DE4407142A1 - Heterogener Immunassay und dessen Verwendung zur Bestimmung von Proteinen - Google Patents

Description

Zur selektiven und sensitiven Bestimmung von Proteinen werden verschiedene Immuntechniken verwendet. Besonders hervorzuhe­ ben sind die RIAs (Radioimmunassays) oder ELISAs (Enzyme Lin­ ked Immunoassays). Sie werden zur Analyse biotechnologischer Proben standardmäßig verwendet. Auch andere Assays (siehe beispielsweise Freitag, R.; Scheper, T.; Spreinat, A., Antra­ nikian, G. (1991b) On-line monitoring of pullulanase produc­ tion during continuous culture of Clostridium thermosulfuro­ genes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 35, 471-476, Freitag, R.; Scheper, T.; Schügerl, K. (1991) Development of a turbidime­ tric immunoassay for on-line monitoring of proteins in culti­ vation processes, Enzyme Microb. Technol., 13, 969-975, Mat­ tiasson, B.; Hakanson H. (1992) Immunochemically based assays for process control, in: Modern Biochemical Engineering (ed.: A. Fiechter) Advances in Biochem. Eng./Biotechnol., Vol, 46, Springer Verlag Berlin, pp.: 81-101, Middendorf, C.; Schulze, B.; Freitag, R.; Scheper, T.; Howaldt, M.; Hoffmann, H. (1993) On-line immunoanalysis for bioprocess control, J. Bio­ technol., 3, 395-403, Miyabayashi, A.; Mattiasson, B. (1990) A dual streaming potential device used as an affinity sensor for monitoring hybridoma cell cultivation, Anal. Biochem., 184, 165-171 und Stöcklein, w.; Jäger, V.; Schmid, R.D. (1992) Monitoring of mouse immunoglobulin G by flow injection analytical affinity chromatography, Anal. Chim. Acta, 245 (1), 1-6) können verwendet werden.

Bei einem herkömmlichen ELISA sind verschiedene Schritte nötig:

Probenverdünnung auf den optimalen Arbeitsbereich, Immunreak­ tion, Waschschritt und Detektionsschritt.

Zwar lassen sich einzelne Schritte automatisieren, doch bleibt der Assay zeitaufwendig, personalintensiv und fehler­ anfällig. Dies gilt für alle anderen Immunassays auch. Ein anderer Nachteil dieser Assays in Bezug auf die Bioprozeßana­ lytik ist, daß diese Verfahren alle zur Detektion geringster Proteinmengen ausgelegt sind. Da in Bioprozeßproben höhere Proteinkonzentrationen vorliegen (oberhalb von 100 mg/l), müssen deshalb die Proben extrem verdünnt werden, was zusätz­ lich zeit-, personal- und fehlerintensiv ist.

Neben diesen angeführten Punkten fehlen für die Bioprozeßana­ lytik Verfahren, die schnell, das heißt innerhalb weniger Mi­ nuten, eine große Anzahl von Proben vermessen und schnell auf andere Fragestellungen umgerüstet werden können, die vollau­ tomatisch arbeiten und die auch on line am Bioprozeß arbeiten können.

Neben den oben angeführten reinen Off-line-Verfahren, wurden auch einige automatisierte Verfahren etabliert, beispielswei­ se seien folgende erwähnt:

• - Verfahren über die Detektion von Immunreaktionen mit Hilfe der Strömungspotentialänderung (Miyabayashia und Mattiasson, 1990), Verfahren zur Trübungsmessung bei der Bildung von Im­ munkomplexen (turbidimetrischer Assay, TIA) (Freitag et al; 1991a, Middendorf, et al., 1993),
• - Verfahren zur Automatisierung heterogener, kompetitiver As­ says mit anschließender UV-Detektion (Freitag et al., 1991b; Stöcklein et al., 1992) und
• - Verfahren mit einer automatisierten Durchfluß-ELISA-Technik (Mattiasson und Hakanson, 1992).

Diese Verfahren sind bis auf das TIA-System recht aufwendig, nur mit großem Aufwand zu automatisieren. Das TIA-System ist das einzige, das schon an realen, industriellen Prozesse ein­ gesetzt wurde und auch validiert wurde. Ein Nachteil ist der hohe Verbrauch an Antikörpern, da für jeden Assay neue Anti­ körperlösung aufgegeben werden muß.

