DE69013475T2 - Methode zur Auflösung und Naturation von Somatotropin unter Verwendung von einer niedrigen Harnstoffkonzentration. - Google Patents

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
• Die vorliegeden Erfindung bezieht sich auf den Einsatz einer geringen molaren wässerigen Konzentration von Harnstoff in Kombination mit einer wässerigen Alkalilösung als einer Auflösungs- und Naturierungsmethode für Proteine. Mit dem Aufkommen der rekombinanten DNA-Technologie zur Herstellung vieler Proteine und Polypeptide in den vergangenen Jahren sind Methoden bzw. Verfahren zum effektiven und effizienten Auflösen solcher Proteine während des Reinigungsverfahrens der Schlüssel zur Schaffung einer wirtschaftlichen Großproduktion solcher Produkte.
• Es wurden viele Verfahren zum Auflösen und Naturieren von Proteinen untersucht. So wurden zum Beispiel in der US-PS 4,511,503 refraktive Körper, die als Granulat aggregierten denaturierten Somatotropins unlöslich sind, im Zytoplasma des gesamten Mikroorganismus, E. coli, in dem sie erzeugt wurden, gefunden. Diese refraktiven Körper werden durch Überproduktion des spezifischen interessierenden Proteins, wie Somatotropin, als ein Ergebnis der genetischen Änderung der E. coli-Zelle zur beabsichtigten Überproduktion dieses erwünschten Proteins gebildet. Häufig besteht der einzige Mechanismus in einer Behandlung der refraktiven Körper mit einem starken Denaturierungs- oder chaotropen Mittel, um das Entfalten bzw. Auseinanderklappen und Löslichwerden der unkorrekt gefalteten Moleküle sowohl des erwünschten Produktes (Protein) als auch der E. coli-Proteine zu verursachen. Zusätzlich zur Verursachung dieser Denaturierung müssen die Proteine dann in die richtige monomere Form "renaturieren", um biologisch aktiv zu sein. Diese monomere Form ist besonders wichtig für Somatotropien. Um das aktive Produktprotein zu erhalten, wurden häufig starke Denaturierungsmittel, wie Guanidinhydrochlorid oder Harnstoff in sehr hohen Konzentrationen eingesetzt.
• Zusätzlich zu diesen starken Denaturierungsmethoden wurden chaotrope Mittel, wie Natriumdodecylsulfat (SDS), wie in der US-PS 4,677,196 offenbart, oder schwache Denaturierungsmittel, wie Harnstoff, vorzugsweise in molaren Konzentrationen von 3 bis 5 eingesetzt, wie in der US-PS 4,731,440 offenbart, oder ohne Harnstoff, wie in der US-Patentanmeldung 2854775 vom 16. Dezember 1988, benutzt. Figur 1 vergleicht alle drei Harnstoff-Verfahren.
• Mit jedem der Verfahren sind gewisse Probleme verbunden. Guanidinhydrochlorid ist teuer und muß während des Naturierungsverfahrens ersetzt werden, damit die Naturierung stattfindet. SDS ist ein wirksames Denaturierungsmittel und weniger teuer als Guanidinhydrochlorid, doch bindet es das denaturierte Protein so fest, daß es die vollständige Entfernung aus dem Protein schwierig macht und die Verarbeitungskosten erhöht. Harnstoff wird üblicherweise als ein schwaches Denaturierungs- oder chaotropes Mittel benutzt, doch selbst mit Harnstoff verwendenden Verfahren sind Probleme verbunden, wie die Verunreinigung der Endprodukte, Handhabungs-, Lagerungs- und Abfall-Behandlungsprobleme. Deshalb hilft jedes Verfahren, das geringe Harnstoffkonzentrationen benutzt, die Rückgewinnung der richtigen monomeren Form des Produktproteins, das spezifisch benötigt wird, zu unterstützen.
• Zusätzlich ist es der Erhalt dieses Monomerproduktes, der wichtig ist, um Produktproteine zu bekommen, die die physiologischen und biologischen Aktivitäten von Somatotropinen haben. Das Somatotropinmonomer besteht aus etwa 191 Aminosäureresten und hat ein Molekulargewicht von etwa 22.000 Dalton. Das Monomer ist nicht mit anderen ähnlichen Monomermolekülen verknüpft oder nicht kovalent verbunden.
