzt wird. Die Anzahl von Methylengruppen, die die Stickstoffatome der verschiedenen internen Aminogruppen voneinander als auch von der terminalen Aminogruppe trennen, kann in einer ähnlichen Weise dadurch eingestellt werden, dass ein geeignetes aliphatisches Amin ausgewählt wird, um das Iodatom des Iod-Vorläufers zu ersetzen. Der Sättigungsgrad der kationischen Kette kann auch durch die geeignete Wahl der Diiodalkyl- und aliphatischen Aminreaktanten eingestellt werden.
Die Schemata (I) und (II) sind zum Synthetisieren der erfindungsgemäßen Farbstoffe besonders geeignet, da mit Ausnahme der Aminogruppen die verschiedenen R-Substituenten kein Schützen benötigen. Aminogruppen können in geeigneter Weise mit Fmoc oder anderen herkömmlichen basenlabilen Amino-Schutzgruppen gemäß bekannter Verfahren geschützt werden (siehe zum Beispiel Greene & Wuts, 1991, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, NY).
Verfahren zum Synthetisieren bestimmter bevorzugter erfindungsgemäßer Verbindungen, sind in dem Beispielsteil gezeigt.
5.5 Verfahren zum Verwenden der Verbindungen
Die neuen erfindungsgemäßen [8,9]Benzophenoxazin-Farbstoffe können verwendet werden, um Nukleinsäuren für eine nachfolgende Detektion in einem breiten Bereich von Anwendungen zu markieren oder anzufärben. Zum Beispiel können die Farbstoffe verwendet werden, um Nukleinsäuren in Lösungen, in Elektrophoresegelen, in Blot-Anwendungen, etc. anzufärben. Wenn verwendet, wird ein erfindungsgemäßer Farbstoff mit einer Probe, die eine Nukleinsäure enthält, vereinigt, für einen gewissen Zeitraum inkubiert, der ausreicht, um ein detektierbares Fluoreszenzsignal zu erhalten, und das Fluoreszenzsignal wird überwacht.
Der Farbstoff kann direkt zu der Probe gegeben werden, aber er ist typischerweise als eine Komponente einer wässrigen Anfärbelösung vorhanden, die mit der Probe biologisch kompatibel ist. Die Anfärbelösung wird dadurch hergestellt, dass der Farbstoff direkt in einem wässrigen Lösungsmittel wie Wasser, einer Pufferlösung (z. B. Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, "PBS") oder Zellkultur-Medium, einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel oder einem Gemisch, das ein wässriges Lösungsmittel und ein wassermischbares organisches Lösungsmittel umfasst, gelöst wird. Geeignete wassermischbare organische Lösungsmittel umfassen in nicht begrenzender Weise Dimethylsulfoxid (DMSO), Dimethylformamid (DMF), N-Methylpyrrolidon (NMP), niedere Alkohole (z. B. Ethanol, Propanol, Isopropanol, etc.) und Acetonitril. Da die erfindungsgemäßen Farbstoffe wasserlöslich sind, wird der Farbstoff gewöhnlich zuerst in einer wässrigen Lösung bei einer Konzentration gelöst, die etwa 1.000- bis 10.000-mal größer ist als die, die für eine Verwendung in der Anfärbelösung gewünscht ist, und sodann einmal oder mehrere Male mit einem wässrigen Lösungsmittel, wie einem biologischen Zellmedium oder PBS (mit einem pH-Wert von 7,4) verdünnt, um eine Anfärbelösung zu erhalten, die eine wirksame Menge des Farbstoffs enthält. Eine wirksame Menge des Farbstoffs ist eine Menge, die ausreicht, um ein detektierbares Fluoreszenzsignal zu ergeben, wenn Nukleinsäuren vorhanden sind.
Obwohl nicht beabsichtigt ist, an irgendeine bestimmte Theorie des Vorgangs gebunden zu sein, wird angenommen, dass die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Farbstoffe, Zellmembranen zu permeieren und/oder Nukleinsäuren zu binden, teilweise auf die positiven Ladungen an der kationischen Kette zurückzuführen ist. Obwohl die Nettoladung der kationischen Kette durch eine Vielzahl von Faktoren, einschließlich zum Beispiel des pH-Werts der Anfärbelösung, beeinflusst/beeinträchtigt werden kann, ist die Verwendung eines bestimmten pH-Werts für den Erfolg nicht entscheidend. Die erfindungsgemäßen Farbstoffe sind fähig, Zellen zu permeieren und/oder Nukleinsäuren zu binden, um detektierbare Fluoreszenzsignale über einen breiten Bereich von pH-Werten zu ergeben. Somit können Nukleinsäuren mit den erfindungsgemäßen Farbstoffen unter Verwendung von pH-Werten angefärbt werden, die für die bestimmte Anwendung üblich sind. Die meisten Nukleinsäure-Anfärbungstests können bei einem pH-Wert von pH 6 bis pH 8-9 erfolgen. Folglich werden Anfärbelösungen für in vitro-Anwendungen, wie Anfärben von Elektrophoresegelen, einen pH-Wert in diesem gleichen Bereich aufweisen. Anfärbelösungen für in vivo-Anwendungen, die Tests mit lebenden Zellen umfassen, werden vorzugsweise bei dem gleichen pH-Wert gehalten, wie derjenige des Zellkulturmediums, typischerweise um pH 7,4.
Typischerweise weisen Anfärbelösungen für zelluläre Proben eine Farbstoffkonzentration von mehr als etwa 0,1 nM und weniger als etwa 100 μM, typischer mehr als etwa 1 nM auf. Vorzugsweise wird die Anfärbelösung etwa 1 nM bis 20 nM Farbstoff enthalten. Anfärbelösungen für Elektrophoresegele weisen typischerweise eine Farbstoffkonzentration von mehr als etwa 1 μM und weniger als etwa 10 μM, typischer etwa 4–5 μM auf. Obwohl die vorstehend beschriebenen Anfärbelösungen allgemeine Richtlinien bereitstellen, wird in dem Fachgebiet verstanden, dass die spezifische Farbstoffkonzentration in einer Anfärbelösung durch, neben anderen Faktoren, die physikalische Art der Probe, die Konzentration der vorhandenen Nukleinsäuren und die Art der durchgeführten Analyse bestimmt wird. Die Farbstoffkonzentration, die benötigt wird, um einen spezifischen Test durchzuführen, wird folglich von dem Test abhängen und wird leicht durch den Fachmann bestimmt werden können.
