DE4342625A1

DE4342625A1 - Pulverförmige Meliazeen-Extrakte

Info

Publication number: DE4342625A1
Application number: DE19934342625
Authority: DE
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
Current assignee: REMBOLD, HEINZ, PROF. DR., 81379 MUENCHEN, DE
Priority date: 1993-12-14
Filing date: 1993-12-14
Publication date: 1995-06-22

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue lagerfähige pulverförmige Extrakte aus Meliazeen mit Ausnahme des Neembaumes, deren Her stellung und Verwendung.

Ein bedeutendes Gebiet der organischen Chemie ist die Insektizid forschung. Fortschreitende Resistenzbildungen, wachsende ökolo gische und wirtschaftliche Anforderungen erfordern immer lei stungsfähigere Produkte. In dieser Hinsicht gewinnen zunehmend Wirkstoffe an Bedeutung, die über natürliche Rohstoffquellen erhältlich sind. Eine unter diesem Aspekt viel untersuchte Pflan zenfamilie ist die der Meliazeen. Zahlreiche Pflanzen haben im Verlauf ihrer Evolution ein breites Spektrum von Abwehrstoffen entwickelt. Hierzu zählen verschiedene Sekundärmetabolite, die fraßhemmend, toxisch oder wachstumshemmend auf Insekten wirken. Ein besonders reichhaltiges Arsenal findet sich in tropischen und subtropischen Pflanzen. Chemisch lassen sich diese Naturstoffe in verschiedene Stoffklassen einordnen, u. a. in die große Klasse der Terpenoide. Dieses enorme Potential biologisch aktiver Natur stoffe sollte die Entwicklung neuer Insektizide und Akarizide, die durch biologische Aktivität Schadarthropodenangreifen und human- und ökotoxologisch weniger bedenklich sind als die gegen wärtig eingesetzten Insektizide und Akarizide erlauben.

Eine unter diesem Aspekt viel untersuchte Pflanzenfamilie ist die der Meliazeen. Ihr prominentester Vertreter ist der Neembaum (Azadirachta indica A. Juss). Es ist seit langem bekannt, daß aus den Samenkernen des Neembaumes gewonnene Extrakte zur Herstellung stark insektizid wirkender Formulierungen verwendet werden können ("Natural Pesticides from the Neem Tree and Other Tropical Plants" (1984), ed. H. Schmutterer, K.R.S. Ascher GTZ, Eschborn, S. 435 (M. Dreyer), S. 263 (B.N. Islam) und S. 565 (S. Ahmed et al.)). Die insektizide Wirkung dieser Formulierungen beruht im wesentlichen auf den in den stark ölhaltigen Samenkernen des Neembaumes enthaltenen Azadirachtinen, wobei das sogenannte Aza dirachtin A, welches die Hauptwirkstoffkomponente der Neem-Ex trakte darstellt, bis zu 85% der insektiziden Aktivität umfaßt. Zur Herstellung von Neem-Formulierungen wurden die unterschied lichsten Verfahren beschrieben. Ein Verfahren zur Herstellung Azadirachtin-haltiger Extrakte aus Neem wird in der deutschen Patentanmeldung DE 41 09 473 beschrieben. Gemäß DE 41 09 473 werden zur Herstellung eines Azadirachtin-haltigen Trocken extrakts die Bestandteile, insbesondere die Samenkerne des Neem baumes, zunächst mit Wasser extrahiert und anschließend mit einem mit Wasser nicht vollständig mischbaren organischen Lösungsmittel eine Azadirachtin-reiche Phase isoliert, aus der nach dem Aufkon zentrieren mittels eines flüssigen Kohlenwasserstoffs ein Azadi rachtin-reicher Niederschlag erhalten wird. Das Verfahren basiert auf der Anwendung von Wasser als primärem Extraktionsmittel. Dadurch können aus den Früchten des Neembaumes Azadirachtin-hal tige Insektizide gewonnen werden, die gemäß DE 41 09 473 weitge hend frei von Öl sind. Dieses Verfahren, das auf die Anreicherung und Isolierung von Azadirachtinen ausgerichtet ist, ist hinsicht lich seiner Anwendbarkeit innerhalb der Meliazeen-Familie stark begrenzt und richtet sich nicht auf die Anreicherung und Isolie rung der Wirkstoffe aus anderen Meliazeen als dem stark Azadi rachtin- und ölhaltigen Neembaum. Der Neembaum nimmt innerhalb der Meliazeen-Familie eine Sonderstellung ein. Die Sonderstellung des Neembaumes ist einerseits im hohen Ölgehalt seiner Früchte und andererseits in der Hauptwirkstoffkomponente, dem Azadirach tin, insbesondere dem Azadirachtin A, zu sehen. Alle übrigen stark insektiziden Meliazeen, wie etwa die Meliazee volkensii, weisen einen sehr niedrigen Ölgehalt auf und ihre insektizide Aktivität beruht nicht auf Azadirachtinen (Rembold und Mwangi, Proc. 2nd Symp. vector Arthropods, Vero Beach, S. 3-8 (1989)). Dies konnte u. a. anhand von Melia volkensii-Rohextrakten, die hinsichtlich ihrer insektiziden Wirkung getestet wurden, gezeigt werden (R.W. Mwangi und H. Rembold, Entomol. Ex. Appl. 46 : 103-108, (1988); O. Nasseh, H. Wilps, H. Rembold und S. Krall, J. Appl. Ent. 116 (1993), 1-11; H. Wilps, O. Nasseh, H. Rembold und S. Krall, J. Appl. Ent. 116 (1993), 12-19). Diese Extrakte zeig ten eine beträchtliche fraß- und wachstumshemmende bzw. toxische Wirkung auf Insekten, welche keinesfalls auf die in dem Neembaum als Hauptwirkstoff vertretenen Azadirachtine zurückzuführen ist.

