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Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Entfernen
von Pyrogenen aus einer pyrogenhaltigen Lösung, um dadurch eine
pyrogenfreie Lösung herzustellen.
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Pyrogenfreie Lösungen werden für medizinische Zwecke verwendet,
zum Beispiel als Dialysat zum Behandeln derjenigen, welche an
Nierenversagen leiden, als Ersatzflüssigkeit für eine
künstliche Niere vom Filtrationstyp, als Verdünnungsmittel für ein
Instillationsmedikament mit einer hohen Konzentration zur
Verwendung am Krankenbett, zum Waschen verschiedener medizinischer
Instrumente, bei der Herstellung von Arzneimitteln wie etwa
gereinigtem Wasser zur Injektion und zum Waschen von
Injektionsgefäßen.
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Zur Verabreichung über das Blut ist es notwendig, Pyrogene aus
einer wäßrigen, einen Wirkstoff (Wirkstoffe) enthaltenden
Lösung zu entfernen. Beispiele einer derartigen wäßrigen Lösung
schließen diejenigen verschiedener Wirkstoffe ein, welche einem
Pyrogentest gemäß der Pharmakopöe von Japan unterzogen werden
sollten, zum Beispiel Fruktoseinjektion, physiologische
Kochsalzlösung, Dextran 40-Injektion, Glukoseinjektion,
Ringer-Lösung und Natriumcitrat-Injektion zur Transfusion.
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Ein Pyrogen, insbesondere ein Endotoxin, welches ein typisches
Beispiel davon ist, stammt von der Zellwand eines gramnegativen
Bakteriums und umfaßt Lipopolysaccharide. Das Molekulargewicht
des Lipopolysccharids schwankt in Abhängigkeit von seiner
bakteriellen Herkunft von einigen Tausend bis zu einigen
Zehntausend. Von Lipopolysacchariden wird jedoch angenommen, daß sie
als Assoziat vorliegen, welches in wäßriger Lösung ein
relatives Molekulargewicht von einigen Hunderttausend bis Millionen
besitzt. Selbst wenn es in einer Ultramikromenge in den Körper
eindringt, löst es schweres Fieber aus und verursacht manchmal
den Tod.
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Es ist kürzlich offenbart worden, daß Lipid A, welches ein
Bestandteil eines Endotoxins ist und ein Molekulargewicht von
ungefähr 2000 besitzt, ebenfalls pyrogen ist.
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Die Pharmakopöe von Japan verpflichtet uns, einen Pyrogentest
an Kaninchen auszuführen, um Endotoxine nachzuweisen. Da jeder
herkömmliche Pyrogentest ein beschwerliches Verfahren und einen
langen Zeitraum erfordert, wird ein Nachweisreagenz vermarktet,
durch welches Endotoxine leicht innerhalb eines kurzen
Zeitraums nachgewiesen werden können. Dieses Reagens nützt eine
Reaktion zwischen einem Endotoxin und Limulus-Blutzellen aus,
wodurch die Blutzellen koagulieren. Weiter ist ein
kolorimetrisches Verfahren mit der Verwendung eines Synthetischen
Substrats begründet worden, welches auf dem Reaktionsmechanismus
zwischen einem Endotoxin und Limulus-Blutzellen beruht.
Kürzlich ist die Nachweisgrenze dieses kolorimetrischen Verfahrens
von der Größenordnung von ng/ml zu der von pg/ml weiter
verbessert worden. Auf diese Weise ist es jetzt möglich, eine
Ultramikromenge Endotoxine nachzuweisen.
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Bekannte Verfahren zum Herstellen einer pyrogenfreien Lösung
aus einer pyrogenhaltigen Vorratslösung schließen diejenigen
ein, in welchen eine osmotische Umkehrmembran oder eine
Ultrafiltrationsmembran eingesetzt wird. Eine osmotische
Umkehrmembran, welche bei der Entsalzung eingesetzt wird, besitzt ein
Ausschlußmolekulargewicht von 500 oder darunter. Auf diese
Weise ermöglicht sie es, sowohl Lipopolysaccharide, welche
Endotoxine bilden, als auch Lipid A zu entfernen, welches deren
Endbestandteil ist. Die osmotische Umkehrmembran sollte jedoch
unter erhöhtem Druck betrieben werden, was ein beträchtliches
Auslaufen der Vorratslösung aus einem beschädigten Teil der
Membran hervorruft und eine große Energiemenge erfordert.