Die Anfärbelösung wird mit einer Probe, die eine Nukleinsäure enthält, vereinigt. Die Nukleinsäure in der Probe kann entweder RNA oder DNA oder ein Gemisch davon sein. Alternativ kann die Probe Analoga von RNA und/oder DNA enthalten, die Anfärbeeigenschaften aufweisen, die ähnlich sind zu denjenigen von RNA und/oder DNA sind. Wenn die Nukleinsäure DNA (oder ein Analogon davon) ist, kann sie in einem jeglichen Strangzustand vorhanden sein, zum Beispiel einzel-, doppel-, dreifach- oder vierfachsträngig. Die Nukleinsäure kann entweder natürlich (d.h. im Ursprung biologisch) oder synthetisch (d.h. künstlich hergestellt sein) sein und kann in der Probe in ihrem natürlichen Zustand, wie in der Form einer mRNA oder eines kondensierten Chromosoms, oder in einem nicht-nativen Zustand, wie in der Form einer denaturierten Nukleinsäure, vorliegen.
Die Nukleinsäure kann praktisch eine jegliche Länge aufweisen, von einem Oligonukleotid, das so wenig wie 10–40 Nukleotide oder Basenpaare umfasst, über ein Polynukleotid, das Hunderte bis Tausend Nukleotide oder Basenpaare umfasst, bis zu cDNAs, Genen und sogar ganzen Chromosomen. Die Nukleinsäure kann homogen über die gesamte Probe verteilt sein, zum Beispiel gelöst in einer Nukleinsäurelösung, oder kann nur in einem Teil der Probe vorhanden sein, zum Beispiel abgesondert in einer Bande des Elektrophoresegels oder in einer Zelle oder einem Teil einer Zelle, und sie kann folglich verwendet werden, um zwischen individuellen Proben zu unterscheiden oder einen Teil oder eine Region innerhalb einer einzigen Probe zu unterscheiden.
Da ein signifikanter Vorteil der erfindungsgemäßen (8,9]Benzophenoxazin-Farbstoffe deren Permeabilität für Zellen ist, kann die Nukleinsäure in einer biologischen Struktur eingeschlossen sein, zum Beispiel eingeschlossen innerhalb eines viralen Partikels, einer Organelle oder innerhalb einer Zelle. In biologischen Strukturen eingeschlossene Nukleinsäuren können aus einer großen Vielzahl von Umgebungen erhalten werden, einschließlich in nicht begrenzender Weise kultivierten Zellen, Organismen oder Geweben, ungefilterten oder abgetrennten biologischen Flüssigkeiten (z. B. Urin, zerebrospinale Flüssigkeit, Blut, Lymphflüssigkeiten, etc.), Gewebshomogenaten, Schleim, Speichel, Stuhl, physiologischen Sekreten, Erde, Wasser und Luft. Die Nukleinsäure kann endogen hinsichtlich der Probe sein oder sie kann als ein Fremdmaterial eingebracht worden sein, wie durch Infektion oder Transfektion. Ganze Zellen können lebend oder tot angefärbt werden und sie können zunächst fixiert und gemäß histochemischer oder cytochemischer Routineverfahren behandelt werden.
Die Probe kann mit der Anfärbelösung mittels jeglicher Mittel vereinigt werden, die einen Kontakt zwischen dem Farbstoff und der Nukleinsäure vereinfachen. Der Kontakt kann bei simplem Mischen, wie in dem Fall, in dem die Probe eine Lösung ist, oder bei Inkubation einer Struktur, die die Nukleinsäure enthält, mit der Anfärbelösung auftreten, wie in dem Fall eines Anfärbens von Nukleinsäuren, die in Elektrophoresegelen oder anderen Matrices eingebettet sind. Obwohl es sich gezeigt hat, dass die erfindungsgemäßen Farbstoffe Zellmembranen schnell und vollständig bei einer Zugabe der Anfärbelösung zu einer Zellprobe permeieren, kann eine jegliche andere Technik, die zum Transport des Farbstoffs über eine Membran geeignet ist, vorzugsweise mit einer minimalen Schädigung der Zell- und/oder Membranintegrität, auch im Zusammenhang mit den Farbstoffen verwendet werden. Beispielhafte Techniken umfassen die Verwendung von chemischen Mitteln (Detergenzien, Enzyme, Adenosintriphosphat), Rezeptor- oder Transportproteinen, porenbildenden Proteinen, Mikroinjektion, Elektroporation, hypoosmotischen Schock, Scrape Loading, Partikelbeschuss, etc.
Die Probe wird in Gegenwart des Farbstoffs für eine Zeitspanne inkubiert, die ausreicht, um ein detektierbares Fluoreszenzsignal zu ergeben. Obwohl nicht beabsichtigt ist, an eine jegliche Theorie des Vorgangs gebunden zu sein, wird angenommen, dass, da die erfindungsgemäßen Farbstoffe signifikante Zunahmen der Quantenausbeute in Gegenwart von Nukleinsäuren aufweisen, das detektierbare Fluoreszenzsignal bei einer Bildung eines Nukleinsäure-Farbstoff-Komplexes verursacht wird. Eine detektierbare Fluoreszenz in einer Nukleinsäurelösung erfolgt im Wesentlichen augenblicklich. Eine detektierbare Fluoreszenz innerhalb von Zellmembranen erfordert, dass der Farbstoff in die Zelle permeiert. Im Allgemeinen kann eine sichtbare detektierbare Fluoreszenz in einer großen Vielzahl von Zellen mit erfindungsgemäßen Ausführungsformen innerhalb von etwa 5 Min. nach Vereinigen der Zellen mit einer Anfärbelösung erhalten werden, die etwa 1 nM bis 10 nM Farbstoff umfasst.
