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CN104360074A - 血浆脂蛋白磷脂酶a2的时间分辨荧光免疫检测方法及试剂盒 - Google Patents

血浆脂蛋白磷脂酶a2的时间分辨荧光免疫检测方法及试剂盒 Download PDF

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CN104360074A
CN104360074A CN201410609662.9A CN201410609662A CN104360074A CN 104360074 A CN104360074 A CN 104360074A CN 201410609662 A CN201410609662 A CN 201410609662A CN 104360074 A CN104360074 A CN 104360074A
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Abstract

本发明提供一种血浆脂蛋白磷脂酶A2的时间分辨荧光免疫检测方法，采用双抗体夹心法结合时间分辨荧光免疫检测方法测量血浆脂蛋白磷脂酶Lp-PLA2的含量，包括如下步骤：在包被有抗Lp-PLA2单克隆抗体A的微孔板上，加入Lp-PLA2标准品或离心后获得的血清样本到各自的微孔中，振荡反应后用浓缩洗液洗涤，然后加入生物素标记的抗Lp-PLA2单克隆抗体B，振荡反应后浓缩洗液洗涤；加入镧系元素标记的链霉亲和素，然后振荡反应后用浓缩洗液洗涤；加入增强液振荡后，在紫外光的激发下发射荧光，用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，对照标准曲线即可确定待测样品中Lp-PLA2含量。本发明可定量测定样本中Lp-PLA2的含量，具有灵敏度高、分析范围宽、稳定性好、检测快速且易于自动化的特点。

Description

血浆脂蛋白磷脂酶A2的时间分辨荧光免疫检测方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体地涉及血浆脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA2)的时间分辨荧光免疫检测方法。
背景技术
Lp-PLA2属于磷脂酶A2超家族，主要由炎症细胞(如巨噬细胞、淋巴细胞等)分泌。Lp-PLA2是由441个氨基酸组成的蛋白质，相对分子量约为45400，与磷脂酶A2家族其余成员不同的是，Lp-PLA2不需要钙离子维持其催化活性。Lp-PLA2具有降解血小板活化因子的活性，因此也被称为血小板活化因子乙酰水解酶，它在动脉粥样硬化部位大量存在，并可被炎症介质调节，具有促动脉粥样硬化的作用。Lp-PLA2是一种新的炎症反应标志物，是反映血管炎症的特异性标记物。
目前用于检测Lp-PLA2的试剂主要为酶联免疫吸附法、化学发光免疫分析法、胶乳增强比浊法与胶体金法原理产品。但酶联免疫法存在检测时间长，重复性差，自动化程度不高等缺陷。化学发光免疫分析法存在稳定性与重复性差，检测成本高等缺陷。胶乳增强比浊法具有线性范围窄，灵敏度差等缺陷。而胶体金法也存在灵敏度弱的缺陷。
时间分辨荧光免疫分析法是以镧系元素标记抗原或抗体，并与时间分辨测定技术相结合而建立起来的一种新型非放射性微量分析技术，具有灵敏度高、发光稳定、荧光寿命长、自然荧光干扰少、标准曲线范围宽等特点。目前已在临床检测中广泛应用。目前还没有报道专门用于检测Lp-PLA2的时间分辨荧光分析的免疫检测方法，也没有相应的试剂盒提供。
发明内容
发明目的：为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种建立一种基于时间分辨荧光分析的血浆脂蛋白磷脂酶A2的时间分辨荧光免疫检测方法，为Lp-PLA2的临床分析提供一种灵敏度高、分析范围宽、稳定性好、检测快速且易于自动化的检测技术。
