KR102650195B1 - 유리 메티오닌ｒ설폭사이드를 정량적으로 측정할 수 있는 형광단백질 센서 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유리 메티오닌-R-설폭사이드를 정량적으로 측정할 수 있는 형광단백질 센서 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 Thioredoxin 1 단백질; cpYFP 단백질; 및 fRMsr 단백질이 순차적으로 연결된 유리 메티오닌-R-설폭사이드 검출을 위한 형광바이오 센서용 재조합 단백질, 상기 재조합 단백질을 포함하는 유리 메티오닌-R-설폭사이드 검출을 위한 형광바이오 센서, 검출용 조성물, 유리 메티오닌-R-설폭사이드를 정량분석하는 방법, 산화적 스트레스 관련 질환의 진단을 위한 정보제공방법 및 산화적 스트레스 관련 질환의 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 형광바이오 센서용 재조합 단백질은 형광스펙트럼 분석을 통해 산화적 스트레스에 의해 발생하는 유리 메티오닌-R-설폭사이드를 정량분석할 수 있으므로, 산화적 스트레스 질환의 진단용 형광 바이오센서, 산화적 스트레스 질환 치료제의 스크리닝 방법 및 약물 또는 수술 처치 후 질환의 예후진단을 위한 방법에 모두 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 생체 내 산화 스트레스의 축적을 측정할 수 있는 방법으로, 유리 메티오닌-R-설폭사이드를 정량적으로 측정할 수 있는 형광단백질 센서 및 이의 용도에 관한 것이다.
살아있는 생물은 체내의 대사과정 혹은 외부의 환경 스트레스에 의해 발생하는 활성산소의 위험에 대해 항상 노출되어 있다. 이러한 활성산소의 문제점은 생체 내 거대분자(Macromolecule)들을 손상시킴으로써 병의 발생이나 노화의 촉진을 유발한다. 이러한 거대 분자 중 대표적으로 DNA, 지질, 단백질 등이 활성산소에 의한 직접적인 손상을 받는다.
산화적 스트레스의 대표적인 원인물질 중 하나인 활성산소는 일반적인 세포 활동의 부산물로 여러 세포 소기관의 대사과정 및 효소 반응에서 자연적으로 생성된다. 일반적인 경우 생체는 그에 대응하는 항산화 기작을 가지고 있으며 활성산소의 생성과 균형을 이룬다. 하지만 노화나 질병 등이 발생하게 되면 활성산소의 발생이 급격히 증가하거나 체내의 항산화 기작이 정상적인 기능을 하지 못하여 활성산소에 의한 생체 내 물질의 손상이 축적되는 산화 스트레스가 발생한다. 산화 스트레스에 의해 DNA, 단백질, 지질 등 생체 내 물질이 손상되면 다시 노화나 질병을 악화시키는 결과를 초래하게 된다. 따라서 노화뿐만 아니라 암이나 심혈관계 질환 등 여러 질병의 진단이나 추적에서 체내 활성산소의 수준은 매우 중요한 정보이다.
한편, 생체 내 활성산소의 양을 측정하기 위해 DCFDA, DHE 염색 등 형광 염색약을 이용하는 방법을 포함한 여러 가지 방법들이 고안되었다. 하지만 활성산소는 순간적으로 발생하고 다른 생체 내 거대분자들과 즉각적으로 반응하기 때문에 살아있는 세포를 제외하고 일반적인 생체 샘플에서는 활성산소의 양을 직접적으로 측정하기에 어려움이 있다.
그 대안으로 활성산소에 의해 산화되는 물질에 대한 축적을 측정하는 방법들이 개발되었다. 메티오닌 (Methionine)은 황 원소를 가지는 아미노산으로 활성산소에 의해 쉽게 산화되어 메티오닌 설폭사이드(Methionine sulfoxide)를 형성한다. 이때 메티오닌-R-설폭사이드(Methionine-R-sulfoxide)와 메티오닌-S-설폭사이드 (Methionine-S-sulfoxide)의 2 가지 형태의 입체이성질체가 생성될 수 있다. 생체 내에는 이러한 산화 스트레스에 대응하여 메티오닌 설폭사이드를 다시 메티오닌으로 환원시켜주는 여러 종류의 Msrs (Methionine sulfoxide reductases) 단백질들이 존재한다. 그 중 MsrA는 단백질 내 혹은 유리 상태의 메티오닌-S-설폭사이드를 환원시켜주고, MsrB는 단백질 내의 메티오닌-R-설폭사이드, fRMsr은 유리 상태의 메티오닌-R-설폭사이드를 환원시켜주는 역할을 한다.
하지만, 고등동물에는 생체 내에 유리 메티오닌-R-설폭사이드를 특이적으로 환원시켜주는 fRMsr 효소가 존재하지 않는다. 따라서 MsrA, B에 의해 적절하게 조절되는 다른 종의 메티오닌 설폭사이드와는 다르게 활성산소에 의해 생성된 유리 메티오닌-R-설폭사이드는 체내에 축적되어 생체 내 산화 스트레스의 지표가 될 수 있다. 그러나 HPLC나 GC-MS/MS 등 기존에 알려진 분석기법으로는 생체 수준의 유리 메티오닌-R-설폭사이드만을 특이적으로 정량하는 데 기술적 한계가 있다.
