DE68917407T2

DE68917407T2 - Bereicherung und Konzentrierung von Proteinen durch Ultrafiltration.

Info

Publication number: DE68917407T2
Application number: DE68917407T
Authority: DE
Inventors: Christopher Thurman Cordle; Larry Grant Criswell; Ronald Lewis Thomas
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1988-10-12
Filing date: 1989-10-10
Publication date: 1995-02-02
Anticipated expiration: 2009-10-11
Also published as: EP0363896A2; IL91781A0; CA1330050C; ATE109792T1; ES2061873T3; DE68917407D1; MX163729B; NZ230993A; EP0363896B1; KR900005998A; AU624633B2; IL91781A; US4897465A; IE893057L; AU4257089A; EP0363896A3; IE64919B1; JPH02218691A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft im allgemeinen verbesserte Verfahren zur Konzentrierung gewünschter Proteine aus Fluiden und insbesondere Verfahren, um Immunglobuline aus Fluiden durch Ultrafiltration über Metallmembranen zu erhalten.

Hintergrund

Die Filtration ist eine viel verwendete Technik, um gewünschte Substanzen von denjenigen, die unerwünscht sind, abzutrennen. Es existieren zwei gebräuchliche Wege, auf denen ein Ausgangsstrom auf ein Filter trifft: Dead-End-Filtration und Querstromfiltration. Bei der Dead-End-Filtration fließt der Ausgangsstrom senkrecht zu der Filteroberfläche. Bei der Querstromfiltration andererseits verläuft der Ausgangsstrom parallel zu dem Filter, und das Filtrat diffundiert durch ihn hindurch. Die zur Filtration verwendeten Filter werden oft anhand der zurückgehaltenen Teilchengröße klassifiziert.
Beispielsweise halten Membranmikrofilter im allgemeinen Teilchen mit einem Durchmesser von 0,1-10 um zurück, Ultrafilter halten im allgemeinen Teilchen und Makromoleküle von 1 000 - 500 000 Dalton (etwa 0,001-0,02 um im Durchmesser) zurück, und Hyperfilter halten im allgemeinen Moleküle von 200-300 Dalton zurück. Im Labor ist die Filter-auswahl im allgemeinen unkompliziert, jedoch treten bei der Vergrößerung auf industrielle Anwendungen oft zahlreiche Schwierigkeiten auf.
In der Theorie sollte die Ultrafiltration die selektive Trennung, Konzentrierung und Reinigung von Proteinkomponenten ermöglichen. Das Produkt, das die Membran passiert, ist als Ultrafiltrat oder "Permeat" bekannt, und das Produkt, das zurückgehalten und konzentriert wird, ist als "Retentat" bekannt.
In der Praxis verläuft die Ultrafiltration nicht gemäß den idealen Hypothesen. Bei der Ultrafiltration von Molke beispielsweise weist das Retentat einen relativ großen Restgehalt an Fett, Bakterien und Mineralstoffen auf, die das ideale Ultrafiltrationsverfahren erschweren. Ferner besitzen die meisten gängigen Ultrafiltrationsmembranen variable Porendurchmesser. Ihre Ausschlußkapazität ist nicht absolut exakt und entspricht nicht einer idealen isoporösen Membran. Außerdem wird der Permeatfluß (Volumen des Produkts pro Filterflächeneinheit pro Zeiteinheit) einer Ultrafiltrationsmembran stark von der Gegenwart einer Polarisationsschicht oder Verschmutzung der Membran beeinflußt.
Die Polarisationsschichten bilden sich im Verlauf der Ultrafiltration und verändern den Transfer von gelösten Stoffen durch die Membran, wodurch die Permeationsgeschwindigkeit des Gerätes verringert wird und seine Trenneigenschaften verändert werden. Die Polarisation wird durch die Konvektion durch die Membran verursacht. Fließt ein Fluid durch die Membran schneller als das zurückgehaltene Material in die Fluidmasse zurückdiffundieren kann, baut sich neben der Membran eine gesättigte Schicht auf. Die Tiefe der Schicht und ihr Widerstand zu fließen, hängt von der Geschwindigkeit ab, mit der das Retentat zirkuliert. Die Gesamtpermeabilität der Membran im Verlauf des Betriebs hängt von der Dicke der Polarisationsschicht und ferner von der Art ihrer Komponenten ab. Der Widerstand aufgrund von Verschmutzung baut sich auf, wenn Ablagerungen chemisch an die Membran binden. Die Verschmutzung ist im Vergleich zur Polarisation, bei der die Störschicht durch hydrodynamische (nicht chemische) Kräfte an der Membran gehalten wird, recht unterschiedlich.
Um hoch gereinigte Konzentrate zu erhalten, kann die Filtration von einer Diafiltration gefolgt oder begleitet werden, die beinhaltet, daß die Proteinkonzentrate gewaschen und einer weiteren Filtration unterzogen werden. Beispielsweise wird ein Proteinkonzentrat während der Diafiltration mit der Ultrafiltrationsmembran gleichzeitig mit der Waschlösung, z.B. einer wäßrigen Lösung, zusammengebracht. Die Diafiltration verringert die filtrierbaren Komponenten des Retentats. Es kann ein Batchverfahren (Verdünnungen und anschließende stufenweise Konzentrierungen) oder ein kontinuierliches Verfahren (Wasser wird mit der gleichen Geschwindigkeit zugegeben, mit der das Permeat verringert wird) sein. Im allgemeinen können durch die Diafiltration Proteinkonzentrate verbesserter Reinheit erhalten werden.
Die U.S.-Patentschrift Nr. 4 485 040 von Roger et al. betrifft ein Verfahren, um ein mit α-Lactalbumin angereichertes Produkt aus Molke zu erhalten. Das beschriebene Verfahren führt zunächst mit der unpasteurisierten rohen Molke bei einem pH-Wert zwischen 6,3 und 7 und einer Temperatur zwischen 30 ºC und 60 ºC eine Ultrafiltration durch, um die Molkeproteine zurückzuhalten, wobei die Membranen einen Molekulargewichtsausschlußgrenze von über 5 000 Dalton aufweisen. Das Permeat wird anschließend einer zweiten Ultrafiltration (die vorzugsweise eine Diafiltration ist) mit einer Membran unterzogen, die α-Lactalbumin zurückzuhalten vermag und vorzugsweise eine Ausschlußgrenze von unter 5 000 Dalton aufweist, bei der das Retentat der zweiten Ultrafiltration gesammelt wird, das aus dem mit α-Lactalbumin angereicherten gesuchten Produkt besteht. Es wird berichtet, daß ein solches Verfahren α-Lactalbumin aus Molke fraktioniert, jedoch erfolgt dies wie berichtet mittels leicht verunreinigter Hohlfasermembranen ohne Anwendung einer pH-Wertverschiebung.
