DE3828287A1

DE3828287A1 - Verfahren zur reduktion von methioninsulfoxidresten

Info

Publication number: DE3828287A1
Application number: DE3828287A
Authority: DE
Inventors: Richard Dennis Di Marchi; Harlan Beall Long
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1987-08-24
Filing date: 1988-08-19
Publication date: 1989-03-09
Also published as: US4835254A; NL8802041A; SE503255C2; IT8821716A0; DK465588D0; CN1029976C; BE1004198A3; KR890003798A; CN1031538A; IT1226864B; IL87479A; CA1315482C; SE8802941L; HU200438B; GB2209033B; GB2209033A; GB8819861D0; FR2619820A1; DK465588A; FR2619820B1

Description

Das Sulfoxidoxidationsprodukt von Methionin ist ein Derivat, das in der Natur und auch bei Peptidsynthesen häufig vorkommt. Methioninsulfoxid wird leicht gebildet und ist daher eine übliche Verunreinigung bei den meisten methioninhaltigen Peptiden, die aus natürlichen Quellen isoliert werden.

Gereinigte Peptide sollen am besten nicht unter Bedingungen gelagert werden, die die Bildung eines Sulfoxids bevorzugen. Hierzu wird beispielsweise auf J. Biol. Chem. 129, Seite 481 (1939) (G. Toennis und T.P. Callan) verwiesen. Ist die Aminosäure einmal oxidiert, dann wird sie infolge ihrer erniedrigten Nucleophilität für andere Modifikationen weniger zugänglich. Dieses Verhalten bildet die Basis für ihre Anwendung bei Peptidsynthesen (Helv. Chim. Acta 44, Seite 61 (1961) (B. Iselin) und bei Studien zur Proteinabwandlung (Biochem. 3, Seite 1175) (1964), (A. Tashjian, D. Ontjes und P.L. Munson). Die Oxidationsneigung von gereinigtem Methionin und die zusätzliche Notwendigkeit von dessen reversiblem Schutz für Synthesen hat viele Forscher dazu geführt, Methionin durch andere Aminosäuren zu ersetzen (Biotechnology 4, Seite 565 (1986) (T. Kempe, F. Chow, S.M. Peterson, P. Baker, W. Hays, G. Opperman, J.J. L′Italien, G. Long und B. Paulson), J. Am. Chem. Soc. 108, Seite 1696 (1986) (J.L. Krstenansky, D. Trivedi, D. Johnson und V. Hruby) und Endocrinology 115, Seite 2590 (1984) (D. Schalch, D. Reisman, C. Emler, R. Humbel, C.H. Li, M. Peters und E. Lau).

Eine selektive und nicht destruktive Reduktion methioninsulfoxidhaltiger Peptide ist in der Peptidchemie ein immer wiederkehrendes Problem (Helv. Chim. Acta 49, Seite 1330 (1966) (W. Kessler und B. Iselin). Am häufigsten wird eine Reduktion durch Anwendung hoher Konzentrationen an Reduktionsmitteln, wie Dithiotreit oder β-Mercaptoethanol, bei erhöhten Temperaturen erreicht (Anal. Biochem. 98, Seite 36 (1979) (R.A. Houghten und C.H. Li). Die Reaktionsgeschwindigkeit ist jedoch niedrig, und das Verfahren ergibt gewöhnlich eine unvollständige Reduktion. Eine andere Reduktionsmöglichkeit besteht in einer Förderung des Sauerstoffaustauschs durch Dimethylsulfid oder Thioanisol in wäßriger HCl (Adv. in Enzymology 47, Seite 453 (1977) (W.E. Savige und A. Fontana), J. Biol. Chem. 261, Seite 66 (1986) (Y. Shechter), in wasserfreiem HF (J. Am. Chem. Soc. 105, Seite 6442 (1983) (J.P. Tam, W.F. Heath und R.B. Merrifield), in 1molarer Trifluormethansulfonsäure-TFA (Chem. Pharm. Bull. Jpn 33, Seite 4587 (1985) (N. Fujii, S. Kuno, A. Otaka, S. Funakoshi, K. Takagi und H. Yajami). In diesen Fällen ist die Reduktion leicht, und es läßt sich ein veränderliches Ausmaß an Disulfidintegrität beibehalten. Besonders nachteilig sind dabei allerdings die möglichen Sekundärfolgen eines Arbeitens mit den erforderlichen starken Säuren.