技术方案：为实现上述技术目的，本发明建立了一种血浆脂蛋白磷脂酶A2的时间分辨荧光免疫检测方法，其特征在于，采用双抗体夹心法结合时间分辨荧光免疫检测方法测量血浆脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA2)的含量，包括如下步骤：在包被有抗Lp-PLA2单克隆抗体A的微孔板上，加入Lp-PLA2标准品或离心后获得的血清样本到各自的微孔中，振荡反应后用洗涤液洗涤，然后加入生物素标记的抗Lp-PLA2单克隆抗体B，振荡反应后洗涤液洗涤；加入镧系元素标记的链霉亲和素，然后振荡反应后用洗涤液洗涤；加入增强液振荡后，在紫外光的激发下发射荧光，用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，对照标准曲线即可确定待测样品中Lp-PLA2含量。
其中，所述的镧系元素选自Eu3+、Tb3+、Sm3+、Nd3+和Dy3+中的任意一种。优选地，所述的镧系元素为Eu3+。
具体地，包被于微孔板上的Lp-PLA2单克隆抗体A与用生物素标记的抗Lp-PLA2单克隆抗体B分别识别Lp-PLA2的不同表位且互不影响，其中，Lp-PLA2单克隆抗体A、B通过单克隆杂交瘤细胞技术制备或者通过噬菌体抗体技术筛选获得。
所述的洗涤液为含0.05wt％TWEEN-20的0.01M磷酸盐缓冲液(1×PBST)。
所述的增强液包括如下组分：1L pH 3.2的邻苯二甲酸氢钾缓冲液含15μmolβ-萘甲酰三氯丙酮、50μmol三正辛基氧化膦TOPO和1ML曲拉通X-100。
本发明的方法同样可以用固相竞争法或固相抗原竞争法来代替。具体地，当使用固相抗体竞争法时，将Lp-PLA2和Eu3+标记抗原与固相抗体发生竞争结合，温育洗涤后在固相中加入荧光增强液，测定荧光强度，所测得的荧光强度与Lp-PLA2含量呈负相关。
当使用固相抗原竞争法时，将Lp-PLA2和固相抗原竞争性结合定量的Eu3+标记抗体，温育洗涤后在固相中加入荧光增强液，测定荧光强度，所测得的荧光强度与Lp-PLA2含量呈负相关。
本发明同时提出了一种血浆脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA2)的时间分辨荧光免疫检测试剂盒，其包括如下部分：包被有抗Lp-PLA2单克隆抗体A的微孔板、浓缩洗液、增强液、镧系元素标记的链霉亲和素和生物素标记的抗Lp-PLA2单克隆抗体B，其中，所述的包被有抗Lp-PLA2单克隆抗体A的微孔板和用生物素标记的Lp-PLA2单克隆抗体B通过如下方法制备：
(1)Lp-PLA2单克隆抗体A和Lp-PLA2单克隆抗体B的制备和纯化：
以增量培养法扩增杂交瘤细胞，所得细胞液经辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，得到单克隆抗体。
(2)微孔板的包被：
将纯化后Lp-PLA2单克隆抗体A用包被液稀释至1-10ng/ml，，96微孔板各孔加100ul，4℃放置过夜；弃去包被液，用含0.05wt％TWEEN-20的0.01M磷酸盐缓冲液冲洗两次，加150ul封闭液封闭，4℃放置过夜。弃去封闭液，真空抽干，板条密封后放置-20℃冷冻保存；
(3)Lp-PLA2单克隆抗体B的生物素标记：将纯化后Lp-PLA2单克隆抗体B使用磷酸盐缓冲液稀释至1-10ng/ml，然后将Lp-PLA2单克隆抗体B与NHS活化的生物素按1:1混合，避光反应30min，用50kDa的超滤膜柱去除可能未参与标记的NSH-Biotin，得到生物素标记的Lp-PLA2单克隆抗体B。
其中，包被于微孔板上的Lp-PLA2单克隆抗体A与用生物素标记的抗Lp-PLA2单克隆抗体B分别识别Lp-PLA2的不同表位且互不影响，其中，Lp-PLA2单克隆抗体A、B通过单克隆杂交瘤细胞技术制备或者通过噬菌体抗体技术筛选获得。
具体地，所述的包被液为pH9.6、50mmol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液，所述的封闭液为含0.05wt％TWEEN-20、3g/L BSA的磷酸盐缓冲液。
所述的浓缩洗液为含1wt％TWEEN-20的0.2M磷酸盐缓冲液(20×PBST)。
