DE3132656A1

DE3132656A1 - Zedrachrindenextrakt mit antineoplastischer wirkung

Info

Publication number: DE3132656A1
Application number: DE19813132656
Authority: DE
Inventors: Takeo Nomura; Masaki Shimizu; Tadashi Sudo
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 1980-08-19
Filing date: 1981-08-18
Publication date: 1982-06-03
Also published as: GB2082066A; GB2082066B; CH650404A5; FR2488800A1; DE3132656C2; US4515785A; FR2488800B1

Description

Henkel,Kern»FeSs^&HaiM©! _; - - " . t*®t@ift£®.BS walte

European Patent Office

Möhlstraße 37 D-800Q München 80

TeL: 088/98208^8? Telex: 05298Ö2 hnk! d Telegramms: ©llipsoid

Terumo Corporation, 44-1, 2-chome, Hatagaya, Shibuya-ku Tokyo / Japan

Zedrachrindenextrakt mit antineoplastischer Wirkung

Die Erfindung bezieht sich auf neue Zedrachrindenextrakte, Die erfindungsgemäßen Zedrachrindenextrakte besitzen antineoplastische Wirkungen und sind als tumorhemmende Mittel nützlich.

Bisher war bekannt, daß Extrakte des Zedrachbaums verschiedene pharmakologisch wirksame Bestandteile enthalten. Es sind daher Verfahren zur Herstellung von kosmetischen Mitteln zur Behandlung der Haut aus der Rinde, den Blättern, den Blüten, den Früchten, den Zweigen, der Oberhaut der Wurzel oder dem Harz des Zedrachbaums bekannt , indem man die genannten Produkte des Baums mit Wasser oder einem hydrophilen Lösungsmittel extrahiert, oder indem man die genannten Produkte fein pulverisiert

(JA-PS'en 28 853/77, 28 854/77 und 10 125/78); weiter ist ein Verfahren bekannt,.aus den Produkten des Zedrachbaums die Bestandteile zu gewinnen, die eine die Funktion des Magen und Darms und der Leber verbessernde Wirkungen besitzen,indem man die Produkte des Zedrachbaums mit einem hydrophilen Lösungsmittel und / oder heißem Wasser extrahiert (JA-PS 10 124/78); ein weiteres Verfahren zur Gewinnung dieser Bestandteile aus den Produkten des Zedrachbaums, die für die Behandlung von Hautkrankheiten und Rheuma wirksam sind, umfaßt die Extraktion der Produkte mit einem hydrophoben Lösungsmittel (JA-PS 13 689/78).

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist ein Zedrachrindenextrakt zu schaffen, der für die Behandlung von bösartigen Geschwulsten, insbesondere von bösartigen Tumoren, wirksam ist.

Diese Aufgabe wird durch die in Anspruch 1 und 6 gekennzeichnete Erfindung gelöst.

Aufgrund von umfangreichen Untersuchungen der pharmakologischen Wirkungen der in dem Zedrachbaum enthaltenen Bestandteilen hat man herausgefunden, daß die aufeinanderfolgenden Behandlungen der Zedrachrinde mit zwei Lösungsmitteln mit unterschiedlichen Dielektrizitätskonstanten zu Bestandteilen führt, die ausgezeichnete antineoplastische Wirkungen besitzen.

Die bekannten Verfahren unterscheiden sich von der vorliegenden Erfindung dadurch, daß sie zur Gewinnung der wirksamen Bestandteile keine Vorbehandlung, sondern nur die direkte Extraktion anwenden.

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Demgegenüber bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Zedrachrindenextrakte, die. man erhält, wenn man die Zedrachrinde einer Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel mit einer Dielektrizitätskonstante von 10 oder weniger und darauffolgend den Rückstand der ersten Extraktion einer Extraktion mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel mit einer Dielektrizitätskonstante von 15 bis 35 unterwirft. Wie im folgenden unten beschrieben,besitzt der erfindungsgemäße Zedrachextrakt mitosehemmende Eigenschaften bei befruchteten Eiern von Seeigeln als auch wachstumhindernde Eigenschaften bei Mäuse-Sarkom 180 Aszites und festen Geschwulsten und Mäuse L-5178Y Zellen.

Der Zedrachbaum ist etwa 10 Meter hoch oder höher, und wächst in den Tropen. Sein botanischer Name ist Melia azadirachta. Seine Rinde wird in der vorliegenden Erfindung verwendet. Die Rinde wird vorzugsweise getrocknet und zur Verwendung entsprechend fein zerteilt.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Extraktion, in dem die Zedrachrinde mit einem organischen Lösungsmittel mit einer Dielektrizitätskonstante von 10 oder weniger behandelt wird, als Vorbehandlung zur Extraktion der aktiven Bestandteile angewendet.