Die U.S.-Patentschrift Nr. 4 644 056 von Kothe et al. betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Lösung von Immunglobulinen aus Milch oder Kolostrum oder aus beiden. Bei den beschriebenen Verfahren wird Milch oder Kolostrum auf einen pH-Wert von 4,0-5,5 angesäuert, das Fluid wird verdünnt, und das verdünnte angesäuerte Fluid wird einer Querstromdiafiltration in einer Filtrationseinheit mit einer mittleren Porengröße von 0, 1-1,2 um unterzogen. Das Volumen des Fluids wird während dieser ersten Filtration durch Zugabe von Natriumchloridlösung konstant gehalten. Die erste Diafiltration hält Casein zurück, und das Permeat ist eine klare Lösung, die die gesamten Molkeproteine und die niedermolekularen Komponenten enthält. Die niedermolekularen Komponenten werden sodann aus dem ersten Permeat mittels einer zweiten Querstromdiafiltration in einer Filtrationseinheit mit einer mittleren Porengröße von 5 000 - 80 000 Dalton, vorzugsweise von 10 000 Dalton, entfernt. Der pH-Wert des Fluids für diese zweite Filtration wird zwischen 4,0-5,5 gehalten. Das Retentat der zweiten Querstromdiafiltration besteht aus dem gesuchten Immunglobulinprodukt. Es wird berichtet, daß bei einem solchen Verfahren die Immunglobuline aus Kolostrum oder hyperimmunisierter Milch gewonnen werden, jedoch wird berichtet, daß dieses Ergebnis mittels leicht verunreinigter Hohlfasermembranen erzielt wird und daß die Immunglobuline im Vergleich zu den anderen Proteinspezies nicht angereichert waren. Um den Nachteil der Hohlfasermembran zu beheben, wurde ein Versuch durch extensive Anwendung der Diafiltration unternommen, die diese Verfahren für großindustrielle Anwendungen nicht praktisch macht.
Die japanische Patentveröffentlichung 60-248l52 betrifft ein Verfahren zur Herstellung Calcium-angereicherter Salze und ihre Anwendung. Bei dem beschriebenen Verfahren wird konzentrierte angesäuerte (pH eingestellt auf 5,0 oder darunter) Käsemolke durch solche Membranen als Ultrafiltration smembran und Elektrodialysemcmbran filtriert, um zu ermöglichen, daß Calcium durch die Membran in seinem ionischen Zustand in Lösung mit Phosphat- und Citrationen austritt. Das so erhaltene Filtrat wird durch Zugabe einer alkalischen Lösung auf pH 6,0-9,0 eingestellt, so daß ein Niederschlag von Calciumphosphat und Calciumcitrat erhalten wird, der durch Zentrifugieren isoliert wird. Die Patentschrift beschreibt kein Mittel, durch das eine Anreicherung und Konzentrierung von Proteinen in einem Fluid erreicht werden kann.
Thomas et al., U.S.-Patentschrift Nr. 4 7l6 044, beschreiben ein verbessertes Verfahren, um Saft aus Früchten zu erhalten. Das beschriebene Verfahren unterzieht ein fluides Fruchtpüree und Saft einer einzigen Ultrafiltration durch ein starres poröses röhrenförmiges Gehäuse mit einer lebensmittelreinen Ultrafiltrationsmembran, vorzugsweise einer Metalloxidmembran, die auf seinen Innenflächen angebracht ist. Während des einzigen Durchgangs passieren die wasserlöslichen Zucker, organischen Säuren, Aromaverbindungen und dergleichen wie beschrieben die Membran, während unlösliche Feststoffe, Proteine von einem Molekulargewicht von über etwa 14 000 und alle Mikroorganismen wie beschrieben in dem Fruchtretentat zurückgehalten werden. Obwohl diese Patentschrift ein Mittel beschreibt, durch das eine Konzentrierung von Proteinen in einem Fluid auftritt, betrachtet sie nicht die Anreicherung einer speziellen Proteinfraktion eines Fluids mittels Ultrafiltration und Verschiebung des pH-Wertes.
Trulson et al., U.S.-Patentschrift Nr. 3 977 967, beschreiben eine Ultrafiltrationsapparatur, die zur Konzentrierung und Trennung von Komponenten verwendet wird, die in Flüssigkeiten enthalten sind. Die beschriebene Apparatur besteht wie angegeben aus einem Modul, das eine Reihe von axial ausgerichteten röhrenförmigen hohlen Gliedern enthält, die eine definierte Porositat und einen im wesentlichen gleichmäßigen, kontinuierlichen, haftenden, porösen Überzug aus vorgeformten aggregierten anorganischen Metalloxidteilchen auf ihrer Innen- oder Außenfläche aufweisen. Bei den beschriebenen Verfahren durchdringen die gelösten niedermolekularen Phasen wie beschrieben die Wände der Röhren, während die Moleküle mit größerem Durchmesser in der Flüssigkeit zurückgehalten werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Beschreibung ist das auf die Ultrafiltrationsapparatur aufgebrachte Metalloxid Zirconiumdioxid. Trulson et al. beschreiben, daß diese Ultrafiltrationsapparatur verwendet werden kann, um die Proteinfraktion von Quarkmolke von der Masse von Wasser, Lactose und gelösten Salzen abzutrennen. Jedoch zeigen sie nicht, daß die Proteinbestandteile dieser Proteinfraktion mit Hilfe ihrer Apparatur konzentriert und aufgetrennt werden können oder daß eine solche Trennung und Konzentrierung durch Veränderung des pH-Wertes, bei dem das Fluid der Ultrafiltration unterzogen wird, erzielt werden kann.
Johnson et al., U.S.-Patentschrift Nr. 3 431 201, beschreiben ein verbessertes Hyperfiltrationsverfahren zur Verringerung der Konzentration des gelösten Stoffes in einer wäßrigen Lösung. Die Verbesserung umfaßt das Zusammenbringen einer wäßrigen Ausgangslösung mit einer wäßrigen Metalloxid-Ionenaustauschermasse, so daß die Ionen, die die wäßrigen Metalloxidmembranen schädigen, durch diese Form der Membran vor der Hyperfiltration aus der Ausgangslösung entfernt werden können. Durch Entfernung der Störionen verlängert dieses Verfahren wie beschrieben die Dauer des Betriebseinsatzes der Membran, stellt ein Verfahren zur pH-Kontrolle der Ausgangslösung und ein Verfahren zur Zugabe von membranbildendem Material zu der Membran bereit. Johnson et al. berichten, daß die Zurückhaltung von gelöstem Stoff durch die wäßrige Zirconiumdioxidmembran während der Hyperfiltration verbessert werden kann, indem der pH-Wert der Ausgangslösung verändert wird, um die Anionenaustauscher- Eigenschaften der dynamischen Membran zu verstarken. Johnson et al. verändern den pH-Wert, um die Moleküle auf der Grundlage der Ladung zu trennen. Sie betrachten jedoch nicht die Trennung der Komponenten auf der Grundlage der Größe, wobei die effektive "Permeabilitätsgrößel" einer Komponente durch Veränderung des pH-Wertes des Fluids kontrolliert wird.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