所述的镧系元素选自Eu3+、Tb3+、Sm3+、Nd3+和Dy3+中的任意一种。优选地，所述的镧系元素为Eu3+。
所述的增强液包括如下组分：1L pH 3.2的邻苯二甲酸氢钾缓冲液含15μmolβ-萘甲酰三氯丙酮、50μmol三正辛基氧化膦TOPO和1ML曲拉通X-100。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)Lp-PLA2的临床cut-off值为175ng/ml，包含在本试剂盒的检测范围内，可满足临床需要；
(2)分析范围广，检测范围50-3000ng/ml；
(3)测量快速，易于自动化；
(4)使用镧系元素进行标记，无放射性污染
(5)抗干扰能力强,根据镧系元素螯合物的发光特点，可有效地排除非特异荧光的干扰。
附图说明
图1：Lp-PLA2的时间分辨荧光分析检测标准曲线图；
图2：Lp-PLA2时间分辨荧光分析方法检测反应示意图。其中，A:Lp-PLA2单克隆抗体；B:Lp-PLA2蛋白；C:生物素标记的抗Lp-PLA2单克隆抗体；D:Eu3+-链霉亲和素复合物。
具体实施方式
实施例是对本发明所提供的Lp-PLA2时间分辨荧光分析检测方法的进一步说明，但发明的实施不限于此，任何功能相同的替换均属于本发明的保护范围。
实施例1Lp-PLA2时间分辨荧光分析检测试剂盒的制备。
(1)实验溶液的配制：
浓缩洗液：含1wt％TWEEN-20的0.2M磷酸盐缓冲液(20×PBST)；
洗涤液：含0.05wt％TWEEN-20的0.01M磷酸盐缓冲液；该洗涤液由浓缩洗液稀释而得；
增强液：1L pH3.2邻苯二甲酸氢钾缓冲液含15μmolβ-萘甲酰三氯丙酮(β-NTA)、50μmol三正辛基氧化膦TOPO和1mL曲拉通X-100(Triton X100)。
(2)Lp-PLA2单克隆抗体A和Lp-PLA2单克隆抗体B的制备的制备与纯化：
Lp-PLA2单克隆抗体A和Lp-PLA2单克隆抗体B为分别识别Lp-PLA2的不同表位且互不影响，其中，Lp-PLA2单克隆抗体A和B均可以通过单克隆杂交瘤细胞技术制备或者通过噬菌体抗体技术筛选获得。本实施例中直接采用是市售的、识别Lp-PLA2不同表位的两种单抗。其中，Lp-PLA2单克隆抗体A选择抗人脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA 2)单克隆抗体(货号CLM0019006，购买自深圳市常量医学工程有限公司)，Lp-PLA2单克隆抗体B选择抗人脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA 2)单克隆抗体(货号CLM0019005，购买自深圳市常量医学工程有限公司)，两种单克隆抗体分别识别Lp-PLA2的不同表位。当然，两种单克隆抗体可以交换使用，只要保证两种单克隆抗体识别Lp-PLA2的不同表位即可。
分别以增量培养法扩增杂交瘤细胞，所得细胞液经辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，得到单克隆抗体。
(3)包被板的制备：
将纯化后Lp-PLA2单克隆抗体A用50mmol/L Na2CO3-NaHCO3PH9.6缓冲液稀释至8ng/ml，96微孔板各孔加100ul,4℃放置过夜。弃去包被液，用洗涤液(含0.05％TWEEN-20的磷酸盐缓冲液(1×PBST))冲洗两次，加150ul含3g/LBSA的上述缓冲液封闭，4℃放置过夜。弃去封闭液，真空抽干，板条密封后放置-20℃冷冻保存。
(5)抗体生物素标记：
Lp-PLA2单克隆抗体B的生物素标记：将纯化后Lp-PLA2单克隆抗体B使用磷酸盐缓冲液稀释至8ng/ml，然后将Lp-PLA2单克隆抗体B与NHS活化的生物素按1:1混合，避光反应30min，用50kDa的超滤膜柱去除可能未参与标记的NSH-Biotin。
(5)测试：
A：样品的准备：采集病人血液样本，1500r/min离心5分钟
B：检测：
