DE3855453T2

DE3855453T2 - Hefestämme zur Erhöhung der Fermentationsrate von Zuckern, Verfahren zur Gewinnung solcher Hefen und Verwendung dieser Hefen

Info

Publication number: DE3855453T2
Application number: DE3855453T
Authority: DE
Inventors: Robert Franciscus Beudeker; Hollander Johannes Abraham De; Klaas Anne Osinga; Der Plaat Johannes Bertus Van
Original assignee: Gist Brocades NV
Current assignee: Koninklijke DSM NV
Priority date: 1987-09-03
Filing date: 1988-09-01
Publication date: 1997-01-09
Anticipated expiration: 2008-09-02
Also published as: DK490588A; DK490588D0; FI100473B; FI884064A0; CA1335264C; JP2683253B2; AU2186888A; NO174214C; NZ226020A; PT88394A; NO883919L; NO174214B; IE882660L; IL87661A; FI884064L; DE3855453D1; IE76719B1; AU606989B2; NO883919D0; JPH01153082A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf neue, zur Verbesserung der Zuckervergärung befähigte Hefen, auf ein Verfahren zur Konstruktion solcher Hefen und auf die Anwendung dieser verbesserten Hefen.
Es ist altbekannt, dass z.B. zur Gattung Saccharomyces gehörende Hefestämme dazu befähigt sind, Zucker unter anaeroben Bedingungen zu ungefähr äquimolaren Mengen CO&sub2; und Ethanol zu vergären. Die Säuerungsaktivität der Hefe im Teig ist ein Ergebnis dieser Vergärung. Das im Handel erhältliche Erzeugnis Backhefe kommt in verschiedenen Formulierungen wie Presshefe, Frischhefe oder Trockenhefe vor. Trockenhefe ist als aktive Trockenhefe und als Fertig-Trokkenhefe mit Feuchtigkeitsgehalten von 6 bis 8 beziehungs weise 3 bis 6 erhältlich.
Einer der ersten Schritte im durch die Hefe bewirkten Glucidmetabolismus ist der Transport der Glucidmoleküle durch die Plasmamembran. Für verschiedene Glucide sind in der Hefe verschiedene spezifische Träger exprimiert. Die Aufnahme von Maltose hängt zum Beisdiel von der Anwesenheit einer spezifischen Maltosepermease ab. Dieser Träger kann in zwei verschiedenen Formen vorliegen, die sich hinsichtlich ihrer maximalen Reaktionsgeschwindigkeit (vmax) und ihrer Affinitätskonstante (Km) unterscheiden (A. Busturia und R. Lagunas, Biochim. Biophys. Acta 820, 324 (1985)). Der Durchtritt der Maltose durch die Plasmamembran der Hefe ist an den elektrochemischen Protonengradienten in dieser Membran gekoppelt. Mit jedem Maltosemolekül wird gleichzeitig ein Proton eingeführt. (R. Serrano, Eur. J. Biochem. 80, 97 (1977)).
Intrazellulär wird Maltose in einer durch Maltase (alpha-Glucosidase) katalysierten Reaktion zu zwei Glucosemoleküle hydrolysiert. Die Glucose wird darauf über den Embden-Meyerhof-weg in Kohlendioxid und Ethanol umgewandelt. Im vergleich zur Vergärung der Glucose erfordert die Vergärung der Maltose zwei zusätzliche Enzyme, nämlich Maltosepermease und Maltase. Die Synthese cieser Enzyme wird durch Maltose induziert und durch Glucose, Fructose oder Mannose unterdrückt. In nicht gezuckerten ("mageren") Teigen ist die Maltose der häufigste für die Hefe verfügbare Zucker. Falls dem Teia Saccharose zugegeben wurde, wird dieses Disaccharid extrazellulär durch die Hefe zu Glucose und Fructose hydrolysiert. Anschliessend werden diese Hexosen durch die Hefe durch die Einwirkung verschiedener Permeasen aufgenommen.
Man stellt allgemein fest, dass bei Zugabe von Saccharose zu maltosehaltigen Medien, z.B. einem Teig, der Maltose-Metabolismus ter Hefezellen unterdrückt wird. Das ist darauf zurückzuführen, dass die Transkription der Gene, die die Maltosepermease und Maltase kodieren, durch Glucose unterdrückt wird (R.B. Needleman, D.B. Kaback, R.A. Dubin E.L. Perkins, N.G. Rosenberg, K.A. Sutherland, D.B. Forrest und C.A. Michels, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 2811 (1984)).
Die für die Aufnahme und Hydrolyse der Maltose benötigten Gene sind auf einem MAL-Locus gruppiert (R.B. Needleman et al., siehe oben). Saccharomyces-Stämme können bis zu fünf nicht verknüpfte und bei den Telomeren verschiede ner Chromosomen liegende MAL-Loci (MAL 1 bis 4 und MAL 6) enthalten (J.L. Celenza und M. Carlson, Genetics 109, 661 bis 664 (1985)). Ein MAL-Locus beinhaltet Gene, die die Maltosepermease, Maltase und eines oder mehrere zur Maltoseinduktion benötigte Regulierproteine (MAL-Regulierer) ko dieren (R.B. Needleman et al., siehe oben; J.D. Cohen, M.J. Goldenthal, T. Chow, B. Buchferer und J. Marmur, Mol. Gen. Genet. 200, 1 (1985); R.A. Dubin, E.L. Perkins, R.B. Needleman und C.A. Michels, Mol. Cell. Biol. 6, 2757 (1986)).
Die besagten Gene sind isoliert und kloniert worden (A.O. J.D. Cohen et al., siehe oben; R.B. Needleman et al., siehe oben; H.J. Federoff, J.D. Cohen, T.R. Eccleshall, R.B. Needleman, B.A. Buchferer, J. Giacolone und J. Marmur, J. Bacteriol. 149, 1064 (1982)).
Wie oben erwähnt, hängt die Hefegärung in einem mageren Teig von der Maltose als Hauptsubstrat ab. Maltose wird im Teig aus Stärke unter der Einwirkung von normalerweise im Mehl vorhandenen Amylasen gebildet. Ausserdem enthält das Mehl variable Mengen (0 bis 0,5%) freier Glucide wie Glucose, reiner Weisszucker usw. (H. Suomalainen, J. Dettwiler und E. Sinda, Process Biochem. 7, 16 (1972)). Diese Gludde werden durch die Hefe schnell verbraucht. Verschiedene Studien sind veröffentlicht worden, die den möglichen Zusammenhang zwischen Maltosevergärung und Säuerungsaktivität der Backhefe untersuchen. In einigen Fällen wurde eine positive Korrelation zwischen der Geschwindigkeit der Maltosevergärung und der Aktivitäten der Maltase und Maltosepermease gefunden. Eine positive Korrelation zwischen den Aktivitäten von Maltase und Maltosepermease sowie dem Säuerungsvermögen in magerem Teig konnte jedoch nicht beobachtet werden (P. Hautera und T. Lövgren, J. Inst. Brew. 81, 309, (1975); T. Lövgren und P. Hautera, Eur. J. Appl. Microbiol. 4, 37 1977)).
Transformation von Hefezellen mit Mehrfachkopie-Plasmiden, die Gene zur Kodierung der Maltase und Maltosepermease enthielten, ergaben eine Erhöhung der spezifischen Aktivität der Maltase auf das Vierfache, aber die Maltosepermeaseaktivität wurde nicht gesteigert. Der Einbau weite rer, das Regulierprotein kodierender Gene ergab eine mässige Erhöhung der spezifischen Aktivität der Maltase, aber wiederum wurde kein Effekt bei der Aktivität der Maltosepermease gefunden (J. D. Cohen et al., siehe oben). Von diesen Forschern wurde bei den erhaltenen Transformanten keine Messungen zur Kohlendioxid- oder Ethanolbildung durchgeführt. Frühere Arbeiten liessen gar von solchen Tests absehen, da wiederholt gezeigt worden war, dass keine Korrelation zwischen den Aktivitäten von Maltosepermease und Maltase und der Kohlendioxidproduktion (Säuerungsaktivität) in magerem Teig bestand (H. Suomalainen, J. Dettwiler und E. Sinda, siehe oben; H. Suomalalnen, Eur. J. Appl. Microbiol. 1, 1 (1975); P. Hautera und T. Lövgren, siehe oben; T. Lövoren und P. Hautera, siehe oben).
Wir haben nun gefunden, dass Hefen, die durch im Folgenden mittels Besolelen beschriebene integrative Plasmide transformiert wurden, im Vergleich zum untransformierten Stamm ein erhöhtes Mass an Maltosepermease- und Maltase- Aktivität aufweisen. Überraschenderweise gehen diese erhöhten Maltase- und Maltosepermease-Aktivitäten mit einer Erhöhung der CO&sub2;-Bildung oder Säuerungsaktivität einher, was auch bei mit episomalen Vektoren transformierter Hefe beobachtet wurde.
Diese verbesserten Hefen zeigen erhöhte Metabolismusgeschwindigkeiten, was sich zum Beispiel in Medien, die Glucide wie Maltose als hauptsächliche Kohlenstoff- und Energiequelle enthalten, in einer verstärkten CO&sub2;- und Ethanolbildung äussert. Die zur Verfügung gestellten Verfahren beinhalten die Anwendung von DNA-Rekombinationstechniken in einer solchen Art, dass die Geschwindigkeit der Maltosevergärung solcher Hefen drastisch erhöht wird, unabhängig davon, ob andere Glucide wie z.B. Glucose vorhanden sind.
Im Weiteren zeigen diese verbesserten Hefestämme eine ausgezeichnete Säuerungsaktivität (Gasbildung) im Teig. Ebenso wird die erhöhte Bildung von Ethanol dieser Hefen eine Verringerung der benötigen Vergärungszeit oder eine Erhöhung der gebildeten Alkoholmenge bei gegebener Zeit bewirken, wenn solche Hefen für die Herstellung von Trinkoder Industriealkohol verwendet werden. Im Weiteren ist die schnelle Entfernung der Naltose vorteilhaft für den besagten Gärungsprozess, wenn die Maltose (oder ihre Anhäufung) Enzyme unterdrückt, die Glucide oder Stärke umwandeln. Die Anwendung des erfindungsgemässen Verfahrens ergibt eine Hefe, in der ein (mehrere) zusätzliche(s), die Maltase und / oder Maltosepermease kodierende(s) Gen(e) eingeführt ist (sind).
Die vorliegende Erfindung ergibt eine transformierte Hefe und ein Verfahren zur Herstellung dieser Hefe, wobei besagte Hefe bei Gärenlassen in einem Gludde als hauptsächliche Kohlenstoff- und Energiequelle enthaltenden Medium eine erhöhte Kohlendioxid- und Ethanolbildung gegenüber der nicht transformierten Stammhefe ergibt, wenn letztere in besagtem Medium Glucide zu vergären vermag, wobei besagte transformierte Hefe enthält:
Mindestens ein als Transformationsergebnis in ihr vorliegendes, vorzugsweise homologes DNA-Konstrukt, welches DNA-Konstrukt mindestens ein Gen in besagter Hefe enthält, das ein Protein kodiert, welches die Aufnahme und/oder den Start der metabolischen Umwandlung eines transportierten Substrates fördert, und wobei das Gen in der besagten Hefe zur Expression befähigt ist. Die Vergärungsgeschwindigkeit der Glucide kann zu mehreren Zeipunkten der Säuerung verbessert werden, so z.B. eine erhöhte Geschwindigkeit, die durch die Vergärung der Maltose oder Saccharose hervorgerufen wird.
Mit homologer DNA ist eine DNA gemeint, die von der selben Hefegattung stammt. Saccharomyces wird zum Beispiel mit von Saccharomyces stammender DNA transformiert. Auf diese Weise ist es möglich, in der Hefegattung bereits vorhandene Eigenschaften zu verbessern, ohne neue Eigenschaften einzuführen, die in der Gattung vorher nicht vorhanden waren. Die Verbesserung der Vergärungsgeschwindigkeit der Glucide kann unter aeroben und/oder anaeroben Bedingungen erhalten werden. Die interessierenden Enzyme beinhalten Permeasen, insbesonders Maltosepermease; Saccharidasen, insbesonders Maltase; Kinasen, insbesonders Hexokinasen und Glucokinase; und Änliches. Diese Erfindung kann zum Beispiel auf ein Trägerprotein angewendet werden, das für die Aufnahme von Glucose oder Fructose benötigt wird, oder auf Hexokinasen und Glucckinase, die die anfängliche intrazelluläre metabolische Umwandlung dieser Hexosen in Hexosephosphate katalysieren.
Die vorliegende Erfindung ergibt auch effiziente Ver fahren zur Einführung mindestens eines homologen DNA-Konstrukts in die Hefen.
Vorteilhaft kann die Erfindung auf ein Konstrukt angewendet werden, das mindestens ein Gen für die Kodierung eines Proteins zur Förderung der Maltoseaufnahme und zur anfänglichen metabolischen Umwandlung von Maltose zu Glucose beinhaltet. Auf diese Weise können Hefen mit mehreren Vorteilen gegenüber den ursprünglichen (Wlrts-) Stämmen erhalten werden. Der Nutzen solcher verbesserter Hefen liegt insbesonders in der erhöhten Ethanol- und CO&sub2;-Bildung. Wird die Erfindung zum Beispiel auf eine Backhefe angewendet, ergibt sich ein grosser Vorteil für den Bäcker, da er wegen der verbesserten Säuerungsaktivität der neuen Stämme weniger Zeit oder weniger Hefe zur Entwicklung mageren Teigs benötigt.
Man wird es zu schätzen wissen, dass erfindungsgemäss transformierte Hefe als Ausgangsstamm ausser in der DNA- bewirkten Transformation noch in anderen Stammverbesserungsverfahren eingesetzt werden kann, so in der Protoplastenfusion, der Massenverschmelzung und der Mutation. Die sich ergebenden Stämme werden als Teil der Erfindung angesehen.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die neuen Stämme beträchtliche Mengen Maltose in Gegenwart von Glucose verbrauchen. Daher können die Bäkker auch Ausgaben für Zucker einsparen, da zur Herstellung eines süssen Teigs weniger Zucker zugegeben werden muss.
Es ist gut bekannt, dass osmotolerante Hefen in magerem Teig eine schlechte Leistung (Säuerungsaktlvität) aufweisen. Mit osmotoleranten Hefen sind Hefen gemeint, dla eine gute Leistung in süssen Teigen zeigen. Teige für süsse Backwaren enthalten zum Beispiel 10 bis 30% Zucker (bezogen auf das Mehigewicht). Wenn also eine osmotolerante Hefe als Wirt für die erfindungsgemässe Transformation ausgewählt wird, erhält man eine osmotolerante Hefe, die nicht nur in süssen Teigen, sondern auch in mageren Teigen eingesetzt werden kann, da ihr Vergärungsvermögen für Maltose erfindungsgemäss verbessert wird. Folglich benötigt der Bäcker zweckmässigerweise nur eine Hefeart, sowohl für süsse als auch für magere Teige.
Der Bedarf an Hefestämmen, die sowohl in mageren als auch süssen Teigen eine gute Leistung zeigen, ist zum Beispiel in EP-A-128524 und DE-A-2757778 erwähnt. EP-A-128525 beschreibt ein Protoplastenfusionsverfahren zur Herstellung solcher Hefestämme, die eine gute Leistung in zuckerreichen und mageren Teigen haben, DE-A-2757778 beschreibt, um solche Hefen zu erhalten, ein Stammselektionsverfahren aus einer Population von diploiden Stämmen, die mittels Hybridisierungs- oder Mutationsverfahren hergestellt wurde. Beide Verfahren benötigen viel experimentelle Arbeit, die Ergebnisse können nicht vorhergesagt werden und sind nicht wiederholbar. Bei Verwendung des erfindungsgemässen Verfahrens können steuerbare und wiederholbare Ergebnisse mit den transformierten Hefestämmen erhalten werden. Das Testen der erfindungsgemäss hergestellten Stämme kann sehr gering sein, da die Eigenschaften des Stamms selber im Wesentlichen, mit Ausnahme der offenbarten verbesserten Eigenschaften, nicht verändert werden.
Die vorliegende Erfindung ergibt eine Presshefe, die eine Gasentwicklung von wenigstens 340 ml / 285 mg Hefe- Trockengewicht nach 165 Minuten im Test B und eine Gasentwicklung von mindestens 170 ml / 285 mg Hefe-Trockengewicht im Test B' zeigt. Die Tests B und B' werden weiter unten beschrieben. Bevorzugt zeigt die Presshefe eine Gasentwicklung von 380 bis 450 ml / 285 mg Hefe-Trockengewicht nach 165 Minuten im Test B und 180 bis 240 ml / 285 mg Hefe- Trockengewicht im Test B', besonders bevorzugt mindestens 4C0 ml / 285 mg Hefe-Trockengewicht nach 165 Minuten im Test B und mindestens 190 ml / 285 mg Hefe-Trockengewicht im Test B'. Mit Vorteil wird getrocknet Fertigbefe oder aktive Trockenhefe aus dieser Presshefe hergestellt. Durch das Trocknen der Presshefe gehen im allgemeinen 15 bis 25% der auf die Trockenmasse bezogenen Säuerungsaktivität verloren. Die vorliegende Erfindung ergibt auch eine Trockenhefe (3 bis 8% (g/g) Feuchtigkeit), die eine Gasentwicklung von 310-360 ml / 285 mg Hefe-Trockengewicht nach 165 Minuten im Test C und 145-195 ml / 285 mg Hefe-Trockengewicht im Test C' zeigt, die bevorzugt mindestens 330 ml / 285 mg Hefe-Trockengewicht im Test C und mindestens 155 ml / 285 mg Hefe-Trockengewicht im Test C' zeigt. Die mit erfindungsgemäss hergestellter Hefe erhaltenen Gaswerte wurden, wenn im Handel erhältliche Hefestämme mit den Tests C und C' untersucht wurden, nie gefunden. Die Erfindung kann auch auf Hefen angewendet werden, die eine gute Leistung in der Säuerungsaktivität bei Teigen mit 0 bis 6% oder 0 bis 10% Zucker zeigen. Auf diese Art können Presshefen hergestellt werden, die eine Gasentwicklung von 400 bis 500 ml / 285 mg Hefe-Trockengewicht nach 165 Minuten im Test B und bevorzugt eine Gasentwicklung von mindestens 440 ml / 285 mg He fe-Trockengewicht zeigen. Trockenhefen, die eine Gasentwicklung von 320-400 ml / 285 mg Hefe-Trockengewicht nach 165 Minuten im Test C und bevorzugt eine Gasentwicklung von mindestens 350 ml / 285 mg Hefe-Trockengewicht zeigen, sind dann zugänglich.
Änliche Vorzüge dieser neuen Stämme werden bei Vergärungen zur Herstellung von Trink- oder Industriealkohol gefunden.
