DE3877300T2

DE3877300T2 - Substratunterstuetzte katalyse.

Info

Publication number: DE3877300T2
Application number: DE8888903692T
Authority: DE
Inventors: John Carter; Allen Wells
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1987-04-02
Filing date: 1988-03-30
Publication date: 1993-06-03
Anticipated expiration: 2008-03-31
Also published as: DE3877300D1; EP0308499B1; WO1988007578A1; ATE84313T1; EP0308499A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Enzymmutanten, die von einem Vorlläuferenzym durch Ersetzen oder Modifizieren von zumindest einer katalytischen funktionellen Gruppe eines Aminoslaurerestes in einem Vorlläuferenzym abgeleitet sind. Derartige mutante Enzyme haben eine katalytische Präferenz für Substrate, welche die ersetzte oder modifizierte funktionelle Gruppe oder ihr Äquivalent aufweisen, sodaß das Substrat im wesentlichen gemeinsam mit dem Enzymmutanten zu seiner eigenen Katalyse beiträgt.

OFFENBARUNGEN VOR DER EINREICHUNG

Enzyme sind Polypeptide, die eine große Vielzahl chemischer Reaktionen katalysieren. Es wird allgemein anerkannt, daß es zur enzymatischen Katalyse erforderlich ist, daß das Substrat sich im Bereich der reaktiven Stelle des Enzyms an das Enzym bindet, sodaß der spezifische Bereich, auf den das Enzym einwirkt, in eine Konfiguration verzerrt wird, die dem Übergangsstadium der katalysierten Reaktion nahe kommt. In vielen Fällen muß die spezifische Katalysestelle im Substrat so ausgerichtet sein, daß spezifische Reste des an der Katalyse beteiligten Enzyms auf das gebundene und verzerrte Substrat einwirken können. So können innerhalb der reaktiven Stelle Aminosäurereste im allgemeinen als diejenigen charakterisiert werden, die primär an Substratbindung beteiligt und somit für Substratspezifität bestimmend sind, und diejenigen, die primär an der tatsächlichen chemischen Katalyse beteiligt sind, z.B. die an Proton- oder Elektrontransfer oder nukleophilem oder elektrophilem Angriff auf das Substrat beteiligt sind.
Eine grobe Vielzahl herkömmlicher Verfahren ist eingesetzt worden, um die Bindungs- und katalytischen Reste an der reaktiven Stelle eines Enzyms herzuleiten. Beispielsweise haben die Röntgenstrahlen-Kristallstrukturen der Serinendoproteasesubtilisin enthaltenden kovalent gebundenen Peptidinhibitoren (Robertus, J.D. et al. (1972) Biochemistry 11, 2439-2449), Produktkomplexe (Robertus, J.D. et al. (1972) Biochemistry 11, 4293-4303), und Übergangsstadiumanaloge (Matthews, D.A., et al. (1975) J.Biol.Chem. 250, 7120-7126; Poulos, T.L. et al. (1976) J.Biol.Chem 251, 1097-1103), die berichtet wurden, Informationen bezüglich der reaktiven Stelle von Subtilisin einschließlich der an der Substratbindung und katalytischen Aktivität beteiligten Aminosäurereste geliefert. Außerdem sind über Subtilisin eine große Zahl kinetischer und chemischer Modifikationsuntersuchungen berichtet worden, die ebenfalls dabei geholfen haben, die Substratbindung und katalytischen Reste von Subtilisin herzuleiten (Philip, M., et al. (1983) Mol.Cell.Biochem. 51, 5-32; Svendsen, I.B. (1976) Carlsberg Res.Comm. 41, 237-291; Markland, F.S. et al., (1971) In the Enzymes Ed. Boyer, P.D., Academic Press, New York, Band 3, S.561-608). In den meisten Fällen, in denen die chemische Modifikation an einem katalytischen Aminosäurerest erfolgte, wurde die enzymatische Aktivität der modifizierten Enzyme zerstört oder schwer beeinträchtigt (Fersht, A. (1977) "Enzyme Mechanism and Structure", William Freeman, San Francisco, California, S. 201-205). In zwei berichteten Beispielen führte die chemische Modifikation des Serins an der reaktiven Stelle von Subtilisin zum Ersetzen des Serin-OH durch -SH, das eine modifizierte enzymatische Aktivität erzeugte (Neet, K.E., et al. (1968) J.Bio.Ghem. 248, 6392-6401; Polgar, L., et al. (1967) Biochemistry 6, 610-620). Die meisten chemischen Modifikationen katalytischer Reste erhalten oder erhöhen jedoch notwendigerweise das wirksame Seitenkettenvolumen der modifizierten Aminosäure und erhalten oder senken folglich das wirksame Volumen, in dem die katalytischen Reste wirken müssen.
Die jungste Entwicklung verschiedener in vitro-Techniken zum Manipulieren der für natürlich auftretende Polypeptide kodierenden DNA-Sequenzen sowie jungste Entwicklungen bei der chemischen Synthese relativ kurzer Sequenzen von ein- oder doppelstrangiger DNA hat zur berichteten Synthese verschiedener Enzyme geführt, worin spezifische Aminosäurereste durch andere Aminosäuren substituiert worden sind (Ulmer, K.M. (1983), Science 219, 666-671).
Es gibt mehrere berichtete Beispiele, in denen ein katalytischer Rest eines speziellen Enzyms durch eine andere Aminosäure substituiert worden ist. Einige dieser Literaturstellen beschreiben das Ersetzen einer katalytischen Aminosäure durch eine Aminosäure, die eine funktionelle Seitenkettengruppe aufweist, die sich von jener der ersetzten katalytischen Aminosäure unterscheidet, z.B. die Substitution einer Seitenkettengruppe, die eine Säuregruppe enthält, durch eine neutrale polare Seitenkettengruppe, oder die Substitution einer nukleophilen Seitenkettengruppe mit einer anderen nukleophilen Gruppe. Andere beschreiben Ersetzungen, bei denen die funktionelle Seitenkettengruppe eines katalytischen Restes konstant blieb, aber die Position dieser funktionellen Gruppe innerhalb der reaktiven Stelle bewegt wurde.
Beispielsweise wird berichtet, daß Aspartat-1002 von eukaryotischem Trypsinogen ein für Endoproteasewirksamkeit erforderlicher katalytischer Rest ist. Roczniak, S.O., et al. (1985), J. Cell Biochem. 9B (Abstracts), S. 87 berichten kurz über die Substitution von Aspartat durch Asparagin an Position 102. In diesem Fall wurde das Carboxylat von Asparaginsäure wirksam durch die polare neutrale Seitenkette von Asparagin substituiert, das, wie berichtet wird, zu einer drastischen Abnahme an Kcat führte.
Dalbadie-McFarland, G. et al., (1982) PNAS (USA) 79, 6409-6413, berichteten die Inversion der ser-thr-Diade der in Plasmid pBR322 enthaltenen β-Lactamase. Diese Inversion führte zur Umwandlung des katalytisch aktiven Serin-70 in Threonin und erzeugte, wie berichtet wird, einen Mutanten mit einem ampicillinempfindlichen Phänotyp.
Die Substitution von Serin-70 in β-Lactamase durch Cystein wird von Sigal, I.S. et al. (1984) J.Bio.Chem. 259, 5327-5332, berichtet. Dieses Ersetzen eines Serins einer reaktiven Stelle durch einen Cysteinrest führt zur Nettosubstitution einer -OH-Gruppe durch eine -SH-Grupe, die jeweils wirksame Nukleophile sein können. Die thiolhältige β-Laktamase katalysiert, wie berichtet wird, die Hydrolyse von β-Laktamen mit einer Substratspezifität, die sich von der von Wildtypenzym unterscheidet. Für Benzylpenicillin und -ampicillin, sind die Km-Werte den Wildtypwerten ähnlich, obwohl die Kcat-Werte 1-2% der eines Wildtypenzyms ausmachen. Bei Umsetzung mit dem Cephalosporinnitrocefin ist das Km jedoch 10 Mal größer als das des Wildtyps, und das Kcat ist zumindest so groß wie das kcat für das Wildtypenzym.
Bei Strauss, et al. (1985) PNAS (USA) 82, 2272-2276, wurde Triosephosphatisomerase, wie berichtet wird, so modifiziert, daß Glutaminsäure an Position 165 durch Asparaginsäure ersetzt wurde. Dieses Ersetzen ändert die chemische Natur der Seitenketten an Position 165 nicht, sondern bewegt die katalytische Carboxylgruppe an dieser Position, im wesentlichen, durch das Entfernen einer Methylengruppe von Glutaminsäure. Das Kcat für verschiedene Substrate wurde durch diese Mutation drastisch verändert, was den Autor zu dem Schluß brachte, daß Glutaminsäure an Position 165 für das Hin- und Herwandern von Proton während der Katalyse entscheidend ist, und weiters darauf hindeutet, daß dieser Rest nur einen kleinen Beitrag zur Bindung der Reaktionszwischenverbindungen macht.
Die Substitution von Serin-102 an der reaktiven Stelle von alkalischer Phosphatase mit Cystein wird von Ghosh, S.S. et al. (1986) Science 231, 154-148, berichtet. Das resultierende Thiolenzym katalysiert die Hydrolyse einer Vielfalt von Phosphatmonoestern. Die Autoren vertreten jedoch, ausgehend von der beobachteten katalytischen Wirksamkeit des thiolhältigen Enzyms, die Hypothese, daß die Mutation von Serin zu Cystein zu einer Veränderung des die Pate bestimmenden Schritts der Katalyse von Dephosphorylierung zur Bildung einer Phosphorylenzymzwischenverbindung führt.
Die Substitution mutmaßlicher katalytischer Reste durch andere Aminosäuren in verschiedenen Enzymen richtete sich auf die Bestimmung dessen, ob diese Reste primär an der Katalyse und nicht an der Substratbindung beteiligt sind. In mehreren berichteten Fällen wurden die erwarteten Ergebnisse nicht erzielt. Bei Gardell, S.J. et al. (1985) Nature 317, 551-555, wurde Tyrosin-248 in Carboxypeptidase A von einer Ratte mit Phenylalanin substituiert. Zuvor war angenommen worden, daß Tyrosin-248 durch seine Phenol-Seitenkette eine Rolle bei der Katalyse spielt. Die beschriebene spezielle Susbstitution entfernte die mutmaßliche Phenol-Hydroxidgruppe und substituierte eine Phenylgruppe. Die Autoren berichten, daß die katalytische Reaktivität des Wildtypenzyms im Vergleich zum substituierten Enzym, das Phenylalanin an Position 248 enthielt, für bestimmte Substrate darauf hindeutete, daß Tyrosin-248 für die Hydrolyse von Peptidsubstraten nicht obligatorisch war. Statt dessen meinen die Autoren, daß die Tyrosin-248-Hydroxylgruppe nicht an der Katalyse, sondern an der Substratbindung beteiligt ist.
Auf ähnliche Weise ist Threonin-113 in Dihydrofolatreduktase aus E.coli ein streng konservierter Rest an der Dihydrofolatbindungsstelle, die mit einem zweiten konservierten Rest, Aspartat-27, über eine Wasserstoffbindung und vermutlich mit dem Substratdihydrofolat indirekt durch ein Wassermolekül interagiert (Jin-Tann Chen, et al., (1985) J.Cell.Biochem. 29, 73-82). Da Aspartat-27 ebenfalls konserviert und an der Katalyse beteiligt ist, deutet das für die Autoren darauf hin, daß Threonin-113 für Protonentransfer während der Katalyse erforderlich sein könnte. Die Autoren berichten die Substitution von Threonin-113 mit Valin und schließen, daß Theonin-113 nicht an der Katalyse beteiligt ist, da es bei Substitution mit Valin keinen Verlust an katalytischer Wirksamkeit gibt.
Schultz, S.C., et al. (1986) PNAS (USA) 83, 1588-1592, berichten die Substitution von Threonin-71 in Klasse A β-Laktamase mit allen möglichen Aminosäuresubstitutionen, um die Rolle dieses Restes zu bestimmen. Threonin-71 ist ein Rest in der konservierten Triade Ser-Thr-Xaa-Lys. Die von diesen Autoren erhaltenen Ergebnisse deuten darauf hin, daß Threonin-71 für die Bindung oder Katalyse nicht unabdingbar ist, wie erwartet, aber für die Stabilität des β-Laktamaseproteins wichtig ist.
Ein wesentlicher Teil der Arbeit in Zusammenhang mit der Substitution anderer Aminosäuren in verschiedenen Enzymen war auf die Substitution von Aminosäureresten gerichtet, die an der Substratbindung beteiligt sind. Beispiele umfassen die Substitution einzelner Aminosäuren innerhalb der reaktiven Stelle von Tyrosyl-tRNA-Synthetase (Cystein-35TSerin, Winter G. et al. (1982) Nature 299, 756-758; Cystein-35TGlyzin, Wilkinson, A.J. et al. (1983) Biochemistry 22, 3581-3586; und Threonin-51TAlanin und Threonin-51TProlin, Wilkinson A.J. et al. (1984) Nature 307, 187-183).
Andere Beispiele für Substitutionen von Aminosäuren, die an der Substratbindung beteiligt sind, umfassen einen Doppelmutanten von Tyrosyl-tRNA-Synthetase, an der Cystein-35TGlycin gemeinsam mit Threonin-51TProlin (Carter, P.J. et al. (1984) Cell 38, 835-840) beteiligt ist; die Substitution von Glycinresten an den Positionen 216 und 226 von Rattenbauchspeicheldrüsentrypsin mit Alaninresten, um zwei einzelne Substitutionen und eine doppelte Substitution zu erzeugen (Craik, C.S. et al. (1985) Science 228, 291-297); und die Substitution verschiedener nichtkatalytischer Reste in Dihydrofolatreduktase (Villafranca, J.E., et al. (1983) Science 222, 782-788).
Paluh, J.L., et al. (1984) J.Biol.Chemistry 260, 1188-1894, berichten die Substitution von Cystein-84 mit Glyzin in Serratia marcescens Anthranilatsynthetase-Bestandteil II. Sie berichten, daß durch dieses Ersetzen die glutaminabhängige Anthranilatsynthetasewirksamkeit, aber nicht die ammoniumabhängige Wirksamkeit des Enzyms beseitigt wurde. Sie schließen auch, daß die Mutation einen weiteren Beweis für die Rolle des Cystein-84 der reaktiven Stelle in der Glutaminamidtransferfunktion des Enzyms schafft. Die Autoren stellen jedoch auch fest, daß der spezifische Aminosäureaustausch eine relativ unbedeutende strukturelle Veränderung verursachen könnte, die eine Glutaminbindung oder einen Amidtransfer unabhängig von der Funktion von Cystein-84 beseitigen könnte. Aus dieser Literaturstelle geht nicht klar hervor, ob Cystein-84 ein an der Bindung oder der eigentlichen Katalyse beteiligter Rest ist.
Die Substitution von Aminosäureresten, von denen angenommen wird, daß sie an der Übergangsstadiumstabilisierung verschiedener Enzyme beteiligt sind, ist ebenfalls berichtet worden. Derartige Arbeit ist vor kurzem in Fersht, A.R. et al. (1986), Trends in Biochemical Sciences, 11, 321-325, zusammengefaßt worden.
Ein Bezug auf einem anderen Gebiet ist Rossman, M.G., et al. (1985) Nature 317, 145-153, worin postuliert wird, daß die RNA von menschlichem Rhinovirus als ein Protonenakzeptor für die autokatalytische Spaltung des viralen Hüllproteins VP0 in VP2 und VP4 agiert.
Die oben besprochenen Literaturstellen sind nur aufgrund ihrer Offenbarung vor dem Einreichungsdatum des vorliegenden Falles angegeben, und nichts hierin darf als ein Eingeständnis interpretiert werden, daß die Erfinder aufgrund einer früheren Erfindung oder Priorität auf der Basis früher eingereichter Anmeldungen nicht dazu berechtigt sind, derartige Offenbarung vorzudatieren.
Auf Basis der obigen Verweise jedoch ist es offensichtlich, daß die Fachleute sich darauf konzentriert haben, die Enzymspezifität durch Veränderung der Bindungsreste abzuändern. Es ist bisher nicht anerkannt worden, daß Reste, die direkt an der Katalyse beteiligte Seitenketten enthalten, mit Resten substituiert werden können, die kleinere und katalytisch inaktive Seitenketten enthalten, um Enzymmutanten zu erzeugen, die mit Substraten katalytisch aktiv sind, welche die katalytische Funktion der ersetzten Restseitenkette bieten. Somit weisen diese Enzymmutanten eine Substratspezifität auf, die sich primär auf der Ebene der Katalyse und nicht der Substratbindung unterscheidet.
Demgemäß ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Enzymmutanten zu schaffen, worin zumindest eine katalytische Gruppe eines Aminosäurerestes eines Vorläuferenzyms so ersetzt oder modfiziert ist, daß das so gebildete mutante Enzym eine bevorzugte katalytische Wirksamkeit für ein Substrat aufweist, das fähig ist, die ersetzte oder modifizierte katalytische Funktion zu bieten, wenn es mit dem mutanten Enzym in Kontakt ist.
Es ist ein weiteres Ziel, für derartige Enzymmutanten kodierende DNA-Sequenzen sowie Expressionsvektoren, die derartige mutante DNA-Sequenzen enthalten, zu schaffen.
Ein wieder anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, mit derartigen Vektoren transformierte Wirtszellen zu schaffen, sowie Wirtszellen, die fähig sinn, derartige Enzymmutanten entweder intrazellular oder extrazellular zu exprimieren.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen katalytisch aktiven mutanten Enzymsubstratkomplex zu schaffen, worin zumindest eine der katalytischen funktionellen Gruppe des Komplexes vom Substrat geschaffen wird.