Obwohl die für diese biologische Aktivität verantwortlichen Wirk stoffe bisher nicht erkannt sind, konnte jedoch durch eingehende HPLC-Untersuchungen ausgeschlossen werden, daß es sich hierbei um Azadirachtine handelt. Bisher konnten aus Melia volkensii zwar mehrere Limonoide, wie etwa Volkensin, Ohchinin-3-acetat, 1-Ti gloyl-trichilinin und 1-Cinnamoyl-trichilinin isoliert werden, jedoch konnte diesen bisher keine eindeutige biologische Aktivi tät zugeordnet werden.

Bei den verwendeten Meliazeen-Extrakten handelte es sich aus schließlich um Rohextrakte oder deren Formulierungen (O. Nasseh, H. Wilps, H. Rembold und S. Krall, J. Appl. Ent. 116 (1993), 1-11; H. Wilps, O. Nasseh, H. Rembold und S. Krall, J. Appl. Ent. 116 (1993), 12-19). Die Herstellung eines leicht dosierbaren, angereicherten Wirkstoffextrakts war bisher nicht möglich. Die Reinigung und Anreicherung des Rohextrakts konnte bisher nur durch aufwendige, wirtschaftlich nicht vertretbare Verfahren erfolgen. Der Methanol/Wasser-Rohextrakt wurde im Vakuum einge dampft und der Rückstand mit kaltem Methanol extrahiert. Anschließend wurde erneut eingeengt und mit Aceton digeriert. Nach dem Entfernen des Acetons wurde die acetonlösliche Fraktion in Ethylacetat aufgenommen, auf Kieselgel aufgezogen und fraktio niert eluiert. Die Rohextrakte sind hygroskopisch und werden des halb bereits durch die Luftfeuchtigkeit in ein klebriges, klumpi ges Material übergeführt. Dieses ist schwer dosierbar und weist bei der Herstellung von Anwendungsformulierungen schlechte Lös lichkeitseigenschaften auf.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung war folglich die Bereit stellung eines lagerfähigen und leicht handzuhabenden angerei cherten Wirkstoffextrakts aus Meliazeen mit Ausnahme des Neembau mes. Die Herstellung dieses Extrakts sollte unter weitgehender Vermeidung der im Stand der Technik bekannten Nachteile erfolgen.

Diese Aufgabe wurde erfindungsgemäß durch die Bereitstellung eines pulverförmigen Extrakts aus den Früchten oder/und Samen einer Meliazee mit Ausnahme des Neembaumes gelöst.

Der erfindungsgemäße Extrakt ist dadurch erhältlich, daß man durch Behandlung zerkleinerter Früchte oder/und Samen der Melia zee mit Wasser und einem polaren organischen Lösungsmittel einen Rohextrakt erzeugt, die organolöslichen Bestandteile des Rohex trakts in ein polares Lösungsmittel, das weniger als 5 Gew.-% Wasser enthält, überführt, und durch Anwendung eines weniger polaren Lösungsmittels pulverförmiges Material präzipitiert.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Her stellung eines pulverförmigen Extrakts aus den Früchten oder/und Samen einer Meliazee mit Ausnahme des Neembaumes, wobei man

(a) die zerkleinerten Meliazeen-Früchte oder/und Samen zur Erzeugung eines Rohextrakts in Form einer Lösung oder Suspension in Gegenwart von Wasser aufschließt und extrahiert,
(b) die organolöslichen Bestandteile des Rohextrakts in einem polaren, organischen Lösungsmittel oder einem Gemisch von polaren organischen Lösungsmitteln, das weniger als 5 Gew.-% Wasser ent hält, löst und
(c) durch Anwendung eines weiteren, weniger polaren Lösungsmit tels ein pulverförmiges Material präzipitiert.

Darüber hinaus betrifft die Erfindung die Verwendung eines erfin dungsgemäßen pulverförmigen Extrakts zur Bekämpfung von Schadar thropoden.

Die erfindungsgemäßen pulverförmigen Extrakte enthalten im all gemeinen ein Gemisch von durch organische Lösungsmittel aus Me liazeen mit Ausnahme des Neembaumes extrahierbaren Stoffen, ins besondere sogenannte Limonoide. Die Limonoide umfassen im all gemeinen mindestens 10 Gew.-%, vorzugsweise mindestens 25 Gew.-% des pulverförmigen Extrakts. Im Gegensatz zu Neemextrakten ent halten die erfindungsgemäßen Extrakte nur geringe bzw. nicht nachweisbare Azadirachtinmengen.

Die erfindungsgemäßen Meliazeen-Extrakte enthalten als wesentli chen aktiven Bestandteil vorzugsweise mindestens ein Limonoid, ausgewählt aus der Gruppe Ochinin-3-acetat, 1-Tigloyltrichilinin und 1-Cinnamoyl-trichilinin. Daneben können weitere Limonoide, wie etwa das Salannin, Meliacin oder Volkensin vorliegen. Diese spielen jedoch hinsichtlich der biologischen Gesamtaktivität der erfindungsgemäßen Extrakte nur eine untergeordnete Rolle.