Nach der Anfärbung kann die Anfärbelösung entfernt und, abhängig von der Anwendung, die Nukleinsäure vor einer Detektion gespült werden. Zum Beispiel kann in Elektrophoreseanwendungen das angefärbte Gel vor einer Detektion gespült werden (z. B. mit Wasser oder Puffer). Jedoch aufgrund ihrer großen Zunahme hinsichtlich der Quantenausbeute beim Binden oder Komplexieren mit Nukleinsäuren, muss der ungebundene Farbstoff vor einer Detektion nicht entfernt werden. Diese Eigenschaft der Farbstoffe verleiht ihnen einen unschätzbaren Wert beim Analysieren von Nukleinsäuren in lebenden Zellen durch statische und/oder Flusscytometrie, bei denen die Anfärbelösung vor der Detektion nicht entfernt wird. Obwohl Permeation und Fluoreszenz für die meisten Ausführungsformen schnell sind, wird dem Fachmann leicht ersichtlich sein, dass die Zeitspanne, die für eine ausreichende Bildung eines detektierbaren Fluoreszenzsignals nötig ist, von, neben anderen Faktoren, der physikalischen und chemischen Art der individuellen Probe und des Probenmediums abhängt.
Die nahezu universale Membranpermeabilität der erfindungsgemäßen Farbstoffe und deren schnelle Aufnahmekinetiken erlauben die Untersuchung von Nukleinsäuren in einer großen Vielzahl von lebenden Proben. Praktisch jeglicher Zelltyp kann unter Verwendung der erfindungsgemäßen Farbstoffe getestet werden, einschließlich Prokaryonten wie Bakterien und Eukaryonten wie Säugerzellen. In einigen Zelllinien, zum Beispiel HCT-116, sind die Farbstoffe besonders geeignet, da sie spezifisch den Kern dieser Zellen anfärben.
Wie viele Nukleinsäure-Farbstoffe weisen die erfindungsgemäßen [8,9]Benzophenoxazin-Farbstoffe eine erhöhte Fluoreszenz in Gegenwart von Nukleinsäuren auf. Die spektralen Eigenschaften der [8,9]Benzophenoxazin-Farbstoffe, einschließlich der Quantenausbeute ohne Nukleinsäuren, sind in der Tabelle 1 gezeigt. Typischerweise erhöht sich die Quantenausbeute signifikant in Gegenwart von Nukleinsäuren. Im Vergleich zu verfügbaren rot-emittierenden Farbstoffen für lebende Zellen weisen die erfindungsgemäßen Farbstoffe verbesserte Quantenausbeuten beim Binden an Nukleinsäuren auf.
Außerdem weisen die erfindungsgemäßen Farbstoffe signifikant schnellere Permeationskinetiken auf als gegenwärtig erhältliche rot-emittierende Farbstoffe für lebende Zellen, wobei sie im Allgemeinen signifikant schneller als SYTO 61® (Molecular Probes, Eugene, OR) aufgenommen werden. Die 2 zeigt, dass Bona 12- und Bona 25-Farbstoffe eine signifikante, detektierbare Fluoreszenz in etwa 5 Minuten erzeugen, während SYTO 61 etwa 1 bis 2 Stunden benötigt. Diese Verbesserungen hinsichtlich der Quantenausbeute und der Permeationskinetiken übertragen sich direkt auf eine erhöhte Geschwindigkeit und Sensitivität in nahezu jedem Bereich der Nukleinsäuredetektion.
Obwohl nicht jede Ausführungsform der erfindungsgemäßen Farbstoffe Verbesserungen hinsichtlich der Quantenausbeute und/oder Permeationskinetiken, relativ zur zuvor bekannten Nukleinsäure-Farbstoffen aufweisen wird, stellen andere Ei genschaften der erfindungsgemäße Farbstoffe signifikante Verbesserungen hinsichtlich anderer Aspekte der Verwendung dar, einschließlich der Fähigkeit, selektiv deren Anregungs- und/oder Emissionsbanden zur Anpassung an spezifische Instrumente, zum Beispiel Laseranregungsfrequenzen, anzupassen, und/oder deren erhöhte Fotostabilität. Ganz signifikant werden alle erfindungsgemäßen Farbstoffe in dem roten Bereich des sichtbaren Spektrums (≥ 630 nm) angeregt und emittieren dort und sie sind hochgradig fotostabil. Farbstoffe mit 5 Ringen in dem kondensierten Ringsystem emittieren bei Wellenlängen über 700 nm. Gegenwärtig gibt es keine käuflich erhältlichen, fotostabilen Nukleinsäure-Farbstoffe für lebende Zellen, deren Emissionsmaxima über 700 nm liegen.
Die Nukleinsäuren werden basierend auf den spektralen Anregungs- und Emissionseigenschaften des Nukleinsäure-Farbstoff-Komplexes detektiert. Im Allgemeinen wird die angefärbte Probe durch eine Strahlungsquelle, wie einem Laser, angeregt, der fähig ist, Strahlung bei einer Wellenlänge bei oder nahe dem Anregungsmaximum des Nukleinsäure-Farbstoff-Komplexes zu erzeugen. Die Nukleobasen von zellulären Nukleinsäuren und/oder andere zelluläre Komponenten wie Proteine absorbieren ultraviolette Strahlung (λ_max = 260–280 nm) mit hohen molaren Absorptionsgraden. Folglich stellen die sichtbaren Rotanregungsprofile der erfindungsgemäßen Farbstoffe einen signifikanten Vorteil bereit, da die meisten dieser zellulären Komponenten keine rote Strahlung absorbieren (d.h. sie sind hierfür durchlässig).
Die Fluoreszenz des Nukleinsäure-Farbstoff-Komplexes wird qualitativ oder quantitativ dadurch detektiert, dass die sich ergebende Strahlungsemission bei einer geeigneten Wellenlänge detektiert wird. Da die erfindungsgemäßen Farbstoffe in dem roten Bereich des sichtbaren Spektrums fluoreszieren, wird das Fluoreszenzsignal typischerweise bei Wellenlängen über etwa 650 nm detektiert. Farbstoffe mit höheren Emissionsmaxima können bei noch größeren Wellenlängen detektiert werden. Die Emission kann durch Mittel detektiert werden, die beispielhaft und nicht begrenzend eine Untersuchung mit dem unbewaffneten Auge, einen fotografischen Film, Fluorimeter, Quantenzähler, Plattenausleser, Epifluoreszenzmikroskope und statische und Flusscytometer umfassen. Die emittierte Strahlung kann direkt detektiert werden oder sie kann zunächst verstärkt werden, zum Beispiel dadurch, dass ihr zuerst erlaubt wird, dass sie einen Fotomultiplier durchläuft.