그러므로 생체 내에서 발생하는 산화적 스트레스를 진단할 수 있는 지표로서, 유리 메티오닌-R-설폭사이드만을 특이적으로 검출 및 정량분석할 수 있는 기술의 개발이 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 유리 메티오닌-R-설폭사이드를 생체 수준에서 정량분석할 수 있는 형광단백질 센서를 개발하였고, 이를 이용할 경우, 매우 소량의 유리 메티오닌-R-설폭사이드도 검출할 수 있으며 나아가 산화적 스트레스 질환의 진단 및 약물을 스크리닝 하는 방법에도 적용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 Thioredoxin 1 단백질; cpYFP 단백질; 및 fRMsr 단백질이 순차적으로 연결된, 유리 메티오닌-R-설폭사이드 검출을 위한 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 포함하는, 유리 메티오닌-R-설폭사이드 검출을 위한 형광바이오 센서를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 포함하는, 유리 메티오닌-R-설폭사이드의 정량 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 이용한 생물학적 시료에 함유된 유리 메티오닌-R-설폭사이드를 정량분석하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 이용하여 생물학적 시료 내에 함유된 유리 메티오닌-R-설폭사이드의 정량분석을 통한 산화적 스트레스 관련 질환의 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 이용하여 산화적 스트레스 관련 질환의 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
그러므로 본 발명은 Thioredoxin 1 단백질; cpYFP 단백질; 및 fRMsr 단백질이 순차적으로 연결된, 유리 메티오닌-R-설폭사이드 검출을 위한 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 형광바이오 센서용 재조합 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 thioredoxin 1 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열에서 1~109번째의 아미노산로 이루어진 것이고, 상기 cpYFP 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열에서 116~357번째의 아미노산로 이루어진 것이고, 상기 fRMsr 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열에서 358~522번째의 아미노산로 이루어진 것일 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 서열번호 1의 염기서열에서 thioredoxin 1 단백질을 코딩하는 염기서열은 1~327 번째의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 cpYFP 단백질을 코딩하는 염기서열은 346~1071 번째의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 fRMsr 단백질을 코딩하는 염기서열은1072~1566 번째의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명의 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 포함하는, 유리 메티오닌-R-설폭사이드 검출을 위한 형광바이오 센서를 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 포함하는, 유리 메티오닌-R-설폭사이드의 정량 검출용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은, (1) 생물학적 시료를 준비하는 단계; (2) 상기 시료에 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 처리하는 단계; 및 (3) 상기 형광바이오 센서용 재조합 단백질에 대한 형광스펙트럼 값을 측정하는 단계를 포함하는, 생물학적 시료에 함유된 유리 메티오닌-R-설폭사이드를 정량분석하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 형광스펙트럼 값은 하기 계산식을 통해 NFI(Normalized Fluorescence Intensity) 값으로 계산되어지는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유리 메티오닌-R-설폭사이드의 함량이 많을수록 형광스펙트럼 값의 수치가 높아지는 것일 수 있다.
또한 본 발명은, 시험대상에서 분리된 생물학적 시료에 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 처리한 다음, 형광바이오 센서용 재조합 단백질에 대한 형광스펙트럼 값을 정상 대조군에 대한 형광스펙트럼 값과 비교하는 단계를 포함하며, 상기 형광스펙트럼 값은 상기 계산식으로 계산되는 것을 특징으로 하는, 상기 생물학적 시료 내에 함유된 유리 메티오닌-R-설폭사이드의 정량분석을 통한 산화적 스트레스 관련 질환의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 시료는 세포, 조직, 혈액, 혈장, 혈청, 타액 또는 뇨일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 산화적 스트레스 관련 질환은 암, 뇌졸중, 심근경색증, 협심증, 동맥경화증, 불임, 간염, 골관절염, 급성 관상동맥 증후군, 백내장, 노화, 지질대사질환, 심부전증, 고혈압성 심장질환, 부정맥 및 노화로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
또한 본 발명은, (1) 유리 메티오닌-R-설폭사이드를 포함하는 시료에 산화적 스트레스를 유도하는 단계; (2) 상기 시료에 후보약물을 처리하는 단계; 및 (3) 상기 후보물질이 처리된 시료에 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 처리하고, 형광바이오 센서용 재조합 단백질에 대한 형광스펙트럼 값을 후보약물을 처리하지 않은 대조군에 대한 형광스펙트럼 값과 비교하여 상기 시료 및 대조군에 함유된 유리 메티오닌-R-설폭사이드를 정량분석하는 단계를 포함하며, 상기 형광스펙트럼 값은 상기 계산식으로 계산되는 것을 특징으로 하는, 산화적 스트레스 관련 질환의 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 후보약물을 처리한 형광스펙트럼 값이 대조군의 형광스펙트럼 값에 비해 낮은 경우, 상기 후보약물은 산화적 스트레스 관련 질환의 치료제로 판단하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 산화적 스트레스 관련 질환은 암, 뇌졸중, 심근경색증, 협심증, 동맥경화증, 불임, 간염, 골관절염, 급성 관상동맥 증후군, 백내장, 노화, 지질대사질환, 심부전증, 고혈압성 심장질환, 부정맥 및 노화로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 형광바이오 센서용 재조합 단백질은 산화적 스트레스에 의해 생성된 유리 메티오닌-R-설폭사이드를 특이적으로 정량 검출할 수 있다. 따라서 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질은 형광스펙트럼 분석을 통해 생물학적 시료 내에 함유된 유리 메티오닌-R-설폭사이드의 정량분석이 가능하므로, 산화적 스트레스 질환의 진단을 위한 형광 바이오센서로 사용될 수 있고, 산화적 스트레스 질환 치료제를 스크리닝 방법에도 사용될 수 있으며, 약물 또는 수술 처치 후 질환의 개선 정도를 진단하는 방법에도 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질(TYfR 재조합 단백질)이 산화 또는 환원 시 구조적인 변화를 나타낸 모식도 및 본 발명의 형광바이오센서용 재조합 단백질의 유전자 구성을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 발현시킬 수 있도록 제조한 재조합 발현벡터의 벡터맵을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질에 고농도의 유리 메티오닌 설폭사이드와 GSH (Glutathione)를 각각 처리하여 가장 산화된 상태와 환원된 상태에서의 형광 스펙트럼을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 유리 메티오닌-S-설폭사이드와 유리 메티오닌-R-설폭사이드 농도별로 처리한 후, 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 이용하여 형광 값의 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 도 4의 결과를 토대로 최종적으로 유리 메티오닌-R-설폭사이드를 정량 측정할 수 있는 표준곡선을 나타낸 것이다.
도 6은 HEK293FT 세포주에 1 mM, 2 mM H2O2와 0.4mM, 1mM NaOCl을 포함하는 배지의 처리로 산화 스트레스를 유도한 후, 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 이용하여 유리 메티오닌-R-설폭사이드를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 As2O3 (Arsenic Trioxide)가 처리된 마우스의 혈청에 대하여 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 이용한 유리 메티오닌-R-설폭사이드의 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 골관절염을 DMM 수술로 유도하고 산화 스트레스의 극대화를 위해 셀레늄 결핍 식이요법을 진행한 마우스와 수술 없이 셀레늄 결핍 식이요법을 진행한 마우스의 혈청에 대하여 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 이용한 유리 메티오닌-R-설폭사이드의 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 급성 관상동맥 증후군 환자의 혈청 및 정상인의 혈청에 대하여 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 이용한 유리 메티오닌-R-설폭사이드의 측정 결과를 나타낸 것이고, 또한 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 이용하여 급성 관상동맥 증후군 환자에 대하여 PCI(percutaneous coronary intervention) 혈관 재개통 시술 전 후의 유리 메티오닌-R-설폭사이드의 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 발현시킬 수 있도록 제조한 재조합 발현벡터의 벡터맵을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질에 고농도의 유리 메티오닌 설폭사이드와 GSH (Glutathione)를 각각 처리하여 가장 산화된 상태와 환원된 상태에서의 형광 스펙트럼을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 유리 메티오닌-S-설폭사이드와 유리 메티오닌-R-설폭사이드 농도별로 처리한 후, 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 이용하여 형광 값의 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 도 4의 결과를 토대로 최종적으로 유리 메티오닌-R-설폭사이드를 정량 측정할 수 있는 표준곡선을 나타낸 것이다.