In Anspruch 1 wird ein Verfahren zur Konzentrierung eines Proteins aus einem Fluid und zur Anreicherung des Proteins bezüglich der Konzentrationen von Proteinen verschiedener Größen und/oder isoelektrischer Punkte beschrieben, wobei das genannte Verfahren umfaßt
a) Leiten eines Fluids zu einer ersten Metalloxid-Ultrafiltrationsmembran, bei der das Metalloxid auf eine starre poröse Fläche aufgebracht ist, bei einem pH-Wert, der unterhalb des isoelektrischen Punktes eines ausgewählten Proteins liegt, wobei ein Retentat erzeugt wird, das das ausgewählte Protein enthält,
b) Unterziehen des genannten Retentats einer zweiten Ultrafiltration bei einem pH-Wert oberhalb des isoelektrischen Punktes des ausgewählten Proteins, wobei ein Permeat erzeugt wird, das das ausgewählte Protein enthält, und
c) Sammeln des Permeats, das das ausgewählte Protein enthält.
Außerdem wird in Anspruch 6 ein Verfahren zur Konzentrierung eines Proteins aus einem Fluid und die Anreicherung des Proteins bezüglich der Konzentrationen der Proteine verschiedener Größe und eines unterschiedlichen elektrischen Punktes beschrieben, wobei das genannte Verfahren umfaßt
a) Leiten eines Fluids zu einer ersten Metalloxid-Ultrafiltrationsmembran, bei der das Metalloxid auf eine starre poröse Fläche aufgebracht ist, bei einem pH-Wert, der oberhalb des isoelektrischen Punktes eines ausgewählten Proteins liegt, wobei ein Retentat erzeugt wird, das das ausgewählte Protein enthält,
b) Unterziehen des genannten Permeats einer zweiten Ultrafiltration bei einem pH-Wert unterhalb des isoelektrischen Punktes des Proteins, wobei ein Retentat erzeugt wird, das das ausgewählte Protein enthält, und
c) Sammeln des Retentats, das das ausgewählte Protein enthält.

