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WO1998025643A2 - Neuropeptide als modulatoren zur zelldifferenzierung und proliferation - Google Patents

Neuropeptide als modulatoren zur zelldifferenzierung und proliferation Download PDF

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WO1998025643A2
WO1998025643A2 PCT/EP1997/006901 EP9706901W WO9825643A2 WO 1998025643 A2 WO1998025643 A2 WO 1998025643A2 EP 9706901 W EP9706901 W EP 9706901W WO 9825643 A2 WO9825643 A2 WO 9825643A2
Authority
WO
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cgrp
substance
npy
tissue
bone
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Application number
PCT/EP1997/006901
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French (fr)
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WO1998025643A3 (de
Inventor
Konrad Wolf
Irmgard GÜRTNER
Original Assignee
Konrad Wolf
Guertner Irmgard
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Konrad Wolf, Guertner Irmgard filed Critical Konrad Wolf
Priority to DE19781388T priority Critical patent/DE19781388D2/de
Priority to AU58555/98A priority patent/AU5855598A/en
Publication of WO1998025643A2 publication Critical patent/WO1998025643A2/de
Publication of WO1998025643A3 publication Critical patent/WO1998025643A3/de

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    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells

Definitions

  • Neuropeptides as modulators for cell differentiation and proliferation
  • the present invention relates to drugs for the treatment of tissue lesions, differentiation or granulation deficits and calcium metabolism disorders, containing calcitonin-related peptides (CGRP) and / or substance P or / and neuropeptide Y (NPY), and the use of these substances for the production of autologous tissue equi - valents.
  • CGRP calcitonin-related peptides
  • NPY neuropeptide Y
  • the current procedure provides for cementing the implant with bone cement or anchoring the implant by driving in the shaft or fixing the socket with additional screws (Degreif et al., Schuchirurg 99 (1 996), 744-749).
  • the primary location of the implant is ensured by the close contact with the cortical bone (Ludwig et al., Trauma surgeon 99 (1 996), 750-757). If there is a low-replacement camp, there is the option of introducing additional cancellous bone pulp to increase the osteogenic potency in the interface (Rueger et al., Osteologie Volume 4, Supplement 1 (1 995) 35). Demineralized bone matrix is also used.
  • Bone fleeces have recently been used which are coated with bone morphogenetic protein (BMP) and which stimulate mineralization and osteoblasts in the surrounding tissue (Dee et al., Biomaterials 1 7 (2) (1 996), 209-21 5).
  • BMP bone morphogenetic protein
  • the object of the present invention was to enable anchoring of prostheses as effectively as possible, in particular the use of animal auxiliary materials should be avoided and, above all, the use of patient's own auxiliary materials should be made possible.
  • the concept according to the invention is therefore characterized by the use of the neuropeptides CGRP or / and substance P or / and NPY and the use of patented (autologous) precursor cells which are stimulated by these neuropeptides as implants or implant anchors.
  • the neuropeptides CGRP, substance P and NPY are to be regarded as neurotransmitters.
  • the definition of a neurotransmitter presupposes that various biochemical, physiological and pharmacological criteria are met, such as synthesis and storage in the neuron, transport of the neurotransmitter for axon termination and release at the nerve endings, and ultimately the effect of the substance on the postsynaptic receptor.
  • Hormones belong to different chemical groups.
  • the neuropeptides are short-chain peptides.
  • An organism's hormones are substances that are synthesized by specific tissues.
  • Cells have hormone receptors in their plasma membrane.
  • the association of a hormone with its specific receptor in the plasma membrane stimulates adenylate cyclase, which is also bound to the plasma membrane.
  • the increased activity of the adenylate cyclase increases the amount of cAMP in the cytosol.
  • the cAMP then changes the speed of one or more processes within the cell.
  • Cyclo-AMP is created from ATP, a ubiquitous molecule, in a simple reaction that is driven by the subsequent hydrolysis of pyrophosphate.
  • cAMP is synthesized from a substance that is at the heart of the metabolism, cAMP itself does not belong to a main metabolic pathway. It is only used as an integrator of metabolism, not as a biosynthetic starting product or as an intermediate in energy production. This means that its concentration can be checked independently. It is also stable unless it is hydrolyzed by a specific phosphodiesterase. Due to the numerous functional groups, the cAMP can bind firmly and specifically to receptor proteins, for example the regulatory subunits of the protein kinase of the muscle, and thus have allosteric effects.
  • the calcitonin gene-related peptide plays the most important role in the early phase of granulation tissue formation for precursor cell stimulation.
  • the cAMP production of osteoblasts can be increased 30 to 50 times by high CGRP doses (Zaidi et al., Quarterly Journal of Experimental Physiology 72 (1 987), 371-408). This is a clear indication of a hormonal character of CGRP.
  • Substance P has the highest affinity for the neurokinin 1 receptor; in higher concentrations there is also an interaction with the neurokinin receptor type 2 / type 3.
  • the receptor binding to the neurokinin 1 receptor increases in the presence of bivalent cations, such as Mg 2 + and Mn 2 + (Garrett NE, Rapp, PI, Crawys SC, Kidd, BL, Blake, DR, Role of substance P in inflammatery arthritis, (1 992), Annuals of the Rheumatic Diseases, 51: 1 014-1 01 8) .
  • the NPY binds to a specific class of receptors on the cell surface of which 2 subtypes are known to date: the Y, and the Y 2 receptor.
  • the Y, receptor is coupled to an inhibitory G protein and thus has an inhibitory effect on adenylate cyclase (Ahmed, M., Bjurholm, B., Theodorsson, E., Schutzberg, M., Kreicbergs, A., Neuropeptide Y- and Vasoactive Intestinal Polypeptide-like Immunreactivity in Adjuvant Arthritis: Effects of Capsaicin Treatment (1 995), Neuropeptides, 29: 33-43).
  • a systemic effect can also be postulated.
  • the calcitonin gene complex codes for a small group of peptides - the calcitonin family - consisting of the calcitonin itself, the katacalcin and finally the CGRP.
  • the calcitonin / CGRP gene complex comprises at least 2 genes, which are referred to as a and ⁇ genes.
  • the ⁇ -CGRP gene is located on the short arm of chromosome 1 1, between the catalase and the PTH gene (Kittur et al., 1 985: Höppener et al., Ham. Gent. 70 (1 985), 259-263; Alevizaki et al., Federation of European Biochemical Societies 206 (1) (1 986), 47-52). It consists of 6 exons, extends over 6.5 kilobase pairs and is fully transcribed. Exons 1, 2 and 3 are common to calcitonin and CGRP, with the first exon not being translated in any of the peptides. Both have the same coding and non-coding regions at the 5 'end.
  • ß-CGRP gene A second calcitonin / CGRP gene was also found on the short arm of chromosome 1 1 in humans and rats, which appears to have arisen from gene duplication (Steenbergh 1985; Amara et al., 1 985, Alevizaki et al., Federation of European Biochemical Societies 206 (1) (1 986), 47-52). While exons 3 and 5 are very similar to the ⁇ gene, the non-coding 5 'and 3' end regions in particular show significant differences.
  • the active neuropeptide consists of 37 amino acids, a disulfide bridge between positions 2 and 7 and a C-terminal amide group. Biochemical processes enable the artificial synthesis of neuropeptides.
  • the human neuropeptide CGRP consists of 37 amino acids of a certain amino acid sequence (Brain et al., Nature 31 3 (1 985), 54-56; Alevizacki et al., Federation of European Societies 206 (1) (1986), 47-52 ).
  • a- and ß-CGRP sequences differ by three amino acids, in the rat by one. Two of the three human deviations appear in places where h (human) CGRP differs from r (rat) CGRP.
  • a comparison of the sequences of different species reveals different amino acids at different positions (Zaidi et al., Quarterly Journal of Experimental Physiology 72 (1 987), 371-408).