Es ist bereits seit einiger Zeit bekannt, die Sauerstoffübertragung von einem Sulfoxid auf ein Sulfid mittels Halogenwasserstoffsäure als Katalysator vorzunehmen (Acc. Chem. Res. 6, Seite 132 (1973) (G. Scorrano). In Adv. in Enzymology 47, Seite 453 (1977) (W.E. Savige und A. Fontana) wird erstmals die Reduktion von freiem Methioninsulfoxid (nämlich Methioninsulfoxid, das nicht Teil eines Proteins ist) unter Verwendung von 12 n HCl und Dimethylsulfid beschrieben. Weiter wird darin auch die erfolgreiche Anwendung auf ein oxidiertes Lysozymderivat beschrieben, wobei sekundären Nebenreaktionen jedoch nur geringe Beachtung geschenkt wird. Als Schlußfolgerung wird darin festgestellt, daß die Reaktionsbedingungen ziemlich streng sind und eine HCl mit hohen Konzentrationen erfordern. In J. Biol. Chem. 261, Seite 66 (1986) (Y. Shechter) wird über eine ähnliche Reduktion von Methioninsulfoxid in Proteinen unter Verwendung von Dimethylsulfid und unterschiedlichen Konzentrationen an HCl berichtet. Darin wird festgestellt, daß die Umsetzung mit 4,4 bis 10,7molarer HCl vollständig abläuft, während bei niedrigeren Konzentrationen an HCl (nämlich einer 1,0molaren Konzentration hiervon) das Ausmaß der Reduktion ziemlich stark retardiert ist. Bei keiner dieser Studien ist eine Hochleistungsanalyse bezüglich sekundärer Modifikationen durchgeführt worden.

Die Reduktion von Methioninsulfoxid in wasserfreiem HF oder in 1molarer Trifluormethansulfonsäure-TFA dürfte nach einem anderen Mechanismus ablaufen als die Reduktion in wäßriger HCl. Bei diesen starken wasserfreien Säuren dürfte die Reduktion eine Funktion der Acidität des Gemisches sein und nicht von der Nucleophilität des Säureanions abhängen. Es wurde auch bereits über eine wirksame Reduktion unter einem nur minimalen Ausmaß an unerwünschten Modifikationen berichtet. Die hierzu notwendigen kaustischen Lösungsmittel erfordern jedoch spezielle Vorsichtsmaßnahmen bei der Handhabung, so daß einem Arbeitenden damit ernsthafte Grenzen gesetzt sind.

Die Erfindung ist nun auf ein einfaches und hochselektives Verfahren zur Behandlung von Proteinen und Peptiden gerichtet, die Methioninsulfoxidreste enthalten, in dem solche Reste selektiv zu Methioninresten reduziert werden. Bei diesem Verfahren wird die Reduktion unter wesentlich milderen Bedingungen als bei den bekannten Verfahren durchgeführt.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Reduktion von Methioninsulfoxidresten durch Behandlung von Peptiden und Proteinen, die ein oder mehr Methioninsulfoxidreste enthalten, unter Reduktion dieser Reste zu Methioninresten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man solche Peptide oder Proteine mit einem praktisch wasserfreien Trifluoressigsäurereaktionsmedium behandelt, das ein organisches Sulfid in einer etwa 0,01 bis 3molaren Konzentration und eine Halogenwasserstoffsäure, die ausgewählt ist aus Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure und/oder Iodwasserstoffsäure, in einer etwa 0,01 bis etwa 3molaren Konzentration enthält.