Beispiele derartiger Lösungsmittel sind Benzol, Toluol, Xylol , η-Hexan, Chloroform, Kohlenstofftetrachloride Äthylacetat und Ähnliche. Die Behandlung vor der Extraktion wird entweder einige Stunden oder über Nacht durchgeführt. Der Rückstand der ersten Extraktion wird mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel extrahiert. Beispiele de.artiger, in diesem Verfahrensschritt verwendete Lösungsmittel sind die erwähnten niedrigen Alko-

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hole, wie ζ. B. Äthanol, Methanol, Propanol und n-Butanol, Pyridin, Aceton und Ähnliche. Die Extraktion wird über eine Zeitdauer von einigen Stunden oder über Nacht in üblicher Weise durchgeführt. Die Entfernung des Lösungsmittels aus dem Extrakt geschieht beispielsweise mittels Destillation und liefert den Zedrachrindenextrakt gemäß der Erfindung. Der so erhaltene Zedrachrindenextrakt kann so wie er ist bei der Behandlung von bösartigen Geschwulsten verwendet werden. Alternativ kann der Extrakt gereinigt werden, um einen Zedrachrindenextrakt höherer Reinheit zu erhalten, indem man das folgende Verfahren verwendet. Den in der oben beschriebenen Weise erhaltenen Zedrachrindenextrakt löst man in einem wässerigen niedrigen Alkohol, wie z. B. wässerigem Methanol oder Äthanol,und bringt die sich ergebende Lösung mit einem nicht-polaren Harz zur Absorptionschromatographie, wie z. B. Amberlite XAD-2, XAD-4 (Rohme und Haas), Bio Beads SM-1, SM-2 (Biorad), Diaion HP-IO, HP-20, HP-30 (Mitsubishi Chemical Industries) oder Ähnlichem in Berührung, wobei das Absorptionsharz mit einem 10% wässerigen Methanol behandelt wird. Darauf folgt die Elution des absorbierten Materials mit 50% wässerigen Methanol. Die Entfernung des Lösungsmittels von dem Eluat, beispielsweise mittels Destillation, ergibt den gewünschten Zedrachrindenextrakt.

Der Zedrachrindenextrakt gemäß der vorliegenden Erfindung hat die folgenden Eigenschaften:

1. Aussehen
braunes Pulver

2. IR Absorptionsspektrum
siehe Fig. 1 und 2

? cm"¹: 3400, 1600, 1435

Iu 3. X

3. UV Absorptionsspektrum

siehe Fig. 3. Als Lösungsmittel wurde Methanol verwendet. UV /I max: 279 nm !λ min.: 259 nm

4. Lösbarkeit

ca. 40 mg/ml in Wasser, 50 mg/ml in Methanol ca. 20 mg/ml in Äthanol, ca. 1,5 mg/ml in Aceton und fast unlöslich in Benzol, Chloroform, Äthylacetat oder n-Hexan.

5. Behandlung bei verschiedenen ph-Werten

der vorliegende Extrakt verliert seine antineoplastischen Eigenschaften nicht, wenn er bei 60⁰C 30 Minuten in einer wässerigen Lösung mit einem ph-Wert von 2, 7 oder 9 behandelt wird.

Die erfindungsgemäßen Zedrachrindenextrakte sind bei der Behandlung von einer Vielzahl bösartiger -Geschwülste nützlich. Man kann sie parenteral, beispielsweise mittels subkutaner, intravenöser oder intramuskulärer Injektion oder oral in Form von Tabletten, Kapseln, Granulat, Pulver, Sirup oder Ähnlichem verabreichen. Die Dosierung des Extrakts liegt zwischen 1 bis 5 g pro Tag für männliche Erwachsene , obwohl sie in Abhängigkeit vom Alter, vom Körpergewicht und dem Zustand des behandelnden Patienten verändert werden kann»

Die erfindungsgemäßen Extrakte werden in üblicher Weise aufbereitet. Beispielsweise wird das getrocknete Pulver des vorliegenden Extrakts in einen Behälter, z. B. einer Viole, eingebracht. Getrennt wird beispielsweise in einer Ampulle eine physiologische Kochsalzlösung, eine wässerige Glucoselösung oder eine Suspension von Karboximethylzellulose (CMC) vorbereitet. Das pulver wird bei Gebrauch entweder gelöst oder suspensiert. Alternativ kann der Extrakt in einer Emulsion injiziert werden. Im Fall einer Waseer-in-öl (w/o) Emulsion wird beispielsweise

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eine Kombination eines Mineralöls, wie z. B. flüssiges Paraffin oder eines Pflanzenöls, wie z. B. Sesamöl oder Erdnußöl, mit einem oberflächenaktiven Mittel, wie z. B. aliphatische Esther der Sorbinsäure, verwendet.

Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung werden im folgenden unter Bezugnahme auf die Zeichnung beschrieben. Es zeigen:

ein IR-Absorptionsspektrum des in Beispiel 1 erhaltenen Zedrachrindenextrakt; ein IR-Absorptionsspektrum des in Beispiel 5 erhaltenen Zedrachrindenextrakts; ein UV-Äbsorptionsspektrum des gleichen Extrakte wie in Fig. 2.