  • Osteoblasts have specific CGRP receptors to which the adenylate cyclase is coupled (Zaidi et al., Biochemical Biophysiological Research 2, 1 59 (1) (1 989), 68-71). Stimulation of the osteoblast via the CGRP receptor can be achieved using the neuropeptide CGRP (Bjurholm et al., Journal of Bone and Mineral Research 7 (9) (1 992), 101 1 -101 9).
  • the polypeptide Substance P (SP) consists of 1 1 amino acids. It shows a broad spectrum of activity in the body and a widely ramified distribution. It has both neurocrine and paracrine and limited endocrine effects.
  • the sequence of Substance P has been phylogenetically constant for a long time and shows no or only minimal deviations in vertebrates.
  • Substance P belongs to the family of tachykinins in addition to neurokinins A and B. Their common structural feature is the Phe-X-Gly-Leu-Met-NH 2 sequence, which is uniform at the carboxy end.
  • the tachykinins bind specifically to the so-called neurokinin receptors, Substance P to the receptor subclass Neurokinin-1 (Cascieri et al., 1 992).
  • Substance P acts as a cotransmitter together with various classic neurotransmitters, e.g. GABA, serotonin or noradrenaline.
  • GABA GABA
  • serotonin noradrenaline
  • SP-positive neurons are found in the basal ganglia (striatonigralis tract, striatopallidal tract) as a paracrine effector in the pituitary system and as a mediator in the limbic system.
  • the neuropeptide has also been detected in cortical interneurons and in spinal projection pathways.
  • Substance P appears in the periphery as an agonist in pain management.
  • Substance P represented on all levels, from the first (peripheral) neuron via strand cells or interneurons in the spinal cord to central pathways such as the spinothalamic tract.
  • the neuropeptide is represented in a wide variety of local control loops. This is how it was found in perivascular nerve fibers of the entire vascular system. In vitro and in vivo experiments demonstrated its strong vasodilatory effect and participation in the control of local blood flow. Substance P is involved in pain transmission, vasodilation and histamine release and in the organism's reaction to inflammatory processes.
  • SP-positive neurons of the adrenal medulla, carotid body and gastrointestinal tract are assigned to the APUD system (amine precursor uptake and decarboxylation).
  • APUD system amine precursor uptake and decarboxylation
  • cells of the "peripheral endocrine system” they can characteristically both in secrete the bloodstream (endocrine) as well as synaptically (neurocrine) or into the surrounding tissue (paracrine).
  • Substance P is not only a carrier of the intramural nervous system, but also of extrinsic, vegetative innervation.
  • the contraction-stimulating effect of the neuropeptide on the non-vascular, smooth muscles plays a functionally important role in the digestive system. In addition to vasodilation, this results in the second cross-organ reaction to the release of the peptide.
  • Other places of action are the lungs (bronchoconstriction) and presumably the smooth muscles of the urogenital tract (ureter, bladder, uterus).
  • the periosteum, the epiphysis and other bone-cartilage borders have the highest concentration of the neuropeptide. Furthermore, nerve fibers containing SP could be detected in all other bone areas. The sprouting of SP-positive nerve fibers in a heterotopic bone implant suggests that they belong to the innervation of the bone (Bjurholm et al., Arthritis-Rheum. 33 (6) (1 990), 859-865).
  • the transmitter has a significant influence on the regulation of local blood circulation, the inflammatory response and the nociception. Furthermore, the afferent neurons are said to have an effect on the pressure sensation of the bone (Gronblad et al., 1 984). The removal of mechanoreceptors of the periosteum can, however, as demonstrated by Aro et al., 1 985, on the rat fibula lead to the nonunion of a fracture. Table IV: Occurrence and effects of Substance P
  • the neuropeptide SUBSTANZ P can stimulate the osteoblast (Bjurholm et al., 1 992)
  • the neuropeptide Y consists of 36 amino acids. Its sequence shows a tyrosine at the N-terminal and a tyrosinamide at the C-terminal.
  • the neurotransmitter belongs to the peptide family of the better known pancreatic polypeptide (PP) and the neuropeptide YY (NYY).
  • NPY binds to its own specific class of receptors on the cell surface, of which two subtypes are known to date: the Y1 and the Y2 receptor.
  • the Y1 receptor is coupled to an inhibitory G protein and therefore usually has an inhibitory effect on adenylate cyclase or other second messenger systems.
  • the neuropeptide Y has so far been detected in the CNS in the pituitary system and in the spinal cord, mainly in the substantia gelatinosa. NPY has an inhibitory effect on the transmission of pain in inhibitory interneurons.
  • NPY is represented as a co-transmitter in the autonomic nervous system and in cells of the APUD system.
  • the peptide usually appears to have an inhibitory function in the gastrointestinal tract: on the one hand, the inhibition of fEPSP (fast, excitatory, post-synaptic potentials that result in an action potential when summing and consequently a forwarding of arousal) has been achieved in nerve fibers others described an inhibition of gastrointestinal motility. There is also a vasoconstrictive effect.
  • other parts of the body such as the heart and cerebral vasculature, also contain perivascular, NPY-containing nerve fibers that cause vasoconstriction.
  • NPY fibers innervate the whole bone, preferably transition regions such as the bone-cartilage border or the surrounding soft tissue.
  • Neuropeptide Y has a specific receptor on the osteoblasts and has an inhibitory effect on stimulation of osteoblast activity caused by PTH, noradrenaline or norephinephrine. It completely or partially suppresses an increase in the intracellular cAMP level caused by the substances mentioned above. NPY is therefore involved in modulating bone growth and remodeling.
  • conductive elements i.e. the ingrowth of the nerve fibers from outside into the fracture gap
  • inductive elements i.e. the nerve stimulation outside the fracture gap or the stimulation of the precursor cells in the fat marrow.
  • the present invention relates to a medicament for the treatment of tissue lesions, differentiation or granulation deficits and calcium metabolism disorders, which is characterized in that it contains calcitonin gene-related peptides (CGRP) or / and substance P and / or NPY, if appropriate, with conventional pharmaceutical contains table auxiliaries and / or carriers.
  • CGRP calcitonin gene-related peptides
  • the medicament according to the invention makes it possible to combat tissue lesions, fracture healing disorders, differentiation or granulation deficits or calcium metabolism disorders in a variety of forms. This is made possible by the stimulating effect of CGRP, substance P or NPY on cells, whereby both cell division and cell differentiation are promoted. Blood circulation and revascularization are also promoted.
  • the active ingredient that is to say CGRP or / and substance P or / and NPY
  • a biologically or medically suitable carrier In principle, all carriers known to date are suitable for this, human embryonic collagen type III or other bone substitution material being particularly preferred. However, all endoprosthetic surfaces are suitable for applying the active substances according to the invention to them, or if so is a porous material, to be introduced into it and then to be introduced into wounds or bone gaps or other defects.
  • the stimulation of the precursor cells in the fatty marrow by Neuropeptide hormones lead to a precursor cell proliferation of 3-18 million cells / cm 3 , as shown by our own test results (Wolf et al., 1 997).
  • the medicament according to the invention can additionally contain other active constituents, growth factors in particular being regarded as preferred, with particularly preferred growth factors being the BMP proteins.
  • Another object of the present invention is the use of CGRP or / and substance P or / and NPY for the production of autologous tissue equivalents, wherein progenitor cells taken from a patient are cultivated in vitro with the addition of CGRP or / and substance P or / and NPY.
  • CGRP or / and substance P or / and NPY it was surprisingly found that by adding CGRP or / and substance P or / and NPY to tissue cultures it is possible to cultivate them very effectively and in this way to produce tissue equivalents which make it possible for patient's own material to be grown to obtain a sufficient amount that this can be reimplanted.
  • tissue equivalents have the advantage that they avoid the risk of disease transmission (HIV transmission, hepatitis transmission, problems with BSE when using animal material) and that rejection reactions only occur in a much smaller form.
  • the active substance is added to the culture medium in a concentration of 10 "21 to 10 " 3 mol / l.
  • the precursor cells can preferably be stimulated to grow biomechanically, electromagnetically or by changing the oxygen partial pressure.
  • the precursor cells are applied to a carrier.