Da die Gesamtgeschwindigkeit des Metabolismus dieser neuen Stämme erhöht wurde, wenn Maltose als Substrat dient, erhöht sich die Bildungsgeschwindigkeit von Metaboliten wie Glycerin und Aromastoffen ebenfalls.
In einem Aspekt der Erfindung werden Vektoren verwendet, die ein DNA-Konstrukt tragen, das eines oder mehrere Enzyme kodiert, die bei der Vergärung der Maltose eine Rolle spielen. Die vorliegende Erfindung ergibt auch einen mikrobiellen Wirt, bevorzugt eine Hefe, die zum Beispiel eine mit in der Erfindung offenbarten Vektoren transformierte Saccharomyces-Art ist. Diese Vektoren können selbstreplizierend sein und enthalten mit Vorteil ein Gen, oder eine Kombination von Genen, ausgewählt aus denjenigen, die die Maltosepermease, Maltase, und das Maltose-Regulierprotein kodieren. Überraschenderweise wurde gefunden, dass die mit solchen Vektoren transformierte Hefe eine erhöhte Geschwindigkeit der Maltosevergärung aufweist, was eine erhöhte Bildungsgeschwindigkeit von CO&sub2; im Teig ergibt. Diese zusätzlichen Gene liegen jedoch auf Episomen, und es ist aus der Literatur bekannt, dass solche extrachromosomalen Moleküle bei der nichtselektiven Vermehrung (d.h. in diesem Fall Wachstum in Anwesenheit von G418) leicht verloren gehen (C.D. Hollenberg (1982) in: Gene Cloning 12, Organisms Other Than E. Coli, Seite 119; Herausgeber P.H. Hofschneider, W. Goebel; Springer Verlag; S.A. Parent, C.M. Fenimone und K.A. Bostian (1985) , Yeast 1, 83). Vom praktischen Standpunkt aus gesehen wird Hefe mit Vorteil unselektiv gezüchtet, und daher wird vorteilhaft ein Satz integrierender Plasmide konstruiert, die Gene für Maltase und/oder Maltosepermease enthalten, wobei diese Gene bevorzugt verändert sind. Mit "verändert" ist gemeint, dass der natürliche Promotor durch einen anderen, vorzugsweise homologen Promotor ausgetauscht ist. Falls Verfahren entwickelt werden, die eine stabile Vermehrung der Plasmide ohne Selektionsdruck erlauben, ist die Integration der neu eingeführten DNA keine Vorbedingung menr, um stabile Transformanten zu erhalten.
Es ist aus der Literatur bekannt, das eine Zelle zwischen 20 und 100 Moleküle solcher zusätzlichen Plasmide enthält (C.D. Hollenberg (1982), siehe oben; A. Takagi, E.N. Chun, C. Boorchird, S. Harashima, und Y. Oshima, Appl. Miorobiol. Biotechnol. 23, 123; J. Mellor, M.J. Dobson, N.A. Roberts, N.J. Kingsman und S.M. Kingsman (1985), Gene 33, 215).
Das Ausmass der Expression episomaler Gene kann weiter gesteigert werden, indem die ursprünglichen Promotoren durch stärkere Promotoren ersetzt werden. Es scheint, dass es in der Zukunft möglich sein wird, eine stabile Vermehrung der Plasmide in Abwesenheit eines Selektionsdrucks zu gewährleisten.
Die Gene der Maltase und/oder Maltosepermease werden erfindungsgemäss über eine Transformation mit linearen Plasmiden in das Hefechromosom integriert (siehe T.L. Orr- Weaver, J.W. Szostak, R. Rothstein (1981), Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 78, 6354). Die erhaltenen Hefen sind stabile Transformanten, d.h. veränderte Gene der Maltose und / oder Maltosepermease können auch in Abwesenheit eines Selektionsdrucks im Genom erhalten bleiben.
Es ist bekannt, dass bei der Integration nur eine oder wenige Kopien der sich auf dem Plasmid befindenden Gene in das Chromosom integriert werden. Um ähnliche Verbesserungen in der CO&sub2;-Bildung zu erhalten wie bei Verwendung von episomalen Vektoren, wird das Ausmass der Genexpression daher vorteilhaft geändert, indem starke konstitutive, gegen Glucoserepression unempfindliche Pronotoren angewendet werden. Solche Promotoren werden bevorzugt, um die unterschiedliche Kopienzahl der Gene bei mit ecisomalen Vektoren und mit integrativen Vektoren transformierter Hefe auszugleichen und um den Auswirkungen der Glucoserepression vorzubeugen. Es wird zum Beispiel beobachtet, dass während der ersten 30 bis 40 Minuten der Gärung in Medien, die Maltose als hauptsächliche Kohlenstoff- und Energiequelle und relativ tiefe Konzentrationen an Glucose enthalten, die mRNA- Spiegel für Maltosepermease und Maltase auffast unmessbare Werte absinken. Sobald die Glucose verbraucht ist, ergibt die Induktion der Genexpression durch Maltose einen raschen Anstieg beider mRNA-Spiegel.
Wie angegeben können die Gene mit ihrem natürlichen oder Wildtyp-Promotor verwendet werden, der Promotor kann auch durch einen anderen, vorzugsweise homologen Promotor ersetzt werden. Besonders wenn der Wildtyp-Promotor regulierbar oder induzierbar ist, kann es wünschenswert sein, konstitutive Transkription oder einen stärkeren oder schwä cheren Promotor anzuwenden. Wenn umgekehrt der Wildtyp-Promotor konstitutiv ist, kann es interessant sein, für einen regulierbaren oder induzierbaren Promotor oder einen stärkeren oder schwächeren Promotor zu sorgen.
Es ist wünschenswert, starke Promotoren einzusetzen, besonders wenn eine eher niedrige Kopienzahl des Konstrukts im Wirt vorhanden ist. Starke Promotoren sind in der Regel solche, die in der Bildung der Proteine mit hohem Spiegel während des Lebenszyklus der Hefe eine Rolle spielen, oder die zu einem für die vorliegende Erfindung bedeutsamen Zeitpunkt im Lebenszyklus der Hefe regulierbar sind.
Promotoren, die mit dem glykolytischen Zyklus der Hefe zu tun haben, sind von besonderem Interesse; diese beinhalten die Promotoren der Alkoholdehydrogenasen I und II, der Phosphoglucoiscmerase, der Glucose-6-Phosphatdehydrogenase, der Triosephosphat-Isomerase, der Glycerinaldehydphosphat-Dehydrogenase, der Phosphoglycerat-Kinase, der Enolase, der Phosphoglyceromutase, der Pyruvatkinase und der Lactatdehydrogenase. Andere Promotoren, die mit in grossen Mengen produzierten Enzymen zu tun haben, beinhalten Promotoren, die mit der ribosomalen Expression zu tun haben, so die Promotoren für die Transkription der Initiationsfaktoren, Elongationsfaktoren und Ahnlichem. Besondere Elongationsfaktoren beinhalten EF-1 und EF-2, usw.
Von besonderem Interesse ist die Anwendung von Promotoren in Kombination mit Strukturgenen, die mit dem Metabolismus der Maltose zu tun haben, insbesonders für die Maltase, Maltosepermease und den MAL-Regulierer. Diese Promotoren können konstitutiv oder regulierbar sein, solange der Promotor während der Vergärung des Zuckers induziert wird. Viele der glykolytischen Promotoren werden zum Beispiel in Gegenwart eines Zuckers oder Zuckermetaboliten wie Ethanol aktiviert. Deshalb werden Promotoren wie derjenige der Alkoholdehydrogenase während der Säuerung des Mehls aktiv sein. Gleichermassen werden Promotoren, die mit der Zellvermehrung zu tun haben, auch während der Säuerung des Teigs aktiv sein. Des weiteren kann die Hefe, indem für Promotoren gesorgt wird, die nicht durch den MAL-Regulierer reguliert werden, in Gegenwart von Glucose ohne Repression eingesetzt werden. Ausserdem benötigen die Gene keine Maltose für die Induktion.
Wo die Wildtyp-Promotoren zusammen mit den interessierenden Strukturgenen verwendet werden, kann es wünschenswert sein, für eine erhöhte Bildung eines Regulierproteins zu sorgen. Auf diese Weise kann der Spiegel des Regulierproteins hoch gehalten werden, wenn der Induktor vorhanden ist. Das MAL-Regulierprotein wird zum Beispiel in Anwesenheit von Maltose in hohem Mass exprimiert, um für die Expression der anderen Enzyme zu sorgen, die mit dem Metabolismus der Maltose zu tun haben unc die durch das MAL-Regulierprotein reguliert werden.
Die Änderungen in der Genexpression, wie sie in den experimentellen Verfahren genau beschrieben werden, beinhalten den Austausch der ursprünglichen Promotoren und (eines Teils) der nicht translatierten Leadersequenzen gegen diejenigen der Alkoholdehydrogenase 1 (ADHI) und des Translationverlängerungsfaktors EF1αA, wobei diese bevorzugt von der Wirtshefe abgeleitet sind, zum Beispiel Saccharomyces. Als Folge davon wird die Expression unempfindlich gegen Glucoserepression und unabhängig von Maltose für die Induktion.
Es wurde gefunden, dass Hefen, die durch diese integrativen Plasmide transformiert wurden, im Vergleich zum untransformierten Stamm erhöhte Werte der Maltose- und Maltosepermease-Aktivität aufweisen. Diese erhöhten Maltaseund Maltosepermease-Aktivitäten gehen überraschenderweise mit einer Zunahme der CO&sub2;-Bildung oder der Säuerungsaktivität einher, was auch bei mit episomalen Vektoren transformierten Hefen beobachtet wurde.
Die erhaltene Verbesserung der Säuerungsaktivität bleibt bei der Lagerung erhalten, sogar bei erhöhter Temperatur, so zum Beispiel bei 20 bis 25ºC. Der relative Verlust an Säuerungsaktivität während der Lagerung ist fast identisch für die Ausgangsstämme und die erfindungsgemässen Stämme. Die Säuerungsaktivität in Teigen mit hohem Zuckergehalt wird durch die eingeführten Veränderungen nicht beeinflusst, da die Säuerungsaktivität der neuen, mit integrativen Plasmiden transformierten Stämme gleich gut ist wie diejenige, die mit dem Wirtsstamm erhalten wird.
Die Wirtshefe, von der hier die Rede ist, wird mindestens eine Kopie des Konstrukts enthalten und kann zwei oder mehrere, in der Regel nicht mehr als 200 davon enthalten, abhängig davon, ob das Gen in das Genom integriert ist, vervielfacht ist oder auf einem extrachromosomalen Element in vielfacher Kopienzahl vorhanden ist. Es kann Integration oder Nicht-Integration gewählt werden, abhängig davon, wie stabil das hergestellte extrachromosomale Element sein muss, damit es erhalten bleibt; wieviele Kopien gewünscht werden; wie gross die Transkriptlon bei gegebener Kopienzahl sein kann; und Ähnlichem.
Das Konstrukt kann eines oder mehrere Strukturgene mit demselben oder verschiedenen Promotoren enthalten. Das Konstrukt kann in herkömmlicher Weise hergestellt werden, indem die gewünschten Gene von einem geeigneten Wirt isoliert werden, indem alle oder ein Teil der Gene synthetisiert werden, oder durch Kombinationen dieser Verfahren. In gleicher Weise können die Regulationssignale, die transkriptionellen und translationellen Initiations- und Terminationsregionen, von einer natürlichen Quelle isoliert, synthetisiert, oder durch eine Kombination dieser Verfahren erhalten werden. Die verschiedenen Bruchstücke können einem Abbau durch eine Endonuclease (Restriktion), der Ligasierung, Sequenzierung, in vitro-Mutagenese, dem Primer-Wiederaufbau und Ähnlichem unterworfen werden. Die verschiedenen Vorgehen sind in der Literatur gut bekannt und werden zur Erreichung bestimmter Zwecke zum Einsatz kommen.
Die verschiedenen Bruchstücke können auf herkömmlichem Weg kombiniert, kloniert, isoliert und sequenziert werden. Nach jedem Arbeitsgang kann das DNA-Bruchstück oder Kombinationen von Bruchstücken in den Klonierungsvektor eingefügt, der Vektor in einen Klonierungswirt, z.B. E. coli, transformiert, der Klonierungswirt herangezüchtet, lysiert, das Plasmid isoliert und das Bruchstück durch Restriktionsanalyse, Sequenzierung oder deren Kombinationen untersucht werden, oder Ähnliches.
Verschiedene Vektoren können im Verlauf der Entwicklung des Konstrukts und der Transformation der Wirszelle verwendet werden. Diese Vektoren können Klonierungsvektoren, Expressionsvektoren und die Integration in den Wirt bewirkende Vektoren beinhalten, es kann auch blosse DNA zur Transformation und Integration verwendet werden.
Der Klonierungsvektor ist in den meisten Fällen dadurch gekennzeichnet, dass er einen im Klonierungswirt funktionellen Replikationsursprung und einen Marker zur Selektion eines Wirts mit dem Klonierungsvektor aufweist, er kann einen oder mehrere Polylinker, oder zusätzliche Sequenzen zur Insertion, Selektion, Abänderung, Vereinfachung der Sequenzierung, Exzision oder Ähnlichem enthalten. Ausserdem können Trägervektoren verwendet werden, wobei der Vektor einen oder mehrere Replikationsanfänge haben kann, was es ermöglicht, den Vektor in mehr als einem Wirt zu re plizieren, z.B. in einem prokaryotischen Wirt und einem eukaryotischen Wirt.
Im allgemeinen werden Expressionsvektoren dafür sorgen, dass ein Konstrukt, welches die transkriptionellen und transiationellen Initiations- und Terminationsbereiche enthält, eingefügt wird; dem Konstrukt können ein oder beide Regulierbereiche fehlen, dann werden diese von dem Expressionsvektor bei der Einfügung der Sequenz, die das Proteinprodukt kodiert, bereitgestellt. So kann das Konstrukt in ein Gen, das funktionale transkriptionelle und translationelle Bereiche hat, eingefügt werden, wobei die Insertion in der Nähe des 5'-Endes des vorhandenen Gens erfolgt und das Konstrukt unter die regulierende Steuerung der vorhandenen Regulierbereiche kommt. Normalerweise wäre es für das Startcodon wünschenswert, dass es 5' des bereits vorhandenen Startcodon ist, es sei denn, ein Fusionsprodukt kann akzeptiert werden, oder dass das Startcodon ausser Phase zum bereits vorhandenen Startcodon ist. In anderen Fällen kommen Expressionsvektoren vor, die einen oder mehrere Restriktionsstellen zwischen den Initiations- und Terminations-Regulierbereichen aufweisen, so dass das Strukturgen bei der (den) Restriktionsstelle(n) eingefügt und der Regulierungssteuerung durch diese Bereiche unterliegt. Als Expressionsvektor sind für die Erfindung, von der hier die Rede ist, für den extrachromosomalen stabilen Erhalt oder für die Integration Konstrukte und Vektoren von besonderem Interesse, die in ihrer stabilen Form im Wirt frei von heterologer (Saccharomyces-fremder) DNA sind.
Gemäss einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Verfahren zur Verfügung gestellt, die Hefen mit allen oben geschilderten Vorteilen liefern, wobei ausserdem prokaryotische DNA-Sequenzen aus ihnen entfernt worden sind. Dies wurde durch Genersatztechniken erreicht (R.J. Rothstein (1983), Methods in Enzymology 101, 202). Erfindungsgemäss werden diese Techniken nun vorteilhaft auf Saccharomyces- Zellen angewendet. Ein Beispiel ist die Transformation von Saccharomyces-Zellen mit einem Vektor, der Gene enthält, die eine veränderte Maltase und/oder Maltosepermease kodieren, wobei diese in einem für die Sporulation spezifischen Saccharomyces-Gen gelegen sind (E. Gottlin-Ninga, D.B. Kaback, Mol. Cell. Biol. 6, 2185 (1986)). Nachdem diese DNA in eine Saccharomyces-Wirtszelle eingeführt ist, findet eine homologe Rekombination der neu eingeführten DNA mit dem chromosomalen sporulationsspezifischen Gen statt. Als Folge davon werden in die Sequenzen des sporulationsspezifischen Gens eingebettete Gene zur Kodierung einer veränderten Maltase und/oder Maltosepermease in das Chromosom integriert. Die erhaltenen Transformanten sind völlig frei von prokaryotischer DNA.
Man wird die Erkenntnis zu schätzten wissen, dass noch bessere Ergebnisse erzielt werden können, wenn das optimale Verhältnis von Maltase und Maltosepermease-Aktivität bestimmt wird. Das kann getan werden, indem die Promotoren beider Gene geändert werden, oder indem verschiedene Anzahlen (veränderter) Maltase- und Maltosepermease-Gene in das Hefegenom integriert werden, was zum Beispiel durch Verwen dung verschiedener Einbau-Loci gemäss den unten beschriebenen Verfahren möglich ist. Das optimale Verhältnis Maltasezu Maltosepermease-Aktivität kann auch erhalten werden, indem Maltase- und Maltosepermease-Gene eingesetzt werden, die andere Isoenzyme der Maltase und Maltosepermease kodieren. Im Weiteren kann irgend ein Enzym angewendet werden, das mindestens entweder Maltase oder Maltosepermease-Aktivität hat. Ausserdem können das MAL-Regulierprotein kodierende Gene in einer analogen Weise (siehe auch Beispiel 1), entweder von ihrem eigenen, natürlichen Promotor oder von einem anderen, bevorzugt von Saccharomyces stammenden Promotor gesteuert in das Genom eingefügt werden. Das kann auch zum Erreichen eines optimalen Verhältnisses von Maltase zu Maltosepermease-Aktivität nützlich sein.