Fig.	1
Fig.	2
Fig.	3
Beispiel 1

Zu 10 g trockener Zedrachrinde wurden 100 ml Benzol hinzugefügt. Die Mischung wurde eine Stunde lang stehengelassen , wobei sie zur Durchführung der Extraktion in Abständen geschüttelt wurde. Die sich ergebende Mischung wurde gefiltert und zu dem Rückstand 100 ml Benzol hinzugefügt. Die Mischung wurde dann in der gleichen Weise wie oben behandelt. Die Benzolextraktion wurde insgesamt drei Mal wiederholt. Die kombinierten Benzolextrakte wurden bis zur Trockenheit konzentriert, wodurch man ein Pulver erhielt. Das so erhaltene Pulver war die Benzolfraktion. Zu dem Rückstand der Benzolextraktionen wurden 100 ml Methanol hinzugefügt, woraufhin die Mischung dann der gleichen Behandlung mit Benzol, wie oben beschrieben, unterworfen wurde. Das dann erhaltene Pulver wurde als Methanolfraktion bezeichnet. Ein IR-Absorptionsspektrum der Methanolfraktion ist in Fig. 1 dargestellt.

Das erhaltene trockene Pulver wog für die Benzolfraktion 48,2 mg und für die Methanolfraktion 385,4 mg.

Beispiel 2

10g trockene Zedrachblätter wurden dem gleichen Extraktionsverfahren wie im Beispiel 1 unterworfen.Es wurden hierbei 120,2 mg Benzolfraktion und 682,5 mg einer Methanolfraktion in Form von trockenem Pulver hergestellt.

Beispiel 3

Die gleichen Verfahrensschritte wie in Beispiel 1 wur- " den mit 10g trockener Zedrachrinde mit der Ausnahme wiederholt, daß statt Benzol Äthylacetat verwendet wurde. Man erhielt 86,0 mg einer Äthylacetatfraktion und 360,3 mg einer Methanolfraktion in Form von trockenem Pulver.

Beispiel 4

Es wurden die gleichen Verfahrensschritte wie in Beispiel 1 mit 10 mg trockener Zedrachrinde mit der Ausnahme wiederholt, daß statt Methanol Äthanol verwendet wurde. Man erhielt 43,9 mg einer Benzolfraktion und 334,8 mg einer Äthanolfraktion in Form von trockenem Pulver.

Die in der oben beschriebenen Weise erzeugten Zedrachextrakte wurden mit Seeigeisiern, Mäuse-L-5178Y Zellen und Mäusesarkom 180 Aszites und festen Geschwulsten untersucht. Es wurden weiter die Wirkungen, die wirksame Dosierung und die Wirkungen im Vergleich zu bekannten tumorhemmenden Mitteln untersucht. Die Versuchsergebnisse werden im folgenden beschrieben.

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Versuch I

Die mitosehemmenden Wirkungen der Zedrachextrakte wurden mittels Verwendung von Seeigeleiern wie folgt bestimmt:

Befruchtete Seeigeleier, Hemicentrotus pulcherrimus oder Anthocidaris crassispina in der Anzahl von 200 bis 300 wurden zusammen mit 2 ml Seewasser in einem Versuchsröhrchen angeordnet. Unmittelbar darauf wurden 0.2 ml einer wässerigen oder DMSO (Dimethylsulfoxid)Lösung des in den obigen Beispielen erhaltenen Versuchsmaterials dem Versuchsröhrchen zugefügt. Darauf wurde dann die Zellteilung der befruchteten Eier mikroskopisch beobachtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle I angegeben. In der Tabelle stellen drei Pluszeichen, zwei Pluszeichen, ein Stern und ein Bindestrich eine vollkommene Einstellung der Eiteilung, eine etwa 50 bis 80% Eiteilung, ein oder zwei Teilungen der Eier und keine Einstellung der Eiteilung dar.

Tabelle I Wirkung auf die Zellteilung von Seeigelzygoten

Teil d. Ze- Fraktion Konzentration der Testlösung drachbaums Beispiel mg / ml

Nr. 0,25 ..0,50 1,0

Benzol (1) -

Methanol
(1) - ++ +++

Äthylacetat
(3) *

Rinde ,, ., ,

Methanol

(3) - ++ +++ Benzol (4) - *

Äthanol

Tabelle I Wirkung auf die Zellteilung von Seeigelzygoten

Teil d. Ze- Fraktion Konzentration der Testlösung drachbaums Beispiel mg / ml

Nr. 0,25 0,50 1,0

Benzol

Blätter ⁽²⁾

Methanol
(2)

Man sieht leicht aus den Ergebnissen des obigen Versuchs in Tabelle 1, daß die Methanol (1) Fraktion der Rinde, Methanol (3) Fraktion der Rinde und die Äthanol (4) Fraktion der Rinde und die Methanol (2) Fraktion der Blätter wirksam die Zellteilung befruchteter Seeigeleier im Vergleich zu den anderen Fraktionen hemmt.