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Auf der anderen Seite kann eine Ultrafiltrationsmembran unter
niedrigerem Druck betrieben werden und erfordert somit weniger
Energie, als es die osmotische Umkehrmembran tut. Erstere ist
jedoch in der Fähigkeit, Endotoxine zu entfernen, schlechter
als letztere. Insbesondere können die Lipopolysaccharide mit
einem hohen Molekulargewicht mittels einer
Ultrafiltrationsmembran mit einem Ausschlußmolekulargewicht von zum Beispiel 30000
entfernt werden. Lipid A, welches der Endbestandteil der
Lipo-Polysaccharide ist und ein niedrigeres Molekulargewicht
besitzt, würde jedoch hindurchwandern. Es ist daher notwendig,
eine Ultrafiltrationsmembran mit einem
Ausschlußmolekulargewicht von 5000 oder darunter zu verwenden, obwohl die
Durchgangsgeschwindigkeit geringer ist als diejenige einer
Ultrafiltrationsmembran mit einer Fraktionierung oder einem
Ausschlußmolekulargewicht von 30000. Außerdem wird eine
Ultrafiltrationsmembran bei langer Betriebsdauer beschädigt, was das
Auslaufen eines Teils der auf dessen gesamter Oberfläche
angesammelten Endotoxine aus dem zerstörten Teil zur Folge hätte.
Um diese Nachteile zu überwinden, wird gebräuchlicherweise eine
Zweistufenfiltration eingesetzt. Bei diesem Verfahren ist der
Wirkungsgrad der Entfernung im ersten Schritt hoch, derjenige
im zweiten Schritt ist jedoch niedrig.
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Der der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Gegenstand ist
es daher, ein Verfahren zum Entfernen von Pyrogenen aus einer
pyrogenhaltigen Lösung zur Verfügung zu stellen, welches nicht
von den vorstehend beschriebenen Problemen begleitet wird und
welches ohne Einschränkung auf jeden Wirkstoff zur
Verabreichung über das Blut, aus welchem Pyrogene während des
Verfahrens dessen Herstellung entfernt werden sollen, angewandt
werden kann.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung wird dieses Ziel mit einem
Verfahren zum Entfernen von Pyrogenen aus einer Lösung
erreicht, welches die Schritte des
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(a) Behandelns einer Pyrogene enthaltenden Lösung mit einer
Ultrafiltrationsmembran mit einem Ausschlußmolekulargewicht von
10000 bis 200000, einer großen Porengröße und einem hohen
Durchlässigkeitswert für Wasser unter Entfernen von Pyrogenen
mit Molekulargewichten von einigen Zehntausend bis Millionen zu
entfernen und anschließend
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(b) Behandelns der Lösung mit einem Pyrogenadsorptionsmittel,
unter Entfernen von Endotoxinen mit Molekulargewichten von
mehreren Zehntausend oder darunter und Lipid A mit
Molekulargewichten von etwa 2000 umfaßt.
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Fig. 1 bis 3 sind jeweils eine schematische Ansicht einer
bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden
Erfindung. Fig. 4 bis 7 sind jeweils eine schematische Ansicht
eines Beispiels des Systems der vorliegenden Erfindung. Fig. 8
und 9 sind jeweils eine schematische Ansicht eines Beispiels
des Systems der vorliegenden Erfindung, in welchem zwei UF-
Membranen eingesetzt werden.
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In den Abbildungen stellt a eine Vorratslösung dar, b und e
stellen jeweils eine Pumpe dar, c stellt ein Ultrafiltrations
membranmodul dar und d stellt ein Absorptionsmittel dar.
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A stellt eine Vorratslösung dar, B stellt eine Regenerierlösung
dar, C stellt eine Produktlösung dar, D ist ein
Regenerierungsabfall, E ist ein Abfall. Die behandelte Flüssigkeit wird von
einer Vorlage aufgenommen.
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1 stellt einen Vorratslösungstank dar, 2 stellt einen
Regenerierlösungstank dar, 3 stellt eine
Pyrogenadsorptionsmittelsäule dar, 4 stellt einen Produktlösungstank dar, 5 stellt eine
Ultrafiltrationsmembran dar, 5' stellt eine weitere
Ultrafiltrationsmembran dar, 6 stellt eine Pumpe dar, 6' stellt eine
weitere Pumpe dar, 7 stellt einen Durchflußmesser dar und 11
bis 20 stellen jeweils ein Ventil dar.