Weiters ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Verfahren zu schaffen, worin die erfindungsgemäßen Enzymmutanten mit modifizierten Substraten verwendet in Kontakt gebracht werden, um die gewünschte enzymatische Katalyse herbeizuführen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung umfaßt nicht in der Natur vorkommende Enzymmutanten, die durch das Ersetzen oder die Modifikation von zumindest einer katalytischen Gruppe eines Aminosäurerestes von einem Vorläuferenzym abgeleitet sind, welcher Rest, wenn er sich mit einem ausgewählten Bereich eines Polypeptidsubstrats in Kontakt befindet, katalytisch damit reagiert. Der so gebildete Enzymmutant ist im Vergleich zur katalytischen Wirksamkeit des Mutanten mit einem modifizierten Substrat, das durch Ersetzen oder Modifizieren einer Gruppe in einem ausgewählten Bereich des Substrats des Vorläuferenzyms gebildet ist, mit dem entsprechenden Substrat katalytisch relativ inaktiv. Dieser ausgewählte Bereich des Substrats ist so modifiziert, daß er die katalytische Gruppe oder ihr Äquivalent einschließt, das im Vorläuferenzym ersetzt oder modifiziert ist, sodaß der Enzymmutant mit dem modifizierten Substrat katalytisch aktiv ist.
Die Erfindung umfaßt auch mutante DNA-Sequenzen, die für derartige mutante Enzyme kodieren, Expressionsvektoren, die derartige mutante DNA-Sequenzen enthalten, und Wirtszellen, die mit derartigen Vektoren transformiert sind, die fähig sind, die genannten Enzymmutanten zu exprimieren.
Die Erfindung umfaßt auch einen katalytisch aktiven Enzymsubstratkomplex, der einen Enzymmutanten und ein modifiziertes Substrat umfaßt. Der Enzymmutant kommt in der Natur nicht vor und ist durch das Ersetzen oder die Modifikation von zumindest einer katalytischen Gruppe eines Aminosäurerestes von einem Vorläuferenzym abgeleitet, welcher Rest, wenn er mit einem ausgewählten Bereich eines Substrats für das Vorläuferenzym in Kontakt steht, katalytisch mit derartigem Substrat reagiert. Der so gebildete Enzymmutant ist mit dem Substrat für das Vorläuferenzym im Vergleich zur katalytischen Wirksamkeit des Enzymmutanten mit einem modifizierten Substrat relativ inaktiv. Das modifizierte Substrat wird durch Ersetzen oder Modifizieren einer Gruppe im ausgewählten Bereich des Substrats des Vorläuferenzyms gebildet. Dieser ausgewählte Bereich des Substrats ist so modifiziert, daß er die katalytische Gruppe oder ihr Aquivalent einschließt, die im Vorläuferenzym so ersetzt oder modifiziert ist, daß der Enzymmutant mit dem modifizierten Substrat katalytisch aktiv ist.
Die Erfindung umfaßt weiters ein Verfahren, welches das In-Kontakt-bringen eines Enzymmutanten und eines modifizierten Substrats umfaßt, um substratunterstützte Katalyse des modifizierten Substrats zu erzeugen. Bei diesem Aspekt der Erfindung ist der Enzymmutant derselbe wie für den Enzymmutantsubstratkomplex der Erfindung definiert.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figur 1 ist die DNA- und Aminosäuresequenz für B. amyloliquefaciens Subtilisin.
Figur 2 stellt die katalytischen Reste von B. amyloliquefaciens Subtilisin dar.
Die Figuren 3A und 3B stellen die Aminosäuresequenz von Subtilisin wie aus verschiedenen Quellen erhalten dar.
Figur 3C stellt die konservierten Reste von B.amyloliquefaciens Subtilisin im Vergleich zu anderen Subtilisinsequenzen dar.
Figur 4 ist ein schematisches Diagramm, welches die Substratbindungsspalte an Subtilisin gemeinsam mit einem Substrat zeigt.
Figur 5 ist eine Stereoansicht von B. amyloliquefaciens Subtilisin, das ein modelliertes gebundenes Peptidsubstrat mit der Sequenz L-Phe-L-Ala-L-His-L-Tyr-L-Gly-L-Phe enthält, die die Reste P4 bis P2' des Substrats darstellt.
Figur 6 stellt das Plasmid PS4 dar.
Die Figuren 7A, 7B und 7C stellen die pH-Abhängigkeit von Hydrolyse von p-Nitroanilidpeptidsubstraten durch Cys-24/Ala-64-Subtilisin dar.
Figur 8 stellt die Hydrolyse eines Polypeptidsubstrats durch Cys-24/Ala-64-Subtilisin dar.
Figur 9 stellt eine Stereoansicht eines Komplexes zwischen Rindertrypsin und Bauchspeicheldrüsentrypsininhibitorkomplex dar.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfinder haben entdeckt, daß verschiedene katalytische Gruppen in Aminosäureseitenketten in einem Enzym ersetzt oder modifiziert werden können, um ein mutantes Enzym zu erzeugen, das mit Substraten reaktiv ist, welche die ersetzte oder modifizierte katalytische Gruppe enthalten. Die ersetzte oder modifizierte katalytische Gruppe ist im Substrat so angeordnet, daß sie fähig ist, mit dem mutanten Enzym die Katalyse des modifizierten Substrats zu unterstützen.
Im speziellen ist B. amyloliquefaciens Subtilisin, eine alkalische bakterielle Protease, durch Modifizieren der für Subtilisin kodierenden DNA so mutiert worden, daß sie für die Substitution des katalytischen Restes His-64 mit Alanin kodiert. Wie erwartet wurde kcat und die katalytische Wirksamkeit, wie in kcat/Km gemessen, dieses mutanten Enzyms im Vergleich zum Wildtypsubtilisin beträchtlich verringert, wenn es mit Substraten in Kontakt gebracht wurde, die leicht durch Wildtypsubtilisin zu spalten sind. Überraschenderweise wurden vom Ala-64 mutanten Subtilisin verschiedene Substrate bevorzugt, die Histidin in der P2-Position enthielten.
Frühere Untersuchungen konzentrierten sich auf das Abändern der Enzymspezifität durch das Verändern der Reste, die das Substrat an das Enzym binden. Der hierin beschriebene alternative Ansatz, der als "substratunterstützte Katalyse" bezeichnet wird, ist auf einen weiten Bereich von Enzymen und Substraten mit Ausnahme derer anwendbar, die speziell hierin geoffenbart sind. Im allgemeinen ist die Erfindung auf jedes Enzym anwendbar, bei dem Teil des Enzyms entfernt ist und das auf geeignete Weise durch eine ähnliche Funktionalität von einem gebundenen Substrat versorgt wird. Auf diese Weise werden Substrate primär auf der Ebene der Katalyse und nicht der Bindung unterschieden, wodurch die Konstruktion äußerst spezifischer Enzymmutanten ermöglicht wird.
Wie hierin verwendet sind "Enzyme" Polypeptide, die entweder allein oder zusammen mit verschiedenen Cofaktoren eine kovalente Änderung in einem Substrat katalysieren. Enzyme können nach einer systematischen Nomenklatur und Klassifikation kategorisiert werden, die auf Empfehlung der Internationalen Enzymkommission angenommen wurde. So können Enzyme als Oxidoreduktasen (an Oxidations-Reduktionsreaktionen beteiligte Enzyme), Transferasen (am Transfer funktioneller Gruppen beteiligte Enzyme), Hydrolasen (an hydrolytischen Reaktionen beteiligte Enzyme), Lyasen (Enzyme, die Additionsreaktionen an Doppelbindungen katalysieren), Isomerasen (an Isomerisierungsreaktionen beteiligte Enzyme) und Ligasen (an der Bildung von Bindungen mit ATP-Spaltung beteiligte Enzyme) kategorisiert werden. Siehe im allgemeinen Lehninger, A.L., Biochemistry, Worth Publishers, Inc. New York, New York (1970), S.147-187.
Mit "Vorläuferenzym" ist ein Enzym gemeint, bei dem ein katalytischer Aminosäurerest ersetzt oder modifiziert werden kann, um ein mutantes Enzym zu erzeugen. Typischerweise kann die für das Vorläuferenzym kodierende DNA-Sequenz so modifiziert werden, daß sie eine mutante DNA-Sequenz erzeugt, die für die Substitution einer oder mehrerer katalytischer Aminosäuren in der Vorläuferenzymaminosäuresequenz kodiert. Geignete Modifikationsverfahren werden hierin und in der EPO Veröffentlichungsnr. 0130756, vom 9. Januar 1985 geoffenbart. Das Vorläuferenzym kann jedoch auch auf andere Weise als durch rekombinante DNA-Technologie modifiziert werden, um das erfindungsgemäße mutante Enzym zu erzeugen.
Ein Vorläuferenzym kann auch ein rekombinantes Enzym sein, womit ein Enzym gemeint ist, für das seine DNA geklont worden ist, oder ein Enzym, in dem die geklonte DNA-Sequenz, die für ein Enzym kodiert, modifiziert ist, um eine rekombinante DNA-Sequenz zu erzeugen, die für die Substitution, Löschung oder Einfügung einer oder mehrerer Aminosäuren in der Sequenz eines natürlich auftretenden Enzyms kodiert. Geeignete Verfahren zur Erzeugung derartiger Modifikationen umfassen die hierin und in der EPO Veröffentlichung Nr. 0130756 geoffenbarten. Zum Beispiel kann vom multiplen Subtilisinmutanten gemäß vorliegender Erfindung, der die Substitution von Serin am Aminosäurerest 24 durch Cystein und die Substitution von Histidin am Aminosäurerest 64 durch Alanin enthält, angenommen werden, daß er vom rekombinanten Subtilisin abgeleitet ist, das die Substitution von Serin durch Cystein an Rest 24 enthält. Der Mutant wird somit durch die Substitution von Histidin durch Alanin an Rest 64 im Cys-24 rekombinanten Subtilisin erzeugt.
Carbonylhydrolasen sind Enzyme, die Verbindungen hydrolysieren, die -X-Bindungen enthalten, worin X Sauerstoff oder Stickstoff ist. Sie umfassen natürlich auftretende Carbonylhydrolasen und rekombinante oder chemisch synthetisierte Carbonylhydrolasen. Natürlich auftretende Carbonylhydrolasen umfassen hauptsächlich Hydrolasen, z.B. Lipasen und Peptidhydrolasen, z.B. Subtilisin oder Metalloproteasen. Peptidhydrolasen umfassen α-Aminoacylpeptidhydrolase, Peptidylaminosäurehydrolase, Acylaminohydrolase, Serincarboxypeptidase, Metallocarboxypeptidase, Thiolproteinase, Carboxylproteinase und Metalloproteinase. Serin,- Metallo-, Thiol- und Säureproteasen sind eingeschlossen, ebenso wie Endo- und Exoproteasen.
Subtilisine sind bakterielle Carbonylhydrolasen, die im allgemeinen dahingehend wirken, daß sie Peptidbindungen von Proteinen oder Peptiden spalten. Wie hierin verwendet, bedeutet "Subtilisin" ein natürlich auftretendes Subtilisin oder ein rekombinantes Subtilisin. Es ist bekannt, daß eine Reine natürlich auftretender Subtilisine von verschiedenen bakteriellen Spezies erzeugt und oft ausgeschieden wird. Aminosäuresequenzen der Elemente dieser Reihe sind nicht vollkommen homolog. Jedoch weist das Subtilisin in dieser Reihe die gleiche oder ähnliche Art proteolytischer Wirksamkeit auf. Dieser Klasse von Serinproteasen ist eine Aminosäuresequenz gemeinsam, die eine katalytische Triade definiert, die sie von der mit Chymotrypsin verwandten Klasse von Serinproteasen unterscheidet. Die Subtilisine und mit Chymotrypsin verwandten Serinproteasen weisen beide eine katalytische Triade auf, die Aspartat, Histidin und Serin umfaßt. Bei den mit Subtilisin verwandten Proteasen ist die relative Reihenfolge dieser Aminosäuren, vom Amino- zum Carboxyterminus gelesen, Aspartat-Histidin-Serin. Bei den mit Chymotrypsin verwandten Proteasen ist die relative Reihenfolge jedoch Histidin-Aspartat-Serin. Somit bezieht sich Subtilisin hierin auf eine Serinprotease mit der katalytischen Triade von mit Subtilisin verwandten Proteasen.
Carbonylhydrolasen und ihre Gene können aus vielen prokaryotischen und eukaryotischen Organismen erhalten werden. Geeignete Beispiele für prokaryotische Organismen umfassen gramnegative Organismen wie E.coli oder Pseudomonas und grampositive Bakterien wie Micrococcus oder Bazillus. Beispiele für eukaryotische Organismen, aus denen Carbonylhydrolase und ihre Gene erhalten werden können, umfassen Hefe wie S. cerevisiae, Pilze wie Aspergillus sp., und Säugetierquellen wie beispielsweise Rindersp., aus dem das für die Carbonylhydrolase Chymosin kodierende Gen ernalten werden kann. Wie bei Subtilisinen kann eine Reihe von Carbonylhydrolasen aus verschiedenene verwandten Spezies erhalten werden, die Aminosäuresequenzen aufweisen, die zwischen den Elementen dieser Serie nicht vollständig homolog sind, aber dennoch die gleiche oder eine ähnliche Art biologischer Wirksamkeit aufweisen. Somit hat Carbonylhydrolase wie hierin definiert eine funktionale Definition, die sich auf Carbonylhydrolasen bezieht, die direkt oder indirekt mit prokaryotischen und eukaryotischen Quellen assoziiert sind.
Ein "Enzymmutant" hat eine Aminosäuresequenz, die von der Aminosäuresequenz eines "Vorläuferenzyms" abgeleitet ist und weist eine katalytische Präferenz für ein modifiziertes Substrat wie hierin definiert auf. Die Aminosäuresequenz des Enzymmutanten kann von der Vorläuferaminosäuresequenz durch die Substitution eines oder mehrerer katalytischer Aminosäurereste der Vorläuferaminosäuresequenz "abgeleitet" sein. Geeignete Verfahren für derartige Manipulation der Vorläufer-DNA-Sequenz umfassen Verfahren, die hierin und in der EPO-Veröffentlichung Nr. 0130756 geoffenbart sind. Andere Verfahren, um beispielsweise die Aminosäureseitenkette des Vorläuferenzyms direkt zu modifizieren, können eingesetzt werden, vorausgesetzt, sie erzeugen die katalytische Präferenz für ein modifiziertes Substrat. Ein "katalytischer Aminosäurerest" ist einer, der eine katalytische Gruppe enthält.
Wie hierin in Verbindung mit Enzymmutanten verwendet, ist eine "katalytische Gruppe" in einem Enzym eine funktionelle Seitenkette eines Aminosäurerestes, die während einer Reaktionsfolge eine Veränderung der Ladung oder des chemischen Bindungszustands durchmacht, und die am Ende der Reaktionsfolge regeneriert wird, oder die direkt mit einer derartigen funktionellen Seitenkette interagiert, um ihre Veränderung der Ladung oder des chemischen Bindungszustands zu erleichtern. Katalytische Gruppen nehmen typischerweise an der Katalyse teil, indem sie direkt oder indirekt als ein Nukleophil, Elektrophil, eine Säure, Base oder ein Elektronentransfermittel mit der reaktiven Stelle eines Substrats interagieren. Typische katalytische Aminosäurereste und ihre jeweiligen katalytischen Gruppen (in Klammern gezeigt) umfassen: Ser(-OH), Thr(-OH), Cys(-OH), Tyr(-OH), Lys(-NH&sub2;), Asp(-CO&sub2;H), Glu(-CO&sub2;H), His(imidazolyl) und Met(-SCH&sub3;). Siehe Tabelle I. So umfassen beispielsweise katalytische Gruppen für B.amyloliquefaciens Subtilisin und wie in Figur 2 gezeigt den Aminosäurepositionsnummern entsprechend, auf die in Figur 1 bezuggenommen wird, die Seitenketten für die Aminosäuren Asp-32, His-64 und Ser-221. TABELLE I Vorläuferenzym modifiziertes Substrat katalytisch katalytischer Rest Bevorzugte Aminosäurerest-Substitution Alternative Aminosäurerest-Substitution katalytische Gruppe äquivalente katalytische Gruppe Imidazoyl Phenol Phenyl Indole Imidazolium
Wie hierin in Verbindung mit den erfindungsgemäßen Enzymsubstratkomplexen oder -verfahren verwendet, umfaßt eine "katalytische Gruppe" zusätzlich zur obigen Definition funktionelle Seitenketten von Aminosäureresten, die zur Stabilisierung des Übergangsstadiums einer Reaktion beitragen, indem sie direkt oder indirekt mit einem polarisierten oder geladenen Übergangsstadium interagieren. Derartige Übergangsstadiumsstabilisierung wird typischerweise durch die Bildung von Salzbrücken oder die Schaffung einer Dipol-Dipol-Wechselwirkung (z.B. Wasserstoffbindungsbildung) zwischen dem Übergangsstadium und den es stabilisierenden katalytischen Resten erreicht. Typische katalytische Aminosäurereste, die an der Stabilisierung des Übergangsstadiums beteiligt sind, und ihre jeweiligen katalytischen Gruppen (in Klammern gezeigt) umfassen die katalytiscnen Reste von Tabelle I:
Asn(- -NH&sub2;),
Gln(- -NH&sub2;),
und
(siehe Tabelle II). Für das in den Figuren 1 und 2 gezeigte B.amyloliquefaciens Subtilisin ist ein an der Stabilisierung des Übergangsstadiums beteiligter katalytischer Rest Asn-155, das eine Wasserstoffbindung schafft, um das Oxyanion der in Figur 2 gezeigten tetrahedralen Zwischenverbindung zu stabilisieren. TABELLE II Vorläuferenzym modifiziertes Substrat katalytisch katalytischer Rest Bevorzugte Aminosäurerest-Substitution Alternative Aminosäurerest-Substitution katalytische Gruppe äquivalente katalytische Gruppe Imidazoyl Imidazolium
