DE10130172A1

DE10130172A1 - Fluoreszenz-Farbstoffderivate

Info

Publication number: DE10130172A1
Application number: DE2001130172
Authority: DE
Inventors: Eloisa Lopez-Calle; Joachim Fries
Original assignee: Evotec OAI AG
Current assignee: Evotec OAI AG
Priority date: 2001-06-22
Filing date: 2001-06-22
Publication date: 2003-01-09

Abstract

Die Erfindung betrifft Oxonol-Derivate der allgemeinen Formel DOLLAR F1 und ihre Anwendung als Fluoreszenzfarbstoffe zur Detektion des Membranpotentials von Zellen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Fluoreszenz-Farbstoffderivate, insbesondere Oxonol-Farbstoffderivate und ihre Anwendung als Fluoreszenzfarbstoffe zur Detektion des Membranpotentials von Zellen.

Seit den späten 60er Jahren sind Fluoreszenzfarbstoffe, die in der Lage sind, das Membranpotential in lebenden Zellen zu detektieren, in der Wissenschaft etabliert. Das Membranpotential in Zellen wird durch die Ungleichverteilung von Ionen, insbesondere Kalium-, Natrium- und Chloridionen sowie intrazellulären Bestandteilen, insbesondere Proteinen, hervorgerufen und kann durch Ionenkanäle und Ionenpumpen moduliert werden.

Zur Untersuchung des Membranpotentials, das u. a. bei Aktionspotentialen während der Reizweiterleitung im Nervengewebe oder im Herzen sowie bei der Proliferation von Zellen eine wesentliche Rolle spielt, wurden verschiedene Farbstoffklassen entwickelt, die sich in langsame oder schnelle Farbstoffe unterteilen lassen (Molecular Probes, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Chapter 25, sixth edition, 1996). Schnelle Farbstoffe zeichnen sich durch eine Veränderung ihrer Elektronenverteilung nach Veränderung des Membranpotentials aus, was schließlich zu veränderten Fluoreszenzeigenschaften führt. Die Änderungen in der Fluoreszenz sind allerdings gering. Bei langsamen Farbstoffen führt eine Veränderung des Membranpotentials zu einer Umverteilung zwischen dem Inneren und dem Äußeren der Zelle. Innerhalb der Zelle binden diese Farbstoffe an intrazelluläre Bestandteile, wodurch die Fluoreszenzausbeute erhöht wird (Plásek, J. und Sigler K.

1996. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 33, 101-124). Die Veränderung der Fluoreszenz (und somit das Signal in Abhängigkeit einer bestimmten Veränderung des Membranpotentials) ist deutlich größer verglichen mit den Änderungen der schnellen Farbstoffe. Aus diesem Grund eignen sich langsame Farbstoffe besser für Testverfahren, insbesondere Hochdurchsatz-Screening-Verfahren, in denen eine hohe Dynamik des Meßsignals gewährleistet sein muß. Diese Hochdurchsatz- Screening-Verfahren können beispielsweise zur Identifizierung von Substanzen, die beispielsweise Ionenkanäle modulieren, verwendet werden. Solche Verfahren sind insbesondere für die Suche nach biologisch aktiven oder pharmazeutisch wirksamen Verbindungen relevant.

Unter den langsamen Farbstoffen zeichnen sich die bis- Oxonolderivate durch ihre vergleichbar hohe Änderung ihrer Fluoreszenz aufgrund der membranpotentialabhängigen Transmembranverteilung aus (Molecular Probes, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Chapter 25, sixth edition, 1996). Bei einer Depolarisierung der Zelle dringen sie durch die Membran in die Zellen ein und binden dort an intrazelluläre Bestandteile, was zu einer erhöhten Fluoreszenzausbeute, einer erhöhten Fluoreszenzlebensdauer sowie einer leichten Rotverschiebung der Emissionswellenlänge führt (Epps, D. E., Wolfe, M. L. and Groppi, V. 1994. Chemistry and Physics of Lipids, 137-150). Unter den bis-Oxonolen wiederum ist DiBAC(4)3 am weitesten verbreitet, da es neben hohen Änderungen der Fluoreszenz bei einer Verschiebung des Membranpotentials, verglichen mit strukturell verwandten Molekülen wie DiBAC(4)5, weniger toxisch für lebende Zellen ist. Zudem interagiert DiBAC(4)3 aufgrund seiner negativen Ladung, im Gegensatz zu positiv geladenen Farbstoffen wie beispielsweise den Rhodaminen, weniger stark mit intrazellulären Organellen wie den Mitochondrien und ist deswegen besonders für eine Detektion des Membranpotentials an der Plasmamembran geeignet.