KURZE ZUSAMMENFASSUNG

Die Erfindung betrifft ein Ultrafiltrationsverfahren zur Anreicherung und Konzentrierung eines gewünschten Proteins aus einem Fluid, das verschiedene Proteine enthält, unter Einsatz von Metalloxid-Ultrafiltrationsmembranen und einer Verschiebung des pH- Wertes. Das Verfahren verwendet dieselbe Ultrafiltrationsmembran für zwei aufeinanderfolgende Ultrafiltrationen, wobei der pH-Wert zwischen den beiden aufeinanderfolgenden Ultrafiltrationen verschoben wird, um niedermolekularere oder höhermolekularere Materialien als das gewünschte Protein auf der Grundlage von Ladung und Größe zu entfernen. Eine Diafiltration der Fraktion, die das gewünschte Protein enthält, kann durchgeführt werden, um die Fraktion anzureichern, so daß die durch die zweite Ultrafiltration erzielte Trennung verbessert wird. Ferner kann eine dritte Ultrafiltration bei einem pH-Wert angewendet werden, der sich von dem pH-Wert der zweiten Ultrafiltration unterscheidet, um das gewünschte Protein noch weiter anzureichern.
Das Metalloxid wird auf einer starren porösen Fläche unter Bildung der Metalloxid- Ultrafiltrationsmembran angebracht, so daß die Membran eine Anfangspermeabilität (P) gegenüber Wasser von etwa 0,24 bis etwa 3,6 aufweist, wie sie durch die Formel
P =Permeatfluß
Einlaßdruck
bestimmt wird, worin der Permeatfluß der Anzahl von Litern Wasser entspricht, die pro Stunde durch einen Quadratmeter Membran hindurchgehen und der Einlaßdruck in Kilopascal gemessen wird. Eine bevorzugte Anfangspermeabilität der Membran für Wasser beträgt etwa 2,4.
Während des Filtrierens eines Proteins durch eine Ultrafiltrationsmembran ist das Produkt, das die Membran passiert, als Ultrafiltrat oder "Permeat" bekannt. Die Bestandteile, die zurück- oder festgehalten werden, sind als "Retentat" oder Proteinkonzentrat bekannt.
Um ein Protein von den niedermolekulareren und höhermolekulareren Komponenten in einem Fluid zu fraktionieren, wird das Fluid in eine erste Metalloxid-Ultrafiltrationsmembran bei einem Einlaßdruck von etwa 34,5 bis etwa 12 420 Kilopascal, vorzugsweise von etwa 207 bis 276 Kilopascal, bei einem Permeatfluß der starren porösen Röhre von etwa 25,5 bis etwa 51 Litern pro Quadratmeter pro Stunde, vorzugsweise bei etwa 34 Litern pro Quadratmeter pro Stunde, bei einer Fluid-Zirkulationsgeschwindigkeit größer oder gleich 4,5 m pro Sekunde und bei einem pH-Wert unterhalb des isoelektrischen Punktes des Proteins eingeleitet, um ein Retentat zu erzeugen, das das Protein enthält, oder es wird bei einem pH-Wert eingeleitet, der oberhalb des isoelektrischen Punktes des Proteins liegt, um ein Permeat zu erzeugen, das das Protein enthält. Die Bezeichnung isoelektrischer Punkt bedeutet der pH-Wert, bei dem die Nettoladung eines Moleküls in Lösung Null ist.
Wenn das Retentat der ersten Ultrafiltration das Protein enthält, kann dieses Retentat, das das Protein enthält, einer Diafiltration mit einer wäßrigen Lösung von konstantem Volumen oder unter stufenweiser Zugabe unterzogen werden, wobei das Volumen der zur Diafiltration verwendeten wäßrigen Lösung im allgemeinen etwa 5 % bis etwa 100 % des Volumens der Ausgangsproteinlösung beträgt, um ein diafiltriertes Retentat zu erzeugen. Physiologische Salzlösung und 5%ige Saccharoselösung befinden sich ebenso wie Wasser unter den bevorzugten wäßrigen Lösungen, die zur Diafiltration verwendet werden. Wenn die Diafiltration nicht gewünscht wird, wird dieses Retentat das das Protein enthält, bei den Parametern der ersten Ultrafiltration einer zweiten Ultrafiltration unterzogen, außer daß der pH-Wert so eingestellt wird, daß er oberhalb des isoelektrischen Punktes des gewünschten Proteins liegt, wodurch ein Permeat erzeugt wird, das das Protein enthält. Dieses Permeat, das das Protein enthält, wird anschließend gesammelt.
Wenn das Permeat der ersten Ultrafiltration das Protein enthält, wird dieses Permeat, das das Protein enthält, bei den Parametern der ersten Ultrafiltration einer zweiten Ultrafiltration unterzogen, außer daß der pH-Wert unterhalb des isoelektrischen Punktes des gewünschten Proteins liegt, wodurch ein Retentat erzeugt wird, das das Protein enthält. Dieses Retentat, das das Protein enthält, kann mit einer wäßrigen Lösung von konstantem Volumen oder chargenweise einer Diafiltration unterzogen werden, wobei das Volumen der wäßrigen Lösung, die für die Diafiltration verwendet wird, im allgemeinen etwa 5 % bis etwa 100 % des Ausgangsvolumens der Proteinlösung beträgt, um ein diafiltriertes Retentat zu erzeugen. Physiologische Salzlösung und 5%ige Saccharoselösung befinden sich ebenso wie Wasser unter den bevorzugten wäßrigen Lösungen, die zur Diafiltration verwendet werden. Dieses Retentat, das das Protein enthält, wird sodann gesammelt. Ist die Diafiltration nicht erwünscht, wird das Retentat, das das Protein enthält, direkt gesammelt.
Weitere Gesichtspunkte und Vorteile der Erfindung werden dem Fachmann beim Lesen der folgenden ausführlichen Beschreibung in Verbindung mit den Figuren und den beigefügten Ansprüchen klar.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Figur 1 ist ein schematisches Diagramm einer beispielhaften Apparatur, die in der Praxis der Erfindung geeignet ist.
Figur 2 ist ein Hochdruckflüssigkeitschromatogramm (HPLC), das das Proteinprofil der ursprünglichen Ausgangsmolke zeigt.
Figur 3 ist ein HPLC, das das Proteinprofil des Retentats der Ausgangsmolke nach 15facher Konzentrierung durch Ultrafiltration bei einem pH-Wert von 5,0 zeigt.
Figur 4 ist ein HPLC, das das Proteinprofil des Retentats der Ausgangsmolke nach Diafiltration mit einem Volumen Wasser zeigt, das einem Fünftel des ursprünglichen Molkevolumens entspricht.
Figur 5 ist ein HPLC, das das Proteinprofil des Permeats der Ausgangsmolke nach Ultrafiltration bei pH 7,0 zeigt.
Figur 6 ist ein HPLC, das das Proteinprofil von Ausgangseigelb zeigt.