  • This carrier facilitates the extraction of the cell culture and also later facilitates the introduction of the autologous tissue equivalents to the place where they are supposed to be effective.
  • the carrier consists of resorbable material.
  • the carrier also particularly preferably consists of autologously obtained material (e.g. cancellous bone).
  • Another object of the invention is the use of the medicament according to the invention for the treatment of tissue lesions, differentiation or granulation deficits, e.g. of bone, cartilage, skin and soft tissues, for the treatment of bone metabolic disorders, in particular calcium metabolic disorders, or for the treatment of metabolic metabolic disorders.
  • the tissue equivalents produced according to the invention are preferably used as implants in the field of therapy for tissue defects, tissue lesions or granulation disorders.
  • the tissues are preferably soft parts, cartilage or bones. Endoprostheses can also be coated with the tissue equivalent according to the invention. In a further preferred embodiment, one sets also autologous bone matrix too. Finally, erythrocytes or other cells are preferably added during implantation.
  • Surgical debridement is required to prepare the recipient site.
  • the debridement opens larger blood vessels and capillaries.
  • a large collection of erythrocytes and individual granulocytes with platelets fill the room.
  • a fibrin network promotes the migration of new cells.
  • Inflammatory cells such as macrophages, multinucleated leukocytes and mast cells migrate early.
  • the phagocytosis of the immigrating granulocytes and monocytes begins (Sedlarik, wound healing (1 993), publisher K.M. Sedlarik. Publisher: Gustav Fischer-Verlag, Jena-Stuttgart).
  • Implanted precursor cells begin to proliferate after a few hours. After a few days, the first formation of vascular sinuses shows a capillary sprout. Later, phagocytic cells decrease in favor of fibroblasts. CGRP-positive, substance P-positive and NPY-positive nerve fibers growing from the recipient camp maintain a further stimulation of precursor cell tissue.
  • CGRP or / and substance P or / and NPY introduced into the wound stimulate the precursor cells already present in the wound and promote the consolidation of granulation tissue and the formation of new capillaries.
  • Bone gap healing was investigated experimentally (rabbit) on the defined fracture gap model.
  • the granulation tissue removed from the fracture gap contained stem cells or precursor cells in high concentration.
  • CGRP-positive fibers were found after a period of 5 days from the edge of waxing (conductive). The histology of the granulation tissue at this time showed the detection of precursor cells.
  • neuropeptide-positive fibers CGRP and substance P
  • NPY-positive nerve fibers were detected in the fat marrow, which is the production site of the precursor cells, after a period of 5 to 10 days.
  • CGRP- and substance P-positive fibers could be regularly detected (Wolf et al., 60th Annual Meeting of the German Society for Trauma Surgery, Springer Verlag, Heidelberg-New York, 88 (1,996)).
  • the NPY regulates the blood supply to the nerve fibers in the fat marrow.
  • the immunocytochemical test results prove that the neuropeptide hormones described are potent stimulators of precursor cell proliferation and differentiation.
  • the investigations with the laser Doppler flowmetry showed an increased blood flow after stimulation by the described neuropeptide hormones for the microcirculation in the granulation tissue of the fracture gap (Wolf et al., 1 997).
  • cartilage cell stimulator for cartilage defects on the hip, knee, shoulder, ankle, hand, finger joint in arthrosis in intra-articular fractures with cartilage detachment in benign or malignant cartilage tumors in autoimmune diseases that cause cartilage damage, e.g. Rheumatoid arthritis
  • a central aspect of the invention is the use of the neuropeptides calcitonin gene related peptides (CGRP or / and substance P or / and NPY).
  • CGRP neuropeptides calcitonin gene related peptides
  • the multiplication and differentiation of progenitor cells, tissues or their equivalents is stimulated.
  • Tissue equivalents are cell aggregates or collagen fiber structures generated in vitro from corresponding progenitor cells.
  • combined growth factors, biomechanical stimulation processes and electromagnetic field stimulation processes are used. The local as well as the systemic effect of the CGRP, substance P, NPY on the osteogenesis should be used.
  • BMP bone morphogenic protein
  • the biochemical activation cascade of the CGRP or substance P takes place via the adenylate cyclase cascade and leads to an increased cAMP level or to the activation of the protein kinase.
  • the products inositol, diaglycerol, calmodulin and prostaglandin E cause intracellular calcium influx on the cell membrane via appropriate receptor structures.
  • the NPY has an inhibitory effect on the adenylate cyclase system via the Y receptor.
  • the cell proliferation is achieved with electromagnetic field stimulation (stimulation 1 994).
  • stimulation 1 994 cell metabolism processes of regulation and reaction are regulated by appropriate mediators.
  • the growth of the cell culture is said to be influenced by varying the oxygen partial pressure.
  • the oxygenation of the tissue ultimately depends on the vascularization, which is modulated in its different quality by the model variation of the oxygen partial pressure.
  • Bjurholm (1 990) described an occurrence of neuropeptide-positive nerve fibers in combination with particles of a demineralized bone matrix - embedded in rat muscles.
  • the carrier medium represents a possibility of bringing the cells to the place of their transplantation and embedding them there.
  • biodegradable, resorbable materials are ideal.
  • Collagen is one of the most commonly used materials.
  • the carrier medium can consist of embryonic, recombinant collagens which are in the solid or liquid phase.
  • the carrier medium can be altered in a corresponding manner as:
  • Sponge calcium apathite sponge, coated with neuropeptide hormone
  • autologous material can be used, e.g. proliferated fibroblasts that differentiate into fibrocytes and also synthesize collagen material.
  • This collagen material can be used as a carrier medium.
  • Bone wax is also a suitable carrier material.
  • the erythrocytes as such can be used as a carrier medium.
  • the fracture hematoma is also the starting point for the infusion of connective tissue cells in physiological healing, so that the same material is introduced here by analogy.

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Abstract

Ein Arzneimittel zur Behandlung von Gewebeläsionen, Differenzierungs- oder Granulationsdefiziten sowie Stoffwechselstörungen enthält als Wirkstoff Calcitonin-gene related peptide (CGRP) oder/und Substanz P oder/und Neuropeptid Y (NPY) gegebenenfalls mit üblichen pharmazeutischen Hilfs- oder/und Trägerstoffen. Zur Herstellung von autologen Gewebeäquivalenten werden einem Patienten entnommene Vorläuferzellen in vitro unter Zugabe von CGRP oder/und Substanz P oder/und NPY kultiviert. Derartige Gewebeäquivalente dienen erfindungsgemäß als Implantate im Bereich der Therapie von Gewebedefekten, Gewebeläsionen oder Granulationsstörungen.

Description

Neuropeptide als Modulatoren zur Zelldifferenzierung und Proliferation
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft Arzneimittel zur Behandlung von Gewebelasionen, Differenzierungs- oder Granulationsdefiziten sowie Calciumstoffwechselstörungen, enthaltend Calcitonin-gene related peptide (CGRP) oder/und Substanz P oder/und Neuropeptid Y (NPY), sowie die Verwendung dieser Substanzen zur Herstellung von autologen Gewebeäqui- valenten.
Bei Einbringen einer Gelenksprothese sieht die derzeitige Verfahrensweise die Einzementierung des Implantates durch Knochenzement oder die Verankerung des Implantates durch Einschlagen des Schaftes oder Fixierung der Pfanne durch zusätzliche Schrauben vor (Degreif et al., Unfallchirurg 99 ( 1 996), 744-749). Der primäre Sitz des Implantates wird hierbei durch den engen Kontakt mit dem kortikalen Knochen gewährleistet (Ludwig et al., Unfallchirurg 99 (1 996), 750-757). Liegt ein ersatzschwaches Lager vor, besteht die Möglichkeit, zusätzlich Spongiosabrei einzubringen, um im Interface die osteogene Potenz zu erhöhen (Rueger et al., Osteologie Band 4, Supplement 1 ( 1 995) 35). Zudem wird auch demineralisierte Knochenmatrix verwendet.