Die Fluoreszenzquantenausbeute der bekannten bis-Oxonole ist stark temperaturabhängig und steigt bei niedrigeren Temperaturen. Da in zellulären Hochdurchsatz-Screening-Verfahren eine physiologische Temperatur von 37°C angestrebt wird, ist es wichtig, bis-Oxonolderivate zur Hand zu haben, deren Fluoreszenzquantenausbeute auch bei physiologischen Temperaturen hoch genug ist, um eine optimale Dynamik bei der Messung zu gewährleisten. Es zeigt sich weiterhin, daß das Signal-Rausch Verhältnis welches durch Einsatz der bekannten bis-Oxonole bei Membranpotentialänderungen, beispielsweise nach Blockade eines Ionenkanals, zu erzielen ist, in einer Größenordnung liegt, die nach gängigen Kriterien (Z'-Faktor) nur begrenzt für Hochdurchsatz-Screening-Verfahren geeignet ist.

Durch den kostengünstigen Zugang zu rotemittierenden Laser- Lichtquellen sowie der geringen Hintergrundfluoreszenz von biologischem Material bei roter Anregung gegenüber energiereicheren Anregungswellenlängen kommt dem Einsatz von rotanregbaren Fluoreszenzfarbstoffen steigende Bedeutung zu. Darüber hinaus ist beim Hochdurchsatz-Screening die Fluoreszenz der im Assay zugesetzten Komponenten bei möglichst langwelliger Anregung weniger problematisch. Besonders der rote Spektralbereich (z. B. mit HeNe-Lasern der Wellenlänge 633 nm oder Diodenlasern) ist hierbei interessant, da die herkömmlichen Analysegeräte mit diesen Anregungswellenlängen ausgerüstet sind bzw. sehr kostengünstig ausgerüstet werden können.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, langsame fluoreszierende Farbstoffderivate zur Verfügung zu stellen, die eine hohe Dynamik der Messungen, insbesondere bei physiologischen Temperaturen und eine geringe Temperaturabhängigkeit der Fluoreszenzquantenausbeute, aufweisen. Die Verteilung der Fluoreszenz-Farbstoffderivate in Bezug auf die Membran soll membranpotentialsensitiv sein. Das Signal-Rausch-Verhältnis soll verbessert werden und die Anregungs- und Emissionswellenlängen sollen besser an bestehende Auslesesysteme angepasst sein als die der bekannten Farbstoffe und im Zusammenhang mit kostengünstigen Analysesystemen verwendet werden können.

Diese Aufgabe wird mit den Oxonol-Derivaten gelöst, die in Anspruch 1 definiert sind.

Gegenstand der Anmeldung sind Oxonol-Derivate der allgemeinen Formel I

worin:

a) die Reste R1, R2, R3 und R4 voneinander unabhängig Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Alkenyl, Alkenoxy, Aryl, Aryldiazo, Alkylaryl, Arylalkoxyl, Alkoxy, Alkoxycarbonyl, Hydroxy, Halogen, Cyan, Carbonyl, Acyl, Acyloxy oder Carboxylamid bedeuten;
b) n und m gleich oder verschieden sind und Null oder ganze Zahlen größer als Null bedeuten;
c) R1 mit R2 und/oder R3 mit R4 und/oder R1 mit R3 und/oder R2 mit R4 eine oder mehrere gesättigte oder ungesättigte Brücke (Brücken) bilden kann (können), die ggf. substituiert ist (sind);
d) die Reste R5, R6, R7, R8 und R9 voneinander unabhängig Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Alkenyl, Alkenoxy, Aryl, Aryldiazo, Alkylaryl, Arylalkoxyl, Alkoxy, Alkoxycarbonyl, Hydroxy, Halogen, Cyan, Carbonyl, Acyl, Acyloxy oder Carboxylamid bedeuten;
e) R5 mit R6 und/oder R5 mit R7 und/oder R5 mit R8 und/oder R5 mit R9 und/oder R6 mit R7 und/oder R6 mit R8 und/oder R6 mit R9 und/oder R7 mit R8 und/oder R7 mit R9 und/oder R8 mit R9 eine oder mehrere gesättigte oder ungesättigte Brücke (Brücken) bilden kann (können), die ggf. substituiert ist (sind).

Die Reste Alkyl, Cycloalkyl, Alkenyl, Alkenoxy, Alkylaryl, Alkoxy und Alkoxycarbonyl weisen in der Regel 1 bis 20, bevorzugt 1 bis 14 Kohlenstoffatome auf. Die Reste können verzweigt oder unverzweigt sein.

In bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Oxonol- Derivate handelt es sich bei den Resten R1, R2, R3 und R4 um Alkylreste mit 4 bis 5 Kohlenstoffatomen.