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Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist darin vorteilhaft,
daß Endotoxine mit hohen Molekulargewichten durch das
Pyrogenadsorptionsmittel entfernt werden können, wenn die
Ultrafiltrationsmembran nach langem Betrieb beschädigt wird, und daß das
Lipid A mit einem Molekulargewicht von ungefähr 2000 während
eines ausgedehnten Betriebs ebenfalls beständig entfernt werden
kann. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist weiter bei
der Entfernung von Pyrogenen aus einer wäßrigen Lösung eines
nützlichen Materials mit niedrigem Molekulargewicht, z.B.
einige Tausend Dalton oder darunter, welches dazu befähigt ist,
durch eine Ultrafiltrationsmembran hindurchzugehen, benutzbar.
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In diesem Fall besitzt die einzusetzende
Ultrafiltrationsmembran vorzugsweise ein Ausschlußmolekulargewicht von 10000 bis
200000 und eine durchschnittliche Porengröße von 2x10&supmin;&sup9; m bis
10&supmin;&sup7;
m (20 Å bis 0,1 um), noch bevorzugter 3x10&supmin;&sup9; m bis 2x10&supmin;&sup8; m
(30 Å bis 200 Å).
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Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist weiter bei der
Entfernung von Pyrogenen aus einer wäßrigen Lösung benutzbar,
welche einen Wirkstoff zur Verabreichung über das Blut enthält.
Genauer werden Endotoxine mit höheren Molekulargewichten als
dem des Wirkstoffs, wie etwa assoziierte Lipopolysaccharide und
Bakterien, aus welchen die Endotoxine hervorgehen, durch
Verwenden einer Membran mit einer großen Porengröße, durch welche
der Wirkstoff leicht hindurchgehen kann, entfernt. Anschließend
werden Endotoxine mit niedrigeren Molekulargewichten und Lipid
A mit einem Pyrogenadsorptionsmittel selektiv entfernt. Auf
diese Weise können alle in der Wirkstofflösung enthaltenen
Pyrogene wirksam entfernt werden. Die in dem vorliegenden
Verfahren zu verwendende Membran sollte solch eine Porengröße
haben, daß der Wirkstoff dadurch leicht hindurchgehen kann,
während Verunreinigungen einschließlich Endotoxinen, welche
größer sind als der Wirkstoff, und Mikroorganismen dadurch
entfernt werden können.
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Beispiele des Wirkstoffs schließen Blutzubereitungen,
Enzymzubereitungen, rekombinierte Proteine, Peptide, Hormone und
Polysaccharide für Wirkstoffe ein. Weiter können verschiedene
Injektionen und Infusionen, wie etwa eine Dextraninjektion,
Fruktoseinjektion, Glukoseinjektion, Ringerlösungs- und
Natriumcitratinjektion zur Transfusion auf die vorstehend angeführte
Weise behandelt werden.
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Wenn der Wirkstoff eine Verbindung mit einem Molekulargewicht
von 1000000 Dalton oder darüber ist, wie etwa Hyaluronsäure,
kann eine UF-Membran mit einem Ausschlußmolekulargewicht (was
die Molekulargewichtsobergrenze einer Probe bedeutet, welche
dazu befähigt ist, durch die Membrane hindurchzugehen; dasselbe
trifft nachfolgend zu) von 1000000 oder darüber eingesetzt
werden. Wenn der Wirkstoff eine Verbindung mit einem
Molekulargewicht von 100000 bis 1000000 Dalton ist, wie etwa
Immunoglobulin, kann eine UF-Membran mit einem
Fraktionierungsmolekulargewicht von 1000000 oder darüber eingesetzt werden.
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Wenn der Wirkstoff eine Verbindung mit einem Molekulargewicht
von 100000 Dalton oder darunter ist, wie etwa Albumin, kann
eine Membrane mit einem Ausschlußmolekulargewicht von 100000
oder darüber eingesetzt werden. Wenn der Wirkstoff ein
Molekulargewicht Von 10000 Dalton oder darunter besitzt, kann eine
Membran mit einem Ausschlußmolekulargewicht von 10000 oder
darüber verwendet werden.
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Weiter kann eine Kombination von zwei oder mehr UF-Membranen
eingesetzt werden. Fig. 8 und 9 zeigen jeweils ein System zum
Entfernen von Pyrogenen unter Verwendung zweier UF-Membranen.