Liste der hinterlegten Stämme

Die folgenden Stämme wurden bei dem Centraal Bureau veor Schimmebultures (CBS), Baarn, Die Niederlande, hinterlegt:
Saccharomyces cerevisiae 237 Ng (Stamm A) wurde bei dem CBS unter der Registriernummer 158.86 am 25. März 1986 hinterlegt.
Saccharomyces cerevisiae DS 15543 Stamm C) wurde bei dem CBS unter der Registriernummer 406.87 am 3. September 1987 hinterlegt.
Escherichia ccli, enthaltend Plasmid p21-40, wurde bei dem CBS unter der Registriernummer 400.87 am 28. August 1987 hinterlegt.
Escherichia coli, enthaltend Plasmid pYEF46, wurde bei dem CBS unter der Registriernummer 401.87 am 28. August 1987 hinterlegt.
Escherichia coli, enthaltend Plasmid pY6, wurde bei dem CBS unter der Registriernummer 402.87 am 28. August 1987 hinterlegt.
Escherichia coli, enthaltend Plasmid pEG418, wurde bei dem CBS unter der Registriernummer 160.87 am 25. März 1986 hinterlegt.
Escherichia coli, enthaltend Plasmid pTZ19R, wurde bei dem CBS unter der Registriernummer 405.87 am 3. September 1987 hinterlegt.
Escherichia coli, enthaltend Plasmid pTZ19R/ADHI, wurde bei dem CBS unter der Registriernummer 404.87 am 3. September 1987 hinterlegt.
Escherichia coli, enthaltend Plasmid p153-215 AK, wurde bei dem CBS unter der Registriernummer 403.87 am 3. September 1987 hinterlegt.
Escherichia coli, enthaltend Plasmid pLF24, wurde bei dem CBS unter der Reglstriernummer 156.88 am 8. März 1988 hinterlegt.
Escherichia coli, enthaltend Plasmid pUT332, wurde bei dem CBS unter der Registriernummer 158.88 am 8. März 1988 hinterlegt.
Escherichia coli, enthaltend Plasmid pTZ18R, wurde bei dem CBS unter der Registriernummer 480.88 am 27. Juli 1988 hinterlegt.

Kurze Beschreibung der Figuren

Figur 1 beschreibt die Konstruktion des Plasmids pGbeMAL69. Die Pfeile geben die Richtung der Transkrlption der angegebenen Gene an. Die Plasmide sind schematisch und nicht massstabsgetreu gezeichnet. Abkürzungen: G418, das Tn5-Gen (unter der Steuerung des ADHI-Promotors), das Resistenz gegen G418 verleiht; P, PvuI; X, XbaI; S, SalI; H, HindIII; CIP, Phosphatase aus Kalbsdarm.
Figur 2 beschreibt die Konstruktion von pGb-eMAL61. Die Plasmide sind schematisch und nicht massstabsgetreu gezeichnet. Abkürzungen: Δ Maltase, Maltase-Gen mit teilweiser Deletion; B, BglII. Siehe auch Beschreibung zu Figur 1.
Figur 3 beschreibt die Konstruktion des Plasmids pGb- eMAL63. Die Plasmide sind schematisch und nicht massstabsgetreu gezeichnet. Abkürzungen: (K), eingefügte KpnI-Spaltstelle; (S), eingefügte SalI-Spaltstelle; Klenow, grosse Untereinheit aus DNA-Polymerase; H, HindIII. Siehe auch Beschreibung zu Figur 1.
Figur 4 beschraibt die Konstruktion von pGb-M6g(Δ-9). Abkürzungen H, HindIII; St, StuI; Klenow, grosses Bruchstück aus DNA-Polmerase I; EV, EcoRV; Xh, XhOI; M, MluI; fl ori, Ursprung des Replikationsphagen f1; amp, Resistenzgen gegen Ampicillin ; s.p., Sequenz-Primer. Die Pfeile geben die Richtung 5'T3' an. Das deletierte Gebiet ist mit gepunkteten Linien und mit Δ angegeben.
Figur 5 beschreibt die Sequenz des Plasmids pGb-M6g (Δ-9).
a) Maltase- und Maltosepermease-Gene. Der Pfeil gibt die Richtung der Transkription an. St (StuI) diente als Ausgangspunkt für die Konstruktion des Deletionsmutanten. Die wichtigen Teile der Sequenz des intergenen Gebiets sind unterhalb dieser Karte gezeigt.
b) Sequenz von pGb-m6g (Δ-9) . Das deletierte Gebiet erstreckt sich von -9 bis -417. Als Polylinker werden die Oligonucleotide bezeichnet, die an die Bal31-behandelte DNA ligasiert wurden (siehe auch Figur 4).
Figur 6 beschreibt die Konstruktion des Plasmids pGb- iA32/G418. Die Pfeile geben die Richtung der Transkription an. Die Plasmide sind schematisch und nicht massstabsgetreu gezeichnet. Abkürzungen: H, HindIII; EV, EcoRV; f1 ori, Ursprung des Replikationsphagen f1; amp, Resistenzgen gegen Ampillicin; G418, Tn5-Gen (ADHI-Promotor), das Resistenz gegen G418 verleiht; S, SmaI; Hc, HincII; pADHI, Promotor der Alkoholdehydrogenase I und Teil des 5'-Leaders (schraffiertes Gebiet).
Figur 7 beschreibt die Konstruktion von Plasmid pGb- iRR01.
a) Das Plasmid pT4 ist nicht massstabsgetreu gezeichnet. Abkürzungen: E, EcoRI; B/Bg BamHI/BglII Ligation; H, HindIII.
b) Die Mutagenese an pT4, um den EF1αA-Promotor und den 5'-Leader an die fünf N-terminalen Aminosäuren-Codons des Maltase-Gens so zu fusionieren, dass auch eine BglII- Spaltstelle gebildet wird. Die wichtigen Sequenzen sind gezeigt.
- Der Mutagenese-Primer ist teilweise komplementär (gepunktet angegeben) zur EF1αA-Sequenz. Im nicht komplementären Bereich sind die Maltase-Codons und die - umrahmte - BglII-Erkennungssteiie (es ist zu beachten, dass die gezeigte Orientierung des Mutagenese-Primers 3'T5' ist, d.h. die BglII-Stelle sollte von rechts nach links (5'T3') gelesen werden).
- In der Maltasesequenz sind die N-terminalen fünf Aminosäure-Codons angegeben. Die B1I-Erkennungsstelle ist umrahmt.
- In der Sequnez von pT4-M ist die die Mutation umfassende Sequenz gezeigt. Die BglII-Stelle ist umrahmt. Die Sternchen geben die Abweichung von der Maltase-Nukleotidsequenz an. Die Abweichung im vierten Codon ist eine stumme Mutation.
c) Die Plasmide sind nicht massstabsgetreu gezeichnet. Abkürzungen: H, HindII; Bc, Bc1I; E, EcoRI; Bg, BglII; EV, EcoRV; Bg/Bc, BglII/BcII Ligation; pEF1αA (schraffierter Rahmen), 5'-Flanke (Promotor und 5'-Leadersequenz) von EF1αA; f1 ori, Ursprung der Replikation vom Phagen f1; ampr, Resistenzgen gegen Ampillicin.
d) Die Plasmide sind nicht massstabsgetreu gezeichnet. Abkürzungen: siehe c).
Figur 8 beschreibt die Konstruktion des Plasmids pGb- SNENS. Die Plasmide sind schematisch und nicht massstabsgetreu gezeichnet. Abkürzungen: E, EcoRI; H, HindIII; Sf, SfiI; N, NotI; f1 ori, Ursprung des Replikationsphagen f1; amp, Resistenzgen gegen Ampillicin. Die Pfeile geben die Richtung 5'T3' an. Oligomer 3 und 4 sind synthetische Oligodesoxynucleotide mit der Basensequenz wie angegeben.
Figur 9 beschreibt die Konstruktion des Plasmids pGb- RB2. Die Plasmide sind schematisch und nicht massstabsgetreu gezeichnet. Abkürzungen: E, EcoRI; Bg, BglII; H, HindIII; Hc, HincII; B, BamHI; Sm, SmaI; P, PstI; f1 ori, Ursprung des Replikationsphagen f1; ampr, Resistenzgen gegen Ampillicin. Die Pfeile geben die Richtung 5'T3' an. Oligomere 5 und 6 sind synthetische Oligodesoxynucleotide mit der Basensequenz wie angegeben. Die transiationellen Stopcodons in allen Leserastern sind unterstrichen.
Figur 10 beschreibt die Konstruktion des Plasmids pGbRBN3. Die Pfeile geben die Richtung der Transkription an. Die Plasmide sind schematisch und nicht massstabsgetreu gezeichnet. Abkürzungen: Sf, SfiI; Sm, SmaI; H, HindIII; f1 ori, Ursprung des Replikationsphagen f1; ampr, Resistenzgen gegen Ampillbin; Tn5-Gen (unter der Steuerung des ADHI-Promotors), das Resistenz gegen G418 verleiht; EV, EcoRV; Hc, HincII.
Figur 11 beschreibt die Konstruktion des Plasmids pGb-RBRR01. Das Plasmid pGb-iRR01 ist in Figur 7 vollständig beschrieben und enthält das Maltase-Gen unter der Lenkung des EFI1αA-Promotors (pEF1αA) und das Maltosepermease- Gen unter der Lenkung des Alkoholdehydrogenase I-Promotors (pADHI) (beide Promotoren sind mit schraffierten Kästen angegeben). pGb-RB2 ist in Figur 9 beschrieben. In pGb-RBRR01 ist das SIT4-haltige Bruchstück in zwei Teile geteilt ("SIT4-Flanken"). Die Plasmide sind schematisch und nicht massstabsgetreu gezeichnet. Die Abkürzungen sind wie bei der Legende für Figur 10. Die Pfeile geben die Richtung der Transkription an.
Figur 12 beschreibt das Gen-Aufbrechen in einem Schritt. In Schritt 1 wird pGb-RBN3 mit SfiI abgebaut. Das setzt ein DNA-Bruchstück frei, das auf beiden Seiten Homologie zu dem SIT4-Genbereich aufweist. Das lenkt die Integration in das SIT4-Gen (siehe auch R:J: Rothstein (1983) in: Methods In Enzymology, 101, 202): Der SIT4-Genbereich ist mit einem schraffierten Kasten angegeben. Beide chromosomalen Allele sind schematisch gezeigt worden. In Schritt 2 wird der sich ergebende Stamm ApGb-RBN3 sowohl mit pUT332 (nicht abgebaut) als auch mit pGb-RBRR01, abgebaut mit SfiI, transformiert. Das Prinzip der Kotransformation ist gut dokumentiert (Querverweise: A.H. Brand, I. Breeden, J. Abraham, R. Steiglanz und K. Kasmyth (1985) Cell 41, 41 bis 48 und P. Siliciano und K. Thatchell (1984) Cell 37, 969 bis 978. Bei der ersten Selektion haben wir Resistenz gegen Phleomycin (Plasmid pUT 332) verwendet, aber natürlich können auch 2µ-abgeleitete episomale Plasmide angewendet werden, die Resistenz gegen andere Antibiotika wie Hygromycin B verleihen. Das pUT332 und Phleomycin können von Cayla, Avenue Larrien, Centre Commercial de Gros, 31094 Toulouse Cédex, Frankreich, bezogen werden. Auf pUT332 ist das Resistenzgen gegen Phleomycin von dem Transposon Tn5 abgeleitet und ist unter die Lenkung eines Hefepromotors gestellt worden. In Schritt 3 wird das episomale Plasmid pUT332 von den Transformanten durch Züchtung in einem unselektiven Medium entfernt (Heilung). Abkürzungen: G418r, Resistenzgen gegen G418 unter der Lenkung des ADHI-Promotors; Sf, Ende eines durch Abbau mit SfiI erzeugten DNA-Bruchstücks; MAL, ein abgeändertes Maltase- und Maltosepermease-Gen. Siehe auch Figuren 9 und 11 für Einzelheiten der Plasmide; +pUT332, episomales Plasmid pUT332.
Figur 13 beschreibt die Korrelation zwischen der Zunahme an spezifischer Aktivität der Maltosepermease und der Maltase mit dem Verschwinden der Glucose aus Medium A. Die Darstellungen sind für im Handel erhältliche Stämme von Backhefe wie z.B. Stamm A typisch.
Figur 14 beschreibt die spezifischen Aktivitäten der Maltosepermease in Stamm A und seinen rDNA-Abkömmlingen während einem in Medium A simulierten Aufgehen eines Teigs.
Figur 15 beschreibt die spezifischen Aktivitäten der Maltase in Stamm A und seinen rDNA-Abkömmlingen während einem in Medium A, enthaltend Maltose als hauptsächliche Kohlenstoff- und Energiequelle, simulierten Aufgahen eines Teigs.
Figur 16 beschreibt die Vergärung von Maltose durch Stamm A und seine RDNA-Abkömmlinge während einem in Medium A, enthaltend Maltose als hauptsächliche Kohlenstoff- und Energiequelle, simulierten Aufgehen eines Teigs.
Figur 17 beschreibt die Vergärung von Maltose durch Stamm A und seine rDNA-Abkömmlinge während einem in Medium B, enthaltend Glucose als hauptsächliche Kohlenstoff- und Energiequelle, simulierten Aufgehen eines Teigs.
Die folgenden experimentellen Daten werden zur Veranschaulichung der Erfindung angegeben. Es soll verständlich sein, dass der Fachmann, der mit diesen Verfahren vertraut ist, andere Hefestämme und Vektoren verwenden kann, die genauso für den Zweck der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können. Diese Abwandlungen sind in den Schutzbereich der Erfindung eingeschlossen.