• Zusätzlich zur Monomerform können Somatotropine in Dimerform existieren, was bedeutet, daß zwei Monomermoleküle durch intermolekulare Disulfidbindungen kovalent verknüpft oder nicht-kovalent miteinander assoziiert sind. Das Dimer-Proteinmolekül besteht aus der doppelten Anzahl von Aminosäuren und dem Doppelten des Molekulargewichtes des Monomers und wird unglücklicherweise durch die Unwirksamkeiten von Verfahren gebildet, die zum Auflösen und Renaturieren der refraktiven Körper benutzt werden. In anderen Worten, es wird durch das Isolations-, Naturierungs- und Reinigungsverfahren gebildet, das erforderlich ist, um das aktive Produktprotein aus den inaktiven Einschluß(refraktiven)-Körpern zu erhalten, die innerhalb der Mikroorganismenzelle kombiniert sind.
• Die vorliegende Erfindung schafft ein kommerziell ausführbares Verfahren zum Auflösen von Proteinen durch wirksames Kombinieren des Einsatzes von Harnstoff als einem Auflösungsmittel mit optimalen Naturierungsbedingungen, wie sie in wässerigen Auflösungsverfahren benutzt werden, bei denen kein Harnstoff eingesetzt wird. Die Naturierung schließt die Oxidation der Cystinreste zur Bildung von Cysteinbindungen ein. Der Einsatz sehr geringer molarer Konzentrationen von Harnstoff führt zu Ausbeutevorteilen, verglichen mit anderen Harnstoff-Verfahren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
• Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Verfahren zum Auflösen und Naturieren von Somatotropinen unter Einsatz geringer Harnstoffkonzentrationen in Kombination mit einem wässerigen alkalischen Auflösungsverfahren zur Maximierung der Monomerbildung bei der Stufe der Auflösung der refraktiven Körper als einem Teil eines Gesamtverfahrens zur Herstellung von gereinigtem Somatotropin (rekombinant). Dieses Verfahren umfaßt das Dispergieren von refraktiven Somatotropin-Körpern in einer geringen molaren Harnstoffkonzentration von 1,8 bis 2,2 Mol Harnstoff für eine genügende Zeit, um die refraktiven Körper aufzulösen (2 bis 20 Minuten), bei einem pH, der zum Auflösen der refraktiven Körper erforderlich ist, und dann Verdünnen der Lösung um mindestens das Dreifache mit Wasser, so daß die resultierende Harnstofflösung eine sehr schwache, geringe Harnstoffkonzentration, d.h. 0,4 molar, hat. Der pH der resultierenden Lösung wird für eine genügende Zeit bei einem Wert gehalten, die die richtige monomere Faltung und Oxidation des Somatotropins gestatten.
• Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Auflösen refraktiver Körper, insbesondere solcher aus Somatotropin, zu schaffen durch Kombinieren eines wässerigen alkalischen Auflösungsverfahrens mit einer geringen molaren Harnstoffkonzentration. Dies führt zu einer nicht nur nützlichen und bevorzugten Monomerbildung, sondern hat außerdem Ausbeutevorteile, sowohl gegenüber dem im Stande der Technik offenbarten Verfahren mit der höheren Harnstoffkonzentration als auch ohne Harnstoffeinsatz. Weiter ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Bildung von Dimeren zu ininimieren und doch die richtige Monomer-Naturierung zu gestatten. Diese und andere Aufgaben der Erfindung ergeben sich aus der folgenden detaillierteren Beschreibung der Erfindung.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
• Figur 1 bietet schematisch einen Vergleich eines Verfahrens mit höherer molarer Harnstoffkonzentration, eines Verfahrens ohne Harnstoff und eines Verfahrens der vorliegenden Erfindung. "Einschlußkörper" bzw. "Zell-Einschlußkörper" ist ein analoger Begriff für "refraktive Körper", und er kann hier austauschbar benutzt werden.