Insbesondere hemmen die Metanol (1) und die Methanol (3) Fraktionen die Zellteilung der Eier vollständig. Bei einer Konzentration der Testlösung von 1 mg/ml wurde bei der Äthanol (4) Fraktion eine 50 bis 80% Hemmung beobachtet. Nur ein oder zwei Zellteilungen fanden bei der Methanol (2) Fraktion der Blätter statt. Die Benzol (1) Fraktion von Tabelle I entspricht dem pharmakologisch wirksamen Bestandteil der JA-PA 13 689/78. Es ist daher von Bedeutung, daß die erfindungsgemäßen Zedrachextrakte pharmakologisch wirksamer als die früheren sind.

Versuch II

Der folgende Versuch mit der Methanol (1) Fraktion durchgeführt, welche eine hohe mitosehemmende Wirkung bei be-

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fruchteten Seeigeleiern im Versuch gezeigt hat.

Zu den Seeigeleiern wurde eine Testlösung hinzugefügt, woraufhin weiter Samenzellen hinzugefügt wurden. Daraufhin wurde beobachtet, ob die Befruchtung gehemmt wurde. Man beobachtete eine 100% und 80% Hemmung der Befruchtung der Seeigeleier mit einer Testlösung, die eine Konzentration von 0,8 mg/ml bzw. 016 mg/ml aufwies. Die Testlösung mit einer Konzentration von 0,032 mg/ml hemmte die Befruchtung nicht, jedoch wurde die Teilung der Eier nach einer Teilung unterbrochen.

Wenn man eine Testlösung mit einer Konzentration von 0,8 mg/ml 15 Minuten nach der Befruchtung der Eier hinzufügte, wurde die Teilung nach zwei Teilungen unterbrochen .

Die oben beschriebenen Versuchsergebnisse ergaben, daß der erfindungsgemäße Zedrachextrakt nicht nur die Zellteilung, sondern ebenfalls die Befruchtung der Eier behinderte. Derartig pharmakologisch wirksame Mittel, die die Befruchtung und Teilung der Eier behindern, können einen weiten Anwendungsbereich als Agrochemikalien und Pharmazeutika finden. Die wirksame Dosierung, die Bereitstellung und Giftigkeit können entsprechend dem beabsichtigten Anwendungsgebiet bestimmt werden.

Versuch III (Wirkung auf Mäuse L-5178Y Zellen) 1. Vorbereitung des Zellennährbodens

Es wurde unter Verwendung von auf einem RPMI-1640 Nährboden aus 10 % fötalen Rinderserum 3 Tage lang kultivierten Mäuse-L 5178Y Zellen ein Nährboden mit 1x10 Zellen/ml präpariert. Der Nährboden wurde auf eine U-Mikroscheibe mit 96 Vertiefungen

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mit einer Menge von 50 μΐ pro Vertiefung aufgebracht. 2. Auswertverfahren

Ein Teil des Versuchsmaterial, welches eins der in den obigen Beispielen beschriebenen erfindungsgemäßen Extrakte war, wurde in dem Nährboden bis zu einer Endkonzentration in dem Nährboden,wie in Tabelle II gezeigt, gelöst. Die Menge der Lösung pro Vertiefung betrug 60μ1. Das so vorbereitete Versuchsmaterial wurde in einem Kohlendioxidinkubator bei 37⁰C zwei Tage lang inkubiert. Nach Abschluß der Inkubation wurden Zellen gesammelt und Vertiefung für Vertiefung gezählt und dann die Anzahl der Zellen mit der Anzahl der Kontrollzellen verglichen, die nicht im Testmaterial enthalten waren. Die Anzahl der Kontrollzellen betrug ungefähr 8,6 χ 10 /ml. Zum Vergleich der Wirksamkeit wurde der gleiche Test mit Mitomycin C (MMC) oder Bleomycin (BLM) wiederholt. In Tabelle II stellt T/C das Verhältnis der mit dem Versuchsmaterial behandelten Zellen zu den nicht mit Versuchsmaterial behandelten Zellen dar. IDr_Q ist die Konzentration des für die Abnahme der Konzentration der Zellen auf 1/2 zu den der Kontrollzellen erforderlichen Versuchsmaterial.

