DE3903983A1 - Neues, doppelt derivatisiertes polymer fuer die umkehrphasen-fluessigkeitschromatographie - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen, enthaltend quervernetzte Polymere von Styrol, alkyliertem Styrol und sulfoniertem Styrol, die als Säulenfüllmaterialien in der Flüssigkeitschromatographie, zum Beispiel in der modernen Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und verwandten Gebieten, geeignet sind.

Die chromatographische Trennung von bestimmten Verbindungen, insbesondere von einigen Verbindungen, die in wichtigen, physiologisch wirksamen Flüssigkeiten vorkommen, wie zum Beispiel Katecholaminen, Indolaminen und Metanephrinen bereitet nach wie vor große Schwierigkeiten. Obwohl Materialien auf Kieselgel-Basis als gebräuchliche Trennmaterialien für solche Trennungen wohlbekannt sind und eine Vielzahl von chemisch modifizierten Kieselgelen kommerziell erhältlich ist und auch verwendet wird, so sind Materialien auf Kieselgel-Basis dennoch nur in einem engen pH-Intervall stabil (J.R. Benson, D.J. Woo, Chrom. Sci. 22, 386-399 (1984). Dementsprechend erfordert die Auftrennung der genannten Verbindungen mit Säulenmaterialien auf Kieselgel-Basis größte Sorgfalt bei der Auswahl des geeigneten Eluens. Dies wiederum erfordert aber Vorkenntnisse von der unbekannten Probe.

Zum Beispiel werden zur Auftrennung der obengenannten physiologisch wirksame Substanzen unter Verwendung von Kieselgelmaterialien Ionenpaarreagenzien benötigt, üblicherweise Alkylsulfonsäuren. Weiterhin ist der angewandte Analysenprozeß auch empfindlich gegenüber Konzentrationsschwankungen.

Wegen der Bedeutsamkeit der genannten Verbindungsklasse besteht seit langem ein Bedürfnis nach solchen chromatographischen Füllmaterialien, die weniger empfindlich sind gegenüber Schwankungen, die im Zusammenhang mit der Probenvorbereitung auftreten.

Um diese und andere Nachteile zu beseitigen, wurde in der Fachwelt nach geeigneteren Materialien gesucht. Auf der einen Seite wurde die Verwendung von Materialien auf Polystyrolbasis untersucht. Bei diesen Materialien besteht ein Hauptnachteil gegenüber den Kieselgelmaterialien nicht, und zwar ist quervernetztes Polystyrol über den gesamten pH-Bereich stabil (D.P. Lee, J. Chromatogr. Sci. 20, 203-208 (1982); J.V. Dawkins et al., J. Chromatogr. 352, 157-167 (1986)). Die besagten Verbindungen besitzen jedoch keine unterschiedliche Affinität zu underivatisiertem, quervernetztem Polystyrol, so daß dieses Material trotz größerer Stabilität für die Trennung ungeeignet ist.

Vor kurzem sind von der Fa. Interaction (USA) Materialien entwickelt worden, bei denen durch Addition von langkettigen Alkylresten an quervernetztes Polystyrol das geschilderte inhärente Trennproblem nicht mehr auftritt (ACT-1 C-18 Polymer Column).

Da jedoch vor dieser Entwicklung lediglich die underivatisierten Polystyrole in der Umkehrphasen-HPLC verwendet wurden, waren die Analysen durch lange Retentionszeiten der gelösten Substanzen und durch Asymmetrien in der Form einzelner peaks charakterisiert. Dies ist vermutlich auf die hohe π-Elektronendichte der aromatischen Polymermatrix zurückzuführen.

Lange Retentionszeiten aufgrund der Verwendung von underivatisiertem Polystyrol als Säulenfüllmaterial sind für praktische Überlegungen unerwünscht, die Analyse einiger Verbindungen benötigt sogar Zeiten, die im Bereich von Stunden liegen. Bei einigen Anwendungen sind derartige Trennzeiten lediglich störend und das Material ist noch einsetzbar. Für andere Anwendungen hingegen ist die Wahl von underivatisiertem Polystyrol völlig unakzeptabel.

Wie die Ergebnisse bei der Verwendung des ACT-1 Polymers zeigen, scheint prinzipiell die Einführung von langen Alkylgruppen in die Polymermatrix die gelösten Substanzen von den π-Elektronen der Polymermatrix mit dem Effekt abzuschirmen, daß ihre Retentionszeiten verkürzt werden.