Viele Enzyme sind hinreichend charakterisiert, sodaß die katalytischen Gruppen dieser Enzyme (wie oben definiert) Fachleuten wohlbekannt sind. Jedoch können bei denjenigen Enzymen, die nicht so charakterisiert sind, die katalytischen Reste leicht bestimmt werden.
In dieser Beziehung verursachen das Ersetzen von Aminosäure oder die chemische Modifizierung katalytischer Gruppen (einschliedlich der direkt an der Katalyse beteiligten und der an der Übergangsstadiumstabilisierung beteiligten) typischerweise große Unterbrechungen im katalytischen Schritt der Reaktion (z.B. oft durch kcat gemessen) und geringe Wirkung auf die Enzymsubstratdissoziationskonstante (z.B. oft durch Km gemessen).
So kann ein Fachmann, um zu bestimmen, ob eine vermutlich katalytische Gruppe tatsächlich katalytisch ist, den die Gruppe enthaltenden Rest wie hierin beschrieben ersetzen oder modifizieren. Wenn eine derartige Substitution oder Modifikation kcat beseitigt oder wesentlich verringert, aber Km nicht wesentlich beeinflußt (z.B. Zunahme oder Abnahme von Km um einen Faktor von 50 oder vorzugsweise 10 oder weniger), ist die Seitenkette des substituierten Rests eine katalytische Gruppe.
Strukturelle Verfahren wie Röntgenstrahlenkristallographie können auch verwendet werden, um potentielle katalytische Gruppen durch ihre Nähe zur Stelle der chemischen Substratbindung zu identifizieren, die verändert wird. Chemische, kinetische und nmr-Verfahren können auch beim Identifizieren katalytischer Gruppen nützlich sein, indem sie eine Änderung in ihrer Ladung oder den chemischen Bindungseigenschaften während einer Reaktion zeigen.
Alternativ dazu können, wenn ein bestimmtes Enzym nicht gut charakterisiert ist, aber mit einem Enzym eng verwandt ist, in dem eine oder mehrere katalytische Gruppen bereits gut definiert ist/sind, die katalytischen Gruppen in diesem Enzym durch das Bestimmen ihrer äquivalenten katalytischen Reste identifiziert werden.
So ist beispielsweise ein katalytischer Rest (Aminosäure) einer Vorläufercarbonylhydrolase einem Rest von B. amyloliquefaciens Subtilisin äquivalent, wenn sie entweder homolog (d.h. entweder in der primären oder der tertiären Struktur was die Position betrifft entsprechend) oder analog zu einem speziellen Rest oder Abschnitt dieses Rests in B. amyloliquefaciens Subtilisin (d.h. mit der gleichen oder ähnlichen funktionellen Fähigkeit, chemisch zu kombinieren, reagieren oder interagieren) ist.
Um im obigen Beispiel Homologie zur primären Struktur herzustellen, wird die Aminosäuresequenz einer Vorläufercarbonylhydrolase direkt mit der B. amyloliquefaciens Subtilisin-Primärsequenz und insbesondere mit einem Satz Reste verglichen, von dem bekannt ist, daß er für alle Subtilisine invariabel ist, für welche die Sequenz bekannt ist (Figur 3C). Nach dem Ausrichten der konservierten Reste, wobei nötige Einfügungen und Löschungen zugelassen werden, um Ausrichtung beizubehalten (d.h. das Vermeiden der Eliminierung konservierter Reste durch willkürliche Löschung und Einfügung), werden die den katalytischen Aminosäuren (His-64, Asp-32, Ser-221, Asn-155) äquivalenten Reste in der Primärsequenz von B. amyloliquefaciens Subtilisin definiert. Die Ausrichtung konservierter Reste sollte vorzugsweise 100% derartiger Reste konservieren. Jedoch ist die Ausrichtung von mehr als 75% oder sogar nicht mehr als 20% der konservierten Reste adäquat, um äquivalente Reste zu definieren.
Beispielsweise sind in Figur 3A die Aminosäuresequenz von Subtilisin von B. Amyloliquefaciens B. Subtilisin var. I168 und B. lichenformis (carlsbergensis) ausgerichtet, um das maximale Maß an Homologie zwischen Aminosäuresequenzen zu bieten. Ein Vergleich dieser Sequenzen zeigt, daß in jeder Sequenz eine Anzahl konservierter Reste enthalten ist. Diese Reste sind in Figur 3C identifiziert.
Diese konservierten Reste können so verwendet werden, um die entsprechenden äquivalenten katalytischen Aminosäurereste von B. amyloliquefaciens Subtilisin in anderen Carbonylhydrolasen wie von Thermoactinomyces abgeleiteter Thermitase zu definieren. Diese beiden speziellen Sequenzen sind in Figur 3B ausgerichtet, um die maximale Homologie konservierter Reste zu erzeugen. Wie zu sehen ist, gibt es eine Anzahl von Einfügungen und Löschungen in der Thermitasesequenz im Vergleich zu B. amyloliquefaciens Subtilisin. Somit ist die äquivalente katalytische Aminosäure von Asn-155 in B. amyloliquefaciens Subtilisin in Thermitase das spezielle unterhalb von Asn-155 gezeigte Lysin.
Äquivalente katalytische Reste, die auf dem Niveau der tertiären Struktur für eine Vorläufercarbonylhydrolase homolog sind, deren tertiäre Struktur durch Röntgenstrahlenkristallographie bestimmt worden ist, sind als diejenigen definiert, für welche die Atomkoordinaten von 2 oder mehr der Hauptkettenatome eines speziellen Aminosäurerests der Vorläufercarbonylhydrolase und B. amyloliquefaciens Subtilisin (N auf N, CA auf CA, C auf C und 0 auf 0) nach der Ausrichtung innerhalb eines Bereichs von 0,13 nm und vorzugsweise 0,1 nm liegen. Ausrichtung wird erreicht, nachdem das beste Modell so ausgerichtet und positioniert worden ist, daß sich die maximale Überlappung von Atomkoordinaten von Nicht-Wasserstoff-Proteinatomen der fraglichen Carbonylhydrolase zum B. amyloliquefaciens Subtilisin ergibt. Das beste Modell ist das kristallographische Modell, das den niedrigsten R-Faktor für experimentelle Diffraktionsdaten bei höchstmöglicher Auflösung ergibt.
Äquivalente katalytische Reste, die zu einem katalytischen Rest von B. amyloliquefaciens Subtilisin funktionell analog sind, werden als diejenigen Aminosäuren der Vorläufercarbonylhydrolasen definiert, die eine Konformation annehmen können, sodaß sie die Katalyse auf definierte Weise entweder ändern, modifizieren oder zu ihr beitragen, und einem spezifischen katalytischen Rest des B. amyloliquefaciens Subtilisin wie hierin beschrieben zugeschrieben. Des weiteren gibt es jene Reste der Vorläufercarbonylhydrolase (für welche eine tertiäre Struktur durch Röntgenstrahlenkristallographie erhalten worden ist), die in einem solchen Ausmaß eine analoge Position einnehmen, daß, obwohl die Hauptkettenatome des gegebenen Rests den Äquivalenzkriterien auf Basis des Einnehmens einer homologen Position möglicherweise nicht entsprechen, die Atomkoordinaten von zumindest zwei der Seitenkettenatome des Restes bei 0,13 nm der entsprechenden Seitenkettenatome einer katalytischen Gruppe von B. amyloliquefaciens Subtilisin liegen. Die dreidimensionalen Strukturen wären wie vorstehend ausgeführt ausgerichtet.
Wie hierin verwendet bezieht sich ein "Substrat" auf ein Substrat, das mit einem Vorläuferenzym reaktiv ist. Für diejenigen Enzyme, die Polypeptide als Substrat einsetzen, ist das Substrat typischerweise durch eine Aminosäuresequenz definiert, die vom Vorläuferenzym erkannt wird, um das Substrat damit zu binden. Beispielsweise enthält bin Substrat für Trypsin die Aminosäuresequenz
X- -Y
worin X eine Aminosäure ist, Y eine Aminosäure mit Ausnahme von Pro ist, R Arg ist und K Lys ist. Subtilisin ist weitgehend spezifisch, spaltet aber leicht ein Substrat mit der Sequenz FAAY AF (an der durch den Pfeil gekennzeichneten Stelle), worin F, A, und Y Phe, Ala bzw. Tyr sind und Tyr die P1-Position einnimmt (siehe Figur 4). Diese Reste sind im allgemeinen diejenigen vom Enzym erkannten, um ein bestimmtes Substrat zu binden, und werden hierin als ein "ausgewählter Bereich" des Substrats bezeichnet. Selbstverständlich kann es einen weiten Bereich von Polypeptiden geben, die Substrate für ein spezielles Vorläuferenzym sind. Jedoch enthält jedes dieser Substrate einen ausgewählten Bereich, der vom Vorläuferenzym erkannt wird.
In verschiedenen Aspekten der Erfindung kann das Substrat ein nicht-eiweißhältiges Molekül wie eine Nukleinsäure, Kohlehydrat, ein Metabolit in einem biologischen Weg oder ein Antibiotikum sein. Im Fall von Nukleinsäuren und Kohlehydraten kann das "Substrat" ähnlich wie für ein Polypeptidsubstrat definiert werden, mit der Ausnahme, daß diese Bereiche nicht durch Aminosäuresequenz, sondern durch Nukleinsäuresequenz bzw. Kohlehydratsequenz definiert werden. So erkennen beispielsweise Restriktionsendonukleasen spezifische DNA-Sequenzen und eine α-Amylase erkennt die α(1T4)-Glykosidbindung zwischen Glukosemolekülen in Amylose.
Im Fall von Antibiotika, die üblicherweise weder Polypeptide, Nukleinsäuren noch Kohlehydrate sind, gibt es üblicherweise kaum Probleme beim Identifizieren des Substrats.
So sind beispielsweise die Substrate für β-Lactamasen Penicilline und Cephalosporane.
Im allgemeinen sind Substrate für einen weiten Bereich von Enzymen einschließlich des ausgewählten Bereichs derartiger Substrate Fachleuten bekannt oder können von ihnen leicht bestimmt werden.
Ein "modifiziertes Substrat" ist ein Substrat, worin zumindest eine darin enthaltene Gruppe ersetzt oder modifiziert wird, um eine modifizierte Gruppe zu bilden, welche die in einem Vorläuferenzym ersetzte oder modifizierte katalytische Gruppe oder das Äquivalent der so ersetzten oder modifizierten katalytischen Gruppe umfaßt. Die im modifizierten Substrat enthaltene katalytische Gruppe ist so angeordnet, daß das modifizierte Substrat nach dem Binden mit dem durch MJodifizieren eines bestimmten Vorläuferenzyms gebildeten mutanten Enzym eine modifizierte Gruppe schafft, die, wenn sie mit dem mutanten Enzym in Kontakt ist, die im Vorläuferenzym ersetzte katalytische Gruppe oder ihr Äquivalent schafft. Der so gebildete Enzymmutant-modifiziertes Substrat-Komplex wird dadurch katalytisch aktiv gemacht.
Im Fall von Vorläuferenzymen mit entsprechenden Polypeptidsubstraten, ist das modifizierte Substrat auch ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz enthält, die sich an das mutante Enzym bindet und die einen Aminosäurerest innerhalb des ausgewählten Bereiches enthält, der eine katalytische Seitenkettengruppe aufweist, die der zum Bilden des mutanten Enzyms ersetzten oder modifizierten Aminosäure gleich oder äquivalent ist.
Eine "äquivalente" katalytische Gruppe in einem modifizierten Substrat ist eine, die fähig ist, auf die gleiche oder ähnliche Weise wie diejenige zu reagieren, zu kombinieren oder zu interagieren, die vom Vorläuferenzym entfernt oder in diesem modifiziert wurde. Äquivalente katalytische Gruppe bezieht sich auf eine Gruppe, die die Fähigkeit aufweist, eine ähnliche oder äquivalente katalytische Rolle zu spielen. Es ist nicht notwendig, daß eine äquivalente katalytische Gruppe äquivalente chemische Struktur aufweist. Wenn beispielsweise ein katalytischer His-Rest vom Enzym entfernt wird, wäre eine äquivalente katalytische Gruppe vom Substrat eine Imidazolylgruppe, die von einer His-Seitenkette (aber nicht immer oder ausschließlich) gespendet werden kann. Wenn ein katalytischer Ser-Rest vom Enzym entfernt wird, kann eine äquivalente katalytische Gruppe vom Substrat eine Hydroxylgruppe sein, die von Threonin- oder Tyrosin-Seitenkette gespendet werden kann. In manchen Fällen kann es sein, daß die äquivalente katalytische Gruppe mit der ursprünglichen Enzymgruppe nicht identisch ist. So kann eine äquivalente katalytische Gruppe für das Serin-OH das Cystein-SH sein. Siehe Tabellen I und II.
Nach dem Binden mit dem Enzymmutanten ist die gleiche oder äquivalente katalytische Gruppe im modifizierten Substrat fähig, so angeordnet zu sein, daß sie der ursprünglichen Position der Seitenkette des im Vorläuferenzym substituierten oder modifizierten Aminosäurerests nahe ist. Auf diese Weise kann die katalytische Funktion des Vorläuferenzyms wiederhergestellt werden, wenn der Enzymmutant sich an ein modifiziertes Substrat bindet.
Die Positionierung der katalytischen Gruppe oder äquivalenten katalytischen Gruppe innerhalb des ausgewählten Bereichs eines Substrats, um ein modifiziertes Substrat zu bilden, kann durch Substituieren eines jeden der Aminosäurereste innerhalb des ausgewählten Bereiches durch eine andere Aminosäure erreicht werden, um die katalytische oder äquivalente Gruppe im modifizierten Substrat in verschiedenen Positionen einzubauen. Derartige modifizierte Substrate können leicht nach hierin geoffenbarten Verfahren und nach Fachleuten bekannten Verfahren hergestellt werden. Danach werden diese modifizierten Substrate mit dem speziellen mutanten Enzym in Kontakt gebracht, um festzustellen welches, wenn überhaupt eines, der modifizierten Substrate mit dem Enzymmutanten reaktiv ist.
Alternativ dazu kann, wenn die Kristallstruktur eines speziellen Enzym- oder Enzymsubstratkomplexes bekannt ist, Modellbau eingesetzt werden, um zu bestimmen, wie ein modifiziertes Substrat konstruiert sein sollte. Für derartiges Modellbauen dann beispielsweise ein FRODO-Programm (Jones, T.A. (1978), J.Appln. Crystallogr. 11, 268) in Verbindung mit einem Evans und Sutherland PS300 Graphiksystem verwendet werden. Zum Beispiel haben die Erfinder ein derartiges Programm und Graphiksystem verwendet, um die in Figur 5 gezeigte Stereoansicht von B. amylolquefaciens Subtilisin zu konstruieren, die ein modellgebundenes Peptidsubstrat mit der Sequenz L-Phe-L-Ala-L-His-L-Tyr-L-Gly-L-Phe enthält, welche die Reste P4-P2' des Substrats darstellt.
Eine zweidimensionale Darstellung der Beziehung zwischen den an Subtilisin beteiligten Substellen (S4 bis S3') und den an einer Substratbindung beteiligten Substratresten (P4 bis P3') wird in Figur 4 gezeigt. Normalerweise erfordert die P2-Position in den Substraten, die typischerweise mit Subtilisin reaktiv sind, kein Histidin.
Das Modell in Figur 5 basiert auf einer 2,0 Å kristallographischen Röntgenstrahlenuntersuchung von an Subtilisin gebundenen Produktkomplexen. Siehe z.B. Robertus, J.D. et al. (1972) Biochemistry 11, 4293; Poulos, T.L. et al. (1976) J.Biol. Chem. 251, 1097. Die katalytische Triade (Asp-32, His-64 und Ser-221) wird mit der His P2-Seitenkette vom über das katalytische His-64 gelegte Substrat gezeigt. Die Abstände zwischen dem OG von Ser-221 und den entsprechenden NE2-Stickstoffatomen von His-64 und der Modell-P2-His-Seitenkette betragen 3,17 Å bzw. 3,17 A. Die Abstände zwischen dem OD2 von Asp-32 und den entsprechenden NDI-Stickstoffatomen von His-64 und der Modell-P2-His-Seitenkette betragen 2,72 Å bzw. 2,72 Å. Die Modellabstände zwischen den NE2- und ND1-Stickstoffatomen der Histidine betragen 1,39 Å bzw. 1,35 Å. Die Wasserstoffbindungsabstände und die Dihedralwinkel für die Stereoansicht des Komplexes von Figur 4 werden in Tabelle III als Subtilisin Modell S1 angegeben.
Ebenso haben die Erfinder eine Stereoansicht eines Komplexes zwischen Rindertrypsin und Bauchspeicheldrusentrypsininhibitor (PTI)-Komplex erzeugt, worin die äquivalente P2-Substrat-Seitenkette (Cys-14 in PTI) durch His ersetzt und über His-57 in Trypsin gelegt wird. Die Koordinaten für den Trypsin/Trypsin-Inhibitorkomplex wurden von der Brookhaven Protein Data Bank Eintragung 2 PTC, hinterlegt von R. Huber und J. Deisenhofer, 9/82, entnommen. Siehe auch Deisenhofer, J., et al. (1975) Acta.Crystallogr. Abschnitt B, 31, 238. Die katalytische Triade von Trypsin (Ser-195, His-57, Asp-102) wird gezeigt und der Carbonylkohlenstoff von Lys-15 an der P1-Position in PTI ist markiert. Die Wasserstoffbindungsabstände und die Dihedralwinkel für diese Stereoansicht in Figur 9 werden als Trypsinmodell T1 in Tabelle 3 angegeben.