In den erfindungsgemäßen Oxonol-Derivaten ist n vorzugsweise im Bereich von 0 bis 6, besonders bevorzugt 0 bis 4. Unabhängig von n ist in den erfindungsgemäßen Oxonol-Derivaten m vorzugsweise im Bereich von 0 bis 6, besonders bevorzugt 1 bis 4. Die Werte von n und m können gleich oder verschieden sein.

Die jeweiligen Reste R5/R6 von aufeinanderfolgenden, mit n gekennzeichneten, repetitierenden Einheiten können gleich oder verschieden sein. Analoges gilt für die Reste R7/R8 der mit m gekennzeichneten Einheiten.

In bevorzugten Oxonolderivaten bildet (bilden) R1 mit und/oder R3 mit R4 und/oder R1 mit R3 und/oder R2 mit R4 eine oder mehrere gesättigte oder ungesättigte Brücke (Brücken). Die Brücke (Brücken) ist (sind) ggf. substituiert. Die Brücken umfassen vorzugsweise Alkinketten mit 4 bis 15, vorzugsweise 8 bis 12 Kohlenstoffatomen. Besonders bevorzugt umfassen die Alkinketten mindestens 2, vorzugsweise mindestens 3 Dreifachbindungen. Besonders bevorzugt bildet R1 mit R3 eine Brücke mit 8 bis 12 Kohlenstoffatomen und vorzugsweise 3 Dreifachbindungen.

In weiteren bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Brücke von R1 mit R2 und/oder R3 mit R4 und/oder R1 mit R3 und/oder R2 mit R4 Cykloakyl-Systeme, insbesondere Cyclopentyl- und Cyclohexylringe, besonders bevorzugt Cyclohexylringe. Die Cycloalkyl-Systeme sind ggf. substituiert. Besonders bevorzugt bildet R1 mit R3 eine Brücke, die 2 Cyclohexylringe umfasst.

Bei anderen bevorzugten Oxonolderivaten bildet (bilden) R5 mit R6 und/oder R5 mit R7 und/oder R5 mit R8 und/oder R5 mit R9 und/oder R6 mit R7 und/oder R6 mit R8 und/oder R6 mit R9 und/oder R7 mit R8 und/oder R7 mit R9 und/oder R8 mit R9 eine oder mehrere gesättigte oder ungesättigte Brücke (Brücken), die ggf. substituiert ist (sind).

In verschiedenen weiteren Ausführungsformen können R1 mit R5 und/oder R1 mit R6 und/oder R1 mit R7 und/oder R1 mit R8 und/oder R1 mit R9 und/oder R2 mit R5 und/oder R2 mit R6 und/oder R2 mit R7 und/oder R2 mit R8 und/oder R2 mit R9 und/oder R3 mit R5 und/oder R3 mit R6 und/oder R3 mit R7 und/oder R3 mit R8 und/oder R3 mit R9 und/oder R4 mit R5 und/oder R4 mit R6 und/oder R4 mit R7 und/oder R4 mit R8 und/oder R4 mit R9 eine oder mehrere gesättigte oder ungesättigte Brücke (Brücken) bilden.

Beispiele für die Substituenten umfassen Alkyl, Cycloalkyl, Alkenyl, Alkenoxy, Aryl, Aryldiazo, Alkylaryl, Arylalkoxyl, Alkoxy, Alkoxycarbonyl, Hydroxy, Halogen, Cyan, Carbonyl, Acyl, Acyloxy oder Carboxylamid.

Besonders bevorzugte Ausführungsformen sind in den Formeln II bis VI dargestellt.

Die Synthese der erfindungsgemäßen Oxonol-Derivate erfolgt unter Verwendung üblicher Synthesemethoden.

Eine Erhöhung der Quantenausbeute, insbesondere bei Temperaturen im Bereich von 20 bis 37°C, wurde bei den erfindungsgemäßen Oxonol-Derivaten durch eine Rigidisierung der Molekülstruktur erreicht. Es ist auf diesem Wege möglich, die Rate der strahlungslosen Relaxation aus dem 1. angeregten Zustand in den Grundzustand zugunsten der Relaxation unter Emission eines Photons (Fluoreszenz) zurückzudrängen. Die Erhöhung der Quantenausbeute ermöglicht es, Untersuchungen mit sehr guten Ergebnissen bei physiologischen Temperaturen durchzuführen.