Für eine quantitative Detektion können die emittierten Photonen mit einem Photonenzähler gezählt werden.
Die Sensitivität, Permeabilität, Fotostabilität und Anregungs- und Emissionseigenschaften der erfindungsgemäßen Farbstoffe stellen einen universellen Nutzen in allen Tests, die ein Anfärben von Nukleinsäure umfassen, als auch wesentliche Verbesserungen gegenüber gegenwärtig erhältlichen Farbstoffen für lebende Zellen und anderen Nukleinsäure-Farbstoffen bereit. Die Fähigkeit, Nukleinsäuren in einer jeglichen Lösung, auf einem jeglichen Substrat und/oder von einer jeglichen Probe und insbesondere von Proben von lebenden Zellen unter Verwendung von roten Lasern schnell zu detektieren und/oder zu quantifizieren, bietet beispielslose Möglichkeiten in Gebieten, die eine Fluoreszenzanfärbung von Nukleinsäuren verwenden.
6. BEISPIELE
Die Erfindung wurde beschrieben und die nachstehenden Beispiele werden zur Veranschaulichung und in nicht begrenzender Weise angegeben.
6.1. Verbindungssynthesen
6.1.1 Synthese von Bona 11 und Bona 12
Die [8,9]Benzophenoxazin-Farbstoffe Bona 11 und Bona 12 wurden, wie nachstehend in dem Schema (III) veranschaulicht, synthetisiert: Schema (III)
Mit Bezug auf das Schema (III) wurden 1,18 g Nil Blau-Chlorid (4, Aldrich) in 100 ml Wasser bei 60 °C 30 Min. suspendiert. 100 ml 0,5 molarer wässriger NaOH wurden zugegeben. Das basische Nil Blau wurde mit Methylenchlorid extrahiert (3-mal, jeweils 100 ml) und die vereinigten Extrakte wurden mit Kochsalzlösung, gefolgt von wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet. Nach Entfernung des Lösungsmittels durch Verdampfung wurde der Rückstand (basisches Nil Blau) über Nacht bei vermindertem Druck getrocknet.
In einem 50 ml-Rundkolben wurden 64 mg des basischen Nil Blaus (0,2 mmol) in 5 ml wasserfreiem Toluol gelöst. 230 ml Diiodpropan (6, 2 mmol, Aldrich) wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde unter Argon 16 h refluxiert. 88,1 mg der Verbindung 8 (Ausbeute 72%) wurden durch Flash-Silicagel-Säulenchromatographie unter Verwendung von 5% (v/v) Methanol in Methylenchlorid als dem Eluenten erhalten. Verbindung 8 MS (M+H): berechnet: 486,1, gemessen: 486,3.
In einem 50 ml Rundkolben wurden 10 mg Verbindung 8 (16 mmol) in 10 ml wasserfreiem Ethanol gelöst und 17,2 ml N,N,N',N'-Tetramethyl-1,3-diaminopropan (10, 103 mmol, Aldrich) wurden zugegeben und das Gemisch wurde unter Argon 6 h refluxiert, was ein Gemisch von Bona 11 und Bona 12 ergab. Die zwei Farbstoffe wurden mittels HPLC mit reverser Phase unter Verwendung eines linearen Gradienten (0%–70% über 30 Min.) von Puffer B (0,085% TFA in Acetonitril) in Puffer A (0,1% TFA in Wasser) als dem Eluenten isoliert. In diesem Gradienten eluierte der Farbstoff Bona 11 bei 14,8 Min. und der Farbstoff Bona 12 eluierte bei 16,1 Min.

Bona 11 MS (M+H): berechnet: 488,3, gemessen: 488,0. MS-MS-Fragmentierung: 403,2 358,2, 349,8, 330,0, 303,2, 286,0, 259,2, 86,0, 58,0. Bona 12 MS (M+H): berechnet: 403,2, gemessen: 403,0. MS-MS-Fragmentierung: 403,2 358,2, 330,0, 303,2, 286,2, 259,2, 86,0, 58,0.

6.1.2 Synthese des Farbstoffs Bona 2
Der [8,9]Benzophenoxazin-Farbstoff Bona 2 wurde, wie nachstehend in dem Schema (IV) veranschaulicht, synthetisiert: Schema (IV)
In Bezug auf das Schema (IV) wurden in einem 250 ml Rundkolben 1,16 g 2-Nitroso-5-diethylaminophenolhydrochlorid (14, 5 mmol, TCI America) und 0,97 g 1-Aminoanthracen (16, 4,5 mmol, ~90% Reinheit, Aldrich) in 100 ml Ethanol mit 3 ml konzentrierter HCl (37%) gelöst und das Gemisch wurde 2 h refluxiert. 1,62 g der Verbindung 18 (Ausbeute 89%) wurden durch Flash-Silicagel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Methanol/Methylenchlorid als dem Eluenten erhalten.

Verbindung 18 MS (M+H): berechnet: 368,2, gemessen: 368,2. ¹H-NMR der Verbindung 18 (in DMSO-d6, ppm): 1,12 (Triplett, 6H), 3,40 (Multiplett, 4H), 6,42 (Duplett, 2H), 6,58 (d, 1H), 7,40 (d, 1H), 7,60 (m, 2H), 8,15 (m, 2H), 8,98 (d, 2H) und 10,10 (breites Singulett, 1H).

101 mg der Verbindung 18 (0,25 mmol) wurden in 10 ml Methanol gelöst, 90 ml Methylenchlorid wurden zugegeben und die Lösung wurde mit 50 ml 1 molarer NaOH (zweimal), gefolgt von 50 ml Kochsalzlösung (einmal) in einem Scheidetrichter gewaschen. Die organische Phase wurde mit wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet. Nachdem das Lösungsmittel verdampft war, wurde der Rückstand mit einer Ölpumpe 6 h getrocknet. Der getrocknete Rückstand wurde sodann in 20 ml Toluol gelöst, 345 ml 1,3-Diiodpropan (6, 3 mmol) wurden zugegeben und das Gemisch wurde unter Argon 16 h refluxiert. 95 mg der Verbindung 20 (Ausbeute 57%) wurden durch Flash-Silicagel-Säulenchromatographie unter Verwendung von 5% (v/v) Methanol in Methylenchlorid als dem Eluenten erhalten.