TABELLE III

Angemessene Bindungswinkel und Abstände dienten als Modell für substratgestützte Katalyse durch eine His P2 Seitenkette in Subtilisin oder Trypsin wie in den Figuren 5 bzw. 9 dargestellt. Die Dihedralwinkel für die His-Seitenketten werden durch χ1(N-Cα-Cβ-Cγ) und χ2(Cα-Cβ-Cγ-Cδ) definiert. Die Wasserstoffbindungswinkel (N&epsi; 2(His)-Hδ (ser)-Oγ (Ser)) wurden vom gemessenen Winkel Cβ(Ser)-Oγ (Ser)-N&epsi; 2(His), dem N&epsi; 2(His)-Oγ (Ser)-Bindungsabstand und dem bekannten Oγ (Ser)-Hδ (Ser)-Abstand (0,95Å) und dem Cβ(Ser)-Oγ (Ser)-Hδ (Ser)-Bindungswinkel (108,5º) berechnet (Weiner, S.J. et al. (1984), J.Am.Chem.Soc. 106, 765). H-Bindungsabstände wurden zwischen dem katalytischen Ser(Oγ) und Asp (Oδ 1 und Oδ 2) zum N&epsi; 2 bzw. Nδ 1 vom Enzym His oder dem Substrat His P2 gemessen. Die Abstände sind zwischen dem Enzym His und dem Modellsubstrat His P2 N&epsi; 2- und Nδ 1-Stickstoffatomen angegeben. Modell 1 (in den Figuren 5 und 9 für Subtilisin bzw. Trypsin gezeigt) hat die für H-Bindungsabstände zwischen dem Imidazolylstickstoff, N&epsi; 2 und Nδ 1 zum katalytischen Ser bzw. Asp optimierte His P2-Seitenkette. Modell 2 (graphische Ansicht nicht gezeigt) hat idealisierte χ-Winkel für die His P2-Seitenkette. Winkel Abstände (Å) dihedral H-Bindung katal. Subtilisin katal (tatsächlich) His P2 Seitenkette Modell S1 Modell S2 Trypsin His P2 Seitenkete Modell T1 Modell T2
Im allgemeinen können modifizierte Substrate natürlich auftretende Substrate sein, die Aminosäuresequenzen enthalten, die zuvor nicht vom Vorläuferenzym oder anderen Enzymen erkannt wurden, oder können rekombinante Substrate sein. So haben die Erfinder beispielsweise im ersteren Fall festgestellt, daß der Subtilisinmutant Cys-24/Ala-64 mit den natürlich auftretenden Substraten Inhibin (zwischen den Resten 61 und 80) und ACTH (zwischen den Resten 1 und 10) reaktiv ist.
Im letzteren Fall wird das rekombinante Substrat so konstruiert, daß es mit einem spezifischen Enzymmutanten reaktiv ist. Derartige rekombinante Substrate umfassen beispielsweise ein Verschmelzungspolypeptid, das eine Prosequenz (wie die Trp-LE-Sequenz von E.coli) und ein gewünschtes Polypepid enthält. Derartige Verschmelzungspolypeptide werden typischerweise durch rekombinante Techniken erzeugt, um die Expression und/oder Sekretion des rekombinanten Polypeptids zu erleichtern. In vielen Fällen wird die verschmolzene Sequenz jedoch durch Sekretion oder durch andere bekannte Verfahren (z.B. durch relativ unspezifische chemische Reaktionen wie Behandlung mit CNBr, Hydroxylamin usw.) nicht vom gewünschten Polypeptid abgespalten. Dieses Problem wird durch den Einsatz des Enzymmutanten gemäß vorliegender Erfindung überwunden, worin die Polypeptidsequenz für derartige Verschmelzungspolypeptide an der Verknüpfungsstelle der Pro- und Polypeptidsequenzen so modifiziert ist, daß sie eine Spaltungsstelle einschließt, die vom mutanten Enzym erkannt wird und die zu ihrer eigenen Katalyse beiträgt, um das gewünschte Polypeptid frei von der Prosequenz zu erzeugen. So kann die Erfindung verwendet werden, um eine einzige Spaltungsstelle, die von einem mutanten Enzym erkannt wird, an der Verknüpfungsstelle der Pro- und Polypeptidsequenz zu konstruieren, die nicht zu sekundärer Spaltung innerhalb des gewünschten Polypeptids führt.
Im Fall von Enzymmutanten, die nicht auf Polypeptidsubstrate wirken, besteht das modifizierte Substrat aus einem Substrat für ein Vorläuferenzym, das auf geeignete Weise modifiziert worden ist, um eine modifizierte Gruppe zu enthalten, die katalytisch ist, wenn sie mit dem Enzymmutanten in Kontakt ist. Derartige modifizierte Substrate können durch Substratmodellieren wie oben beschrieben unter Verwendung der dreidimensionalen Röntgenstrahlenkristallstruktur eines Vorläuferenzyms oder Enzymsubstratkomplexes konstruiert werden. Die Konstruktion derartiger modifizierter Substrate hängt natürlich von der chemischen Natur des modifizierten Substrats wie durch derartiges Modellieren bestimmt ab und könnte die biochemische und/oder chemische Modifikation oder Synthese des modifizierten Substrats umfassen.
Wenn bestimmt wird, wie eine katalytische Gruppe in einem Vorläuferenzym ersetzt oder modifiziert werden sollte, muß das modifizierte Substrat berücksichtigt werden, mit dem das Enzym umgesetzt werden soll. Im allgemeinen sollte der Aminosäurerest im Vorläuferenzym, da das modifizierte Substrat eine vom Vorläuferenzym entfernte katalytische Gruppe schafft, so ersetzt oder modifiziert werden, daß Raum für die modifizierte Gruppe des modifizierten Substrats geschaffen wird. Typischerweise ist es dazu erforderlich, daß die Seitenkette der Vorläuferaminosäure im Volumen verringert wird, sodaß der Enzymmutant die Gruppe des modifizierten Substrats empfangen kann.
Das mittlere Aminosäurevolumen von Aminosäuren, wenn sie in einem Protein enthalten sind, und das mittlere Seitenkettenvolumen solcher Aminosäuren, die auf ein Nullseitenkettenvolumen für Glycin normiert sind, werden in Tabelle IV gezeigt. Wie in den Tabellen I und II gezeigt gibt es verschiedene bevorzugte und alternative Aminosäuren, mit denen spezifische katalytische Reste innerhalb der aktiven Stelle eines Vorläuferenzyms substituiert werden können. In jedem Fall hat die Aminosäure, mit der ein katalytischer Rest substituiert wird, ein mittleres Seitenkettenvolumen, das kleiner als die Seitenkette des katalytischen Restersatzes ist. Im allgemeinen sollte der katalytische Aminosäurerest durch eine Aminosäure ersetzt werden, sodaß die Veränderung des mittleren Seitenkettenvolumens nach dem Durchführen der Substitution dafür ausreicht, die katalytische Gruppe oder äquivalente katalytische Gruppe des modifizierten Substrats, wie empirisch oder durch Modelluntersuchungen bestimmt, aufzunehmen. So erhöht beispielsweise die Substitution von Ala durch His-64 das aktive Stellenvolumen um etwa 75 Å³ (101 Å³.-26 Å³). Diese Volumszunahme reicht jedoch aus, um das Histidin an Rest P2 in einem modifizierten Substrat aufzunehmen, das ein mittleres Seitenkettenvolumen von 101 Å³ aufweist. Tabelle IV Aminosäure Chothia(1) Mittleres Aminosäurevolumen in Protein (Å³) Mittleres Seitenkettenvolumen (2) (Å³) (1) Chothia (1984) Ann. Rev. Biochem 53, 537 (2) Normiert auf Nullseitenkettenvolumen für Glycin
Zusätzlich zur Schaffung von ausreichendem Raum für die katalytische Gruppe oder äquivalente katalytische Gruppe des modifizierten Substrats sollte die Seitenkettenfunktionalität des im Vorläuferenzyin ersetzten katalytischen Rests so verändert werden, daß sie das Binden und die katalytische Wirksamkeit des modifizierten Substrats erleichtert. Beispielsweise sollten diese Aminosäuren, wo die Seitenkette eines katalytischen Aminosäurerestes im Vorläuferenzym positiv oder negativ geladene polare Gruppen enthält, so ersetzt oder modifiziert werden, daß sie Seitenketten enthalten, die nicht-polare oder ungeladene polare Gruppen enthalten. Derartige Substitutionen sind in den Tabellen I und II zusammengefaßt.
"Expressionsvektor" bezieht sich auf ein DNA-Konstrukt, das eine DNA-Sequenz enthält, die operabel mit einer geeigneten Steuersequenz verbunden ist, die fähig ist, die Expression der genannten DNA in einem geeigneten Wirt zu bewirken. Derartige Steuersequenzen umfassen einen Promotor, um Transkription zu bewirken, eine wahlweise Operatorsequenz, um derartige Transkription zu steuern, eine für geeignete mRNA-Ribosombindungsstellen kodierende Sequenz und Sequenzen, welche die Beendigung der Transkription und Translation steuern. Der Vektor kann ein Plasmid, ein Phagenpartikel oder einfach eine potentielle genome Einfügung sein. Sobald er in einen geeigneten Wirten transformiert ist, kann der Vektor replizieren und unabhängig vom Wirtsgenom wirken oder kann sich, in manchen Fällen, in das Genom selbst integrieren. In der vorliegenden Beschreibung werden "Plasmid" und "Vektor" manchmal austauschbar verwendet, da das Plasmid gegenwärtig die am häufigsten verwendete Vektorform ist. Jedoch soll die Erfindung auch solche andere Formen von Expressionsvektoren umfassen, die äquivalenten Funktionen dienen und die nach dem Stand der Technik bekannt sind oder werden.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten "Wirtszellen" sind im allgemeinen prokaryotische oder eukaryotische Wirte, die vorzugsweise nach den in der EPO-Veröffentlichung Nr. 0130756 geoffenbarten Verfahren manipuliert worden sind, um sie unfähig zu machen, enzymatisch aktive Endoprotease abzuscheiden. Eine bevorzugte Wirtszelle zum Exprimieren von Subtilisin ist der Bacillusstamm BG2036, dem enzymatisch aktive neutrale Protease und alkalische Protease (Subtilisin) fehlt. Die Konstruktion von Stamm BG2036 wird im Detail in der EPO-Veröffentlichung Nr. 0130756 beschrieben und weiter von Yang, M.Y. et al., (1984) J.Bacteriol. 160, 15-21 beschrieben. Derartige Wirtszellen sind von den in der PCT-Veröffentlichung Nr. 03949 geoffenbarten unterscheidbar, worin enzymatisch inaktive Mutanten von intrazellularen Proteasen in E.coli geoffenbart werden. Andere Wirtszellen zum Exprimieren von Subtilisin umfassen Bacillus subtilis 1168 (EPO Veröffentlichung Nr. 0130756).
Wirtszellen werden mit Vektoren transformiert oder transfiziert, die unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken konstruiert wurden. Derartige transformierte Wirtszellen sind fähig, entweder Vektoren zu replizieren, die für die Enzymmutanten kodieren, oder den gewünschten Enzymmutanten zu exprimieren. Im Fall von Vektoren, die für eine Prä- oder Präproform des Enzymmutanten kodieren, werden derartige Mutanten, wenn sie exprimiert sind, typischerweise von der Wirtszelle in das Wirtszellmedium abgeschieden.
"Operabel verbunden" bedeutet beim Beschreiben der Beziehung zwischen zwei DNA-Bereichen einfach, daß sie funktional miteinander in Beziehung stehen. Zum Beispiel ist eine Präsequenz operabel mit einem Peptid verbunden, wenn sie als eine Signalsequenz fungiert und am Ausscheiden der reifen Form des Proteins beteiligt ist, was sehr wahrscheinlich die Spaltung der Signalsequenz zur Folge hat. Ein Promotor ist operabel mit einer Kodierungssequenz verbunden, wenn er die Transkription der Sequenz steuert; eine Ribosombindungsstelle ist operabel mit einer Kodierungssequenz verbunden, wenn sie so positioniert ist, daß sie Translation zuläßt.