Figur 7 ist ein HPLC, das das Proteinprofil des Retentats von Ausgangseigelb nach einer 10fachen Konzentrierung durch Ultrafiltration bei pH 5,0 zeigt.
Figur 8 ist eine graphische Darstellung, die den Proteinkonzentrierungsfaktor von vier Proteinen in Molke (Immunglobulin, Rinderserumalbumin, β-Iactoglobulin und α-Lactalbumin) gegen das Gewichtkonzentrierungsverhältnis bei pH 5,0 zeigt.
Figur 9 ist eine graphische Darstellung, die den Proteinkonzentrierungsfaktor von vier Proteinen in Molke (Immunglobulin, Rinderserumalbumin, β-Lactoglobulin und α-Lactalbumin) gegen das Gewichtskonzentrierungsverhältnis bei pH 5,5 zeigt.
Figur 10 ist eine graphische Darstellung, die den Proteinkonzentrierungsfaktor von vier Proteinen in Molke (Immunglobulin, Rinderserumalbumin, β-Lactoglobulin und α-Lactalbumin) gegen das Gewichtskonzentrierungsverhältnis bei pH 6,5 zeigt.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Erzeugung eines speziellen proteinangereieherten Produktes auf der Grundlage von Ladung und Größe bereit, indem ein Fluid durch metallische Membranen ultrafiltriert wird und indem eine pH-Wertverschiebung zur Fraktionierung der Komponenten mit niedrigerem oder höherem Molekulargewicht als das gewünschte Protein angewendet wird. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Fraktionierung von Immunglobulinen, insbesondere IgG, aus der Mehrheit der anderen Proteine, die in Milch, Käsemolke oder weiteren immunglobulinhaltigen Fluiden enthalten sind, und umfallt zwei Faktoren: 1) die metallische Membran führt zu einem hohen Rückhalt von IgG bei einem pH-Wert von 5,8 oder weniger, jedoch zu einem viel geringeren Rückhalt von IgG bei einem pH-Wert von 6,5 oder höher und 2) die metallische Membran ermöglicht einen kontinuierlichen Durchtritt von niedermolekulareren Proteinen bei jedem pH-Wert, sogar bei sehr hohen Konzentrationen.
Figur 1 ist eine schematische Darstellung einer beispielhaften erfindungsgemäßen Apparatur. Ein Auslaß aus einem Reservoir 10 ist mit einem Einlaß eines Kontrollventils 12 durch Leitung 11 verbunden. Ein Auslaß aus Kontrollventil 12 ist mit einem Einlaß eines T-Stückes 14 durch eine Leitung 13 verbunden. Ein Auslaß aus dem T-Stück 14 ist mit einem Einlaß eines Kontrollventils 17 durch eine Leitung 16 verbunden. Ein Auslaß aus dem Kontrollventil 17 ist mit einem Einlaß eines Retentat-Sammlungsbehälters 19 mit einer Leitung 18 verbunden. Ein Auslaß aus dem T-Stück 14 ist mit dem Einlaß einer Pumpe 20 durch eine Leitung 15 verbunden. Ein Auslaß aus der Pumpe 20 ist mit einem Einlaß eines T-Stückes 22 durch eine Leitung 21 verbunden. Ein Auslaß aus dem T-Stück 22 ist mit einer Pumpe 24 durch eine Leitung 23 verbunden. Ein Auslaß aus der Pumpe 24 ist mit einem Einlaß eines Moduls 27 durch eine Leitung 26 verbunden. Ein Druckmesser 25 ist mit der Leitung 26 verbunden. Ein Retentatauslaß aus dem Modul 27 ist mit einem Einlaß eines Moduls 29 durch eine Leitung 28 verbunden. Ein Retentatauslaß aus dem Modul 29 ist mit einem T-Stück 32 durch eine Leitung 31 verbunden. Ein Druckmesser 30 ist mit Leitung 31 verbunden. Ein Auslaß des T-Stückes 32 ist mit einem Einläß eines Kontrollventils 35 durch eine Leitung 34 verbunden. Ein Auslaß des T-Stückes 32 ist mit einem Einlaß des T-Stückes 22 durch eine Leitung 33 verbunden. Ein Auslaß aus dem Kontrollventil 35 ist mit einem Einlaß des Reservoirs 10 durch eine Leitung 36 verbunden. Die Zugabe eines Fluids zu Vorratsbehälter 10 wird durch eine Eintrittsöffnung 37 kontrolliert. Ein Permeat-Austritt aus Modul 29 wird mit dem Außengehäuse von Modul 27 durch eine Leitung 38 verbunden. Ein Permeat-Austritt aus dem Modul 27 wird mit einem Einlaß eines Kontrollventils 40 durch eine Leitung 39 verbunden. Ein Austritt aus dem Kontrollventil 40 wird mit über eine Leitung 41 mit einem Permeat-Sammelbehälter 42 verbunden.
Das Fluid, das das Protein enthält, das angereichert und konzentriert werden soll, wird durch die Einlaßöffnung 37 in den Vorratsbehälter 10 geleitet. Im allgemeinen wird das Fluid auf einen pH-Wert angesäuert, zweckmäßigerweise unterhalb des isoelektrischen Punktes des Proteins, indem durch Einlaßöffnung 37 lebensmittelreine Säure hinzugegeben wird, beispielsweise Phosphorsäure oder Essigsäure. Nach dem Ansäuern wird das Fluid aus dem Vorratsbehälter 10 durch die Leitung 11, Kontrollventil 12 und die Leitungen 13 und 15 durch Pumpe 20 gepumpt, die eine positive Diaphragmaverdrängerpumpe ist. Pumpe 20 erzeugt einen Einlaßdruck für die Ultrafiltration. Das Fluid tritt über Leitung 21 aus Pumpe 20 aus, passiert Leitung 23 und tritt in Pumpe 24 ein, die eine C-114-Zentrifugenpumpe ist. Pumpe 24 befördert das Fluid über die Leitung 26 in die Ultrafiltrationsmodule 27 und 29. Der Einlaßdruck des Fluids wird mit dem Druckmesser 25 gemessen. Die Ultrafiltrationsmodule 27 und 29, die durch die Leitung 28 verbunden sind, trennen das Fluid in Retentat und Permeat auf. Das Permeat aus Modul 29 fließt durch die Permeatleitung 38 in das Außengehäuse von Modul 27. Das Permeat läuft aus Modul 27 über Leitung 39 durch Kontrollventil 40 in den Permeat- Sammelbehälter 42. Das Retentat verläßt Modul 29 durch die Leitung 31. Der Auslaßdruck wird durch den Druckmesser 30 gemessen. Ein Teil des Retentats wird durch die Leitung 33 direkt zu den Ultrafiltrationsmodulen zurücktransportiert. Der Rest des Retentats fließt durch die Leitung 34 über das Konzentratkontrollventil 35 in den Vorratsbehälter 10, um erneut in den Kreislauf zurückgeführt zu werden, bis die gewünschte Konzentrierung des Retentats erreicht ist. Nach der Konzentrierung fließt das Retentat aus dem Vorratsbehälter durch Leitung 11 über Kontrollventil 12 durch Leitung 13 zu einem T-Stück 14. Das Retentat fließt durch dieses T-Stück über Kontrollventil 17 zu Leitung 16 und sodann in den Retentat-Sammelbehälter 19.
Das folgende Beispiel stellt eine spezielle Ausführungsform der Erfindung dar und soll den Umfang der Erfindung nicht einschränken.