도 6은 HEK293FT 세포주에 1 mM, 2 mM H2O2와 0.4mM, 1mM NaOCl을 포함하는 배지의 처리로 산화 스트레스를 유도한 후, 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 이용하여 유리 메티오닌-R-설폭사이드를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 As2O3 (Arsenic Trioxide)가 처리된 마우스의 혈청에 대하여 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 이용한 유리 메티오닌-R-설폭사이드의 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 골관절염을 DMM 수술로 유도하고 산화 스트레스의 극대화를 위해 셀레늄 결핍 식이요법을 진행한 마우스와 수술 없이 셀레늄 결핍 식이요법을 진행한 마우스의 혈청에 대하여 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 이용한 유리 메티오닌-R-설폭사이드의 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 급성 관상동맥 증후군 환자의 혈청 및 정상인의 혈청에 대하여 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 이용한 유리 메티오닌-R-설폭사이드의 측정 결과를 나타낸 것이고, 또한 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 이용하여 급성 관상동맥 증후군 환자에 대하여 PCI(percutaneous coronary intervention) 혈관 재개통 시술 전 후의 유리 메티오닌-R-설폭사이드의 측정 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 산화 스트레스의 축적에 대한 바이오마커로서 생체 내 유리 메티오닌-R-설폭사이드를 정량적으로 정확하게 신속하게 검출할 수 있는 형광단백질 센서를 제공한다는 점에 특징이 있으며, 구체적으로, 본 발명은 Thioredoxin 1 단백질; cpYFP 단백질; 및 fRMsr 단백질이 순차적으로 연결된, 유리 메티오닌-R-설폭사이드 검출을 위한 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 제공한다는 점에 특징이 있다.
산화 스트레스에 의한 산물인 메티오닌 설폭사이드(Methionine sulfoxide)는 메티오닌-R-설폭사이드(Methionine-R-sulfoxide)와 메티오닌-S-설폭사이드 (Methionine-S-sulfoxide)의 2 가지 형태의 입체이성질체가 존재하며, 유리 상태의 메티오닌-S-설폭사이드 및 메티오닌-S-설폭사이드는 MsrA을 통해 환원이 되고, 메티오닌-R-설폭사이드는 MsrB을 통해 환원이 되지만, 고등동물에서는 유리 상태의 메티오닌-R-설폭사이드를 환원시켜주는 효소가 존재하지 않는다.
또한 종래 성분 분석법인 HPLC나 GC-MS/MS 등의 방법은 입체이성질체를 명확히 분리하는데 어려움이 있고 측정 범위에도 한계가 있다.
이에 본 발명자들은 산화적 스트레스에 의해 발생하는 유리 상태의 메티오닌-R-설폭사이드만을 특이적으로 정량분석할 수 있는 방법을 연구하던 중, Thioredoxin 1 단백질; cpYFP 단백질; 및 fRMsr 단백질이 순차적으로 연결된, 유리 메티오닌-R-설폭사이드 검출을 위한 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 이용할 경우, 유리 상태의 메티오닌-R-설폭사이드를 형광스펙트럼 분석을 통해 정량측정 할 수 있음을 확인하였다.
이에 본 발명에서는 유리 상태의 메티오닌-R-설폭사이드의 정량 분석을 위해 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 제조하였는데, Thioredoxin 1 단백질; cpYFP(circularly permuted yellow fluorescence protein) 단백질; 및 fRMsr(free methionine-R-sulfoxide reductase) 단백질이 순차적으로 융합된 재조합 단백질을 제조하였다.
본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질의 원리를 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질 구조에서, cpYFP는 구조변화에 따라 형광 값이 바뀌도록 조작된 형광단백질로 형광바이오 센서용 재조합 단백질(TYfR 재조합 단백질)의 중앙에 위치하며 양 옆에 35번 시스테인을 세린으로 치환시킨 Trx1(Thioredoxin 1) 단백질과 fRMsr이 위치한다. 일반적으로 fRMsr은 유리 메티오닌-R-설폭사이드를 특이적으로 환원시켜 메티오닌으로 돌려주며 스스로 산화되고 산화된 fRMsr은 다시 Trx1 단백질에 의해 환원되어 재생된다. 이때, fRMsr과 Trx1 단백질 사이에 분자 간 이황화 결합이 형성되고 Trx1 단백질의 35번 시스테인에 의해 이 분자 간 이황화 결합이 Trx1 단백질의 분자 내 이황화 결합으로 치환되며 반응이 진행된다. 이에 본 발명에서는 Trx1 단백질의 35번 시스테인이 세린으로 치환된 Trx1을 사용하였고 이로 인해 fRMsr과 Trx1 단백질의 분자 간 이황화 결합을 유지하도록 구성하여 이 결합에 의해 두 단백질 사이의 거리가 가까워짐에 따라 cpYFP의 형광 값이 변화하여 유리 메티오닌-R-설폭사이드를 정량할 수 있도록 하였다.
그러므로 본 발명은 Thioredoxin 1 단백질; cpYFP 단백질; 및 fRMsr 단백질이 순차적으로 연결된, 유리 메티오닌-R-설폭사이드 검출을 위한 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 제공할 수 있다.
바람직하게 상기 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 서열번호 2의 아미노산 서열에서 상기 Thioredoxin 1 단백질은 1~109번째의 아미노산로 이루어진 것이고, 상기 cpYFP 단백질은 116~357번째의 아미노산로 이루어진 것이고, 상기 fRMsr 단백질은 358~522번째의 아미노산로 이루어진 것일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공할 수 있으며, 바람직하게 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
서열번호 1의 염기서열에서 Thioredoxin 1 단백질을 코딩하는 염기서열은 1~327번째의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 cpYFP 단백질을 코딩하는 염기서열은 346~1071번째의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 fRMsr 단백질을 코딩하는 염기서열은 1072~1566번째의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 발현벡터를 제공할 수 있으며, 본 발명에서 상기 ‘발현벡터’는 본 발명의 재조합 단백질을 발현시키는 형질전환체를 만들기 위하여 숙주세포에 DNA를 도입하여 재조합 단백질을 발현시키기 위한 수단으로서, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 등이 사용될 수 있다. 바람직하게는 플라스미드 벡터를 사용할 수 있다. 본 발명의 목적상 발현벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인헨서 같은 발현조절 엘리먼트를 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 서열번호 1의 재조합 폴리뉴클레오티드 서열을 pET-32a 벡터로 삽입하여 재조합 발현벡터인 “pTYfR-pET-32a” 벡터를 제조하였다.