Die für das natürlich auftretende Vorläuferenzym kodierenden Gene können nach den allgemeinen, in der EPO-Veröffentlichung Nr. 0130756 beschriebenen Verfahren oder nach anderen nach dem Stand der Technik bekannten Verfahren erhalten werden. Wie aus den in der EPO Veröffentlichung Nr. 0130756 geoffenbarten Beispielen zu sehen ist, umfassen die Verfahren im allgemeinem das Synthetisieren markierter Sonden, die mutmaßliche Sequenzen aufweisen, die für Bereiche des interessierenden Enzyms kodieren, das Herstellen genomer Sammlungen aus Organismen, die das Enzym exprimieren, und das Screenen der Sammlungen auf das interessierende Gen hin durch Hybridisierung an die Sonden. Positiv hybridisierende Klone werden dann gemappt und sequenziert.
Das geklonte Enzym wird dann verwendet, um eine Wirtszelle zu transformieren, um das Enzym zu exprimieren. Das Enzymgen wird dann in ein Plasmid mit hoher Kopiezahl ligiert. Dieses Plasmid repliziert in Wirten in dem Sinn, daß es die wohlbekannten Elemente enthält, die für Plasmidreplikation erforderlich sind: einen Promotor, der operabel mit dem fraglichen Gen verbunden ist (der als der eigene homologe Promotor des Gens zugeführt werden kann, wenn er vom Wirt erkannt, d.h. transkribiert wird), ein Transkriptionsterminations- und Polyadenylierungsbereich (notwendig für die Stabilität der vom Wirt vom Hydrolasegen in bestimmten eukaryotischen Wirtszellen transkribierten mRNA), die exogen ist oder vom endogenen Terminatorbereich des Hydrolasegens geliefert wird und, wünschenswerterweise, ein Selektionsgen wie ein antibiotisches Resistenzgen, welches das kontinuierliche Aufrechterhalten der Kultur aus plasmidinfizierten Wirtszellen durch Züchten in Antibiotika hältigem Medium ermöglicht. Plasmide mit hoher Kopiezahl enthalten auch einen Replikationsursprung für den Wirt, wodurch sie es ermöglichen, daß ohne chromosomale Beschränkungen Plasmide in großer Zahl im Zytoplasma erzeugt werden. Jedoch liegt es im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, Mehrfachkopien des Hydrolasegens in das Wirtsgenom zu integrieren. Das wird durch prokaryotische und eukaryotische Organismen erleichtert, die für homologe Rekombination besonders anfällig sind.
Sobald das Vorläuferenzymgen geklont worden ist, wird eine Reihe von Modifikationen durchgeführt, um die Verwendung des Gens über die Synthese des natürlich auftretenden Vorläuferenzyms hinaus zu verstärken. Derartige Modifikationen umfassen die Erzeugung rekombinanter Vorläuferenzyme (wie in der EPO Veröffentlichung Nr. 0130756 geoffenbart) und die Produktion von Enzymmutanten.
Das folgende Kassettenmutageneseverfahren kann eingesetzt werden, um die Konstruktion und Identifizierung der Enzymmutanten gemäß vorliegender Erfindung zu erleichtern, obwohl andere Verfahren einschließlich der stellengerichteten Mutagenese verwendet werden können. Zuerst wird das für das Enzym kodierende Gen erhalten und als Ganzes oder teilweise sequenziert. Dann wird die Sequenz auf einen Teil gescannt, an dem es gewünscht wird, eine Mutation einer oder mehrerer Aminosäuren im exprimierten Enzym durchzuführen. Die diesen Punkt flankierenden Sequenzen werden auf die Gegenwart von Restriktionsstellen bewertet, um ein kurzes Segment des Gens durch ein Oligonukleotidpool zu ersetzen, das, wenn es exprimiert wird, für verschiedene Mutanten kodiert. Derartige Restriktionsstellen sind vorzugsweise einzelne Stellen innerhalb des Gens, um das Ersetzen des Gensegments zu erleichtern. Jedoch kann jede zweckmäßige Restriktionsstelle im Gen verwendet werden, die nicht übermäßig redundant ist, vorausgesetzt, daß die durch Restriktionsdigestion erzeugten Genfragmente in der richtigen Sequenz wieder zusammengesetzt werden können. Wenn Restriktionsstellen nicht an Positionen innerhalb eines zweckmäßigen Abstands vom gewählten Punkt (von 10 bis 15 Nukleotide) vorhanden sind, werden derartige Stellen durch das Substituieren von Nukleotiden im Gen auf solche Weise erzeugt, daß weder der Leseraster, noch die Aminosäuren, für die kodiert wird, in der Endkonstruktion verändert werden. Das Ziel der Lokalisierung geeigneter Flankierungsbereiche und das Bewerten der erforderlichen Veränderungen, um zu zwei zweckmäßigen Restriktionsstellensequenzen zu gelangen, wird durch die Redundanz des genetischen Codes, einen Restriktonsenzymplan des Gens und die große Anzahl verschiedener Restriktionsenzyme zur Routine. Es ist zu bemerken, daß, wenn eine zweckmäßige flankierende Restriktionsstelle verfügbar ist, das obige Verfahren nur in Verbindung mit dem flankierenden Bereich verwendet werden muß, der keine Stelle enthält.
Die Mutation des Gens, um seine Sequenz zu verändern, um der gewünschten Sequenz zu entsprechen, wird durch M13-primerausweitung nach allgemein bekannten Verfahren erreicht. Sobald das Gen geklont ist, werden die Restriktionsstellen, welche die zu mutierende Sequenz flankieren, mit den verwandten Restriktionsenzymen digeriert, und eine Vielzahl von Endtermini-komplementären Oligonukleotidkassetten werden in das Gen ligiert. Die Mutagenese wird durch dieses Verfahren wesentlich vereinfacht, weil alle Oligonukleotide so synthetisiert werden können, daß sie die gleichen Restriktionsstellen aufweisen, und keine synthetischen Linker notwendig sind, um die Restriktionsstellen zu erzeugen.
Bei der geoffenbarten Ausführungsform wurde Subtilisin als ein Modell ausgewählt, um das Konzept der substratunterstützten Katalyse zu testen. Bei der Hydrolyse von Peptidbindungen durch Subtilisin, wirkt His-64 als eine katalytische Base bei der Bildung einer Acyl-Enzym-Zwischenverbindung und als eine katalytische Säure beim darauffolgenden Deacylierungsschritt. Stroud, R.M. et al. (1975), Proteases and Biological Control (Cold Spring Harbor Laboratory, New York), S. 13; Kraut, J. (1977) Ann.Rev. Biochem. 46, 331.
Die katalytische Triade von Subtilisin wird in Figur 2 gezeigt. Wie zu sehen ist, sind Ser-221, His-64 und Asp-32 so positioniert, daß sie nukleophilen Angriff durch das Serinhydroxylat auf das Carbonyl der spaltbaren Peptidbindung erleichtern. Mehrere Wasserstoffbindungen können auch dabei helfen, den Übergangsstadiumkomplex für die tetrahedrale Substratzwischenverbindung zu stabilisieren. Eine Wasserstoffbindung befindet sich zwischen Aspartat und dem positiv geladenen Histidin, ND1. Kossiakoff, A.A. et al. (1981) Biochem. 20, 6462-6474. Eine zweite Wasserstoffbindung bildet sich zwischen dem abspaltbaren Amidstickstoff des Substrats und dem (NE2)-Proton auf dem Histidin. Ein dritter Satz Wasserstoffbindungen bildet sich zwischen dem Enzym und dem Oxyanion, das aus dem Carbonylsauerstoff des Substrats erzeugt wird. Dieser letztere Satz Wasserstoffbindungen wird unterschiedlich durch die Säugetierserinproteasen und Subtilisin gebildet. Es scheint eine vierte Wasserstoffbindung zwischen dem Amidstickstoff der Peptidbindung zwischen P-1 und P-2 und dem Carbonylsauerstoff von Ser-125 zu bestehen. Im speziellen deuten kristallographische Röntgenstrahlenuntersuchungen von Chymotrypsin (Henderson, R. (1970) J.Mol.Biol. 54, 341) darauf hin, daß zwei Wasserstoffbindungen sich zwischen dem Substratoxyanion und zwei Hauptkettenamidprotonen vom Enzym bilden (Gly-193 und das katalytische Ser-195). Kristallographische Untersuchungen von Subtilisin (Robertus, et al. (1972) Biochem. 11, 4293-4303; Matthews, et al. (1975) J.Biol. Chem. 250, 7120-7126; Poulos, et al. (1976) J.Biol.Chem. 250, 1097-1103) zeigen, daß zwei Wasserstoffbindungen auch mit dem Oxyanion gebildet werden; ein Wasserstoffbindungsspender stammt vom katalytischen Ser-221 Hauptkettenamid, während der andere von einem der NE2-Protonen der Asd-155 Seitenkette stammt. Siehe Figur 2.
Das in Figur 5 gezeigte Modell ließ erkennen, daß die Delta- und Epsilonstickstoffe des Histidins in Position P2 im modifizierten Substrat innerhalb von etwa 1 Angstrom von den entsprechenden Stickstoffen des katalytischen His-64 (nicht in Figur 4 gezeigt) überlagert werden kann. Das deutete darauf hin, daß, wenn das Histidin in der katalytischen Triade von Subtilisin unter Einsatz von stellengerichteter Mutagenese durch ein Alanin ersetzt wurde, ein Histidin vom Substrat die fehlende katalytische Gruppe im mutanten Enzym substituieren kann.
Es wird angenommen, daß Reifung des primären Subtilisingenprodukts (Präprosubtilisin) zu Subtilisin in B. subtilis durch Autoproteolyse vermittelt wird, an der Spurenmengen von aktivem Subtilisin beteiligt sind (Power, S.D. et al. (1986) Proc.Natl.Acad.Sci USA 83, 3096). Die His-64TAla-Mutation verursachte eine starke Verringerung der Abcheidung von reifem Subtilisin. Jedoch war es möglich, den inaktiven Ala-64-Mutanten zu verarbeiten und daraufhin zu reinigen, indem gleichzeitig B.subtilis-Zellen kultiviert wurden, die das mutante Ala-64-Gen mit B.subtilis-Zellen enthielten, die ein aktives Subtilisingen trugen ("Helfer").
Es wurden strenge Vorsichtsmaßnahmen getroffen, um die Reinigung von Ala-64-Subtilisin weg vom "Helfer-"Subtilisin und jeglichen anderen verunreinigenden Proteasen sicherzustellen. Erstens wurde das mutante Subtilisin im in der EPO-Veröffentlichung Nr. 0130756 beschriebenen B. subtilis Wirt BG2036 exprimiert, dem chromosomale Kopien der Gene für alkalische Protease (Subtilisin) und neutrale Protease fehlten. Zweitens wurde, um "Helfer"-Verunreinigung zu minimieren, das Verhältnis zwischen "Helfer"-Zellen und Ala-64-Zellen in der Fermentationskultur auf 1:1000 eingestellt. Drittens wurde eine funktionell stille Ser-24-CysTMutation, die auf der Oberfläche von Subtilisin angeordnet ist (Wells, J.A. et al. (1986) J.Bio.Chem. 261, 6564) in den Ala-64-Mutanten eingebracht. Dieses zugängliche Cystein diente als eine Affinitätshandhabe zur Reinigung des Ala-64-Mutanten weg vom nichtcysteinhältigen "Helfer" auf einer aktivierten Thiolsepharosesäule. Schließlich enthielt das aktive "Helfer"-Subtilisin eine funktionell stille Ala-48TGlu-Mutation, die ihre elektrophoretische Mobilität bezüglich Cys-24/Ala-64 auf nativen und SDS-Polyacrylamidgels änderte. Nach der Reinigung wurde durch silbergefärbte SDS (Morrissey, J.H. (1981) Anal.Biochem. 11, 307; Laemmli, U.K. (1970) Nature 227, 580) und native Polyacrylamidgelelektrophorese die Reinheit des Cys-24/Ala-64-Mutanten mit mehr als 99% beurteilt. Diese Reinigungsverfahren, einschließlich der Verwendung eines Helfersubtilisins, das zur elektrophoretischen Trennung vom Subtilisinmutanten fähig ist, sind nicht notwendigerweise erforderlich, um die vorliegende Erfindung durchzuführen.