Klonierungstechniken

Für allgemeine Klonierungstechniken wird auf das Handbuch von Maniatis et al. verwiesen (T. Maniatis, E.F. Fritsch, J. Sambrook (1982): Molecular Cloning, A Laboratory Manual). Restriktionsenzyme werden gemäss den Empfehlungen des Herstellers verwendet und werden entweder von New England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) oder Boehringer Mannheim (Boehringer) erhalten. Im Allgemeinen werden 1 bis 5 Enzymeinheiten zur Spaltung von 1µg DNA benötigt.
Die Transformation von E. coli wurde mit dem CaCl&sub2;- Verfahren durchgeführt (T. Maniatis et al., siehe oben).

Konstruktion rekombinanter Plasmide

1. pGb-eMAL6g

Dieses Plasmid ist in der Hefe zur Selbstreplikation befähigt und enthält die Maltosepermease und Maltase kodierenden Gene. Seine Konstruktion ist in Fig. 1 dargestellt.
Das peG418 wird von pEMBLYe23 abgeleitet (Baldari und G. Cesarini (1985), Gene 35, 27) und enthält zwischen den SalI- und HindIII-Spaltstellen ein Bruchstück mit dem Tn5- Gen (Reiss et al. (1984), EMBO J. 3, 3317), das unter der Lenkung des Promotors der Alkoholdehydrogenase I (ADHI) aus Hefe Resistenz gegen G418 verleiht, ähnlich dem von Bennetzen und Hall beschriebenen (J.C. Bennetzen und B.D. Hall (1982), J. Biol. Chem. 257, 3018). Das peG418 wurde mit Hindlil gespalten, mit CIP dephosphoryliert und mit dem Abbauprodukt von pY6 x HindIII x PvuI ligasiert. Das pY6 ist beschrieben (R.B Needleman und C. Micheis (1983) Mol. Cell. Biol. 3, 796; R.B Needleman, D.B. Kaback, R.A. Dubin, S.L. Perkins, N.G. Rosenberg, K.A. Sutherland, D.B. Forrest, C. Michels (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81 , 2811) und enthält ein den MAL6g-Locus enthaltendes HindIII- Bruchstück von 7,0 kb. Das ergab pGb-eMAL6g.

2. pGb-EMAL61

Dieses 2µ-abgeleitete episomale Plasmid enthält das die Maltosepermease kodierende Gen. Seine Konstruktion ist in Figur 2 dargestellt.
Das pGb-eMAL61 enthält zwei BglII-Spaltstellen, die beide im Maltase-Gen liegen. Dieses BglII von 1,4 kb wurde durch Digerieren mit BglII, gefolgt von erneutem Ligasieren unter starker Verdünnung zur Förderung intramolekularer Ligasierung, aus dem pGb-eMALg deletiert. Es ist gezeigt worden, dass eine solche Deletion die Maltase-Funktion zarstört (J.D. Cohen, M.J. Goldenthal, T.Chow, B. Buchferer und J. Marmur (1985) Mol. Gen. Genet. 20, 1).

3. pGb-EMAL63

Dieses 2µ-abgeleitete episomale Plasmid enthält die DNA, die die MALP-Funktion (Regulierprotein-Gen oder MAL- Regulierer) abdeckt. Seine Konstruktion ist in Figur 3 dargestellt.
Das KpnI/SalI-Bruchstück, das das Regulierprotein- Gen enthält, wurde von p21-40 isoliert (R.B. Needleman und C. Michels (1983), siehe oben) . Dieses Bruckstück wurde an den Enden mittels T4 DNA-Polymerase und der Klenow DNA- Polymerase abgestumpft und danach in die eingefügte HindI- II-Spaltstelle des peG418 kloniert.

4. pGb-M6g (Δ-9)

Dieses Plasmid ist ein Mutant, bei dem Promotoren aus dem intergenen Bereich der divergent transkribierten Gene für Maltosepermease und Maltase deletiert wurden (siehe Figur 4). Dieser Bereich enthält die Promotoren für beide Gene (S.H. Hong und J. Marmur (1986) Gene 41, 75). Dieser Deletionsmutant wurde hergestellt, um die ursprünglichen Promotoren zu ersetzen. Die Konstruktion beinhaltet die folgenden Schritte:
a) Das ungefähr 7,0 kb grosse HindIII-Bruchstück, das die Gene für Maltase uno Maltosepermease enthält (siehe auch Figur 1), wurde in die HindIII-Spaltstelle von pTZ19R kloniert. Dieses Plasmid ist im Handel erhältlich (Pharmacia). Das ergibt pGb-M6g.
b) Das pGb-M6g wurde mit StuI geöffnet, die in der intergenen Region spaltet. Die von StuI erzeugten Enden dienten als Ausgangspunkte für die Exonuclease Bal31, um die die Promotoren enthaltende intergene Region (oder Teile davon) abzutrennen. StuI liegt näher bei dem Maltosepermease-Gen. (S.H. Hong und J. Marmur (1986), siehe oben). Die Inkubation mit Bal31 wurde wie von Maniatis et al. beschrieben durchgeführt (T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook (1982), siehe oben). Zu geeigneten Zeitpunkten wurden Proben aus der Reaktion entnommen und mit Klenow DNA-Polymerase inkubiert, um stumpfe Enden zu erzeugen. Dann wurden synthetische Linker mit mehreren Restriktionsstellen an diese Enden ligasiert.
Die folgenden komplementären Oligodesoxynucleotide wurden verwendet:
1. 5' GATATC CTCGAG AGGCCT A 3'
2. 3' CTATAG GAGCTC TCCGGA TGCGC 5'
In der Doppelstrangform werden Restriktionsstellen für ECcoRV (GATATC), XhoI (CTCGAG), StuI (AGGCCT) gebildet; Ligasieren an das kohäsive Ende erzeugt eine MluI-Stelle (ACGCGT). Nach der Kinase-Reaktion wurden die Linker gemäss beschriebenen Bedingungen an die mit Bal31 behandelte DNA ligasiert (T. Maniatis et al., (1982), siehe oben). Das Reaktionsgemisch wurde mit MluI inkubiert und über eine 5ml- Säule aus Sepharose Cl-2B ohromatographiert, um nichtligasierte Oligodesoxynucleotide von dem DNA-Bruchstück abzutrennen. Die Fraktionen, die diese lineare DNA enthielten, wurden vereinigt, an die Plasmid-DNA ligasiert und in Bakterien eingebracht.
c) Der sich ergebende Satz von Deletions-Mutanten wurde der Sequenzanalyse unterzogen. Dazu wurden die doppelsträngigen Plasmide durch Superinfektion mit einem Helferphagen in einzelsträngige DNA umgewandelt (Vorgehen gemäss den Empfehlungen des Lieferanten) . Die einzelsträngigen Matrizen wurden mit üblichen M13-Verfahren entnommen, um in der Didesoxysequenzierung angewendet zu werden (F. Sanger, S. Nicklen und A.R. Coulson (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 5463). Als Primer haben wir ein synthetisches Oligodesoxynucleotid (5'-GAATTCGGTAGCGTTCACGC-3') verwendet, das komplementär zu einem in der Nähe des ATG- Startcodons des Maltosepermease-Gens liegenden DNA- Abschnitt ist. Seine Orientierung ist so, dass die Sequenz gegen den Promotor gelesen wird (siehe auch Figur 4).
Derjenige Deletions-Mutant, in dem das Meiste von dem Maltosepermease-Promotor entfernt worden war, wurde für weitere Experimente ausgewählt. Der Maltase-Promotor (oder ein Teil davon) ist immer noch vorhanden (es ist zu beachten, dass die StuI-Spaltstelle, als Ausgangspunkt für die Behandlung mit der Exonuclease, asymmetrisch in dem intergenen Bereich liegt). Figur 5 führt die Sequenz bei dem Deletionspunkt im Mutanten pGb-M6g (Δ-9) auf. Diese wird mit der kürzlich bestimmten Sequenz in diesem ganzen Gebiet verglichen (S.H.Hong und J. Marmur (1986), siehe oben). In der Wildtyp-Sequenz wurde ein Unterschied zur veröffentlichten Sequenz beobachtet: Das C bei -878 (Numerierung gemäss S.H. Hong und J. Marmur (1986), siehe oben) ist in unserer Sequenz nicht vorhanden. Dementsprechend kann die DNA an dieser Stelle nicht mit HpaI oder HincII abgebaut werden.
Das Plasmid pGb-M6g (Δ-9) ist das Ausgangsplasmid, um andere Promotoren sowohl an das Maltosepermease-Gen als auch an das Maltase-Gen zu fusionieren (siehe unten).

5. pGb-iA32/G418

Dieses Plasmid ist ein integrierendes Hefe-Plasmid. Es enthält das an den Promotor der Alkoholdehydrogenase 1 und einen Teil seiner 5'-Leadersequenz gehängte Maltosepermease-Gen. Seine Konstruktion war wie folgt (Figur 6).
a) Das Plasmid pTZ19R/ADHI enthält ein BamHI-Bruchstück von 1,4 kb mit dem ADHI-Promotor, der bei der Stelle -15 ab dem AUG-Codon anfängt (J.L. Bennetzen und B.D. Hall (1982), J. Biol. Chem. 257, 3018). Von diesem Plasmid wurde das EcoRV-HincII-Bruchstück mit 700 bp isoliert und an das mit EcoRV abgebaute pGb-M6g (Δ-9) ligasiert. Die sich ergebenden Plasmide wurden mittels Restriktionsenzym-Abbau untersucht und die richtige Orientierung wurde durch Didesoxy-Sequenzanalyse von einzelsträngigen Matrizen bestätigt (siehe Figur 6). Es wurde derselbe Oligoprimer verwendet wie in Abschnitt 4c beschrieben.
As Ergebnis des Klonierungsverfahrens des ADHI-Promotor-Bruchstücks ist ein Teil des Polylinkers von pTZ19R (BamHI-HincII) zwischen dem Maltosepermease-Gen und dem ADHI-Promotor vorhanden. Struktur und Sequenz von pGb-A32 sind in Figur 6a gezeigt.
b) Das Plasmid pGb-A32 wurde mit dem dominanten Selektlons-Marker G418res versehen. Ein EcoRV/HincII-Bruchstück von 1,9 kb enthält das T5-Gen, das unter der Lenkung des Promotors der Alkoholdehydrogenase I Resistenz gegen G418 verleiht. Dieses Bruchstück wurde durch einen Doppelabbau des Plasmids 153-215 AK mittels EcoRV/HincII isoliert. Das EcoRV/HincII-Bruchstück wurde in die SmaI- Spaltstelle von pGb-A32 kloniert. Das ergab pGb-iA32/G418.