双抗体夹心法：取包被抗体的微孔板板条，加入100μl阳性质控品Lp-PLA2标准品或离心后获得的血清样本到各自的微孔中，阴性对照孔用PBS代替。37℃振荡1h后，洗涤液洗3次。每孔加入100ul生物素标记的Lp-PLA2单克隆抗体，37℃振荡1h后，涤液洗3次。每孔加入100ul Eu3+-链霉亲和素复合物，37℃振荡1h后，洗涤液洗3次。每孔加入200ul增强液，37℃振荡15min,与时间分辨分析仪读数。从标准曲线计算样品中的Lp-PLA2含量，见图1。
在测定前需要注意：使用之前将所有的试剂回升至室温(18-30℃)；使用之后立即将所有的试剂放回2-8℃；如果样品量大建议使用多通道移液器；在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖子盖住微孔。
可能的替换方案：
固相抗体竞争法：将Lp-PLA2和Eu3+标记抗原与固相抗体发生竞争结合，温育洗涤后在固相中加入荧光增强液，测定荧光强度，所测得的荧光强度与Lp-PLA2含量呈负相关。
固相抗原竞争法：将Lp-PLA2和固相抗原竞争性结合定量的Eu3+标记抗体，温育洗涤后在固相中加入荧光增强液，测定荧光强度，所测得的荧光强度与Lp-PLA2含量呈负相关。
实施例2Lp-PLA2时间分辨荧光分析检测试剂盒的精确度、准确度和稳定性测试。
1.试剂盒的准确度、精确度分析实验：
对207ng/ml Lp-PLA2的标准溶液(pH7.4、0.05M的磷酸盐缓冲液)进行20次检测。207ng/ml是Lp-PLA2预测心脑血管疾病高发病风险的临界值，方法的高精确度有利于对发病风险的准确判断。20次检测结果的平均值为204.64ng/ml，标准差为8.26，变异率为4.03％。结果显示，检测结果与实际浓度较为接近，准确度较高，同时变异率<5％，具有较好的精确度。
2.试剂盒稳定性试验：
试剂盒保存条件为2-8℃，保存6个月后，测定试剂盒的各项指标，发现均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存的条件下放置6天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻5天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2-8℃至少可以保存6个月以上。
实施例3Lp-PLA2时间分辨荧光分析检测试剂盒与ELISA检测试剂盒的比较。
选择高、中、低三个浓度的Lp-PLA2标准品溶液，以本试剂盒和ELISA检测试剂盒同时进行分析，每个浓度检测5次，将所得结果进行比较，确定两种方法的一致性。高浓度选择1000ng/ml，中浓度选择300ng/ml，低浓度选择80ng/ml。得到的检测结果如下表：
均值1(高) S1 均值2(中) S2 均值3(低) S3
ELISA 995.56 45.67 304.34 14.76 78.35 3.4
TRIFA 1002.45 48.65 297.36 13.67 78.12 3.87
对两组数据做配对样本的t检验，得P>0.05，两者的差别无统计学意义，说明两种方法无论在高、中或者低浓度Lp-PLA2的检验中，均有较好的一致性。

Claims (10)

1.一种血浆脂蛋白磷脂酶A2的时间分辨荧光免疫检测方法，其特征在于，采用双抗体夹心法结合时间分辨荧光免疫检测方法测量血浆脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA2)的含量，包括如下步骤：在包被有抗Lp-PLA2单克隆抗体A的微孔板上，加入Lp-PLA2标准品或离心后获得的血清样本到各自的微孔中，振荡反应后用洗涤液洗涤，然后加入生物素标记的抗Lp-PLA2单克隆抗体B，振荡反应后洗涤液洗涤；加入镧系元素标记的链霉亲和素，然后振荡反应后用洗涤液洗涤；加入增强液振荡后，在紫外光的激发下发射荧光，用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，对照标准曲线即可确定待测样品中Lp-PLA2含量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的镧系元素选自Eu3+、Tb3+、Sm3+、Nd3+和Dy3+中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，包被于微孔板上的Lp-PLA2单克隆抗体A与用生物素标记的抗Lp-PLA2单克隆抗体B分别识别Lp-PLA2的不同表位且互不影响，其中，Lp-PLA2单克隆抗体A、B通过单克隆杂交瘤细胞技术制备或者通过噬菌体抗体技术筛选获得。