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Die beiden UF-Membranen in dem System von Fig. 8 sind in
umgekehrter Reihenfolge zu denjenigen von Fig. 9 angebracht. Jedes
System kann in Abhängigkeit von dem darin enthaltenen Wirkstoff
und den Pyrogenen ausgewählt werden.
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Die in diesen Systemen verwendete UF-1 ist eine Membrane mit
einem Fraktionierungsmolekulargewicht, welches es einer Probe
ermöglicht, wie vorstehend beschrieben dadurch hindurchzugehen.
Das optimale Fraktionierungsmolekulargewicht sollte in
Abhängigkeit von dem Molekulargewicht der zu behandelnden Probe
bestimmt werden.
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Die UF-2 ist eine Membrane mit einem
Fraktionierungsmolekulargewicht, welches die Probe daran hindert, dadurch
hindurchzugehen. Wenn die Probe zum Beispiel eine Verbindung mit einem
Molekulargewicht von 1000000 Dalton oder darüber ist, wie etwa
Hyaluronsäure, ist es möglich, eine UF-2 mit einem
Ausschlußmolekulargewicht von 1000000 oder darunter zu verwenden. Wenn die
Probe eine Verbindung mit einem Molekulargewicht von 100000 bis
1000000 Dalton ist, wie etwa Immunoglobulin, ist es möglich,
eine UF-2 mit einem Ausschlußmolekulargewicht von 100000 oder
darunter zu verwenden. Wenn die Probe eine Verbindung mit einem
Molekulargewicht von 10000 bis 100000 Dalton ist, wie etwa
Albumin, ist es möglich, eine UF-2 mit einem
Ausschlußmolekulargewicht von 10000 oder darunter zu verwenden. Wenn die Probe
eine Verbindung mit einem Molekulargewicht von 2000 bis 10000
Dalton ist, ist es möglich, eine UF-2 mit einem
Ausschlußmolekulargewicht
von 2000 oder darunter zu verwenden.
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Somit sollte die UF-2 mit dem optimalen
Ausschlußmolekulargewicht ähnlich wie im Fall der UF-1 in Abhängigkeit von der
Probe ausgewählt werden.
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Wie in Fig. 8 und 9 gezeigt, können sich in Abhängigkeit von
der Probe zwei Mikrofiltrationsmembranen (MF-Membranen) vor
und/oder nach den UF-Membranen befinden, obwohl diese
MF-Membranen in diesen Systemen nicht immer erforderlich sind. Die
MF-1 wird eingesetzt, um Makromoleküle einschließlich
Bakterienzellen, wie etwa gramnegative, welche für die Behandlung
mit den UF-Membranen ein Hindernis darstellen, zu entfernen,
während die MF-2 zum Entfernen unbedeutender
Pyrogenadsorptionsmittelfragmente (P.A.f.) eingesetzt wird. Es ist
bevorzugt, daß jede dieser MF-1- und MF-2-Membranen eine Porengröße
von ungefähr 0,2 um hat.
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Die in Fig. 8 und 9 verwendeten Symbole LS, LM und LL bedeuten
jeweils die Größe eines Pyrogenassoziats. Ein Pyrogen bildet im
allgemeinen in Lösung Assoziate mit einer bestimmten
Molekulargewichtsverteilung. Wenn es mit einer Membran behandelt wird,
wird es daher in Fraktionen aus Assoziaten mit einem zu
einander unterschiedlichen Molekulargewicht aufgeteilt. Auf diese
Weise werden diese Pyrogenassoziate von Vorteil in von der
Größe abhängige Typen aufgeteilt. Ein Pyrogenassoziat mit einem
Molekulargewicht, welches demjenigen der Probe vergleichbar
ist, wird als LM bezeichnet, während diejenigen, welche größer
oder kleiner als es sind, als LL beziehungsweise LS bezeichnet
werden.
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Die in der vorliegenden Erfindung zu verwendenden Membranen
können aus einem synthetischen Polymer, wie etwa Polysulfon
(PS), Polyacrylnitril (PAN) oder Polyamid, oder einem
halbsynthetischen Polymer, wie etwa Celluloseacetat, hergestellt sein.
Die Module daraus können zum Beispiel aus dem Hohlfaser- (HF)
Typ, Spiraltyp, Falztyp, Rohrtyp und Platten- und Rahmentyp
ausgewählt sein.