상기 본 발명의 발현벡터는 본 발명의 재조합 단백질을 발현할 수 있는 숙주세포, 예컨대 대장균(E.coli) 세포에 도입한 후, 대장균(E.coli) 등의 숙주세포에서 상기 단백질을 대량으로 발현시킬 수 있고, 발현된 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질은 당업계에 공지된 단백질 정제 방법을 통해 정제할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 His-tag을 이용한 컬럼크로마토그래피를 통해 본 발명의 재조합 단백질을 제조하였다.
본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질은 앞서 기술한 원리에 의해 산화적 스트레스의 마커인, 유리 메티오닌-R-설폭사이드를 정량적으로 측정할 수 있는 바, 본 발명은 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 포함하는, 유리 메티오닌-R-설폭사이드 검출을 위한 형광바이오 센서를 제공할 수 있다.
본 발명의 형광바이오 센서는 재조합 단백질을 이용하여 다른 생물학적 활성에는 영향을 주지 않으면서 시료 내에 함유된 유리 메티오닌-R-설폭사이드만을 특이적으로 검출할 수 있으며, 이때 상기 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질은 액체 상태의 단백질을 형광측정용 기판에 분주한 후, 시료를 처리하여 분석을 수행할 수 있다.
또한 본 발명은 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 포함하는, 유리 메티오닌-R-설폭사이드의 정량 검출용 조성물을 제공할 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 이용하여 유리 메티오닌-R-설폭사이드를 정량분석하는 방법을 제공할 수 있는데, 상기 방법은 바람직하게, (1) 생물학적 시료를 준비하는 단계; (2) 상기 시료에 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 처리하는 단계; 및 (3) 상기 형광바이오 센서용 재조합 단백질에 대한 형광스펙트럼 값을 측정하는 단계를 포함한다.
특히 본 발명은 유리 메티오닌-R-설폭사이드만을 특이적으로 정량 측정할 수 있는 기술로서, 본 발명의 일실시예에서는 유리 메티오닌-R-설폭사이드 및 유리 메티오닌-S-설폭사이드를 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질과 반응 시킨 후, 형광 값의 변화를 측정하였는데, 유리 메티오닌-S-설폭사이드의 경우에는 변화가 없는 것으로 나타난 반면, 유리 메티오닌-R-설폭사이드의 경우에만 형광 값의 변화를 보이는 것으로 나타나, 유리 메티오닌-R-설폭사이드 특이적으로 검출이 가능하다는 것을 실험을 통해 확인하였다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 생물학적 시료로서 HEK 293FT 세포에 산화적 스트레스 유발인자로서 H2O2 및 NaOCl을 각각 농도별로 처리한 후, 세포 용해물을 수득한 후, 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 처리하여 산화적 스트레스에 의해 발생한 유리 메티오닌-R-설폭사이드의 양을 측정하였다. 이때 대조군으로는 산화적 스트레스를 유발하지 않은 대조군을 사용하였다.
그 결과, 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 이용하여 산화적 스트레스가 유도됨에 따라 유리 메티오닌-R-설폭사이드가 증가됨을 확인하였다.
따라서 이를 통해 본 발명자들은 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 이용하여 유리 메티오닌-R-설폭사이드를 특이적으로 정량분석 할 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 본 발명에서 상기 형광스펙트럼 값의 측정은 하기 계산식을 통해 NFI(Normalized Fluorescence Intensity) 값으로 계산될 수 있는데, 시료 내 유리 메티오닌-R-설폭사이드의 양이 많을수록, 즉 산화적 스트레스 정도가 높을수록 하기 계산식을 통해 산출된 값도 높아진다.
본 발명의 일실시예에서는 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 이용하여 형광측정을 통해 유리 메티오닌-R-설폭사이드를 정량 측정할 수 있는 최적의 조건으로, 상기 계산식을 통해 형광스펙트럼 값을 계산할 수 있음을 확인하였다.
나아가 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질은 산화적 스트레스 관련 질환의 진단에도 사용될 수 있는 특징이 있다.
활성산소와 같은 산화적 스트레스는 다양한 질병의 원인이 되고 있다. 따라서 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질은 산화 스트레스에 의해 발생하는 마커인 유리 메티오닌-R-설폭사이드를 측정할 수 있으므로, 산화적 스트레스 관련 질환의 증상정도, 약물처리 또는 수술 후 예후의 진단, 및 치료제를 스크리닝 하는 방법 등에 유용하게 사용할 수 있다.
따라서 본 발명은 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 이용한 산화적 스트레스 관련 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공할 수 있으며, 상기 방법은, 시험대상에서 분리된 생물학적 시료에 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 처리한 다음, 형광바이오 센서용 재조합 단백질에 대한 형광스펙트럼 값을 대조군에 대한 형광스펙트럼 값과 비교하는 단계를 포함하며, 상기 형광스펙트럼 값은 상기 계산식을 통해 산출된다.
이때 상기 형광스펙트럼 값이 대조군의 값에 비해 높은 경우, 산화적 스트레스에 의해 유리 메티오닌-R-설폭사이드가 증가되어 있음을 의미하는 것으로 산화적 스트레스 질환이 악화된 것으로 판단할 수 있고, 반면 상기 형광스펙트럼 값이 대조군의 값에 비해 낮은 경우, 산화적 스트레스가 개선되어 질환이 개선 또는 치료되고 있다고 판단할 수 있다.
상기 시료는 세포, 조직, 혈액, 혈장, 혈청, 타액 또는 뇨일 수 있다.
상기 산화적 스트레스 관련 질환은 이에 제한되지는 않으나, 암, 뇌졸중, 심근경색증, 협심증, 동맥경화증, 불임, 간염, 골관절염, 급성 관상동맥 증후군, 백내장, 노화, 지질대사질환, 심부전증, 고혈압성 심장질환, 부정맥 및 노화로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 이용하여 산화적 스트레스 관련 질환의 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공할 수 있는데, 상기 방법은, (1) 유리 메티오닌-R-설폭사이드를 포함하는 시료에 산화적 스트레스를 유도하는 단계; (2) 상기 시료에 후보약물을 처리하는 단계; 및 (3) 상기 후보물질이 처리된 시료에 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 처리하고, 형광바이오 센서용 재조합 단백질에 대한 형광스펙트럼 값을 후보약물을 처리하지 않은 대조군에 대한 형광스펙트럼 값과 비교하는 단계를 포함하며, 상기 형광스펙트럼 값은 상기 계산식으로 계산된다.