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的洗涤液为含0.05wt％TWEEN-20的0.01M磷酸盐缓冲液。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的增强液包括如下组分：1L pH 3.2的邻苯二甲酸氢钾缓冲液含15μmolβ-萘甲酰三氯丙酮、50μmol三正辛基氧化膦TOPO和1ML曲拉通X-100。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的双抗体夹心法可以用固相抗体竞争法或者固相抗原竞争法替代：
其中，当用固相抗体竞争法替换时，将Lp-PLA2和Eu3+标记抗原与固相抗体发生竞争结合，温育洗涤后在固相中加入荧光增强液，测定荧光强度，所测得的荧光强度与Lp-PLA2含量呈负相关。
当用固相抗原竞争法替换时，将Lp-PLA2和固相抗原竞争性结合定量的Eu3+标记抗体，温育洗涤后在固相中加入荧光增强液，测定荧光强度，所测得的荧光强度与Lp-PLA2含量呈负相关。
7.一种血浆脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA2)的时间分辨荧光免疫检测试剂盒，其特征在于，包括如下部分：包被有抗Lp-PLA2单克隆抗体A的微孔板、浓缩洗液、增强液、镧系元素标记的链霉亲和素和生物素标记的抗Lp-PLA2单克隆抗体B，其中，包被于微孔板上的Lp-PLA2单克隆抗体A与用生物素标记的抗Lp-PLA2单克隆抗体B分别识别Lp-PLA2的不同表位且互不影响，所述的包被有抗Lp-PLA2单克隆抗体A的微孔板和用生物素标记的Lp-PLA2单克隆抗体B通过如下方法制备：
(1)Lp-PLA2单克隆抗体A和Lp-PLA2单克隆抗体B的制备和纯化：
以增量培养法扩增杂交瘤细胞，所得细胞液经辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，分别得到Lp-PLA2单克隆抗体A和Lp-PLA2单克隆抗体B；
(2)微孔板的包被：
将纯化后Lp-PLA2单克隆抗体A用包被液稀释至1～10ng/ml，96微孔板各孔加100ul，4℃放置过夜；弃去包被液，用含0.05wt％TWEEN-20的磷酸盐缓冲液冲洗两次，加150ul封闭液封闭，4℃放置过夜。弃去封闭液，真空抽干，板条密封后放置-20℃冷冻保存；
(3)Lp-PLA2单克隆抗体B的生物素标记：将纯化后Lp-PLA2单克隆抗体B使用磷酸盐缓冲液稀释至1～10ng/ml，然后将Lp-PLA2单克隆抗体B与NHS活化的生物素按1:1混合，避光反应30min，用50kDa的超滤膜柱去除可能未参与标记的NSH-Biotin，得到生物素标记的Lp-PLA2单克隆抗体B。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的包被液为pH9.6、50mmol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液，所述的封闭液为含0.05wt％TWEEN-20、3g/LBSA的磷酸盐缓冲液。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的浓缩洗液为含1wt％TWEEN-20的0.2M磷酸盐缓冲液。
10.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的增强液包括如下组分：1L pH 3.2的邻苯二甲酸氢钾缓冲液含15μmolβ-萘甲酰三氯丙酮、50μmol三正辛基氧化膦TOPO和1ML曲拉通X-100。
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