• Figur 2 zeigt, daß die Proteinoxidation, wie nach der Ellman-Reaktion oder durch nicht reduzierende SDS-PAGE gemessen, in den ersten 20 Minuten des vorliegenden Verfahrens mit einer Geschwindigkeit von insgesamt 2 bis 7% stattfindet, was zeigt, daß der größte Teil der Oxidation unter den Bedingungen des verdünnten Harnstoffes stattfindet, zum Vergleich mit der in der US-PS 4,652,630 beanspruchten Oxidation.
• Figur 3 zeigt, daß beim 5-minütigen Halten der refraktiven Körper bei einer der höchsten Harnstoffkonzentrationen, d.h. 2-molarem Harnstoff, keine merkliche Oxidation stattfindet.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
• Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Auflösen und Naturieren von Somatotropinen, umfassend das Dispergieren von refraktiven Somatotropin- Körpern in Wasser, das etwa 1,8 bis 2,2 M Harnstoff enthält, Einstellen des pH der refraktiven Körper in Wasser auf einen Wert, um das Auflösen zu bewirken, so daß die Somatotropinprotein-Konzentration etwa 2 bis 10 g/l beträgt, Halten der resultierenden Lösung bei diesem pH und bei dieser Konzentration für etwa 2 bis 20 Minuten, Verdünnen mit Wasser und Einstellen des pH auf 11,0 bis 12,5, was zu einer resultierenden Harnstoffkonzentration von etwa 0,4 molar und einem Somatotropin-Gehalt von etwa 0,4 bis 2,0 g/l führt, Halten der Lösung bei dem neu eingestellten pH für eine genügende Zeit, damit der Somatotropin-Gehalt in Lösung aus richtig gefaltetem monomeren Somatotropin in guter Ausbeute zusammengesetzt ist (etwa 5 bis 10 Stunden).
• "Somatotropin", wie hier benutzt, bezeichnet (1) tierisches Wachstumshormon, Derivate, Analoge und Fragmente von welcher Art auch immer, zum Beispiel Mensch, Rind, Schwein, Schaf, Ziege, Pferd, Vogel (Huhn, Ente, Gans, Truthahn), Fisch und andere; (2) Vorläufer des Wachstumshormons, wie reduziertes (-SH) Wachstumshormon und S-geschütztes Wachstumshormon, zum Beipsiel Wachstumshormon-S-Sulfonat; (3) Varianten des Wachstumshormons oder seiner Vorläufer, zum Beispiel Strukturen, die zur Verlängerung und/oder Verkürzung der Aminosäuresequenz des Wachstumshormons modifiziert worden sind, zum Beipsiel die 20K-Variante des Wachstumshormons, menschliches Methionyl-Wachstumshormon, Delta 7- und Delta 9- Wachstumshormon der Schweine und ähnliche und (4) Analoge des Wachstumshormons und seiner Vorläufer, zum Beispiel Strukturen, bei denen die Aminosäuresequenz des Wachstumshormons durch Weglassen oder Ersatz eines oder mehrerer Aminosäurereste modifiziert worden ist. Sowohl rekombinant erhaltenes Somatotropin als auch natürlich vorkommendes Somatotropin, sowie irgendeine andere Art von Somatotropin können gemäß der vorliegenden Erfindung benutzt werden.
• Die erste Stufe des neuen Verfahrens ist das Dispergieren der refraktiven Somatotropin-Körper in Wasser (vorzugsweise entionisiertem Wasser), das eine geringe molare Harnstoffkonzentration enthält, in einer geeigneten Konzentration. Die Konzentration von Somatotropin ist ein wichtiger Faktor der vorliegenden Erfindung, und sie muß so überwacht werden, daß sie in den Bereich zwischen 2 bis 10 g/l fällt. Eine geeignete Harnstoffkonzentration beträgt etwa 1,8 bis 2,2 M und vorzugsweise etwa 2 M.
• Der pH des konzentrierten Somatotropins wird auf einen Bereich von etwa pH 11,5 bis etwa pH 12,5, vorzugsweise etwa pH 12,0 bis etwa pH 12,2 eingestellt, um das Somatotropin in einer wässerigen Harnstofflösung aufzulösen. Es kann irgendeine starke Base benutzt werden, um den pH der Lösung einzustellen (zum Beipsiel die Zugabe von Natrium- oder Kaliumhydroxid). Dies findet im allgemeinen innerhalb einer relativ kurzen Zeitdauer statt, wobei etwa 2 bis 20 Minuten typisch sind. Dann wird diese Lösung mit Wasser verdünnt, vorzugsweise entionisiertem Wasser, um das mindestens Dreifache, vorzugsweise Fünffache (Drei- bis Fünffache). Die Somatotropin-Konzentration beträgt nun etwa 2 g/l bis 10 g/l, wobei 4 bis 6 g/l bevorzugt sind.