6. pGb-iRRo1

Dieses Plasmid ist ein integrierendes Plasmid. Es enthält das unter der Lenkung des Promotors der Alkoholdehydrogenase I stehende Maltosepermease-Gen und das unter der Lenkung des Promotors des Translationsverlängerungs- Faktors EF1αA stehende Maltase-Gen. Der Klonierungsablauf ist in Figur 7 gezeigt. Das Vorgehen war wie folgt: Das Maltase-Gen enthält ungefähr beim fünften Aminosäure-Codon eine Bc1I-Spaltstelle. Daher wurde der EF1αA-kodierende Bereich so mutagenisiert, dass die ersten fünf Aminosäuren identisch mit denen des Maltase-Proteins wurden. Gleichzeitig wurde eine BglII-Spaltstelle bei dem Ort der Bc1I- Spaltstelle eingeführt. Die Umwandlung einer Boll-Spaltstelle in eine BglII-Spaltstelle ist eine stumme Mutation im vierten Codon. Mittels einer BglII/BglI-Ligasierung konnten der EF1αA-Promotor und die Leadersequenz mit dem Rest des Maltase-Gens fusioniert werden. Das Vorgehen umfasste die folgenden Schritte:
a) Das Ausgangsplasmid war pYEF46 (S. Nagata, K. Nagashima, Y. Tsunetsugu-Yokota, K. Fuyimura, M. Miyaraki und Y. Kaziro (1984), EMBO J. 3, 1825), das das gesamte EF1αA-kodierende Gen enthält. Ein BglII-Bruchstück von 2,5 kb, das dieses Gen umfasst, wurde isoliert und in die Bam- HI-Spaltstelle von pTZ19R kloniert. Der Klone pT4 wurde ge nommen (siehe Figur 7a) und für die oligodesoxynucleotidgerichtete Mutagenese verwendet.
b) Nach Superinfektion mit dem Helferphagen wurde die einzelsträngige (es-) DNA von pT4 isoliert. 400 ng es-DNA, 400 ng hitzedenaturierte pTZ19R x BamHI und 100 ng Mutagenese-Oligodesoxynucleotide (siehe Figur 7b) wurden in einem Volumen von 10 µl 7 mM TrisHCl pH 7,5; 50 mM NaCl und 7 mM MgCl&sub2; für 10 Minuten bei 56ºC inkubiert. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden Synthese des zweiten Strangs und Ligasierung durch Zugabe von 1 µl Klenow DNA-Polymerase (2 E), 1 µl T4 DNA-Ligase (4 E), 1 µl TMD (200 InM TrisHCl pH 7,5; 100 mM MgCl&sub2;; 100 mM DTT), 4 µl 2,5 mM dNTP-Mischung, 1 µl 10 mM ATP und 2 µl H&sub2;O ausgelöst. Das Endvolumen war 20 µl, die Inkubation wurde für 16 Stunden bei 17ºC durchgeführt, worauf die Mischung auf E. Coli JM101 transformiert wurde. Die Mutanten wurden durch Koloniehybridisierung mit einem kinasierten, für den Mutanten spezifischen Oligodesoxynucleotid reihenuntersucht (siehe Figur 7b). Dieses Oligomer für die Reihenuntersuchung, 5'-GACTATTTCAGATCTTC-3', war zu den eingeführten Maltase-Codons und flankierenden Nucleotiden komplementär. Die Hybridisierung wur de für 16 Stunden in 6 x NET (1 x NET = 0,15 M NaCl; 0,015 M TrisHCl pH 7,5; 0,001 M EDTA) bei 25ºC durchgeführt. Die Waschungen nach der Hybridisierung wurden in der selben Mischung und bei der selben Temperatur (dreimal 10 Minuten) ausgeführt, gefolgt von einer Waschung in 3 x NET bei 25ºC. Mehrere positive Kolonien wurden weiter untersucht. BglII- Abbau bestätigte das Vorhandensein einer BglII-Spaltstelle. Ausserdem wurde einzelsträngige DNA von einem eine BglII- Spaltstelle enthaltenden Mutanten (pT4-M) entnommen und der Didesoxy-Sequenzanalyse unterworfen, wobei ein synthetischer 17-mer Primer, 5'-CAATACCACCACACTTG-3', der zu den Nucleotiden 87 bis 103 des EF1αA-Genes komplementär ist, verwendet wurde (S. Nagata, K. Nagashima, Y. Tsunetsugu- Yokota, K. Fujimura, M. Miyaraki, und Y. Kaziro (1984), EMBO J. 3, 1825). Die erhaltene Sequenz bestätigte die erfolgreiche Einführung der gewünschten Mutationen.
c) Der nächste Schritt war, das Gensegment der Maltase mit dem EF1αA-Promotor und dem NH&sub2;-Endstück von pT4-M zu isolieren und es über Kohäsive Enden-Ligasierung mittels BglII/Bc1I mit dem Rest des Maltase-Gens zu fusionieren. Dieser Schritt stellt den Bereich wieder her, der stromabwärts des EF1αA-Promotors und der Leadersequenz liegt und die Maltase kodiert (siehe Fig. 7c). Das Plasmid pGb-M6g (Δ-9) wurde auf GM113, ein Mutter-Stamm von E. Coli, transformiert, damit die BclI-Spaltstelle (die empfindlich auf Methylierung ist) verwendet werden konnte (GM113: thr-, leuB6, proA2, tris-4, metB1, lacY1, galK2, ara-14, tsx33, thi-1, thyA12, deoB16, supE44, rpsL260, dam-3). Ein Bc1I/HindIII-Bruchstück von 3,8 kb wurde isoliert, das das Maltase-Gen, abzüglich dem NH&sub2;-Endstück selber, enthält. Der pt4-M wurde mit BglII/HindIII abgebaut und das grosse Bruchstück mit 4,1 kb (EF1αA-Promotor, NH&sub2;-Endstück und Maltase-Gen) isoliert. Beide Bruchstücke wurden aneinander ligasiert, was pGb-EFMT-3 ergab. Die Sequenzanalyse bestätigte die Richtigkeit aller eingeführten Mutationen.
d) Schlussendlich wurde das pGb-EFMT-3 mit EcoRV und HindIII abgebaut, um ein Bruchstück von 4,8 kb mit dem EF1αA-Promotor und dem Maltase-Gen zu reinigen. Aus pGb- ia32/G418 (siehe Figur 6) wurde ein ungefähr 8,3 kb grosses Teil-HindIII/EcoRV-Bruchstück isoliert. Dieses besteht aus oem pTZ19R-Grundgerüst, dem Segment mit dem ADHI-Promotor und dem Maltosepermease-Gen, und dem ADHI/G418res-Segment. Beide wurden ligasiert, was pGb-iRRo1 ergab (siehe Figur 7d).

7. pGb-RB2

Dieses Plasmid dient als Klonierungsvehikel, um DNA- Stücke tn das SIT4-Gen von Saccharomyces cerevisiae zu integrieren. Seine Konstruktion beinhaltet die folgenden Schritte (siehe Figuren 8 und 9).
a. Das pTZ19R wurde mit EcoRI und HindIII abgebaut, um seinen Polylinker durch ein synthetisch hergestelltes DNA-Bruchstück von 40 Nucleotiden zu ersetzen. Dieses DNA- Stück wird durch Rekombination der synthetischen Oligodesoxynucleotide 3 und 4 hergestellt (siehe Figur 8). Dieses kurze Bruchstück enthält kohäsive EcoRI- und HindIII-Enden. Klonierung dieses DNA-Bruchstücks in den pTZ19R-Vektor stellt die Spaltstellen von EcoRI und HindIII nicht wieder her. Das synthetische DNA-Bruchstück enthält an den Enden Restriktionsstellen für NotI und SfiI, und in der Mitte eine EcoRI-Spaltstelle, wie angegeben. Das sich ergebende Plasmid wird mit pGb-SNENS bezeichnet.
b. Ein EcoRI-Bruchstück, enthaltend das SIT4-Gen (Gottlin-Ninga und Kaback, siehe oben) wurde aus pLF24 (auch unter dem Code pLN420 bekannt) isoliert und in die EcoRI-Spaltstelle vom pGb-SNENS kloniert. Das ergab pGb- Spons31. Da brauchbare Vergleichs-Restriktionsstellen fehlen, ist seine Orientierung unbekannt.
c. Das Plasmid pGb-Spons31 enthält eine einzige BglII-Spaltstelle in der Mitte des SIT4-Gens. Diese kann als Spaltstelle verwendet werden, in den jedes durch Genersetzung in das SIT4-Gen zu transferierende DNA-Bruchstück kloniert werden kann. Um das Klonierungsverfahren zu vereinfachen wurde das SIT4-Gen mit einem synthetischen Stück DNA versehen, das mehrere eindeutige Restriktionsstellen enthält. Die Konstruktion von pGb-RB2 ist in Figur 9 dargestellt.
Das synthetische DNA-Bruchstück hat zwei kohäsive BglII-Enden. Seine Orientierung in pGb-RB2, wie in Figur 9 angegeben, stützt sich auf eine Restriktionsenzym-Analyse von pGb-RBN3 (siehe nächstes)

8. pGb-RBN3

Ein EcoRV/HincII-Bruchstück von 1,9 kb, das das unter der Steuerung des ADHI-Promotors stehende G418res-Gen enthält (siehe auch Konstruktion von pGb-iA32/G418), wurde in die SmaI-Spaltstelle von pGb-RB2 kloniert. Das ergab pGb- RBN3 (Figur 10).

9. pGb-RBRR01

Dieses Plasmid enthält das unter der Lenkung des Promotors der Alkoholdehydrogenase 1 stehende Maltosepermease- Gen und das unter der Lenkung des EF1αA.-Promotors stehende Maltase-Gen. Beide liegen auf einem HindIII-Bruchstück von 8,3 kb, das in das SIT4-Gen kloniert wurde. Seine Konstruktion ist in Figur 11 dargestellt. Dazu wurde pGb-iRR01 mit HindIII abgebaut und an pGb-RB2 x HindIII (mit Phosphatase aus Kalbsdarm behandelt) ligasiert. Das ergab pGb-RBRR01.

10. pGb-RBREG01

Dieses Plasmid enthält das unter der Lenkung des Promotors der Alkoholdehydrogenase stehende MAL-Regulierergen.
1. Das pGb-RBREG01 kann wie folgt konstruiert werden. Von p21-40 (R.B. Needleman und C. Michels (1983), siehe oben) wird das Sali-Bruchstück, das das Regulierprotein-Gen enthält, isoliert. Dieses Bruchstück wird in die SalI- Spaltstelle von pTZ18R kloniert. Dieses Plasmld ist im Handel erhältlich (Pharmacia). Seine Orientierung ist dergestalt, dass das Promotor-Gebiet des MAL-Regulierergens zur T7-Promotorsequenz von pTZ18R hin zeigt. Unter Verwendung des Sequenz-Primers von pTZ18R und anderer neu hergestellter, auf der erhaltenen DNA-Sequenz beruhender Oligonucleotid-Primer kann der Promotor-Bereich des MAL-Regulierergens und den das NH&sub2;-Ende kodiernden Bereich des Gens sequenziert werden. Das stellt den Ort des AUG-Startcodons fest. Falls nutzbare Restriktionsstellen im Promotor-Bereich, nahe beim AUG-Startcodon, fehlen, kann eine solche Stelle (z.B. BglII) durch ortspezifische Mutagenese nach gängigen Verfahren mit einem Oligonucleotid in dieses Gebiet eingeführt werden (siehe auch die Konstruktion rekombinanter Plasmide, Sektion 5b).
Nach so einer Mutagenese können das BglII/SalI-Bruchstück (das das MAL-Regulierergen ohne das Promotor-Gebiet enthält) und ein EcoRV/BanHI-Bruchstück (das den ADHI- Promotor enthält, siehe auch Figur 7d, pGb-iRR01) zusammen in pGb-RB2 so ligasiert werden (siehe Figur 9), dass das MAL-Regulierergen unter der Steuerung des ADHI-Promotors ist. Das wird das Plasmid pGb-iRBREG01 liefern. Eine Sequenzanalyse auf es-DNA als Matrize nach den Didesoxyketten-Verfahren mit Oligonucleotiden kann leicht die Richtigkelt der Klonierungsschritte und die Orientierung des Promotors feststellen.
Man wird die Erkenntnis zu schätzen wissen, dass die oben erwähnten Plasmid-Konstruktionen nur gerade als Beispiele zur Veranschaulichung der Erfindung dienen. Andere Promotoren (bevorzugt Saccharomyces) können verwendet werden (oder andere Teile des selben Promotors), andere Integrations-Loci können ausgewählt werden, andere Kombinationen von Maltase, Maltosepermease und MAL-Regulierprotein (entweder unter der Steuerung ihres eigenen Promotors oder eines anderen, vorzugsweise Saccharomyces-Promotors) können gemacht werden, und es können eine oder mehrere Integrationsstellen im Hefe-Genom verwendet werden. Es wird schlussendlich zum optimalen Verhältnis von vorhandener Maltaseund Maltosepermeas-Aktivität während der ganzen Dauer der anaeroben Gärung führen.