이때 상기 후보약물을 처리한 형광스펙트럼 값이 대조군의 형광스펙트럼 값에 비해 낮은 경우, 상기 후보약물은 산화적 스트레스 관련 질환의 치료제로 판단할 수 있다. 이는 후보약물의 처리로 인해 대조군보다 산화 스트레스 마커인 유리 메티오닌-R-설폭사이드의 양이 감소었다는 것을 의미하므로 상기 후보물질이 산화적 스트레스의 증상을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 활성이 있다고 판단할 수 있다.
이를 확인하기 위해 본 발명의 일실시예에서는 산화 스트레스 축적으로 발생되는 질환 중 하나인 골관절염 유발시키기 위해 마우스에 DMM(destabilization of the medial meniscus) 수술을 진행하였고, 산화 스트레스를 더욱 극대화하기 위해 하고 셀레늄 결핍 식이요법을 수행하였다. 대조군으로는 수술을 진행하지 않은 채 셀레늄 결핍 식이요법을 수행한 마우스를 사용하였다. 이들 각 마우스로부터 혈청을 분리한 후, 상기 혈청으로부터 대사체를 추출하고 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 처리한 다음, 형광스펙트럼 값을 측정하였다.
그 결과, DMM 수술로 골관절염을 유도한 마우스의 경우, 대조군에 비해 더 높은 형광스펙트럼 값을 나타내었다. 이는 수술에 의한 산화 스트레스의 극대화에 따라 유리 메티오닌-R-설폭사이드의 생성이 더 증가되어 있음을 의미한다.
본 발명의 또 다른 일실시예에서는, 산화 스트레스 축적으로 발생되는 급성 관상동맥 증후군(Acute Coronary Syndrome) 환자의 혈청과 정상인의 혈청을 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 처리하여 형광스펙트럼 값을 측정한 결과, 정상군에 비해 환자군에서 더 높은 형광스펙트럼 값을 나타내었다.
또한, 급성 관상동맥 증후군(Acute Coronary Syndrome) 환자에 대하여 산화 스트레스가 더욱 급격히 증가하는 것으로 알려진 PCI(percutaneous coronary intervention)에 의한 혈관 재개통 시술 전 후에 혈청을 각각 수득하고 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 처리하여 형광스펙트럼 값을 측정한 결과, PCI 시술 처리 후의 군이 처리 전의 군에 비해 더 높은 형광스펙트럼 값을 나타내었다.
따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 이용할 경우, 생체 내에서 발생하는 산화 스트레스 마커인 유리 메티오닌-R-설폭사이드를 쉽고 정확하게 정량적으로 측정할 수 있어, 산화적 스트레스 질환에 대한 증상 또는 예후를 분석 및 진단할 수 있음을 알 수 있었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
유리 메티오닌-R-설폭사이드를 정량적으로 측정할 수 있는 형광단백질 센서용 재조합 DNA 구조물의 제조
<1-1> 유리 메티오닌-R-설폭사이드 검출을 위한
형광단백질 센서용 재조합 DNA 구조물의 제조
본 발명자들은 생체 내 시료에 존재하는 유리 메티오닌-R-설폭사이드를 정량적으로 측정할 수 있는 형광단백질 센서용 재조합 DNA 구조물의 제조를 위해 다음과 같은 방법으로 클로닝을 수행하였다.
먼저, 대장균 유래 cpYFP 단백질을 코딩하는 염기서열 및 fRMsr단백질을 코딩하는 염기서열을 Overlap extension PCR을 통해 cpYFP와 fRMsr이 연결된 DNA 단편을 제조하였다. 이후 상기 DNA 단편을 pET-32a 벡터에 클로닝하였는데, 이때 pET-32a 벡터는 삽입된 유전자가 발현될 때 단백질의 N-말단에 Trx1(Thioredoxin 1)이 함께 발현되도록 구성된 벡터이다. 본 발명자들은 상기 pET-32a 벡터에 삽입되어 있는 되어 있는 Trx1 서열에서 35번째 시스테인이 세린으로 치환되도록 site-directed mutagenesis를 수행하였고, 이 과정을 수행한 pET-32a 벡터에 최종적으로 cpYFP와 fRMsr이 연결된 DNA 단편을 클로닝하여, Trx1, cpYFP 및 fRMsr에 대한 DNA 서열이 순차적으로 연결된 재조합 발현벡터(pTYfR-pET-32a 벡터)를 제조하였다(도 2 참조). 이때 상기 pET-32a 벡터 C-말단에 His-tag이 함께 발현되므로 추후에 His-tag과 Nickel의 affinity를 통해 Trx1, cpYFP 및 fRMsr이 연결된 융합 단백질을 정제할 수 있다.
<1-2> 유리 메티오닌-R-설폭사이드를 정량적으로 측정할 수 있는 형광 바이오 센서용 재조합 단백질의 정제
상기 <1-1>에서 제조된 “pTYfR-pET-32a” 발현벡터를 이용하여 생체 내 산화 스트레스 정도를 측정할 수 있는 유리 메티오닌-R-설폭사이드 측정을 위한 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 다음과 같은 방법을 통해 정제하였다.
상기 pTYfR-pET-32a 벡터 플라스미드를 Rosetta (DE3) E.coli에 형질전환 시키고, OD600이 0.6~0.8이 될 때까지 배양한 후 500 μM IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 처리하여 18 ℃에서 18 시간 동안 배양하면서 본 발명의 형광바이오 센서용 재조합 단백질[일명, TYfR 재조합 단백질(Trx1, cpYFP 및 fRMsr의 융합단백질)이라고 함]이 과발현 되도록 하였다. 이후 세포의 용해물을 수득하였고, 세포 용해물을 FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) 시스템을 이용한 Ni-NTA 친화적 크로마토그래피를 통해 정제하여 순도가 높은 본 발명의 유리 메티오닌-R-설폭사이드 검출용 TYfR 재조합 단백질을 대량 정제하였다.