Die Erfindung ist, wie bereits oben angegeben, auf ein Verfahren zur selektiven Reduktion von Proteinen und Peptiden, die Methioninsulfoxidreste enthalten, zu den entsprechenden Methioninresten gerichtet. Dieses Verfahren wird hauptsächlich zur Herstellung eines reifen und biologisch wirksamen Produkts aus seinem oxidierten Vorläufer verwendet, welcher sehr häufig infolge von Bedingungen gebildet wird, die bei der synthetischen Erzeugung des Proteins oder Peptids angewandt werden. Bedingungen, die zu einer Oxidation von Methioninresten zur Sulfoxidform führen, können im Verlaufe der verschiedensten Verarbeitungsstufen auftreten, wie beispielsweise einer Synthese und Reinigung des gewünschten Proteins oder Peptids. Ohne ein brauchbares Verfahren, durch das sich der Methioninrest in seinem reduzierten Zustand halten läßt, hätte man ziemliche Probleme, wenigstens bei der Erzeugung großer Mengen an reifem Produkt, um hierdurch vernünftige und brauchbare Mengen des gewünschten Produkts zu erhalten.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird in Trifluoressigsäure als Lösungsmittel durchgeführt. Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens unter praktisch wasserfreien Bedingungen und somit die Anwendung von praktisch wasserfreier Trifluoressigsäure ist hoch bevorzugt, obwohl dies nicht absolut wesentlich ist. Unter einer praktisch wasserfreien Trifluoressigsäure wird jedoch nicht verstanden, daß spezielle Maßnahmen für einen Ausschluß der Anwesenheit von Spurenmengen an Wasser ergriffen werden müssen. Es soll vielmehr lediglich vermieden werden, daß Wasser bewußt hinzukommt. Zur Trifluoressigsäure wird das zu reduzierende Protein oder Peptid zusammen mit einem organischen Sulfid und einer Halogenwasserstoffsäure zugesetzt. Die Reagenzien können in irgend einer Reihenfolge zugegeben werden. Am besten wird das Protein oder Peptid jedoch zuerst in der Trifluoressigsäure gelöst und dann das organische Sulfid und anschließend die Halogenwasserstoffsäure zugesetzt.

Das Protein oder Peptid wird der Trifluoressigsäure im allgemeinen in einer Menge zugesetzt, daß sich eine Konzentration im Bereich von etwa 0,01 bis etwa 100 mg/ml ergibt. Vorzugsweise beträgt die Konzentration an Protein oder Peptid etwa 0,1 bis etwa 20 mg/ml und insbesondere etwa 1 bis etwa 10 mg/ml.

Das Protein oder Peptid wird in der Trifluoressigsäure mit einem organischen Sulfid und einer Halogenwasserstoffsäure umgesetzt. Hierzu können die verschiedensten organischen Sulfide verwendet werden, sofern sie, abgesehen vom reaktionsfähigen Sulfidrest, unter den Bedingungen des erfindungsgemäßen Verfahrens inert sind. Beispiele für geeignete Sulfide sind Dimethylsulfid, Diethylsulfid, Ethylmethylsulfid, Diphenylsulfid, Dithiothrietol, Cystein und dergleichen. Bevorzugte Sulfide sind die Dialkylsulfide, bei denen jede Alkylgruppe 1 bis 3 Kohlenstoffatome enthält. Besonders bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung von Dimethylsulfid durchgeführt.

Das organische Sulfid wird dem Reaktionsgemisch in einer Menge zugesetzt, daß sich eine im allgemeinen etwa 0,01 bis etwa 3molare Konzentration ergibt. Die Konzentration ist vorzugsweise etwa 1,0 bis etwa 1molar und insbesondere etwa 0,5 bis etwa 1molar.

Ein restliches wesentliches Reagens ist eine Halogenwasserstoffsäure. Die Halogenwasserstoffsäure wird ausgewählt aus Chlorwasserstoff, Bromwasserstoff und Iodwasserstoff. Die Halogenwasserstoffsäure ist vorzugsweise Chlorwasserstoff. Die Halogenwasserstoffsäure ist im Reaktionsgemisch im allgemeinen in einer Menge vorhanden, die einer etwa 0,01molaren bis etwa 3molaren Konzentration entspricht. Vorzugsweise ist die Halogenwasserstoffsäure in einer Menge vorhanden, die etwa 0,1molar bis etwa 1molar ist. Innerhalb dieses Bereichs wird das Verfahren am unteren Ende des Konzentrationsbereichs durchgeführt, falls das zu behandelnde Protein oder Peptid ein oder mehr Disulfidbindungen enthält, wobei man am oberen Ende dieses Bereichs arbeitet, falls keine Disulfide vorhanden sind.