Transformation der Hefe

Die Transformation der Hefestämme wurde gemäss dem Verfahren von Ito et al. (H. Ito, Y. Fukuda, K. Murata, A. Kimura (1983), J. Bacteriology 153, 163 bis 168) durchgeführt. Es beinhaltet das Heranzüchten von Saccharomyces in einem üblichen Hefe-Nährmedium auf eine Dichte von 1 bis 25, wünschenswert 4 bis 10 OD&sub6;&sub1;&sub0; nm. Die Hefezellen werden dann entnommen, gewaschen und mit chaotropischen Ionen, bevorzugt die Alkalimetallionen Lithium, Cäsium oder Rubidium, insbesonders als Chloride oder Sulfate, besoders bevorzugt die Lithiumsalze, in Konzentrationen von ungefähr 2 mM bis 1,0 M, vorzugsweise ungefähr 0,1 M, vorbehandelt. Nach Inkubieren der Zellen für ungefähr 5 bis 120 Minuten, vorzugsweise ungefähr 60 Minuten mit dem(den) chaotropischen Ion(en) werden die Zellen dann mit DNA für eine kurze Zeit bei mässiger Temperatur, im Allgemeinen für ungefähr 5 Minuten bis 60 Minuten bei ungefähr 20ºC bis 35ºC, inkubiert. Wünschenswerterweise wird Polyäthylenglycol in einer Konzentration von ungefähr 25 bis 50% zugegeben, wobei das Gesamtmedium durch Zugabe eines gleichen Volumens eines Polyäthylenglycol-Konzentrats verdünnt werden kann, woraus sich die gewünschte Endkonzentration ergibt. Das Polyäthylenglycol wird ungefähr 2000 bis 8000 Daltons, bevorzugt ungefähr 4000 bis 7000 Daltons, gross sein. Die Inkubation wird im Allgemeinen für eine relativ kurze Zeit, im Allgemeinen für ungefähr 5 bis 60 Minuten durchgeführt. Es ist wünschenswert, das Inkubationsmedium einer Hitzebehandlung bei ungefähr 35ºC bis 45ºC, bevorzugt bei 42ºC, für ungefähr 1 bis 10 Minuten zu unterziehen. Für die Selektion der Transformanten kann jeder nützliche Marker wie Phleomycin (D. Genilloud, M.C. Garrido, F. Moreno (1984) Gene 32, 225), Hygromycin B (Gritz et al. (1983), Gene 25, 178) und Aminoglycosid G418 (Jiminez et al. (1980), Nature 287, 869) angewendet werden.
Nach der Transformation der Hefezellen mit integrierenden Plasmiden wurde die Integration an den MAL-Locus gelenkt, wobei BglII-abgebaute DNA verwendet wurde. Die verwendeten integrierenden Plasmide enthalten zwei BglII Spaltstellen, beide im Maltase-Gen, im Abstand von 1,4 kb. Das erzeugt doppelsträngige Brüche, die rekombinogen sind und die Interaktion mit homologer chromosomaler DNA anregen. Die Lücke wird währnd des Integrationsvorgangs aus chromosomaler Information repariert (T.L. Orr-Weaver, J.W. Szostak, R. Rothstein (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 6354). Der Integrationsvorgang liefert eine oder einige wenige Kopien des Plasmid-Vektors (J.W. Szostak, R. Cou (1979), Plasmid 2, 536). Die genaue Anzahl Kopien in diesen Transformanten, die ftr CO&sub2;-Bildungsexperimente verwendet wurden, ist nicht bestimmt worden.
Es wurde ein Schema entwickelt, um stabile Hefe- Transformanten zu erhalten, die keine heterologe DNA enthalten. Beispiele für heterologe DNA sind die DNA des pTZ19R-Vektors und die Selektionsgene, die Resistenz gegen die Antibiotika G418, Phleomycin oder Hygromycin B verleihen. Kurz gefasst war der experimentelle Ablauf wie folgt (Figur 12):
1) Gen-Spaltung eines SIT4-Gens in einem Schritt, via Transformation der Hefe mit pGb-RBN3, das mit SfiI abgebaut worden war. Die Transformanten wurden über die Resistenz gegen G418 selektioniert. Das Ergebnis war der Stamm ApGb- RBN3, in dem ein SIT4-Gen durch ein SIT4-Gen ersetzt wurde, das von dem unter der Steuerung des ADHI-Promotors stehenden G418r-Gen unterbrochen ist.
2) Der Stamm ApGb-RBN3 wurde als Wirts-Stamm in einem Kotransformations-Verfahren mit pUT332 und mit von SfiI abgebautem pGb-RBRR01 eingesetzt. Das pUT332 ist ein 2µ-abgewandeltes episomales Plasmid, das ein Resistenz gegen Phleomycin verleihendes Gen enthält. Die erste Selektion in diesem Kotransformationsschritt wurde auf Platten durchgeführt, die Phleomycin enthielten (30 µg / ml). In einem gewissen Prozentsatz dieser Phleomycinr-Hefezellen (in der Grössenordnung von 0,1 bis 1%) ist das unterbrochene SIT4- Gen (mit pADHI/G418r) durch das kotransformierte SIT4- Bruchstück ersetzt worden, das veränderte Maltosepermeaseund Maltase-Gene enthält. Diese zweite Gen-Ersetzung ergab eine Hefe, die wieder gegen G418 enpfindlich ist. Um Hefezellen auszuwählen, in denen diese zweite Gen-Ersetzung stattgefunden hatte, wurden die Phleomycinr-Tranformanten auf Platten, die G418 (300 µg/ml) enthielten, replikaplattiert. In Zellen, die nicht wuchsen, war das zwischen den SIT4-Gensequenzen eingelagerte G418r-Gen durch die abgeänderten MAL-Gene ersetzt worden, wobei diese zwischen SIT4-Gensequenzen eingelagert waren.
3) Die Phleomycinr/G418sens-Transformanten wurden dann von dem episomalen Plasmid PUT332 geheilt, indem sie über 10 bis 20 Generationen auf einem unselektiven Medium (d.h. ohne Phleomycin) herangezüchtet wurden. Der sich ergebende Transformant ApGb-pRBRR01 ist sowohl gegen Phleomycin wie auch gegen G418 empfindlich und enthält keine prokaryotischen Sequenzen. Alle Integrationsvorgänge wurden auf DNA- Stufe mit Southern Blot-Versuchen überprüft (die Daten sind nicht gezeigt).
Der sich ergebende Stamm kann als Wirt in anschliessenden Transformationen verwendet werden, unter Gebrauch eines anderen Integrations-Locus und/oder - für Hefestämme die diploid oder polyploid sind - auf dem (den) anderen Allel(en) des SIT4-Gens. Stamm A ist aneuploid und diploid für das das SIT4-Gen enthaltende Chromosom. Beide SIT4-Gene vom Stamm A wurden als Zielstelle für Genersatz verwendet. Das ergab schliesslich den Transformanten ApGb-p2RBRR01#1. Der Gebrauch beider Allele für die Integration erhöhte höchstwahrscheinlich auch die genetische Stabilität des Transformanten, da der zweite Integrationsvorgang den Poly morphismus an diesem Locus beseitigte. Solche polymorphen Bereiche sind empfindlich auf Genkonversion, die den Verlust der integrierten Sequenzen bewirken kann. Der auf diese Weise erhaltene Transformant wurde mit Seuthern Blot- Techniken untersucht und zeigt das Hybridisierungsmuster, wie es aus den Genspaltungs-Vorgängen an beiden SIT4-Genen vorhersagbar war.
Der konstruierte Vektor pGb-RB2, der als Ausgangsplasmid für pGb-RBN3 und pGb-RBRR01 diente, hat mehrere nützliche Eigenschaften, die sich aus den folgenden Überlegungen ergeben:
1. Oft muss ein DNA-Segment integriert werden, das konstruiert wird, indem ein Hefepromotor mit einem kodierenden Bereich eines anderen (Hefe-)Gens fusioniert wird. Gen-Ersetzungen werden natürlich nur dann leicht erhalten, wenn die transformierenden Bruchstücke an beiden Seiten Sequenzen haben, die homolog zu der Zielsequenz im Genom sind. Daher muss ein DNA-Segment an das 3'-Ende des kodierenden Bereichs (siehe oben) gehängt werden, das vom selben Gen abgeleitet ist wie die ausgewählten Promotoren. Der Nachteil dieses Verfahrens ist, dass es viele Klonierungs schritte braucht, da nicht immer derselbe Promotor gebraucht wird. Ausserdem wird oft ein starker Promotor gewählt, der von einem Gen abgeleitet wird, das während den interessierenden Zeitabschnitten funktional ist (während des vegetativen Wachstums, der anaeroben Gärung, usw.). Nach der Integration des aufgebauten Bruchstücks wird eine Kopie dieses Gens unfunktional gemacht.
Daher wünschen wir, die Genersetzun an einen Locus zu lenken, der während des vegetativen Wachstums nicht exprimiert wird. Wir habe das SIT4-Gen (sporulation-induzler te transkribierte Sequenz) gewählt, dessen Expression durch Gottlin-Ninja und Kaback (siehe oben) gut untersucht ist, aber natürlich sind andere SIT-Gene oder allgemein nicht kodierende Segmente geeignet. Wenn das interessierende DNA- Konstrukt in dieses SIT4-Gen kloniert wird, dienen die beiden sich ergebenden Hälften als homologe Enden für die Rekombination.
Man könnte der Meinung sein, dass das ohromosomale Gebiet, in dem das Gen sich befindet, während dem vegetativen Wachstum als Ergebnis eines Unterdrückers, der analog zu dem für den HMR-Locus beschriebenen ist (A.H. Brand et al. (1985), Cell 41, 41 bis 48), transkriptionell inaktiv ist. Diese Unterdrücker-DNA unterdrückt auch die durch Promotoren gesteuerte Transkription, wenn diese nicht nicht mit Promotoren von Kreuzungstypen verwandt sind, und kann auf 2600 bp entfernte Promotoren einwirken. Gottlin-Ninfa und Kaback (siehe oben) haben indessen gezeigt, dass das HIS3-Gen während dem vegetativen Wachstum funktionieren kann, wenn es in ein SIT4-Gen integriert wird.
2. Um die Klonierungsschritte zu erleichtern, wird das SIT4-Gen mit einem synthetischen Stück DNA versehen, das mehrere eindeutige Restriktionsstellen enthält (Polylinker mit Klonierungsstellen) Ausserdem enthält der Polylinker auf beiden Seiten Stopcodons für die Translation in allen möglichen Leserastern (siehe Figur 9). Das ist ein Sicherheitsventil, um die Translation jedes möglichen hybriden Transkripts zu stoppen, das über die Verküpfungsstelle hinweg synthetisiert werden könnte. Ein solches hybrides Transkript kann andernfalls für ein Protein kodieren, dessen Effekt unbekannt ist.
3. Um eine nomologe Rekombination zu erreichen, enthält das zu inteorierende DNA-Segment an beiden Enden Restriktionsstellen für NotI und SfiI, die beide Sequenzen von 8 bp erkennen. Die Auftretenshäufigkeit dieser Restriktionsstellen ist sehr niedrig, und daher ist es äusserst unwahrscheinlich, dass ein In den Polylinker im SIT4-Gen zu klonierendes DNA-Segment beide Erkennungsstellen enthält. Daher setzt, sobald das DNA-Segment in das SIT4-Gen des Plasmids pGb-R82 kloniert worden ist, die Restriktion mit Noti oder SfiI ein DNA-Bruchstück frei, das durch Interak tion mit homologen Sequenzen im Genom, d.h. an dem SIT4- Locus, rekombinieren kann. Obwohl die äussersten Enden Teil der NotI- oder SfiI-Stelle und daher nicht homolog sind, haben andere Studien gezeigt, dass - offenbar durch beschränkten Exonuclease-Abbau in der Zelle - diese Sequenzen entfernt werden (z.B. H. Rudolph, J. Koenig-Ranseo and A. Hinnen (1985), Gene 36, 87 bis 95).
4. Als Ausgangsplasmid wird das im Handel erhältliche Plasmid pTZ19r, ein puclg-Abkömmling, verwendet. Dieser Vektor hat den Vorteil, dass er eine hohe Kopienzahl aufweist und dass er ein Replikationsursprung von dem einzelsträngigen Phagen f1 besitzt. Das macht es - nach Infektion mit einem Helferphagen - sehr einfach, einzelsträngige DNA zu isolieren und die DNA-Sequenzen über die Verknüpfungsstellen hinweg mit Hilfe von Primern zu überprüfen. Das erleichtert die genaue Beschreibung der manipulierten DNA beträchtlich.
Es wird geschätzt werden, dass diese Verbesserungen nicht nur auf Backhefe, sondern auch auf andere Hefen angewendet werden können.

Messungen der CO&sub2;-Bildung

a) in einem künstlichen Teia-Medium (Test A)

Die Hefezellen wurden in YEPMS-Medium inkubiert (1% Hefeextrakt; 2%- Bakteriopepton; 3,75% Maltose; 1,25% Saccharose, mit 200 µg/ml G418 versetzt) . Das Wachstum war bei 30ºC bis gegen das Ende der Log-Phase. Die Hefezellen aus 6 ml der Kultur wurden gesammelt und in 8,8 ml des synthetischen Teig-Mediums resuspendiert. zusammensetzung dieses Mediums (pro Liter): Saccharose 4,6 g; Maltose 64,37 g; KH&sub2;PO&sub4; 2,07 g, MgSO&sub4;-Heptahydrat 2,769; (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 0,67 g Casaminosäuren 2,07 g; Citronensäure 4,02 g; Trinatrium Citrat 44,25 g; vitamin B&sub1; 9,2 mg; vitamin B&sub6; 9,2 mg; Nicotinsäure 46 mg; Ca-D(+)-Panthothenat 18,2 mg; Biotin 0,23 µg. Die Suspension wurde für 10 Minuten in einem Wasserbad von 28ºC unter schwachem Rühren äquilibrieren gelassen, worauf die Kolben mit der Hefesuspension über einen Schlauch an eine rigasbürettelt angeschlossen wurden. Diese Bürette wurde mit einer Lösung gefüllt, die pro Liter 20 ml Indikatorlösung (1 g Methylrot, 0,5 g Methylenblau, gelöst in 1 l 96% Ethanol), 40 ml 1 N H&sub2;SO&sub4; und einer Spur CuSO&sub4; (gelöst in HNO&sub3;) enthielt. Das verdrängte Volumen dieser Lösung in der Bürette ist ein Mass für die CO&sub2;-Bildung, die während 165 Minuten gemessen wurde.
In jedem Satz Versuche wurden die erhaltenen Werte für die CO&sub2;-Bildung von Umgebungstemperatur resp. Umgebungsdruck auf standardisierte Bedingungen von 28ºC resp. 10t3 mbar korrigiert. Zusätzlich wurde eine Korrektur für die Menge Hefe gemacht. Die kolorimetrischen Messungen der Kultur bei 600 nm wurden als Korrekturfaktor verwendet, um die Menge Hefe bei jeder CO&sub2;-Messung anzugleichen.

b) im Teig (Test B und BW)