• Nachdem die refraktiven Somatotropin-Körper aufgelöst worden sind, kann der pH auf einen Bereich von etwa pH 11 bis etwa pH 12,5 neu eingestellt werden. Die Verringerung des pH erhöht die Geschwindigkeit der Naturierung. Der pH kann nach irgendeinem geeigneten Verfahren vermindert werden, zum Beispiel durch die Zugabe von Phosphorsäure. Der neu eingestellte Bereich liegt vorzugsweise von etwa pH 11,3 bis pH 12,0, um Dimer zu minimieren. Besonders bevorzugt ist ein pH von 11,5 bis 11,7.
• Figur 1 vergleicht das vorliegende Verfahren mit einem Verfahren ohne Harnstoff (wässeriges Verfahren) und einem 4M-Harnstoff-Verfahren. Weiter wird der direkte Vergleich eines repräsentativen Verfahrens mit höherer Harnstoffkonzentration, wie in der US-PS 4,652,630 beansprucht, mit dem vorliegende Verfahren vorgenommen, und dieser Vergleich zeigt, daß im Gegensatz zu dem, was in dieser PS erklärt wird, das vorliegende System nicht zu einer raschen Oxidation führt. In der Tat ist die Oxidationsgeschwindigkeit des vorliegenden Verfahrens so kalkuliert, daß sie etwa 0,35%/min oder 2% bis 7% für die ersten 2 bis 20 Minuten des Aussetzens gegenüber der geringen Harnstoffkonzentration beträgt. Figur 3 bestätigt, daß der Grad der stattfindenden Oxidation während der Dauer der Auflösung in der geringen Harnstoffkonzentration unbedeutend ist, wenn man den Endzweck betrachtet, daß 100% oxidiertes Monomer, das biologisch aktiv ist, erforderlich ist. Diese Vergleiche beweisen die einzigartigen Eigenschaften des vorliegenden Verfahrens, mit dem gute Ausbeuten des Endproduktes trotz der Lehre der Druckschriften erhalten werden.
• Zusätzlich kann ein Reduktionsmittel, wie β- Mercaptoethanol oder Dithiothreit zu der Lösung hinzugegeben werden. Wird dieses Reduktionsmittel eingesetzt, dann sollte es unmittelbar vor der Stufe der 3- bis 5-fachen Verdünnung hinzugegeben werden, statt vor der Auflösung.
• Vier verschiedene Laboratoriums-Lieferungen von Somatotropin wurden bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt, und die Ergebnisse sind in Tabelle I angegeben. TABELLE I Vergleich der Monomerausbeuten der 2M-Harnstoff-, 4M- Harnstoff- und wässerigen Verfahren unter Einsatz verschiedener Lieferungen gewaschener fraktiver Körper. Monomerausbeute %* Lieferung ID M-Harnstoff Wässerig * Die Monomerausbeute ist errechnet als das Verhältnis der Konzentration des Somatotropin von 22K Dalton, gemessen durch Gelpermeationschromatographie zur gesamten Somatotropin-Konzentration, gemessen durch rp-HPLC.
• Die %-Monomer, die auf das 2M-Harnstoffverfahren normalisiert wurden, sind in Klammern angegeben.
BEISPIEL 1 RINDER-SOMATOTROPIN
• Ein Fermentationsbrei, enthaltend E. coli-Zellen, die genetisch modifiziert worden sind, um refraktive Körper (auch als Einschluß bzw. Zell-Einschlußkörper bezeichnet) von Rinder-Somatotropin zu produzieren, wurde zur Trennung der Zellen von der Brühe zentrifugiert. Die Zellen wurden wieder aufgeschlämmt und mittels zwei Durchgängen bei 8.000 psig durch einen Gaulin-Homogenisator zerrissen. Die Suspension wurde zentrifugiert und der Bodensatz erneut aufgeschlämmt und mit Lysozym und Triton\ x-100-Detergenz bei 37ºC behandelt. Die Suspension wurde zentrifugiert und der Bodensatz zweimal mit Wasser gewaschen und nach jedem Waschen zentrifugiert.
• Der resultierende Bodensatz, der das unlösliche denaturierte Rinder-Somatotropin (bST) enthielt, wurde in entionisiertem Wasser bei 25ºC dispergiert. Das Wasservolumen wurde so ausgewählt, daß die Somatotropin-Konzentration nach der Harnstoff zugabe 5 g/l betrug. Fester Harnstoff wurde hinzugegeben, bis die Harnstoffkonzentration 2M betrug. Die resultierende Aufschlämmung wurde auf 25ºC erwärmt, um die endotherme Wirkung der Harnstoffauflösung zu beseitigen. Der pH wurde dann durch Zugabe von 1N Natriumhydroxid auf 12,0 eingestellt, was zu einer sichtbaren Auflösung der Einschlußkörper führte. Nach 20 Minuten wurde die Lösung in vierfachem Volumen entionisierten Wassers vom pH 11,5 verdünnt und 7 Stunden gealtert. Nach der Verdünnung im vierfachen Volumen Wassers von pH 11,5 betrug die Somatotropin-Konzentration 1 g/l.