Allen Systemen ist hierbei ein hoher Analytverbrauch gemein­ sam, allerdings sind die Standzeiten (bis auf TIA) und der Automatisierungsgrad (bis auf TIA) gering. Die Systeme sind kontaminationsanfällig und eine Abtrennung störender Substan­ zen ist gar nicht oder nur über Verdünnungsschritte möglich. Ohne Verdünnungsschritte kommt nur der TIA aus.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, einen Immunassay zu entwickeln, welcher folgende Mindestan­ forderungen erfüllt:

• - allgemeingültiges Analysensystem unter Ausnutzung von Affi­ nitätsreaktionen;
• - Immobilisierung der Affinitätskomponente zur wiederholbaren Benutzung, z. B. von mindestens 100 Assays;
• - keine Probenverdünnung notwendig;
• - einfache Entfernung von Störsubstanzen;
• - vollständig automatisierbar;
• - einfach anzupassender Meßbereich;
• - keine Gefahr von Kontaminationen;
• - variable Detektionsmöglichkeiten;
• - jederzeit kalibrierbar;
• - Einsatz zur On-line- und Off-line-Analyse (mindestens 10 Proben pro Stunde);
• - einfach umzurüsten;
• - Möglichkeit der Analyse verschiedener IgGs mit einer Immun­ kartusche (mit immobilisiertem Protein A oder G).

Erfindungsgemäß basiert die Meßanlage (siehe Fig. 1) auf einem neuen heterogenen Immunassay (heterogener Elutionsas­ say) nach den Prinzipien der Fließinjektionsanalyse. Hierbei wird ein Partner einer starken Bindungsreaktion auf einen festen Träger irreversibel immobilisiert, wobei dieser vor­ zugsweise in eine Durchflußkartusche implementiert wird. Nach der Immobilisierung des Bindungspartner auf einem geeigneten Trägermaterial wird die nicht markierte Probe in einen stän­ dig durch das System fließenden Pufferstrom aufgegeben und durch das Immobilisat geführt (siehe Fig. 2). Der Bindungs­ partner bindet seinen spezifischen Gegenpart aus der Probe, während alle anderen Stoffe durch den Trägerstrom ausgetragen werden. Es kommt zu einer Trennung zwischen Analyten (Gegen­ part) und Störsubstanzen. Anschließend werden die gebunden Stoffe durch einen Wechsel von dem Trägerpuffer auf einen Elutionspuffer ausgetragen. Wasch- und Konditionierungs­ schritte können je nach Analysenproblem implementiert werden. Die ausgetragenen Stoffe werden dann anschließend mit einen Detektor zum Beispiel auf ihre Konzentration oder biologische Eigenschaften analysiert. Je nach Detektorsignal und Aus­ wertemethode kann die Konzentration des Analyten in der Probe zum Beispiel proportional zum Peakintegral sein. Vor einer erneuten Probenaufgaben kann die Kartusche gereinigt, kondi­ tioniert oder äquilibriert werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein heteroge­ ner Immunassay, welcher dadurch gekennzeichnet ist, daß die­ ser einen Partner mit einer starken Bindungsreaktion enthält, wobei der Partner auf einen festen Träger irreversibel immo­ bilisiert ist und der Träger einem fließenden Pufferstrom in der Weise aussetzbar ist, daß der zu bestimmende und gebun­ dene nicht markierte Gegenpart nach gegebenenfalls erforder­ lichem Waschen mit einem geeigneten Puffer eluiert und mit einem Detektor bestimmt wird, dessen Verwendung zur Bestim­ mung von Proteinen und ein Verfahren zur Bestimmung von Pro­ teinen unter Verwendung des erfindungsgemäßen Immunassays.

Das beschriebene System und Analysenprinzip eignet sich, um Proben in wenigen Minuten zu analysieren. Bestimmt werden können Proteine (dabei werden die entsprechenden Antikörper in der Kartusche immobilisiert), Immunglobuline (durch immo­ bilisiertes Proteine A/G) oder andere Systeme mit hohen Bin­ dungskonstanten wie Avidin/Biotin oder Lectine/glykosilierte Makromoleküle.

Der erfindungsgemäße Immunassay weist folgende Vorteile auf:

• - Das Gerät arbeitet selbständig und ist voll automatisier­ bar;
• - es können sowohl on line als auch off line Proben analy­ siert werden;
• - es sind nur kurze Analysenzeiten, z. B. nur wenige Minuten, nötig;
• - durch Kopplung an Fluoreszenzfarbstoffe oder andere Marker vor oder nach der Kartusche kann die Empfindlichkeit des Im­ munassays gesteigert werden;
• - eine Analyse in zellhaltigen Proben ist möglich;
• - durch eine Optimierung der Elutionsbedingungen kann er­ reicht werden, daß sowohl in der Kartusche als auch im Fließ­ system kein Bewuchs mit Mikroorganismen stattfindet und keine weiteren Reinigungszyklen notwendig sind;
• - der Meßbereich des Immunassays kann durch Variation des In­ jektionsvolumen (kummulativer Effekt) angepaßt werden, hier­ durch können auch sehr kleine Konzentrationen gemessen wer­ den;
• - bei Verwendung der Meßanlage können Proben direkt (sprich unverdünnt, nicht konditioniert) eingesetzt werden. Ist hier­ bei die Konzentration des zu analysierenden Stoffes sehr groß, z. B. mehrere Milligramm pro Milliliter, so kann durch eine erhöhte Dispersion der Meßbereich nach oben angepaßt werden;
• - die Anlage läßt sich an einen Autosampler koppeln, dadurch ist eine einfach Analyse von mehreren hundert Proben hinter­ einander möglich;
• - die Detektion kann auf verschiedenste Arten erfolgen, be­ sonders geeignet sind die Bestimmung der Fluoreszenz der Pro­ teine oder der UV-Absorption;
• - da es zu einer Trennung zwischen Störsubstanzen und Analy­ ten kommt, können auch zuverlässige Analysen durchgeführt werden, wenn sich die Zusammensetzung der Störsubstanzen än­ dert, eine Referenzmessungen ist hierbei nicht notwendig;
• - mit Hilfe dieser neuartigen Kombination ist eine kontamina­ tionsfreie, störungsfreie, automatisierte Analytik möglich, da verschiedene Spülschritte eingeschaltet werden können. Das System kann für beliebige Systeme wiederholt verwendet wer­ den.