Seit kurzem werden auch Knochenvliese verwendet, die mit Bone morpho- genetic protein (BMP) beschichtet sind, welche die Mineralisation und die Osteoblasten im umliegenden Gewebe stimulieren (Dee et al., Biomaterials 1 7 (2) ( 1 996), 209-21 5). Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand nun darin, eine möglichst effektive Verankerung von Prothesen zu ermöglichen, wobei insbesondere auf die Verwendung tierischer Hilfsmate- rialien verzichtet werden sollte und vor allem die Verwendung von patienteneigenen Hilfsmaterialien ermöglicht werden sollte. Im Gegensatz zu den im Stand der Technik bekannten Verfahren unter Verwendung von Spongiosabrei, demineralisierter Knochenmatrix oder Kollagenviies mit BMP wird das erfindungsgemäße Konzept daher charakterisiert durch die Verwendung der Neuropeptide CGRP oder/und Substanz P oder/und NPY sowie die Verwendung von patentieneigenen (autologen) Precursorzellen, die durch diese Neuropeptide stimuliert werden als Implantate oder Implantatverankerungen.
Die Neuropeptide CGRP, Substanz P und NPY sind als Neurotransmitter anzusehen. Die Defintion eines Neurotransmitters setzt voraus, daß verschiedene biochemische, physiologische und pharmakologische Kriterien erfüllt sind, wie Synthese und Speicherung im Neuron, Transport des Neurotransmitters zur Axonenendigung und Freisetzung an den Nervenendi- gungen, letztendlich die Wirkung der Substanz am postsynaptischen Rezeptor. Hormone gehören verschiedenen chemischen Gruppen an. Bei den Neuropeptiden handelt es sich um kurzkettige Peptide.
Die Hormone eines Organismus sind Stoffe, die von spezifischen Geweben synthetisiert werden.
Sie ändern in spezifischer Weise die Aktivitäten der Gewebezellen in ihrem Zielorgan.
Neuere Forschungen ergaben, daß die Wirkungsweise von Hormonen verschiedene Prinzipien beinhalten. Die meisten Hormone binden an Rezeptoren der Zelloberfläche und lösen eine Kaskade enzymatischer Reaktionen aus. Die Adenylat-Cyclase-Kaskade - die zu einem erhöhten cAMP-Spiegel und zu Aktivierung einer Protein-Kinase führt - ist ein wichtiger Übertragungsweg. Cyclo-AMP wird von der Adenylat-Cyclase synthetisiert und von einer Phosphodieesterase gespalten. Zyklisches AMP wird aus ATP unter Wirkung eines integralen Membranproteins aus der Adenylat-Cyclase gebildet. Cyclo-AMP ist der Second messenger vieler Hormone. Der "erste Bote" ist das Hormon selbst. Die Grundzüge dieses Modells beinhalten folgende Definition: Zellen besitzen in ihrer Plasmamembran Hormonrezeptoren. Die Verbindung eines Hormons mit seinem spezifischen Rezeptor in der Plasmamembran führt zur Stimulierung der Adenylat-Cyclase, die ebenfalls an die Plasmamembran gebunden ist. • Die gesteigerte Aktivität der Adenylat-Cyclase erhöht die Menge an cAMP im Cytosol.
Das cAMP ändert dann innerhalb der Zelle die Geschwindigkeit eines oder mehrerer Prozesse.
Eine wichtige Eigenschaft des Second-messenger-Modells ist, daß das Hormon nicht in die Zelle eindringt, sondern seine Wirkung an der Zellmembran entfaltet. Die biologischen Hormonwirkungen in der Zelle werden von cAMP und nicht vom Hormon selbst vermittelt.
Cyclo-AMP entsteht aus ATP, einem ubiquitär auftretenden Molekül, in einer einfachen Reaktion, die durch die nachfolgende Hydrolyse von Pyrophos- phat angetrieben wird. Obwohl cAMP aus einer Substanz synthetisiert wird, die im Mittelpunkt des Stoffwechsels steht, gehört cAMP selbst keinem Hauptstoffwechselweg an. Es wird nur als Integrator des Stoffwechsels verwendet, nicht als biosynthetisches Ausgangsprodukt oder als Zwischenprodukt bei der Energiegewinnung. Somit kann seine Konzentration unabhängig kontrolliert werden. Außerdem ist es stabil, sofern es nicht von einer spezifischen Phosphodiesterase hydrolysiert wird. Durch die zahlreichen funktionellen Gruppen kann sich das cAMP fest und spezifisch an Rezeptorproteine, zum Beispiel die regulatorischen Untereinheiten der Protein-Kinase des Muskels, binden und so allosterische Effekte ausüben.
Unter den bekannten Neuropeptiden spielt in der Frühphase der Granulationsgewebebildung für die Precursorzellstimulation das Calcitonin-gene-rela- ted-Peptide die wichtigste Rolle. Die cAMP-Produktion der Osteoblasten läßt sich durch hohe CGRP-Dosen um das 30- bis 50-fache steigern (Zaidi et al., Quarterly Journal of Experimental Physiology 72 ( 1 987), 371 -408) . Dies stellt einen eindeutigen Hinweis auf einen Hormoncharakter von CGRP dar.
Die Substanz P hat die höchste Affinität zu dem Neurokinin 1 Rezeptor, in höheren Konzentrationen besteht auch eine Interaktion mit dem Neurokinin Rezeptor Typ 2/Typ 3. Die Rezeptorbindung an den Neurokinin 1 Rezeptor steigt bei Anwesenheit von bivalenten Kationen, wie z.B. Mg2 + und Mn2 + (Garrett N.E., Rapp, P.I., Crawys S.C., Kidd, B.L., Blake, D.R., Role of substance P in inflammatery arthritis, ( 1 992), Annuals of the Rheumatic Diseases, 51 : 1 014-1 01 8) .
Das NPY bindet an eine spezifische Rezeptorklasse an der Zelloberfläche von der bisher 2 Subtypen bekannt sind: der Y,- und der Y2-Rezeptor. Der Y.,-Rezeptor ist mit einem inhibitorischen G-Protein gekoppelt und wirkt somit hemmend auf die Adenylatcyclase (Ahmed, M., Bjurholm, B., Theodorsson, E., Schutzberg, M., Kreicbergs, A., Neuropeptide Y- and Vasoactive Intestinal Polypeptide-like Immunreactivity in Adjuvant Arthritis: Effects of Capsaicin Treatment ( 1 995), Neuropeptides, 29: 33-43) .
Abgesehen von einer lokalen rezeptorgebundenen Wirkung ist auch eine systemische Wirkung zu postulieren.
CGRP
Bei der Verpflanzung von Karzinomzellen aus dem Schilddrüsenmark entdeckten Rosenfeld et al., (1981 ), einen permanenten Wechsel von hoher zu niedriger Calcitoninsynthese. Wie spätere DNA- und RNA-Analysen zeigten, wurde in diesen Zellen die Calcitonin mRNA durch eine ähnliche, aber um ca. 200 Nucleotide längere mRNA ersetzt, die für einen 1 28 Aminosäuren langen Präkursor kodiert (Rosenfeld et al., Nature 304, 7 ( 1 983), 1 29-1 35). Aus diesem Vorläufer entsteht schließlich ein Peptid mit 37 Aminosäuren: Das Calcitonin-gene-related-peptid. Der Calcitonin-Gen- komplex kodiert für eine kleine Gruppe von Peptiden - der Calcitoninfamilie - bestehend aus dem Calcitonin selbst, dem Katacalcin und schließlich dem CGRP. Der Calcitonin/CGRP-Genkomplex umfaßt mindestens 2 Gene, die als a- und ß-Gen bezeichnet werden.