Verbindung 20 MS (M+H): berechnet: 536,1, gemessen: 536,3. ¹H-NMR der Verbindung 20 (in DMSO-d6, ppm): 1,19 (t, 6H), 3,19 (m, 2H), 3,45 (m, 2H), 3,56 (Quadruplett, 4H), 3,78 (m, 2H), 6,742 (s, 1H), 6,930 (s, 1H), 7,105 (m, 1H), 7,74 (m, 3H), 8,10 (d, 1H), 8,26 (d, 1H), 9,065 (s, 1H), 9,219 (s, 1H) und 10,353 (breites Singulett, 1H).

In einem 25 ml-Rundkolben wurden 27 mg der Verbindung 20 (0,041 mmol) in 5 ml wasserfreiem Ethanol gelöst, 34 ml N,N,N',N'-Tetramethyl-1,3-diaminopropan (10, 0,204 mmol, Aldrich) wurden zugegeben und das Gemisch wurde unter Argon 4 h refluxiert. Nachdem der Ethanol verdampft war, wurde der Rückstand in 15 ml H₂O mit 0,5 ml Trifluoressigsäure (TFA) gelöst und 5-mal mit Ethylacetat (jeweils 50 ml) gewaschen, um die Ausgangsmaterialien zu entfernen. Die wässrige Lösung wurde sodann konzentriert und durch eine Gelfiltrationssäule (Sephadex G-10) geleitet. 5%ige wässrige Essigsäurelösung wurde als der Eluent verwendet. Nachdem die Lösungsmittel verdampft waren, wurden 9,1 mg reines Bona 2 (Ausbeute 31%) erhalten. Bona 2 MS (M+H): berechnet: 538,3, gemessen: 538,0. MS-MS-Fragmentierung: 538,2, 408,2, 380,2, 336,0, 86,01, 58,0.
6.1.3 Synthese der Farbstoffe Bona 22, Bona 24 und Bona 25
Die [8,9]Benzophenoxazin-Farbstoffe Bona 22, Bona 24 und Bona 25 wurden, wie nachstehend in dem Schema (V) veranschaulicht, synthetisiert: Schema (V)
Bona 22
In einem 25 ml-Rundkolben wurden 3,0 mg der Verbindung 20 (4,5 mmol, wie in Abschnitt 6.1.2 vorstehend beschrieben hergestellt), in 2 ml wasserfreiem Ethanol gelöst, 2,86 ml Trimethylamin (21, 45,2 mmol, Aldrich) wurden zugegeben und das Gemisch wurde unter Argon 4 h refluxiert. Nachdem der Ethanol verdampft war, wurde der Rückstand in 0,1% wässriger TFA gelöst und durch HPLC, wie vorstehend in Abschnitt 6.1.1 beschrieben, aufgereinigt. 1,9 mg reines Bona 22 wurden erhalten (Ausbeute 61%, Retentionszeit 17,0 Min.). Bona 22 MS (M+H): berechnet: 467,3, gemessen: 467,1. MS-MS-Fragmentierung: 467,4, 408,2, 380,0, 336,2.
Bona 24 und Bona 25
In einem 25 ml-Rundkolben wurden 1,5 mg der Verbindung 20 (2,3 mmol, wie in Abschnitt 6.1.2 vorstehend beschrieben hergestellt) in 3 ml wasserfreiem Ethanol gelöst, 20,8 ml N,N,N',N',N''-Pentamethyldiethylentriamin (23, 0,1 mmol, Aldrich) wurden zugegeben und das Gemisch wurde unter Argon 8 h refluxiert, wodurch ein Gemisch der Farbstoffe Bona 24 und Bona 25 erhalten wurde, die durch HPLC, wie vorstehend in Abschnitt 6.1.1 beschrieben, aufgereinigt wurden. Der Farbstoff Bona 24 eluierte bei 17,8 Min. und der Farbstoff Bona 25 eluierte bei 19,2 Min. Die Bildung des Farbstoffs Bona 25 war wahrscheinlich auf die Fragmentierung der Verbindung 24 während der Refluxierungsbedingungen zurückzuführen.

Bona 24 MS (M+H): berechnet: 581,4, gemessen: 581,3. MS (M/2+H): berechnet: 291,1, gemessen: 291,3. MS-MS-Fragmentierung: 581,2, 408,2, 129,2, 72,0. Bona 25 MS (M+H): berechnet: 453,3, gemessen: 453,0. MS (M/2+H): berechnet: 227,2, gemessen: 227,3. MS-MS-Fragmentierung: 453,6, 408,2, 380,2, 363,8, 353,0, 336,4, 335,8, 309,4, 86,2, 72,2, 58,4.

Mit Bezug auf das Schema (V) wurde in einem alternativen Verfahren der Farbstoff Bona 25 wie folgt erhalten: In einem 10 ml-Rundkolben wurde 1 mg der Verbindung 20 (1,5 mmol) in 3 ml 2 M Dimethylamin in Methanol (26, 6 mmol, Aldrich) gelöst. Die Lösung wurde unter Argon 2 h refluxiert und das reine Bona 25 wurde durch HPLC, wie vorstehend beschrieben, erhalten.
6.1.4 Synthese der Farbstoffe Bona 27 und 28
Die [8,9]Benzophenoxazin-Farbstoffe Bona 27 und 28 (vorstehend veranschaulicht), die eine primäre terminale Aminogruppe aufweisen, wurden aus Verbindung 20, wie in dem Schema (V) veranschaulicht, unter Verwendung von 3,3'-Diamino-N-methyldipropylamin (CH₃N(CH₂CH₂CH₂NH₂)₂, Aldrich) als dem Alkylamin synthetisiert. Kurz gesagt wurden in einem 25 ml-Rundkolben 1,5 mg der Verbindung 20 (2,3 mmol, wie vorstehend in Abschnitt 6.1.2 beschrieben hergestellt) in 3 ml wasserfreiem Ethanol gelöst, 16,1 ml 3,3'-Diamino-N-methyldipropylamin (0,1 mmol) wurden zugegeben und das Gemisch wurde unter Argon 8 h refluxiert, wodurch ein Gemisch der Farbstoffe Bona 27 und Bona 28 erhalten wurde. Reines Bona 27 und Bona 28 wurden durch HPLC, wie vorstehend in Abschnitt 6.1.1 be schrieben, erhalten. Der Farbstoff Bona 27 eluierte bei 17,0 Min. und der Farbstoff Bona 28 eluierte bei 18,1 Min.