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Tabelle II Wirkung auf L-5178Y Mäusezellen

	Beispiel (Beispiel Nr.)	Konzentration d. Versuchs- materials Ug/ml)	T/C (%)	^ID50 (ug/ml)
Teil d. Ze- drachbaums	Benzol (1)	100	98,1
		30	105	-
		15	114
	Äthylacetat (3)	100	94,5
		30	99,8	-
		15	100,0

Rinde	Methanol (1)	100	1,0
		30	15,0	21
		20	60,0
	Äthanol (4)	100	17,5
		31	58,0	38
		15	83,0
	Benzol (2)	100	102,4
		31	110,3	-
		15	108,4
	Methanol (2)	100	94,8
		31	99,2	-
		15	115
	MMC	1,0	13,4
		0,3	24,7	0,09
		0,1	47,9
Versuchsma- terial	BLM	100	8,8
		10	46,1	7,8
		5	57,1

-Ίβ/ιγ-

3. Ergebnisse

Die mit den verschiedenen in den obigen Beispielen erzeugten Fraktionen und den Vergleichsmitteln erzielten Ergebnisse sind in Tabelle II dargestellt. Die Benzol- und Äthylacetatfraktion der Zedrachrinde und die Methanolfraktion der Blätter zeigen leichte Wirksamkeit. Es wurde herausgefunden, daß die Wirksamkeiten sehr gering sind, wenn die ID₅₀ Werte sehr hoch sind. Andererseits zeigten die Methanol- oder Äthanolfraktionen eine hohe Wirksamkeit. Obwohl die Wirksamkeiten unter den Wirksamkeiten von MMC und BLM liegen, kann man sie als hoch genug ansehen, wenn der in der Methanol- oder Äthanolfraktion enthaltene wirksame Bestandteil in Betracht gezogen wird.

Versuch IV (Wirkungen auf die Aszitesgeschwulst eines Sarkom 180)

1. Vorbereitung des Versuchsmaterials

Ein Teil.jeder Extraktionsfraktion wurde in einer 0,5% Suspension von Carboxymethylzellulose (CMC) in einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS im Handel erhältlich von den GIBCO Laboratories, mit einem Gehalt von ca. 9,5mM Phosphat) bis zu einer vorbestimmten Konzentration suspendiert oder gelöst.

2. Transplantation der Geschwulstzellen eines Sarkom

Geschwulstzellen eines Mäusesarkoms 180, die in ICR Mäusen intraperitoneal subkultiviert wurden, wurden von der Maus zusammen mit der Aszitesflüssigkeit abgezogen und mit physiologischer Kochsalzlösung zu einer

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Zellenanzahl von 10 pro ml verdünnt. Die so erhaltene Geschwulstzellensuspension wurde dann mittels einer Spritze intraperitoneal in 4 Wochen alte männliche ICR Mäuse mit einer Dosierung von 0,1 ml transplantiert. Entsprechend betrug die pro Maus transplantierte Zellenanzahl 1 χ 10 .

3. Verabreichung des Versuchsmaterials

Das wie oben beschriebene,hergestellte Versuchsmaterial wurde mit einer Dosierung von 0,1 ml pro Maus 4 Tage lang 1 Mal pro Tag nach dem auf die Transplantation der Tumorzellen des Mäusesarkoms 180 intraperitoneal ver-· abreicht. Für jede Konzentration jedes Versuchsmaterials wurde eine Gruppe von sechs Mäusen verwendet. Als Wirksamkeitskontrolle wurde MMC, BLM, Aktiomycin D (ACD>, 5-Fluorouracil (5-fu) und Zyklophosphamid (CYP) verwendet. Zur Kontrolle wurde das CMC-enthaltende PBS, wie oben beschrieben, nur in der gleichen Weise wie oben beschrieben, verabreicht. Die Dosierung wird in Gewicht pro kg Körpergewicht der Maus ausgedrückt.

4. Auswertverfahren

Am siebten Tag der Transplantation der Geschwulstzellen wurde das Körpergewicht jeder Maus (X) bestimmt. Dann wurde die Aszitesflüssigkeit sorgfältig von der Maus abgezogen, woraufhin das Körpergewicht (Y) bestimmt wurde. X minus Y wird als die Menge der Aszitesflüssigkeit bestimmt.

Die abgezogene Aszitesflüssigkeit wurde dann in ein Hamatokritzentrifugierglas eingegeben und dann bei 15000 G 5 Minuten lang mittels eines Hämatokritrotors

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bei einer niedrigen Temperatur zentrifugiert. Auf diese Weise wurde die Bestimmung des Aszitokritwertes durchgeführt, d. h., das Verhältnis der in der Aszitesflüssigkeit vorhandenen Zellen, die dem Hämatokritwert in der Hämatologie entsprechen. Das Produkt des Wertes mit dem Volumen der A.szitesf lüssigkeit gibt das in der Aszitesflüssigkeit vorhandene Volumen der Zellen. Dies wird als das gesamte Zellvolumen (total packed cell volume, TPCV) bezeichnet. Bei der Überprüfung betrug das gesamte Volumen der Aszitesflüssigkeit 6 bis 10 ml und das TPCV 1,6 bis 2,5 ml.

Die Wirkung auf die Geschwulst wurde als wirkungslos ( - ) angesehen, wenn das TPCV Verhältnis der behandelten zu den Prüfungsmedien (P/C) 100 bis 66% betrug. Die Wirkung wurde als Plus 1 (+)bezeichnet, wenn sie 65 bis 41%, Plus 2 (++), wenn sie 40 bis 11% und Plus 3 (+++), wenn sie 10 bis 0% betrug. Die Versuchsergebnisse für die erfindungsgemäßen Stoffe sind im Vergleich zu den bekannten Stoffen in Tabelle III dargestellt.