Zur Herstellung eines erfindungsgemäßen pulverförmigen Extrakts aus den Früchten oder/und Samen einer Meliazee mit Ausnahme des Neembaumes werden im ersten Schritt die zerkleinerten Meliazeen- Früchte oder/und Samen zur Erzeugung eines Rohextrakts in Form einer Lösung oder Suspension in Gegenwart von Wasser aufgeschlos sen. Hierzu werden zunächst die Meliazeen-Früchte oder/und Samen in getrockneter oder feuchter Form zerkleinert. Dies kann bei spielsweise durch das von R.W. Mwangi und H. Rembold in Entomol. Ex. Appl. 46, S. 103-108 (1988) beschriebenen Verfahren erfolgen. D.h. die Früchte bzw. Samen werden bei Temperaturen im Bereich von 40°C getrocknet und anschließend mittels einer Hammermühle pulverisiert. Die Früchte können jedoch auch im rohen, ungetrock neten Zustand zerkleinert werden.

Das zerkleinerte Material wird anschließend zur Erzeugung eines Rohextrakts mit Wasser und einem polaren, vorzugsweise mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel behandelt und extrahiert. Als organische Lösungsmittel werden vorzugsweise Alkohole, ins besondere Ethanol, Methanol oder Gemische davon verwendet. Wasser dient in diesem Zusammenhang vorrangig als Quellmittel, durch welches die in Stärke eingeschlossenen Wirkstoffe des zerkleiner ten Materials freigesetzt und für das verwendete polare organi sche Lösungsmittel zugänglich werden, wobei der Quell- und Ex traktionsvorgang im allgemeinen bei einer Temperatur zwischen 20 und 60°C stattfinden. Das Wasser wird vorteilhafterweise in einer Menge von 25 bis 200 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des zerkleinerten Materials, angewendet. Prinzipiell kann die Extrak tion auch über ein zweiphasiges System erfolgen, beispielsweise durch Gegenstromextraktion mit Ethylacetat.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird das zerkleinerte Melia zeen-Material, welches vorzugsweise aus Melia volkensii stammt, im Wasser aufgenommen und suspendiert. Nachdem man das Material bei 20 bis 60°C für mehrere Stunden quellen ließ, wird unter Zusatz eines polaren, mit Wasser vollständig mischbaren Lösungs mittels, insbesondere Methanol oder Ethanol, extrahiert. Die Extraktion kann direkt nach Zusatz des organischen Lösungsmittels in die wäßrige Suspension erfolgen. Gleichfalls ist es möglich, die wäßrige Suspension zumindest teilweise von Wasser zu befrei en, wie etwa durch eine Filtration und anschließend mit dem orga nischen Lösungsmittel zu extrahieren. Diese Extraktion der Melia zee-Inhaltsstoffe mit dem polaren organischen Lösungsmittel kann mehrfach wiederholt werden, um eine möglichst umfassende Isolie rung der Wirkstoffe zu erreichen.

Gemäß einer weiteren Verfahrensvariante wird das zerkleinerte Material direkt mit einem einphasigen Gemisch des polaren organi schen Lösungsmittels mit 10 bis 25 Gew.-% Wasser behandelt. Das Lösungsmittelgemisch dient hierbei als Quell- und Extraktions mittel, d. h. nach dem Quellen wird mit dem vorliegenden Lösungs mittelgemisch extrahiert. Auch diese Extraktion kann mehrfach wiederholt werden.

Die Extraktion des zerkleinerten Rohstoffmaterials wird auf all gemein übliche, im Stand der Technik bekannte Art und Weise durchgeführt. Hierzu wird beispielsweise das Mahlgut mit dem Ex traktions- bzw. Extraktions/Quellmittel gründlich durchmischt und anschließend der Extrakt abgetrennt und gesammelt. Die Abtrennung des Extrakts kann durch Dekantieren, Zentrifugieren oder Filtrie ren erfolgen.

Im nächsten Verfahrensschritt werden die organolöslischen Be standteile des wasserhaltigen Rohextrakts in einem polaren orga nischen Lösungsmittel oder einem Gemisch von polaren organischen Lösungsmitteln, das weniger als 5 Gew.-% Wasser enthält, aufge nommen und gelöst. Vor der Durchführung dieser Verfahrensstufe (b) wird der wasserhaltige Rohextrakt im allgemeinen aufkonzen triert, d. h. zumindest teilweise vom Lösungsmittel befreit und gegebenenfalls getrocknet. Anschließend wird mit einem polaren organischen Lösungsmittel, das weniger als 5 Gew.-% Wasser ent hält, extrahiert. Für diesen Extraktionsschritt geeignete orga nische Lösungsmittel umfassen beispielsweise Ketone, wie 2-Buta non, Cyclohexanon oder Aceton, Ester, wie etwa Essigsäureethyl ester, Nitrile, wie etwa Acetonitril oder Alkohole, wie etwa Ethanol oder Methanol. Zur Extraktion der organolöslichen Be standteile aus dem Rohextrakt eignen sich dem Fachmann bekannte Extraktionsverfahren.