<실시예 2>
본 발명의 유리 메티오닌-R-설폭사이드 검출용 TYfR 재조합 단백질의 작동확인 및 형광특성 분석
상기 실시예 1에서 정제된 유리 메티오닌-R-설폭사이드 검출용 TYfR 재조합 단백질의 작동을 검증하기 위해 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 형광 스펙트럼을 분석하였다. 분석 전 TYfR 재조합 단백질을 완전히 환원시켜주기 위해 50 mM의 DTT (dithiothreitol)을 첨가하고 상온에서 30분 반응시킨 후 탈염 컬럼(Desalting column)을 이용하여 완전히 환원된 단백질만을 확보하였다. 그 후 TYfR 재조합 단백질을 약 15 μM 까지 희석한 후 96-well black plate에 190 μL 씩 분주하고, 기질을 10 μL 씩 추가하여 최종 200 μL가 되도록 하였다. 각 기질은 3번 반복하여 측정하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
분석 결과, TYfR 재조합 단백질에 고농도의 유리 메티오닌 설폭사이드와 GSH (Glutathione)를 처리하여 가장 산화된 상태와 환원된 상태에서의 형광 스펙트럼을 비교하였는데, 그 결과 430 nm와 500 nm에서 Excotation peak가 나타났으며 535 nm에서 Emition peak가 나타났다. 특히 430 nm에서의 extation peak는 TYfR 재조합 단백질의 산화/환원 상태와 관계없이 유사하게 나타났으나, 500 nm에서는 차이가 극대화되는 것을 확인하였다. 이를 이용하여 추후 생체 샘플의 분석에 있어 Emission 파장은 535 nm로 고정하고, Excitation 500 nm 에서의 형광 값을 430 nm 에서의 형광 값으로 나누어 보정한 값(NFI, Normalized Fluorescence Intensity)을 사용하였고, NFI 계산식은 다음과 같다.
<실시예 3>
본 발명의 유리 메티오닌-R-설폭사이드 검출용 TYfR 재조합 단백질의 기질특이성 확인
본 발명에 따른 TYfR 재조합 단백질에 대한 기질특이성을 확인하기 위하여 유리 메티오닌-S-설폭사이드와 유리 메티오닌-R-설폭사이드를 분리하고 다양한 농도로 처리하여 형광 값의 변화를 측정하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 유리 메티오닌-S-설폭사이드에 대해서는 농도 변화에 따른 NFI의 차이가 거의 없는 반면, 유리 메티오닌-R-설폭사이드에 대해서는 농도에 따라 확연히 증가하는 양상을 보였다. 유리 메티오닌-S-설폭사이드와 유리 메티오닌-R-설폭사이드는 O원자의 입체구조만 다른 매우 유사한 물질이기 때문에 fRMYT 재조합 단백질이 유리 메티오닌-R-설폭사이드에 대해 매우 특이적으로 작동한다는 것을 확인할 수 있었다.
이에 본 발명자들은 이러한 결과를 바탕으로 최종적으로 유리 메티오닌-S-설폭사이드(fMetRO)를 정량할 수 있는 표준곡선을 작성하였다(도 5). 작성된 표준곡선은 R-squared 값이 0.9952로 신뢰도가 매우 높으며 나노 몰 (nM) 단위의 유리 메티오닌-R-설폭사이드까지 정량할 수 있는 것으로 나타났다.
따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에 따른 TYfR 재조합 단백질이 생체 내 존재하는 나노 몰 수준의 미량의 유리 메티오닌-R-설폭사이드를 특이적으로 정량 측정할 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 4>
HEK293FT 세포 용해물을 통한 산화 스트레스 축적 검출능 분석
HEK293FT 세포 (mammalian cell)을 DMEM 배양액에 하루 동안 배양한 후 산화 스트레스를 유도하기 위하여 1 mM, 2 mM H2O2와 0.4mM, 1mM NaOCl을 포함한 배양액으로 교체한 후, 배양하였다. 18시간 후 수확한 각 세포의 용해물을 PCA (Perchloric Acid) kit를 이용해 탈단백질화 시킨 후 대사체만을 본 발명의 TYfR 재조합 단백질과 반응시켜 결과를 확인하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, NFI를 전체 단백질 양으로 보정하여 나타낸 결과, 산화 스트레스가 유도됨에 따라 유리 메티오닌-R-설폭사이드의 증가가 검출되는 것으로 나타났다.
<실시예 5>
산화적 스트레스가 유도된 마우스 혈청시료에서 본 발명의 TYfR 재조합 단백질을 이용한 유리 메티오닌-R-설폭사이드의 검출능 분석
생체 내에서 활성산소를 유도하는 물질인 As2O3 (Arsenic Trioxide)을 중탕하여 PBS에 녹인 후, As2O3 5 μg/g 씩 7주령의 C57BL/6N 마우스에 복강 주사한 다음, 3, 6, 12시간 후 심장 채혈을 통해 혈액을 채취하였다. 이후 상기 혈액 500 μL을 채취하고 혈청 분리 튜브에 옮겨 30분 동안 상온 보관 후 4 ℃에서 3500 rpm으로 15 분 동안 원심분리하였고, 분리된 상층액(혈청)은 장기 보관 시 -80 ℃에 보관 후 대사체 추출 시 얼음 내에서 해동하여 사용하거나, 즉시 대사체를 추출할 경우 얼음에 보관하였다. 혈액으로부터 대사체 추출을 위한 용매로는 얼음 내에 보관된 8 : 1 부피 비율의 고순도의 메탄올과 물이 혼합된 추출 용매를 이용하였다. 100 μL의 혈청에 800 μL의 추출 용매를 처리한 후 1 분 동안 교반한 다음, 30 분 동안 얼음에 방치하면서 5분 간격으로 흔들어 주었다. 30 분 후 4 ℃에서 10,000 rpm으로 10 분 동안 원심분리하고 상층액 200 μL를 새로운 튜브에 옮겼다. 동결건조를 통해 용매를 휘발시킨 후 상온에 보관하고, 분석 직전에 PBS 50 μL에 녹여 10 μL 씩 3번 반복하여 본 발명의 TYfR 재조합 단백질과 반응시켰다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, As2O3를 처리하지 않은 대조군에 비해 As2O3를 처리한 군의 경우, 시간이 지남에 따라 유도된 활성산소에 의한 산화 스트레스의 축적이 유리 메티오닌-R-설폭사이드의 증가로 확실하게 확인되는 것으로 나타났다.
따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 TYfR 재조합 단백질을 이용할 경우, 생체 내 시료에서 유리 메티오닌-R-설폭사이드를 정량적으로 검출할 수 있어 산화 스트레스 축적 정도를 확인할 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 6>
골관절염이 유도된 마우스 혈청에서 본 발명의 TYfR 재조합 단백질을 이용한 유리 메티오닌-R-설폭사이드의 검출을 통한 산화 스트레스 축적 분석
골관절염은 노화로 인한 산화 스트레스 축적에 의해 발생하는 대표적인 질병 중 하나이며, 산화 스트레스가 심화될 경우, 질병이 악화되는 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 본 발명의 TYfR 재조합 단백질을 이용할 경우, 유리 메티오닌-R-설폭사이드의 측정을 통해 골관절염에 의한 산화적 스트레스 축적 정도를 확인할 수 있는지를 다음과 같은 실험을 통해 분석하였다.