σ-CGRP-Gen
Das σ-CGRP-Gen befindet sich auf dem kurzen Arm des Chromosoms 1 1 , zwischen dem Katalase- und dem PTH-Gen (Kittur et al. , 1 985: Höppener et al., Ham. Gent. 70 ( 1 985), 259-263; Alevizaki et al., Federation of European Biochemical Societies 206 ( 1 ) ( 1 986), 47-52) . Es besteht aus 6 Exons, erstreckt sich über 6,5 Kilobasenpaare und wird vollkommen transkribiert. Die Exons 1 , 2 und 3 sind Calcitonin und CGRP gemeinsam, wobei das erste Exon bei keinem der Peptide translatiert wird. Beide besitzen am 5'-Ende die gleichen kodierenden und nicht kodierenden Regionen. Beim Menschen stimmen beide in den ersten 225 Nukleotiden überein, das entspricht 75 Aminosäuren (Craiq et al. , 1 982; Jonas et al., Proc. Nat. Acad. Sei 82 ( 1 985), 1 994-1 998).
ß-CGRP-Gen Ebenfalls auf dem kurzen Arm des Chromosoms 1 1 wurde beim Menschen und bei der Ratte ein zweites Calcitonin/CGRP-Gen entdeckt, das durch Genduplikation entstanden zu sein scheint (Steenbergh 1985; Amara et al., 1 985, Alevizaki et al., Federation of European Biochemical Societies 206 ( 1 ) ( 1 986), 47-52) . Während die Exons 3 und 5 eine hohe Ähnlichkeit zum σ-Gen aufweisen, zeigen vor allem die nicht kodierenden 5'- und 3'-Endre- gionen signifikante Unterschiede. Das aktive Neuropeptid besteht aus 37 Aminosäuren, einer Disulfidbrücke zwischen der Position 2 und 7 und einer C-terminalen Amidgruppe. Biochemische Verfahren ermöglichen die künstliche Synthese von Neuropeptiden. Voraussetzung hierzu ist die genaue Kenntnis der Aminosäuresequenz. Das Human-Neuropeptid CGRP besteht aus 37 Aminosäuren einer bestimmten Aminosäuresequenz (Brain et al., Nature 31 3 (1 985), 54-56; Alevizacki et al., Federation of European Societies 206 (1 ) ( 1986), 47-52) .
Tabelle I: Sequenz des a- und ß-Calcitonin-gene-related peptide (CGRP)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 12 13 σ-CGRP AJa Cys Asp Thr AJa Thr Cys Val Thr His Arg Leu AJa ß-CGRP Aia Cys Thr AJa Thr Cys Val Thr His Arg Leu AJa
14 15 l ό 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 -CGRP Gly Leu Leu Ser Arg Ser Gly Gly Val Val Lys Asn Asn ß-CGRP Gly Leu Leu Sεr Arg Ser "Met Gly Val Val Lys "Ser Asn
27 28 29 30 31 32 .5._> 34 35 36 37 -Amid α-CGRP Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser Lys Ala Phe -NH ß-CGRP Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser Lys AJa Phe -NH
Beim Menschen unterscheiden sich die a- und ß-CGRP-Sequenzen um drei Aminosäuren, bei der Ratte um eine. Zwei der drei menschlichen Abweichungen erscheinen an Stellen, in denen sich h (human) CGRP von r (rat) CGRP unterscheidet. Ein Vergleich der Sequenzen verschiedener Spezies (Ratte, Lachs, Kaninchen, Ziege, Meerschweinchen usw.) ergibt an verschiedenen Positionen unterschiedliche Aminosäuren (Zaidi et al., Quarterly Journal of Experimental Physiology 72 ( 1 987), 371 -408) .
Das Vorkommen eines Methionin im menschlichen ß-CGRP, aber nicht im σ-CGRP, ermöglicht eine chromatographische Unterscheidung der beiden Peptide (Petermann et al., 1 987). Bis auf minimale Differenzen zeigen diese beiden CGRP Sequenzen gleiche physiologische Wirkungen, wie Vasodilata- tion, Verringerung der Knochenresorption durch Osteoklasten und Steigerung der Herzaktivität (Tippins et al., 1 986, Zaidi et al., Quarterly Journal of Experimental Physiology 72 ( 1 987), 371 -408) .
Tabelle II: Vorkommen und Wirkung von Calcitonin-gene-related peptide (CGRP)
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Die Autoren Bernard und Shih (Peptides 1 1 ( 1 990), 625-632) beschrieben erstmals einen stimulativen Effekt auf die Knochenbildung. Sie stellten nach Zugabe unterschiedlicher Dosen von Calcitonin gene related peptide eine Erhöhung der Anzahl und der Größe von Knochenkolonien in der Gewebe- kultur fest. Zudem zeigte sich eine Vergrößerung der Formation der Knochenkolonien, indem sich die Zellteilung erhöhte aufgrund der Stimulation der Stammzellen und der Osteoprogenitorzellen. Zaidi et al. (Quarterly Journal of Experimental Physiology 72 ( 1 987), 371 -408) fanden, daß die cAMP-Produktion der Osteoblasten sich durch hohe CGRP-Dosen um das 30- bis 50-fache steigern läßt. Osteoblasten besitzen spezifische CGRP- Rezeptoren, an welche die Adenylatcyclase gekoppelt ist (Zaidi et al., Biochemical Biophysiological Research 2, 1 59 ( 1 ) ( 1 989), 68-71 ) . Eine Stimulation des Osteoblasten über den CGRP-Rezeptor läßt sich durch das Neuropeptid CGRP erreichen (Bjurholm et al., Journal of Bone and Mineral Research 7 (9) ( 1 992), 101 1 -101 9).
Substance P
Das Polypeptid Substance P (SP) besteht aus 1 1 Aminosäuren. Es zeigt im Körper ein breites Wirkungsspektrum und eine weitverzweigte Verteilung. Es besitzt sowohl neurokrine als auch parakrine und begrenzt endokrine Wirkung. Die Sequenz von Substance P ist phylogenetisch seit langer Zeit konstant und zeigt bei Vertebraten keine oder nur minimale Abweichungen.
Tabelle III: Sequenz der Substance P
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Aminosäure: Arg Pro Lys Pro Gin Gin Phe Phe Gly Leu Met -NH2 Substance P gehört neben Neurokinin A und B zur Familie der Tachykinine. Deren gemeinsames Strukturmerkmal ist die am Carboxyende einheitliche Sequenz Phe-X-Gly-Leu-Met-NH2. Die Tachykinine binden spezifisch an die sogenannten Neurokininrezeptoren, Substance P an die Rezeptorsubklasse Neurokinin-1 (Cascieri et al., 1 992).
Im Zentralnervensystem wirkt Substance P als Cotransmitter zusammen mit verschiedenen klassischen Neurotransmittern, wie z.B. GABA, Serotonin oder Noradrenalin. Im Gehirn finden sich SP-positive Neurone unter anderem in den Basalganglien (Tractus striatonigralis, Tractus striatopallidalis) als parakriner Effektor im hypophysären System und als Mediator im limbischen System. Auch in kortikalen Interneuronen und in spinalen Projektionsbahnen ist das Neuropeptid nachgewiesen worden.
Zum einen erscheint Substance P in der Peripherie als Agonist in der Schmerzleitung. Im noziceptiven System finden wir Substance P auf allen Ebenen vertreten, vom ersten (peripheren) Neuron über Strangzellen oder Interneurone im Rückenmark bis zu zentralen Bahnen wie dem Tractus spinothalamicus.
Zum anderen ist das Neuropeptid in den verschiedensten lokalen Regelkreisläufen vertreten. So wurde es in perivaskulären Nervenfasern des gesamten Gefäßsystems gefunden. In vitro und in vivo Experimente bewiesen seine starke vasodilatatorische Wirkung und die Partizipation in der Steuerung der lokalen Durchblutung. Substance P ist beteiligt bei Schmerzweiterleitung, Vasodilatation und Histaminfreisetzung und an der Reaktion des Organismus auf Entzündungsprozesse.
SP-positive Neurone des Nebennierenmarks, des Glomus caroticus und des Magen-Darm-Traktes werden dem APUD-System (amine precursor uptake and decarboxylation) zugerechnet. Als Zellen des "peripheren endokrinen Systems" können sie ihren Transmitter charakteristischerweise sowohl in die Blutbahn (endokrin) als auch synaptisch (neurokrin) oder ins umliegende Gewebe (parakrin) sezernieren.