5. Ergebnisse

Es wurden mit den Benzol und Äthylacetatfraktionen der Zedrachrinde als auch mit den Fraktionen der Zedrachblätter überhaupt keine Wirkungen beobachtet. Andererseits wurden insbesondere mit den Methanol- und Äthanolfraktionen der Zedrachrinde"hohe Wirkungen beobachtet. Obwohl die Wirkungen unter den Wirkungen der wirksamen Prüfstoffe MMC, BLM, u.s.w., lagen, kann man sie als hoch genug ansehen, wenn man die wirksamen in der Fraktion enthaltenen Bestandteile betrachtet. Eine weitere Reinigung dieser Fraktionen zur Erzielung

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-ie--.. AS

reinerer Bestandteile würde zu gesteigerter Wirksamkeit führen. Die minimale wirksame Dosierung für die Methanolfraktion (1) wurde bei dem Dosierungs T/C Verhältnis in der Tabelle III zu etwa 30 mg/kg bestimmt.

Tabelle III Wirkung auf die Aszitesgeschwulst eines

Sarkoms 180	Rinde	Methanol (3)	Dosierung (mg/kg)	T/C Verhältnis
Teil d. Ze- Fraktion drachbaums (Beispiel Nr.)		Äthanol (4)	100	97,6
Benzol (1)			100	95,2
Benzol (4)		Blätter ^{Benzo1 (2)} Methanol (2)	100	96,8
fithylacetat (3)	MMC	20	94,8
Methanol (1)			84,8
	BLM	50	34,3 ++
	Prüfstoff ACD		32,2 ++
5-fu	100	4,8 +++
CYP		10,8 ++
		12,4 ++
	100	8,5 +++
100	14,8 ++
	18,5 ++
100 100	94,8 76,8
0,5	0 + + +
1,5	0 + + +
10	0 + + +
0,1	0 + + +
20	0 + + +
33	0 + + +
67	0 + + +

Test V (Wirkungen auf die feste Geschwulst eines Sarkom 180)

1. Vorbereitung des Versuchsmaterials

Das Versuchsmaterial wurde in der gleichen Weise wie bei dem Versuch IV Ziffer 1 vorbereitet.

2. Transplantation der festen Geschwulstzellen eines Sarkoms 180

Es wurde eine Zellensuspension mit 1 χ 10 Zellen pro ml in der gleichen Weise wie in Versuch IV Ziffer 2 vorbereitet. Es wurden 4 Wochen alte ICR Mäuse subkutan auf der Rückseite mit 0,1ml der Suspension mittels einer Spritze geimpft.

3. Verabreichung des Versuchsmaterials

Wie in Versuch IV Ziffer 3 wurden eine Gruppe von sechs Tieren für jede Konzentration jedes Versuchsmaterials verwendet.

4. Auswertverfahren

Das gewachsene Geschwulstgewebe wurde am 15. bis 21. Tag der Geschwulstzellentransplantation resektiert und gewogen. Zur Auswertung wurde ein Mittelwert der Gruppe von 6 Tieren genommen. Die Wirkung wurde auf Grundlage des Verhältnisses des mittleren Gewichts der behandelten Tiere zu dem der Kontrolltiere ausgewertet. Das mittlere Gewicht betrug 1,5 bis 3,5 g für die Kontrolltiere. Verhältnisse (T/C) von 100 bis 71% wurden als wirkungslos (-■) , von 70 bis 51% als

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Plus 1 (+), von 50 bis 21% als Plus 2 (++) und von
20 bis 0% als Plus 3 (+++) bezeichnet. Die Ergebnisse mit den erfindungsgemäßen Versuchsmaterialien und
den bekannten Mitteln . sind in Tabelle IV dargestellt.

Tabelle IV Wirkungen auf	Rinde	Methanol (3)	die feste	Geschwulst eines
Sarkoms 180		Äthanol (4)
Teil d. Ze- Fraktion drachbaums (Beispiel Nr.)			I Dosierung (mg/kg)	T/C Verhältnis
Benzol (1)		Blätter ^{Benzo1 {2)} Methanol (2)	100	86,4
	MMC		92,0
Benzol (4)		100	91,3
Äthylacetat (3)		100	94,2
Methanol (1)	BLM	20	105,4
			128,2
ALD	50	83,9 88,0
5-Fu	100	40,7 ++
CYP		65,0 +
	200	24,1 ++
100	50,8 +
100	68,2 +
	51,3 +
100 100	93,8 95,9
0,5	71 ,0
1,5	32,5 ++
	50,2 +
10	43,5 ++
	52,3 +
0,1	102,4
20	47,8 +
33	0 + + +
67	0 + + +

5. Ergebnisse

Die Methanolfraktionen der Zedrachrinde zeigt eine hohe Wirksamkeit,wohingegen mit den Benzol und Sthylacetatfraktionen der Zedrachrinde als auch mit den Fraktionen der Zedrachblätter überhaupt keine Wirkungen beobachtet wurden. Die minimale wirksame Dosis für die Methanolfraktion (1) beträgt von dem Dosierungs-/T/C Verhältnis ungefähr 65 mg/kg. Obwohl die Wirksamkeiten verglichen mit den wirksamen Prüfstoffen, wie z. B. MMC und BLM, niedrig sind, führt eine weitere Reinigung der erfindungsgemäßen Extrakte hinsichtlich der aktiven Bestandteile zu höheren Wirksamkeiten.