Entgegen der obigen Ausführungen, wonach das Verfahren vorzugsweise unter wasserfreien Bedingungen durchgeführt wird, werden in das Reaktionsgemisch durch Zugabe der Halogenwasserstoffsäure normalerweise bestimmte Wassermengen eingeführt. Da die Gesamtmenge an Halogenwasserstoffsäure gering ist und sich diese Menge durch Zugabe von konzentrierter Säure einführen läßt, braucht nur eine geringe Menge des tatsächlich erforderlichen Wassers zum Gemisch gegeben zu werden. Die hierdurch zugesetzte Wassermenge kann beim erfindungsgemäßen Verfahren insgesamt toleriert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann über einen weiten Temperaturbereich durchgeführt werden, der beispielsweise im allgemeinen irgendwo zwischen etwa 4°C und etwa 45°C liegen kann. Vorzugsweise wird die Umsetzung bei etwa Raumtemperatur (etwa 20°C bis etwa 25°C) durchgeführt.

Die Reduktion verläuft normalerweise ziemlich rasch. Die Reaktion kann zwar während einer langen Zeitdauer, beispielsweise etwa 6 Stunden, durchgeführt werden, sie kann jedoch auch innerhalb von nur 5 Minuten zu Ende sein. Gewöhnlich wird die Umsetzung daher über eine Zeitdauer von etwa 30 Minuten bis etwa 90 Minuten durchgeführt.

Nach beendeter Reduktion kann das gewünschte Produkt unter Anwendung irgend einer üblichen Gewinnungstechnik gewonnen werden.

Durch die folgenden Beispiele wird das erfindungsgemäße Verfahren weiter erläutert. Hierdurch soll allerdings der Schutzumfang der Erfindung nicht beschränkt werden.

Beispiel 1 Behandlung von H-Phe-Met(O)-Gly-Pro-Glu-Thr-NH₂ (FM(O)GPET-NH₂)

Das Peptid FM(O)GPET-NH₂ (2,15 mg) wird in 1,72 ml wasserfreier Trifluoressigsäure (TFA) gelöst. Die Peptidlösung wird in 17 Teilmengen von jeweils 80 µl unterteilt. Eine Teilmenge dient als Kontrolle und wird nicht mit Dimethylsulfid (DMS) oder Chlorwasserstoffsäure (HCl) versetzt. Die anderen 16 Peptidlösungen werden mit unterschiedlichen Minuten an DMS von 0,01molaren bis 1molaren Konzentrationen und mit konzentrierter HCl von 0,01 n bis 1 n HCl-Konzentrationen versetzt. Zu Beginn werden die Lösungen kräftig durchmischt, und dann werden sie ohne Durchmischung 60 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Umsetzungen werden durch Zugabe von jeweils 900 µl 0,1%iger wäßriger TFA beendet.

Das Ausmaß an chemischer Modifikation wird durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mittels einer Altex Ultrasphere ODS Umkehrphasensäule (0,46×25 cm) ermittelt. Die Chromatographie wird in 0,1%iger wäßriger TFA bei 45°C unter Elution mit einem zunehmenden linearen Gradienten an CH₃CN durchgeführt. Die quantitative Auswertung erfolgt durch Ausmessen der Peakfläche bei 214 nm. Das mit TFA/DMS/HCl behandelte FM(O)GPET-NH₂ ergibt ein Peptid, das eine identische chromatographische Retentionszeit aufweist wie das als Standard dienende synthetische FMGPET-NH₂. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengefaßt.