Im Gastrointestinaltrakt ist Substance P nicht nur ein Überträgerstoff des intramuralen Nervensystems, sondern auch der extrinsischen, vegetativen Innervation. Neben dem vasodilatatorischen Effekt spielt im Verdauungssystem die kontraktionsstimulierende Wirkung des Neuropeptids auf die nichtvaskuläre, glatte Muskulatur eine funktioneil bedeutsame Rolle. Hierbei ergibt sich neben der Vasodilatation die zweite organübergreifende Reaktion auf die Ausschüttung des Peptids. Weitere Wirkorte sind die Lunge (Bronchokonstriktion) und vermutlich die glatte Muskulatur des Urogenitaltraktes (Ureter, Blase, Uterus) .
Im Knochen weisen das Periost, die Epiphyse und andere Knochen- Knorpelgrenzen die höchste Konzentration des Neuropeptids auf. Desweiteren konnten in allen anderen Knochenbereichen SP-haltige Nervenfasern nachgewiesen werden. Die Einsprossung von SP-positiven Nervenfasern in ein heterotopes Knochenimplantat legt den Schluß nahe, daß sie zur Innervation des Knochens gehören (Bjurholm et al., Arthritis-Rheum. 33 (6) ( 1 990), 859-865).
Bedeutenden Einfluß hat der Transmitter auf die Regulation der lokalen Durchblutung, die Entzündungsantwort und die Noziception. Des weiteren wird den afferenten Neuronen eine Wirkung für das Druckempfinden des Knochens zugesprochen (Gronblad et al., 1 984) . Die Entfernung von Mechanorezeptoren des Periosts kann aber, wie von Aro et al., 1 985, an der Rattenfibula demonstriert wurde, zur Nonunion einer Fraktur führen. Tabelle IV: Vorkommen und Wirkung von Substance P
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Eine Stimulation des Osteoblasten läßt sich durch das Neuropeptid SUBSTANZ P erreichen (Bjurholm et al., 1 992)
Neuropeptid Y
Biochemie des Neuropeptids Y
Das Neuropeptid Y besteht aus 36 Aminosäuren. Seine Sequenz weist N- terminal ein Tyrosin, C-terminal ein Tyrosinamid auf. Der Neurotransmitter gehört zur Peptid-Familie des bekannteren pankreatischen Polypeptids (PP) und dem Neuropeptids YY (NYY) .
NPY bindet an eine eigene spezifische Rezeptorklasse an der Zelloberfläche, von der bisher zwei Subtypen bekannt sind: der Y1 - und derY2-Rezeptor. Der Y1 -Rezeptor ist mit einem inhibitorischen G-Protein gekoppelt, wirkt somit in der Regel hemmend auf die Adenylatcyclase oder andere Second- messenger-Systeme.
Vorkommen und Wirkung von Neuropeptid Y
Das Neuropeptid Y wurde im ZNS bisher im hypophysären System und im Rückenmark nachgewiesen, hauptsächlich in der Substantia gelatinosa. NPY wirkt in inhibitorischen Interneuronen hemmend auf die Schmerzweiterleitung.
In der Peripherie ist NPY als Kotransmitter im vegetativen Nervensystem sowie in Zellen des APUD-Systems vertreten. Dem Peptid scheint im Magen-Darm-Trakt in der Regel eine hemmende Funktion zuzukommen: so wurde zum einem in Nervenfasern die Inhibition von fEPSP (schnelle, exzitotorische, postsynaptische Potentiale, die bei Summierung ein Aktionspotential und somit eine Erregungsweiterleitung zur Folge haben), zum anderen eine Hemmung der gastrointestinalen Motilität beschrieben. Dazu kommt noch eine vasokonstriktorische Wirkung. Außer im Abdomen befinden sich auch in anderen Körperregionen, z.B. Herz und cerebrales Gefäßsystem, perivaskuläre, NPY-haltige Nervenfasern, die eine Vasokonstriktion bewirken.
Vorkommen und Wirkung von Neuropeptid Y im Knochen
NPY-Fasern innervieren den ganzen Knochen, vorzugsweise Übergangsregionen wie die Knochen-Knorpel-Grenze oder das umgebende Weichgewebe. Neuropeptid Y besitzt einen spezifischen Rezeptor auf den Osteoblasten und wirkt hemmend auf eine durch PTH, Noradrenalin oder Norephinephrin bewirkten Stimulierung der Osteoblastenaktivität. Dabei unterdrückt es einen, durch die oben genannten Stoffe hervorgerufenen, Anstieg des intrazellulären cAMP-Spiegels ganz oder teilweise. NPY ist somit an der Modulation des Knochenwachstums und -umbaus beteiligt.
Tabelle zu 2.5.3.4 Vorkommen und Wirkung von Neuropeptid Y
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In unseren eigenen Untersuchungen haben wir festgestellt, daß es durch die Neuropeptidhormone zu einer massiven Stimulation von Precursorzellen kommt.
Es bestehen konduktive Elemente, d.h. das Einwachsen der Nervenfasern von außen in den Frakturspalt, und induktive Elemente, d.h. die nervale Stimulation außerhalb des Frakturspalts bzw. die Stimulation der Precursorzellen im Fettmark.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Arzneimittel zur Behandlung von Gewebelasionen, Differenzierungs- oder Granulationsdefiziten sowie Calciumstoffwechselstörungen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es als Wirkstoff Calcitonin gene related peptide (CGRP) oder/und Substanz P oder/und NPY gegebenenfalls mit üblichen pharmazeu- tischen Hilfs- oder/und Trägerstoffen enthält.
Das erfindungsgemäße Arzneimittel ermöglicht es, in vielseitiger Form Gewebelasionen, Frakturheiiungsstörungen, Differenzierungs- oder Granulationsdefizite oder Calciumstoffwechselstörungen zu bekämpfen. Dies wird ermöglicht durch die stimulierende Wirkung von CGRP, Substanz P bzw. NPY auf Zellen, wobei sowohl die Zellteilung als auch die Zelldifferenzierung gefördert wird. Zusätzlich wird die Durchblutung und die Revaskula- risation gefördert.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Wirkstoff, also CGRP oder/und Substanz P oder/und NPY, in oder auf einem biologisch oder medizinisch geeigneten Träger eingebracht. Hierfür sind im Prinzip alle bisher bekannten Träger geeignet, wobei insbesondere humanes embryonales Collagen Typ III oder anderes Knochensubstitutionsmaterial besonders bevorzugt ist. Alle endoprothetischen Oberflächen sind jedoch geeignet, die erfindungsgemäßen Wirksubstanzen darauf aufzubringen oder, wenn es sich um ein poröses Material handelt, darin einzubringen und dieses Material dann in Wunden oder Knochenspalten oder sonstige Defekte einzubringen.
Bevorzugt wird im erfindungsgemäßen Arzneimittel CGRP oder/und Substanz P oder und NPY in einer Konzentration von 1 0~21 bis 10"3 mol/l enthalten sein, die dann zu verabreichende Menge liegt vorzugsweise im Femtomolbereich. Die Stimulation der Precursorzellen im Fettmark durch die Neuropeptidhormone führt zu einer Precursorzellvermehrung von 3 - 18 Millionen Zellen/cm3, wie eigene Untersuchungsergebnisse belegen (Wolf et al., 1 997) .
Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann zusätzlich weitere wirksame Bestandteile enthalten, wobei insbesondere Wachstumsfaktoren als bevorzugt anzusehen sind, wobei besonders bevorzugte Wachstumsfaktoren die BMP-Proteine sind.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von CGRP oder/und Substanz P oder/und NPY zur Herstellung von autologen Gewebeäquivalenten, wobei einem Patienten entnommene Vorläuferzellen in vitro unter Zugabe von CGRP oder/und Substanz P oder/und NPY kultiviert werden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde nämlich überraschenderweise festgestellt, daß es durch Zugabe von CGRP oder/und Substanz P oder/und NPY zu Gewebekulturen möglich ist, diese sehr effektiv heranzuzüchten und auf diese Weise Gewebeäquivalente herzustel- len, die es ermöglichen, patienteneigenes Material in ausreichender Menge zu erhalten, daß dieses reimplantiert werden kann. Diese Gewebeäquivalente haben den Vorteil, daß sie die Gefahr von Krankheitsübertragung (HIV- Übertragung, Hepatitis-Übertragung, Problematik von BSE bei Verwendung von tierischem Material) vermeiden und auch Abstoßungsreaktionen nur in sehr viel geringerer Form auftreten. Bei dieser erfindungsgemäßen Verwendung von CGRP oder/und Substanz P oder/und NPY wird dem Kulturmedium die Wirksubstanz in einer Konzentration von 10"21 bis 10"3 mol/l zugesetzt. Zusätzlich können vorzugsweise die Vorläuferzellen biomechanisch, elektromagnetisch oder durch Veränderung des Sauerstoffpartialdrucks zu Wachstum stimuliert werden.