Akute Toxitität

Der LDc_n Wert für die Methanolfraktion betrug bei intraperitonealer Verabreichung bei männlichen ICR Mäusen von 19 bis 21 g 1100mg/kg Körpergewicht.

Beispiel 5

Es wurden 100 g trockene Zedrachrinde einem Liter Benzol zugegeben. Die Mischung wurde 5 Stunden lang hingestellt und in Abständen zur Durchführung der Extraktion geschüttelt. Die erhaltene Mischung wurde gefiltert und der Rückstand einem Liter Benzol zugegeben. Die Mischung wurde dann in der gleichen Weise wie oben behandelt. Die Benzolextraktion wurde insgesamt drei Mal wiederholt. Von den kombinierten Benzolextrakten wurde das Lösungsmittel auf einem Rotationsverdampfer entfernt, wodurch man 3,9 g eines Extrakts in pulveriger Form erhielt. Von dem so erhaltenen pulverigen Extrakt wurden 2,1 g

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in 1 Liter 10% Methanol gelöst und daraufhin sorgfältig mit 300 ml Amberlite XAD-2 gemischt. Die Mischung wurde in eine 3.0 χ 40 cm Säule eingegeben. Durch die Säule wurden nacheinander 10% wässeriges Methanol, 50% wässeriges Methanol und 100% Methanol gegeben. Jedes der EIuate wurde dann bis zur Trockenheit konzentriert. Man erhielt 0,81 g der 10% Methanolfraktion, 0,84 g der 50% Methanolfraktion und 0,22 g der 100% Methanolfraktion in entsprechend pulveriger Form.

Beispiel 6

Es wurden die gleichen Verfahrensschritte wie in Beispiel 5 wiederholt, mit der Ausnahme, daß statt einem Liter Methanol als Extraktionsmittel ein Liter Äthanol verwendet wurde. Man erhielt 0,69 g der 10% Methanolfraktion , 0.80 g der 50% Methanolfraktion und 0,33 g der 100% Methanolfraktion in entsprechender pulveriger Form.

Beispiel 7

Es wurden die gleichen Verfahrensschritte wie in Beispiel 5 wiederholt, mit der Ausnahme, daß statt einem Liter Benzol als Extraktionsmittel ein Liter Äthylacetat verwendet wurde. Man erhielt 0,78 g der 10% Methanolfraktion , 0,8 2 g der 50% Methanolfraktion und 0,24 g der 100% Methanolfraktion in entsprechender pulveriger Form.

Die in den Beispielen 5 bis 7 erzeugten Zedrachextrakte wurden hinsichtlich ihrer Wirkungen an L5178Y Zellen, Aszitesflüssigkeit eines Sarkom 180 und der festen Geschwulst entsprechend den in den Versuchen 2 bis 4 beschriebenen Verfahren untersucht.

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Die Ergebnisse sind in den Tabellen IV und VI angegeben.

Tabelle V Wirkung auf L-5178Y Zellen

Versuchsina terial

Beispiel Nr.
Beispiel 5

Beispiel 6
Beispiel 7

Methanolfraktion

10% MeOH 50% MeOH 100% MeOH 50% MeOH 50% MeOH

^ID

>100
16,5 67,5 35,0 18,0

Tabelle VI	Wirkungen auf	transplantierte Geschwülste	Dosierung T/C Ver- (mg/kg) (%) hält- nis	100,25 -
	eines Sarkoms	180 (Mäuse)	25	99,2
Art der Geschwulst	Beispiel Nr.	Methanol- fraktion	50	98,8
		10% MeOH	100 ·	77,5 38,0 ++
			25 50	7,9 +++
			100	102,5
Aszites- geschwulst	Beispiel 5	50% MeOH	25	99,8
			50	107,3
		100% MeOH	100	41,3 +
			50	10,2 +++
			100	40,2 ++
	Beispiel 6	50% MeOH	50	8,5 ++.+
			100
	Beispiel 7	50% MeOH

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Art der Geschwulst	Beispiel Nr.	Methanol- fraktion	MeOH	Dosierung (mg/kg)	T/C Ver- (%) hält- nis
		10%		25	101,3
				50	89,2
			MeOH	100	76,9
		50%	MeOH	25	63,6 +
feste Geschwulst	Beispiel 5	100%		50 100 25	60,7 + 37,5 ++ 99,9
				50	98,4
			MeOH	100	91 ,7
	Beispiel 6	50%		50	59,0 +
			MeOH	100	45, θ' + +
	Beispiel 7	50%		50	53,5 +
			100	41,2 ++