Tabelle 1

Reduktion von FM(O)GPET-NH₂

Beispiel 2 Behandlung von GRF(1-45)Met(O)²⁷,Lys⁴⁵-OH

GRF(1-45)Met(O)²⁷,Lys⁴⁵-OH (1,68 mg) wird in 1,5 ml wasserfreier Trifluoressigsäure (TFA) gelöst. Man versetzt 900 µl der Peptidlösung zuerst mit Dimethylsulfid (DMS) und dann mit 10 µl konzentrierter HCl. Die Lösung wird kräftig gerührt und dann ohne Rühren bei Raumtemperatur stehen gelassen. Jeweils 5, 15, 30 und 60 Minuten nach Zugabe der HCl werden aus der Lösung des Reaktionsgemisches Teilmengen von 60 µl entfernt. Jede Probe wird mit N₂ getrocknet und durch Zugabe von 0,1%iger wäßriger TFA auf 1,2 ml verdünnt. Am Ende von 60 Minuten wird die restliche Peptidlösung (760 µl) mit weiterer konzentrierter HCl (7,6 µl) versetzt und die Lösung erneut kräftig durchmischt und dann ohne Rühren bei Raumtemperatur stehen gelassen. Jeweils 65, 75, 90, 120 und 180 Minuten nach der ersten Zugabe von HCl werden Teilmengen von 60 µl entfernt, wobei diese Proben, wie oben beschrieben, jeweils mit N₂ getrocknet und mit 0,1%iger wäßriger TFA verdünnt werden.

Das Ausmaß der chemischen Modifizierung wird durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mittels einer Vydac C₄ Umkehrphasensäule (0,46×10 cm) bestimmt. Die Chromatographie wird in 0,1%iger wäßriger TFA bei 45°C unter Elution mit einem zunehmenden linearen Gradienten an CH₃CN durchgeführt. Die quantitative Bestimmung erfolgt durch Messung der Peakhöhe bei 214 nm. Das mit TFA/DMS/HCl behandelte GRF(1-45)Met(O)²⁷,Lys⁴⁵-OH ergibt ein Peptid, das eine identische chromatographische Retentionszeit entwickelt wie das des als Standard dienenden GRF(1-45)Met²⁷,Lys⁴⁵-OH. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in der folgenden Tabelle 2 zusammengefaßt.

Reduktion von GRF(1-45)Met(O)²⁷,Lys⁴⁵-OH
Zeit (Minuten)
Ausbeute an GRF(1-45)Met²⁷,Lys⁴⁵-OH in Prozent
5
64
15	92
30	98
60	93
65	96
75	97
90	95
120	93
180	88

Beispiel 3 Behandlung von Glucagon Met(O)²⁷

Glucagon Met(O)²⁷ (1,32 mg) wird in 660 µm 1molarem DMS in wasserfreier Trifluoressigsäure (TFA) gelöst. Zur Gewinnung einer unbehandelten Kontrolle wird eine Teilmenge von 300 µl der Lösung entnommen, mit N₂ getrocknet und in 1,2 ml 0,1%iger wäßriger TFA solubilisiert. Die Peptid/TFA/DMS- Lösung wird in 6 Anteile aufgeteilt. Die Lösungen werden mit unterschiedlichen Mengen an konzentrierter HCl und Tryptophan versetzt, und die einzelnen Lösungen werden kräftig durchmischt und dann ohne Rühren 60 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Der Zusatz von Tryptophan dient dazu, um die Zerstörung des inneren Tryptophans von Glucagon in Stellung 25 minimal zu halten. Teilmengen von jeweils 60 µl werden von jeder Lösung entfernt, und die Umsetzungen werden durch rasche Trocknung mit N₂ und Verdünnung mit 1,2 ml 0,1%iger wäßriger TFA beendet. Nach 60 Minuten werden die restlichen Peptidlösungen mit weiterer konzentrierter HCl versetzt. Die Gemische werden kräftig durchmischt und dann ohne Rühren bei Raumtemperatur stehen gelassen. 60 Minuten nach der zweiten Zugabe von HCl werden von jeder Lösung Teilmengen von 60 µl entfernt und in der oben beschriebenen Weise mit N₂ getrocknet und mit 1,2 ml 0,1%iger wäßriger TFA verdünnt. Das Ausmaß der chemischen Modifizierung wird durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit einer C₈-Umkehrphasensäule von DuPont (0,46×25 cm) bestimmt. Die Chromatographie wird in 0,1molarem Ammoniumphosphat vom pH 7 bei 45°C unter Elution mit einem zunehmenden linearen Gradienten an CH₂CN durchgeführt. Die quantitative Auswertung erfolgt durch Ausmessen der Peakfläche bei 214 nm. Das mit TFA/DMS/HCl behandelte Glucagon Met(O)²⁷ ergibt ein Peptid, das eine identische chromatographische Retentionszeit aufweist wie das als Standard dienende synthetische Glucagon. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in der folgenden Tabelle 3 zusammengefaßt.