Bona 27 MS (M+H): berechnet: 553,4, gemessen: 553,6. MS (M/2+H): berechnet: 277,2, gemessen 277,5. Bona 28 MS (M+H): berechnet: 496,3, gemessen: 496,5. MS (M/2+H): berechnet: 248,7, gemessen 248,8.

6.2 Spektrale Eigenschaften der erfindungsgemäßen Farbstoffe
Die Absorptions- (Anregungs-) Maxima (λ_{abs, max}), die molaren Extinktionskoeffizienten (ε), Emissionsmaxima (λ_em,
max) und Quantenausbeuten (Q) von bestimmten beispielhaften erfindungsgemäßen Farbstoffen in Tris-Puffer (pH 7,4) und/oder Methanol sind nachstehend in der TABELLE 1 gezeigt:
TABELLE 1 Spektrale Eigenschaften von beispielhaften erfindungsgemäßen Farbstoffen
6.3 Die erfindungsgemäßen Farbstoffe diffundieren über Zellmembranen
Dieses Beispiel zeigt die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Farbstoffe, passiv durch die Membranen von lebenden Zellen zu permeieren oder darüber zu diffundieren.
6.3.1 Experimentelles Protokoll
HCT-116-Colorectalzellen wurden bei einer Dichte von etwa 10.000 Zellen/Well in einer 96 Well-Mikrotiterplate (Costar 3603) in einem Volumen von 200 μl Medium (RPMI 1640-Medium mit 10% fötalem Rinderserum) ausplattiert. Penicillin/Streptomycin wurden zugesetzt, um bakterielle Infektionen in der Zellkultur zu hemmen. Nachdem die Zellen sich an die Plattenmatrix angelegt hatten (Inkubation über Nacht), wurden die Zellen mit 50 μl Anfärbelösung (1–10 nM Farbstoff in entweder Medium, PBS oder einem Calciumpuffer mit 12,5 mM CaCl₂, 140 mM NaCl und 10 mM Hepes, pH 7,4) angefärbt. Bilder der Zellen wurden sofort nach dem Anfärben auf einem FMAT 8100 HTS-Instrument (PE Biosystems, Foster City, CA) gesammelt.
6.3.2 Ergebnisse
Die Ergebnisse des Membranpermeabilitätsexperiments sind in der TABELLE 2 bereitgestellt.
TABELLE 2 Permeabilitätseigenschaften der erfindungsgemäßen Farbstoffe
Wie in TABELLE 2 angegeben, wiesen die Farbstoffe Bona 11, Bona 12, Bona 24 und Bona 25 eine hervorragende Membranpermeabilität auf. Der Farbstoff Bona 22 wies eine gute Membranpermeabilität auf. Die Farbstoffe Bona 2, Bona 27 und Bona 28 waren für Zellmembranen nicht permeabel.
Ähnliche mit UC11 (Astrocytoma)-, COS (Affennieren)-, CHO (Chinesischen Hamster-Ovar)- und HUVEC (humanen Nabelschnurvenenendothel)-Zellen durchgeführte Experimente zeigten ähnliche Ergebnisse.
6.4 Die erfindungsgemäßen Farbstoff färben Nukleinsäuren in ganzen Zellen an
HCT-116-Zellen wurden, wie vorstehend in Abschnitt 6.3.1 beschrieben, mit den Farbstoffen Bona 12 (20 nM), Bona 24 (20 nM), Bona 25 (20 nM) und käuflich erhältlichem SYTO 61© (4 nM, Molecular Probes, Eugene, OR) angefärbt. Als eine Kontrolle wurden Zellen auch mit 0,57 μg/μl Antikörper HLA-A,B,C (Pharmingen) angefärbt, der mit dem Cyanin-Farbstoff Cy5 (Cy5-NHS-Ester, Amersham) markiert worden war.
Die Ergebnisse des Anfärbeexperiments mit lebenden Zellen sind in den 1A-D gezeigt. Die 1A zeigt Zellen, die mit dem markierten Antikörper angefärbt wurden, der an Membranrezeptoren bindet und folglich die gesamte Zelle erleuchtet. In 1A sind die ganzen Zellen klar sichtbar. Im Vergleich dazu ist in den 1B, C und D, die mit Bona 12, Bona 24 bzw. Bona 25 angefärbte Zellen zeigen, das angefärbte Gebiet viel kleiner und mehr lokalisiert, was anzeigt, dass die Farbstoffe die Kernmembranen durchdringen und die Kerne der Zellen anfärben. In den mit SYTO 61^® angefärbten Zellen (1E) ist ein großer Bereich der Zellen sichtbar, sehr vergleichbar mit den mit dem markierten Antikörper angefärbten Zellen. Folglich zeigt dieses Experiment, dass die erfindungsgemäßen Farbstoffe heller und für Nukleinsäuren spezifischer sind als der käuflich erhältliche rotemittierende Farbstoff SYTO 61^®.
6.5 Die erfindungsgemäßen Farbstoffe sind heller und weisen überlegenere Anfärbekinetiken auf als verfügbare rot-emittierende Nukleinsäure-Farbstoffe für lebende Zellen
HCT-116-Zellen wurden, wie vorstehend in Abschnitt 6.3.1 beschrieben, mit den Farbstoffen Bona 12, Bona 25 und SYTO 61^® bei 0,156 nM angefärbt und die durchschnittliche Fluoreszenz wurde als eine Funktion der Zeit aufgezeichnet. Die Kurve der zeitabhängigen Fluoreszenz ist in 2 gezeigt. Bei nahezu jedem Zeitpunkt ergaben die erfindungsgemäßen Farbstoffe ein helleres Signal als SYTO 61^®, was anzeigt, dass die erfindungsgemäßen Farbstoffe Zellmembranen schneller permeierten als SYTO 61^®. Ganz signifikant ist bei 200 Min. das Fluoreszenzsignal für Bona 12 mehr als viermal so stark wie das von SYTO 61^®. Das Signal von Bona 25 ist mehr als dreimal so stark.