BEISPIEL 1

Die Proteinkonzentrationen und Proteinverhältnisse (auf der Basis von IgG) von Cheddar-Käsemolke als Ausgangsmaterial, erhalten aus einer Käserei, sind in Tabelle I gezeigt. TABELLE 1 Protein Konz. (mg/ml) Verhältnis β-Lactoglobulin α-Lactalbumin
Figur 2 zeigt das HPLC-Profil des Molke-Ausgangsmaterials. Der pH-Wert der Molke wurde durch Zugabe von lebensmittelreiner Säure auf 5,0 eingestellt. 94,5 kg Molke wurden 15fach konzentriert, indem die Molke eine CARRE-Bio-1-CI-200-Membran passierte, die von CARRE Inc., Seneca, South Carolina, erhältlich ist, mit einer Anfangspermeabilität für Wasser von 2,5 bei 36,7 ºC. Der Permeatfluß betrug 50,9 l/m²/h am Anfang und betrug 34 l/m²/h nach der 15fachen Konzentrierung. Der Einlaßdruck betrug 207 kP, und die Zirkulationsgeschwindigkeit des Fluids betrug 6,1 m/s. Figur 3 zeigt das HPLC-Profil der Molke nach der 15fachen Konzentrierung. Die Proteinkonzentrationen und -verhältisse nach der l5fachen Konzentrierung sind in Tabelle 2 gezeigt. TABELLE 2 Protein Konz. (mg/ml) Verhältnis β-Lactoglobulin α-Lactalbumin
Die erste Konzentrierung verbessert die Proteinverhältnisse deutlich zugunsten von IgG mit einer Gewinnung von IgG von fast 100 % in dem Retentat. Das Verhältnis von IgG zu β-Lactoglobulin verschob sich von 1:9,0 auf 1:5,1. Das Profil zeigte ebenfalls eine fast vollständige Entfernung von Peptiden und eine sehr starke Verringerung des Anteils an α-Lactalbumin zu IgG.
Eine weitere Anreicherung von IgG wurde als nächstes durch Diafiltration des Konzentrats bei einem pH-Wert von 5,0 mit Wasser in der Menge von einem Fünftel des Gewichts der ursprünglichen Molke oder von 18,9 kg Wasser durch die CARRE-BIO-1- CI-200-Membran erreicht, wobei sämtliche Parameter gleich gehalten wurden. Die Proteinkonzentrationen und -verhältnisse nach Diafiltration und Verdünnung auf eine 2,2fache Konzentration im Vergleich zur ursprünglichen Molke sind in Tabelle 3 gezeigt. TABELLE 3 Protein Konz. (mg/ml) Verhältnis β-Lactoglobulin α-Lactalbumin
Das HPLC von Figur 4 zeigt, daß nach der Diafiltration die IgG-Konzentrierung eine 96%ige Gewinnung des gesamten IgG aus der Ausgangsmolke (d.h. 0,61 mg/ml, dividiert durch 2,2 entspricht einer Konzentration von 0,28 mg/ml) bedeutete. Für den Peak des Totvolumens ergab sich von Figur 2 zu Figur 4 eine große Zunahme, da die Verbindungen mit höherem Molekulargewicht als IgG ebenfalls konzentriert wurden.
Die Entfernung der höhermolekulareren Verbindungen, die nach der Fraktionierung von IgG zurückblieben, von den anderen Molkeproteinen wurde erreicht, indem der pH-Wert des Molkekonzcntrats durch Zugabe einer lebensmittelreinen Base, wie NaOH, auf 7,0 eingestellt wurde, und indem es durch dieselbe CARRE-BIO-1-CI-200-Membran, die in der ersten Stufe verwendet wurde, mit genau denselben Parametern geleitet wurde, nachdem die Leitungen mit beispielsweise einer alkalischen Hypochloritlösung bei pH 11 und anschließend mit einer Lösung aus Salpetersäure/Phosphorsäure bei pH 2 gereinigt und mit Wasser gespült worden waren. Diese Ultrafiltration entfernte große teilchenförmige Substanzen, wie Casein mit Zellen, Fettkügelchen und Bakterien, jedoch gingen 90 % des IgG in das Permeat über. Das resultierende Permeat war eine wasserklare, nahezu sterile Lösung, die mit IgG angereichert war. Die Proteinkonzentrationen und -verhältnisse des zweiten Permeats sind in Tabelle 4 gezeigt. TABELLE 4 Protein Konz. (mg/ml) Verhältnis β-Lactoglobulin α-Lactalbumin
Figur 5 zeigt das HPLC-Profil des Endpermeats. Die Bakterienzellpopulation wurde um log 7,3 verringert, was es ermöglichte, daß die Lösung leicht und wirksam mit Standard- Bakterienfiltern für ein steriles Endprodukt gereinigt wurde.
Das Gewichtkonzentrierungsverhältnis (WCR) ist ein Verfahren zur Berechnung der Ausbeute. Es wird bestimmt, indem das Verhältnis des Gewichts des Ausgangsmaterials zu dem Gewicht des Materials nach einem einzigen Durchgang durch die Ultrafiltrationsmembran berechnet wird. Der Proteinkonzentrierungsfaktor (PCF) wird berechnet, indem die Konzentration eines bestimmten Proteins bestimmt wird und diese Zahl durch die ursprüngliche Konzentration des Proteins in der Ausgangsmolke geteilt wird. Eine 100%ige Retention eines Proteins wird erhalten, wenn der Proteinkonzentrierungsfaktor dem Gewichtskonzentrierungsverhältnis entspricht. Die Figuren 8, 9 und 10 sind graphische Darstellungen, die die Proteinkonzentrierungsfaktoren von vier Proteinen in Molke (PCF-Werte) gegen das Gewichtskonzentrierungsverhältnis (WCR-Werte) bei verschiedenen pH-Werten zeigen. α-Lactalbumin ist durch Kreise, β-Lactoglobulin durch Rechtecke, Rinderserumalbumin (BSA) durch Rauten und IgG durch Dreiecke dargestellt.
Die Analyse der Figuren 8 und 10 zeigt, daß bei einem pH-Wert von 5,0 bzw. 6,5 IgG und BSA denselben PCF-Wert besitzen. Dies zeigt, daß bei diesen pH-Werten IgG durch das in der Erfindung beschriebene Ultrafiltrationsverfahren von BSA nicht in einem einzigen Schritt abgetrennt werden kann. Die Analyse der Figur 9 zeigt, daß jedoch bei einem pH-Wert von 5,5 IgG einen PCF-Wert von etwa 7,5 besitzt, wohingegen BSA einen PCF-Wert besitzt, der etwa 6,5 entspricht. Dies zeigt, daß IgG durch das in der Erfindung beschriebene Ultrafiltrationsverfahren in einem einzigen Schritt bei einem pH-Wert von 5,5 von BSA getrennt werden kann.
Bei jedem Membranverfahren ist es wichtig, die Membranen bis zu ihrer ursprünglichen Permeabilität gegenüber Wasser zu wieder reinigen, so daß eine größtmögliche Leistung bezüglich des Permeatflusses erhalten bleibt. Bei dem hier beschriebenen Verfahren ist die Reinigung zur Aufrechterhaltung der Trennfähigkeiten gleichermaßen wichtig. Der Grund dafür ist großenteils, daß die Trennungen überwiegend von der Ladung abhängen.
Sowohl organische Verunreinigungen, die hauptsächlich Proteine darstellen, als auch mineralische Verunreinigungen, die in Milch und Molke sehr zahlreich vorkommen, können die Membranpermeabilität deutlich verändern. Die Betriebsparameter einer hohen Geschwindigkeit und eines geringen Druckes beschränken die Proteinverunreinigung auf ein Minimum, was sich durch gleichmäßige Flüsse und einen fortwährenden Proteindurchtritt sogar bei sehr hohen Volumengewinnungen oder Konzentrierungen zeigt. Jedoch könnten die Trennungen Schaden nehmen, wenn die Membranen nicht sorgfältig gereinigt werden.
Es wurde gefunden, daß das Waschen mit Säure die Trennfähigkeit aufrechterhält sowie die Membranpermeabilitat wiederherstellt. Ein bevorzugtes handelsübliches Reinigungsfluid ist URACIL 75, erhältlich von Henkel Corp., Burlington, Iowa. Dieses saure Reinigungsmittel wird bei den Betriebsparametern der Ultrafiltrationsmembran auf die Membran aufgebracht. Ein weiteres wirksames Reinigungsverfahren ist die Anwendung von Rückfluß sowohl während der basischen als auch sauren Reinigung. Es wurde bei Reinigungsstudien gefunden, daß die Verwendung des Rückflusses sowohl während der sauren als auch basischen Reinigung nach einem typischen Versuch mit Molke die Permeabilität gegenüber Wasser zwischen 8 und 69 % vergrößerte. Bei weiteren Reinigungsstudien ergab der Rückfluß eine sofortige Verbesserung der Wasserpermeabilität, sogar nach mehreren vorherigen Reinigungscyclen mit Base/Säure ohne Rückfluß. Darum wird empfohlen, daß der Rückfluß sowohl in den basischen als auch sauren Reinigungsstufen angewendet wird.