Tabelle 3

Reduktion von Glucagon Met(O)²⁷

Beispiel 4 Behandlung von IGF-I,Met(O)⁵⁹

IGF-I,Met(O)⁵⁹ (0,90 mg) wird in 0,90 ml wasserfreier Trifluoressigsäure (TFA) gelöst. Die Peptidlösung wird in 8 Teilmengen von jeweils 100 µl aufgeteilt. Die Proben 1, 2, 7 und 8 werden vor der Behandlung mit N₂ getrocknet. Jedes Probenpaar (nämlich 1 und 2, 3 und 4, 5 und 6, 7 und 8) wird in identischer Weise behandelt, wobei die geradzahligen Proben vor der Untersuchung jedoch in das Cysteinyl-S-Sulfonat überführt werden. Die Proben werden mit unterschiedlichen Mengen an wasserfreier TFA, Dimethylsulfid (DMS) und konzentrierter HCl versetzt. Die Lösungen werden kräftig durchmischt und dann ohne Rühren bei Raumtemperatur stehen gelassen. Einige Proben werden 30 Minuten nach der ersten Zugabe von HCl mit weiterer konzentrierter HCl versetzt. Die Reaktionen aller Proben werden nach Ablauf von 30 Minuten oder 60 Minuten durch Verdünnung mit 0,1%iger wäßriger TFA oder durch Sulfitolyse neutralisierter Lösungen beendet.

Das Ausmaß der chemischen Modifizierung wird durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mittels einer C₈-Umkehrphasensäule (Reliance) von DuPont (0,6×4 cm) ermittelt. Die Chromatographie wird in 0,1molarem Ammoniumphosphat vom pH 7 bei 45°C unter Elution mittels eines zunehmenden linearen Gradienten an CH₃CN durchgeführt. Die quantitative Auswertung erfolgt durch Ausmessen der Peakfläche bei 214 nm. Das mit TFA/DMS/HCl behandelte IGF-I,Met(O)⁵⁹ ergibt ein Peptid, das eine identische chromatographische Retentionszeit aufweist wie das als Standard dienende synthetische IGF-I. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in der folgenden Tabelle 4 zusammengefaßt.

Tabelle 4

Reduktion von IGF-I Met(O)⁵⁹

Claims

1. Verfahren zur Reduktion von Methioninsulfoxidresten durch Behandlung von Peptiden und Proteinen, die ein oder mehr Methioninsulfoxidreste enthalten, unter Reduktion dieser Reste zu Methioninresten, dadurch gekennzeichnet, daß man solche Peptide oder Proteine mit einem praktisch wasserfreien Trifluoressigsäurereaktionsmedium behandelt, das ein organisches Sulfid in einer etwa 0,01 bis etwa 3molaren Konzentration und eine Halogenwasserstoffsäure, die ausgewählt ist aus Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure und/oder Iodwasserstoffsäure, in einer etwa 0,01 bis etwa 3molaren Konzentration enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein oder Peptid in einer Konzentration im Bereich von etwa 0,01 bis etwa 100 mg/ml vorhanden ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein oder Peptid in einer Konzentration im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 20 mg/ml vorhanden ist.

4. Verfahren nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das organische Sulfid ein Dialkylsulfid ist, bei dem jede Alkylgruppe 1 bis 3 Kohlenstoffatome enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das organische Sulfid Dimethylsulfid ist.

6. Verfahren nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das organische Sulfid im Reaktionsgemisch in einer etwa 0,1 bis etwa 1molaren Konzentration vorhanden ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das organische Sulfid im Reaktionsgemisch in einer etwa 0,5 bis etwa 1molaren Konzentration vorhanden ist.

8. Verfahren nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Halogenwasserstoffsäure Chlorwasserstoffsäure ist.

9. Verfahren nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Halogenwasserstoffsäure im Reaktionsgemisch in einer etwa 0,1 bis etwa 1molaren Konzentration vorhanden ist.