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Jedes Pyrogenadsorptionsmittel kann in der vorliegenden
Erfindung ohne Einschränkung verwendet werden, solange es Pyrogene
wirksam adsorbieren kann. Bevorzugte Beispiele dafür schließen
diejenigen ein, welche durch Immobilisieren zum Beispiel einer
Aminosäure, Iminodiessigsäure oder eines Antibiotikums auf
einem Substrat, welches zum Beispiel Agarose oder Cellulose
umfaßt, erhalten wurden; wahlweise ein Adsorptionsmittel, welches
durch Binden einer stickstoffhaltigen heterocyclischen
Verbindung, wie etwa L-Histidin, an einen wasserunlöslichen Träger
erhalten wurde (vgl. JP-A-183172/1982) oder ein weiteres,
Hyaluronsäure und ein anorganisches Harz umfassendes (vgl. JP-
A-67024/1979).
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Obschon die gemäß der vorliegenden Erfindung zu behandelnde
pyrogenhaltige Lösung nicht besonders beschränkt ist, sind
diejenigen mit einer Endotoxinkonzentration von 10&sup4; ng/ml oder
darunter besonders bevorzugt.
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Was nun die Zeichnungen betrifft, so werden einige bevorzugte
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gezeigt. Fig. 1
bis 3 zeigen jeweils schematisch ein Verfahren zum Herstellen
einer pyrogenfreien Lösung aus einer pyrogenhaltigen
Vorratslösung.
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Das Verfahren von Fig. 1 kann eingesetzt werden, wenn die
Packungsdichte des Pyrogenadsorptionsmittel hoch ist, und die
Adsorptionsmittelsäule sollte unter erhöhtem Druck betrieben
werden. Eine Vorratslösung a wird mit einer Pumpe b mit Druck
beaufschlagt und durch ein Ultrafiltrationsmembranmodul c
geleitet, um dadurch eine Permeationslösung g zu ergeben. Wenn
die hohe Packungsdichte des Adsorptionsmittels d es der
Vorratslösung a unmöglich macht, einzig unter dem
Membranmoduldruck durch das Adsorptionsmittel d hindurchzugehen, wird vor
dem Adsorptionsmittel d weiter eine Pumpe e vorgesehen, um
dadurch die durch das Ultrafiltrationsmembranmodul c
hindurchgehende Lösung erneut mit Druck zu beaufschlagen. Anschließend
wird die Lösung durch das Adsorptionsmittel d hindurchgeleitet
und die angestrebte pyrogenfreie Lösung g wird auf diese Weise
erhalten.
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Das Verfahren von Fig. 2 kann eingesetzt werden, wenn die
Packungsdichte eines Adsorptionsmittels d niedrig ist und der
Permeationsdruck niedrig ist. Eine Vorratslösung wird mit einer
Pumpe b mit Druck beaufschlagt und durch das
Ultrafiltrationsmembranmodul c geleitet. Die auf diese Weise erhaltene
hindurchgehende Lösung wird darauf durch ein Adsorptionsmittel d
geleitet, um dadurch die angestrebte pyrogenfreie Lösung g zu
erhalten.
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In dem Verfahren von Fig. 3 wird ein Adsorptionsmittel in einen
Behälter für die ein Ultrafiltrationsmembranmodul
durchdringende Lösung eingetaucht. Die durch das
Ultrafiltrationsmembranmodul hindurchgehende Lösung wird ähnlich dem Verfahren von
Fig. 2 vorübergehend im Behälter f gelagert, in welchen das
Adsorptionsmittel d eingetaucht ist. Auf diese Weise kann die
angestrebte pyrogenfreie Lösung in dem Behälter hergestellt
werden. Die pyrogenfreie Lösung g kann daher kontinuierlich
oder zu jeder beliebigen Zeit verwendet werden.
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(Beispiele)
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Das Vorliegende Verfahren zum Entfernen von Pyrogenen der
vorliegenden Erfindung umfaßt das Kombinieren einer Filtration mit
einer Ultrafiltrationsmembran mit der Adsorption mit einem
Pyrogenadsorptionsmittel. Im Adsorptionsschritt wird jedoch das
Leistungsvermögen des Pyrogenadsorptionsmittel im Verlauf der
Zeit erniedrigt. Wenn dieses Leistungsvermögen unter einen
Schwellenwert fällt, ist es daher notwendig, das
Adsorptionsmittel zu regenerieren, um dadurch dessen Leistungsvermögen
wieder herzustellen. Keines der bekannten Systeme zum wirksamen
Entfernen von Pyrogenen umfaßt jedoch ein derartiges Mittel zum
Regenerieren eines Pyrogenadsorptionsmittel. Dementsprechend
wird in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung ein Mittel zum wirksamen Regenerieren des
Pyrogenadsorptionsmittel bereitgestellt. Genauer umfaßt dieses sowohl
ein Mittel zum Entfernen von in einer Vorratslösung enthaltenen
Pyrogenen unter Verwendung des Pyrogenadsorptionsmittel als
auch ein weiteres Mittel zum Regenerieren des Adsorptionsmittel
mit einer Regenerierlösung.