Beispiel 1

Konstruktion von Helfersubtilisin, das eine funktionell stille Ala-48TGlu-Mutation enthält

Die Konstruktion von pS4 wird im Detail in der EPO-Veröffentlichung Nr. 0130756 beschrieben. Dieses Plasmid ist in Figur 6 dargestellt. pS4 enthält 4,5 kb von pBS42 abgeleitete Sequenz (volle Linie) und 4,4 kb Sequenz, die das B.amyloliquefaciens-Subtilisingen und flankierende Sequenzen enthält (strichlierte Linie). pBS42 wurde wie in der EPO-Veröffentlichung Nr. 0130756 und Band, L. und Henner, D.J. (1984) DNA 3, 17-21 beschrieben konstruiert. Es wurde mit BamHI digeriert und mit Sau3A teilweise digerierter chromosomaler DNA von B. amyloliquefaciens (ATCC Nr. 23844) wie in der EPO-Veröffentlichung Nr. 0120756 beschrieben ligiert. pS4 wurde aus dieser genomischen Sammlung ausgewählt.
pS4-5, ein nach Wells, et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11, 7911-7924, hergestelltes Derivat von pS4, wurde mit EcoRI und BamHI digeriert und das 1,5 kb EcoRI-BamHI-Fragment wurde wiedergewonnen. Dieses Fragment wurde in M-13 mp 9 replikativer Form ligiert, das mit EcoRI und BamHI digeriert worden war (Sanger, et al., (1980), J.Mol.Biol. 143, 161-178; Messing, et al., (1981) Nucleic Acids Res. 9, 304-321; Messing, J. und Vieira, J. (1982) Gene 19, 269-276). Die als M-13 mp9 SUBT bezeichneten M-13 mp9-Phagenligationen wurden verwendet, um E.coli Stamm JM101 (ATCC 33876) zu transformieren, und einstrangige Phagen-DNA wurde aus einer 2 ml-Kultur über Nacht hergestellt. Ein Oligonukleotidprimer mit der Sequenz
5'-GTAGCAGGCGGAGAATCCATGGTTCC-3
wurde synthetisiert. Der Primer umfaßte die Sequenz des Subtilisingenfragments, das für die Amionosäuren 44 bis 52 kodiert, mit der Ausnahme, daß das Kodon, das normalerweise für Alanin kodiert, mit dem Kodon GAA substituiert wurde, das für Glutamat kodiert; das Serinkodon an 49(AGC) wurde auch in TCC umgewandelt,um eine zweckmäßige NcoI-Stelle einzubringen.
Der Primer (etwa 15 uM) wurde durch Inkubation mit [ ³²p]-ATP (10 uL in 20 uL-Reaktion) (Amersham 5000 Ci/mmol, 10218) und T&sub4;-Polynukleotidkinase (10 Einheiten) markiert, gefolgt von nichtradioaktivem ATP (100 uM), um die vollständige Phosphorylierung des Mutageneseprimers zuzulassen. Die Kinase wurde durch Erwärmen der Phosphorylierungsmischung auf 68ºC für 15 Minuten inaktiviert.
Der Primer wurde durch Kombinieren von 5 uL des markierten Mutageneseprimers ( 3 uM), 1 ug M-13 mp9 SUBT-Schablone, 1 uL 1 uM M-13 Sequenzierungsprimer (17-mer) und 2,5 uL Puffer (0,3 M Tris pH 8, 40 mM MgCl&sub2;, 12 mM EDTA, 10 mM DTT, 0,5 mg/ml BSA) zu M-13 mp9 SUBT hybridisiert, wie von Norris, et al., (1983) Nucleic Acids Res. 11, 5103-5112 modifiziert. Die Mischung wurde 10 Minuten lang auf 68ºC erwärmt und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur abgekühlt. Der Ringschlußmischung wurden 3,6 uL 0,25 mM dGTP, dCTP, dATP und dTTP, 1,25 ul 10 mM ATP, 1 uL Ligase (4 Einheiten) und 1 uL Klenow (5 Einheiten) hinzugefügt. Die Primerextensions- und -ligationsreaktion (Gesamtvolumen 25 ul) lief 2 Stunden lang bei 14ºC ab. Das Klenow und die Ligase wurden durch 20minütiges Erwärmen auf 68ºC inaktiviert. Die erwärmte Reaktionsmischung wurde mit BamHI und EcoRI digeriert und ein Aliquot des Digests wurde auf ein 6 % Polyacrylamidgel aufgebracht und radioaktive Fragmente wurden durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Das zeigte, daß der [³²P] Mutageneseprimer tatsächlich in das EcoRI-BamHI-Fragment aufgenommen worden war, welches das nun mutierte Subtilisingen enthielt.
Das Verbleibende der digerierten Reaktionsmischung wurde mit 10 mM Tris, pH 8, das 1 mM EDTA enthielt, auf 200 uL verdünnt, einmal mit einer 1:1 (V:V) Phenol/Chloroform-Mischung extrahiert, dann einmal mit Chloroform, und die wässerige Phase gewonnen. 15 uL 5M Ammoniumacetat (pH 8) wurden gemeinsam mit 2 Volumina Äthanol hinzugefügt, um die DNA von der wässerigen Phase auszufällen. Die DNA wurde durch 5-minütige Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge pelletiert, und der Überstand wurde verworfen. 300 uL 70%iges Äthanol wurden hinzugefügt, um das DNA-Pellet zu waschen, die Waschflüssigkeit wurde verworfen und das Pellet lyophilisiert.
pBS42 wurde mit BamHI und EcoRI digeriert und auf einem Acrylamidgel gereinigt, um den Vektor zu gewinnen. 0,5 ug des digerierten Vektors, 0,1 ug des obigen primermutierten EcoRI-BamHI-digerierten genomischen Subtilisinfragments, 50 uM ATP und 6 Einheiten Ligase wurden in 20 ul Ligationspuffer aufgelöst. Die Ligation fand über Nacht bei 14ºC statt. Die DNA wurde in den B.subtilis Wirt BG2036 transformiert.

Beispiel 2

Konstruktion von His-64TAla mutantem Subtilisin

Das B. amyloliquefaciens Subtilisingen auf einem 1,5 kb EcoRI-BamHI-Fragment (Wells, J.A. et al., (1983) Nucleic Acids Res. 11, 7911-7925) wurde in M13mp11 geklont (Messing, J. und Vieira, J., (1982) Gene 19, 269-276), um M13mp11SUBT und einstrangige DNA isoliert zu ergeben (Carter P., et al., (1985) in "Oligonucleotide site-directed mutagenesis in M13" Anglian Biotechnology Limited). Die Mutation His64TAla wurde unter Verwendung des synthetischen Oligonukleotids HA64'
und der M13 SUBT-Schablone nach einem zuvor beschriebenen Verfahren (Carter, P., et al., (1985) Nucleic Acids Res. 13, 4431-4443) konstruiert. Die Sterne in HA64 zeigen Fehlanpassungen an die Wildtypsequenz an und unterstrichen ist eine einzelne SACII-Restriktionsstelle.
Der Primer (HA64) wurde zu einer einstrangigen M13SUBT-Schablone ringgeschlossen, die 12 Stunden lang bei 4ºC mit DNA-Polymerase 1 (Klenowfragment) in der Gegenwart von Deoxynukleosidtriphosphaten und T4-DNA-Ligase verlängert wurde (Carter P., et al., (1985) Nucleic Acids Res. 13, 4431-4443). Die M13 Heteroduplex-DNA wurde dann direkt in den E.coli Wirt BMH 71-18 mutL transfiziert (Kramer, B., et al., (1984) Cell 38, 879-887). Mutante Phagen wurden durch Kolonieblot-Hybridisierungsscreening wie zuvor beschrieben identifiziert (Carter, P.J. et al., (1984) Cell 38, 835-840).
Mutmaßliche His64-> Ala-Mutanten wurden durch Didesoxynukleotidsequenzieren verifiziert (Sanger, F. et al., (1977) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 77, 5463-5467) wie von Bankier, A.T. und Barrell, B.G. (1983) in "Techniques in the life sciences" B5, Nucleic Acids Biochemistry, B508, 1, Elsevier, Ireland modifiziert und mit M13mp11SUBT-Ala-64 bezeichnet. Das 1,5 kb EcoRI-BamHI-Fragment von M13mp11SUBT-Ala-64 wurde isoliert und mit dem 3,7 kb EcoRI-BamHI-Fragment vom B.subtilis-E.coli Shuttlevektor pBS42 ligiert (Band, L. und Henner, D.J. (1984) DNA 3, 17-21). E.coli MM294-Zellen (Murray, N.E. et al., (1977) Mol.Gen. Genet. 150, 53) wurden mit der Ligationsmischung unter Verwendung eines CaCl&sub2;-Verfahrens (Cohen, S.N. Chang, A.C.Y., und Hsu, L., (1972) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 69, 2110-2114) transformiert. Plasmid-DNA wurde von einzelnen Transformanten unter Verwendung eines Alkali-Natriumdodecylsulfat(SDS)verfahrens (Birboim, H.C. und Doly, J. (1979) Nucleic Acids Res. 7, 1513-1528 wie von Burke, J.F. und Ish-Horowicz, D. (1982) Nucleic Acids Res. 10, 3821-3830 modifiziert), um pBS42SUBT-Ala-64 zu erzeugen. Die Ala64-Mutation wurde durch Restriktionsendonukleasedigeste der Plasmid-DNA unter Verwendung der Enzyme SacII und BamHI, die ein 0,9 kb Fragment erzeugen, verifiziert.

Beispiel 3

Konstruktion des Doppelmutanten Ser-24TCys/His-64TAla

Der Doppelmutant Ser-24-CysT24/His-64TAla wurde aus den einzelnen Mutanten pBS42SUBT-Cys-24 (Wells, J.A. und Powers, D.B., (1986) J.Biol.Chem. 261, 6564-6570) und pBS42SUBT-Ala-64 (vorliegendes Dokument) durch eine 3-Weg-Ligation unter Verwendung der folgenden Fragmente konstruiert: 3,7 kb EcoRI/BamHI aus pBS42, 0,5 kb EcoRI/Clal aus pBS42SUBT-Cys-424 und das 1,0 kb Clal/BamHI aus pBS42SUBT-Ala-64. Der Doppelmutant Cys-24/Ala-64 wurde durch Restriktionsendonukleasestellenmarkierungen identifiziert, die durch die einfachen Mutationen eingebracht wurden (His-64TAla: neue SacII-Stelle; Ser-24TAla: Sau3A-Stelle entfernt) und als pBS425UBT-Cys-24/Ala-64 bezeichnet. Das pBS42SUBT-Cys-24/Ala-64-Plasmid wurde in den B.subtilis Wirt BG2036 eingebracht (Anagostopoluos, C. und Spizizen, J. (1961) J.Bacteriol. 81, 741-746), dem alkalische und neutrale Proteasen fehlten (Yang, M.Y. et al., (1984) J.Bacteriol. 160, 15-21).

Beispiel 4

Gemeinsame Kultivierung von Cys-24/Ala-64 und Glu48 mutanten Subtilisinen

Mutante Subtilisingene wurden in BG2036 durch Fermentation in Rüttelkolben bei 37ºC 18-20 Stunden lang unter Verwendung von 2 X TY-Medien exprimiert (Miller, J.H. (1972) in "Experiments in Molecular Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY), das 12,5 ug/ml Chloramphenicol enthielt. Cokulturen wurden durch Verdünnen von Cys-24/Ala-64-Kulturen im Verhältnis 1:100 und Glu-48-Kulturen im Verhältnis 1:100.000 in 2 x TY, das 12,5 ug/ml Chloramphenicol enthielt, hergestellt und bei 37ºC 20-24 Stunden lang unter heftiger Belüftung gezüchtet.

Beispiel 5

Reinigung von Cys-24/Ala-64

Kulturen (21) wurden zentrifugiert (8 000 g, 15 min, 4ºC) und dem Überstand 3 Volumina Äthanol (-20ºC) hinzugefügt. Nach dem Zentrifugieren (8 000 g, 15 min. 4ºC) wurde das Pellet erneut in 50 mM Tris.HCl (pH 8,0), 5 mM CaCl&sub2;, 10mM Dithiotreitol (DTT), 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) suspendiert. Nach dem Zentrifugieren (40 000 g, 30 min., 4ºC) wurde der Überstand gegen 2 l 10mM 2-[N-Morpholinläthansulfonsäure (MES) (pH 6,0), 5mM CaCl&sub2;, 10 mM DTT, 0,1 mM PMSF (S-Puffer) über Nacht bei 4ºC dialysiert. Das Dialysat wurde über eine 50 ml DE52 (Whacman)-Säule geschickt und auf eine 50 ml CM Trisacryl (LKB)-Säule geladen. Subtilisin wurde mit einem 600 ml Gradienten von S-Puffer, der 0-100 mM NaCl enthielt, mit 1,5 ml/min eluiert. Vereinigte subtilisinhältige Fraktionen wurden gegen 2 l entlüftete 10 mM MES (pH 6,0), 5mM CaCl&sub2;, 100mM NaCl, 0,1 mM PMSF (T-Puffer) dialysiert. Proben wurden auf eine aktivierte Thiolsepharosematrix (Pharmacia) geladen, ausgiebig mit T-Puffer gewaschen und dann mit T-Puffer eluiert, der 20 mM DTT enthielt. Das Eluat wurde unter Verwendung von Centricon 10 Mikrokonzentratoren (Amicon) eingeengt und dann durch Gelfiltration unter Verwendung von PD10 G25 (Pharmacia)-Säulen in 10 mM MES (pH 6,0), 5mM CaCl&sub2;, 10mM DTT, 0,1mM PMSF (U-Puffer) transferiert. Die Subtilisinkonzentration wurde durch die gemessene dekadische Extinktion bei 230 nm (E&sub2;&sub8;&sub0; 0,1% = 1,17) (Matsubara, H. et al., (1965) J.Biol.Chem. 240, 1125-1130) bestimmt. Aliquote an gereinigtem Enzym wurden in flüssigem Stickstoff blitzartig gefroren und dann bei -70ºC gelagert.

Beispiel 6

Präparative native Gelelektrophorese

1,5 mg Cys-24/Ala-64 Subtilisin in U-Puffer wurde auf 10 mM Phenylboronat, 10 Vol.-% Glycerin und 0,1 Gew./Vol.-% Methylenblue eingestellt. Die Probe wurde 24 Stunden lang bei 7 W (konstant) auf einem 10%igen Polyacrylamidgel (20 cm x 20 cm x 0,75 cm) mit rezirkulierendem Puffer der Elektrophorese unterworfen. Der Lauf-Puffer und das Gel enthielten 10 mM Phenylboronat, 2mM CaCl&sub2;, 5mM DTT 50 mM Histidin und 60 mM 3-[N-Morpholin]propansulfonsäure (MOPS). Das Protein wurde auf Nitrozelluiose diffusionsgeblottet (Hancock, K. und Tsang, V.C.W., (1983) Anal.Biochem. 133, 157-162 wie modifiziert von Carter, P., et al., (1986) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 83, 1189-1192). Subtilisin wurde nach dem Binden von Kaninchen-anti-Subtilisinantikörper (Power, S.D. et al., (1986) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 83, 3096-3100), dann Meerrettichperoxidase-konjugiertes Protein A unter Verwendung des chromogenen Substrats 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid sichtbar gemacht. Subtilisinhältige Gelscheiben wurden in Dialysebeutel mit 6 ml Lauf-Puffer (unter Wegiassung von Phenylboronat) gegeben und bei 10 mA (konstant) 20 Stunden lang bei 4ºC elektroeluiert. Wiedergewonnenes Material wurde eingeengt und zu U-Puffer wie für säulengereinigtes Enzym (oben) transferiert.