Die Polymerisation langkettiger Alkylstyrole ist bereits beschrieben (C.G. Overberger et al., J. Am. Chem. Soc. 75, 3326-3360 (1953); US 28 02 812), jedoch sind diese Materialien nicht quervernetzt. Aus diesem Grund können sie nicht als feste Trägermaterialien in HPLC-Säulen oder anderen vergleichbaren Vorrichtungen verwendet werden, da sie sich in vielen organischen Lösungsmitteln, die normalerweise in der Flüssigkeitschromatographie eingesetzt werden, auflösen.

Wenn auch das ACT-1 Polymer verbesserte Eigenschaften gegenüber underivatisiertem Polystyrol aufweist, so bleiben dennoch Probleme bei der Anwendung solcher Materialien. Insbesondere sind die Retentionszeiten im Falle bestimmter Substanzklassen wie Katecholaminen, Indolaminen und Metanephrinen zu kurz, um sie unter Bedingungen zu trennen, die ohne den Einsatz von Ionenpaarreagenzien noch akzeptabel sind.

Es besteht somit ein Bedürfnis nach Zusammensetzungen, geeignet als Säulenfüllmaterial für die Flüssigkeitschromatographie, welche in der Lage sind, Verbindungen wie Katecholamine, Indolamine und Metanephrine voneinander zu trennen, welche chemische Stabilität bei extremen pH-Werten aufweisen, welche mechanisch stabil genug sind, um den bei der HPLC üblichen hohen Drucken standzuhalten, welche nicht die unakzeptabel langen Retentionszeiten, wie im Falle des underivatisierten Polystyrols, erfordern oder gar unannehmbar lange Retentionszeiten, wie im Falle von sulfoniertem Polystyrol und welche nicht den Einsatz von Ionenpaarreagenzien für eine erfolgreiche Trennung notwendig machen.

Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen gelöst. Sie basieren auf Polystyrol, bei dem ein Teil der aromatischen Copolymermatrix eine langkettige Alkylgruppe über eine C-C-Bindung an die Matrix kovalent gebunden enthält, und bei dem ein Teil der Matrix sulfoniert ist. Ähnliche Materialien sind bereits bekannt. Es handelt sich jedoch entweder um Kationenaustauscher in Form von Latexsystemen (EP 1 34 099) oder um Materialien mit kurzkettigen Alkylsubstituenten, wie Methyl oder Ethyl und darüber hinaus teilweise komplexen Gegenionen (EP 1 04 912, JP 6 01 96 664 und JP 5 81 54 655) zur Trennung von Zuckern oder Aminosäuren.

Gegenstand der Erfindung sind somit Zusammensetzungen auf Basis von quervernetztem Polystyrol mit einem Anteil an sulfoniertem Polystyrol und alkyliertem Polystyrol, wobei Alkylketten in Form von -(CH₂) _n -CH₃ mit n gleich 7 bis 23 vorliegen.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, in dem man quervernetztes Polystyrol zuerst alkyliert und dann sulfoniert.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen als Säulenfüllmaterial für die Flüssigkeitschromatographie.

Gegenstand der Erfindung sind schließlich Chromatographiesäulen, die die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen enthalten.

Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen ergeben Säulenfüllmaterialien mit einer Summe von einzigartigen und erwünschten charakteristischen Eigenschaften, wie sie in ihrer Kombination bisher nicht erhältlich waren. Mit den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können Katecholamine, Indolamine, Metanephrine und andere Verbindungen getrennt werden. Sie besitzen hohe chemische Stabilität und weisen eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber Schwankungen auf, die sich im Zusammenhang mit der Probenvorbereitung ergeben. Weiterhin wird eine deutliche Verbesserung bezüglich der Retentionszeiten und der Peaksymmetrien erzielt. Darüber hinaus werden keine Ionenpaarreagenzien benötigt, die Trennung der genannten Spezies gelingt unter Verwendung einfacherer Eluentien.

Die Anbindung von Alkylketten mit Kettenlängen von 8 Kohlenstoffatomen und mehr, verbunden mit einem effizienten Grad an Sulfonierung an noch verbleibenden Resten des Polymergerüsts ist erforderlich, um besagte vorteilhafte Eigenschaften zu erzielen. Insbesondere ergibt die Anbindung von Alkylketten der Form -(CH₂)₁₇-CH₃ (C18) Produkte mit speziell erwünschten Eigenschaften.

Für die Umkehrphasen-HPLC kann somit ein erfindungsgemäßes Polystyrol-Füllmaterial hergestellt werden, in dem eine Kombination von Alkylketten mit Längen von 8 C-Atomen oder mehr, mit sulfonierten Reaktionsstellen der aromatischen Polymermatrix gewählt wird.