Die CO&sub2;-Gasbildungskurven für auf Melasse in Zulaufkultur herangezüchtete Presshefe wurden in Teig ohne Zukkerzusatz (magerem Teig) (Test B) oder mit 30% Zucker (Test B') bestimmt. Der magere Teig wurde wie folgt zubereitet: 1 g Presshefe (28,5% Trockenmasse enthaltend), 34 ml Salzlösung A (1,25 g NaCl, in 34 ml destilliertem Wasser aufgelöst) und 62,5 g Mehl wurden in einem Hobart-Gerät für 30 Sekunden bei Geschwindigkeit 1 und für 2 Minuten bei Geschwindigkeit 2 gemischt, um einen gut entwickelten Teig zu erhalten.
Der Teig mit 30% Zucker emthielt 2,0 g Presshefe (von 28,5% Trockenmasse), 34 ml Salzlösung B (0,938 g NaCl in 34 ml destilliertem Wasser), 62,5 g Mehl und 18,75 g Saccharose (d.h. 30% Zucker, bezogen auf das Mehl) . Das Mischen geschah wie beim mageren Teig.
Der Teig wurde dann in einen Rundkolben überführt. Mit der Messung der Gasbildung wurde 7,5 Minuten nach der Mischung begonnen, indem die den Teig enthaltenden Kolben über einen Schlauch an eine Gasbürette angeschlossen wurden (siehe Abschnitt a), und es wurde für 165 Minuten bei 28ºC gemessen. In Fällen, in denen der Trockengehalt der Presshefe von dem oben angegebenen Wert abweicht, wurde solche Hefe verwendet, der gemessene Wert des CO&sub2;-Gasbildungsvermögens wurde dann aber korrigiert, indem das CO&sub2;-Gasbildungsvermögen mit dem Verhältnis von Sollwert des Gehalts an Trockenmasse zu tatsächlich gemessenem Wert multipliziert wurde. In jedem Satz Versuche wurden die erhaltenen Werte für die CO&sub2;-Bildung von Umgebungstemperatur resp. - druck auf 28ºC resp. 1013 mbar korrigiert. In einigen Fällen wurden zusätzliche Berechnungen durchgeführt, in denen die erhaltenen Gaswerte um den prozentualen Gehalt an N in der in Zulaufkultur gezüchteten Hefe korrigiert wurden (%N ist ein Hinweis auf den Proteingehalt). Dabei wurden ähnliche prozentuale Verbesserungen wie ohne diese letzte Korrektur gefunden.

c) im Teig (Test C und C')

Die CO&sub2;-Gasbildungskurven von Trockenhefe, wie z.B. nach in US-A-3843800 oder US-A-4341871 beschriebenen Ver fahren hergestellte getrocknete Fertighefe, wurden in Teig ohne Zuckerzusatz (Test C) oder mit 30% Zucker (Test C') bestimmt. Diese Tests wurden auf die selbe Art durchgeführt wie für Test B und B' beschrieben, ausser dass in Test C resp. C' 300 mg Trockenhefe (enthaltend 96% Trocken masse) resp. 600 mg Trockenhefe (enthaltend 96% Trockenmasse) verwendet wurden. Vor dem Test wurde die Hefe mit dem Mehl gemischt und für 10 Minuten bei 28ºC inkubiert.

Enzymatische Analyse

Das Transportvermögen der Hefezellen für Maltose wurde bei 30ºC unter Verwendung von [U-¹&sup4;C]-Maltose als Substrat in einer Konzentration von 15 mM bestimmt. Einzelheiten wurden von R. Serrano veröffentlicht (siehe oben) . Der Gehalt der Maltase (E.C. 3.2.1.20) wurde in zellfrelen Extrakten unter Verwendung von p-Nitrophenyl-α-D-Glucopyranosid als Substrat bestimmt. Die Gehaltsbestimmung wurde gemäss H. Halvorson und E.L. Elias, Biochim. Biophys Acta (1958), 30, 28, durchgeführt.

Substratverbrauch und Produktbildung im flüssigen Medium

Das Verschwinden der Maltose und Glucose aus flüssigen Medien wurde unter Verwendung von üblichen HPLC-Techniken quantifiziert. Ein Liter Medium enthielt: 100 g Malto se, 10 g Glucose, 3,0 g (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 4,0 g MgSO&sub4;-Heptahydrat, 4 g KH&sub2;PO&sub4;, 4 g Casaminosäuren (Difco) 4 g Citronensäure- Monohydrat, 45 g Trinatriumcitrat-Dihydrat, 10 mg Vitamin B&sub1;, 10 mg Vitamin B&sub6;, 40 mg Nicotinsäure, 20 mg Ca-D(+)- Pantothenat und 0,02 mg Biotin. Der pH wurde auf 5,7 ge stellt. Zwei ml Medium wurden einer Suspension der Hefe (20 mg Trockengewicht / 2,0 ml destilliertes Wasser) zugegeben. Diese Mischung, genannt Medium A, wurde bei 28ºC inkubiert. Medium B war wie Medium A, enthielt aber 2omal mehr Glucose. Der Versuch wurde unter anaeroben Bedingungen durchgeführt.

Proteinbestimmung

Das Protein in zellfreien Auszügen und in ganzen Zellen wurde mittels des Mikro-Biuret-Verfahrens von J. Goa, Scand J. Chim. Lab. Invest. (1953), 5, 218, bestimmt. Ovalbumin diente als Standard.

Haltbarkeit

Presshefe wurde für 4 Tagen bei 23ºC in geschlossenen Kunststoffbehältern gelagert. Die Haltbarkeit wird als das nach dieser Zeit verbleibende Gasbildungsvermögen, in Prozent, definiert.

Herstellung der Presshefe

Eine Kultur eines Hefestamms wurde in einer Reihe von Gärbehältern heranoezüchtet. Die Zellen wurden in Laboratoriums-Gärbehältern von 10 Liter Fassungsvermögen in einem Nettovolumen von 6 Litern gezüchtet. Der pH und die Temperatur wurden während der Gärung durch automatische Steuerung bei den gewünschten Werten gehalten. Das Vorgehen bei der Gärung beruht auf Vorschriften, die von G. Butscheck und R. Kautzmann in "Die Hefen", Band II Technologie der Hefen, Seiten 501 bis 591 (1962), Verlag Hans Carl, Nürnberg, BRD, sowie von G. Reed und H.J. Peppler in "Yeast Technology", The AVI Publishing Company Inc., Westport, Connecticut, USA (1973) veröffentlicht wurden. Im Einzelnen waren die Züchtungsbedingungen bei der letzten Gärung:
- Die angewendeten Melassen bestanden zu 80 Gewichtsprozenten aus Rübenmelassen und zu 20 Gewichtsprozenten aus Zuckerrohrmelassen, berechnet auf der Basis von 50% Zucker.
- die benötigte Menge Phosphat wurde in Form von Mono-Ammoniumphosphat, vor der Animpfung, zugegeben.
- die Temperatur stieg während der Gärung gemäss Tabelle 1 von 28ºC auf 30ºC.
- Stickstoff wurde während der Gärung in Form einer 10%igen NH&sub3;-Lösung in Wasser gemäss Tabelle 1 zugegeben.
- Der pH wurde während den ersten 8 Stunden der Gärung bei 5,0 gehalten und stieg dann gemäss Tabelle 1 gegen das Ende der Gärung hin auf 6,2 an.
- Pro kg Melasse, enthaltend 50% vergärbarer Zucker, wurden vor der Animpfung 12 mg Vitamin B&sub1; zugegeben.
Die mit dieser Gärung erhaltene Hefe wurde aufkonzentriert und mit Leitungswasser in einer Laboratoriumszentrifuge mit Spüldüse gewaschen. Die Hefebreie wurden auf einen Gehalt an Trockenmasse von zwischen 26 und 32% gepresst.
Der erhaltene Proteingehalt (%N mal 6,25) schwankte als Folge der unterschiedlichen während der Gärung zugegebenen Ammoniakmengen zwischen 42 und 55%. Tabelle 1 Angewendetes Vorgehen bei der Gärung für die Zulaufkulur-Herstellung von Backhefe

Beispiel 1

CO&sub2;-Bildung von Hefe, die mit 2µ-abgeleiteten, von dem MAL6-Locus stammende Gene enthaltenden Plasmiden transformiert wurde.
Die im Handel erhältlichen Backhefe-Stämme A und C wurden mit pGb-eMAL6g (Maltosepermease und Maltase, siehe Figur 1), pGb-eMAL61 (Maltosepermease, siehe Figur 2) und pGb-eMAL63 (MAL-Regulierer, siehe Figur 3) transformiert. Die MAL-Gene enthalten noch ihre ursprünglichen Promotoren. Die Nomenklatur der transformierten Hefestämme ist wie folgt: ApeG418 bezeichnet den mit peG418 transformierten Stamm A. Andere transformierte Stämme sind in einer ähnlichen Art angegeben worden. Die Auswirkungen dieser Plasmide auf die CO&sub2;-Bildung in einem synthetischen Teigmedium sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Der Wirtsstamm, der mit Ausgangs-peG418 transformiert wurde (siehe Figur 1) dient als Bezugsstamm, da wir gefunden haben, dass die blosse Anwesenheit eines Plasmids in vielen Kopien eine negative Auswirkung auf die Gasbildung hat.
Alle Transformanten zeigen eine grössere Verbesserung In der CO&sub2;-Bildung gegenüber dem Bezugsstamm. Die Kombination von zusätzlichen Kopien sowohl des Maltosepermeasewie des Maltase-Gens gibt die höchste Zunahme, ungefähr 40% in Stamm A und 18% in Stamm C.
Die Transformanten ApGb-eMAL6g und CpGb-eMAL6g wurden auch in Teig ohne Zuckerzusatz getestet. In diesem Fall wurde die Hefe in Zulaufkultur auf Melasse herangezüchtet.
Wiederum wurden grössere Verbesserungen in der CO&sub2;- Bildung erhalten (Tabelle 3). Tabelle 2 Gasbildung des mit 2µ-abgeleiteten Plasmiden transformierten Stamms A und Stamms C, im Vergleich zu den vektor-transformierten Stämmen. Die CO&sub2;-Bildung wurde in einem synthetischen Teig-Medium gemessen (siehe experimentelle Verfahren) und auf 285 mg Trockenmasse korrigiert. Die Daten sind Mittelwerte aus mehreren Versuchen. Tabelle 3 Relative Gasbildung der mit den 2µ-abgeleiteten Plasiden peG418 und pGb-eMAL6g transformierten Stämme A und C in Teig; die CO&sub2;-Bildung wurde auf 285 mg Trockenmasse korrigiert.

Bespiel 2

CO&sub2;-Bildung von Hefestämmen, die mit integrierenden Plasmiden, die rekombinante Maltase und/oder Maltosepermease-Gene enthalten, transformiert wurden.
Der elterliche Hefestamm A ist mit pGb-iA32/G418 (hauptsächliches Merkmal: ADHI/Maltosepermease; siehe Figur 6) und pGb-iRRo1 (hauctsächliches Merkmal: ADHI/Maltosepermease und EF1αA/Maltase, siehe Figur 7) transformiert worden.
Der elterliche Stamm A und beide integrative Transformanten werden in Zulaufkultur auf Melasse herangezüchtet, ähnlich der gewerblichen aeroben Gärung (sieh Tabelle 1). Nach Entnahme der Zellen wird die CO&sub2;-Bildung in einem standardisierten Test mit Teig ohne Zuckerzugabe gemessen. Die Gasbildung, gemessen gemäss diesem Test, ist in Tabelle 4 zusammengefasst. Die Integration von pGb-iA32/G418 in das Chromosom von Stamm A verbessert die Gasbildung im Teig deutlich. Die relative Zunahme schwankt etwas in Abhängigkeit vom Zeitpunkt der Messung (siehe Tabelle 4). Wenn zusätzlich zu einem abgeänderten Maltosepermease-Gen ein abgeändertes Maltase-Gen unter Verwendung von pGb-iRRo1 in das Chromosom vom im Handel erhältlichen Stamm A integriert wird, wird das Gasbildungsvermögen noch weiter verbessert. In diesem typischen Versuch wird in einem mageren Teig nach 165 Minuten ungefähr 30% mehr CO&sub2; gebildet, was einem Wert von ungefähr 410 ml CO&sub2; / 285 mg Trockengewicht Hefe entspricht.
In einem Teig mit 30% Zuckerzusatz wurden keine we sentlichen Unterschiede in der CO&sub2;-Bildung zwischen den Transformanten und dem elterlichen Stamm bemerkt (ungefähr 190 ml CO&sub2; / 285 mg Trockengewicht Hefe).
Die erhaltene Verbesserung in der Säuerungsaktivität bleibt während der Lagerung bei 23ºC erhalten. Der Verlust an Säuerungsaktivität ist für den elterlichen Stamm A und die neuen Stämme nahezu identisch (siehe Tabelle 5). Tabelle 4 Relative Gasbildung des Stamms A und seiner mit abgeänderten Maltase- und/oder Maltosepermease-Gene versehenen RDNA- Abkömmlinge. Die Gaswerte wurden auf 285 mg Trockenmasse korrigiert. Dem Teig wurde kein Zucker zugegeben. Tabelle 5 Lagerfähigkeit des Stamms A und seiner mit abgeänderten Maltase- und/oder Maltosepermease-Genen versehenen RDNA- Abkömmlinge. Die Säuerungsaktivität wurde wie in Tabelle 4 nach Lagerung der Presshefe bei 23ºC für vier Tage gemessen.

Beispiel 3

CO&sub2;-Bildung eines Hefestammes, der rekombinante Maltase- und Maltosepermease-Gene und keine heterologe DNA enthält.
Der elterliche Stamm A wurde genetisch so abgewandelt, dass ein pADHI/Maltosepermease-Gen und ein pEF1αA/- Maltase-Gen in das SIT4-Gen auf beiden homologen Chromosomen eingeführt wurde. Dieser Stamm, abgekürzt ApGb- p2RBRR01#1, ist unter Verwendung der vorher beschriebenen Verfahren und Plasmide konstruiert worden. (siehe die Abschnitte über Transformation und Konstruktion des Plasmids pGb-RBN3 (Figur 10) und pGb-RBRR01 (Figur 11) und das allgemeine Schema der Transformation über Gen-Ersetzung). Der elterliche Stamm A und der homologe Transformant ApGb- P2RBRR01#1 sind in Zulaufkultur auf Melasse ähnlich der ge werblichen aeroben Gärung herangezüchtet worden (siehe Tabelle 1). Nach der Ernte der Zellen wird die CO&sub2;-Bildung in einem Test in einem standardisierten Teig ohne Zuckerzusatz gemessen.
Tabelle 6 fasst die Ergebnisse zusammen. Im "mageren" Teig beträgt die Verbesserung ungefähr 18% nach 165 Minuten, was einem Wert von ungefähr 367 ml CO&sub2; / 285 mg Trokkengewicht Hefe entspricht. Dieser Stamm enthält je zwei Kopien eines unter der Steuerung des ADHI-Promotors stehenden Maltosepermease-Gens und eines unter der Steuerung des EF1αA-Promotors stehenden Maltase-Gens. In Tabelle 4 ist gezeigt, dass der Stamm ApGb-IRROI eine Verbesserung von ungefähr 30% hat. Eine anfängliche Schätzung der Zahl Mole küle von pGb-iRR01, die in einen MAL-Locus des Stamms A integriert sind, gibt eine Kopienanzahl integrierter Plasmidmoleküle von mindestens 3. Durch weitere Erhöhung der Kopienzahl der abgeänderten Maltosepermease- und Maltase-Gene im Stamm ApGb-p2RBRR01#1 (z.B. durch Integration in andere sporulationsspezifische Gene) kann ein homologer transformierter Hefestamm erhalten werden, der mindestens ähnliche Gasbildungwerte aufweist wie Stamm ApGb-iRR01. Tabelle 6 Relative Gasbildung des Stamms A und seines mit abgeänderten Maltase- und Maltosepermease-Gene versehenen homologen rDNA-Abkömmlings. Die Gaswerte wurden auf 285 mg Trockenmasse korrigiert. Dem Teig wurde kein Zucker zugegeben.