Bei der erfindungsgemäßen Verwendung ist es zudem von Vorteil, wenn man Kulturmedium mit autologem Blut oder/und Serumbestandteilen verwendet. Hierdurch werden weitere Übertragungswege für Krankheiten ausgeschlossen, was von großem Vorteil ist. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Vorläuferzellen auf einen Träger aufgebracht. Dieser Träger erleichtert die Gewinnung der Zellkultur und erleichtert auch später das Einbringen der autologen Gewebeäquivalente an den Ort, wo sie ihre Wirkung entfalten sollen. Hierbei ist es von besonderem Vorteil, wenn der Träger aus resorbierbarem Material besteht. Besonders bevorzugt besteht auch der Träger aus autolog gewonnenem Material (z.B. spongiöser Knochen) .
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Arzneimittels zur Behandlung von Gewebelasionen, Differenzierungsoder Granulationsdefiziten, z.B. des Knochens, des Knorpels, der Haut und der Weichteile, zur Behandlung von Knochenstoffwechselstörungen, insbesondere Calciumstoffwechselstörungen, oder zur Behandlung von metabolischen Stoffwechselentgleisungen.
Die erfindungsgemäß hergestellten Gewebeäquivalente werden vorzugsweise als Implantate im Bereich der Therapie von Gewebedefekten, Gewebelasionen oder Granulationsstörungen eingesetzt. Die Gewebe sind hierbei vorzugsweise Weichteile, Knorpel oder Knochen. Endoprothesen können auch mit dem erfindungsgemäßen Gewebeäquivalent beschichtet werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform setzt man außerdem autologe Knochenmatrix zu. Schließlich werden noch bevorzugt Erythrocyten oder andere Zellen bei der Implantation zugesetzt.
Die Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten autologen Gewebeäqui- valente bzw. ihre Herstellung wird im folgenden weiter ausgeführt:
Für die Vorbereitung des Empfängerlagers ist ein chirurgisches Debridement erforderlich. Das Debridement eröffnet größere Blutgefäße und Kapillaren. Eine große Ansammlung von Erythrozyten und einzelnen Granulozyten mit Thrombozyten füllen den Raum aus. Ein Fibrinnetz begünstigt die Wanderung von neuen Zellen. Früh vorhandene Entzündungszellen wie Makropha- gen, vielkernige Leukozyten und Mastzellen wandern ein. Die Phagozytose der einwandernden Granulozyten und Monozyten beginnt (Sedlarik, Wundheilung ( 1 993), Herausgeber K.M. Sedlarik. Verlag: Gustav Fischer- Verlag, Jena-Stuttgart) .
Implantierte Precursorzellen beginnen nach wenigen Stunden zu proliferie- ren. Nach wenigen Tagen läßt sich die erste Ausbildung von Gefäßsinusoi- den eine Kapillarsprossung feststellen. Später kommt es zur Abnahme phagozytierender Zellen zugunsten der Fibroblasten. Vom Empfängerlager einwachsende CGRP-positive, Substanz P-positive und NPY-positive Nervenfasern unterhalten eine weitere Stimulation von Precursorzellgewebe.
In die Wunde eingebrachtes CGRP oder/und Substanz P oder/und NPY stimulieren die bereits in der Wunde vorhandenen Precursorzellen und fördern die Festigung von Granulationsgewebe und die Neubildung von Kapillaren.
Am definierten Bruchspaltmodell wurde tierexperimentell (Kaninchen) die Knochenspaltheilung untersucht. Das entnommene Granulationsgewebe aus dem Bruchspalt enthielt in hoher Konzentration Stammzellen bzw. Precursorzellen. CGRP-positive Fasern ließen sich bereits nach einem Zeitraum von 5 Tagen vom Rande der einwachsend (konduktiv) darstellen. Die Histologie des Granulationsgewebes ergab zu diesem Zeitpunkt den Nachweis von Precursorzellen. Darüber hinaus wurden neuropeptidpositive Fasern (CGRP und Substanz P) zeitgleich mit Ausbildung von Gefäßsinusoiden und Mikrokapillaren und einer Precursorzellanhäufung nachgewiesen. NPY- positive Nervenfasern konnten im Fettmark, das die Produktionsstätte der Precursorzellen darstellt, nachgewiesen werden nach einem Zeitraum von 5 bis 10 Tagen. Perivaskulär, subendothelial, extrazellulär in der Nähe der Precursorzellanhäufungen, aber auch im Fibringitter ließen sich regelmäßig CGRP- und Substanz P-positive Fasern nachweisen (Wolf et al., 60. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Unfallchirurgie, Springer Verlag, Heidelberg-New York, 88 ( 1 996)) . Das NPY reguliert die Blutgefäßversorgung der Nervenfasern im Fettmark.
Resümee
Die immunocytochemischen Untersuchungsergebnisse belegen, daß die beschriebenen Neuropeptidhormone potente Stimulatoren der Precursorzell- proliferation und Differenzierung darstellen. Die Untersuchungen mit der Laser-Doppler-Flowmetrie ergaben für die MikroZirkulation im Granulations- gewebe des Frakturspalts eine Mehrdurchblutung nach Stimulation durch die beschriebenen Neuropeptidhormone (Wolf et al., 1 997) .
Das erfindungsgemäße Arzneimittel bzw. die Gewebeäquivalente können daher eingesetzt werden:
1 . als Knochenzellstimulator bei Knochendefekten bei gut- oder bösartigen Knochentumoren bei Frakturen mit Osteosyntheseindikation - bei Frakturen mit segmentalen Defekten zur Implantatverankerung der Prothesen des Hüftgelenks, des Schultergelenks, des Kniegelenks, des Handgelenks, des Fingergelenks und anderer Gelenkersatzprothesen bei der Kallusdistraktion - bei Korrekturosteotomie bei Knochentransplantation mit Gefäßanschluß zur Implantatverankerung nach Prothesenaustausch von Hüftgelenksprothesen, Schultergelenksprothesen, Kniegelenksprothesen, Handgelenksprothesen und Fingergelenksprothesen und anderer Gelenkersatzprothesen bei Pseudarthrosen (Falschgelenkbildung nach Frakturen)
2. als Knorpelzellstimulator: bei Knorpeldefekten am Hüft-, Knie-, Schulter-, Sprung-, Hand-, Fingergelenk bei Arthrosen bei intraartikulären Frakturen mit Knorpelabsprengung bei gut- oder bösartigen Knorpeltumoren bei Autoimmunerkrankungen, die Knorpelschäden hervorrufen, z.B. rheumatoide Arthritis
3. als Stimulator der Wundheilung: bei ausgedehnten Weichteildefekten bei Diabetes mellitus - bei operationsbedingten Wundheilungsstörungen bei chronischen Wunden
Weitere Anwendungsmöglichkeiten bieten sich für den Einsatz hei Erkrankungen, die den Knochenstoffwechsel betreffen, wie z.B. der Morbus Sudeck, die Osteoporose, der Morbus Paget sowie bei den Hypercalcämie Syndromen bei tumorhedingten Osteolysen, Pankreatitis etc. Ein zentraler Aspekt der Erfindung ist die Verwendung der Neuropeptide Calcitonin gene related peptide (CGRP oder/und Substanz P oder/und NPY) . Die Vermehrung und Differenzierung von Vorläuferzellen, Geweben oder deren Äquivalenten wird stimuliert. Als Gewebeäquivalente werden z.B. in vitro aus entsprechenden Vorläuferzellen erzeugte Zellverbände oder Kollagenfaserstrukturen bezeichnet. Eingesetzt werden fakultativ kombiniert Wachstumsfaktoren, biomechanische Stimulationsverfahren und Elektromagnetfeld-Stimulationsverfahren. Die lokale als auch systemische Wirkung des CGRP, Substanz P, NPY auf die Osteogenese soll genutzt werden.