Beispiel 7

Kinetische Analyse von Cys24/Ala64

Die kinetischen Parameter für Cys-24 und Cys-24/Ala-64 wurden gegen die Substrate N-Succinyl-L-Phe-L-Ala-L-[X]-L-Phe- -nitroanilid (abgekürzt sFAXF-pNA) bestimmt, worin x (P2 Position) Ala, Gln oder His war (Tabelle I). Die kinetischen Parameter für das Cys-24-Enzym sind im wesentlichen identisch mit Wildtypsubtilisin gegen diese Substrate, was darauf hindeutet, daß die Ser24TCys-Mutation kinetisch still ist. Im Vergleich dazu verursacht die His-64TAla-Mutation einen 10&sup6;-fachen Abfall an kcat/Km gegen die Ala und Gln P2-Substrate. Beinahe die gesamte Abnahme an katalytischer Wirksamkeit wird durch einen verringerten kcat-Term (bis zu 10&sup6; Mal) verursacht, obwohl kleinere, aber wichtige Zunahmen an Km auftreten. Anders als Wildtyp- oder Cys-24-Subtilisin war das Cys-24/Ala-64-Enzym völlig resistent gegen Hemmung durch das aktive Stellenreagens, Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF). Das läßt darauf schließen, daß das katalytische Histidin für stabile Sulfonylierung durch PMSF entscheidend ist. Obwohl der Anteil an funktionell aktiven Stellen in Cys-24/Ala-64-Enzympräparaten durch derartiges Markieren der aktiven Stellen nicht direkt bestimmt werden konnte, wies Enzym, das durch zusätzliche native Gelelektrophorese gereinigt wurde (Beispiel 6) idente kinetische Parameter mit in Tabelle V beschriebenem Cys-24/Ala-64 auf.
Die Daten stehen damit im Einklang, daß His-64 bei der Katalyse (vermutlich durch Protonentransfer) äußerst wichtig ist und bei der Substratbindung nur am Rande wichtig ist. Da man jedocn nicht sicher sein kann, daß Acylierung für den Ala-64-Mutanten ratenbegrenzend ist, wie das für Wildtypenzym der Fall ist (Wells, J.A. (1986) Phil.Trans.R.Soc.Lond.A, 317, 415-423), ist es möglich, daß die relativ kleinen Veränderungen an Km keine Veränderungen der Enzymsubstratdissoziationskonstanten (Ks) widerspiegeln, sondern eine Verlagerung im die Rate bestimmenden Schritt der Reaktion (Guttreund, et al. (1956) Biochem. J., 63, 656). In jedem Fall trägt das katalytische Histidin einen Faktor von etwa 10&sup6; zur gesamten Erhöhung der enzymatischen Rate bei (Tabelle V).
Die katalytische Wirksamkeiten von Cys-24 gegenüber den drei P2-Substraten liegen alle innerhalb eines Faktors von 5 zueinander. Für den Cys-24/Ala-64-Mutanten, sind kcat/Km für die Ala- und Gln- P2-Substrate im wesentlichen gleich; jedoch ist die Hydrolyse des HisP2-Substrats jeweils 170 bis 210 Mal wirksamer. Im wesentlichen die gesamte Zunahme an kcat/Km für das His gegenüber den Ala- und Gln-P2-Substraten resultiert daraus, daß der kcat-Term um einen Faktor von 2000 bzw. 500 größer ist. Die größeren Km-Werte für die His- und Gln-P2-Substrate im Vergleich zu Ala spiegeln möglicherweise eine verringerte Bindungsaffinität wider, die das Resultat einer sperrigen Gruppe bei P2 ist. Größere Km-Werte werden auch bei den Gln- -und His-Substraten für das Cys-24-Enzym beobachtet. So wird der von der His-64-AlaTMutation verursachte Abfall an kcat/Km beim Spalten eines His-P2-Substrats teilweise wiederhergestellt. Die Nettowirkung ist eine deutliche Zunahme an Substratpräferenz für eine His-P2-Seitenkette, die auf der Katalyse- und nicht auf der Bindungsebene herbeigeführt wird. Die nichtenzymatische Hydrolyserate des HisP2-Substrats ist den Ala- und Gln-P2-Substraten ähnlich (Tabelle V). So wird das His-P2-Substrat nur im Kontext der vom Enzym geschaffenen katalytischen Gruppen funktionell aktiv.
Die Tatsache, daß die katalytische Wirksamkeit des Cys-24/Ala-64-Mutanten gegen das His-P2-Substrat 5000-fach unter dem Wildtyp liegt, deutet darauf hin, daß His vom Substrat P2 bei der Katalyse schlecht wirkt. Das kann davon herrühren, daß das His P2 schlechte sterische Kontakte herstellt und/oder von ungeeigneter Ausrichtung der katalytischen Triade. Tatsächlich entspricht das Modell der His P2-Seitenkette nicht genau dem katalytischen His-64, insofern, als die Ebenen der Histidine vom Enzym und dem Substrat beinahe senkrecht zueinanderstehen (Figur5).

Beispiel 8

pH-Abhängigkeit von Peptidbindungs- hydrolyse durch Cys²&sup4;/Ala&sup6;&sup4;

Die pH-Abhängigkeit von kcat/Km- für Wildtypsubtilisin zeigt eine sigmoidale Zunahme von pH 6 zu 8 (Glazer, A.N. (1967), J. Biochem., 242 433), die die Titrierung des katalytischen His&sup6;&sup4; (pKa:7,1 ± 0,1) widerspiegelt. Das Wildtyp-pH-profil bleibt über den Bereich von 8 bis 10 relativ flach und sinkt danach ab (Ottesen, et al. (1970), In Methods of Enzymology (Hrsg. Perleman, Acad. Press, N.Y. Band 19, S.199)).
Figur 7 zeigt die pH-Abhängigkeit der Hydrolyse von p-Nitroanilidpeptidsubhstraten durch Cys-24/Ala-64-Subtilisin. Analyse von Cys-24/Ala-64 gegen sFAAF-pNA (Figur 7A) wurde wie in Tabelle V bestimmt, wobei aber 100 mM Tris.HCl oder 100 mM 3-(Cyclohexylamino)-1-propansulfonsäure (CAPS)-Puffer eingesetzt wurde. Die Daten wurden angepaßt, wobei eine lineare Beziehung mit Hydroxidionenkonzentration angenommen wurde (volle Linien in den Figuren 7a und 7b). Die Analyse von Cys-24/Ala-64 mit sFAHF-pNA (Figur 7C) wurde wie in Tabelle V bestimmt, mit der Ausnahme, daß 100 mM 3-(N-morpholino)propansulfonsäure (MOPS)-Puffer (ausgefüllte Kreise) oder 100 mM Tris.HCl (offene Kreise) eingesetzt wurden und dann die Ionenstärke unter Verwendung von KCl normiert wurde. Die Daten wurden unter Verwendung eines Anpassungsverfahrens der kleinsten Quadrate an eine sigmoide Beziehung angepaßt (volle Linie).
Die pH-Abhängigkeit von kcat/Km unterscheidet sich beim Cys-24/Ala-64-Enzym deutlich. Beim sFAAF-pNA-Substrat gibt es eine 15-fache Zunahme an kcat/Km zwischen pH 8 und 10 (Figur 7A). Das kcat/Km zeigt eine lineare Abhängigkeit von der Hydroxidionenkonzentration (Figur 7B), was darauf hindeutet, daß ein Hydroxidion in Abwesenheit einer katalytischen Histidinseitenkette als eine katalytische Base wirken kann. Wenn man von der Zunahme an kcat/Km als eine Funktion der Hydroxidkonzentration (2 x 10&sup4; s&supmin;¹M&supmin;²) zum kcat/Km für Cys-24 gegen dieses selbe Ala P2-Substrat (8 x 10&sup5; s&supmin;¹M&supmin;¹) extrapoliert, wäre die äquivalente Konzentration des Hydroxidions etwa 40 M.
Im Gegensatz dazu zeigt das kcat/Km für die Hydrolyse von sFAHF-pNA durch Cys-24/Ala-64 eine sigmoidale pH-Abhängigkeit zwischen pH 6 und 8 (Figur 2C), die Wildtypsubtilisin ähnlich ist. Das pKa der wirksamkeitsabhängigen Gruppe beträgt 6,8 ± 0,1, und fast die gesamten pH-abhängigen Veränderungen an kcat/Km resultieren aus Veränderungen im kcat (Daten nicht gezeigt). Für das sFAHF-pNA-Substrat gibt es keine starke lineare Zunahme an kcat/Km mit Hydroxid über pH 8, wie für die Hydrolyse von sFAAF-pNA beobachtet. Diese Daten deuten stark darauf hin, daß die P2-Histidinseitenkette vom Substrat funktionell für das fehlende katalytische Histidin 64 substituieren kann.
Die in Tabelle V gezeigten Daten (gemessen bei pH 8,6) unterschätzten die Substratpräferenz für His gegenüber Ala (und Gln), da das kcat/Km für das sFAHF-pNA bei pH 8,0 maximal ist (Figur 7C), während es für das sFAAF-pNA-Substrat bei pH 8,0 deutlich niedriger ist (Figur 7B). So schätzt man für Cys-24/Ala-64 bei pH 8,0, daß die Substratpräferenz bis zu 400 Mal für das His P2-Substrat gegenüber den entsprechenden Ala- oder Gln-Substraten liegt.

Tabelle V

Kinetische Analyse von mutantem Subtilisin gegen die Substrate N-Succinyl-L-Phe-L-Ala-L-X-L-Phe- -nitroanilid, worin X Ala, Gln oder His ist. Sechs Hydrolyseassays wurden gleichzeitig gegen entsprechende Substratblindproben in 0,10 M Tris-HCl (pH 8,6), 10 mM DTT bei 25 ± 0,1ºC unter Verwendung eines Kontron unvikon 860-Spektrophotometers durchgeführt. Die anfänglichen Umsetzungsraten wurden durch die Zunahme an dekadischer Extinktion bestimmt, die durch die Freisetzung von -Nitroanilingruppe (&epsi; M&sup4;¹&sup0;=8.480 M&supmin;¹, cm&supmin;¹ (DelMar, E.G. et al. (1979) Anal. Biochem. 99 316)) verursacht wurde, und durch lineare Regression an ein Eadi-Hofstee-Plot angepaßt, um Vmax zu berechnen, und Km kcat wurde aus Vmax/[Enzym] berechnet, wobei die spektrophotometrisch bestimmte Enzymkonzentration verwendet wurde (Matsubara, et al. (1965) J.Biol.Chem. 240, 1125). Die Enzymkonzentrationen bei den Tests betrugen etwa 50 ug/mL für Cys-24/Ala-64 und 1 ug/mL für Cys-24. Die Standardfehler bei allen Bestimmungen lagen unter 20%. Eine leichte Variation der absoluten kinetischen Werte ist zwischen Enzymchargen beobachtet worden, aber die relativen Werte unter den Substraten sind konstant geblieben. Substrat nichtenzymatisch P2-Rest Hydrolyserate
Verschiedene Hinweise deuten darauf hin, daß die Cys-24/Ala-64 zugeschriebene Wirksamkeit nicht das Ergebnis irgendeiner anderen Proteaseverunreinigung ist. Erstens ist die extreme Substratpräferenz für His an der P2-Position ungleich Wildtypsubtilisin oder jeder bekannten Bacillus-Protease. Zweitens weist der Mutant Km-Werte auf, die sich deutlich von Wildtypsubtilisin unterscheiden, was auf Unterschiede in der Energetik zwischen Substratbindung und/oder Katalyse hindeutet. Drittens ist der Mutant, anders als andere Serinproteasen, völlig resistent gegen Hemmung durch PMSF. Tatsächlich werden die kinetischen Bestimmungen für den Cys-24/Ala-64-Mutanten routinemäßig in der Gegenwart von PMSF durchgeführt, um jegliche Möglichkeit von aktivem "Helfer"-Subtilisin auszuschließen (Tabelle V, Figur 7). Viertens sind die substratabhängigen pH-Profile anders als alle bekannten Proteasen. Fünftens sind Präparate aus Cys-24/Ala-64 äußerst unverfälscht von anderen verunreinigenden Proteinen, ausgehend von der Analyse auf SDS und nativen Gels (> 99%). Schließlich sind die für Cys-24/Ala-64, das zusätzlich durch native Gelelektrophorese gereinigt wurde (Beispiel 6), bestimmten kinetischen Werte im wesentlichen gleich wie die in Tabelle V berichteten.

Beispiel 9

Hydrolyse von Polypeptidsubstraten durch Cys-24/Ala-64

Um die Spezifität des Cys-24/Ala-64-Mutanten im Vergleich zu Cys-24 weiter zu bewerten, wurden beide Enzyme mit einem 20 Reste-Fragment der Inhibin B-Kette bei pH 8,0 inkubiert. Die Wahl des Peptids basierte auf der Gegenwart von zwei Histidinen (Position 5 und 11) gemeinsam mit 16 verschiedenen Aminosäuren und einer Vielzahl großer hydrophober Aminosäuren, die bevorzugte Aminosäuren sind, an der P1-Position von Wildtypsubtilisin (Esteil, D.A. et al. (1986) Science 233, 659). Figur 8 zeigt die Hydrolyse des Inhibinpeptidsubstrats TVINHYRMRGHSPFANKLSC durch Cys-24/Ala-64-Subtilisin. Dieses Substrat (100 ug) wurde mit 10 ug Cys-24/Ala-64 (Figur 8A) oder 0,13 ug Cys-24 (Figur 83) digeriert. Die Reaktionsmischungen hatten ein Gesamtvolumen von 250 uL und enthielten 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM Dithiothreitol, 5 Vol-% Dimethylsulfoxid und 1 mM PMSF (nur Cys-24/Ala-64). Nach den angegetenen Zeiten bei 37ºC wurden die Digestionsprodukte (überwacht bei 214 nm) von einer Umkehrphasen-HPLC-Säule (Waters, C18) eluiert, wobei ein Gradient (von links nach rechts) von 0-50 Vol-% Acetonitril in 0,1 Vol.-% Trifluoressigsäure verwendet wurde.
Nach 2-stündiger Inkubation mit Cys-24/Ala-64 (Figur 8A) wurde ein 120-facher Molüberschuß an Inhibinpeptid (Peak a) mit mehr als 95%iger Vollständigkeit in zwei Stücke gespalten (Peaks b und c). Die Analyse der Aminosäurezusammensetzung dieser beiden Peptidfragmente zeigte an, daß Spaltung zwischen Tyr-6 und Arg-7 stattgefunden hatte, wie es für substratunterstützte Katalyse durch His-5, angeordnet an der P2-Position von der Spaltungsstelle erwartet wurde. Nach zehnmal längerer Digestion (20 Stunden) trat ein kleinerer dritter Peak auf (in Figur 8A mit X markiert). Die Analyse zeigte, daß er die gleiche Zusammensetzung wie das nicht digerierte Inhibinpeptid aufwies. Dieses Nebenprodukt trat auch bei einer nichtenzymatischen Blindprobeninkubation auf. An der zweiten Histidinstelle wurde keine Digestion beobachtet.
Im Gegensatz zu den von Cys-24/Ala-64 erzeugten beiden Fragmenten erzeugte das Cys-24-Enzym zumindest sieben Fragmente (Figur 8B) mit einem ähnlichen Digestionsausmaß des Ausgangsmaterials (vergleiche 5 Minuten Digestion mit Cys-24 bis 2 Stunden Digestion mit Cys-24/Ala-64). Obwohl keines dieser sieben Fragmente sequenziert wurde, eluierten die ersten beiden erzeugten vom HPLC-Profil an den gleichen Positionen wie die Peaks b und c in Figur 8A. Digestion bis zu 95%iger Vollständigkeit des Ausgangspeptids durch Cys-24 (30 min Inkubation, Figur 8C) erzeugte mehr als zehn verschiedene Peptidfragmente.
Digestionsversuche für diese und fünf andere Peptide werden in Tabelle VI zusammengefaßt. Ein 10-Reste-Fragment von menschlichem ACTH wurde durch Cys-24/Ala-64 quantitativ an einer einzelnen Stelle gespalten. Die Aminosäurezusammensetzungsanalyse der beiden Digestionsprodukte bestätigte, daß die Spaltung wie erwartet mit einem His-Rest an der P2-Position des Substrats aufgetreten war. Jedoch ergab die Digestion dieses Peptids mit Cys-24 auch spezifische Spaltung an dieser Position (nicht gezeigt). Das ergab sich vermutlich, weil Phe einen sehr günstigen P1-Rest bietet und die zwei kurzen freigesetzten Peptide keine wirksamen Substrate für Subtilisin bieten. Die vier anderen getesteten Peptide (von denen drei His enthielten und eines nicht) wurden nicht durch Cys-24/Ala-64 gespalten, sondern wurden an mehreren Stellen durch den Cys-24 Mutanten gespalten (nicht gezeigt).