BEISPIEL 2

Eigelb wurde mit Wasser verdünnt, um eine Lösung zu erhalten, die im Vergleich zu Wasser auf der Basis von Gewicht: Gewicht 5 % Eigelb enthielt. Peak 3 wurde auf der Basis der Retentionszeit als IgG identifiziert. Peak 2 kann ebenfalls IgG sein, da die Peaks 2 und 3 nicht gut getrennt wurden. Der pH-Wert der Lösung wurde durch Zugabe von Phosphorsäure auf 5,0 eingestellt. 75 l dieser Lösung wurden 10fach konzentriert, indem die Eigelb lösung die CARRE-CI-200-Membran mit einer Anfangspermeabilitat gegenüber Wasser von 2,5 bei 36,7 ºC passierte. Der Permeatfiuß betrug 50,9 l/m²/h bei 37,8 ºC. Der Einlaßdruck betrug 297 kP, und die Zirkulationsgeschwindigkeit des Fluids betrug 6,1 m/s. Figur 7 zeigt das HPLC-Profil der Eigelblösung nach einer 10fachen Konzentrierung. Die Peaks 1, 2 und 3, die im Verhältnis zu den Peaks 4-8 vergrößert sind, zeigen, daß IgG konzentriert wurde, wohingegen die niedermolekulareren Proteine in der Konzentration drastisch verringert wurden. Dieses Beispiel zeigt, daß weitere Fluide durch das erfindungsgemäße Verfahren konzentriert und angereichert werden können.

BEISPIEL 3

Blutserum wurde mit Wasser verdünnt, um eine 2fach verdünnte Lösung zu erhalten. Der pH-Wert der Lösung wurden durch Zugabe von Phosphorsäure auf 5,0 eingestellt. 75,5 l dieser Lösung wurde 20fach konzentriert, indem die Blutserumlösung durch die CARRE-CI-200-Membran mit einer Anfangspermeabilität gegenüber Wasser von 2,5 bei 36,7 ºC geschickt wurde. Der Permeatfluß betrug bei 32,2 ºC 30,5, und der Einlaßdruck betrug 207 kP, und die Zirkulationsgeschwindigkeit des Fluids betrug 6,1 m/s. Obwohl BSA nicht von IgG abgetrennt wurde, wenn die oben beschriebene Ultrafiltrationsapparatur verwendet wurde, wurde bei pH 7,0 eine gewisse Fraktionierung von IgG und BSA beobachtet. Außerdem zeigen die in den Figuren 8, 9 und 10 beschriebenen Ergebnisse, daß die Trennung von BSA und IgG bei einem pH-Wert von 5,5 durch Ultrafiltration erreicht werden kann.
Das Ultrafiltrationssystem, von dem gefunden wurde, daß es die überraschenden Ergebnisse, die vorstehend aufgeführt sind, liefert, ist allgemein in der U.S.-Patentschrift 4 200 533 von Gaddis et al. und insbesondere in der U.S.-Patentschrift 4 762 619 von Gaddis et al. beschrieben. Bestimmte besondere Parameter des Systems selbst werden hier für die Zwecke der Erfindung nicht besonders erwähnt. Insbesondere ist der Träger, auf dem das lebensmittelreine Titandioxid aufgebracht wird, erfindungsgemäß vorzugsweise eine starre poröse Oberfläche, wie gesinterter Edelstahl, so daß jede Sorge um bestimmte Verfahrensbedingungen, wie Temperatur und Druck, die sonst normalerweise den Träger beeinträchtigen oder für bestimmte Reinigungsbedingungen, wie Waschen mit Säure oder Base, überhaupt nicht geeignet sind, verringert wird. Die titandioxidüberzogene CI-200-Membran und die BIO-1-CI-200-Membran, die erfindungsgemäß verwendet werden, sind von CARRE Inc. Seneca, South Carolina, erhältlich. Eine modifizierte Bio-1-CI-200-Membran, die noch nicht getestet wurde, kann sich zur Anreicherung und Konzentrierung eines ausgewählten Proteins von den anderen Proteinen in einer Lösung ebenfalls als geeignet erweisen. Weitere Modifikationen dieser Membran, wie sie von CARRE erhältlich ist, sollen innerhalb des Umfangs der Erfindung liegen. Es wird erwartet, daß eine starre poröse Oberfläche, die aus keramischen Materialien hergestellt wird, ebenfalls als Träger für eine lebensmittelreine Metalloxidmembran dienen könnte.
Es wird vermutet und erwartet, daß Proteine aus weiteren biologischen Fluiden als denjenigen, die hier beschrieben sind, wie Magermilch, Vollmilch, Kolostrum, Kolostrummolke, Vollblut, Zellkultur-Fluide oder Fermentationslösungen, unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens angereichert und konzentriert werden können. Die vorgenannte ausführliche Beschreibung ist nur aus Gründen der Klarheit des Verständnisses angegeben. Es sollten daraus keine unnötigen Einschränkungen abgeleitet werden, da die Gesichtspunkte und Vorteile innerhalb des Umfangs der Erfindung dem Fachmann klar werden.
Werden technische Eigenschaften, die in irgendeinem Anspruch erwähnt sind, von Bezugszeichen gefolgt, so wurden diese Bezugszeichen zum einzigen Zwecke eines verbesserten Verständnisses der Patentansprüche eingeschlossen. Demgemäß besitzen solche Bezugszeichen keinerlei limitierende Wirkung auf den Umfang eines jeden Elements, das beispielhaft anhand solcher Bezugszeichen gekennzeichnet ist.

Claims

1. Verfahren zur Konzentrierung eines Proteins aus einem Fluid und zur Anreicherung des Proteins bezüglich der Konzentrationen von Proteinen verschiedener Größen und/oder verschiedener isoelektrischer Punkte, wobei das genannte Verfahren umfaßt:

a) Leiten eines Fluids zu einer ersten Metalloxid-Ultrafiltrationsmembran bei einem pH-Wert, der unterhalb des isoelektrischen Punktes eines ausgewählten Proteins liegt, wobei ein Retentat erzeugt wird, das das ausgewählte Protein enthält;

b) Unterziehen des genannten Retentats einer zweiten Ultrafiltration bei einem pH-Wert oberhalb des isoelektrischen Punktes des ausgewählten Proteins, wobei ein Permeat erzeugt wird, das das ausgewählte Protein enthält; und

c) Sammeln des Permeats, das das ausgewählte Protein enthält.