Für die kombinierte Stimulation der Zeilproliferation sind generell alle Wachstumsfaktoren zu nennen, wie z.B. IGF, FGF, EGF, TGF alpha, TGF beta, KGF, PDGF, PRP, ILGF, T3/T4, Parathormon etc. "Bone morphogenic protein" (BMP) stellt eine Familie von derzeit 28 bekannten Faktoren dar, die spezifisch bei der Biosynthese von Knochenmaterial interagieren (Bjurholm et al., Peptides (9) ( 1 988), 1 65-1 71 ; Bjurholm, 1 990).
Die biochemische Aktivierungskaskade des CGRP bzw. der Substanz P erfolgt über die Adenylatcyclase-Kaskade und führt zu einem erhöhten cAMP-Spiegel bzw. zur Aktivierung der Protein-Kinase. Des weiteren ergeben sich Berührungspunkte bei der biomechanisch aktivierten Inosi- tol-Phosphat-Kaskade. Die Produkte Inositol, Diaglycerol, Calmodulin und Prostaglandin E bewirken an der Zellmembran über entsprechende Rezeptorstrukturen den intrazellulären Calciumeinstrom. Für das NPY besteht eine inhibitorische Wirkung über den Y Rezeptor auf das Adenylat- cyclase-System.
Die Zeilproliferation wird mit Elektromagnetfeld-Stimulation erreicht (Regung 1 994) . Zellstoffwechselvorgänge der Regulation und Reaktion werden auch hier über entsprechende Mediatoren geregelt. Die Zellkultur soll durch Variation des Sauerstoffpartialdruckes in ihrem Wachstum beeinflußt werden. Die Oxygenierung des Gewebes ist letztendlich abhängig von der Vaskularisierung, die durch die Modellvariation des Sauerstoffpartialdruckes in ihrer unterschiedlichen Qualität moduliert wird.
In der Literatur wurde von Bjurholm ( 1 990) ein Vorkommen von neuropep- tidpositiven Nervenfasern in Kombination mit Partikeln einer demineralisier- ten Knochenmatrix - eingebettet in Rattenmuskulatur - beschrieben.
Bei experimentellen Arbeiten zeigte sich, daß Kulturmedium, angereichert mit autologem Serum anstelle von üblicherweise verwendetem fötalem Kälberserum (FKS), zu einer Verbesserung der Proliferationsrate führte (Spender = Empfänger). Hierdurch lassen sich Gefahrenpunkte wie die Übertragung von Hepatitis oder HIV (AIDS) umgehen.
Das Trägermedium stellt eine Möglichkeit dar, die Zellen an den Ort ihrer Transplantation zu bringen und dort einzubetten. Generell bieten sich biodegradable, resorbierbare Materialien an. Kollagen ist eines der am häufigsten verwandten Materialien. Das Trägermedium kann aus embryona- len, rekombinanten Kollagenen bestehen, die in fester oder flüssiger Phase vorliegen. Das Trägermedium kann in entsprechender Weise alteriert werden als:
Kollagenviies
Kollagenseeds (Körnerform) - Kollagenpins (Stäbchen)
Kollagengranulat Kollagenpulver
Semiliquide Form (in Kombination mit anderen Substanzen, z.B. Fibrin oder Fibrinkleber/gel) - Kapsel (verzögerte Freisetzung durch eine Calciumphosphat/Apatit-
Umhüllung) Schwamm (Caliciumapathitschwamm, beschichtet mit Neuropeptid- hormon)
Spray (hydrophiles/lipophiles FIüssigkeits/Partikel/Gasgemisch) Beschichtung eines Materialfestkörpers (z.B. Endoprothese oder osteosynthetisches Material)
Alternativ kann autolog gewonnenes Material verwandt werden, z.B. proliferierte Fibroblasten, die zu Fibrozyten differenzieren und ebenfalls Kollagenmaterial synthetisieren. Dieses Kollagenmaterial kann als Trägerme- dium benutzt werden kann. Knochenwachs ist ebenfalls ein geeignetes Trägermaterial. Die Erythrozyten als solche können als Trägermedium verwandt werden. Das Frakturhämatom ist auch bei der physiologischen Heilung der Ausgangspunkt für die Einsprossung von Bindegewebszellen, so daß hier in Analogie das gleiche Material eingebracht wird.

Claims

Ansprüche
1 . Arzneimittel zur Behandlung von Gewebelasionen, Differenzierungsoder Granulationsdefiziten sowie Stoffwechselstörungen, dadurch gekennzeichnet, daß es als Wirkstoff Calcitonin-gene related peptide (CGRP) oder/und Substanz P oder/und Neuropeptid Y (NPY) gegebenenfalls mit üblichen pharmazeutischen Hilfs- oder/und Trägerstoffen enthält.
2. Arzneimittel nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff in oder auf einen biologisch oder medizinisch geeigneten Träger eingebracht ist.
3. Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Träger humanes embryonales Kollagen Typ III oder ein anderes Knochensubstitutionsmaterial vorhanden ist.
4. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es CGRP oder/und Substanz P oder/und NPY in einer Konzentration von jeweils 10"21 bis 1 0'3 mol/l enthält.
5. Arzneimittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich weitere wirksame Bestandteile, vorzugsweise Wachstumsfaktoren enthält.
6. Arzneimittel nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der weitere wirksame Bestandteil ein BMP-Protein ist.
7. Verwendung von CGRP oder/und Substanz P oder/und NPY zur Herstellung von autologen Gewebeäquivalenten, dadurch gekennzeichnet, daß einem Patienten entnommene Vorläuferzellen in vitro unter Zugabe von CGRP oder/und Substanz P oder/und NPY kultiviert werden.
8. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß CGRP oder/und Substanz P oder/und NPY dem Kulturmedium in einer Konzentration von 1 0"21 bis 1 0"3 mol/l zugesetzt werden.
9. Verwendung nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorläuferzellen zusätzlich biomechanisch, elektromagnetisch oder durch Veränderung des Sauerstoffpartialdurcks stimuliert werden.
1 0. Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man Kulturmedium mit autologen Blut- oder/und Serumbestandteilen verwendet.
1 1 . Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen auf einen Träger/Implantat aufgebracht werden.
1 2. Verwendung nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, daß der Träger aus resorbierbarem Material besteht.
1 3. Verwendung nach Anspruch 1 1 oder 1 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger aus autolog gewonnenem Material besteht.
14. Verwendung eines Arzneimittels nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Behandlung von Gewebelasionen, Differenzierungs- oder
Granulationsdefiziten, z.B. des Knochens, des Knorpels, der Haut und der Weichteile, zur Behandlung von Knochenstoffwechselstörungen oder zur Behandlung von metabolischen Stoffwechselentgleisungen.
1 5. Verwendung von Gewebeäquivalenten, welche gemäß den Ansprüchen 7 bis 1 3 hergestellt wurden als Implantate im Bereich der Therapie von Gewebedefekten, Gewebelasionen oder Granulationsstörungen.
1 6. Verwendung nach Anspruch 1 5, wobei die Gewebe Knochen sind.
1 7. Verwendung nach Anspruch 1 5 oder 1 6, dadurch gekennzeichnet, daß man außerdem autologe Knochenmatrix oder autologes rekombi- nantes Trägermaterial zusetzt.
1 8. Verwendung nach Anspruch 1 5 bis 1 7, dadurch gekennzeichnet, daß man außerdem Erythrozyten oder andere Zellen zusetzt.
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