Die schnelleren Permeationskinetiken und helleren Signale werden auch bei höheren Farbstoffkonzentrationen beobachtet. In einem ähnlichen Experiment unter Verwendung von 40 nM Farbstoffen (Ergebnisse nicht gezeigt) dauerte es nur 5 Min., um eine detektierbare Menge von HCT-116-Zellen mit Bona 25 zu markieren, im Vergleich mit 1 bis 2 h für SYTO 61^®.
Es ist aus den verschiedenen vorstehend beschriebenen Experimenten ersichtlich, dass die neuen erfindungsgemäßen [8,9]Benzophenoxazin-Farbstoffe eine neue und wichtige Klasse von fluoreszierenden Nukleinsäure-Farbstoffen für lebende Zellen bereitstellen. Die neuen Farbstoffe stellen signifikant schnellere Kinetiken und hellere Fluoreszenz bereit als käuflich erhältliches SYTO 61^®, was eine schnelle Detektion von DNA in Tests mit lebenden Zellen unter Verwendung von weniger Farbstoff erlaubt. Die Farbstoffe stellen auch signifikante Vorteile aufgrund ihrer spektralen Rot-Anregungs- und Emissionseigenschaften bereit. Eine Anregung in dem sichtbaren roten Bereich des Spektrums ist vorteilhaft, da es Autofluoreszenz von Chromophoren, die üblicherweise in Zellen aufgefunden werden (z. B. Flavine, Porphyrine, etc.), die Raman-Streuung von Wasser und die Fluoreszenz, die durch Testausrüstung, wie Plastikmaterialien, beigesteuert werden, minimiert. Folglich sind viele Verbindungen und/oder Substanzen, die in dem grünen Bereich autofluoreszieren, durchlässig in dem roten Bereich, wodurch Hintergrundsignale vermindert werden und auch die Möglichkeit minimiert wird, dass Verbindungen in den Zellen den Test abstoppen. Eine Emission in dem sichtbaren roten Bereich des Spektrums ist vorteilhaft, da sie die Verwendung von billigerer Detektionsausrüstung erlaubt. Folglich stellen die neuen erfindungsgemäßen Farbstoffe signifikante Vorteile sowohl in in vitro- als auch in vivo-Nukleinsäure-Anfärbungsanwendungen bereit.

Claims

Benzophenoxazinverbindung gemäß der Strukturformel (I)
einschließlich jeglicher zugehöriger Gegenionen, worin: R¹, wenn für sich genommen, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff-, Halogenatom, (C₁-C₆)Alkylgruppe, -OR', -SR', -NR'R', -CN, -NO₂ und -C(O)R', oder, wenn mit R² zusammen genommen, eine (C₅-C₁₄)Arylenogruppe oder eine (C₅-C₁₄)Arylenogruppe ist, die mit einer oder mehreren der gleichen oder verschiedenen W-Gruppen substituiert ist, R², wenn für sich genommen, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom, (C₁-C₆)Alkylgruppe, -OR', -SR', -NR'R', -CN, -NO₂ und -C(O)R', oder, wenn mit R¹ zusammen genommen, eine (C₅-C₁₄)Arylenogruppe oder eine (C₅-C₁₄)Arylenogruppe ist, die mit einer oder mehreren der gleichen oder verschiedenen W-Gruppen substituiert ist, R³, wenn für sich genommen, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom, (C₁-C₆)Alkyl- und (C₅-C₁₄)Arylgruppe, oder, wenn mit R3' zusammen genommen, eine (C₂-C₈)Alkyldiylgruppe ist, R3', wenn für sich genommen, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom, (C₁-C₆)Alkyl- und (C₅-C₁₄)Arylgruppe, oder, wenn mit R3 zusammen genommen, eine (C₂-C₈)Alkyldiylgruppe ist, R⁴ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom, (C₁-C₆)Alkylgruppe, -OR', -SR', -NR'R', -CN, -NO₂ und -C(O)R', R⁶ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom, (C₁-C₆)Alkylgruppe, -OR', -SR', -NR'R', -CN, -NO₂ und -C(O)R', R⁷ -(CH₂)_n(NRR-(CH₂)_n)_m-NRRR ist, worin jedes n unabhängig eine ganze Zahl von 2 bis 6 ist, m eine ganze Zahl von 0 bis 6 ist und jedes R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom und (C₁-C₆)Alkylgruppe, R¹¹, wenn für sich genommen, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom, (C₁-C₆)Alkylgruppe, -OR', -SR', -NR'R', -CN, -NO₂ und -C(O)R', oder, wenn mit R¹² zusammen genommen, eine (C₅-C₁₄)Arylenogruppe oder eine (C₅-C₁₄)Arylenogruppe ist, die mit einer oder mehreren der gleichen oder verschiedenen W-Gruppen substituiert ist, R¹², wenn für sich genommen, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom, (C₁-C₆)Alkylgruppe, -OR', -SR', -NR'R', -CN, -NO₂ und -C(O)R', oder, wenn mit R¹² oder R¹³ zusammen genommen, eine (C₅-C₁₄)Arylenogruppe oder eine (C₅-C₁₄)Arylenogruppe ist, die mit einer oder mehreren der gleichen oder verschiedenen W-Gruppen substituiert ist, R¹³, wenn für sich genommen, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom, (C₁-C₆)Alkylgruppe, -OR', -SR', -NR'R', -CN, -NO₂ und -C(O)R', oder, wenn mit R¹² oder R¹⁴ zusammen genommen, eine (C₅-C₁₄)Arylenogruppe oder eine (C₅-C₁₄)Arylenogruppe ist, die mit einer oder mehreren der gleichen oder verschiedenen W-Gruppen substituiert ist, R¹⁴, wenn für sich genommen, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom, (C₁-C₆)Alkylgruppe, -OR', -SR', -NR'R', -CN, -NO₂ und -C(O)R', oder, wenn mit R¹³ zusammen genommen, eine (C₅-C₁₄)Arylenogruppe oder eine (C₅-C₁₄)Arylenogruppe ist, die mit einer oder mehreren der gleichen oder verschiedenen W-Gruppen substituiert ist, jede W-Gruppe unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (C₁-C₆)Alkylgruppe, -OR', -SR', -NR'R', -CN, -NO₂ und -C(O)R' und jedes R' unabhängig ein Wasserstoffatom oder eine (C₁-C₆)Alkylgruppe ist, mit der Maßgabe, dass die Benzophenoxazinverbindung nicht 3-Dimethylamino-7-[2-(diethylamino)ethyl]imino-5H-[8,9]benzophenoxazinchlorid ist.