Im allgemeinen ist es bevorzugt, den Rohextrakt aufzukonzentrie ren oder zu trocknen und erst darauffolgend eine Extraktion mit dem organischen Lösungsmittel vorzunehmen. Die Entfernung des Lösungsmittels aus dem Rohextrakt kann destillativ, insbesondere durch eine Vakuumdestillation erfolgen. Anschließend kann gegebe nenfalls lyophilisiert werden. Sowohl bei der Destillation wie auch der Trocknung ist darauf zu achten, daß Temperaturen von 80°C nicht überschritten werden, da diese zur Zersetzung der erwünschten Inhaltsstoffe führen können. Anschließend werden aus dem, wie vorstehend beschrieben, behandelten Rohextrakt die orga nolöslichen Bestandteile isoliert. Hierzu wird das Rohmaterial in dem polaren organischen Lösungsmittel aufgenommen und extrahiert. Das Verhältnis von Rohextrakt zu Extraktionsmittel liegt vorteil hafterweise im Bereich von 1 : 1 bis 1 : 10, wobei größere Mengen Extraktionsmittel nicht kritisch sind. Die Extraktion kann mehr fach wiederholt werden.

Nach der Abtrennung der wirkstoffenthaltenden organischen Phase durch Filtration, Sedimentation, Zentrifugation oder Phasentren nung kann erfindungsgemäß im Verfahrensschritt (c) direkt das pulverförmige Präzipitat gewonnen werden. Bei der Verwendung von mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln, wie etwa Ethylacetat, zur Erzeugung des Wirkstoffextrakts wird vor der Präzipitation vorzugsweise mit Wasser gewaschen. Hierzu wird der die organolös lichen Bestandteile enthaltende Extrakt mit dem 1- bis 5-fachen Volumen Wasser gründlich vermischt und anschließend von der wäß rigen Phase abgetrennt. Dieser Waschschritt hat einen weiteren Reinigungseffekt und kann zur Abtrennung von möglicherweise in den vorhergehenden Verfahrensschritten mitgeschleppten uner wünschten Bestandteilen des Meliazeen-Rohmaterials dienen. Hier bei handelt es sich beispielsweise um wasserlösliche Polypeptide, Polysaccharide, Proteine, Aminosäuren, Zucker und Salze, die u. a. zur Verklebung des Präzipitats führen können.

Der angereicherte Extrakt wird in Verfahrensschritt (c) mit einem mit dem in Verfahrensschritt (b) verwendeten Lösungsmittel misch baren, weniger polaren organischen Lösungsmittel zur Präzipita tion eines pulverförmigen Produkts behandelt. Bevorzugte Präzipi tationsmittel sind Alkane mit 5 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Gemische davon oder Ether mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen. Beson ders bevorzugte Präzipitationsmittel sind Petrolether und Diethy lether. In einem bevorzugten erfindungsgemäßen Präzipitationsver fahren wird das Präzipitationsmittel, d. h. das weniger polare Lösungsmittel, in einem 1,5- bis 4-fachen Überschuß, bezogen auf das Volumen der vorliegenden Extraktmenge, eingesetzt. Die Präzi pitation kann durch einfaches Mischen des angereicherten Extrakts mit dem Präzipitationsmittel erfolgen. Dies wird herkömmlicher weise bei Raumtemperatur durchgeführt. Zur Vervollständigung der Präzipitation kann gegebenenfalls abgekühlt werden. Nach der Präzipitation des pulverförmigen Produkts wird dieses von der Lösung abgetrennt. Die Trennung von Präzipitat und flüssiger Phase kann durch verschiedene physikalische Maßnahmen, wie Fil tration, Sedimentation, Zentrifugation erfolgen. Das erhaltene pulverförmige Material kann direkt weiterverwendet oder für spä tere Anwendungen gelagert werden. Vorteilhafterweise wird das Material vor der Lagerung getrocknet. Dies kann auf herkömmliche Art und Weise geschehen, wie z. B. im Vakuum bei Temperaturen unterhalb 80°C, vorzugsweise bei Temperaturen im Bereich von 40 bis 60°C.

In einer besonders bevorzugten Verfahrensvariante wird der in Verfahrensstufe (a) erhaltene getrocknete Rohextrakt mit der 1- bis 5-fachen Menge Ethylacetat extrahiert und die Ethylacetatpha se mehrfach mit Wasser gewaschen. Anschließend wird aus der Et hylacetatphase durch Zugabe eines 3- bis 4-fachen Überschusses Petrolether das erwünschte pulverförmige Material präzipitiert.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird es ermöglicht, aus den Früchten einer Meliazee mit Ausnahme des Neembaumes, insbesondere aus den Früchten von Melia volkensii ein pulverförmiges, benetz bares Produkt zu erhalten, das die erwünschten Inhaltsstoffe, insbesondere Limonoide in angereicherter Form (Anreicherungsfak tor 10 bis 20%) enthält. Im Gegensatz zu den bisher im Stand der Technik beschriebenen Melia volkensii-Extrakten sind die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten pulverförmigen Extrakte weitgehend oder vollständig frei von wasserlöslichen, undefinier ten Verunreinigungen aus dem eingesetzten Rohmaterial. Ein weite rer großer Vorteil ist darin zu sehen, daß das Pulver in ein Trockenpulver übergeführt und ohne Verlust der angereicherten biologischen Aktivität gelagert werden kann. Selbst bei längeren Lagerzeiten bleibt die pulverförmige Struktur erhalten. Ein wei terer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist darin zu se hen, daß die verwendeten Lösungsmittel zurückgewonnen und in die einzelnen Verfahrensschritte zurückgeführt werden können.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Ver wendung eines erfindungsgemäßen pulverförmigen Extrakts zur Be kämpfung von Schadarthropoden. Dies kann durch die Anwendung des pulverförmigen Extrakts in Form einer verdünnten oder flüssigen Formulierung geschehen. Vorzugsweise enthält eine derartige An wendungsformulierung als aktiven Bestandteil 10 bis 500 ppm des pulverförmigen Extrakts. Die Herstellung der Anwendungsformulie rung kann nach den im Stand der Technik üblichen Methoden erfol gen. D.h. die Anwendungsformulierungen können herkömmliche Ver dünnungsmittel, wie etwa feste Stäube oder flüssige Verdünnungs mittel, wie etwa Wasser, organische Lösungsmittel, oder Öl und weitere übliche Hilfs- und Zusatzstoffe, wie beispielsweise De tergenzien, Antioxidantien, UV-Filter und Synergisten enthalten. Bei der Anwendung im Feld wird vorzugsweise eine derartige Menge des pulverförmigen Extrakts bzw. der Anwendungsformulierung aus gebracht, daß pro Hektar zu behandelnder Fläche 10 bis 100 g des pulverförmigen Extrakts vorliegen. Bereits dieser niedrige Kon zentrationsbereich ermöglicht eine effektive Bekämpfung von
Schadarthropoden, welche insbesondere auf die Störung ihres Wachstums und ihrer Physiologie zurückzuführen ist.