Beispiel 4

Enzymaktivitäten und Substrataufnahme-Geschwindigkeiten von Hefestämmen, die mit integrierenden, rekombinante Maltaseund/oder Maltosepermease-Gene enthaltenden Plasmiden transformiert wurden.
Wie oben beschrieben, unterliegt die Expression der Maltosepermease und der Maltase der Maltose-Induktion und der Glucose-Repression. Diese Phänomen ist in Figur 13 für die Wildtyp-Zellen des Stamms A gezeigt. Die spezifischen Aktivitäten der Maltosepermease und Maltase nehmen nicht zu, bis die Glucose zum grössten Teil aufgebraucht worden ist.
Die Aktivität der Maltosepermease beim Einsetzten des Aufgehens des Teigs wird durch die Einführung eines abgewandelten Maltosepermease-Gens in das Hefe-Genom (Stamm ApGb-iA32/G418), wie in rigur 14 gezeigt, erhöht.
Uberraschenderweise wurden die Maltase-Aktivitäten in diesem Konstrukt ebenfalls erhöht (Figur 15). Dieser neue Stamm ApGb-iA32/G418 vergärte Maltose schneller als der eiterliche Stamm A im Medium A, das Maltose als hauptsächliche Kohlenstoff- und Energiequelle enthält (Figur 16). Im Medium B, enthaltend Glucose als hauptsächliche Kohlenstoff- und Energiequelle, war dieser Effekt weniger ausgeprägt (Figur 17).
Zusätzlich zu einem abgeänderten Maltosepermease-Gen wurde ein abgeändertes Maltase-Gen in das Chromosom integriert, was Stamm ApGb-iRRo1 ergajb. Dieser Stamm vergärte Maltose mit einer noch grösseren Geschwindigkeit im Medium A (Figur 16) und auch im Medium B (Figur 17). Trotz der hohen extrazellulären Konzentration an Glucose wurden beträchtliche Mengen Maltose durch diesen neuen Stamm metabolisiert. Der Stamm ApGb-iRRo1 zeigte höhere spezifische Aktivitäten der Maltase und Maltosepermease während dem Aufgehen des Teigs als der elterliche Stamm A und Stamm ApGb- iA32/G418 (Figuren 14 und 15).

Claims

1. Transformierte Hefe, welche bei Gärenlassen in einem Gludde als hauptsächliche Kohlenstoff- und Energiequelle enthaltenden Medium eine erhöhte Kohlendioxid- und Ethanolbildung gegenüber der nicht transformierten Stammhefe ergibt, wenn letztere in besagtem Medium Gludde zu vergären vermag, wobei besagte transformierte Hefe:

Mindestens ein als Transformationsergebnis in ihr vorliegendes DNA-Konstrukt enthält, welches DNA-Konstrukt mindestens ein Gen enthält, das ein Protein kodiert, welches die Aufnahme und/oder den Start der metabolischen Umwandlung eines transoortierten Glucidsubstrates fördert, und wobei das Gen in der transformierten Hefe zur Expression befähigt ist.

2. Hefe gemäss Anspruch 1, in der besagtes Konstrukt mindestens ein Gen enthält, das ein Enzym kodiert, welches Maltosepermease-Aktivität, Maltase-Aktivität, Maltose-Regulierprotein-Aktivität oder irgendeine Kombination derselben aufweist.

3. Hefe gemäss Anspruch 1, in der die Transkription besagter Gene oder deren Kombinationen in einer gegen Glucoserepression unempfindlichen und nicht der Maltoseinduktion unterliegenden Weise gesteuert ist.

4. Hefe gemäss Anspruch 2, in der die Transkription des besagten Genes durch den Promotor der Alkoholdehydrogenase I (ADHI) und/oder des Translationsverlängerungsfaktors (EF1αA) gesteuert ist.

5. Hefe gemäss Anspruch 4, in der besagte Promotoren von einer Hefe der Gattung Saccharomyces, bevorzugt Saccharomyces cerevisiae, abgeleitet sind.

6. Hefe gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5, in der besagtes Konstrukt Bestandteil eines episomalen Elementes ist.

7. Hefe gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, in der besagtes Konstrukt in einem ihrer Chromosome integriert ist.

8. Hefe gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, die mindestens zwei der besagten Konstrukte beinhaltet.

9. Hefe gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, in der das in ihr als Ergebnis der Transformation vorliegende DNA-Konstrukt homolog ist, wobei homolog bedeuten soll, dass die DNA von derselben Hefegattung stammt, zu der die transformierte Hefe gehört.

10. Hefe gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei besagte Hefe frei von heterologer DNA ist, d.h. frei von DNA ist, die von einer anderen Hefegattung stammt als jene, zu der die transformierte Hefe gehört.

11. Transformiert Hefe, welche bei Vergärung in einem Glucide als hauptsächliche Kohlenstoff- und Energiequelle enthaltenden Medium, wenn die Stammhefe bei Vergärung in demselben Medium Maltose zu vergären vermag, eine gegenüber der nicht transformierten Stammhefe höhere Vergärungsgeschwindigkeit von Maltose hervorbringt und besagte transformierte Hefe ein DNA-Konstrukt enthält, das im Wesentlichen frei von prokaryotischer DNA ist und mindestens eines der folgenden Gene enthält: ein Gen, das ein Enzym mit Maltase-Aktivität, Maltosepermease-Aktivität oder Maltose- Regulierprotein-Aktivität kodiert.

12. Hefe gemäss Anspruch 11, in der die Maltase der Transkriptionssteuerung der Genexpression durch einen Promotor des Translationsverlängerungsfaktors (EfF1αA) unterliegt.

13. Hefe gemäss Anspruch 11 oder 12, in der die Maltosepermease der Transkriptionssteuerung der Genexpression durch einen Promotor der Alkoholdehydrogenase I(ADHI) unterheot.

14. Hefe gemäss einem der Ansprüche 11 bis 13, in der besagte Promotoren von einer Hefe der Gattung Saccharomyces abgeleitet sind.

15. Hefe mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 3 bis 8%, die durch Trocknen einer Hefe gemäss einem der Ansprüche 1 bis 14 hergestellt ist.

16. Hefe gemäss Anspruch 15, die zur Gattung Saccharomyces gehört und vorzugsweise Saccharomyces cerevisiae ist.

17. Hefe, die durch andere Stammverbesserungsverfahren als DNA-vermittelte Transformation erhältlich ist, wobei für besagte Stammverbesserungsverfahren Hefe gemäss einem der Ansprüche 1 bis 16 als Ausgangsstamm verwendet wird.

18. Transformierte Hefe gemäss Anspruch 1, wobei besagte transformierte Hefe eines von

Saccharomvces cerevisiae Stamm ApGb-iA32/G418, konstruiert gemäss Beispiel 2,

Saccharomyces cerevisiae Stamm ApGb-iRRo1, konstruiert gemäss Beispiel 2,

Saccharomyces cerevisiae Stamm ApGb-eMAL6g, konstruiert gemäss Beispiel 1,

Saccharomyces cerevisiae Stamm ApGb-eMAL6L, konstruiert gemäss Beispiel 1,

Saccharomyces cerevisiae Stamm ApGb-eMAL63, konstruiert gemäss Beispiel 1,

Saccharomyces cerevisiae Stamm ApGb-eMAL6g, konstruiert gemäss Beispiel 1,

Saccharomvces cerevisiae Stamm CpGb-EMAL61, konstruiert gemäss Beispiel 1,

Saccharomyces cerevisiae Stamm ApGb-p2RBRR01#1, konstruiert gemäss Beispiel 3, ist.

19. Trockene Fertig-Presshefe oder aktive Trockenhefe, die aus einer Hefe gemäss einem der Ansprüche 1 bis 18 erhältlich ist.

20. Presshefe, erhältlich aus einer transformierten Hefe gemäss Anspruch 1, die eine Gasentwicklung von wenigstens 340 ml / 285 mg Hefe-Trockengewicht nach 165 Minuten im Test B gemäss Beschreibung und eine Gasentwicklung von mindestens 170 ml / 285 mg Hefe-Trockengewicht nach 165 Minuten im Test B' gemäss Beschreibung hervorbringt, die bevorzugt eine Gasentwicklung von 380-450 ml / 285 mg Hefe- Trockengewicht nach 165 Minuten im Test B und eine Gasentwicklung von 180-240 ml / 285 mg Hefe-Trockengewicht nach 165 Minuten im Test B' zeigt, die besonders bevorzugt eine Gasentwicklung von mindestens 400 ml / 285 mg Hefe-Trockengewicht nach 165 Minuten im Test B und eine Gasentwicklung von mindestens 190 ml / 285 mg Hefe-Trockengewicht nach 165 Minuten im Test B' zeigt.

21. Presshefe, erhältlich aus einer transformierten Hefe gemäss Anspruch 1, die eine Gasentwicklung von 400 bis 500 ml / 285 mg Hefe-Trockengewicht nach 165 Minuten im Test B gemäss Beschreibung zeigt und bevorzugt eine Gasentwicklung von 440 ml / 285 mg Hefe-Trockengewicht nach 165 Minuten im Test B zeigt.

22. Fertig-Trockenhefe oder aktive Trockenhefe, die durch Trocknen der Presshefe gemäss Anspruch 20 oder 21 erhältlich ist.

23. Trockenhefe, erhältlich aus einer transformierten Hefe gemäss Anspruch 1, die eine Gasentwicklung von 310-360 ml / 285 mg Hefe-Trockengewicht nach 165 Minuten im Test C gemäss Beschreibung und eine Gasentwicklung von 145-195 ml / 285 mg Hefe-Trockengewlcht nach 165 Minuten im Test C' gemäss Beschreibung zeigt, die bevorzugt eine Gasentwicklung von mindestens 330 ml / 285 mg Hefe-Trockengewicht nach 165 Minuten im Test C gemäss Beschreibung und eine Gasentwicklung von mindestens 155 ml / 285 mg Hefe-Trockengewicht nach 165 Minuten im Test C' zeigt, oder die eine Gasentwicklung von 320-400 ml / 285 mg Hefe-Trockengewicht nach 165 Minuten im Test C und bevorzugt eine Gasentwick lung von mindestens 350 ml / 285 mg Hefe-Trockengewicht nach 165 Minuten im Test C zeigt.

24. Vektor, der aus der Gruppe bestehend aus

pGb-eMAL6g,

pGb-eMAL61,

pGb-eMAL63,

pGb-iA32/G418,

pGb-iRRo1,

pGb-M6g(Δ-9)

pGb-RBRR01,

pGb-RBN3 und

pGb-RBREG01,

ausgewählt und nach dem beschreibungsgemässen Verfahren konstruiert ist.

25. Teig oder ähnliche Produkte, die eine Hefe gemäss einem der Anstrüche 1 bis 23 enthalten.

26. Verfahren zur Herstellung hefegesäuerter Mehlprodukte oder alkoholischer Getränke und anderer alkoholischer Produkte, dadurch gekennzeichnet, dass eine Hefe gemäss einem der Ansprüche 1 bis 23 verwendet wird.

27. Verfahren zur Herstellung einer transformierten Hefe, welche bei Vergärung in einem Glucide als hauptsächliche Kohlenstoff- und Energiequelle enthaltenden Medium, wenn die Stammhefe bei Vergärung in demselben Medium Maltose zu vergären vermag, eine gegenüber der nicht transformierten Stammhefe höhere Bildung von Kohlendioxid und Ethanol aufweist; welches Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass in die Stammhefe mindestens ein homologes DNA- Konstrukt eingeführt wird, das mindestens ein Gen enthält, das ein Protein kodiert, das die Aufnahme und/ oder die anfängliche metabolische Umwandlung eines transportierten Substrates fördert; und wobei besagte Einführung eine DNA- vermittelte Transformation oder andere Methoden zur Stammverbesserung umfasst, wobei mit homolog gemeint ist, dass die DNA von einer Hefe derselben Gattung wie die transformierte Hefe selbst stammt.

28. Verfahren gemäss Anspruch 27, wobei das Konstrukt mindestens ein Gen enthält, das ein Enzym mit Maltase-Aktivität, Maltosepermease-Aktivität oder Maltose-Regulierprotein-Aktivität kodiert.

29. Verfahren gemäss Anspruch 28, wobei das Konstrukt mindestens zwei der besagten Gene enthält.

30. Verfahren gemäss Anspruch 28, wobei die Transkription des besagten Genes der Steuerung durch einen Promotor der Alkoholdehydrogenase I(ADHI) und/oder des Translationsverlängerungs faktors (EF1αA) unterworfen wird.

31. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 27 bis 30, wobei die Transkription besagter Gene oder deren Kombinationen einer gegen Glucoserepression unempfindlichen und/oder nicht der Maltoseinduktion unterliegenden Steuerung unterworfen wird.

32. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 27 bis 31, wobei besagtes Konstrukt als Bestandteil eines episomalen Elementes eingeführt wird.

33. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 27 bis 31, wobei besagtes Konstrukt in ein Chromosom der besagten Hefe eingeführt wird.

34. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 28 bis 33, wobei mindestens zwei der besagten DNA-Konstrukte eingeführt werden.

35. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 27 bis 31 oder 33 bis 34, wobei besagte Hefe frei von heterologer DNA, d.h. frei von DNA, die von einer anderen Hefegattung stammt als jene, zu der die transformierte Hefe gehört, erhalten wird und besagte Gene durch Genersatz-Techniken in das Chromosom integriert werden.

36. Verfahren gemäss Anspruch 35, wobei ein für die Sporenbildung spezifisches chromosomales Gen durch ein DNA- Segment mit demselben für die Sporenbildung spezifischen Gen und die in den Ansprüchen 27 oder 33 beschriebenen Gene ersetzt wird.

37. Verfahren gemäss Anspruch 30, wobei besagte Promotoren von einer Hefe der Gattung Saccharomyces abgeleitet werden.

38. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 27 bis 37, wobei Hefe der Gattung Saccharomyces, bevorzugt Saccharomyces cerevisiae, verwendet wird.

39. Verfahren zur Herstellung eines Teiges oder ähnlicher Produkte, dadurch gekennzeichnet, dass Hefe gemäss einem der Ansprüche 27 bis 38 verwendet wird.

40. Verfahren zur Herstellung alkoholischer Getränke und anderer alkoholischer Produkte, dadurch gekennzeichnet, dass Hefe gemäss einem der Ansprüche 27 bis 38 verwendet wird.

41. Verfahren zur Herstellung von Brot oder verwandten Produkten, dadurch gekennzeichnet, dass Hefe gemäss einem der Ansprüche 27 bis 38 verwendet wird.

42. Verfahren zur Herstellung eines Enzyms mit Maltaseoder Maltosepermease-Aktivität, dadurch gekennzeichnet, dass Hefe gemäss einem der Ansprüche 27 bis 38 verwendet wird.