Benzophenoxazinverbindung nach Anspruch 1, die membrangängig ist.
Benzophenoxazinverbindung nach Anspruch 1, worin R¹, R², R⁴ und R⁶ jeweils Wasserstoffatome sind.
Benzophenoxazinverbindung nach Anspruch 1, worin R³ und R^3' jeweils unabhängig (C₁-C₃)Alkylgruppen sind.
Benzophenoxazinverbindung nach Anspruch 1, worin R¹ mit R² zusammen genommen wird und eine Benzo-, [1,2]Naphthaleno- oder [2,3]Naphthalenogruppe ist.
Benzophenoxazinverbindung nach Anspruch 1, worin R¹¹, R¹², R¹³ und R¹⁴ jeweils Wasserstoffatome sind.
Benzophenoxazinverbindung nach Anspruch 1, worin R¹¹ mit R¹² zusammen genommen wird und eine Benzogruppe ist.
Benzophenoxazinverbindung nach Anspruch 1, worin R¹² mit R¹³ zusammen genommen wird und ein Benzogruppe ist.
Benzophenoxazinverbindung nach Anspruch 1, worin R¹³ mit R¹⁴zusammen genommen wird und eine Benzogruppe ist.
Benzophenoxazinverbindung nach Anspruch 1, worin R⁷ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -(CH₂)_n-NRRR, -(CH₂)_n-NRR-(CH₂)_n-NRRR und -(CH₂)_n-NRR-(CH₂)_n-NRR-(CH₂)_n-NRRR, worin jedes n unabhängig eine ganze Zahl von 2 bis 3 ist und jedes R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom und (C₁-C₃)Alkylgruppe.
Benzophenoxazinverbindung nach Anspruch 1, die eine Verbindung gemäß der Strukturformel (II):
ist, einschließlich jeglicher zugehöriger Gegenionen, worin R⁷ -(CH₂)_n-[NRR(CH₂)_n)_m-NRRR ist, worin jedes n unabhängig eine ganze Zahl von 2 bis 6 ist, m eine ganze Zahl von 0 bis 6 ist und jedes R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom und (C₁-C₆)Alkylgruppe.
Benzophenoxazinverbindung nach Anspruch 11, die membrangängig ist.
Benzophenoxazinverbindung nach Anspruch 11, worin R⁷ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -(CH₂)_n-NRRR, -(CH₂)_n-NRR-(CH₂)_n-NRRR und -(CH₂)_n-NRR-(CHa)_n-NRR-(CH₂)_n-NRRR, worin jedes n unabhängig eine ganze Zahl von 2 bis 3 ist und jedes R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom und (C₁-C₃)Alkylgruppe.
Benzophenoxazinverbindung nach Anspruch 11, die die Strukturformel:
aufweist, einschließlich jeglicher zugehöriger Gegenionen.
Benzophenoxazinverbindung nach Anspruch 11, die die Strukturformel:
aufweist, einschließlich jeglicher zugehöriger Gegenionen.
Benzophenoxazinverbindung nach Anspruch 1, die eine Verbindung gemäß der Strukturformel (III):
ist, einschließlich jeglicher zugehöriger Gegenionen, worin R⁷ -(CH₂)_n-[NRR-(CH₂)_n]_m=NRRR ist, worin jedes n unabhängig eine ganze Zahl von 2 bis 6 ist, m eine ganze Zahl von 0 bis 6 ist und jedes R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom und (C₁-C₆)Alkylgruppe.
Benzophenoxazinverbindung nach Anspruch 16, die membrangängig ist.
Benzophenoxazinverbindung nach Anspruch 16, worin R⁷ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -(CH₂)_n-NRRR, -(CH₂)_n-NRR-(CH₂)_n-NRRR und -(CH₂)_n-NRR-(CH₂)_n-NRR-(CH₂)_n-NRRR, worin jedes n unabhängig eine ganze Zahl von 2 bis 3 und jedes R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom und (C₁-C₃)Alkylgruppe.
Benzophenoxazinverbindung nach Anspruch 16, die die Strukturformel:
aufweist, einschließlich jeglicher zugehöriger Gegenionen.
Benzophenoxazinverbindung nach Anspruch 16, die die Strukturformel:
aufweist, einschließlich jeglicher zugehöriger Gegenionen.
Benzophenoxazinverbindung nach Anspruch 16, die die Strukturformel:
aufweist, einschließlich jeglicher zugehöriger Gegenionen.
Verfahren zum Anfärben einer Nukleinsäure, umfassend den Schritt eines In-Kontakt-Bringens der Nukleinsäure mit einer Benzophenoxazinverbindung gemäß Anspruch 1.
Verfahren nach Anspruch 22, worin die Nukleinsäure zumindest teilweise doppelsträngig ist.
Verfahren nach Anspruch 22, worin die Nukleinsäure eine DNA ist.
Verfahren nach Anspruch 22, worin die Nukleinsäure eine RNA ist.
Verfahren nach Anspruch 22, worin die Nukleinsäure in einer biologischen Struktur eingeschlossen ist.
Verfahren nach Anspruch 26, worin die biologische Struktur eine Zellmembran ist.
Verfahren nach Anspruch 22, worin die Nukleinsäure in eine Matrix eingebettet ist.
Verfahren nach Anspruch 28, worin die Matrix ein elektrophoretisches Gel ist.
Verfahren zum Anfärben einer Nukleinsäure in einer biologischen Probe, umfassend ein In-Kontakt-Bringen der biologischen Probe mit einer Benzophenoxazinverbindung gemäß Anspruch 1.
Verfahren nach Anspruch 30, worin die biologische Probe eine ganze Zelle umfasst und die Benzophenoxazinverbindung membrangängig ist.
Verfahren nach Anspruch 31, worin die Zelle eine Säugerzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 30, worin die Nukleinsäure eine DNA ist.
Verfahren nach Anspruch 31, worin die Zelle eine eukaryotische Zelle ist.