Eine weitere Maßnahme zu Erhöhung des Signal-zu- Hintergrundverhältnisses bei Untersuchungen unter Beteiligung von Ionenkanälen besteht darin, weitere Farbstoffe als Fluoreszenzlöscher zu nutzen. Diese Farbstoffe weisen eine den erfindungsgemäßen anionischen Oxonolen entgegengesetzte Ladung auf und zeigen dementsprechend ein entgegengesetztes Diffusionsverhalten im Falle der Depolarisation der Zellmembran. Aufgrund der Änderung der Ladungsverteilung durchdringen diese Löscherfarbstoffe die Zellmembran nach außen, während die Oxolon-Moleküle elektroosmotisch in die Zelle eindringen. Dies bewirkt, dass vor der Depolarisation möglicherweise in der Zelle vorhandener Oxolon-Farbstoff gelöscht wird, während nach der Depolarisation der noch im Überstand befindliche Oxolon- Farbstoff gelöscht wird. In Summe kommt es zu einer Erhöhung des Signal-zu-Hintergrundverhältnisses. Diese kationischen Farbstoffe besitzen keine Fluoreszenzeigenschaften und sind von ihrer Absorptionswellenlänge so abgestimmt, dass sie die Fluoreszenz des entsprechenden eingesetzten Oxolon-Derivates über einen Energietransfer aufnehmen können und membrangängig sind.

Die erfindungsgemäßen Oxonol-Derivate eignen sich hervorragend für die Untersuchung von Membranpotentialen von Zellen. Sie eignen sich somit sehr gut für chemische und biotechnologische Untersuchungen zur Suche nach biologisch aktiven Stoffen und/oder pharmazeutischen Wirkstoffen, die an der Regulierung des Membranpotentials, insbesondere durch Ionenkanäle, beteiligt sind. Auf diesem Weg ist es möglich, nach Wirkstoffen zu suchen, die in Bezug auf Krankheiten wirken, die in Zusammenhang mit Ionenkanälen stehen.

Die genannten Untersuchungen lassen sich bevorzugt in Kombination mit Laserlichtanalytik und Fluoreszenzdetektion durchführen. Die dabei angewandten Verfahren schließen praktisch alle Verfahren ein, mit denen die Oxonol-Derivate gemessen werden können. Zu diesen Verfahren zählen die Spektrometrie, Mehrphotonenanregung, insbesondere Zwei-Photonen-Anregung, Laser- Scanning-Anregung, Nahfeldspektroskopie, Photonenverteilungsanalysen, insbesondere FIDA- und 2-D-FIDA, Fluoreszenz- Lebensdauer-Analyse und Fluoreszenz-Polarisationsanalyse. Die Messungen werden vorzugsweise unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops oder anderen konfokalen Optiken durchgeführt. Die Auswertung der Daten erfolgt schließlich vorzugsweise durch Autokorrelationsanalyse und/oder Kreuzkorrelationsanalyse.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Kit zur Untersuchung von Membranpotentialen, insbesondere der Untersuchung von Ionenkanälen. Dieses Kit umfasst, neben üblichen Bestandteilen, ein Oxonol-Derivat nach der allgemeinen Formel I. Übliche Bestandteile sind beispielsweise Analysegefäße und Instruktionen zur Durchführung der Untersuchungen. In bevorzugten Ausführungsformen enthält das Kit ein Oxonol-Derivat der Formeln II-VI.

Claims

1. Oxonol-Derivate der allgemeinen Formel I

worin:

a) die Reste R1, R2, R3 und R4 voneinander unabhängig Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Alkenyl, Alkenoxy, Aryl, Aryldiazo, Alkylaryl, Arylalkoxyl, Alkoxy, Alkoxycarbonyl, Hydroxy, Halogen, Cyan, Carbonyl, Acyl, Acyloxy oder Carboxylamid bedeuten;

b) n und m gleich oder verschieden sind und Null oder ganze Zahlen größer als Null bedeuten;

c) R1 mit R2 und/oder R3 mit R4 und/oder R1 mit R3 und/oder R2 mit R4 eine oder mehrere gesättigte oder ungesättigte Brücke (Brücken) bilden kann (können), die ggf. substituiert ist (sind);

d) die Reste R5, R6, R7, R8 und R9 voneinander unabhängig Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Alkenyl, Alkenoxy, Aryl, Aryldiazo, Alkylaryl, Arylalkoxyl, Alkoxy, Alkoxycarbonyl, Hydroxy, Halogen, Cyan, Carbonyl, Acyl, Acyloxy oder Carboxylamid bedeuten;

e) R5 mit R6 und/oder R5 mit R7 und/oder R5 mit R8 und/oder R5 mit R9 und/oder R6 mit R7 und/oder R6 mit R8 und/oder R6 mit R9 und/oder R7 mit R8 und/oder R7 mit R9 und/oder R8 mit R9 eine oder mehrere gesättigte oder ungesättigte Brücke (Brücken) bilden kann (können), die ggf. substituiert ist (sind).