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Es ist bevorzugt, daß dieses System ein Mittel zum Vorentfernen
von in der Regenerierlösung enthaltenen Pyrogenen durch
Verwenden einer Ultrafiltrationsmembran umfaßt. Als Regenerierlösung
wird im allgemeinen eine wäßrige Lösung einer Verbindung mit
niedrigem Molekulargewicht eingesetzt. Beispiele dafür
schließen wäßrige Lösungen von Natriumdesoxycholat,
Natriumhydroxid und Natriumchlorid ein (vgl. JP-A-183712/1982). Auf
diese Weise werden ausschließlich Pyrogene mit höheren
Molekulargewichten durch deren Behandeln mit einer
Ultrafiltrationsmembran aus der Regenerierlösung entfernt.
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Es ist weiter bevorzugt, daß dieses System ein Mittel zum
Waschen des Pyrogenadsorptionsmittel mit der in umgekehrter
Richtung fließenden Regenerierflüssigkeit umfaßt. Die
Regenerierlösung wird in der zum Fluß der Vorratslösung bei normalem
Betrieb umgekehrten Richtung hindurchgeführt. Auf diese Weise
können die durch das Pyrogenadsorptionsmittel absorbierten
Pyrogene leicht davon desorbiert werden.
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Es ist weiter bevorzugt, daß die Vorratslösung und die
Regenerierlösung dem System durch eine gemeinsame Pumpe zugeführt
werden. Der normale Vorgang des Zuführens der Vorratslösung und
des Regenerierungsvorganges des Zuführens der Regenerierlösung
werden nacheinander ausgeführt. Auf diese Weise ist es möglich,
diese Lösungen durch dieselbe Pumpe zuzuführen, was zum
Einsparen einer Pumpe dient.
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Es ist weiter bevorzugt, daß das System ein Mittel zum
Behandeln des Regenerierungsabfalls mit einer
Ultrafiltrationsmembran und dessen anschließendem Zurückgewinnen umfaßt. Auf diese
Weise kann der Verlust der teuren Regenerierlösung verringert
werden.
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Das System der vorliegenden Erfindung wird unter Bezug auf die
Zeichnungen näher beschrieben.
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Fig. 4 ist eine schematische Ansicht eines Beispiels des
Systems der vorliegenden Erfindung, worin A eine Vorratslösung
ist; B eine Regenerierlösung ist; C eine Produktlösung ist und
D ein Regenerierungsabfall ist. Die Vorratslösung in einem
Vorratslösungstank 1 wird über eine Pumpe 6 und einen
Durchflußmesser 7 einer Pyrogenadsorptionsmittelsäule 3 zugeführt.
Nachdem in der Vorratslösung enthaltene Pyrogene durch das
Pyrogenadsorptionsmittel adsorbiert sind, wird die sich daraus
ergebende Produktlösung in einem Produktlösungstank 4 gelagert.
Wenn das Leistungsvermögen des Pyrogenadsorptionsmittel auf
einen Schwellenwert erniedrigt ist, wird die Zufuhr der
Vorratslösung eingestellt und das Pyrogenadsorptionsmittel wird
regeneriert. Die Regenerierlösung, aus welcher Pyrogene mit
einer Ultrafiltrationsmembran 5 vorentfernt worden sind, wird
in einem Regenerierlösungstank 2 gelagert und über die Pumpe 6
und den Durchflußmesser 7 der Pyrogenadsorptionsmittelsäule 3
zugeführt. Nach dem Regenerieren des Pyrogenadsorptionsmittel
wird der sich daraus ergebende Regenerierungsabfall aus dem
System ausgetragen.
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Fig. 5 ist eine schematische Ansicht eines weiteren Beispiels
des Systems der vorliegenden Erfindung. Bei diesem Beispiel
wird ein Pyrogenadsorptionsmittel durch ein
Umkehrwaschverfahren regeneriert. Eine Vorratslösung wird über eine Pumpe 6 in
eine Pyrogenadsorptionsmittelsäule 3 geleitet. Nach Entfernen
von Pyrogenen davon wird die sich daraus ergebende
Produktlösung in einem Produktlösungstank 4 gelagert. Wenn das
Pyrogenadsorptionsmittel regeneriert werden soll, wird die Zufuhr der
Vorratslösung eingestellt und eine Regenerierlösung wird über
eine Pumpe 6' in umgekehrter Richtung in die
Pyrogenadsorptionsmittelsäule geleitet.