• Am Ende der Alterung wurde der pH der Lösung unter Verwendung von 1M Phosphorsäure auf 10,8 verringert. Die Lösung wurde auf einer 100K Dalton abtrennenden Hohlfaser-Kartusche, wie Amicon\ H26P100-43, ultra- und diafiltriert. Das Hindurchgegangene (Permeat) wurde dann unter Anwendung eines 5K Dalton abtrennenden spiralgewickelten Kartuschen-Ultrafilters, wie Koch\ K131A, konzentriert.
• Die konzentrierte Lösung wurde mit 1M Phosphorsäure auf pH 9 eingestellt und bei 15 g bST/l Harz auf einen Anionenaustauscher, wie DEAE-Sepharose Fast Flow\, gegeben, der mit 10mM Borat, pH 9, äquilibriert worden war. Nach dem Waschen mit dem Äquilibrierungspuffer wurde das bST unter Verwendung einer 100mM NaCl-, 10mM Borat- Lösung beim pH 9 eluiert. Der bST-Peak wurde konzentriert und mit Ammoniaklösung unter Anwendung eines Ultrafilters mit 10K Dalton abtrennenden Kasetten, wie Millipore Pellicon\, entsalzen, bis die Leitfähigkeit des Permeats geringer als 300 uSiemens/cm war. Die entsalzene Lösung bei etwa 100 g/l wurde lyophilisiert, um Rinder-Somatotropin (bST) zu ergeben, das bestehende biologische Tests bestand. Die Ausbeute an lyophilisiertem Rinder-Somatotropin betrug 48% aus der Fermentationsbrühe.
BEISPIEL 2 SCHWEINE-SOMATOTROPIN
• Ein Fermentationsbrühe, enthalten E. coli-Zellen, die genetisch modifiziert worden sind, um Einschlußkörper von Schweine-Somatotropin (pST)zu erzeugen, wurde zur Trennung der Zellen von der Brühe zentrifugiert.
• Der resultierende Bodensatz, der das unlösliche denaturierte Schweine-Somatotropin (pST) enthielt, wurde in entionisiertem Wasser bei 25ºC dispergiert. Das Wasservolumen wurde so ausgewählt, daß die Somatotropin-Konzentration nach der Harnstoffzugabe 5 g/l betrug. Fester Harnstoff wurde hinzugegeben, bis die Harnstoffkonzentration 2M betrug. Die resultierende Aufschlämmung wurde auf 25ºC erwärmt, um die endotherme Wirkung der Harnstoffauflösung zu beseitigen. Der pH wurde dann durch Zugabe von 1N Natriumhydroxid auf 12,0 eingestellt, was zu einer sichtbaren Auflösung der Einschlußkörper führte. Nach 20 Minuten wurde die Lösung in vierfachem Volumen entionisierten Wassers vom pH 11,5 verdünnt und 7 Stunden gealtert. Am Ende des Alterns wurde der pH der Lösung unter Verwendung von 1M Phosphorsäure auf 10,8 verringert. Nach der Verdünnung im vierfachen Volumen Wassers von pH 11,5, betrug die Somatotropin-Konzentration 1 g/l. Die Lösung wurde auf einer 100K Dalton abtrennenden Hohlfaser-Kartusche, wie Amicon\ H26P100-43, ultra- und diafiltriert. Das Hindurchgegangene (Permeat) wurde dann unter Anwendung eines 5K Dalton abtrennenden spiralgewickelten Kartuschen-Ultrafilters, wie Koch\ K131A, konzentriert.
• Die konzentrierte Lösung wurde mit 1M Phosphorsäure auf pH 9 eingestellt und bei 15 g pST/l Harz auf einen Anionenaustauscher, wie DEAE-Sepharose Fast Flow\, gegeben, der mit 10mM Borat, pH 9, äquilibriert worden war. Nach dem Waschen mit dem Äquilibrierungspuffer wurde das pST unter Verwendung einer 100mM NaCl-, 10mM Borat- Lösung beim pH 9 eluiert. Der pST-Peak wurde konzentriert und mit Ammoniaklösung unter Anwendung eines Ultrafilters mit 10K Dalton abtrennenden Kasetten, wie Millipore Pellicon\, entsalzen, bis die Leitfähigkeit des Permeats geringer als 300 uSiemens/cm war. Die entsalzene Lösung bei etwa 100 g/l wurde lyophilisiert, um Schweine-Somatotropin zu ergeben, das bestehende biologische Tests bestand.