Der erfindungsgemäße Extrakt kann auch in Kombination mit anderen Insektiziden eingesetzt werden, um das Wirkungsspektrum zu erhö hen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Ver fahren zur Bestimmung der biologischen Aktivität eines Extraktes aus Meliazeen mit Ausnahme des Neembaumes, worin der Gehalt von Ohchinin-3-acetat oder/und 1-Tigloyl-trichilinin oder/und 1-Cin namoyl-trichilinin im Extrakt bestimmt und als Leitgröße der biologischen Aktivität verwendet wird. Die Bestimmung dieser Wirkstoffkomponenten kann durch ein beliebiges chromatographi sches Verfahren, insbesondere durch HPLC erfolgen. Erfindungs gemäß wurde gefunden, daß ein kausaler Zusammenhang zwischen dem Gehalt dieser Einzelkomponenten und der biologischen Aktivität der genannten Extrakte, insbesondere des pulverförmigen Melia volkensii-Extrakts besteht. Dies war das Ergebnis aus Vergleichs experimenten, worin Schadinsekten (Schistocerca gregaria und Aedes-Larven) mit einem erfindungsgemäßen Extrakt bzw. mit den oben genannten einzelnen Limonoiden behandelt wurden. Aus diesen Vergleichsexperimenten ging eindeutig hervor, daß die einzelnen Wirkstoffe ebenfalls eine insektizide, d. h. larvizide, wachstums hemmende oder fraßhemmende Wirkung besitzen. Auf dieser Basis wird es ermöglicht, durch einfache analytische Maßnahmen, wie HPLC, nach der Bestimmung wenigstens einer dieser drei Komponen ten die notwendigen Anwendungskonzentrationen eines Extrakts zu bestimmen. Damit kann die chargenabhängige Wirkstoffkonzentration der Anwendungsextrakte berücksichtigt und eine gezielte, dosierte Ausbringung auf dem Feld erreicht werden.

Die nachfolgend aufgeführten Beispiele sollen die vorliegende Erfindung näher erläutern.

Beispiel 1 Herstellung eines Melia volkensii-Rohextrakts

10 kg Melia volkensii-Früchte wurden bei 40°C im Ofen getrocknet und in einer Hammermühle zu einem Pulver mit einer Korngröße von 1 mm vermahlen. Man erhielt 3,7 kg Mahlgut, welches in einem etwa gleichen Volumen (w/v) eines Gemisches aus Methanol/Wasser (80/20, v/v) aufgenommen und suspendiert wurde. Nach dem Quellen wurde die flüssige Phase durch Filtration abgetrennt und der Rückstand weitere 2 × mit dem gleichen Volumen eines 80 : 20 (v/v) Methanol-Wasser-Gemisches extrahiert. Die gesammelten Lösungs mittelfraktionen wurden im Vakuum vom Lösungsmittel befreit und unter Vakuum bei 40°C getrocknet. Man erhielt 200 g harzigen Melia volkensii-Rohextrakt.

Beispiel 2 Herstellung eines pulverförmigen Melia volkensii-Extrakts

179 g eines gemäß Beispiel 1 hergestellten Rohextrakts wurden 3 × mit jeweils etwa 150 ml Ethylacetat digeriert. Die Ethylacetat phasen wurden jeweils von dem unlöslichen Material abgetrennt und gesammelt. Man erhielt 130,6 g in Ethylacetat unlösliches Mate rial, welches verworfen wurde. Anschließend wurden in die Ethyla cetatphase 1500 ml Petrolether (Verhältnis Ethylacetat : Petrol ether = 1 : 3,5) eingemischt. Es präzipitierte ein hellgelber pul verförmiger Festkörper. Nach dem Trocknen bei 40°C im Vakuum wurden 24,15 g hellgelbes trockenes Pulver erhalten (13,5% Aus beute, bezogen auf den Rohextrakt).

Beispiel 3 Weitere Aufreinigung des Produkts aus Beispiel 2

440 mg des pulverförmigen Produkts aus Beispiel 2 wurden in 10 ml Ethylacetat aufgenommen und es wurde 3 × mit je 5 ml Wasser ex trahiert. Nach dem Abdestillieren des Ethylacetats und Trocknen bei 40°C im Vakuum erhielt man 377 mg pulverförmiges, gelbes Produkt.