2. Verfahren zur Konzentrierung eines Proteins aus einem Fluid und zur Anreicherung des Proteins bezüglich der Konzentrationen von Proteinen verschiedener Größen und/oder verschiedener isoelektrischer Punkte, wobei das genannte Verfahren umfaßt:

a) Leiten eines Fluids zu einer ersten Metalloxid-Ultrafiltrationsmembran bei einem pH-Wert, der oberhalb des isoelektrischen Punktes eines ausgewählten Proteins liegt, wobei ein Permeat erzeugt wird, das das ausgewählte Protein enthält;

b) Unterziehen des genannten Permeats einer zweiten Ultrafiltration bei einem pH-Wert unterhalb des isoelektrischen Punktes des Proteins, wobei ein Retentat erzeugt wird, das das ausgewählte Protein enthält; und

c) Sammeln des Retentats, das das ausgewählte Protein enthält.

3. Verfahren zur Konzentrierung eines Immunglobulins aus einem Fluid und zur Anreicherung des Immunglobulins bezüglich der Konzentrationen von Proteinen mit verschiedenen Größen und/oder verschiedenen isoelektrischen Punkten, wobei das genannte Verfahren umfaßt:

a) Leiten eines Fluids zu einer ersten Metalloxid-Ultrafiltrationsmembran bei einem pH-Wert, der unterhalb des isoelektrischen Punktes eines Immunglobulins liegt, wobei ein Retentat erzeugt wird, das das Immunglobulin enthält;

b) Unterziehen des genannten Retentats einer zweiten Ultrafiltration bei einem pH-Wert oberhalb des isoelektrischen Punktes des Immunglobulins, wobei ein Permeat erzeugt wird, das das Immunglobulin enthält; und

c) Sammeln des Permeats, das das Immunglobulin enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 3,, bei dem die genannte Stufe der Zuführung die Stufe der Exposition des Fluids gegenüber einer Metalloxid-Ultrafiltrationsmembran bei einer Anfangspermeabilität gegenüber Wasser von etwa 0,24 bis etwa 3,6 und einem Einlaßdruck von etwa 34,3 bis etwa 12 240 Kilopascal bei einem Permeatfluß von etwa 25,5 bis etwa 511 pro m²/h und bei einer Fluidzirkulationsgeschwindigkeit, die größer oder gleich 4,5 m/s ist, umfaßt, und worin die genannte Stufe des Unterziehens die Stufe der Filtration des Fluids über eine Metalloxid- Ultrafiltrationsmembran bei einer Anfangspermeabilität gegenüber Wasser von etwa 0,24 bis etwa 3,6 bei einem Einlaßdruck von etwa 34,5 bis etwa 12 420 Kilopascal bei einem Permeatfluß von etwa 25,5 bis etwa 51 l pro m²/h und bei einer Fluidzirkulationsgeschwindigkeit von größer oder gleich 4,5 m/s umfaßt.

5. Verfahren zur Konzentrierung eines Immunglobulins aus einem Fluid und zur Anreicherung des Immunglobulins bezüglich der Konzentrationen von Proteinen mit verschiedenen Größen und/oder verschiedeneb isoelektrischen Punkten, wobei das genannte Verfahren umfaßt:

a) Leiten eines Fluids zu einer ersten Metalloxid-Ultrafiltrationsmembran bei einem pH-Wert, der oberhalb des isoelektrischen Punktes eines Immunglobulins liegt, wobei ein Permeat erzeugt wird, das das Immunglobulin enthält;

b) Unterziehen des genannten Permeats einer zweiten Ultrafiltration bei einem pH-Wert unterhalb des isoelektrischen Punktes des Immunglobulins, wobei ein Retentat erzeugt wird, das das Immunglobulin enthält; und

c) Sammeln des Retentats, das das Immunglobulin enthält.

6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die genannte Stufe der Zuführung die Stufe der Exposition des Fluids gegenüber einer Metalloxid-Ultrafiltrationsmembran bei einer Anfangspermeabilitat gegenüber Wasser von etwa 0,24 bis etwa 3,6 und einem Einlaßdruck von etwa 34,5 bis etwa 12 240 Kilopascal bei einem Permeatfluß von etwa 25,5 bis etwa 511 pro m²/h und bei einer Fluidzirkulationsgeschwindig keit, die größer oder gleich 4,5 m/s ist, umfaßt, und worin die genannte Stufe des Unterziehens die Stufe der Filtration des Fluids über eine Metalloxid- Ultrafiltrationsmembran bei einer Anfangspermeabilität gegenüber Wasser von etwa 0,24 bis etwa 3,6 bei einem Einlaßdruck von etwa 34,5 bis etwa 12 420 Kilopascal bei einem Permeatfluß von etwa 25,5 bis etwa 511 pro m²/h und bei einer Fluidzirkulationsgeschwindigkeit von größer oder gleich 4,5 m/s umfaßt.

7. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die starre poröse Oberfläche vor der Ablagerung des Metalloxids eine Porengröße von etwa 2 bis etwa 5 um aufweist.

8. Verfahren zur Konzentrierung eines Immunglobulins aus Molke und zur Anreicherung des Immunglobulins bezüglich der Konzentrationen der anderen Proteine einer unterschiedlichen Größe und eines unterschiedlichen isoelektrischen Punktes, wobei das genannte Verfahren umfaßt:

a) Zuführen eines Ausgangsprodukts aus Molke zu einer ersten Metalloxid- Ultrafiltrationsmembran, worin das Metalloxid auf einer starren porösen Oberfläche bei einem pH-Wert von 5,0 abgelagert ist, der unterhalb des isoelektrischen Punktes eines Immunglobulins liegt, wobei ein erstes Retentat erzeugt wird, das das Immunglobulin enthält;

b) Unterziehen des genannten ersten Retentats einer Ultrafiltrationsdiafiltration mit Wasser bei konstantem Volumen bei den Parametern der genannten ersten Ultrafiltration, wobei das Volumen des Wassers, das zur Diafiltration verwendet wird, etwa einem Fünftel des anfänglichen Volumens der Proteinlösung entspricht;

c) Unterziehen des genannten ersten Retentats einer zweiten Ultrafiltration bei den Parametern der genannten ersten Ultrafiltration, außer daß der pH-Wert 7,0 entspricht, wobei ein Permeat erzeugt wird, das das Immunglobulin enthält; und

d) Sammeln des Permeats, das das Immunglobulin enthält.

9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem die genannte Stufe der Zuführung die Stufe der Exposition der Molke gegenüber einer Metalloxid-Ultrafiltrationsmembran bei einer Anfangspermeabilität gegenüber Wasser von 2,5 bei einem Einlaßdruck von 207 kP bei einem Permeatfluß von 50,9 bis 34 l/m²/h und bei einer Fluidzirkulationsgeschwindigkeit von 6,1 m/s umfaßt.