DE3810803A1 - Verfahren zur herstellung eines synthetischen knochenmaterials mit koerpereigenen eigenschaften - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung lebender Knochenersatzmaterialien durch extrakorporale Züchtung autogener Knochenzellen auf Calciumphosphatmaterial und/oder organischen Substanzen, wobei ein "Verbundmaterial" entsteht, welches dem Patienten reimplantiert werden kann, von dem zuvor entsprechende Knochenzellen entnommen wurden.

In der orthopädischen Chirurgie besteht ein dringender Bedarf an Knochenersatz, mit dem auch größere Defekte überbrückt und geheilt werden können. Solcher Knochenersatz findet Einsatz z. B. bei folgenden Indikationen:

• - In der Traumatologie bei ausgedehnten Trümmerbrüchen und großen Defekten;
• - bei onkologischen Operationen zur endgültigen Stabilisierung und Ausfüllung des Defektes;
• - bei schweren Wirbelsäulendeformitäten werden in großem Umfang Knochen transplantiert;
• - beim künstlichen Gelenkersatz;
• - in der Kieferchirurgie u. a.

Da autologer Knochen (d. h. Knochen desselben Patienten) nur im begrenzten Maße zur Verfügung steht, wurden bisher homo­ loge Knochen aus der Knochenbank eingesetzt. Bei ständig stei­ gendem Bedarf wird das Angebot an immunologisch geeignetem Material jedoch zunehmend geringer. Deshalb ist z. B. schon versucht worden, keramische Werkstoffe auf der Basis von Calciumphosphaten, denen eine gewisse osteo-induktive Wirkung zugeschrieben wird, in die betreffenden defekten Stellen des Körpers einzusetzen. Derartige Möglichkeiten konnten aber die Aufgabe zur Therapie größerer Knochendefekte nicht erfüllen, weil nur kleinere Defekte überbrückt werden könnten. Die biologische Wirkungsweise derartiger Materialien ist zudem nach wie vor unklar.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Knochen­ material mit körpereigenen Eigenschaften herzustellen, das von seinen Ausmaßen her genügend groß ist, um auch größere Defekte überbrücken zu können.

Die Lösung dieser Aufgabe besteht im Prinzip darin, knochen­ bildende Zellen, wie z. B. Osteoblasten aus der Zellkultur, extrakorporal mit calciumphosphatischen Werkstoffen, die chemisch dem Knochenmaterial ähnlich sind, und/oder Substratmaterialien in Form von Biopolymeren zu kombinieren und auf diesen Materialien zu kultivieren. Dabei sollen die gewissermaßen als Matrix dienenden Werkstoffe und Substrat­ materialien so beschaffen sein, daß sie günstige Lebensbe­ dingungen für die extrakorporale Entwicklung von lebenden Knochenzellen bieten, so daß sich diese auch gut vermehren lassen.

Es wurde nun überraschend gefunden, daß die Verwendung calciumphosphatischen Materials einer Zusammensetzung möglichst nahe dem Verhältnis CaO:P₂O₅=3:1 diese Anforderungen erfüllt. Diesem Verhältnis entsprechen die Ver­ bindungen Tricalciumphosphat und Hydroxylapatit (vgl. Abb. 3). Hiermit wurde es möglich, auch eine kurzfristige Generierung von Knochenmaterial zu gewährleisten.

Eine besonders vorteilhafte Verfahrensmaßnahme besteht darin, die auf den CaP-Matrizen abgelagerten Zellkulturen in Zell­ generatoren (Abb. 1) ständig von Nährlösung umströmen zu lassen, um sie so optimal mit der Nährlösung zu versorgen sowie gleichzeitig lokale Übersättigungszustände aus den lebenden Zellkulturen zu beseitigen.

Das vorzugsweise poröse CaP-Matrixmaterial kann durch seine äußere Erscheinungsform, z. B. Granulate oder monolithische Formteile mit durchgehenden Poren (Abb. 2 b) optimal an unter­ schiedliche Indikationssituationen angepaßt werden.

Ähnlich positive Ergebnisse konnten mit Substratmaterialien in Form von Biopolymeren wie Kollagen Typ I erzielt werden. Kom­ biniert man die erfindungsgemäßen Biopolymere mit den erfindungsgemäßen CaP-Materialien, so läßt sich das Ergebnis des erfindungsgemäßen Verfahrens noch weiter verbessern.

Beispiele: 1. CaP-Matrix

Als eine besonders günstige Ausführungsart für die CaP- Matrizen wurde die Verbindung Tricalciumphosphat (β- Whitlockit) aus stöchiometrischen Mischungen aus CaHPO₄ und CaCO₃ durch Sintern über mehr als 8 h bei 1100°C gemäß der Formel

2 CaHPO₄ + CaCO₃ → 3 CaO · P₂O₅ + H₂O ↑ + ↑ CO₂

hergestellt, die entstandenen massiven Probematerialien wurden spanabhebend und mittels Bohren in durchgängig poröse Form­ stücke (Abb. 2 b) überführt.