Beispiel 4

Gemäß Beispiel 2 wurden 450 ml Ethylacetatextrakt hergestellt. Der Extrakt wurde anschließend 3 × mit jeweils 200 ml Wasser gewaschen. Zu der gewaschenen organischen Phase wurden anschlie ßend 1000 ml Petrolether gegeben. Es bildete sich ein blaßgelber pulverförmiger Niederschlag. Nach dem Trocknen bei 40°C im Vakuum erhielt man 14,5 g pulverförmigen Extrakt.

Beispiel 5 Isolierung der Einzelkomponenten Ohchinin-3-acetat, 1-Tigloyl trichilinin und 1-Cinnamoyl-trichilinin

200 g eines gemäß Beispiel 1 hergestellten Melia volkensii-Roh extrakts wurden 2 × mit 1000 ml absolutem Methanol extrahiert und der unlösliche Rückstand (120 g) verworfen. Anschließend wurde das Methanol im Vakuum abdestilliert. Die erhaltene Trockenmasse (80 g) wurde 2 × mit 800 ml Aceton extrahiert. Der unlösliche Rückstand (16 g) wurde verworfen. Die Acetonfraktion (64 g nach dem Abdestillieren des Lösungsmittels) besaß eine hohe biolo gische Aktivität im Aedes- und Epilachna-Test und diente als Ausgangsmaterial für die folgenden chromatographischen Aufarbei tungen.

20 g des Acetonextrakts wurden durch Abdampfen des Lösungsmittels im Rotationsverdampfer auf ca. 100 g Kieselgel aufgezogen und auf einer Glassäule (10 × 10 cm) mit Sinterplatte G2 mit einem stu fenweisen Gradienten chromatographiert. Der Rohextrakt wurde nacheinander mit jeweils 2000 ml Petrolether:Ethylacetat (7 : 3), Petrolether: Ethylacetat (1:1), Petrolether: Ethylacetat (4 : 6), Ethylacetat und Methanol eluiert. Die Petrolether-Ethylacetat = 4 : 6- und Petrolether: Ethylacetat 1 : 1-Fraktionen wurden vereinigt. Die Substanzmenge betrug nach Abdestillieren des Lösungsmittels im Vakuum 6 g (30%). Die vereinigten Fraktionen wurden über Kieselgel (Säulenchromatographie 42 cm × 5,5 cm Säule mit 430 g Kieselgel) rechromatographiert. Man erhielt zwei im Aedes-Test hochaktive Fraktionen (Fraktion I und Fraktion II).

Fraktion I: Ausbeute 1,8 g (30%)
Aceton/Chloroform (v/v 3/7) Rf = 0,8-0,9
Fraktion II: Ausbeute 2,7 g (45%)
Chloroform/Aceton (v/v 7/3) Rf = 0,54-0,66

Ohchinin-3-acetat-Isolierung

400 mg Fraktion I wurden durch präparative HPLC (RP8) mit 50% Acetonitril/Wasser bei einem Fluß von 100 ml/min chromatogra phiert (Detektion bei 215 nm). Der Peak mit einer Retentionszeit von 47 bis 49,5 min wurde gesammelt. Die Endreinigung der Sub stanz erfolgt durch Rechromatographie im selben System und unter den gleichen Bedingungen. In der analytischen HPLC (RP18-Säule, 60% Acetonitril und 40% Wasser, Fluß 1,0 ml/min) besaß die Reinsubstanz eine Retentionszeit von 14,7 min. Man erhielt 80 mg (20% in Bezug auf Fraktion I) Ohchinin-3-acetat.

Zur Gewinnung der Trichilinine wurde eine Vorreinigung von Frak tion II über präparative HPLC (RP8) mit 65% Methanol/Wasser bei einem Fluß von 90 ml/min durchgeführt (Detektion bei 215 nm). Dabei fielen zwei im Biotest aktive Fraktionen IIa (33,5 - 37,5 min) und IIb (46,5-52,5 min) an. Aus 500 mg Fraktion II wurden 25 mg II1 (5%) und 25 mg IIb (5%) erhalten.

Isolierung von 1-Tigloyl-trichilinin

100 mg der Fraktion IIa wurden durch präparative HPLC (RP8, 70% Methanol/30% Wasser, Fluß 100 ml/min, Detektion bei 215 nm) chromatographiert und das Produkt mit einer Retentionszeit von 25,5 bis 30,5 min gesammelt. Die erhaltene Rohsubstanz wurde auf derselben Säule erneut chromatographiert (65% Methanol/35% Wasser, Fluß 100 ml/min). Man erhielt 67 mg 1-Tigloyl-trichilinin als Reinsubstanz.

Isolierung von 1-Cinnamoyl-trichilinin

100 mg der Fraktion IIb wurden auf einer HPLC-Säule (RP8, 80% Methanol/Wasser, Fluß 90 ml/min, Detektion bei 215 nm) chromato graphiert. Die Fraktion mit einer Retentionszeit von 27-31,5 min wurde gewonnen, auf der gleichen Säule mit 60% Acetonitril/- Wasser rechromatographiert und dadurch 42 mg (42%) Reinsubstanz erhalten.