Claims (8)

1. Verfahren zum Auflösen und Naturieren von Somatotropinen, umfassend:

Dispergieren refraktiver Somatotropin-Körper in einer wässerigen Lösung von 1,8 bis 2,2 M Harnstoff bei einem pH und für eine genügende Zeit, um die refraktiven Körper aufzulösen und

Verdünnen der Lösung um mindestens das Dreifache mit Wasser bei einem pH und für eine Zeit, die genügen, um richtig gefaltetes monomeres Somatotropin zu ergeben.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Zeit zum Auflösen der refraktiven Köper etwa 2 bis 20 Minuten berägt, der pH 11,0 bis 12,5 ist, die zur Bildung richtig gefalteten monomeren Somatotropins genügende Zeit 5 bis 10 Stunden beträgt und worin das Somatotropin menschliches, Rinder-, Schweine-, Schafs-, Pferde-, Ziegen-, Fisch- oder Vogel-Somatotropin ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, das zusätzlich die Zugabe eines Reduktionsmittels zu der Harnstofflösung vor der Verdünnung mit der mindestens dreifachen Wassermenge umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin das Reduktionsmittel β-Mercaptoethanol, Dithiotreit oder deren Kombinationen ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin das Somatotropin, menschliches, Rinder-, Schweine-, Schafs-, Pferde-, Ziegen-, Fisch- oder Vogel-Somatotropin ist.

6. Verfahren zum Isolieren und Reinigen rekombinant erzeugten Somatotropins, umfassend:

Waschen der Somatotropin und andere Proteine enthaltenden refraktiven Körper mit Wasser,

Auflösen der refraktiven Körper bei pH 11,0 bis 12,5 in etwa 1,8 bis 2,2 M Harnstoff derart, daß die Somatotropin-Konzentration etwa 2 bis 10 g/l beträgt,

Halten der Lösung bei dem genannten pH für etwa 2 bis 20 Minuten,

Verdünnen der Lösung um das mindestens Dreifache mit Wasser,

Einstellen des pH der verdünnten Lösung auf 11,3 bis 12,0 derart, daß die Harnstoff-Konzentration etwa 0,4-molar ist und die Somatotropin-Konzentration etwa 0,4 bis 2,0 g/l beträgt und

Halten dieser Lösung für 5 bis 10 Stunden.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin das Somatotropin menschliches, Rinder-, Schweine-, Schafs-, Pferde-, Ziegen-, Fisch- oder Vogel-Somatotropin ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin die Zeit 7 bis 8 Stunden beträgt.