먼저, 골관절염을 유도하기 위하여 12주령의 C57BL/6N 마우스에 DMM(destabilization of the medial meniscus) 수술을 진행하고 산화 스트레스를 극대화하기 위하여 6주 동안 셀레늄 결핍 식이요법을 진행하였다. 이후 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 혈청으로부터 대사체(분석시료)를 추출하고 본 발명의 TYfR 재조합 단백질을 처리하여 형광스펙트럼을 분석하였다.
그 결과, 대조군 (비수술, 셀레늄 결핍 식이요법 진행) 마우스 대비 DMM 수술로 골관절염을 유도한 마우스의 혈청에서 더 높은 NFI(normalized fluorescence intensity)를 나타내는 것을 확인하였다(도 8 참조).
<실시예 7>
급성 관상동맥 증후군 환자의 혈청에서 본 발명의 TYfR 재조합 단백질을 이용한 유리 메티오닌-R-설폭사이드의 검출을 통한 산화 스트레스 축적 분석
나아가 본 발명자들은 또 다른 산화적 스트레스 질환 중 하나인 급성 관상동맥 증후군(Acute Coronary Syndrome; ACS) 환자에서의 산화 스트레스 축적 정도를 본 발명의 TYfR 재조합 단백질을 이용하여 분석할 수 있는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
급성 관상동맥 증후군 환자의 경우 일반인과 비교하여 산화 스트레스가 높게 나타나며, PCI(percutaneous coronary intervention)에 의한 혈관 재개통 시 시술 후 급격한 산소 공급으로 인해 산화 스트레스가 더욱 급격히 증가한다는 것이 알려져 있다. 먼저 상기 실시예 5의 방법을 이용하여 급성 관상동맥 증후군 환자와 대조군(흉통 등의 증상이 있어 내원하였으나 정상 동맥을 가진 사람)의 혈장에서 대사체를 추출한 후, 본 발명의 TYfR 재조합 단백질을 이용하여 상기 혈청 내 유리 메티오닌-R-설폭사이드를 정량측정하였다.
그 결과, 대조군에 비하여 급성 관상동맥 증후군 환자에서 유리 메티오닌-R-설폭사이드 함량이 높게 측정되었으며, ACS 환자의 경우 동일 환자에서 PCI 시술 전보다 후에 유리 메티오닌-R-설폭사이드가 확연히 증가한 것으로 나타났다(도 9).
이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 TYfR 재조합 단백질이 생체 내 시료에서의 유리 메티오닌-R-설폭사이드를 특이적으로 정량분석할 수 있는 형광바이오 센서용으로 사용 가능함을 확인하였고, 또한 본 발명의 TYfR 재조합 단백질은 산화적 스트레스 관련 질환의 진단에도 활용될 수 있으며, 산화 스트레스를 유발할 수 있는 시술 후, 예후를 확인하기 위한 용도로도 사용 가능함을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Korea University
<120> Fluorescent protein sensor capable of quantitatively measuring
the degree of free methionine-R-sulfoxide and use thereof
<130> NPDC88755
<160> 2
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1566
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Polynucleotide encoding recombinant protein for fluorescent
biosensor
<400> 1
atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60
gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtccaa aatgatcgcc 120
ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180
atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240
ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300
aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccacaacgt ctatatcatg 360
gccgacaagc agaagaacgg catcaaggcc aacttcaaga tccgccacaa cgtcgaggac 420
ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg 480
ctgctgcccg acaaccacta cctgagcttc cagtccgtcc tgagcaaaga ccccaacgag 540
aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg 600
gacgagctgt acaacgtgga tggcggtagc ggtggcaccg gcagcaaggg cgaggagctg 660
ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc 720
agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagctgatc 780
tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg cccaccctcg tgaccaccct cggctacggc 840
ctgaagtgct tcgcccgcta ccccgaccac atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc 900
atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc atcttcttca aggacgacgg caactacaag 960
acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga accgcatcga gctgaagggc 1020
atcggcttca aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc tggagtacaa catgaacaaa 1080
acagaatttt acgcggattt aaatcgcgac tttaacgcgc tgatggcggg agaaaccagt 1140
tttctggcaa cgcttgcgaa caccagtgcg ttgttatatg agcgtctcac tgacgtaaac 1200
tgggcaggtt tttatttgct tgaggacgat acactggtgc tcggaccatt tcagggcaaa 1260
attgcctgtg tccggatacc cgtcgggcgt ggcgtgtgcg gcactgcggt tgcccgcaat 1320
caagtgcagc gtatcgagga tgttcatgcg tttgacgggc atattgcctg tgatgcggcg 1380
agtaattctg aaattgttct gccgctggtg gtgaaaaatc agattattgg tgttctcgac 1440
atcgatagta ccgtcttcgg tcgctttaca gacgaggacg agcaaggctt acgtcagctt 1500
gtggcacagc ttgaaaaagt gcttgcaacg acggattaca aaaaattctt tgcgagcgtc 1560
gcagga 1566
<210> 2
<211> 522
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence for fluorescent biosensor
<400> 2
Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp
1 5 10 15
Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp
20 25 30
Cys Gly Pro Ser Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp
35 40 45
Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn
50 55 60
Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu
65 70 75 80
Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser
85 90 95
Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly
100 105 110
Ser Gly His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile
115 120 125
Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Val Gln
130 135 140
Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val
145 150 155 160
Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Phe Gln Ser Val Leu Ser Lys
165 170 175
Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr
180 185 190
Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Asn Val Asp Gly
195 200 205
Gly Ser Gly Gly Thr Gly Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val
210 215 220
Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe
225 230 235 240
Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr
245 250 255
Leu Lys Leu Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr
260 265 270
Leu Val Thr Thr Leu Gly Tyr Gly Leu Lys Cys Phe Ala Arg Tyr Pro
275 280 285
Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly
290 295 300
Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys
305 310 315 320
Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile
325 330 335
Glu Leu Lys Gly Ile Gly Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His
340 345 350
Lys Leu Glu Tyr Asn Met Asn Lys Thr Glu Phe Tyr Ala Asp Leu Asn
355 360 365
Arg Asp Phe Asn Ala Leu Met Ala Gly Glu Thr Ser Phe Leu Ala Thr
370 375 380
Leu Ala Asn Thr Ser Ala Leu Leu Tyr Glu Arg Leu Thr Asp Val Asn
385 390 395 400
Trp Ala Gly Phe Tyr Leu Leu Glu Asp Asp Thr Leu Val Leu Gly Pro
405 410 415
Phe Gln Gly Lys Ile Ala Cys Val Arg Ile Pro Val Gly Arg Gly Val
420 425 430
Cys Gly Thr Ala Val Ala Arg Asn Gln Val Gln Arg Ile Glu Asp Val
435 440 445
His Ala Phe Asp Gly His Ile Ala Cys Asp Ala Ala Ser Asn Ser Glu
450 455 460
Ile Val Leu Pro Leu Val Val Lys Asn Gln Ile Ile Gly Val Leu Asp
465 470 475 480
Ile Asp Ser Thr Val Phe Gly Arg Phe Thr Asp Glu Asp Glu Gln Gly
485 490 495
Leu Arg Gln Leu Val Ala Gln Leu Glu Lys Val Leu Ala Thr Thr Asp
500 505 510
Tyr Lys Lys Phe Phe Ala Ser Val Ala Gly
515 520
Claims (19)
- 티오레독신1(Thioredoxin 1, Trx1) 단백질; cpYFP(circularly permuted yellow fluorescence protein) 단백질; 및 fRMsr(free methionine-R-sulfoxide reductase) 단백질이 순차적으로 연결된,
유리 메티오닌-R-설폭사이드 검출을 위한 형광바이오 센서용 재조합 단백질로서, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것으로서,
상기 티오레독신1 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열에서 1~109번째의 아미노산으로 이루어진 것이고,
상기 cpYFP 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열에서 116~357번째의 아미노산으로 이루어진 것이고,
상기 fRMsr 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열에서 358~522번째의 아미노산으로 이루어진 것인 유리 메티오닌-R-설폭사이드 검출을 위한 형광바이오 센서용 재조합 단백질. - 삭제
- 삭제
- 제1항의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
- 제4항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드. - 제5항에 있어서,
상기 서열번호 1의 염기서열에서 티오레독신1 단백질을 코딩하는 염기서열은 1~327번째의 염기서열로 이루어진 것이고,
상기 cpYFP 단백질을 코딩하는 염기서열은 346~1071번째의 염기서열로 이루어진 것이고,
상기 fRMsr 단백질을 코딩하는 염기서열은 1072~1566번째의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드. - 제4항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
- 제7항의 발현벡터로 형질전환된 형질전환체.
- 제1항의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 포함하는, 유리 메티오닌-R-설폭사이드 검출을 위한 형광바이오 센서.
- 제1항의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 포함하는, 유리 메티오닌-R-설폭사이드의 정량 검출용 조성물.
- (1) 생물학적 시료를 준비하는 단계;
(2) 상기 시료에 제1항의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 처리하는 단계; 및
(3) 상기 형광바이오 센서용 재조합 단백질에 대한 형광스펙트럼 값을 측정하는 단계를 포함하는,
생물학적 시료에 함유된 유리 메티오닌-R-설폭사이드를 정량분석하는 방법. - 제11항에 있어서,
상기 형광스펙트럼 값은 하기 계산식을 통해 NFI(Normalized Fluorescence Intensity) 값으로 계산되어지는 것을 특징으로 하는, 생물학적 시료에 함유된 유리 메티오닌-R-설폭사이드를 정량분석하는 방법; . - 제12항에 있어서,
상기 유리 메티오닌-R-설폭사이드의 함량이 많을수록 형광스펙트럼 값의 수치가 높아지는 것을 특징으로 하는, 생물학적 시료에 함유된 유리 메티오닌-R-설폭사이드를 정량분석하는 방법. - 시험대상에서 분리된 생물학적 시료에 제1항의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 처리한 다음, 형광바이오 센서용 재조합 단백질에 대한 형광스펙트럼 값을 정상 대조군에 대한 형광스펙트럼 값과 비교하는 단계를 포함하며,
상기 형광스펙트럼 값은 하기 계산식을 통해 NFI(Normalized Fluorescence Intensity) 값으로 계산되어지는 것을 특징으로 하는,
상기 생물학적 시료 내에 함유된 유리 메티오닌-R-설폭사이드의 정량분석을 통한 산화적 스트레스 관련 질환의 진단을 위한 정보제공방법으로서, 상기 산화적 스트레스 관련 질환은 암, 뇌졸중, 심근경색증, 협심증, 동맥경화증, 불임, 간염, 골관절염, 급성 관상동맥 증후군, 백내장, 지질대사질환, 심부전증, 고혈압성 심장질환, 및 부정맥으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인, 산화적 스트레스 관련 질환의 진단을 위한 정보제공방법;
. - 제14항에 있어서,
상기 시료는 세포, 조직, 혈액, 혈장, 혈청, 타액 또는 뇨인 것을 특징으로 하는, 산화적 스트레스 관련 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법. - 삭제
- (1) 메티오닌 잔기를 함유하는 단백질을 포함하는 시료에 산화적 스트레스를 유도하는 단계;
(2) 상기 시료에 후보약물을 처리하는 단계; 및
(3) 상기 후보물질이 처리된 시료에 제1항의 형광바이오 센서용 재조합 단백질을 처리하고, 형광바이오 센서용 재조합 단백질에 대한 형광스펙트럼 값을 후보약물을 처리하지 않은 대조군에 대한 형광스펙트럼 값과 비교하여 상기 시료 및 대조군에 함유된 유리 메티오닌-R-설폭사이드를 정량분석하는 단계를 포함하며,
상기 형광스펙트럼 값은 하기 계산식을 통해 NFI(Normalized Fluorescence Intensity) 값으로 계산되어지는 것을 특징으로 하는, 산화적 스트레스 관련 질환의 치료제를 스크리닝하는 방법으로서, 상기 산화적 스트레스 관련 질환은 암, 뇌졸중, 심근경색증, 협심증, 동맥경화증, 불임, 간염, 골관절염, 급성 관상동맥 증후군, 백내장, 지질대사질환, 심부전증, 고혈압성 심장질환, 및 부정맥으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인, 산화적 스트레스 관련 질환의 치료제를 스크리닝하는 방법;
. - 제17항에 있어서,
상기 후보약물을 처리한 형광스펙트럼 값이 대조군의 형광스펙트럼 값에 비해 낮은 경우, 상기 후보약물은 산화적 스트레스 관련 질환의 치료제로 판단하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 산화적 스트레스 관련 질환의 치료제를 스크리닝하는 방법. - 삭제
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-
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Non-Patent Citations (1)
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| Kim S. et al, 2019 International Symposium and Annual Meeting of the KSABC, PBM-62 (2019)* |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PA0109 | Patent application |
Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 20201111 |
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| PG1601 | Publication of registration |