Beispiel 6 Bioassays von pulverförmigen Melia-volkensii-Extrakten (MVE). 1-Cinnamoyl-trichilinin (CT) und 1 Tigloyl-trichilinin (TT) 1. Mortalität von Schistocerca gregaria (S. gregaria)

S. gregaria Heuschrecken wurden mit den in nachfolgender Tabelle 1 angegebenen Mengen TT, CT, MVE und MVE′ (Ethylacetatphase mit Wasser gewaschen) injiziert. Die in der Tabelle angegebenen Zah len geben die Mortalität 48 Stunden nach der Injektion der ent sprechenden Dosen in µg/g Körpergewicht Insekt an. Der Wirkstoff wurde den Insekten als wäßrig-ethanolische Lösung, die 1,0 µg Wirkstoff pro µl Lösung enthielt, injiziert. Zur Kontrolle wurden ebenfalls 5 Insekten mit dem Lösungsmittel ohne Wirkstoff inji ziert. Während des Versuchverlaufs starb eine der fünf Kontrol linsekten. Aus der Tabelle 1, welche die Mortalitätsraten nach der Injektion der Extrakte angibt, ist ersichtlich, daß bei einer Menge von 30 µg/g Insekt Melia volkensii-Extrakt die letale Dosis erreicht ist. Weiterhin ist aus der Tabelle ersichtlich, daß über die Bestimmung der Konzentration von TT bzw. CT eine Beurteilung der Wirksamkeit eines Melia volkensii-Extraktes möglich wird.

Tabelle 1

2. Untersuchung der fraßhemmenden Wirkung auf S. gregaria

Zur Untersuchung der fraßhemmenden Wirkung von TT, CT, MVE bzw. MVE′ wurden von jedem dieser Wirkstoffe 5 zuckerhaltige Lösungen mit unterschiedlicher Konzentration hergestellt (siehe Tabelle 2). Anschließend wurde ein Filterpapier in die jeweilige Lösung eingetaucht, luftgetrocknet und S. gregaria zum Fraß angeboten. Die Ergebnisse aus der Beobachtung des Fraßverhaltens hinsicht lich einer Fraßhemmung sind in Tabelle 2 angegeben. Aus Tabelle 2 ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäßen Melia volkensii- Extrakte bereits bei einer Konzentration von 5 ppm (0,0005%) zu einer 50%igen Fraßhemmung führen. Eine 100%ige Fraßhemmung kann im Bereich von 50 ppm (0,005%) erreicht werden. Eine Spritzlö sung zur Anwendung auf Pflanzen im Feld sollte daher bei ver gleichbaren Konzentration, d. h. 550 ppm, eine effektive Kon trolle der Schadinsekten erlauben. Weiterhin ist ersichtlich, daß über die Beobachtung von CT bzw. TT eine Einschätzung der fraß hemmenden Wirkung ermöglicht wird.

Tabelle 2

Fraßhemmung in Prozent bei verschiedenen Wirkstoffkon zentrationen

3. Wirkung auf Stechmückenlarven

Die Eier der Gelbfiebermücke (Aedes aegypti) stammten aus der Zucht des zoologischen Instituts der Universität Nairobi in Ke nia. Sie sind im trockenen Zustand für längere Zeit lagerbestän dig und transportfähig und wurden bei Bedarf zum Ausbrüten der Larven in einem Becherglas in ca. 400 ml 0,08%iger NaCl-Lösung bei 25°C unter einer Lampe inkubiert. Innerhalb von 12 bis 24 Stunden schlüpften die Larven und wurden sofort für den Biotest eingesetzt. Hierfür wurden in eine Kristallisierschale 40 Larven in 20 ml 0,08%-iger NaCl-Lösung gebracht und eine entsprechende Menge Testsubstanz, wie in Tabelle 3 angegeben in Methanol ge löst, dazugegeben, so daß in der Testlösung die gewünschte End konzentration vorlag. Die Kontrollschale wurde entsprechend dem Volumen der Substanzlösung in mit maximal 400 µl reinem Methanol versetzt. Die Biotests wurden anschließend bei 25°C und einem Tag/Nacht-Rhythmus von 14 : 10 Stunden für einen Zeitraum von 3 bis 7 Tagen durchgeführt. Für die Beleuchtung wurden 60 W-Glühbirnen verwendet. Als Futter wurden pro Test einige Krümel Meerschwein chenfutter ad libitum zugegeben. Um die Wasserverdunstung auszu gleichen, wurden jeden Tag die Testschalen mit bidest. Wasser wieder auf 20 ml aufgefüllt. Nach 48 Stunden wurden die toten Larven gezählt. Aus der Tabelle 3 ist ersichtlich, daß die LD 50 Dosis der erfindungsgemäßen Melia volkensii-Extrakte im Bereich von 60 ppm liegen muß. Weiterhin wird durch Tabelle 3 gezeigt, daß über die Bestimmung von TT bzw. CT eine Kontrolle der Larven abtötenden Wirkung von Melia volkensii-Extrakten ermöglicht wird.

Tabelle 3

Mortalität in Prozent bei unterschiedlichen Wirkstoff konzentrationen

Claims

1. Pulverförmiger Extrakt aus den Früchten oder/und Samen einer Meliazee mit Ausnahme des Neembaumes.

2. Pulverförmiger Extrakt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Extrakt eine Mischung von durch organische Lösungs mittel extrahierbaren Stoffen enthält.

3. Pulverförmiger Extrakt nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Extrakt mindestens 10 Gew.-% Limonoide enthält.

4. Pulverförmiger Extrakt nach einem der vorhergehenden An sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Extrakt mindestens 25 Gew.-% Limonoide enthält.