Langkettige Alkylgruppen bewirken vermutlich aufgrund der sterischen Verhältnisse eine effektive Abschirmung der gelösten Substanzen gegen die hohe π-Elektronendichte der Aromaten in der Polymermatrix, woraus akzeptablere Retentionszeiten als im Falle von underivatisiertem oder partiell abgeschirmtem Polystyrol resultieren.

Die modifizierten Polystyrole der vorliegenden Erfindung sind Feststoffe und durch Quervernetzung charakterisiert. Sie können in Form eines makroporösen, mikroporösen oder makroreticularen Substrats ausgestaltet sein, je nach dem, für welchen Zweck die Chromatographiesäule verwendet werden soll. Sie bestehen zum überwiegenden Teil aus synthetischem Harz, welches durch Addition von geradkettigen Alkylgruppen an seiner zugänglichen Oberfläche und durch Addition von Sulfonat an mindestens einem Teil der restlichen Oberfläche modifiziert ist. Es ist nicht notwendig, daß das gesamte Polystyrol, oder etwa der überwiegende Teil davon, alkyliert oder sulfoniert ist. Es ist lediglich ein gewisser Alkylierungs- und Sulfonierungsgrad erforderlich. Die restlichen, noch zur Reaktion befähigten Positionen, sofern welche übriggeblieben sind, bleiben frei. Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Zusammensetzungen besitzen einen Anteil an Polystyrol von 0 bis 94 Gew.-%, einen Anteil an quervernetzender Komponente von 5 bis 90 Gew.-% sowie mindestens 1 Gew.-% an alkyliertem Polystyrol und mindestens 0,1 Gew.-% an sulfoniertem Polystyrol.

Das feste, quervernetzte Polystyrol kann nach herkömmlichen, dem Fachmann bekannten Methoden, aus Styrol und einem oder mehreren geeigneten Quervernetzern z. B. aus der Gruppe der polyethylenisch ungesättigten Verbindungen wie Divinylnaphthalin, Divinylbenzol, Trivinylbenzol, 1,4-Butadien und analogen Verbindungen hergestellt werden. Alternativ können auch geeignete, kommerziell erhältliche Materialien, wie PRP-1 (Hamilton Company), XAD-1 (Rohm & Haas) und andere verwendet werden.

Die die Erfindung charakterisierenden Polystyrolcopolymere können in jeder gewünschten Form ausgestaltet sein, insbesondere bevorzugt als fein verteilte, synthetische Harzteilchen, insbesondere in Form von etwa gleich großen Kügelchen.

Im allgemeinen werden die erfindungsgemäßen Materialien vorzugsweise so hergestellt, daß die Polymere zunächst alkyliert und dann sulfoniert werden.

Wird zuerst alkyliert, so können zwei grundsätzliche Synthesewege, die zum alkylierten, quervernetzten Polystyrol führen, eingeschlagen werden. Der eine besteht in der Alkylierung eines bereits fertigen quervernetzten Polymers, wie weiter unten beschrieben wird, der andere Weg wäre die Copolymerisation von p-Alkylstyrol, wie in US 28 02 812 beschrieben, mit Styrol und einem oder mehreren Quervernetzern, und zwar nach Verfahren, wie sie dem Fachmann geläufig sind.

Im folgenden werden Synthesen zur Derivatisierung des Copolymers nach dessen Bildung und Quervernetzung beschrieben.

(1) Die Friedel-Crafts-Alkylierung kann zur direkten Einführung von Alkylgruppen in das quervernetzte Polystyrol durchgeführt werden. Diese Methode ist in zahlreichen Lehrbüchern der Organischen Chemie, beispielsweise von S.R. Sandler und W. Karo in "Organic Functional Group Preparations", Academic Press (1958), beschrieben. Das allgemeine Reaktionsschema lautet:

(2) Ein quervernetztes Polystyrol kann nach bekannten Methoden chlormethyliert werden, so zum Beispiel durch Reaktion des Copolymers mit Chlormethylmethylether (CMME) in Gegenwart eines Katalysators, beispielsweise AlCl₃ oder ZnCl₂, wie in US 25 91 573 beschrieben, oder mittels Friedel-Crafts-Alkylierung mit Chlormethylmethylether in Gegenwart von Zinnchlorid (K.W. Pepper et al., J. Chem. Soc. 4097 (1953) und abschließender Reaktion des chlormethylierten Polystyrols mit Alkyllithium in Tetrahydrofuran (THF). Ein Beispiel dafür die folgende Reaktion:

(3) Alkylbromide reagieren mit Magnesium zu den sogenannten Grignard-Reagenzien. Nach untenstehendem Schema kann dann das Grignard-Reagens mit dem chlormethylierten, quervernetzten Polystyrol (vgl. (2)) das alkylierte Polystyrol bilden.