Tabelle VI

Digestion von Peptidsubstraten durch Cys-24/Ala-64-Subtilisin. Verschiedene gezeigte synthetische Peptide (200 ug) wurden mit Cys-24/Ala-64 (10 ug) in 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM DTT, 5 Vol.-% Dimethylsulfoxid, 1 mM PMSF (250 uL Gesamtvolumen) 20 Stunden lang bei 37ºC digeriert. Digestionsprodukte wurden durch Umkehrphasen HPLC wie in Fig. 3 beschrieben analysiert. Die durch Umkehrphasen HPLC gewonnenen Digestionsprodukte wurden vor der Aminosäureanalyse unter Verwendung von Nor-leucin als ein innerer Standard 24 Stunden lang in 6 N HCl, 1 Vol.-% Phenol hydrolysiert. Die Cys-Reste in Rinderinsulin A- und B-Ketten wurden zu CysSO&sub3;H oxidiert. Sequenzen sind durch den Einzelbuchstabenaminosäurecode bezeichnet. Peptidquelle Sequenz Spaltungspeptide mit Cys-24/Ala-64 Inhibin-β-Kette Reste 61-80 ACTH Reste 1-10 Ubiquitin Peptid C Rinderinsulin B-kette (oxidiert) Rinderinsulin A-kette (oxidiert) nicht gespalten
Diese Versuche sagen viel über die Wirksamkeit, Spezifität und Nützlichkeit des Cys-24/Ala-64-Mutanten aus. Zusätzlich zu -Nitroanilidsubstraten ist das Enzym fähig, normale Peptidbindungen zu spalten. Anders als das Cys-24-Enzym scheint die Spezifität von Cys-24/Ala-64 auf Stellen begrenzt zu sein, die eine an der P2-Position der Spaltungsstelle angeordnete Histidinseitenkette enthalten. Des weiteren sind zusätzliche Spezifitätsdeterminanten erforderlich, weil nicht alle His P2-Stellen gespalten sind. Es wird angenommen, daß das die normalen Spezifitätsdeterminanten des Wildtypenzyms widerspiegelt. Peptidsubstrate wurden so ausgewählt, daß His eine große hydrophobe Aminosäure folgte, die für die P1-Stelle in Subtilisin bevorzugt wird (Estell, D.A. et al. (1986) Sci. 233, 659; Phillip, M. et al. (1983) Mol. Cell Biochem. 51, 5; Svendsen, I. (1976) Carlsberg Res. Commun. 41, 237). Es ist wenig über die P1'-Spezifität bekannt, aber die Abwesenheit von Spaltung an den anderen His-Stellen spiegelt vielleicht die Gegenwart eines negativ Geladenen (Glu oder Cys SO&sub3;H), eines β-verzweigten (Val) oder eines Prolins wider, die alle schwach hydrolysierte P1-Aminosäuren sind (Estell, D.A. et al. (1986) Sci. 233, 659). Alle Literaturhinweise sind ausdrücklich durch Verweis hierin enthalten.
Nachdem die bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben worden sind wird Fachleuten klar sein, daß verschiedene Änderungen an den geoffenbarten Ausführungsformen durchgeführt werden können und daß derartige Änderungen im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung liegen sollen.

Claims

1. Enzymmutant, der nicht in der Natur vorkommt, wobei der genannte Enzymmutant durch das Ersetzen oder die Modifikation von zumindest einer katalytischen Gruppe eines Aminosäurerests in einem Vorläuferenzym hergeleitet ist, der, wenn er mit einem ausgewählten Bereich eines Polypeptidsubstrats in Kontakt steht, katalytisch damit wirkt, um einen Enzymmutanten zu bilden, der mit dem genannten Polypeptidsubstrat im Vergleich zur katalytischen Wirksamkeit des genannten Enzymmutanten mit zumindest einem modifizierten Substrat katalytisch relativ inaktiv ist, wobei das genannte modifizierte Substrat durch Ersetzen oder Modifizieren einer Gruppe im genannen ausgewählten Bereich gebildet wird, um eine modifizierte Gruppe zu bilden, welche die genannte eine katalytische Gruppe oder ihr Äquivalent enthält.

2. Enzymmutant nach Anspruch 1, worin die genannte eine katalytische Gruppe im genannten Vorläuferenzym mit einer zweiten Gruppe substituiert ist, die ein Volumen aufweist, das geringer als das Volumen der genannten einen katalytischen Gruppe ist.

3. Enzymmutant nach Anspruch 1, worin das genannte Ersetzen einen katalytischen Aminosäurerest im genannten Vorläuferenzym durch einen anderen Aminosäurerest betrifft, wobei der genannte katalytische Aminosäurerest aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus His, Lys, Ser, Thr, Cys, Asp, Glu, Tyr, Met, Phe und Trp besteht, und worin die genannte andere Aminosäure aus den bevorzugten oder alternativen Aminosäureresten von Tabelle 1 hierin ausgewählt ist.

4. Enzymmutant nach Anspruch 3, worin das genannte modifizierte Substrat eine modifizierte Gruppe enthält, die eine katalytische Gruppe oder äquivalente katalytische Gruppe von Tabelle I hierin einschließt, die dem genannten ersetzten katalytischen Aminosäurerest im genannten Vorläuferenzym entspricht.

5. Enzymmutant nach Anspruch 1, worin das genannte Vorläuferenzym aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Oxido-Reduktasen, Transferasen, Hydrolasen, Lyasen, Isomerasen und Ligasen besteht.

6. Enzymmutant nach Anspruch 5, worin das genannte Vorläuferenzym eine Hydrolase ist, die eine Carbonylhydrolase umfaßt.

7. Enzymmutant nach Anspruch 6, worin die genannte Carbonylhydrolase Subtilisin ist.

8. Enzymmutant nach Anspruch 7, worin der genannte ersetzte oder modifizierte Aminosäurerest im genannten Subtilisin His-64 in B.amyloliquefaciens Subtilisin ist.

9. Enzymmutant nach Anspruch 8, worin das genannte His-64 durch Ala ersetzt ist.

10. Enzymmutant nach Anspruch 8, worin das genannte modifizierte Substrat eine modifizierte Gruppe enthält, die an Rest P2 des genannten modifizierten Substrats angeordnet ist.

11. Enzymmutant nach Anspruch 10, worin das genannte modifizierte Substrat durch Ersetzen der genannten Gruppe an Position P2 durch Histidin gebildet ist.

12. DNA-Sequenz, die für den Enzymmutanten nach Anspruch 1 kodiert.

13. Expressionsvektor, der die DNA nach Anspruch 12 enthält.

14. Mit dem Expressionsvektor nach Anspruch 13 transformierte Wirtszellen.

15. Katalytisch aktiver Enzymsubstratkomplex, der einen Enzymmutanten in Kontakt mit einem modifizierten Substrat umfaßt, worin der genannte Enzymmutant nicht in der Natur vorkommt und durch das Ersetzen oder die Modifikation von zumindest einer katalytischen Gruppe eines Aminosäurerests in einem Vorläuferenzym hergeleitet ist, der, wenn er mit einem ausgewählten Bereich eines Substrats in Kontakt steht, katalytisch damit wirkt, um den genannten Enzymmutanten zu bilden, der mit dem genannten Substrat im Vergleich zur katalytischen Wirksamkeit des genannten Enzymmutanten mit zumindest einem genannten modifizierten Substrat katalytisch relativ inaktiv ist, wobei das genannte modifizierte Substrat durch das Ersetzen oder Modifizieren einer Gruppe im genannten ausgewählten Bereich gebildet ist, um eine modifizierte Gruppe zu bilden, welche die genannte eine funktionelle Gruppe oder ihr Äquivalent enthält.

16. Enzymsubstratkomplex nach Anspruch 15, worin die genannte eine katalytische Gruppe im genannten Vorläuferenzym durch eine zweite Gruppe substituiert ist, die ein Volumen aufweist, das geringer als das Volumen der genannten einen katalytischen Gruppe ist.

17. Enzymsubstratkomplex nach Anspruch 15, worin das genannte Ersetzen einen katalytischen Aminosäurerest im genannten Vorläuferenzym mit einer anderen Aminosäure betrifft, wobei der genannte katalytische Aminosäurerest aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus His, Lys, Ser, Thr, Cys, Asp, Glu, Tyr, Met, Phe, Trp, Asn, Gln und Arg besteht, und worin der genannte andere Aminosäurerest aus bevorzugten oder alternativen Aminosäureresten von Tabelle I oder II hierin ausgewählt ist.

18. Enzymsubstratkomplex nach Anspruch 15, worin das genannte modifizierte Substrat eine modifizierte Gruppe enthält, die eine katalytische Gruppe oder eine äquivalente katalytische Gruppe von Tabelle I oder II hierin einschließt, die dem genannten ersetzten katalytischen Aminosäurerest im genannten Vorläuferenzym entspricht.

19. Enzymsubstratkomplex nach Anspruch 15, worin das genannte Vorläuferenzym aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Oxido-Reduktasen, Transferasen, Hydrolasen, Lyasen, Isomerasen und Ligasen besteht.

20. Enzymsubstratkomplex nach Anspruch 19, worin das genannte Vorläuferenzym eine Hydrolase ist, die eine Carbonylhydrolase umfaßt.

21. Enzymsubstratkomplex nach Anspruch 20, worin die genannte Carbonylhydrolase Subtilisin ist.

22. Enzymsubstratkomplex nach Anspruch 21, worin der genannte ersetzte oder modifizierte Aminosäurerest im genannten Subtilisin His-64 in B. amyloliquefaciens Subtilisin ist.

23. Enzymsubstratkomplex nach Anspruch 22, worin das genannte His-64 durch Ala ersetzt ist.

24. Enzymsubstratkomplex nach Anspruch 22, worin das genannte modifizierte Substrat eine modifizierte Gruppe enthält, die an Rest P2 des genannten modifizierten Substrats angeordnet ist.

25. Enzymsubstratkomplex nach Anspruch 24, worin das genannte modifizierte Substrat durch Ersetzen der genannten Gruppe an Position P2 durch Histidin gebildet ist.

26. Verfahren, umfassend das In-Kontakt-bringen eines Enzymmutanten und eines modifizierten Substrats, um die substratunterstützte Katalyse des genannten modifizierten Substrats zu erzeugen, worin der genannte Enzymmutant nicht in der Natur vorkommt und durch das Ersetzen oder die Modifikation von zumindest einer katalytischen Gruppe eines Aminosäurerests in einem Vorläuferenzym hergeleitet ist, der, wenn er mit einem ausgewählten Bereich eines Substrats in Kontakt steht, katalytisch damit wirkt, um den genannten Enzymmutanten zu bilden, der mit dem genannten Substrat im Vergleich zur katalytischen Wirksamkeit des genannten Enzymmutanten mit zumindest dem genannten modifizierten Substrat relativ inaktiv ist, wobei das genannte modifizierte Substrat durch Ersetzen oder Modifizieren einer Gruppe im genannten ausgewählten Bereich gebildet wird, um eine modifizierte Gruppe zu bilden, welche die genannte eine katalytische funktionelle Gruppe oder ihr Äquivalent enthält.

27. Verfahren nach Anspruch 26, worin die genannte eine katalytische Gruppe im genannten Vorläuferenzym durch eine zweite Gruppe substituiert wird, die ein Volumen aufweist, das geringer als das Volumen der genannten einen katalytischen Gruppe ist.

28. Verfahren nach Anspruch 26, worin das genannte Ersetzen einen katalytischen Aminosäurerest im genannten Vorläuferenzym durch eine andere Aminosäure betrifft, wobei der genannte katalytische Aminosäurerest aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus His, Lys, Ser, Tnr, Cys, Asp, Glu, Tyr, Met, Phe, Trp, Asn, Gln und Arg besteht, und worin der genannte andere Aminosäurerest aus bevorzugten oder alternativen Aminosäureresten von Tabelle I oder II hierin ausgewählt ist.

29. Verfahren nach Anspruch 28, worin das genannte modifizierte Substrat eine modifizierte Gruppe enthält, die eine katalytische Gruppe oder äquivalente katalytische Gruppe von Tabelle I oder II hierin enthält, die dem genannten ersetzten katalytischen Aminosäurerest im genannten Vorläuferenzym entspricht.

30. Verfahren nach Anspruch 27, worin das genannte Vorläuferenzym aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Oxido-Reduktasen, Transferasen, Hydrolasen, Lyasen, Isomerasen und Ligasen besteht.

31. Verfahren nach Anspruch 30, worin das genannte Vorläuferenzym eine Hydrolase ist, die eine Carbonylhydrolase umfaßt.

32. Verfahren nach Anspruch 31, worin die genannte Carbonylhydrolase Subtilisin ist.

33. Verfahren nach Anspruch 32, worin der genannte ersetzte oder modifizierte Aminosäurerest im genannten Subtilisin His-64 in B. amyloliquefaciens Subtilisin ist.

34. Verfahren nach Anspruch 33, worin das genannte His-64 durch Ala ersetzt wird.

35. Verfahren nach Anspruch 33, worin das genannte modifizierte Substrat eine modifizierte Gruppe enthält, die an Rest P2 des genannten modifizierten Substrats angeordnet ist.

36. Verfahren nach Anspruch 35, worin das genannte modifizierte Substrat durch Ersetzen der genannten Gruppe an Position P2 durch Histidin gebildet wird.