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Aus Tabelle V und VI sieht man, daß die 50% Methanolfraktion hohe antineoplastische Wirksamkeit besitzt. Der Extrakt hat eine minimal wirksame Dosierung von 30 mg/kg Körpergewicht bei Mäusen für die Aszitesgeschwulst und eine minimale wirksame Dosierung von .25 mg/kg Körpergewicht bei Mäusen für die feste Geschwulst. Die akute Toxititat in Form des LD^q Wertes bei männlichen Mäusen betrug 390mg/kg Körpergewicht bei intraperitonealer Verabreichung.

Ansatz Beipiel 1

Es wurden in 500 ml steriler 5% Glucoselösung zur Injektion 1000 mg von in Beispiel 1 hergestelltem Zedrachrindenextrakt suspendiert. Die Suspension wurde aseptisch in Violen in Mengen von 5 ml pro Viole aufgeteilt und gefriergetrocknet. Man erhielt einen Ansatz, bestehend aus 10 mg Zedrachrindenextrakt pro Viole. Zur Verwendung wird er in destilliertem Wasser zur Injektion suspendiert.

Ansatz . Beispiel 2

Es wurde ein Violenansatz in der gleichen Weise wie in dem obigen Beispiel vorbereitet. Es wurden 500 ml einer 0,5% Suspension von CMC J.P. in einer physiologischen Kochsalzlösung zur Injektion statt der 500 ml der 5% sterilen Glucoselösung zur Injektion verwendet. Zur Verwendung wurde zur Injektion eine Suspension in destilliertem Wasser verwendet.

Claims

Henket Kern, Feuer Sr Hfinzel .: "- '.. / Patentanwalt® Registered Representatives before the European Patent Office MöhlstraBe37 D-8000 München 80 Tel.: 089/982085-87 Telex: 0529802 hnkld Telegramme: ellipsoid 18. Aug. 1981 Terumo Corporation, 44-1, 2-chome, Hatagaya, Shibuya-ku Tokyo / Japan Zedrachrindenextrakt mit antineoplastischer Wirkung PATENTANSPRÜCHE

1. Zedrachrindenextrakt mit antineoplastischer Wirkung, dadurch gekennze ichnet, daß er durch Behandlung der Rinde des Zedrachbaums (Melia azadirachta) mit einem organischen Lösungsmittel mit einer Dielektrizitätskonstante von 10 oder weniger, und durch Extraktion des Rückstandes dieser Behandlung mittels eines hydrophilen organischen Lösungsmittels mit einer Dielektrizitätskonstante von 15 bis 35 erhalten wird.

2. Zedrachrindenextrakt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das organische Lösungsmittel mit einer Dielektrizitätskonstante von 10 oder weniger Benzol ist.

3. Zedrachrindenextrakt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das organische Lösungsmittel mit einer Dielektrizitätskonstanten von 10 oder weniger Äthylacetat ist.

4. Zedrachrindenextrakt nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das hydrophile organische Lösungsmittel mit einer Dielektrizitätskonstanten von 15 bis 35 Methanol ist.

5. Zedrachrindenextrakt nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das organische Lösungsmittel mit einer Dielektrizitätskonstanten von 15 bis 35 Äthanol ist.

6. Zedrachrindenextrakt, dadurch gekennzeichnet, daß er durch Behandlung der Rinde des Zedrachbaums (Melia azadirachta) mit einem organischen Lösungsmittel mit einer Dielektrizitätskonstante von 10 oder weniger, durch Extraktion des Rückstands dieser Behandlung mittels eines hydrophilen organischen Lösungsmittels mit einer Dielektrizitätskonstante von 15 bis 35, durch Entfernen des Lösungsmittels von dem Extrakt, durch Lösen des Rückstandes in einem niedrigen Alkohol, durch Inberührungbringen der sich ergebenden Lösung mit einem nicht ionischen Harz zur Absorptionschromatographie, durch Behandlung des Absorptionsharzes mit 1.0% wässerigen Methanol, durch darauffolgende Elution mit 30 bis 50%

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Methanollösung und durch Entfernen des Lösungsmittels aus dem Eluat erhalten wird.

7. Zedrachrindenextrakt nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das organische Lösungsmittel mit einer Dielektrizitätskonstanten von 10 oder weniger Benzol ist.

8, Zedrachrindenextrakt nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das organische Lösungsmittel mit einer Dielektrizitätskonstanten von 10 oder weniger Äthylacetat ist.

9, · Zedrachrindenextrakt nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das hydrophile organische Lösungsmittel mit einer Dielektrizitätskonstanten von 15 bis 35 Methanol ist.

10. Zedrachrindenextrakt nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das hydrophile organische Lösungsmittel mit einer Dielektrizitäts* konstanten von 15 bis 35 Äthanol ist.