(4) Lithiierung (Metallierung) von quervernetztem Polystyrol und nachfolgende Alkylierung mit einem Alkylbromid kann ebenfalls durchgeführt werden. Die Lithiierung von Polystyrol mit n-Butyllithium in Gegenwart von N,N,N′,N′-Tetramethylethylendiamin (TMEDA) ist von M.J. Farrall und J.M.J. Frechet in J. Org. Chem. 41, 3877-3882 (1976) als effektive Darstellungsmethode von lithiiertem Polystyrol beschrieben. Das lithiierte Polystyrol wird dann zur Darstellung des alkylierten Polystyrols mit einem entsprechenden Alkylbromid umgesetzt. Als Beispiel hierfür gilt das folgende Schema:

Die vorliegende Erfindung kann in für den Fachmann geläufiger Weise modifiziert werden. Zum Beispiel können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen auch auf dem Gebiet der chemischen Analyse, chemischen Verfahrenstechnik, auf medizinischen oder anderen wissenschaftlichen Gebieten Verwendung finden, die hier nicht näher bezeichnet, dem Fachmann jedoch geläufig sind.

Zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung dienen die folgenden Beispiele. Sie dienen lediglich zur Veranschaulichung und stellen somit keine Begrenzung des allgemeinen Erfindungsgedankens dar.

Beispiel 1 Synthese von alkyliertem (C 18) und sulfoniertem Polystyrol Alkylierung

Die folgende Reaktion wird an mit Divinylbenzol quervernetztem Polystyrol (makroporöse Kügelchen, mittlerer Durchmesser 5 µm, MEX-100, hergestellt bei Interaction Chemicals Inc.) ausgeführt. Unter Stickstoff werden etwa 3 g der gereinigten und getrockneten Kügelchen in einen mit Thermometer, Rückflußkühler und Septum versehenen 200-ml-Dreihalskolben gegeben. Dazu werden unter Rühren (Magnetrührer) 60 ml Cyclohexan (Baker) und 5 ml TMEDA (Fisher Scientific) gegeben. Nach zweistündigem Rühren bei Raumtemperatur unter Stickstoff wird die Lösung für etwa 15 min mit Helium entgast. Anschließend werden 15 ml einer Lösung von n-Butyllithium in Hexan (1,5 molar, Aldrich) rasch hinzugespritzt. Die Lösung färbt sich rötlichbraun und wird 12 h weitergerührt. Anschließend wird eine Lösung von Octadecylbromid in Cyclohexan (50%ig, 35 ml, Aldrich) hinzugespritzt. Nach einstündigem Rühren bei 70°C wird mit Wasser versetzt und das Produkt abfiltriert. Das so erhaltene Polymer wird mit Toluol, Aceton und Methanol gewaschen und danach an der Luft getrocknet.

Sulfonierung

Pro g des so erhaltenen Polymers wird das Produkt mit einer Lösung von Schwefelsäure in Wasser (50 Vol.-%, 10 ml) versetzt. Das Gemisch wird in einem Kolben 2 h gerührt (Magnetrührer) und anschließend in das vierfache Volumen Eiswasser gegossen. Die Reaktionsmischung wird abfiltriert (Whatman Filterpapier Nr. 50), mit dem vierfachen Volumen an heißem Wasser gewaschen und nochmals filtriert. Das Waschen und Filtrieren wird noch zweimal wiederholt und anschließend mit dem vierfachen Volumen an Methanol insgesamt dreimal durchgeführt. Abschließend wird der Filterkuchen bei 50°C vakuumgetrocknet.

Beispiel 2 Synthese von alkyliertem (C 12) und sulfoniertem Polystyrol

Unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 1 werden 1,54 g des mit Divinylbenzol quervernetzten Polystyrols (Kügelchen wie Bsp. 1) mit 30,9 ml Cyclohexan und 2,6 ml TMEDA suspendiert und gerührt. Die Mischung wird auf 70°C erwärmt und 18 h unter Stickstoff gehalten. Zu dieser Mischung wird eine Lösung von n-Butyllithium in Cyclohexan (1,5 molar, 12,3 ml) zugespritzt und nach zweistündigem Rühren bei 70°C eine Lösung von Dodecylbromid in Cyclohexan (50%, 39 ml). Abschließend wird noch 1 h bei 70°C weitergerührt und das Reaktionsgemisch gefiltert, mit Toluol, Aceton und Methanol gewaschen sowie an der Luft getrocknet. Die Sulfonierung wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt.