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Fig. 6 ist eine schematische Ansicht noch eines weiteren
Beispiels des Systems der Vorliegenden Erfindung. Bei diesem
Beispiel wird dem Verfahren von Fig. 5 gefolgt, ausgenommen, daß
eine Vorratslösung und eine Regenerierlösung über eine
gemeinsame Pumpe zugeführt werden. Die Vorratslösung durchfließt die
Abfolge Vorratslösungstank 1 T Ventil 11 T Pumpe 6 Ventil
13 T Pyrogenadsorptionsmittelsäule 3 T Venti1 19 T Ventil 14
T Produktlösungstank 4, während die Regenerierlösung die
Abfolge Vorratslösungstank 2 T Ventil 12 T Pumpe 6 T Ventil 18
T Pyrogenadsorptionsmittelsäule 3 T Ventil 20 T Ventil 17
durchfließt.
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Fig. 7 ist eine Schematische Ansicht noch eines weiteren
Beispiels des Systems der vorliegenden Erfindung. In diesem
Beispiel wird ein Regenerierungsabfall durch eine
Ultrafiltrationsmembran filtriert und darauf zurückgewonnen. Eine
Vorratslösung durchfließt die Abfolge Vorratslösungstank 1 T Ventil
11 T Pumpe 6 T Ventil 13 T Pyrogenadsorptionsmittelsäule 3 T
Ventil 14 T Produktlösungstank 4, während eine
Regenerierlösung die Abfolge Regeneriertank 2 T Ventil 12 T Pumpe 6 T
Ventil 13 T Pyrogenadsorptionsmittelsäule 3 T Ventil 17 T
Ultrafiltrationsmembran 5' durchfließt. Das Filtrat wird zum
Regenerierlösungstank 2 zurückgeführt, während der Rückstand
als Abfall E aus dem System ausgetragen wird.
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Somit stellt die vorliegende Erfindung in einer bevorzugten
Ausführungsform Systeme zum Entfernen von Pyrogenen aus einer
Lösung zur Verfügung, wodurch ein Pyrogenadsorptionsmittel
wirksam regeneriert werden kann.
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Um die vorliegende Erfindung weiter zu veranschaulichen, werden
die folgenden Beispiele und Vergleichsbeispiele angegeben.
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Vergleichsbeispiel 1
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Eine Vorratslösung mit einer Endotoxinkonzentration von 250
ng/ml wurde mit einem
Polyacrylnitril-Ultrafiltrationsmembranmodul mit einem Ausschlußmolekulargewicht von 30000 bei einem
Filtrationswirkungsgrad von 90% eine Woche kontinuierlich
behandelt. Endotoxine wurden durch Unterziehen des Substrats zwei
Testmethoden nachgewiesen, d.h. dem Limulus-Test unter
Verwendung des Limulus HS-Tests Wako (hergest. von Wako Pure
Chemicals Co., Ltd.) mit einer Nachweisempfindlichkeit von 0,01
ng/ml und der Kolorimetrie unter Verwendung von Endospecy mit
einer Nachweisempfindlichkeit von 1 pg/ml. Wie in der folgenden
Tabelle gezeigt, wurde bis zum zweiten Tag durch keine der
beiden Methoden ein Endotoxin nachgewiesen Endotoxine wurden aber
durch die Kolorimetrie ab dem dritten Tag nachgewiesen. Am
fünften Tag wurden durch beide Methoden Endotoxine
nachgewiesen.
Tag
Limulus HS Test Wako
Endospecy
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< 1: niedriger als die Nachweisgrenze
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Vergleichsbeispiel 2
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Polyacrylnitril-Ultrafiltrationsmembranmodule mit einem
Ausschlußmolekulargewicht von 80000 wurden in zwei Schritten
verwendet und der Wirkungsgrad der Endotoxinentfernung jedes
Moduls wurde ermittelt. Eine Vorratslösung mit einer
Endotoxinkonzentration von 250 ng/ml wurde mit diesen Modulen
behandelt. Nach dem Abschluß jedes Schritts wurden in der
behandelten Lösung enthaltene Endotoxine unter Verwendung von
Endospecy nachgewiesen. Wie in der folgenden Tabelle gezeigt, war
der Entfernungswirkungsgrad im ersten Schritt 99,99%, während
derjenige im zweiten Schritt 80% war.