5. Pulverförmiger Extrakt nach einem der vorhergehenden Ansprü che, dadurch gekennzeichnet, daß der Extrakt mindestens ein Limonoid, ausgewählt aus der Gruppe Ochinin-3-acetat, 1-Tigloyl-trichilinin und 1- Cinnamoyl-trichilinin, enthält.

6. Pulverförmiger Extrakt aus den Früchten oder/und Samen einer Meliazee mit Ausnahme des Neembaumes, dadurch erhältlich, daß man durch Behandlung zerkleinerter Früchte oder/und Samen der Meliazee mit Wasser und einem polaren organischen Lösungsmittel einen Rohextrakt erzeugt, die organolöslichen Bestandteile des Rohextrakts in ein polares Lösungsmittel, das weniger als 5 Gew.-% Wasser enthält, überführt, und durch Anwendung eines weniger polaren Lösungsmittels pulver förmiges Material präzipitiert.

7. Verfahren zur Herstellung eines pulverförmigen Extrakts aus den Früchten oder/und Samen einer Meliazee mit Ausnahme des Neembaumes, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) die zerkleinerten Meliazee-Früchte oder/und Samen zur Erzeugung eines Rohextrakts in Gegenwart von Wasser aufschließt und extrahiert,
(b) die organolöslichen Bestandteile des Rohextrakts in einem polaren organischen Lösungsmittel oder einem Gemisch von polaren organischen Lösungsmitteln, das weniger als 5 Gew.-% Wasser enthält, löst und
(c) durch Anwendung eines weiteren, weniger polaren Lö sungsmittels ein pulverförmiges Material präzipitiert.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Meliazee Melia volkensii ist.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erzeugung des Rohextrakts in Schritt (a) ein ein phasiges Gemisch von Wasser und einem polaren organischen Lösungsmittel verwendet wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das einphasige Lösungsmittelgemisch 10 bis 25 Gew.-% Wasser enthält.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erzeugung des Rohextrakts in Schritt (a) ein Gemisch von Wasser und Alkohol, insbesondere Ethanol oder/und Metha nol verwendet wird.

12. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erzeugung des Rohextrakts die zerkleinerten Früchte oder/und Samen mit Wasser aufschließt und anschließend mit einem polaren, organischen Lösungsmittel extrahiert werden.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß in Verfahrensschritt (a) vor der Zugabe des organischen Lösungsmittels das Wasser zumindest teilweise entfernt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Wasser durch Filtration entfernt wird.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß das organische Lösungsmittel in Verfahrensschritt (a) Alkohol, insbesondere Ethanol, Methanol oder ein Gemisch davon ist.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Rohextrakt vor Verfahrensschritt (b) aufkonzentriert wird.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Rohextrakt vor Verfahrensschritt (b) getrocknet, insbesondere lyophilisiert wird.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß das polare organische Lösungsmittel in Verfahrensschritt (b) ein Keton, Ester, Nitril, Alkohol oder ein Gemisch davon ist.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß in Verfahrensschritt (b) Ethylacetat, Ethanol, Acetoni tril, Aceton oder Gemische davon als organisches Lösungs mittel verwendet werden.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 19, dadurch gekennzeichnet daß in Verfahrensschritt (b) Ethylacetat als organisches Lösungsmittel verwendet wird.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß vor dem Präzipitieren in Schritt (c) mit Wasser gewa schen wird.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (c) ein Präzipitationsmittel verwendet wird, das mit dem in Verfahrensschritt (b) verwendeten organischen Lösungsmittel mischbar ist.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß zur Präzipitation in Schritt (c) ein Alkan oder ein Gemisch von Alkanen mit 5 bis 10 Kohlenstoffatomen oder ein Ether mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen verwendet wird.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß zur Präzipitation in Schritt (c) Petrolether oder Diet hylether verwendet wird.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß in Verfahrensschritt (b) Ethylacetat als polares ogani sches Lösungsmittel und in Verfahrensschritt (c) Petrolether als Präzipitationsmittel verwendet wird.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (c) das Präzipitationsmittel im Überschuß gegenüber der in Schritt (b) erhaltenen Lösung verwendet wird.

27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß in Verfahrensschritt (c) das Verhältnis der Lösung aus Schritt (b) zum Präzipitationsmittel 1 : 1,5 bis 1 : 4 auf Volu menbasis beträgt.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß das pulverförmige Präzipitat von der Lösung abgetrennt und getrocknet wird.

29. Verwendung eines pulverförmigen Extrakts nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Bekämpfung von Schadarthropoden.

30. Verwendung nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß der Extrakt in Form einer verdünnten festen oder flüssi gen Formulierung angewendet wird.

31. Verwendung nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Anwendungsformulierung als aktiven Bestandteil 10 bis 500 ppm des pulverförmigen Extrakts enthält.

32. Verwendung nach einem der Ansprüche 29 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß pro Hektar zur behandelnder Fläche 10 bis 100 g des pulverförmigen Extrakts ausgebracht werden.

33. Verfahren zur Bestimmung der biologischen Aktivität eines Meliazee-Extrakts mit Ausnahme von Extrakten des Neembaumes, dadurch gekennzeichnet, daß der Gehalt von Ochinin-3-acetat oder/und 1-Tigloyl trichilinin oder/und 1-Cinnamoyl-trichinilin im Extrakt bestimmt und als Leitgröße verwendet wird.

34. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß die Gehaltsbestimmung durch ein chromatographisches Verfahren, insbesondere HPLC erfolgt.