Das nachfolgende Beispiel soll die Erfindung näher erläutern:

Beispiel

Für folgende Analyte wurden das System ausgetestet: Anti­ thrombin III, rt-PA und Antikörper des IgG-Typs. Die ersten beiden Analyte wurden mit poly- und monoclonalen Antikörpern ausgetestet, die IgG-Antikörper mit Protein A und G.

Für den rt-PA Assay wurden Sepharose 4B, Eupergit, Eurocell ONB und VA-Epoxy Biosynth als Träger getestet. Kaliumphos­ phatpuffer (0,1 M, pH = 7,4) wurde als Träger-, Wasch/Konditionierungs- und Äquilibrierungspuffer verwendet. Eine Elution war im basischen mit 0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH = 12,3) und im sauren mit Glycinpuffer (0,1 M, pH 2,0) möglich.

Jeweils 20-100 µl Probe wurden injiziert (Dauer 10 sec); dann wurde 170 sec gewaschen und 150 sec eluiert und detektiert. Nach einer Äquilibrierungszeit von 30 sec konnte eine neue Injektion erfolgen.

Die Detektion erfolgte in einem Durchflußspektrophotometer (Anregung bei 273 nm, Emissionsmessung bei 340 nm).

Abbildung I

Zeigt die Kalibriergerade für rt-PA mit verschie­ denen Immobilisaten.

Abbildung II

Zeigt den Einfluß des pH-Werts der Elutionslö­ sung auf die Proteinfluoreszenz.

Abbildung III

Zeigt die Langzeitstabilität für die ATIII-Mes­ sung: Die Korrelationskoeffizienten sind sehr hoch, auch wenn die Steigung der Geraden abnimmt. Eine einfache Zweipunktei­ chung pro Meßtag reicht aus, um diesen Effekt zu berücksich­ tigen.

Abbildung IV

Zeigt die Übereinstimmung der Meßergebnisse von zwei verschiedenen Meßtagen nach vorheriger Zweipunktkali­ brierung.

Abbildung V

Zeigt die Übereinstimmung der Meßergebnisse her­ kömmlichen ELISA und den Meßwerten des automatisierten hetero­ genen Assays.

Abbildung VI

Zeigt, daß Störungen durch Fremdproteine durch den Waschschritt ausgeschlossen werden können.

Abbildung I

Abbildung II

Abbildung III

Abbildung IV

Abbildung V

Abbildung VI

Claims (6)

1. Heterogener Immunassay, welcher dadurch gekennzeichnet ist, daß dieser einen Partner mit einer starken Bindungsreak­ tion enthält, wobei der Partner auf einen festen Träger irre­ versibel immobilisiert ist und der Träger einem fließenden Pufferstrom in der Weise aussetzbar ist, daß der zu bestim­ mende und gebundene nicht markierte Gegenpart nach gegebenen­ falls erforderlichem Waschen mit einem geeigneten Puffer elu­ iert und mit einem Detektor bestimmt wird.

2. Heterogener Immunassay gemäß Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der Bindungspartner in einer Kartusche enthal­ ten ist.

3. Heterogener Immunassay gemäß den Ansprüchen 1 und 2, da­ durch gekennzeichnet, daß der Gegenpart ein Antikörper oder ein Protein ist.

4. Heterogener Immunassay gemäß den Ansprüchen 1 und 2, da­ durch gekennzeichnet, daß der Bindungspartner ein Protein, ein Immunoglobulin oder ein System mit hohen Bindungskonstan­ ten wie Avidin/Biotin oder ein Lectin/glycosiliertes Makromo­ lekül ist.

5. Heterogener Immunassay gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, da­ durch gekennzeichnet, daß zur Steigerung der Empfindlichkeit als Gegenpart ein markierter Gegenpart eingesetzt wird.

6. Verfahren zur Bestimmung eines Gegenparts, dadurch ge­ kennzeichnet, daß der Gegenpart an einen immobilisierten Partner auf einem festen Träger gebunden wird, dieser nach gegebenenfalls erforderlichem Waschen eluiert und anschlie­ ßend mit einem Detektor bestimmt wird.