Endotoxinkonz.
Entfernungswirkungsgrad
Erster Schritt: Einlaß nach Permeation
Zweiter Schritt: Einlaß nach Permeation
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Beispiel 1
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Die Systeme von Fig. 1 bis 3 wurden eingesetzt. In jedem System
wurde eine Vorratslösung mit einer Endotoxinkonzentration von
250 ng/ml kontinuierlich init einem
Polyacrylnitril-Ultrafiltrationsmembranmodul mit einem Ausschlußmolekulargewicht von 30000
bei einem Filtrationswirkungsgrad von 90% behandelt.
Anschließend wurde die behandelte Lösung durch ein
Pyrogenadsorptionsmittel hindurchgeführt, welches auf Agarose
immobilisiertes L-Histidin umfaßte. Darauffolgend wurden in der auf diese
Weise behandelten Lösung enthaltene Endotoxine kolorimetrisch
nachgewiesen. Wie in der folgenden Tabelle gezeigt, enthielt
keine Lösung irgendein nachweisbares Endotoxin.
Tag
System von
Fig.
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< 1: niedriger als die Nachweisgrenze (1 pg/ml)
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Beispiel 2
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Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, außer dem
Verwenden einer 50 ng/ml Endotoxine enthaltenden physiologischen
Kochsalzlösung. Die erhaltenen Ergebnisse waren dieselben wie
diejenigen von Beispiel 1.
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Beispiel 3
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Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, außer dem
Verwenden einer 50 ng/ml Endotoxine enthaltenden
Fruktoseinjektion. Die erhaltenen Ergebnisse waren dieselben wie diejenigen
von Beispiel 1.
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Beispiel 4
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Ein Test wurde mittels einer Humanserumalbumin-(HsA) lösung mit
einer HSA-Konzentration von 5% (bestimmt aus der UV-Absorption
bei 280 nm) als Probe ausgeführt, welche mit einer
Phosphatpufferlösung auf pH 6,5 und auf eine Ionenstärke (u) von 0,01
eingestellt worden war. Gemäß dem Limulus-Test durch Verwenden von
Limulus HS-Test Wako und eines Toxinometers ET-201 (beide
hergest. von Wako Pure Chemicals Co., Ltd.) enthielt diese Lösung
ungefähr 1300 ng/ml Endotoxine.
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100 ml der Probelösung wurde durch ihr Behandeln mit einem
pyrogenfreien (1 pg/ml oder weniger) Polyethersulfon-Hohlfaser-
UF-Modul (Ausschlußmolekulargewicht 100000; FUS-1081, hergest.
von Daicel Chemical Industries, Ltd.) fünffach konzentriert.
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Die auf diese Weise erhaltene hindurchgehende Lösung enthielt
3,2% HSA (HSA-Rückgewinnung ungefähr 40%) und ungefähr 3 ng/ml
Endotoxine.
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Anschließend wurde die hindurchgehende HSA-Lösung durch eine
mit demselben Pyrogenadsorptionsmittel wie dem in Beispiel 1
verwendeten (d.h. 0,9 cm x 27,5 cm) gepackte Säule mit einer
Fließgeschwindigkeit, SV, von 2 (ungefähr 0,6 ml/min) geleitet.
Das auf diese Weise erhaltene Eluat enthielt ungefähr 3% HSA
(HSA-Rückgewinnung nach der Säulenbehandlung: ungefähr 94%) und
ungefähr 0,016 ng/ml Endotoxine.
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Daher betrug der Wirkungsgrad des Entfernens von Pyrogenen aus
der Probe gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung
ungefähr 99,998%.
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Wenn das HSA in einer Probe mit Bakterien verunreinigt ist, ist
es zum Entfernen von Pyrogenen bevorzugt, eine MF-1
(Mikrofiltrationsmembran) in das System einzubauen (vgl. Fig. 8). Wenn
eine Möglichkeit besteht, daß unbedeutende
Pyrogenadsorptionsmittelfragmente (P.A.f.) aus der Pyrogenadsorptionsmittelsäule
ausgewaschen werden können, ist es weiterhin bevorzugt, eine
MF-2 (Mikrofiltrationsmembran) als Endfilter in das System
einzubauen.