Hierbei muß durch diese Wahl der Synthesebedingungen sicherge­ stellt sein, daß die gemäß Abb. 3 mit Tricalciumphosphat (3 CaO × P₂O₅) koexistierenden Phasen Dicalcium- und Tetracalciumphosphat möglichst nicht gebildet werden bzw. durch möglichst vollständigen Umsatz verschwinden, da diese letzteren Verbindungen zellschädigende pH-Werte entwickeln und dadurch die Entwicklung der Zellkulturen beeinträchtigen.

2. Kollagen-Matrix

Die Herstellung von Kollagen entsprechender Reinheit, d. h. ohne immunologisch bedenkliche Proteine, erfolgt nach einer besonders vorteilhaften Ausführungsart aus tierischen Knochen, vorzugsweise vom Kalb, aber auch vom Menschen. Hierzu werden Knochenstücke in 0,2 normaler HCl entkalkt, sodann wird das entkalkte Material mit Pepsin oder anderen Proteasen be­ handelt, welche die nicht-kollagenen Proteine "verdauen" und abbauen. Das verbleibende gelförmige Kollagen wird mit HCl oder Essigsäure gelöst und durch Zugabe von CaCl₂-Lösung bei 4°C ausgefällt und von der Lösung getrennt (1. Reinigungs­ schritt). Zur weiteren Reinigung wird das Kollagen wiederum in HCl aufgelöst und durch erneute Zugabe von CaCl₂-Lösung ausgefällt. Diese Reinigung wird insgesamt dreimal wiederholt, wobei ein hochreines, von Fremdproteinen freies Kollagen, Typ I gewonnen wird.

Die Viskosität und der Vernetzungsgrad dieses Kollagens, welches zur Herstellung der Züchtungsmatrix benutzt wird, kann durch die Ca²⁺-Konzentration in weiten Grenzen eingestellt werden.

3. Anzucht der Zellkultur

Hinsichtlich der Anzucht menschlicher Osteoblastenzellen erwies sich folgender Weg als vorteilhaft: Die aus dem Becken­ kamm eines Menschen intra operationem entnommenen Knochen­ stückchen wurden mittels physiologischer Kochsalzlösung nach Dulbecco von Blut gereinigt und mit 5000 E/ml und 5000 µg/ml Penicillinstreptomycin zum Schutz gegen Infektionen behandelt. Nach nochmaliger Reinigung werden die so behandelten Knochen­ proben in einer Nährlösung aus 10% fötalem Kälberserum ernährt (37°C, 5% CO₂, 20% O₂ und 100% relative Luft­ feuchtigkeit). Die Nährlösung wurde alle 2 Tage gewechselt. Hierdurch wachsen die Zellkulturen und differenzieren sich zu Osteoblasten.

4. Vermehrung der Zellkultur und Bildung des "Verbundmaterials"

Die so angezüchteten Osteoblasten werden nach einer vorteil­ haften Arbeitsweise mittels 0,03% Ethylendinitrotetraessig­ säure-Lösung dispergiert und mit einer berechneten Konzentra­ tion von ca. 3600 Zellen/cm² Substrat in die poröse Calcium­ phosphat-Matrix eingeschwemmt. Nach einer zweistündigen Ruhezeit haben sich die Zellen auf der Keramik abgesetzt. Dann wird mit der Durchflutung der Zelle mit Nährlösung begonnen. Die chemische Zusammensetzung und insbesondere der P_H, P_CO2, P_O2 werden in der austretenden Lösung laufend gemessen. Wenn sich die Lösung durch die Zellaktivität und durch partielle Anlösung der CaP-Matrize meßbar ändert, wird die einströmende Nährlösung entsprechend korrigiert. So ist gewährleistet, daß die Zellen stets optimale Lebensbedingungen behalten und die gesamte durchströmte Matrize oberflächlich mit einem dichten "Zellrasen" überziehen. Dies ist nach ca. 2 Wochen der Fall.

Claims (8)

1. Verfahren zur Herstellung eines synthetischen Knochenma­ terials mit körpereigenen Eigenschaften, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man menschliche Knochenzellen (Präosteoblasten und Osteoblasten) extrakorporal auf den dem natürlichen Knochenmineral ähnlichen calciumphospha­ tischen Werkstoffen, Substratmaterialien in Form von Bio­ polymeren oder Mischungen aus beiden züchtet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als calciumphosphatische Werkstoffe dem Verhältnis CaO:P₂O₅ =3:1 möglichst eng entsprechende Calciumphosphate und als Biopolymere Kollagen verwendet.

3. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß man autologe Knochenzellen verwendet.

4. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß man einem fremden, aber immunologisch geeigneten Pa­ tienten entstammende Knochenzellen verwendet.

5. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die auf den Matrizen abgelagerten Zellkulturen von der Nährlösung ständig umströmen läßt.

6. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrixmaterialien eine durchgängige poröse Form haben.

7. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrixmaterialien in granulärer Form vorliegen.

8. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die porösen Matrixmaterialien in monolithischer, dem zu behandelnden Knochendefekt angepaßter Form vorliegen.