Beispiel 3 Synthese von alkyliertem (C 8) und sulfoniertem Polystyrol Alkylierung

Die Reaktion wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit folgenden Abweichungen durchgeführt.

Etwa 1,39 g der makroporösen Polymerkügelchen werden mit 28 ml Cyclohexan und 2,3 ml TMEDA versetzt. Die Mischung wird auf 70°C erwärmt und 18 h unter Stickstoff gerührt. Zu der Mischung werden 11,1 ml der n-Butyllithium-Lösung rasch hinzugespritzt, worauf unmittelbar eine Rotfärbung eintritt. Nach 2stündigem Rühren bei 70°C wird eine Lösung von Octylbromid in Cyclohexan (50%ig, 25,6 ml) zugespritzt, worauf heftiges Refluxieren und Braunfärbung einsetzt. Anschließend wird 1 h bei 70°C weitergerührt und die Mischung zu 500 ml destilliertem Wasser gegeben. Abschließend wird mit Toluol, Aceton und Methanol gewaschen und an der Luft getrocknet.

Sulfonierung

Die Sulfonierung wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt.

Vergleichende Testergebnisse

Die Abbildungen Fig. 1, 2 und 3 zeigen die Ergebnisse von drei Trennungen einer Probe, welche Tyrosinmetabolite enthält, einschließlich die Verbindungen Epinephrin (EPI), Dopamin (DA) und Norepinephrin (NE). Als Markersubstanz (für relative Lage und Amplitude) wurde der Probe Dihydroxybenzylamin (DHBA) zugegeben.

Eine HPLC-Säule (0,46 cm × 25 cm) wird mit einem Säulenfüllmaterial nach Beispiel 1 in herkömmlicher Weise mittels 30%igem wäßrigen Methanol als Eluens gepackt.

Zum Vergleich wird eine Säule mit alkyliertem, aber nicht sulfoniertem Polystyrol und eine mit sulfoniertem, aber nicht alkyliertem Polystyrol gepackt. Alle Säulen sind gleich dimensioniert. Die Durchflußgeschwindigkeit beträgt jeweils 0,8 ml/min. Der volle Schreiberausschlag liegt in allen Chromatogrammen bei 50 nA. Jede der drei Säulen wird mit einer Probe obengenannter Zusammensetzung beschickt. Die eluierten Species werden elektronisch detektiert. Das verwendete Eluens enthält 0,25 M NH₄OAc, 0,125 M (NH₄)₂SO₄ und 20% CH₃CN (Vol.-%).

Die erste Analyse ist in Fig. 1 dargestellt und bezieht sich auf das sulfonierte aber nicht alkylierte, makroporöse quervernetzte Polystyrol (11 µm durchschnittliche Teilchengröße).

Die zweite Analyse ist in Fig. 2 dargestellt und bezieht sich auf das alkylierte aber nicht sulfonierte, makroporöse quervernetzte Polystyrol (ACT-1 C-18).

Die dritte Analyse ist in Fig. 3 dargestellt und bezieht sich auf das erfindungsgemäße Material aus Beispiel 1.

Wie Fig. 1 zeigt, sind die Retentionszeiten im Falle des sulfonierten Polystyrols unakzeptabel lang (etwa 25 min für NE und etwa 82 min für DA).

Fig. 2 zeigt den Effekt der bloßen Alkylierung (Beispiel 1, ohne Sulfonierung). Es ist keine Auftrennung der einzelnen Species zu erkennen, die Substanzen werden praktisch gleichzeitig eluiert.

Fig. 3 dagegen zeigt eine enorme Verbesserung bezüglich der Retentionszeiten, die mit dem erfindungsgemäßen Material erzielt werden (etwa 7 min für NE und etwa 15 min für DA).

Claims (4)

1. Zusammensetzungen auf Basis von quervernetztem Polystyrol mit einem Anteil an sulfoniertem Polystyrol und alkyliertem Polystyrol, dadurch gekennzeichnet, daß die Alkylketten des alkylierten Polystyrols in Form von -(CH₂) _n -CH₃ mit n gleich 7 bis 23 vorliegen.

2. Verfahren zur Herstellung von Zusammensetzungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man quervernetztes Polystyrol zuerst alkyliert und dann sulfoniert.

3. Verwendung von Zusammensetzungen nach Anspruch 1 als Säulenfüllmaterial für die Flüssigkeitschromatographie.

4. Chromatographiesäule, enthaltend Zusammensetzungen nach Anspruch 1.